DE1021130B

DE1021130B - Herstellung von Foromacidinen

Info

Publication number: DE1021130B
Application number: DE1956C0012936
Authority: DE
Inventors: Dr Ernst Gaeumann; Dr Vladimir Prelog
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1955-05-10
Filing date: 1956-04-25
Publication date: 1957-12-19
Also published as: FR1218406A

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft die Herstellung von vier neuen kristallinen Antibiotika, die im folgenden »Foromacidin A«, »Foromacidin B«, »Foromacidin C« und »Foromacidin Ό« genannt werden, ihren Salzen, Gemischen der freien Verbindungen und der Salze, Hydrierungs- und Spaltprodukten der genannten Antibiotika.

Die Foromacidine sind optisch aktive Basen, die farblose Kristalle bilden. Sie sind unter sich sehr nahe verwandt, unterscheiden sich aber durch ihre Polarität. Ihre wichtigsten Eigenschaften sind in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt.

Im Infrarot-Spektrum zeigen Foromacidin A, B, C und D Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen :

Foromacidin A, in Nujol suspendiert: bei 2,88 μ, 3,42 μ, 3,51 μ, 5,68 μ, 5,76 μ, 5,91 μ, 6,15 μ, 6,80 μ, 7,24 μ, 8,54 μ, 8,89 μ, 9,46 μ, 9,80 μ, 10,02 μ, 10,97 μ und 11,79 μ.

Foromacidin A, in Kaliumbromid: bei 2,86 μ, 3,42 μ, 3,60 μ, 5,79 μ, 5,82 μ, 6,84 μ, 7,05 μ, 7,22 μ, 7,55 μ, ₂ο 7,75 μ, 8,02 μ, 8,53 μ, 8,85 μ, 9,44 μ, 9,78 μ, 10,04 μ, 10,98 μ, 11,80 μ, 12,32 μ und 12,70 μ.

Foromacidin B, in Kaliumbromid: bei 2,86 μ, 3,42 μ, 3,63 μ, 5,78 μ, 6,85 μ, 7,06 μ, 7,24 μ, 7,66 μ, 7,82 μ, 8,06 μ, 8,54 μ, 8,86 μ, 9,44 μ, 9,76 μ, 9,98 μ, 10,96 μ, a₅ 11,58 μ, 11,82 μ, 12,28 μ und 12,68 μ.

Foromacidin C, in Kaliumbromid: bei 2,88 μ, 3,42 μ, 5,77 μ, 6,86 μ, 7,24 μ, 7,68 μ, 7,82 μ, 8,04 μ, 8,59 μ, Herstellung von Foromacidinen

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 10. Mai, 22. November 1S65 und 23. Januar 1956

Dr. Ernst Gäumann und Dr. Vladimir Prelog,

Zürich (Schweiz), sind als Erfinder genannt worden

8,90 μ, 10,02 μ, 10,98 μ, 11,56 μ, 11,84 μ, 12,30 μ und 12,74 μ.

Foromacidin D, in Kaliumbromid: bei 2,90 μ, 3,45 μ, 5,82 μ, 6,10 μ, 6,86 μ, 7,08 μ, 7,25 μ, 7,32 μ, 8,05 μ, 8,66 μ, 8,88 μ, 9,46 μ, 9,82 μ, 10,05 μ, 11,05 μ, 11,50 μ, 11,82 μ, 12,30 μ, 12,72 μ und 14,00 μ.

Durch Behandlung der Foromacidine A, B, C und D mit Hydrierungsmitteln können die entsprechenden

Foromacidin B I C

Schmelzpunkt

in Chloroform ,

in Methanol

UV-Absorption: λ max

Analyse

C

H

N

OCH₃

(N)CH₃

(QCH₃

akt. H

Äqu.-Gewicht (Titration)

Summenformel

Molekulargewicht

134 bis 138°

— 56°

— 81° 231 ΐημ

60,72 % 9,32% 3,22% 3,78% 6,28% 8,18% 0,68%

458 QbH₇₈O₁₅N₂

887 bis 132°

— 61°

— 83°
231 ΐημ

60,38%
8,99 %
2,97 %
3,69 %
5,14%
8,48%
0,54 %

467
C₄₇H₈₀O₁₆N₂

929

124 bis 128°

— 62°

— 79° 231 ΐημ

61,18% 8,66% 2,96% 3,62 % 5,43% 8,96% 0,46%

478 QeH₈₂O₁₆JS₂

943

135 bis 140°

— 231 πιμ

59,85% 8,48% 3,35%

452

709 810/312

Hydro verbindungen, wie ζ. B. die Tetrahydro- und Hexahydro-foromacidine, erhalten werden, die antibiotisch wirksam sind, insbesondere die Tetrahydroderivate. Die Hydrierung erfolgt vorzugsweise katalytisch, z. B. unter Verwendung von Palladium- oder Platinkatalysatoren.

