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DE60030961T2 - Methode zur verbesserung der agronomischen und des ernährungswertes von pflanzen - Google Patents

Methode zur verbesserung der agronomischen und des ernährungswertes von pflanzen Download PDF

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DE60030961T2
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plant
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Transformation von Pflanzenzellen, Samen, Geweben und ganzen Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Insertion rekombinanter Nukleotidsequenzen, die für ein oder mehrere Enzym(e), speziell für den biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweg in das Pflanzenmaterial codieren, mit dem Ziel, dessen agronomischen Wert und Ernährungswert zu verbessern.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Provitamin A(β-Carotin)-Mangel repräsentiert ein sehr ernstes Gesundheitsproblem, das zu schweren klinischen Symptomen in dem Teil der Weltbevölkerung führt, das von Getreide wie Reis als dem überwiegenden oder fast ausschließlichen Grundnahrungsmittel lebt. Allein in Südostasien wird geschätzt, daß 5 Millionen Kinder jedes Jahr die Augenkrankheit Xerophthalmie entwickeln, wovon ungefähr 0,25 Millionen eventuell blind werden (Sommer, 1988; Grant, 1991). Obwohl ein Vitamin A-Mangel nicht eine unmittelbare Determinante für Tod ist, ist er darüber hinaus korreliert mit einer erhöhten Anfälligkeit für tödliche Beschwerden, wie Diarrhoe, Atemwegserkrankungen und Kinderkrankheiten, wie Masern (Grant, 1991). Nach den von UNICEF gesammelten Statistiken, könnte eine erhöhte Provitaminernährung 1 bis 2 Millionen jährliche Todesfälle unter Kindern im Alter von 1 bis 4 Jahren verhindern und eine zusätzliche Anzahl von 0,25 bis 0,5 Millionen Todesfällen im Verlauf der späteren Kindheit (Humphrey et al., 1992). Aus diesen Gründen ist es sehr wünschenswert, den Carotinoid-Gehalt in den Hauptnahrungsmitteln zu erhöhen. Darüber hinaus sind die Carotinoide bekannt, in der Prävention verschiedener Arten von Krebs einen Beitrag zu leisten, und es ist die Rolle von Lutein und Zeaxanthin nachgewiesen, daß sie in der Retina die Degeneration der Macula verhindern (siehe z.B. Brown et al., 1998; Schalch, 1992).
  • Darüber hinaus haben Carotinoide einen weiten Anwendungsbereich als Farbmittel in menschlichen Lebensmitteln und im tierischen Futter, als auch in Pharmazeutika. Zusätzlich besteht ein gesteigertes Interesse an Carotinoiden als Nahrungsmittelverbindungen in "functional food". Dies liegt daran, daß einige Carotinoide, z.B. β-Carotin, in Säugern Provitamin A-Charakter zeigen.
  • Carotinoide sind 40 Kohlenstoffatome (C40) umfassende Isoprenoide, die durch Kondensation aus acht Isopreneinheiten, die von dem biosynthetischen Vorläufer Isopentenyldiphosphat (siehe 1) abgeleitet sind, gebildet werden. Durch Nomenklatur zerfallen die Carotinoide in zwei Klassen, einmal Carotine, die Kohlenwasserstoffatome umfassen, wohingegen die oxidierten Derivate als Xanthophylle bezeichnet werden. Ihre wesentliche Funktion in Pflanzen ist, vor photooxidativem Schaden im photosynthetischen Apparat der Plastiden zu schützen. Zusätzlich nehmen sie an der Ernte von Licht während der Photosynthese teil und repräsentieren integrale Bestandteile der photosynthetischen Reaktionszentren. Carotinoide sind die direkten Vorläufer des Phytohormons Abszisinsäure.
  • Die Carotinoid-Biosynthese, wie in 1 schematisch dargestellt, wurde erforscht und der Stoffwechselweg in Bakterien, Pilzen und Pflanzen (siehe z.B. Britton, 1988) aufgeklärt. In Pflanzen werden Carotinoide in Plastiden gebildet.
  • Das frühe Zwischenprodukt des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselwegs ist Geranylgeranyldiphosphat (GGPP), das von dem Enzym Geranylgeranyldiphosphatsynthase aus Isopentenyldiphosphat (IPP) und Dimethylallyldiphosphat (DMAPP, siehe 1) gebildet wird. Der nachfolgende enzymatische Schritt, der auch die erste Carotinoid-spezifische Reaktion darstellt, wird durch das Enzym Phytoensynthase katalysiert. Die Reaktion umfaßt eine Zweischrittreaktion, resultierend in einer Kopf-zu-Kopf-Kondensation der zwei Moleküle des GGPP, um das erste, jetzt noch ungefärbte Carotin-Produkt, das Phytoen zu bilden (Dogbo et al., 1988, Chamovitz et al., 1991; Linden et al., 1991; Pecker et al., 1992). Die Phytoen-Synthase kommt in zwei Formen löslich/inaktiv und Membran-gebunden/aktiv vor und erfordert benachbarte Hydroxy-Funktionen zur Aktivität, wie sie auf der Oberfläche Plastidgalactolipid-enthaltender Membranen vorhanden sind, (Schledz et al., 1996).
  • Während die Bildung von Phytoen in Bakterien und Pflanzen ähnlich ist, unterscheidet sich die Metabolisierung des Phytoens ausgesprochen. In Pflanzen arbeiten in sequenzieller Weise zwei Genprodukte, um das gefärbte Carotin Lycopen (Beyer et al., 1989) zu generieren. Diese werden durch die Enzyme Phytoendesaturase (PDS, siehe z.B. Hugueny et al., 1992) und ϛ-Carotindesaturase (ZDS, siehe z.B. Albrecht et al., 1996) repräsentiert. Jedes von ihnen führt zwei Doppelbindungen ein, um jeweils ϛ-Carotin mittels Phytofluen und Lycopen mittels Neurosporen zu bilden. Es wird davon ausgegangen, daß PDS mechanistisch an eine Membran-gebundene Redoxkette (Nievelstein et al., 1995) unter Verwendung von Plastochinon (Mayer et al., 1990; Schulz et al., 1993; Norris et al., 1995) gebunden ist, während ZDS mechanistisch in einem unterschiedlichen Weg (Albrecht et al., 1996) arbeitet.
  • In Pflanzen scheint der gesamte Stoffwechselweg cis-konfigurierte Zwischenprodukte (Bartley et al., 1999) einzuschließen. Im Gegensatz dazu wird in vielen Bakterien, wie der Gattung Erwinia, die gesamte ungesättigte Sequenz, die alle vier Doppelbindungen bildet, durch ein einzelnes Genprodukt (CrtI) erreicht, indem Phytoen zu Lycopen direkt konvertiert (siehe z.B. Miawa et al., 1990; Armstrong et al., 1990, Hundle et al., 1994). Dieser Typ bakterieller Desaturase ist bekannt, nicht gegenüber bestimmten bleichenden Herbiziden empfindlich zu sein, die wirksam die pflanzentypische Phytoendesaturase inhibieren.
  • In Pflanzen katalysieren zwei Genprodukte die Ringbildung von Lycopen, nämlich α(ε)- und β-Lycopencyclasen, die jeweils α(ε)- und β-Iononendgruppen bilden (siehe z.B. Cunningham et al., 1993; Scolnik und Bartley, 1995, Cunningham et al., 1996). Normalerweise werden in Pflanzen β-Carotin, das zwei β-Ionon-Endgruppen und α-Carotin, das eine α(ε)- und eine β-Ionon-Endgruppe trägt, gebildet.
  • Die Bildung des Pflanzenxantophylls wird zuerst durch zwei Genprodukte α- und β-Hydroxylasen (Masamoto et al., 1998) vermittelt, indem sie in der Position C3 und C3' des Carotin-Gerüstes von jeweils α- und β-Carotin angreifen. Die erhaltenen Xanthophylle werden Lutein und Zeaxanthin genannt.
  • Die weiteren Anreicherungsreaktionen mit Sauerstoff werden durch Zeaxanthinepoxydase katalysiert, indem die Einführung von Epoxy-Funktionen in Position C5,C6 und C5',C6' des Zeaxanthin-Gerüstes katalysiert werden (Marin et al., 1996). Dies führt zur Bildung von Antheraxanthin und Violaxanthin. Die Reaktion wird durch den Angriff eines unterschiedlichen Genproduktes, nämlich Violaxanthindeepoxydase (Bugos und Yamamoto, 1996) reversibel ausgeführt.
  • Das zur Bildung von Neoxanthin führende Genprodukt muß identifiziert werden.
  • Gene und cDNAs, die für Carotinoid-Biosynthesegene codieren, wurden aus einer Vielzahl von Organismen, die von Bakterien bis Pflanzen reichen, kloniert. Bakterielle und cyanobakterielle Gene schließen ein: Erwinia herbicola (Patentanmeldung WO 91/13078, Armstrong et al., 1990), Erwinia uredovora (Misawa et al., 1990), R. capsulatus (Armstrong et al., 1989), Thermus thermophilus (Hoshino et al., 1993), das Cyanobacterium Synechococcus sp. (Genbank-Zugangs-Nr. X638763), Flavobacterium sp. Stamm R1534 (Pasamontes et al., 1997). Gene und cDNAs, die für Enzyme im biosynthetischen Carotinoidstoffwechselweg in höheren Pflanzen codieren, wurden aus verschiedenen Quellen kloniert, die Arabidopsis thaliana, Sinapis alba, Capsicum annuum, Narcissus pseudonarcissus, Lyceopersicon esculentum, etc., einschließen, wie aus den öffentlichen Datenbanken hergeleitet werden kann.
  • Gegenwärtig ist relativ wenig bezüglich der Verwendung der klonierten Gene in höheren Pflanzentransformationen und den daraus resultierenden Effekten bekannt. Die Expression der Phytoensynthase aus Tomate kann den Carotinoid-Gehalt in der Frucht beeinflussen (Bird et al., 1991; Bramley et al. 1992; Fray und Grierson, 1993). Es wurde auch berichtet, daß eine wesentliche Expression einer Phytoensynthase in transformierten Tomatenpflanzen in Kleinwuchs endet, aufgrund der zurückgerichteten Ausrichtung des Metaboliten GGPP vom biosynthetischen Gibberelin-Stoffwechselweg (Fray et al., 1995). Keine derartigen Probleme waren über die wesentlich exprimierende Phytoensynthase aus Narcissus pseudonarcissus in Reisendosperm (Burkhardt et al., 1997) bekannt. Erwinia uredovora CrtI, als eine bakterielle Desaturase, ist bekannt in Pflanzen zu arbeiten und bleichende Herbizidresistenz (Misawa et al., 1993) zu übertragen.
