DE10220574A1 - Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren mit coryneformen Bakterien unter Verwendung von Phosphoglucose-Isomerasen aus coryneformen Bakterien - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren mit coryneformen Bakterien unter Verwendung von Phosphoglucose-Isomerasen aus coryneformen BakterienInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus coryneformen Bakterien, coryneforme Bakterien, die diese Proteine enthalten und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung dieser Proteine.
Description
- Die Erfindung betrifft Proteine mit Phosphoglucose- Isomerase Aktivität aus coryneformen Bakterien, coryneforme Bakterien, die diese Proteine enthalten und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung dieser Proteine.
- Stand der Technik
- L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
- Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
- Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. Lysin- Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.
- Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene verstärkt oder abschwächt und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.
- Die Nukleotidsequenz des Chromosoms von Corynebacterium glutamicum gehört zum Stand der Technik und ist beispielsweise im Rahmen der EP-A-1108790 und der WO 01/00844 veröffentlicht worden.
- Untersuchungen zum pgi-Gen und dem von diesem Gen kodiertem Enzym Phosphoglucose-Isomerase sind in der EP-A-1087015 und in der WO 01/07626 beschrieben.
- Aufgabe der Erfindung ist es, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
- Beschreibung der Erfindung
- Gegenstand der Erfindung sind Proteine mit Phosphoglucose- Isomerase Aktivität aus coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, gekennzeichnet durch eine Länge von 585 Aminosäureresten, wobei der N- Terminus gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46 Aminosäurereste verkürzt ist, und Nukleotidsequenzen, die die genannten Proteine kodieren.
- Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, gekennzeichnet durch eine Länge von 585 Aminosäureresten, wobei der N-Terminus gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46 Aminosäurereste verkürzt ist und wobei der C-Terminus eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 2 entsprechend Position 47 bis 585, SEQ ID NO: 4 entsprechend Position 47 bis 585 und SEQ ID NO: 6 entsprechend Position 47 bis 585 besitzt und Nukleotidsequenzen, die die genannten Proteine kodieren.
- Gegenstand der Erfindung sind schließlich Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2 entsprechend Position 2 bis 585, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4 entsprechend Position 2 bis 585, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 6 entsprechend Position 2 bis 585 und Nukleotidsequenzen, die die genannten Proteine kodieren dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 einschließlich der Varianten, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben.
- Nukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität kodieren, können auch als pgi-Gene oder -Allele bezeichnet werden.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind coryneforme Bakterien in denen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität verstärkt oder abgeschwächt vorliegen, wobei die genannten Proteine durch eine Länge von 585 Aminosäureresten gekennzeichnet sind, und wobei der N- Terminus der genannten Proteine gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46 Aminosäurereste verkürzt ist.
- Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- Der Begriff "Abschwächung" bzw. "Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym bzw. Protein oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung einer oder mehrere L-Aminosäuren, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe L-Lysin, L-Valin, L- Threonin und L-Methionin, mit coryneformen Bakterien, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Verstärkung von Proteinen mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität in den coryneformen Bakterien,
- b) Fermentation der in Schritt a) erhaltenen Bakterien,
- c) Anreicherung der Aminosäuren im Medium bzw. in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Bakterien, und
- d) Isolierung der Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben,
- Eine Verstärkung der genannten Proteine mit Phosphoglucose- Isomerase Aktivität, wird bevorzugt dann eingesetzt, wenn die zu produzierende Aminosäure im Rahmen ihrer Biosynthese einen hohen NADPH-Verbrauch hat. Dies ist beispielsweise bei den Aminosäuren L-Lysin, L-Valin, L-Threonin und L- Methionin der Fall.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung einer oder mehrer L- Aminosäuren, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe L- Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Tyrosin, mit coryneformen Bakterien, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Abschwächung von Proteinen mit Phosphoglucose- Isomerase Aktivität in den coryneformen Bakterien,
- b) Fermentation der in Schritt a) erhaltenen Bakterien,
- c) Anreicherung der Aminosäuren im Medium bzw. in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Bakterien, und
- d) Isolierung der Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben,
- Eine Abschwächung der genannten Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität, wird bevorzugt dann eingesetzt, wenn ein Metabolit des Pentosephosphatzyklus eine Vorstufe der zu produzierende Aminosäure ist. So ist beispielsweise Erythrose-4-Phosphat ein Metabolit des Pentosephosphatzyklus und eine Vorstufe der aromatischen Aminosäuren L-Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Tyrosin. Zusammenfassende Darstellungen zu den Stoffwechselreaktionen und Metaboliten des Pentosephosphatzyklus findet man in Lehrbüchern der Mikrobiologie und Biochemie wie beispielsweise dem Lehrbuch von G. Gottschalk "Bacterial Metabolism" (2nd ed., Springer-Verlag, New York, USA, 1986).
- Die eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Verstärkung oder Abschwächung der erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität L-Aminosäuren.
- Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin oder Ethanol oder aus Essigsäure oder Milchsäure herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
- Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464,
Corynebacterium glutamicum DSM 5715,
Corynebacterium glutamicum DM58-1 und
Corynebacterium glutamicum DSM12866
oder wie beispielsweise die L-Tryptophan produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC21850 und
Corynebacterium glutamicum KY9218(pKW9901). - Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung gelang es Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität in Corynebacterium glutamicum zu identifizieren, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 dargestellt sind. Durch wirtseigene Enzyme sogenannte Peptidasen können N-terminale Aminosäuren abgespalten werden. Ein bekanntes Enzym ist die Aminopeptidase, die das N-terminale Methionin abspaltet.