Werden die Foromacidine einer Hydrolyse unterworfen, so erhält man, je nach den verwendeten hydrolysierenden Mitteln, verschiedene Spaltprodukte.

Bei saurer Hydrolyse, insbesondere unter milden Bedingungen, wie z. B. bei der Behandlung mit verdünnten Mineralsäuren, wie Salzsäure bei Zimmertemperatur, zerfallen die Foromacidine einerseits in folgende, wasserlösliche Komponenten:

1. Eine neutrale Verbindung C₇H₁₄O₄ vom F. = 126,5 bis 127,5°, die mit der bei der Hydrolyse von Carbomycin erhaltenen Mycarose identisch ist (P. P. Regna et al., J. Amer. Chem. Soc, 75, S. 4625 [1953]);

2. einen Dimethylamino-Zucker, der sich papierchromatographisch vom Desosamin, das aus Erythromycin, Pikromycin oder Narbomycin erhalten wird, deutlich unterscheidet.

Weiter erhält man bei der sauren Hydrolyse aus den Foromacidinen lipophile, kristalline Spaltprodukte, die im folgenden »Forocidine« genannt werden, d. h. aus dem Foromacidin A das »Forocidin A« und aus den Foromacidinen B, C bzw. D die "Forocidine B, C bzw. D«. Die Forocidine sind optisch aktive Basen, die sich leicht papierchromatographisch sowohl von den entsprechenden Foromacidinen als auch untereinander unterscheiden lassen. Ihre wichtigsten Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

	Forocidm	^c
A	B I	217,5°
	227 bis-231" j	-7°
	-6^C :	232 πιμ
232 ηαμ	232 mμ \	665
	633	ο·> -tic 7 vJ-\|o ΪΝ Oo α ι la
C₃₀H₅₃O₁₁N	C₃₂H₅₅O₁₂N C

Schmelzpunkt

[o]d in Alkohol

U V-Absorption: Λ max ..
Äqu.-Gewicht (Titration)
Summenformel

232 ηιμ

Im Infrarotspektrum zeigen sie Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen:

ForocidinB: bei 2,93 μ, 3,42 μ, 5,78 μ, 6,13 μ, 6,86 μ, 7,25 μ, 7,65 μ, 8,05 μ, 8,51 μ, 8,84 μ, 9,16 μ, 9,34 μ, 10,00 μ, 10,58 μ, 11,60 μ und 12,73 μ.

ForocidinC: bei 2,93 μ, 3,42 μ, 5,77 μ, 6,13 μ, 6,86 μ, 4<> 7,24 μ, 7,44 μ, 7,63 μ, 7,82 μ, 8,10 μ, 8,35 μ, 8,54 μ, 8,85 μ, 9,22μ, 9,43μ, 9,93μ, 10,50μ, 11,24μ, 11,50μ, 11,90μ und 12,33 μ.

Bei der alkalischen Hydrolyse der Foromacidine, beispielsweise bei der Behandlung mit verdünnter Natronlauge, entstehen neben Dimethylamin etwa 0,3 Mol Ameisensäure. Weiter konnten bei der alkalischen Hydrolyse von Foromacidin B 1 Mol Essigsäure und bei der Hydrolyse von Foromacidin C 1 Mol Propionsäure nachgewiesen werden. Die Forocidine B bzw. C spalten bei der alkalischen Hydrolyse ebenfalls je 1 Mol Essigsäure bzw. Propionsäure ab.

Die Salze der Foromacidine, der Tetrahydro- und Hexahydro-foromacidine und der Forocidine leiten sich von den bekannten anorganischen oder organischen Säuren ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Citronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Foromacidinsulfat mit pantothensaurem Natrium.