  • Über die Jahre wurden viele Versuche unternommen, die biosynthetischen Carotinioid-Stoffwechselwege in verschiedenen Pflanzengeweben, wie auch vegetativen Geweben oder Samen oder in Bakterien zu ändern oder zu beschleunigen. Siehe zum Beispiel WO 96/13149, WO 98/06862, WO 98/24300, WO 96/28014 und US-Patent 5,618,988. Zusätzlich beschreibt WO 99/07867 Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Samen, die veränderte Carotinoid-Zusammensetzungen haben, indem Wirtspflanzen mit Konstrukten, die eine Anfangsregion zur Transkribierung haben, die von einem Gen, das in einem Pflanzensamen, einem Plastidtransitpeptid, einer DNA-Sequenz, die von wenigstens einer für Carotinoid-Biosynthese-Gen codierender Region abgeleitet ist, exprimiert ist und eine Transkriptionsterminationsregion aufweist. Die in WO 99/07867 offenbarten Verfahren finden besondere Anwendung zur Erhöhung des Carotinoid-Gehaltes in Ölsamenpflanzen. All diese sind auf die Manipulation von bereits existierenden Carotinoid-Biosynthesereaktionen in Zellen beschränkt. Andere Anwendungen mit dem Ziel, die Carotinoid-Biosynthese in ölreichen Samen zu verändern, sind unterschiedlich, da sie ein Auffangbecken zur Anpassung eines Überschusses von Carotinoiden zur Verfügung stellen, das aufgrund des Anwachsens durch die Transformation provoziert wurde, gebildet wurde.
  • Es ist offenkundig, daß ein Verfahren zur Transformierung von Pflanzenmaterial erforderlich ist, mit dem Ziel Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, alle Enzyme des Carotinioid-Biosynthesestoffwechselweges, die zur Produktion der gewünschten Carotine und Xanthophylle erforderlich sind, zu exprimieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Mittel und Verfahren zur Transformation von Pflanzezellen, Samen, Geweben oder ganzen Pflanzen zur Verfügung, mit dem Ziel, Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, alle Enzyme des Carotinoid-Biosynthese-Stoffwechselweges zu exprimieren, die essentiell für die als Ziel erkannte Wirtspflanze sind, um die gewünschten Carotine und/oder Xanthophylle anzureichern. Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA-Moleküle zur Verfügung, die entworfen wurden, um zur Ausführung des Verfahrens der Erfindung geeignet zu sein, und Plasmide oder Vektorsysteme, die derartige Moleküle umfassen. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung transgene Pflanzenzellen, Samen, Gewebe und ganze Pflanze zur Verfügung, die eine gesteigerte Ernährungsqualität entfalten und solche DNA-Moleküle enthalten und/oder die durch Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung generiert wurden.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung sowohl die de novo Einführung als auch Expression der Carotinoid-Biosynthese zur Verfügung, die in besonderem Maße im Hinblick auf Pflanzenmaterial wichtig ist, das bekanntlich essentiell Carotinoid-frei ist, wie Reisendosperm und die Samen vieler anderer Cerealien, und die Veränderung der bereits bestehenden Carotinoid-Biosynthese mit dem Ziel, die Anreicherung bestimmter Zwischenprodukte oder gewünschter Produkte auf- oder abzuregulieren.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein allgemeinen Stoffwechselweg der Pflanzencarotinoid-Biosynthese. Die Namen der Enzyme sind fett angegeben. Ebenso ist die durch eine bakterielle CrtI-Typ Carotindesaturase katalysierte Reaktion angezeigt.
  • 2 zeigt, daß das Zwischenprodukt Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) nicht nur an der Carotinoid-Biosynthese beteiligt ist, sondern auch als ein Baustein in Stoffwechselwegen dient, die zu verschiedenen Verbindungen durch Prenylierungsreaktionen (z.B. Tocopherole, Chinone, Chlorphylle) oder durch eine unterschiedliche Reaktion, die nicht Nicht-Prenyl-Akzeptormoleküle (z.B. Gibberelline, Geschmacks- und Aromastoffe) verwendet, führt.
  • 3 gibt die HPLC-Analysen polierter Reissamen (Endosperm) von nicht-transformierten (3A) und transformierten (mit Plasmid A, 3B; mit Plasmid A plus B, 3C) Reispflanzen wieder. Das Vorhandensein von Carotinoiden, cyclischen Carotinen und Xanthophyllen ist in den Spuren, die die transformierten Samen wiedergeben, evident.
  • 4 illustriert schematisch die Expressionskassetten, die in "Plasmid A" und "Plasmid B" verwendet wurden. LB, linke Grenze; RB, rechte Grenze; psy, Phytoen-Synthase, cDNA aus Narcissus pseudonarcissus; crtI, Carotin-Desaturasegen aus Erwinia uredovora; cyc, Lycopencyclase, cDNA aus Narcissus pseudonarcissus; aphIV, Hygromycinphosphotransferase, Gt1, Reis-Glutelin 1-Promotor; 35S, CaMV35S-Promotor; nos, Nopalin-Synthaseterminator, NptII, Kanamycin-Resistenzgen.
  • Figur 5: A, ein Northern-Blot, der RNA von unbehandelten (Spur 1) und CPTA-behandelten (Spur 2) gelben Narzissen verwendet. Die immobilisierte RNA wurde wiederholt gestrippt, um die Hybridisierung unter Verwendung markierter Sonden für B, Phytoen-Synthase; B, Phytoen-Desaturase; C, ϛ-Carotin-Desaturase; E, Lycopen-Cyclase zu ermöglichen. B, Western-Blot, der Proteinextrakte von unbehandelten (Spur 1) und behandelten (Spur 2) gelben Narzissen verwendete. Die Blots wurden mit Antikörpern, die gegen A, Phytoen-Synthase; B, Phytoen-Desaturase; C, ϛ-Carotin-Desaturase; D, Lycopen-Cyclase gerichtet waren, markiert.
  • In der gesamten Beschreibung verwendete Abkürzungen
  • Die systematischen Namen wesentlicher Carotinoide, die hierin erwähnt werden, sind, wie folgt:
    Phytoen: 7,8,11,12,7',8',11',12'-Octahydro-Ψ,Ψ-carotin
    Phytofluen: 7,8,11,12,7',8'-Hexahydro-Ψ,Ψ-carotin
    ϛ-Carotin: 7,8,7',8'-Tetrahydro-Ψ,Ψ-carotin
    Neurosporen: 7,8-Dihydro-Ψ,Ψ-carotin
    Lycopen: -Ψ,Ψ-Carotin
    β-Carotin: β,β-Carotin
    α-Carotin: β,ε-Carotin
    Zeaxanthin: β,β-Carotin-3,3'-diol
    Lutein: β,ε-Carotin-3,3'-diol
    Antheraxanthin: 5,6-Epoxy-5,6-dihydro-β,β-carotin-3,3'-diol
    Violaxanthin: 5,6,5',6'-Diepoxy-5,6,5',6'-tetrahydro-β,β-carotin-3,3'-diol
    Neoxanthin: 5',6'-Epoxy-6,7-didehydro-5,6,5',6'-tetrahydro-β,β,-carotin-3,5,3'triol
  • Enzyme:
    • PSY: Phytoen-Synthase
    • PDS: Phytoen-Desaturase
    • CrtI: bakterielle Carotin-Desaturase
    • ZDS: ϛ(zeta)-Carotin-Desaturase
    • CYC: Lycopen-β-Cyclase
  • Nicht-Carotin-Zwischenprodukte:
    • IPP: Isopentyldiphosphat
    • DMAPP: Dimethylallyl-diphosphat
    • GGPP: Geranylgeranyldiphosphat
  • Wie hierin verwendet, schließt die Bezeichnung "Pflanze" allgemein ein: eukaryotische Algen, Embryophyten, einschließlich Bryophyta, Pteridophyta und Spermatophyta, wie Gymnospermae und Angiospermae, die letzteren schließen Magnoliopsida, Rosopsida (Eu-"dicots"), Liliopsida ("Monocots") ein. Repräsentative und bevorzugte Beispiele schließen ein: Getreidekörner, z.B. Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Amaranth, Flachs, Triticale, Roggen, Mais und andere Gräser; Ölsamen, wie Brassica-Ölsamen, Baumwollsamen, Sojabohne, Safflor, Sonnenblume, Kokosnuß, Palme und ähnliche; andere eßbare Samen oder Samen mit eßbaren Teilen schließen ein: Kürbis, Squash, Sesam, Mohnblume, Weintraube, Bohnen, Erdnuß, Erbsen, Bohnen, Rettich, Alfalfa, Kakao, Kaffee, Hanf, Baumnüsse wie Walnüsse, Mandeln, Pecannüsse, Kichererbsen, etc. Ferner, Kartoffeln, Karotten, süße Kartoffeln, Tomate, Pfeffer, Maniok, Baumwolle, Eichen, Ulmen, Ahornbäume, Äpfel, Bananen; dekorative Blumen, wie Lilien, Orchideen, Riedgras, Rosen, Butterblumen, Petunien, Phlox, Veilchen, Sonnenblumen und ähnliche. Die vorliegende Erfindung ist in dekorativen Arten aber auch in kultivierten Arten anwendbar, für Nahrung, Fasern, Holzprodukte, Gerbmaterialien, Färbemittel, Pigmente, Gummi, Harze, Latexprodukte, Fette, Öle, Wirkstoffe, Getränke und ähnliche. Vorzugsweise ist die für die Transformation ausgesuchte Zielpflanze für Nahrung kultiviert, wie beispielsweise Samenkörner, Wurzelgemüse, Hülsenfrüchte, Nüsse, Gemüse, Knollen, Früchte, Gewürze, und ähnliche.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Verfügung. In Übereinstimmung mit dem Erfindungsgegenstand werden Mittel und Verfahren zur Transformierung von Pflanzezellen, Samen, Geweben oder ganzen Pflanzen zur Verfügung gestellt, um Transformanien zu erzeugen, die in der Lage sind, alle Enzyme des Carotin- Biosynthese-Stoffwechselweges, die essentiell für die Zielwirtspflanze sind, zu exprimieren, um die gewünschten Carotine und/oder Xantophylle anzureichern. Entsprechend einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung können die vorgenannten Verfahren auch verwendet werden, um die bereits bestehende Carotinoid-Biosynthese zu modifizieren, mit dem Ziel, die Anreicherung bestimmter Zwischenprodukte oder gewünschter Produkte auf- oder abzuregulieren. Weiterhin werden spezifische DNA-Moleküle zur Verfügung gestellt, welche Nukleotidsequenzen umfassen, die eine oder mehrere Expressionskassetten tragen, die in der Lage sind, die Herstellung eines Enzyms oder mehrerer Enzyme zu lenken, die charakteristisch für den Carotinoid-Biosynthese-Stoffwechselweg sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfaßt:
    • – Phytoensynthase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
    • – Phytoendesaturase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
    • – ϛ-Carotindesaturase, abgeleitet aus Pflanzen oder Cyanobakterien und
    • – Lycopencyclase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien.