- Weiterhin wurde bei Lysin produzierenden coryneformen Bakterien gefunden, dass eine Verbesserung der Lysin- Produktion erzielt werden kann, wenn die erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität verstärkt werden.
- Zur Erzielung einer Verstärkung können entweder die Expression oder die katalytischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteine erhöht werden. Gegebenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.
- Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
- Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
- Eine gebräuchliche Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht in der Verwendung von episomalen Plasmiden. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
- Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"- Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
- Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression oder die katalytischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteine verringert werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.
- Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pätek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990). Methoden der "anti sense" RNA-Technik können ebenfalls angewendet werden.
- Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").
- Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
- Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
- Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung oder Abschwächung der erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität bzw. der für sie kodierenden Gene bzw. Nukleotidsequenzen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
- Die Verwendung endogener Gene bzw. endogenen Nukleotidsequenzen wird bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
- So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zur Verstärkung der erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für das Lysin-Exportprotein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (WO 99/18228, US-A-6,171,833)
- - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende Gen gdh (US-A-6,355,454),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), und
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (EP-A-1111062),
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung der erfindungsgemäßen Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für das Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1 (WO 02/18419),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP-A-1094111),
- - das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989); ACCESSION Number X17313),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (EP-A-1106693),
- Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen.
- Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ainmoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190-1206) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. SEQUENCE LISTING
Claims (14)
1. Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus
coryneformen Bakterien gekennzeichnet durch eine Länge
von 585 Aminosäureresten, wobei der N-Terminus
gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis
36 oder 37 bis 46 Aminosäurereste verkürzt ist.
2. Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus
coryneformen Bakterien gekennzeichnet durch eine Länge
von 585 Aminosäureresten, wobei der N-Terminus
gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis
36 oder 37 bis 46 Aminosäurereste verkürzt ist und
wobei der C-Terminus eine Aminosäuresequenz ausgewählt
aus der Gruppe SEQ ID NO: 2 entsprechend Position 47
bis 585, SEQ ID NO: 4 entsprechend Position 47 bis 585
und SEQ ID NO: 6 entsprechend Position 47 bis 585
besitzt.
3. Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus
coryneformen Bakterien mit einer Aminosäuresequenz
ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2
entsprechend Position 2 bis 585, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 4 entsprechend Position 2 bis 585, SEQ ID NO: 6 und
SEQ ID NO: 6 entsprechend Position 2 bis 585.
4. Proteine mit Phosphoglucose-Isomerase Aktivität aus
coryneformen Bakterien gemäß Anspruch 1, 2 oder 3
dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den
coryneformen Bakterien um Corynebacterium glutamicum
handelt.
5. Nukleotidsequenzen die für die Proteine gemäß Anspruch
1, 2 oder 3 kodieren.
6. Coryneforme Bakterien in denen Proteine mit
Phosphoglucose-Isomerase Aktivität verstärkt oder
abgeschwächt vorliegen, wobei die genannten Proteine
durch eine Länge von 585 Aminosäureresten
gekennzeichnet sind, und wobei der N-Terminus der
genannten Proteine gegebenenfalls um 1 bis 2, 3 bis
17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46
Aminosäurereste verkürzt ist.
7. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 6 dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei den coryneformen
Bakterien um Corynebacterium glutamicum handelt.
8. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere mit coryneformen Bakterien, das durch
folgende Schritte gekennzeichnet ist:
wobei die genannten Proteine durch eine Länge von 585
Aminosäureresten gekennzeichnet sind, und wobei der N-
Terminus der genannten Proteine gegebenenfalls um 1
bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46
Aminosäurereste verkürzt ist.
a) Verstärkung von Proteinen mit Phosphoglucose-
Isomerase Aktivität in den coryneformen Bakterien,
b) Fermentation der in Schritt a) erhaltenen
Bakterien,
c) Anreicherung der Aminosäuren im Medium bzw. in der
Fermentationsbrühe oder in den Zellen der
Bakterien, und
d) Isolierung der Aminosäuren, wobei gegebenenfalls
Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die
Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0
bis 100%) davon im Produkt verbleiben,
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei den coryneformen Bakterien um
Corynebacterium glutamicum handelt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei den Aminosäuren um eine oder mehrere
Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Lysin, L-
Valin, L-Threonin und L-Methionin, handelt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei den Aminosäuren um L-Lysin handelt.
12. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere mit coryneformen Bakterien, das durch
folgende Schritte gekennzeichnet ist:
wobei die genannten Proteine durch eine Länge von 585
Aminosäureresten gekennzeichnet sind, und wobei der N-
Terminus der genannten Proteine gegebenenfalls um 1
bis 2, 3 bis 17, 18 bis 21, 22 bis 36 oder 37 bis 46
Aminosäurereste verkürzt ist.
a) Abschwächung von Proteinen mit Phosphoglucose-
Isomerase Aktivität in den coryneformen Bakterien,
b) Fermentation der in Schritt a) erhaltenen
Bakterien,
c) Anreicherung der Aminosäuren im Medium bzw. in
der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der
Bakterien, und
d) Isolierung der Aminosäuren, wobei gegebenenfalls
Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die
Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0
bis 100%) davon im Produkt verbleiben,
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei den coryneformen Bakterien um
Corynebacterium glutamicum handelt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei den Aminosäuren um eine oder mehrere
Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Tryptophan,
L-Phenylalanin und L-Tyrosin, handelt.
Priority Applications (3)
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| DE10220574A DE10220574A1 (de) | 2002-05-08 | 2002-05-08 | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren mit coryneformen Bakterien unter Verwendung von Phosphoglucose-Isomerasen aus coryneformen Bakterien |
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