Die Foromacidine A, B, C und D besitzen hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Test-Organismen in vitro. Verwendet man als Testmethode Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° bebrütet worden sind, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :

Testorganismen

Streptococcus mitis

Streptococcus pyogenes

Streptococcus faecalis

Micrococcus pyogenes var. aureus Micrococcus pyogenes var. aureus,

Penicillin-resistent

Corynebacterium diphtheriae .... Bacillus megatherium

Hemmende

Konzentratio η

/ig/ml

0,01

0,1

10 1 1

Die Foromacidine sind weiter wirksam in einer Konzentration von 1 mg/cm³ gegenüber folgenden Mikroorganismen :

Escherichia coli, Salmonella typhosa, Klebsiella pneumoniae (Typ A), Pasteurella pestis und Vibrio comma (El Tor). Unempfindlich gegenüber 1 mg Foromacidin/ cm³ zeigen sich Salmonella schottmuelleri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv), Candida tropicalis und Candida albicans.

In vivo sind die Foromacidine ebenfalls hoch aktiv. Bei Applikation an mit Streptococcus pyogenes infizierten Mäusen werden mit 4 · 25 mg/kg und mit 5 · 10 mg/kg s. c. 100 °/₀ Überlebende, mit 5 · 1 mg/kg s.c. 75°/₀ Überlebende und mit 9-50 mg/kg peroral 100 °/₀ Überlebende und mit 9 ■ 25 mg/kg peroral 75 °/₀ Überlebende festgestellt.

Weiter werden 100% Überlebende festgestellt, wenn Mäusen, die mit Micrococcus pyogenes var. aureus oder Diplococcus pneumoniae, Typ III, infiziert sind, 5 ■ 50 mg/kg s. c. appliziert werden. Eine Dosis von

9 · 200 mg/kg s. c. hat den gleichen Effekt bei Mäusen, die mit Pasteurella avicida infiziert sind.

Bei subkutaner Applikation von 20 mg/kg oder peroraler Applikation von 100 mg/kg an Mäusen, die mit Borrelia recurrentis infiziert sind, werden 100 % Überlebende festgestellt.

Bei amöbeninfizierten Ratten liegt die minimal effektive Dosis bei 50 mg/kg peroral. Weiter läßt sich die Pl. berghei-Infektion der Maus mit den Foromacidinen leicht beeinflussen.

Die Toxizität der Foromacidine ist gering: 100 mg/kg einmal subkutan injiziert, werden von Mäusen ohne Anzeichen irgendeiner Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden bisher nicht geprüft.

In Gewebskulturen von Hühnerfibroblasten zeigen die Foromacidine in Konzentrationen bis zu 10 μg/cm³ eine gewisse cytostatische Wirkung.

Penicillin-resistente Mikroorganismen sind foromacidinempfindlich. Mit Pikromycin weisen die Foromacidine eine partiell gekreuzte Resistenz auf, d. h. ein auf Resistenz gegen Pikromycin gezüchteter Stamm Micrococcus pyogenes var. aureus wird nicht unempfindlich gegenüber den Foromacidinen, aber doch deutlich weniger empfindlich als sein Mutterstamm.

Die Tetrahydro-foromacidine ebenfalls besitzen hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen in vitro und in vivo. So ergeben sie in oben beschriebenem Verdünnungstest die folgenden noch hemmenden Konzentrationen:

30

20

	Hemmende
Testorganismen	Konzentration
Streptococcus mitis	<1
Streptococcus pyogenes	< 1
Streptococcus faecalis	< 1
Micrococcus pyogenes var. aureus ...	10
Micrococcus pyogenes var. aureus,
Penicillin-resistent	10
Corynebacterium diphtheriae	<1
Bacillus megatherium	<1

Die Forocidine A, B, C und D besitzen gleich wie die Foromacidine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen in vitro und in vivo. Verwendet man als In-vitro-Testmethode Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während

24 Stunden bei 37° bebrütet worden sind, so ergeben 5° bei A 9427 gelbrot, sich z. B. für Forocidin C folgende noch hemmende 7. Gelatinestich bei

Konzentrationen:

sammelt wurden. Die beiden Organismen sind mit keiner der in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage, oder in »Actinomycetes and their Antibiotics« von Waksman und Lechevalier (1953), aufgeführten Arten identisch. Deshalb werden sie hier ausführlich beschrieben und als Stamm A 8703 und A 9427 bezeichnet. Sie werden in den Laboratorien des Erfinders und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter den obigen ίο Bezeichnungen aufbewahrt. Bei den beiden Stämmen handelt es sich um Streptomyceten mit den für diese Gattung charakteristischen Konidienketten. Ihre Sporen sind glatt, und sie bilden auf fast allen Nährmedien ein weißgelbes bis goldgelbes Substratmycel; das Luftmycel ist sammetig, anfänglich weiß, später grau. Spiralen sind bei A 8703 selten, bei A 9427 häufig.