  • Es ist auch offenbart, daß die vorgenannte Expressionskassette ein Gen oder mehrere Gene oder cDNAs, die für eine Pflanze, Pilze oder bakterielle Phytoensynthase, eine Pflanze, Pilze oder bakterielle Phytoendesaturase, Pflanzen-ϛ-Carotindesaturase oder eine Pflanze, Pilze oder bakterielle Lycopencyclase codiert, umfaßt, wobei jede operativ an einen geeigneten, richtungsgebenden induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor gebunden ist, der in der Lage ist, in Pflanzenzellen, Samenkörnern, Geweben oder ganzen Pflanzen zu exprimieren. Besonders bevorzugte Gene oder cDNAs codieren für Pflanzenphytoensynthese, bakterielle Phytoendesaturase oder Pflanzenlycopencyclase. Eine umfängliche, noch wachsende Zahl an Genen, die für Phytoensynthase (Pflanze und bakteriell), CrtI-Typ Carotin-Desaturase (bakteriell) und Lycopencyclase (Pflanze und bakteriell) codiert, wurden isoliert und aus den Datenbanken zugänglich gemacht. Sie stammen aus verschiedenen Quellen und sind alle zur Verwendung in den offenbarten Verfahren erhältlich.
  • Ferner umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform die DNA-Moleküle wenigstens ein selektierbares Markergen oder eine cDNA, operativ an einen geeigneten richtungsgebenden, induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor gebunden, wobei Hygromycinphosphotransferase als selektierbarer Marker unter der Kontrolle eines richtungsgebenden Promotors am meisten bevorzugt ist. Obwohl der Fachmann jeden erhältlichen Promotor, der in Pflanzenmaterial funktionell aktiv ist, auswählen kann, ist im Entwurf erfindungsgemäßer geeigneter Expressionskassetten bevorzugt, die jeweilige Nukleotidsequenz, die für Phytoendesaturase, ϛ-Carotindesaturase oder Lycopencyclase codiert, betriebsfähig mit gewebespezifischen oder richtungsgebenden Promotoren zu verbinden, wobei die für Phytoensynthase codierende Nukleotidsequenz vorzugsweise unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimiert wird, um eine Interferenz mit Gibberellin-Bildung zu vermeiden.
  • Es ist klar, daß die Nukleotidsequenz als funktionelles Element des DNA-Moleküls entsprechend der Offenbarung, jedwede Kombination eines oder mehrerer der vorgenannten Gene oder cDNAs umfassen kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine derartige Nukleotidsequenz funktionelle Expressionskassetten sowohl für die Phytoensynthase als auch die bakterielle oder Pilz-Phytoendesaturase und kann nach Inkorporation in ein geeignetes Plasmid oder Vektorsystem (Plasmid A) in das als Ziel erkannte Pflanzenmaterial eingeführt werden, entweder allein oder zusammen mit einem zweiten Vektor (Plasmid B), umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für Lycopencyclase codiert.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Plasmide oder Vektorsysteme zur Verfügung, enthaltend ein oder mehrere der vorgenannten DNA-Moleküle oder Nukleotidsequenzen, welche vorzugsweise von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind.
  • Der Gegenstand der Erfindung stellt zusätzlich transgene Pflanzenzellen, Samen, Gewebe und ganze Pflanzen zur Verfügung, die eine gesteigerte Ernährungsqualität entfalten und eine oder mehrere der oben genannten DNA-Moleküle, Plasmide oder Vektoren enthalten und/oder unter Verwendung der Verfahren, entsprechend der vorliegenden Erfindung generiert wurden.
  • Die gegenwärtige Erfindung basiert auf der Tatsache, daß das frühe Zwischenprodukt Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) nicht nur allein für die Carotinentstehenung dient, sondern auch eine Verzweigungsstelle darstellt, die für einige verschiedene biosynthetische Stoffwechselwege (2) dient. Es wurde daher geschlossen, daß dieser Vorläufer in den Plastiden aller Pflanzengewebe, Carotinoid-tragenden oder Nicht-Carotinoid-tragenden, wie Reisendosperm vorkommt. Die Quelle von GGPP kann daher verwendet werden, um die Gegenstände der vorliegenden Erfindung, d.h. die Einführung des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges teilweise oder als ganzer und/oder die Verstärkung oder Beschleunigung eines bereits bestehenden biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges zu erreichen.
  • Der Begriff "Carotinoid-frei", der in der gesamten Beschreibung verwendet wird, um zwischen bestimmten Zielpflanzenzellen oder -geweben zu unterscheiden, soll bezeichnen, daß das jeweilige Pflanzenmaterial, das nicht entsprechend der Erfindung transformiert ist, normalerweise bekannt ist, von Carotinoiden essentiell frei zu sein, wie es der Fall ist für beispielsweise Speicherorgane, wie beispielsweise Reisendospern und ähnliche. Carotinoid-frei meint nicht, daß diese Zellen oder Gewebe, die Carotinoide in fast unnachweisbaren Mengen anreichern, ausgeschlossen sind. Vorzugsweise soll diese Bezeichnung Pflanzenmaterial definieren, das einen Carotinoid-Gehalt von 0,001% G/G oder weniger hat.
  • Im Hinblick auf die Auswahl geeigneter Quellen, von denen Carotinoid-Stoffwechselweg-Enzyme abgeleitet werden können, ist so zu verstehen, daß die codierenden Sequenzen von Cyanobacteria zu den entsprechenden Pflanzensequenzen homolog sind und auch in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine höhere Pflanzenphytoensynthase operativ an einen Promotor gebunden, der eine gewebespezifische Expression überträgt. Dieser ist am selben Plasmid (Plasmid A) mit einer bakteriellen (Crt-I-Typ)-Phytoendesaturase vereinigt, die letztere ist zu einer DNA-Sequenz, die für ein Transitpeptid codiert, fusioniert und operativ an einen Promotor gebunden, der die konstitutive Expression ermöglicht. Die Transformation von Pflanzen mit diesem Konstrukt in einem geeigneten Vektor wird die Bildung von Lycopen in diesem Gewebe, das durch den die Phytoensynthase kontrollierenden Promotor ausgewählt ist, lenken, zum Beispiel, in den Samen von Carotinoid-freien Getreidesamen. Überraschenderweise kann diese Transformation allein eine Carotinoid-Synthese außerhalb der Lycopenformation in Richtung stromabwärts gerichteter Xanthophylle, wie Lutein, Zeaxanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin und Neoxanthin initiieren, sogar in einem Carotinoid-freiem Gewebe, wie Reisendosperm. Zusätzlich wird die Bildung von α-Carotin beobachtet. Daher ist eine Carotinoid-Ergänzung, ähnlich derjenigen, die in grünen Blättern vorhanden ist, gebildet. Dieses unerwartete Phänomen (hier auch als "Overshoot"-Mechanismus bezeichnet) kann entstehen, aufgrund der konstitutiven Expression der jeweiligen späteren Gene (Lycopencyclasen, β-Carotinhydroxylasen, Epoxidasen), welche durch den Transformations-vermittelten Substratnachschub aktiviert werden, oder alternativ, durch die Induktion der Expression carotinoider biosynthetischer Gene, ausgelöst durch die Transformation. In dem Fall, daß der "Overshoot"-Mechanismus nicht funktioniert, kann die Co-Transformation (Plasmid B) mit einem Gen oder einer für Lycopencyclase codierenden cDNA das Problem überwinden und wenigstens eine α- oder β-Carotin(Provitamin A)-Bildung ermöglichen. In Fällen, wo der "Overshoot"-Mechanismus funktioniert, kann diese Co-Transformation die durch Phytoensynthase und die CrtI-Typ Carotindesaturase ausgelösten Effekte steigern. Die vorliegende Erfindung schließt daher die Einführung des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges außerhalb des Punktes, der genetisch durch Transformieren mit einem Plasmid A oder A plus B gegeben ist, ein.
  • Plasmid A ist auch in der Lage, die Carotinoid-Produktion in Carotinoid-tragenden Geweben zu verstärken. Diese Transformationen führen zu einer Verstärkung des Ernährungswertes von Lebensmitteln für Menschen und Futter für Tiere. Ein weiterer Vorteil der Verwendung der bakteriellen Phytoendesaturase vom crtI-Typ in der Transformation ist der, daß dieses Enzym auch in Blattchloroplasten exprimiert wird, wobei den bleichenden auf die Pflanzen-Phytoendesaturase zielenden Herbiziden, Resistenz verliehen wird. Die vorliegende Erfindung schließt daher auch ein, bleichende Herbizidresistenz in Verbindung mit transgenen Pflanzen, die wenigstens ein Plasmid A tragen, zu verwerten.
  • Das zweite Plasmid B kann das Gen für eine Pflanzenlycopencyclase tragen; alternativ kann eine bakterielle Lycopencyclase, die mit einer Transitsequenz ausgestattet ist, verwendet werden. Diese ist operativ an einen Promotor gebunden, vorzugsweise einen, der dieselbe Gewebespezifität der Expression verleiht, wie mit Phytoensynthase in Plasmid A. Die Co-Transformation von Plasmid A und B resultiert in der Ergänzung des Zielgewebes, wie einer Wurzelknolle, einer Fruchtknolle oder Samen mit der vollen Information, um den biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweg von Geranylgeranyldiphosphat auszuführen, um β-Carotin zu bilden. In dem Fall von bereits bestehenden oder später induzierten Reaktionen des Stoffwechselweges ermöglicht diese Co-Transformation (siehe oben) einen verstärkten Carotinoid-Gehalt und eine verstärkte Bildung von Carotin-abgeleiteten Xanthophyllen.
  • Alle verwendeten Gene sind mit einer DNA-Sequenz ausgestattet, die für eine Transitsequenz codiert, die einen Plastidimport ermöglicht. Dies ist entweder durch eine rekombinante DNA-Technologie sichergestellt oder die Transitsequenz ist in der Pflanzen-cDNA, die verwendet wird, vorhanden. Die Transformation erlaubt dann eine Carotinoid-Bildung unter Verwendung eines Pools des in Plastiden lokalisierten Geranylgeranyldiphosphat-Precursors. Diese zentrale Verbindung ist weder ein Carotinoid noch repräsentiert sie einen Precursor, der allein der Carotinoid-Biosynthese (siehe 2) gewidmet ist.