Zur weiteren Kennzeichnung wird im folgenden das Wachstum von A 8703 und A 9427 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 8 sowie 12 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt:

1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, am Anfang graugelb, nachher hellgelbrot und stellenweise dunkelbraun. Luftmycel sammetig, grauweiß nach 3 Tagen, nach 13 Tagen bei A 8703 aschgrau mit helleren Tupfen, bei A 9427 gleichmäßig aschgrau. Lösliches Pigment fehlend bei A 8703, schwachrötlichgrau bei A 9427.

2. Synthetische Lösung: Sediment und Flocken, milchweiß; kein Pigment. Dazu bei A 9427 Pellikel nach 24 Tagen, mit weißem Luftmycel.

3. Glucosebrühe: Braune Flocken und oberflächliches Wachstum, pusteliges Luftmycel bleigrau bis aschgrau. Bildet kein Pigment.

4. Glucoseagar: Substratmycel runzelig, nach 3 Tagen goldgelb, nach 7 Tagen hellbraun; Luftmycel sammetig, milchweiß nach 3 Tagen, aschgrau nach 7 Tagen. Bildet ein schwaches hellbraunes Pigment.

5. Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum schleier artig, weißgrau bis grünlichgrau; Luftmycel sammetig; grünlichgrau nach 3 Tagen, nach 7 Tagen bei A 8703 aschgrau mit einem Stich ins Grüne und mit weißlichen Tupfen und bei A 9427 einheitlich lauchgrün. Keine Pigmentbildung.

6. Ca-malat-Agar: Substratmycel dünn, schleierartig, bei A 8703 weißgelb bis grau, bei A 9427 rötlichgelb bis rötlichgrau; Luftmycel staubig, weißgrau nach 3 Tagen, nach 7 Tagen bei A 8703 aschgrau, bei A 9427 stellenweise blaugrün; Substrat bei A 8703 nicht gefärbt,

35

Testorganismen

Streptococcus mitis

Streptococcus pyogenes

Streptococcus faecalis

Micrococcus pyogenes var. aureus
Micrococcus pyogenes var. aureus,

Penicillin-resistent

Corynebacterium diphtheriae ....

Hemmende

Konzentration

μg/ml

10

100

100
100
100

Bacillus megatherium

Die neuen Antibiotika entstehen bei der Kultur zweier Aktinomycetenstämme der Gattung Streptomyces. Diese wurden aus Bodenproben isoliert, die in Rom im Forum Romanum bzw. im Malcantone, Kanton Tessin, ge- 7° kein deutliches. Pigment.

18°: Oberflächliches Wachstum,

Pellikel bei A 8703 braun bis bleigrau, bei A 9427 erst weißgrau, dann rosa; Luftmycel staubig, bei A 8703 kreideweiß, bei A 9427 weißgrau bis aschgrau; Verflüssigung langsam, nach 16 Tagen beginnend, nach 36 Tagen bei A 8703 0,7 bis 1 cm, bei A 9427 1 bis 1,2 cm; Substrat kaum gefärbt.

8. Stärkeplatte: Wachstum dünn, bei A8703 rötlichgrau, bei A 9427 braun; Luftmycel sammetig, bei A 8703 gleichmäßig aschgrau, bei A 9427 aschgrau mit weißen Tupfen. Stärke schwach hydrolysiert (0,3 cm nach 4 Tagen).

9. Nähragar (hergestellt aus 10 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 5 g NaCl, 17 g Agar, 11 Wasser, p_H 7,2). Wachstum dünn, glatt, hellgelb; kein Luftmycel nach 13 Tagen. Substrat nicht gefärbt.

10. Kartoffel: Substratmycel flechtenartig, bei A 8703 hellgelb, bei A 9427 erst sattgelb, nach 10 Tagen rotgelb; Luftmycel zuerst spärlich, dann staubig bleigrau. Bildet

60

11. Karotte: Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb; Luftmycel sammetig, erst weißgrau, nach 7 Tagen bei A 8703 aschgrau, bei A 9427 grüngrau. Keine Exopigmentbildung.