  • Die Pflanzen sollten das/die eingeführte/n Gen/Gene exprimieren und sie sind vorzugsweise zu deren Expression homozygot. Im allgemeinen wird das Gen operativ an einen Promotor gebunden sein, der in den Zielwirtszellen der besonderen Pflanze funktionell aktiv ist. Die Expression sollte auf einem solchen Niveau stattfinden, daß das von dem Gen gewünschte Charakteristikum erhalten wird. Zum Beispiel sollte die Expression des selektierbaren Markergens eine geeignete Selektion von erhaltenen Transformanten, entsprechend den Verfahren der vorliegenden Erfindung, zur Verfügung stellen. In ähnlicher Weise sollte die Expression eines Gens oder mehrerer Gene des biosynthetischen Carotinoid- und Xanthophyll-Stoffwechselweges zur gesteigerten Ernährungsqualität in einer Pflanze resultieren, die einen relativ höheren Gehalt von einem oder mehreren der Stoffwechselweg-Zwischenprodukte oder der Produkte, die im Vergleich zu denen der selben Spezies, die nicht der Transformationsmethode entsprechend der Verbindung unterworfen wurden, aufweisen. Auf der anderen Seite wird allgemein wünschenswert sein, die exzessive Expression des gewünschten Gens oder der gewünschten Gene zu limitieren, mit dem Ziel, eine signifikant nachteilige Wirkung der normalen Pflanzenphysiologie zu vermeiden, d.h. bis zu dem Ausmaß, daß deren Kultivierung schwierig wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes DNA-Molekül, entsprechend Anspruch 15, zur Verfügung.
  • Das Gen oder die Gene, die für das gewünschte oder die gewünschten Enzyme codieren, können in Expressionskassetten zur Expression in die transformierten Pflanzengewebe verwendet werden. Um die Gegenstände der vorliegenden Erfindung zu erreichen, d.h. den biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweg in eine gewünschte Zielpflanze einzuführen oder zu ergänzen, wird die Pflanze mit wenigstens einer Expressionskassette transformiert, die eine transkriptionale Startregion umfaßt, die an ein gewünschtes Gen gebunden ist.
  • Der Transkriptionsstart kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog zu dem Wirt sein. Mit fremd ist beabsichtigt, daß die transkriptionale Startregion nicht in dem Wirt vom Typ "wild" gefunden wird, in die die transkriptionale Startregion eingeführt wird.
  • Von besonderem Interesse sind diese transkriptionalen Startregionen, die mit Vorratsproteinen verbunden sind, wie Glutelin, Patatin, Napin, Cruciferin, β-Conglycinin, Phaseolin oder ähnliche.
  • Die Transkriptionskassette wird in 5'-3'-Richtung der Transkription, eine Transkriptions- und Translationsstartregion, eine gewünschte DNA-Sequenz und eine Transkriptions- und Translationsstoppregion einschließen, die in Pflanzen funktionell ist. Die Stoppregion kann mit der Transkriptionsstartregion nativ sein, kann mit der gewünschten DNA-Sequenz nativ sein oder kann von anderen Quellen abgeleitet sein. Passende Terminationsregionen sind von dem Ti-Plasmid des A. tumefaciens, wie der Octopinsynthase- und den Nopalinsynthaseterminationsregionen (siehe auch Guerineau et al., 1991; Proudfoot, 1991; Sanfacon et al., 1991; Mogen et al., 1990; Munroe et al., 1990; Ballas et al., 1989; Joshi et al., 1987), erhältlich.
  • Größtenteils wird das gewünschte Gen oder werden die gewünschten Gene der vorliegenden Erfindung Plastide, wie Chloroplasten zur Expression als Ziel haben. Auf diese Weise wird die Expressionskassette, wo das gewünschte Gen nicht direkt in das Plastid eingefügt ist, zusätzlich eine Sequenz enthalten, die für ein Transitpeptid codiert, um das gewünschte Gen in das Plastid zu lenken. Derartige Transitpeptide sind in dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Von Heijne et al., 1991; Clark et al., 1989; Della-Cioppa et al., 1987; Romer et al., 1993 und Shah et al., 1986). Jedwede Carotinoid-Stoffwechsel-Gene, die in der Erfindung nützlich sind, können native oder heterologe Transitpeptide verwenden.
  • Das Konstrukt kann auch jede anderen notwendigen Regulatoren, wie Pflanzentranslationskonsensussequenzen (Joshi, 1987), Introns (Luehrsen und Walbot, 1991) und ähnliche einschließen, die operativ an die gewünschte Nukleotidsequenz gebunden sind. Intronsequenzen, in die das gewünschte Gen einzuführen ist, können dessen Expressionsniveau durch Stabilisierung des Transkripts steigern und dessen effektive Translokation außerhalb des Nucleus ermöglichen. Unter solchen bekannten Intronsequenzen befinden sich die Introns des Pflanzenubiquitin-Gens (Cornejo, 1993). Weiterhin wurde herausgefunden, daß dasselbe Konstrukt, das an unterschiedlichen Orten des Genoms eingeführt ist, im Niveau der Expression in Pflanzen variieren kann. Es wird angenommen, daß der Effekt wenigstens teilweise an der Position des Gens auf dem Chromosom begründet ist, d.h. individuelle Isolate werden unterschiedliche Expressionsniveaus haben, (siehe z.B. Hoever et al., 1994). Weitere regulatorische DNA-Sequenzen, die zur Konstruktion von Expressionskassetten verwendet werden können, schließen zum Beispiel Sequenzen ein, die in der Lage sind, die Transkription einer beteiligten DNA-Sequenz in Pflanzengewebe im Sinne der Induktion oder Repression zu regulieren.
  • Diese sind beispielsweise bestimmte Pflanzengene, die bekannt sind, durch verschiedene interne und externe Faktoren, wie Pflanzenhormone, Hitzeschock, Chemikalien, Pathogene, Sauerstoffmangel, Licht, Streß etc., induziert zu werden.
  • Eine weitere Gruppe von DNA-Sequenzen, welche reguliert werden kann, umfaßt chemisch gelenkte Sequenzen, die beispielsweise in den PR(Pathogenese-bezogen)-Proteingenen des Tabaks vorhanden sind und mittels chemischer Regulatoren, wie sie in EP-A-0 332 104 beschrieben sind, induzierbar sind.
  • Sogar eine andere Überlegung in der Expression fremder Gene in Pflanzen ist das Stabilitätsniveau des transgenischen Genoms, d.h. die Tendenz eines fremden Gens, sich von der Population abzusondern. Falls ein selektierbarer Marker an das gewünschte Gen oder die gewünschte Expressionskassette gebunden ist, dann kann die Selektion angewendet werden, um die transgene Pflanze beizubehalten.
  • Es kann vorteilhaft sein, in das Expressionskassettenkonstrukt 5'-Signalsequenzen einzuschließen. Solche Signalsequenzen können bewirken, die Translation zu verstärken. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen ein: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis 5' nicht-codierende Region; Elroy-Stein et al., 1989); Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tobacco Etch-Virus; Allisson et al., 1986); und humanes Immunglobulin, an die schwere Kette bindendes Protein (BiP, Macejak und Sarnow, 1991); nicht-translatierter Leader vom Hüllprotein mRNA des Lucerne-Mosaikvirus (AMV RNA 4; Jobling und Gehrke 1987); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV; Gallie et al., 1989); und Maisfleckvirus-Leader (MCMV; Lommel et al., 1991; siehe auch Della-Cioppa et al., 1987).
  • In Abhängigkeit davon, wo die gewünschte DNA-Sequenz exprimiert werden soll, kann es wünschenswert sein, die Sequenz mit Codons, die von Pflanzen bevorzugt werden, oder alternativ mit Codons, die von Chloroplasten bevorzugt werden, zu synthetisieren. Die Codons, die Pflanzen bevorzugen, können von Codons höchster Frequenz in den Proteinen, die in der höchsten Menge in der besonderen Pflanzenspezies exprimiert werden, bestimmt werden (siehe EP-A-0 359 472; EP-A-0 386 962; WO 91/16432; Perlak et al., 1991 und Murray et al., 1989). Auf diese Weise können die Nukleotidsequenzen zur Expression in jeder Pflanze optimiert werden. Es ist erkannt worden, daß alle oder jeder Teil der Gensequenz optimiert werden kann oder synthetisch sein kann. Daraus folgt, daß synthetische oder teilweise optimierte Sequenzen auch verwendet werden können. Für die Konstruktion von Chloroplasten bevorzugten Genen, siehe USPN 5,545,817.
  • Zur Herstellung der Transkriptionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um sie für die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung zur Verfügung zu stellen, und falls passend, in dem geeigneten Leserahmen zur Verfügung zu stellen. In Richtung dieses Endes können Adapter oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder andere Manipulationen können einbezogen werden, um passende Restriktionsorte zur Verfügung zu stellen, Entfernung überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsorten oder ähnliches. Für diesen Zweck können in vitro-Mutagenese, Primerinstandsetzung, Restriktion, Ausglühen, Resektion, Ligation oder ähnliche verwendet werden, wo Insertionen, Entfernungen oder Substitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen involviert sein können.
  • Die Expressionskassette, die die gewünschten Gene trägt, wird durch Standardmethoden in einen Expressionsvektor plaziert. Die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors wird von der Methode der Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen abhängen. Ein typischer Expressionsvektor enthält: prokaryotische DNA-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsstartpunkt codieren, und ein antibiotisches Resistenzgen, um für das Wachstum und Selektion des Expressionsvektors in dem bakteriellem Wirt zur Verfügung zu stehen; ein Klonierungsort zur Insertion einer exogenen DNA-Sequenz, welche in diesem Kontext für ein spezifisches Enzym oder mehrere spezifische Enzyme des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges codieren würde; eukaryotische DNA-Elemente, die die Initiation der Transkription des exogenen Gens kontrollieren, wie ein Promotor; und DNA-Elemente, die den Prozeßablauf der Transkripte kontrollieren, wie eine Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssequenz. Er kann auch solche Sequenzen enthalten, wie sie für eine eventuelle Integration des Vektors in das Chromosom benötigt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor auch ein Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, wie beispielsweise: Hygromycinphosphotransferase (van den Elzen et al., 1985), welches funktionell an einen Promotor gebunden ist. Zusätzliche Genbeispiele, die antibiotische Resistenz übertragen und daher als auswählbare Marker geeignet sind, schließen diejenigen ein, die für eine Neomycinphosphotransferase-Kanamycinresistenz (Velten et al., 1984) codieren; das Kanamycinresistenzgen (NPTII) ist von Tn5 (Bevan et al., 1983) abgeleitet; das bei Thompson et al. 1987 beschriebene PAT-Gen; und Chloramphenicolacetyltransferase. Zur allgemeinen Beschreibung von Pflanzenexpressionsvektoren und selektierbaren Markergenen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung geeignet sind, siehe Gruber et al. (1993). Wie oben ausgeführt, ist es auch möglich, einen weiteren Selektionsmarker von einer Expressionskassette, die bakterielles crtI umfaßt, wegzulassen, das Genprodukt, von dem gezeigt wurde, daß es die Resistenz auf bleichende Herbizide überträgt. In dieser speziellen Ausführungsform ist bevorzugt, daß crtI unter der Kontrolle eines konstitutiven oder gewebespezifischen Promotors ist. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist crtI durch einen Promotor kontrolliert, der spezifisch und funktionell aktiv in grünen photosynthetisch aktiven Geweben oder Zellen ist.
  • Ein zur Kontrolle der Expression des jeweils gewünschten Gens und des Markergens verwendetes Promotorelement kann jeder pflanzenkompatible Promotor sein. Diese können Pflanzengenpromotoren, wie der Promotor für die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bis-phosphatcarboxylase (RUBISCO), oder Promotoren von Tumor-induzierenden Plasmiden des Agrobacterium tumefaciens, wie die Nopalin-Synthase- und Octopin-Synthaseprotomoren oder virale Promotoren wie die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)19S und 35S Promotoren oder der Feigenkrautmosaikvirus 35S-Promotor. Siehe internationale Patentanmeldung WO 91/19806 als Beispiel für ein Überblick bekannter Pflanzenpromotoren, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
  • "Gewebespezifische" Promotoren stellen zur Verfügung, daß eine Anreicherung eines oder mehrerer dieser Genprodukte in dem Gewebe besonders hoch ist, in dem Produkte des biosynthetischen Carotinoid- oder Xanthophyll-Stoffwechselweges exprimiert werden; irgendeine Expression kann in anderen Teilen der Pflanze vorkommen. Beispiele bekannter gewebespezifischer Promotoren schließen den Glutelin-1-Promotor (Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993), den auf Knollen gerichteten Klasse I-Patatin-Promotor (Bevan et al., 1986); die Promotoren, die von Kartoffelknollen ADPGPP-Genen (Muller et al., 1990) begleitet sind; der Sojabohnenpromotor des β-Conglycins, auch als das 7S-Protein bekannt, das eine auf Samen gerichtete Transkription ausführt (Bray, 1987); und auf Samen gerichtete Promotoren von den Zein-Genen des Maisendosperms (Pedersen et al., 1982). Ein weiterer Promotortyp, der entsprechend der Erfindung verwendet werden kann, ist ein Pflanzenubiquitin-Promotor. Pflanzenubiquitin-Promotoren sind in dem Fachgebiet gutbekannt, wie von Kay et al. (1987), und EP-A-0 342 926 ausgeführt wird. Beispiele bevorzugter chemisch induzierbarer Promotoren, wie der Tabak PR-1a-Promotor, werden detailliert in EP-A-0 332104 erläutert. Eine andere bevorzugte Kategorie von Promotoren ist die, die durch eine Wunde induzierbar ist. Bevorzugte Promotoren dieser Art schließen diejenigen ein, die von Stanford et al. (1989), Xu et al. (1993), Logemann et al. (1989), Rohrmeier & Lehle (1993), Firek et al. (1992) und Warner et al. (1993), beschrieben wurden.
  • Die Pflanzenzellen, die Samen, Gewebe und ganzen Pflanzen, die im Kontext der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, können durch jede der verschiedenen Methoden erhalten werden. Die Fachleute werden schätzen, daß die Auswahl der Verfahren von dem Typ der Pflanze abhängen könnte, d.h. monokot oder dikot, als Ziels zur Transformation ausgewählt. Solche Methoden schließen allgemein einen direkten Gentransfer, chemisch induzierten Gentransfer, Elektroporation, Mikroinjektion (Crossway et al., 1986; Neuhaus et al., 1987), einen Agrobacterium-vermittelten Gentransfer, ballistische Teilchenbeschleunigung unter beispielsweiser Verwendung von Vorrichtungen, die erhältlich sind von Agracetus, Inc. Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (siehe zum Beispiel Sanford et al., US-Patent 4,945,050 und McCabe et al., 1988) und ähnliche.
  • Ein Verfahren, die vorliegenden transformierten Pflanzen oder Teile davon zu erhalten, ist direkter Gentransfer, in welchem Pflanzenzellen kultiviert werden oder anderweitig unter geeigneten Bedingungen in Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden wachsen, die die gewünschte Nukleotidsequenz umfaßt, die in die Pflanze oder einen Teil davon einzuführen ist. Die Donor-DNA-Quelle ist typischerweise ein Plasmid oder ein anderer geeigneter Vektor, der das gewünschte Gen oder die gewünschten Gene enthält. Aus Gründen der Einfachheit wird hierin auf Plasmide mit dem Verständnis Bezug genommen, daß andere geeignete Vektoren, die das gewünschte Gen oder die gewünschten Gene enthalten, auch in Betracht gezogen werden.
  • Jedes geeignete Pflanzengewebe, das das Plasmid aufnimmt, kann mittels direktem Gentransfer behandelt werden. Ein derartiges Pflanzengewebe schließt beispielsweise reproduktive Strukturen bei jedem Stadium der Entwicklung ein, insbesondere vor der Meiose und speziell 1 bis 2 Wochen vor der Meiose. Im allgemeinen werden die prämeiotischen Reproduktivorgane in einer Plasmidlösung gebadet, wie beispielsweise durch Injektion einer Plasmidlösung direkt in die Pflanze oder nahe des Reproduktivorgans. Die Pflanzen sind dann selbstbestäubt oder kreuzweise mit Pollen von einer anderen Pflanze, die in der gleichen Weise behandelt wurde, bestäubt. Die Plasmidlösung enthält typischerweise etwa 10 bis 50 μg DNA in etwa 0,1 bis 10 ml Perfloralstruktur, aber auch mehr oder weniger als dies verwendet werden kann, in Abhängigkeit von der Größe der besonderen Floralstruktur. Das Lösungsmittel ist typischerweise steriles Wasser, Salzlösung oder gepufferte Salzlösung oder ein passendes Pflanzenmedium. Falls gewünscht, kann die Plasmidlösung auch Stoffe enthalten, um chemisch zu induzieren oder die Plasmidaufnahme zu verstärken, wie beispielsweise PEG, Ca2+ oder ähnliche.
  • Nachfolgende Aussetzung der reproduktiven Organe gegenüber dem Plasmid, ist die florale Struktur bis zur Reife gewachsen und die Samen werden geerntet. In Abhängigkeit von dem Plasmidmarker wird die Selektion der transformierten Pflanzen mit dem Markergen durch Keimung oder Wachstum der Pflanzen in einem Marker-sensitiven oder vorzugsweise einem Marker-resistenten Medium vorgenommen. Beispielsweise werden Samen, die von Pflanzen erhalten wurden, die mit Plasmiden behandelt wurden, die das Kanamycin-Resistenzgen haben, grün bleiben, währenddessen solche, ohne dieses Markergen, weiß sind. Anwesenheit der gewünschten Gentranskription von mRNA davon und Expression des Peptids kann weiterhin durch konventionelle Southern-, Northern- und Western-Blot-Techniken demonstriert werden.
  • In einer anderen Methode, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, werden Pflanzenprotoplasten so behandelt, um die Aufnahme des Plasmids zu induzieren. Protoplastenherstellung ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und zieht typischerweise Digerieren von Pflanzenzellen mit Cellulase oder anderen Enzymen für eine ausreichende Zeitperiode nach sich, um die Zellwand zu beseitigen. Typischerweise werden die Protoplasten von dem Aufschlußgemisch durch Sieben und Waschen separiert. Die Protoplasten werden dann in einem geeigneten Medium suspendiert, wie beispielsweise Medium F, CC-Medium, etc., typischerweise bei 104 bis 107 Zellen/ml. Zu dieser Suspension wird dann die oben beschriebene Plasmidlösung und ein Starter, wie Polyethylenglykol, Calcium, Sendai-Virus oder ähnliche hinzugegeben. Alternativ können die Plasmide in Liposomen verkapselt sein. Die Lösung aus Plasmiden und Protoplasten werden dann für eine geeignete Zeitspanne inkubiert, typischerweise etwa eine Stunde bei 25°C. In einigen Beispielen kann es wünschenswert sein, das Gemisch durch kurzes Erhitzen auf etwa 45°C, zum Beispiel für 2 bis 5 Minuten, mit Hitzeschock zu versehen und schnelles Abkühlen auf Inkubationstemperatur. Die behandelten Protoplasten werden dann kloniert und für die Expression des gewünschten Gens oder der gewünschten Gene selektiert, z.B. durch Expression des Markergens und herkömmliche Blot-Techniken. Ganze Pflanzen werden dann in herkömmlicher Weise von den Klonen regeneriert.
  • Die Elektroporationstechnik ist ähnlich, mit der Ausnahme, daß elektrischer Strom typischerweise auf das Gemisch bloßer Plasmide und Protoplasten in einer Elektroporationskammer in Abwesenheit oder Anwesenheit von Polyethylenglykol, Ca2+ oder ähnlichem angewandt wird. Typische Elektroporation schließt 1 bis 10 Pulse von 40 bis 10 000 DC-Volt für eine Dauer von 1 bis 2000 μs mit typischerweise 0,2 Sekunden-Intervallen zwischen den Pulsen ein. Alternierende Strompulse gleicher Stärke können ebenso verwendet werden. Noch typischer wird ein beladener Kondensator durch die Elektroporationskammer entladen, die die Plasmidprotoplastensuspension enthält. Diese Behandlung führt zu einem reversiblen Anwachsen der Durchlässigkeit von Biomembranen und erlaubt daher die Insertion der DNA, entsprechend der Erfindung.
  • Pflanzeprotoplasten mit durch Elektroporese beigebrachten Poren erneuern ihre Zellwand, teilen sich und bilden Kallusgewebe (siehe zum Beispiel Riggs et al., 1986).