12. Lackmusmüch (Difco No. B 107): Oberflächliches Wachstum, mit aschgrauem Luftmycel; Gerinnung und Peptonisierung deutlich nach 7 Tagen, Lackmus bei A 8703 schwachrot, bei A 9427 blau.

Die Stämme A 8703 und A 9427 weisen einige Ähn-

Streptomycetenstamm, z. B. in wäßriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls Kohlehydrate enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Foromacidin hierauf aus dem Kulturfiltrat isoliert.

Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan.

lichkeit mit Streptomyces griseoluteus Umezawa und io An stickstoffhaltigen Verbindungen und gegebenenfalls Mitarbeiter auf, sie wachsen aber gut auf Gelatine; eben- zuzusetzenden Kohlehydraten und wachstumsfördernden falls gleichen sie Streptomyces griseolus (Waksman) Stoffen seien z. B. genannt; Aminosäuren und ihre Waksman et Henrici, aber ihr Luftmycel ist nicht von Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate Anfang an grau, und sie zeigen auch andere Reaktionen wie Pepton und Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche auf Much. Streptomyces flavogriseus (Duche) Waksman 15 Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von et Lechevalier unterscheidet sich von den neuen Stämmen Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung, von insbesondere durch sein Verhalten auf Nähragar und
Milch, Streptomyces bikiniensis Johnstone et Waksman
bildet kein dunkelbraunes Pigment.

Die Stämme A 8703 und A 9427 wachsen, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacteriology, 56, S. 107 [1948], untersucht, bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:

A 8703 A 9427

L-Xylose ... L-Arabinose x-Rhamnose D-Fruktose . D-Galaktose Saccharose . Maltose .... Lactose .... Raffmose .. Inulin

A 8703 A 9427

Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, Stärke usw.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern, vorzugsweise bei einem p_H von 6 bis 8. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 22 und 32°. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach I¹Z₂ bis 5 Tagen.

Zur Isolierung der Antibiotika aus dem vom Mycel abgetrennten Kulturfiltrat können z. B. folgende Verfahren dienen; man extrahiert das Kulturfiltrat, vorteilhaft bei einem p_H über 7,0, mit einem mit W^rasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittelextraktion des Kulturnitrates oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man die Antibiotika auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder aktivierte Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einer sauren wäßrigen Lösung und/oder mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Isopropanol, Butanol oder Methyläthylketon.

Ein gutes Verfahren für die Trennung und Reinigung der neuen Antibiotika stellt die Verteilung zwischen einer sauren wäßrigen Lösung, beispielsweise einem 0,2molaren

Dabei bedeutet: Citratpuffer und einem mit W^rasser nicht mischbaren

-\- gutes Wachstum, sichere Verwendung der be- organischen Lösungsmittel, z. B. Chloroform oder Methy-

treffenden C-Quelle; lenchlorid, dar. Zweckmäßig erfolgt die Verteilung nach

(+) schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden 55 dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten.

C-Quelle fraglich; Auch Chromatographie ist zur Reinigung sehr geeignet.

(—) Wachstum sehr schwach, Verwendung unwahr- Die Gewinnung der reinen Antibiotika in kristalliner

schemlich; Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln,

— kein Wachstum, keine Verwendung. wie Äther-Petroläther-Gemischen, Benzol-Petroläther-

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung der ^6o Gemischen oder Aceton-Petroläther-Gemischen, vor. Zur

Foromacidine anbelangt, nicht auf die Verwendung der Umkristallisation dienen dieselben Lösungsmittel oder beschriebenen Streptomyceten oder anderer der Be- auch wäßrig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkoschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern hole, verdünntes Aceton usw.

betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Außer den Herstellungsverfahren für die kristallinen

Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder 65 Foromacidine, ihre neutralen und sauren Salze mit anMutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultra- organischen oder organischen Säuren, ihre Hydrierungsviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senf- und Spaltprodukte betrifft die vorliegende Erfindung ölen, gewonnen werden. auch die genannten neuen Verbindungen selbst, insbe-

Zur Erzeugung der Foromacidine wird ein die Eigen- sondere die Foromacidinsulfate, die Foromacidin-hydroschaften des Stammes A 8703 oder A 9427 aufweisender 7° chloride, -acetate und -pantothenate.