  • Ein anderes Verfahren, das zur Transformierung von Zielzellen geeignet ist, schließt die Verwendung von Agrobacterium ein. In diesem Verfahren wird Agrobacterium, das das Plasmid mit dem gewünschten Gen oder der Genkassette enthält, benutzt, um die Pflanzenzellen zu infizieren und das Plasmid in das Genom der Zielzellen einzubringen. Die Zellen, die das gewünschte Gen exprimieren, werden dann selektiert und, wie oben beschrieben, kloniert. Beispielsweise ist eine Methode zur Einführung des gewünschten Gens in ein Zielgewebe, zum Beispiel eine Knolle, eine Wurzelknolle, Korn oder Hülsenfrucht mittels eines Plasmids, zum Beispiel eine Ri-Plasmid und ein Agrobacterium, z.B. A. rhizogenes oder A. tumefaciens, ein kleines rekombinantes Plasmid, das zum Klonieren in Escherichia coli geeignet ist, in das ein Fragment der T-DNA eingespleißt wurde, zu benutzen. Dieses rekombinante Plasmid ist an einer Stelle innerhalb der T-DNA aufgespalten. Ein Stück der "Passenger"-DNA wird in diese Öffnung eingespleißt. Die Passenger-DNA besteht aus dem Gen oder Genen dieser Erfindung, die in die Pflanzen-DNA zu inkorporieren sind, als auch aus einem selektierbaren Marker, beispielsweise einem Gen mit Resistenz gegenüber einem Antibiotikum. Dieses Plasmid wird anschließend in ein größeres Plasmid zurückkloniert und dann in einen Agrobacterium-Stamm eingeführt, der ein unmodifiziertes Ri-Plasmid trägt. Während des Wachstums der Bakterien wird manchmal eine seltene Doppel-Rekombination eintreten, die zu Bakterien führt, deren T-DNA einen Einschub beherbergt: die Passenger-DNA. Derartige Bakterien werden identifiziert und selektiert durch ihr Überleben in Medien, die das Antibiotikum enthalten. Diese Bakterien werden zum Einbringen deren T-DNA (modifiziert mit Passenger-DNA) in ein Pflanzengenom verwendet. Dieses A. rhizogenes oder A. tumefaciens verwendende Verfahren verursacht transformierte Pflanzenzellen, die in gesunden, lebensfähigen Pflanzen regeneriert werden können (siehe z.B. Hinchee et al., 1988).
  • Ein anderer geeigneter Zugang ist das Bombardieren der Zellen mit Mikroprojektilen, die mit der zu transformierenden DNA (Wang et al., 1988) überzogen sind, oder die durch eine DNA beschleunigt werden, die eine Lösung in Richtung auf die Zellen enthält, die durch einen Druckstoß zu transformieren sind und dadurch fein in einem Nebel mit der Lösung als Ergebnis des Druckstoßes dispergiert sind (EP-A-0 434 616).
  • Das Bombardement mit Mikroprojektilen wurde als eine wirkungsvolle Transformationstechnik für Zellen unter Einschluß von Pflanzezellen verbessert. Von Sanford et al. (1987) wurde berichtet, daß ein Bombardement mit Mikroprojektilen wirkungsvoll war, um eine Nukleinsäure in das Cytoplasma von Pflanzenzellen von Allium cepa (Zwiebel) zu bringen. Christou et al. (1988) berichteten über eine stabile Transformation von Sojabohnenkallus mit einem Kanamycin-Resistenzgen mittels eines Bombardements mit Mikroprojektilen. Dieselben Autoren berichteten von einer Penetration bei näherungsweise 0,1% bis 5% der Zellen und fanden wahrnehmbare Niveaus einer NPTII-Enzymaktivität und Resistenz in den transformierten Kalli von bis zu 400 mg/l von Kanamycin. McCabe et al. (1988) berichten von einer stabilen Transformation von Glycin max (Sojabohne) unter Verwendung eines Bombardements mit Mikroprojektilen. Weiterhin berichten McCabe et al. von einem Wiedererlangen einer transformierten R1-Pflanze aus R0-chimärer Pflanze (siehe auch Weissinger et al., 1988; Datta et al., 1990 (Reis); Klein et al., 1988a (Mais); Klein et al., 1988b (Mais); Fromm et al., 1990; und Gordon-Kamm et al., 1990 (Mais).
  • Alternativ kann ein Pflanzenplastid direkt transformiert werden. Eine stabile Transformation von Chloroplasten in höhere Pflanzen wurde berichtet, siehe zum Beispiel SVAB et al. (1990); SVAB und Maliga (1993); Staub und Maliga (1993). Die Methode vertraut auf einer Schrotpartikellieferung einer DNA, die einen selektierbaren Marker enthält und Bestimmung der DNA in bezug auf das Plastidgenom durch homologe Rekombination. In solchen Verfahren kann die Plastidgenexpression durch Verwendung eines Plastidgenpromotors oder durch Transaktivierung eines ruhig gestellten, durch ein Plastid erzeugten Transgens vervollständigt werden, wobei das Transgen zur Expression aus einer selektiven Promotorsequenz, wie von T7 RNA-Polymerase erkannt, positioniert ist. Das ruhige Plastidgen wird durch Expression einer speziellen RNA-Polymerase aus einem Kernexpressionskonstrukt aktiviert und läßt die Polymerase auf das Plastid unter Verwendung eines Transitpeptides zielen. In solch einem Verfahren kann gewebespezifische Expression durch Verwendung einer Kern-codierten und Plastid-gerichteten spezifischen RNA-Polymerase, die von einem geeigneten Pflanzengewebe-spezifischen Promotor exprimiert wird, erhalten werden. Solch ein System wird in McBride et al. (1994) widergegeben.
  • Die oben exemplarisch erwähnte Liste möglicher Transformationsverfahren wird nicht als vollständig beansprucht und ist nicht beabsichtigt, den Erfindungsgegenstand in irgendeiner Weise zu limitieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt daher auch transgenes Pflanzenmaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Protoplasten, Zellen, Kalli, Geweben, Organen, Samen, Embryos, kleinen Eiern, Zygoten etc. besteht und besonders ganzen Pflanzen, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens transformiert wurde und die DNA der Erfindung in exrpressionsfähiger Form umfaßt, und die Verfahren zur Herstellung des genannten transgenen Pflanzenmaterials.
  • Positive Transformaten werden in Pflanzen, regeneriert folgend den Verfahren die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, (siehe z.B. McCormick et al., 1986). Diese Pflanzen können dann gewachsen sein und entweder durch dieselbe transformierte Art oder unterschiedliche Arten bestäubt sein, bevor die Frucht auf Anwesenheit der gewünschten Eigenschaften und/oder das Ausmaß, in welchem die gewünschten Eigenschaften exprimiert sind, bewertet wird und das erhaltende Hybrid, das die gewünschte phänotypische Charakteristik aufweist, identifiziert ist. Eine erste Bewertung kann beispielsweise das Niveau bakterieller/Pilz-Resistenz der transformierten Pflanzen einschließen. Zwei oder mehr Generationen können gewachsen sein, um sicherzustellen, daß die phänotypische Charakteristik des Gegenstandes stabil aufrechterhalten ist und vererbt ist, und dann die Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der gewünschte Phänotyp oder eine andere Eigenschaft erreicht wurde.
  • Weiterhin werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung transgene Pflanzen umfaßt, insbesondere transgene fruchtbare Pflanzen, die mittels des Verfahrens der Erfindung transformiert wurden, sowie deren asexuelle und/oder sexuelle Nachkommenschaft, welche die neue und wünschenswerte Eigenschaft oder Eigenschaften auf Grund der Transformation der Mutterpflanze entfalten.
  • Der Begriff "Nachkommenschaft" wird so verstanden, daß er sowohl "asexuell" und "sexuell" erzeugte Nachkommenschaft transgener Pflanzen umschließt. Diese Definition wird auch verstanden, alle Mutanten und Varianten einzuschließen, die mittels bekannter Verfahren erhältlich sind, wie beispielsweise Zellfusion oder Mutantenselektion und die die charakteristischen Eigenschaften der initial transformierten Pflanze zusammen mit allen Kreuz- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials aufweisen.
  • Pflanzenteile, wie beispielsweise Blumen, Stengel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die in transgenen Pflanzen oder deren Nachkommenschaft, bevor sie mittels der Methode der Erfindung transformiert wurden, ihren Ursprung haben und demzufolge wenigstens zum Teil aus transgenen Zellen bestehen, sind ebenso ein Gegenstand der vorliegende Erfindung.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, beschränken sie jedoch nicht.
  • Hinterlegung des biologischen Materials
  • E. coli-Stämme, die die Expressionskassetten entsprechend der vorliegenden Erfindung tragen, wurden unter dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland, unter den folgenden Eingangs-Nrn. hinterlegt:
    Stamm Eingangs-Nr.
    PRiceCYC TOP10 (Kassette von Plasmid B) DSM 12714
    Pbaal42 TOP10 (Kassette von Plasmid A) DSM 12713
  • Beispiele
  • Einführung von Provitamin A (β-Carotin) und Xanthophyll-Biosynthese in Carotinoid-freiem Reis (Oryza sativa) Endosperm.
  • Phytoenbildung (Burkhardt et al., 1997)
  • Frühere biochemische Untersuchungen unter Verwendung radiomarkierten Isopentenyldiphosphates haben gezeigt, daß Reisendosperm enzymatisch aktive GGPP-Synthase besitzt und daher einen wichtigen Vorläufer für die Carotinoid-Biosynthese zur Verfügung stellt. Demzufolge wurde die Vielfalt des Japonica-Reismodells Taipei 309 durch mikroprojektiles Bombardement mit einer cDNA, die für eine Phytoensynthase aus Narzisse (Narcissus pseudonarcissus; (Eingangs-Nr. X78814, Schledz und Beyer, 1996, Schledz et al., 1996) unter der Kontrolle eines konstitutiven und unter der Kontrolle eines Endosperm-spezifischen Promotors transformiert. In transgenen Reispflanzen wurde das Narzissenenzym durch in vivo-Anreicherung des nicht-gefärbten Carotinphytoens im Reisendosperm als aktiv gezeigt. Daher war zum ersten Mal gezeigt worden, daß es im Prinzip möglich war, den ersten Carotinoid-spezifischen enzymatischen Schritt in der Carotinoid-Biosynthese in einem nicht-photosynthetischen, kein Carotinoid enthaltendem Gewebe einzubauen.
  • Einführung des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges gegen Lycopen, β-Carotin (Provitamin A) und Xanthophyllen in Reisendosperm
  • Plasmidkonstruktion
  • (Für molekularbiologische Standardtechniken, siehe Sambrook et al., 1989. Für eine schematische Darstellung der Konstrukte, siehe 4). Die Strukturgene, die für Carotinoide biosynthetische Enzyme codieren, waren:
    Psy: Phytoensynthase von Narcissus pseudonarcissus (Eingangs-Nr. X78814)
    crtI: Carotindesaturase von Bacterium Erwinia uredovora mit der Transitsequenz der Erbse Rubisco (Misawa et al., 1993) verschmolzen.
    cyc: Lycopencyclase von Nacrissus pseudonarcissus (Eingangs-Nr. X98796).
  • Bildung von pB19hpc (im Text als "Plasmid A" bezeichnet):
  • Ein DNA-Fragment, das das intakte Phytoendesaturase-Gen (crtI) von Erwinia uredovora mit der Transitpeptidsequenz der kleinen Untereinheit der Erbse Rubisco (tp) stromabwärts von dem CaMV35S-Promotor und stromaufwärts von dem Polyadenylierungs-Nr. 3'-Signal trägt, wurde von Misawa et al. (1993) konstruiert und in HindIII/EcoRI wurde digeriertes pUC19 ligiert, um das Plasmid pUCET4 zu erhalten. Die crtI-Expressionskassette wurde aus pUCET4 als ein HindIII/EcoRI-Fragment herausgeschnitten und in pBluescriptKS digiertes HindIII/EcoRI ligiert, das das Plasmid pBaal1 ergab. Das Plasmid pGt1PsyH (Bruckhardt et al., 1997), das eine psy-Expressionskassette, bestehend aus einer Phytoensynthase-cDNA von Narcissus pseudonarcissus (Eingangs-Nr. X78814) unter Kontrolle des Reis-Glutelin 1-Promotors (Gt1: Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993) und dem nos 3'-Polyadenylierungssignal trägt, wurde mit SacII digeriert und stumpf unter Verwendung einer T4-DNA-Polymerase beendet. Um die psy-Expressionskassette zu erhalten, wurde eine zweite Digerierung mit KpnI ausgeführt. Das SacII (abgestumpft)/KpnI-Fragment wurde dann in XhoI (abgestumpft)/KpnI digeriertes pBaal1 ligiert, um das Plasmid pBaal2, das crtI- und psy-Expressionskassetten trägt, zu erhalten.
  • Die Polylinkerorte von pUC18 wurden ersetzt, um die folgenden Restriktionsorte in folgender Reihenfolge zu enthalten: HindIII, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI. Das erhaltene Plasmid pUC18M wurde mit KpnI und NotI digeriert.
  • Eine DNA-Fragment, das die crtI- und psy-Expressionskassetten trägt, wurde von Baal2 unter Verwendung von KpnI und NotI herausgeschnitten und in das oben erwähnte digerierte pUC18M ligiert. Das erhaltene pBaal3-Plasmid enthält die doppelten Expressionskassetten, flankiert durch zwei Meganuklease-Restriktionsorte (I-SeeI).
  • Die Hygromycinphosphotransferase-Gen aphIV-Expressionskassette, enthaltend aphIV unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors und das CaMV35S-Polyadenylierungssignal wurde aus pRice (siehe Konstruktion von Plasmid B) als ein KpnI-Fragment herausgeschnitten und in das mit pBaal3 digerierte KpnI-ligiert. Die erhaltenen Plasmide pBaal42 und pBaal41 enthalten eine Hygromycin-Resistenzkassette in derselben Orientierung wie die psy-Expressionskassette (pBaal42) oder in entgegensetzter Orientierung (pBaal41).
  • Der Vektor pBin19 (Bevan, 1984) wurde mit EcoRI und HindIII digeriert und einer synthetischen Oligonukleotidsequenz, die die folgenden Restriktionsorte in der folgenden Reihenfolge enthält: HindIII, I-SecI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI wurde unter Verwendung eines Standardprotokolls, das für pBin19M zusammengestellt wurde, eingeführt.
  • Die Expressionskassetten von crtI, psy und aphIV wurden aus pBaal42 ausgeschnitten, unter Verwendung der Meganukleaseorte I-secI und in pBin19M nach Digerierung mit I-scI ligiert. Das resultierende Plasmid pBl9hpc wurde dann zur Transformation verwendet.
  • Konstruktion von pZCycH (im Text als "Plasmid B" bezeichnet):
  • Der Glutelin 1-Promotor GtI wurde aus pKS1 (Okita et al., 1989) unter Verwendung von EcoRI/BgIII herausgeschnitten und in pV34Gt1 digeriertes BamHI/MunI (Füttere und Potrykus, unveröffentlicht) zwischen zwei I-SceI-Meganukleaseorte ligiert, um das Plasmid pV34Gt1 zu erhalten. Die Hygromycinphosphotransferase-Gen aphIV-Expressionskassette, die das Polyadenylierungssignal CaMV35S enthält, gefolgt von aphIV unter der Kontrolle eines CaMV35S-Promotors und eines zweiten CaMV35S-Polyadenylierungssignals, danach wurde von pCIB900 (Wünn et al., 1996) herausgeschnitten, unter Verwendung von SaclI und SacI. Nach Ligation eines XhoI-Adapters an den SalI-Ort des erhaltenen Fragmentes, wurde in pV34Gt1 ligiert, um das Plasmid (pRice) zu erhalten. Die Lycopencyclase cyc von Narcissus pseudonarcissus (Eingangs-Nr. X98796) wurde aus dem Plasmid pGEM4CYC (Bonk et al., 1997) unter Verwendung von Ec1136II und BamHI herausgeschnitten. Nach Behandlung mit einem Klenow-Fragment wurde das cyc in digeriertes pRice Ec136II ligiert, um pRiceCYC zu erhalten.
  • Der Vektor pPZP100 (Hajdukiewicz et al., 1994) wurde mit EcoRI und HindIII und einer synthetischen Oligonukleotidsequenz, die die folgenden Restriktionsorte in der folgenden Reihenfolge enthält, digeriert: HindIII, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI wurde unter Verwendung eines Standardprotokolls, das für pPZP100M zusammengestellt wurde, eingeführt.
  • Die cyc aphIV-Doppelkassette wurde aus pRiceCYC unter Verwendung der IsceI-Meganuklease herausgeschnitten und in IsceI digeriertes pPZP100M ligiert, um das Transformationsplasmid pZCycH zu erhalten.
  • Kallusinduktion und Transformation
  • Kallusinduktion: Unreife Samen der Japonica-Reiskultur TP309 im Milchzustand wurden aus Gewächshäuserpflanzen gesammelt, für eine Minute in 70%igem Ethanol (V/V) oberflächensterilisiert, für eine Stunde auf einer Schüttelvorrichtung mit 6%igen Calciumhypochlorid inkubiert und 3- bis 5-mal mit sterilem destilliertem Wasser ausgewaschen. Anschließend wurden unreife Embryos von den sterilisierten Samen unter einem Binokularmikroskop in einer luftstromfreien Bank isoliert und auf einem NB-Medium (N6-Salze und B5-Vitamine, die mit 30 g/l Maltose, 500 mg/l Prolin, 300 mg/l Caseinhydrolat, 500 mg/l Glutamin und 2 mg/l 2,4-D, bei pH 5,8 ergänzt wurden) kultiviert. Nach 4 bis 5 Tagen wurden die Coleooptilen entfernt, und die angeschwollene Skutella wurde für 3 bis 5 Tage auf frischem NB-Medium subkultiviert, bis zu Beimpfung des Agrobacteriums.
  • Agrobacterien vermittelte Transformation: Eine Woche alte vorkultivierte unreife Embryos wurden in einer Agrobacterium tumefaciens LBA4404-Zellsuspension, wie beschrieben, getaucht (Uze et al., 1997). Zur Co-Transformation der zwei getrennten Vektoren pZPsC und pZCycH wurde LBA4404/pZPsC (OD600 = 2,0) mit einem gleichem Volumen aus LBA4404/pZCycH (OD600 = 1,0) nach Acetonspritzeninduktion gemischt und zur Impfung verwendet. Die geimpften vorkultivierten Embryos wurden auf NB-Medium, das mit 200 mMol Acetonsyringon ergänzt wurde, für 3 Tage co-kultiviert, auf Rückgewinnungsmedium (NB mit 250 mg/l Cefotaxim) für eine Woche subkultiviert und dann in das NB-Selektionsmedium in Anwesenheit von 30 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotaxim für 4 bis 6 Wochen überführt. Pflanzen wurden von wiedergewonnenen resistenten Kalli auf NB-Medium, das mit 0,5 mg/l NAA und 3 mg/BAP in 4 Wochen regeneriert, der Wurzelbildung unterzogen und in ein Gewächshaus transferiert.
  • Southern-Blotting
  • Um die Anwesenheit der Transgene zu beweisen, wurden nach Standardmethoden (Sambrook et al. (1989) unter Verwendung der homologen markierten Sonden, die von Phytoensynthase, CrtI und Cyclase abgeleitet sind, Southern-Blots ausgeführt.
  • Carotinoid-Pigmentanalysen
  • Samen (1 g) von R0-Pflanzen wurden geschält und für 8 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit Schleifpapier behandelt, um die Samenschale zu entfernen. Bei Augenscheinbetrachtung zeigten die transformierten Linien eine klar erkennbare gelbliche Färbung, aufgrund der Anwesenheit der Carotinoide. Darüber hinaus war ein Trennungsmuster erkennbar, das in einigen Fällen sehr nahe dem erwarteten Verhältnis 3:1 (Gelb zu Weiß) war.
  • Die Summe der Samen von individuellen Linien (jede 50) wurden unter Verwendung eines Mikrodismembrators (Braun, Melsungen) zu einem feinen Pulver aufgeschlossen. Dieses wurde wiederholt mit Aceton extrahiert, um die Entfärbung zu vervollständigen. Die kombinierten Extrakte wurden unter Stickstoffstrom getrocknet. Der Rest wurde in Chloroform aufgelöst und quantitativ der HPLC-Analyse unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems, das mit einem Photodioden-Blitzdetektor und einer C30-Reversed-Phase-Kolonne (YMC Europe GmbH) ausgestattet war, unterworfen. Eine Trennung wurde unter Verwendung des Lösemittelsystems A durchgeführt: MeOH:tert-Butylmethylether (1:1, V/V), B: MeOH:tert-Butylmethylether:H2O (6:1,2:1,2, V/V) unter Verwendung eines Gradienten 100% B bis 43% B innerhalb von 25 min, anschließend bis zu 0% B innerhalb weiterer 75 min. Diese zuletzt genannten Bedingungen wurden für zusätzliche 10 Minuten vor der Wiedereinstellung des Gleichgewichtes aufrechterhalten. Beispiele für die erhaltenen Ergebnisse sind in 3A für eine untransformierte Kontrolle, in 3B für eine Linie, die nur ein Plasmid A trägt und in 3 für eine Linie, die ein Plasmid A und B trägt, angegeben. Offensichtlich sind die Carotinoide in den Transformanten angereichert. Die Kontrollen wiesen einige Male Spuren von Mengen von Carotinoiden auf, welche zum größten Teil der Samenhülle zugerechnet werden können, die schwierig vollständig zu entfernen sind. Unter den in den transformierten Samen aufgefundenen Carotinoiden stellt das β-Carotin (Provitamin A) das Hauptprodukt (bis zu 60%) dar. Zusätzlich war der Xanthophyll-bildende Stoffwechselweg aktiv, der zur Bildung von Lutein und Zeaxanthin, als auch zu einigen Mengen epoxidierter Carotinoide führte. Es wird angenommen, daß dieser letzte Teil des Stoffwechselweges entweder durch die Transformation oder durch Produkte, die von der Transformation abgeleitet sind, induziert wird. Alternativ ist der Xanthophyll-bildende Stoffwechselweg konstitutiv in dem Reisendosperm exprimiert, der als Ergebnis die Bildung des Xanthophylls Zeaxanthin und Lutein sowie einige zusätzliche geringere Bestandteile, die epoxidierte Xanthophylle darstellen, bringt.
  • Die mit Plasmid A allein transformierten Linien zeigten im Prinzip dasselbe Carotinoid-Muster, jedoch war der Carotinoid-Gehalt im allgemeinen geringer, so daß die obigen Schlußfolgerungen auf Lycopencyclase im Reisendosperm ausgedehnt werden.
  • Insbesondere die Anwesenheit von Lutein und Zeaxanthin werden als ein unerwarteter zusätzlicher Wert aufgrund ihrer positiven Effekte angesehen, z.B. im Erscheinungsbild (siehe z.B. Brown et al., 1998; Schalch, 1992).
  • Offensichtlich sind viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der vorgenannten Lehre möglich. Diese ist daher so zu verstehen, daß innerhalb des Bereiches der beigefügten Patentansprüche die Erfindung auch in anderer Weise, als speziell beschrieben, ausgeführt werden kann.
  • Der Precursor Geranylgeranyldiphosphat kommt ubiquitär im Pflanzenmaterial vor
  • Um die Anwesenheit von GGPP in anderen Geweben als Reis zu testen, wurden die Inkubationsexperimente analog denen, wie sie für Reis-Endosperm beschrieben wurden, mit Endosperm, das aus zwei Laboratoriumsvarietäten von Weizen, zwei Varietäten von Roggen und Cavendish-Bananenfrucht isoliert wurde durchgeführt. Unreife Weizen- und Roggenkörner wurde geschält, das Endosperm wurde ausgequetscht und das Embryo entfernt. Inkubationsexperimente wurden in 100 mM Tris/HCl-Puffer bei pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 3 mM ATP in Anwesenheit von 0,5 μCi [1-14C]Isopentenyldiphosphat für 6 h bei 25°C ausgeführt. Die individuellen Bestimmungen wurden mit alkalischer Phosphatase ergänzt, um die Dephosphorylierung des gebildeten Prenyl-diphosphates zu ermöglichen. Nach 3 bis 6 h wurde lipidlösliches Material einschließlich des korrespondierenden Prenylalkoholes durch Chloroform/Methanol-Extraktion (2/1, V/V) isoliert. Anschließend folgte HPLC-Analyse, wie oben angegeben.
  • In dem Endosperm der geprüften Weizenvarietäten (beide waren essentiell Carotinoid-frei) wurde ein sehr aussagekräftiges Signal beobachtet, welches, unter Verwendung authentischer dephosphorylierter GGPP (hergestellt mit Hilfe rekombinanter GGPP-Synthase aus Sinapis alba) bewies, Geranylgereabiol zu repräsentieren. Daher erschien die Installation durch Transformation einer Provitamin A-Biosynthese in Weizen als ausführbar, wie in Reis. Geringere, aber detektierbare Mengen von GGPP in der Form des korrespondierenden Alkohols wurden in Roggen als ein Ausdruck der Tatsache, daß Roggen-Endosperm einen einigermaßen geringen Hintergrund einer Carotinbildung zeigt, beobachtet. In ähnlicher Weise erzeugt eine Cavendish-Banane Carotinoide, und demzufolge waren die Anwesenheit GGPP-bildender Aktivitäten, die insbesondere in einem reifen Stadium beobachtet wurden, nicht überraschend.
  • CTPA-induzierende Carotinoid-Biosynthesegene
  • Der lang bekannte Lycopencyclaseinhibitor CPTA (2-(4-Chlorphenylthio)triethylaminhydrochlorid) und verwandte Verbindungen (siehe z.B. El-Sayed Osman et al., 1984; Fosket und Radin, 1982) ahmen im Hinblick auf die Lycopenanreicherung die Transformation mit Plasmid A nach. In dem Bestreben einer Hochregulierung der Carotinoid-Biosynthesegene zu demonstrieren, synthetisierten wir eine CPTA, entsprechend der durch Scheutz und Baldwin (1957) zur Verfügung gestellten Methode, und wandten diese Verbindung in einer 1 mM wäßrigen Lösung auf Narzissen an. Dieses photosynthetisch inaktive Gewebe antwortete, wie erwartet, durch Anreicherung von Lycopen. Durch die primäre Wirkung von CPTA (ein Inhibitor!) jedoch unerklärlich, wurde der Carotinoid-Gehalt beinahe verdoppelt. Daher wurden Northern- und Western-Blot-Analysen ausgeführt, um eine mögliche Induktion der Reichhaltigkeit in Transkripten zu demonstrieren, die für biosynthetische Carotinoid-Enzyme codieren oder zur Reichhaltigkeit von Enzymen.
  • 5A gibt die Ergebnisse der Northern-Blots wieder. Die gesamte RNA wurde von unbehandelten Blumen (Linie 1) und CPTA-behandelten Blumen isoliert. Die immobilisierte RNA wurde wiederholt abgestreift, um eine nachfolgende Hybridisierung mit Sonden für Phytoen-Synthase (B), Phytoen-Desaturase (C), ϛ-Carotin-Desaturase und Lycopencyclase zu erlauben. Es ist offenkundig, daß mit Ausnahme der ϛ-Carotin-Desaturase alle spezifischen Carotin-genetischen RNAs, einschließlich der Lycopencyclase in ihrer Reichhaltigkeit gesteigert sind.
  • Für eine Western-Blot-Analyse (siehe 5B) wurde das gesamte Protein von unbehandelten und mit CPTA behandelten Blumen isoliert und, nach erfolgter SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (30 μg Protein per Linie), auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Blots waren die mit Antikörpern, entwickelten die gegen Phytoensynthase (A), Phytoen-Desaturase (B), ϛ-Carotin-Desaturase (C) und Lycopencyclase gerichtet sind. Es ist offenkundig, daß nach einer CPTA-Behandlung bei dem Proteinniveau eine Steigerung in der Enzymreichhaltigkeit Platz greift.
  • Aus dem oben angegebenen Reisdatum schließen wir, daß Carotinoide (oder davon abgeleitete Produkte) genetisch die Bildung von Carotinoiden in einer Art von Feedback-Mechanismus induzieren können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher durch Gentechnik Mittel zur Verfügung, um den biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweg in Carotinoid-freies Gewebe einzuführen, oder die Produktivität von bereits bestehenden biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselwegen zu steigern. Das Verfahren kann zur Verbesserung des Ernährungswertes, der Pharmakologie der visuellen Erscheinung von Samen, einer Frucht, Knollen, Blumen oder Blättern verwendet werden.
  • Die Erfindung ist in erster Linie nützlich zur Verbesserung der Ernähungsbedürfnisse, wo es nicht besonders relevant ist, große Menge von Carotinoiden zu erzeugen. Beispielsweise besteht Reis in seiner gemahlenen Form aus dem Endosperm, das keine detektierbaren gefärbten Carotinoide enthält. Diese sind in der Kornhülle vorhanden, die während der Verarbeitung entfernt wird. Diese Verarbeitung ist notwendig, um eine Langzeitlagerung der Reiskörner zu ermöglichen.
  • Diese Erfindung stellt das erste Beispiel einer De-Novo-Technik eines biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselweges dar, und ist auf andere Gewebe von agronomisch wichtigen Carotinoid-freien Feldfrüchten anwendbar, zum Beispiel auf andere Getreidekörner oder auf Wurzelgewebe, das frei von gefärbten oder ungefärbten Carotinoiden ist. Dies schließt nicht das Vermögen des Verfahrens aus, bereits bestehende Carotinoide zu steigern oder zu modifizieren.
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  • Figure 00470001
  • Figure 00480001

Claims (22)

  1. Verfahren zur Erzeugung von Pflanzenzellen, die Carotinoide anreichern, wobei die Zellen normalerweise carotinoidfrei sind, wobei das Verfahren das Transformieren von Pflanzenmaterial mit einem isolierten DNA-Molekül umfasst, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die folgendes umfasst: (a) eine Expressionskassette, die die Erzeugung einer aus einer Pflanze stammenden Phytoensynthase in den Zellen ausrichten kann; und (b) eine Expressionskassette, die die Erzeugung einer aus einem Bakterium stammenden Phytoendesaturase in den Zellen ausrichten kann.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Phytoendesaturase das CrtI-Gen von Erwinia uredovora ist.
  3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–2, worin die Phytoendesaturase mit einem geeigneten Plastiden-Transitpeptid fusioniert ist.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, worin die Phytoendesaturase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder konstitutiven Promotors exprimiert wird.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Phytoendesaturase unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors exprimiert wird.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, worin die Phytoensynthase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimiert wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die Phytoensynthase aus Narcissus pseudonarcissus stammt.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, worin die DNA ferner ein Polynukleotid umfasst, das einen selektierbaren Marker vorsieht.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–8, worin das Pflanzenmaterial über ein Agrobacterium transformiert wird, das die DNA umfasst.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–9, worin die Pflanzenzelle eine Reis-Pflanzenzelle ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–10, worin die Zelle eine Endospermzelle ist.
  12. Transformierte Pflanzenzelle, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–11 erhältlich ist.
  13. Pflanzenzelle gemäß Anspruch 12, die eine Reis-Endospermzelle ist.
  14. Isoliertes DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die folgendes umfasst: (a) eine Expressionskassette, die die Erzeugung einer aus einer Pflanze stammenden Phytoensynthase in einer Pflanzenzelle ausrichten kann, wobei die Zelle normalerweise carotinoidfrei ist; und (b) eine Expressionskassette, die die Erzeugung einer aus einem Bakterium stammenden Phytoendesaturase in der Zelle ausrichten kann.
  15. DNA gemäß Anspruch 14, worin die Phytoendesaturase das CrtI-Gen von Erwinia uredovora ist.
  16. DNA gemäß einem der Ansprüche 14–15, worin die Phytoendesaturase mit einem geeigneten Plastiden-Transitpeptid fusioniert ist.
  17. DNA gemäß einem der Ansprüche 14–16, worin die Phytoendesaturase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder konstitutiven Promotors exprimiert wird.
  18. DNA gemäß Anspruch 17, worin die Phytoendesaturase unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors exprimiert wird.
  19. DNA gemäß einem der Ansprüche 14–18, worin die Phytoensynthase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimiert wird.
  20. DNA gemäß Anspruch 19, worin die Phytoensynthase aus Narcissus pseudonarcissus stammt.
  21. DNA gemäß einem der Ansprüche 14–20, worin die DNA ferner ein Polynukleotid umfasst, das einen selektierbaren Marker vorsieht.
  22. DNA gemäß einem der Ansprüche 14–21, worin die Nukleotidsequenz zur Expression in einer Pflanze optimiert ist.
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