D-Mannit

D-Sorbit

Dulcit

Mesoinosit

Sahein

Natriumacetat .. Natriumeitrat .. Natriumsuccinat

Glyzerin

Glukose

I \

I \

9 10

Die Foromacidine, ihre Hydrierungsprodukte, die tionen 40 bis 44 kristallisieren aus Äther-Petroläther.

Forocidine, ihre Salze oder entsprechende Gemische Durch Animpfen mit diesem Material kristallisieren auch

können als Heilmittel z. B. - in Form pharmazeutischer die Fraktionen 33 bis 39 und 45 bis 52. Insgesamt werden

Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die ge- 164 mg Kristalle gewonnen. Die Umkristallisation erfolgt nannten Verbindungen in Mischung mit einem für die 5 aus Benzol-Petroläther.

enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten Das erhaltene Foromacidin A bildet farblose Kristalle

pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger- vom F. = 134 bis 138°. Die Elementaranalysen (nach

material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, lOstündigem Trocknen bei 80° im Hochvakuum) liefern

die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie folgende Werte:

z. B. Gelatine, Milchzucker Stärke, Magnesiumstearat, 10 C₄₆H₇₈O₁₅N₂ Berechnet Gefunden

Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalky- q ^q 93 0/ gg 72 ⁰I

lenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte jj 8*86°/° 9 32⁰l°

Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate -^ ' 3*16°/° 3 22°l°

können z.B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, j qCH 3 50⁰I° 3 78°/°

Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lö- 15 λ /vnnl nVso/* a'oroi⁰

sungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebe- 5 (C)CH 8 48°/ 818°/

nenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten g ^ jj g'gg ₀;° g'gg 0/°

Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- '' '' ° °
oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere Mu = —56° (in Chloroform) und — 81° (in Methanol), therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 20 UV-Absorption: Amax 231 πιμ, log ε == 4,45. Im Infra-Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen rotspektrum, in Nujol suspendiert aufgenommen, zeigen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des sich Banden unter anderem bei den Wellenlängen 2,88 μ, Erfmdungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Tempera- 3,42 μ, 3,51 μ, 5,68 μ, 5,76 μ, 5,91 μ, 6,15 μ, 6,80 μ, 7,24μ, türen sind in Celsiusgraden angegeben. 8,54 μ, 8,89 μ, 9,46 μ, 9,80 μ, 10,02 μ, 10,97 μ und 11,79 μ,

25 und in Kaliumbromid unter anderem bei 2,86 μ, 3,42 μ,

^BeisP^lel ¹ 3,60μ, 5,79μ, 5,82μ, 6,34μ, 7,05μ, 7,22μ, 7,55μ, 7,75μ,

Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 8,02μ, 8,53 μ, 8,85 μ, 9,44μ, 9,78 μ, 10,04μ, 10,98 μ,

10 g Rohglukose, 10 g des Handelsproduktes »Distillers 11,80 μ, 12,32 μ und 12,70 μ.

Solubles«, 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g In Methylcellosolve-Wasser (80:20) gelöst, weist Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser, und stellt sie 30 Foromacidin A einen p_K-Wert von 6,8 auf, Äquivalentauf p_H 7,8 ein. Diese bzw. ein vielfaches derselben wird gewicht 458. Bei der katalytischen Hydrierung werden, in 500-cm³-Erlenmeyern (mit je 100 cm³ Nährlösung) oder bezogen auf das Molekulargewicht 887, mit Palladiumin 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt katalysator in Äthanol 2 Mol Wasserstoff und mit Platin- und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft katalysator in Eisessig 3 Mol Wasserstoff aufgenommen, man mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden, 35 Die das zweite Aktivitätsmaximum enthaltenden vegetativen Kultur des Stammes A 8703 an und inkubiert Fraktionen 24 bis 32 der ersten Gegenstromverteüung unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fer- werden mit Soda alkalisiert und mehrmals mit Chloroform mentern unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler ausgezogen. Der organische Extrakt wird mit wenig Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute) bei 27°. Nach Wasser gewaschen und eingedampft. Es werden 200 mg 48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter 40 rohes Foromacidin B als Öl erhalten.
Zusatz eines Filterhilfsmittels durch eine Filterpresse Man verteilt dieses Produkt erneut über 120 Stufen oder ein rotierendes Filter und befreit so die antibiotikum- im Lösungsmittelsystem Chloroform-1 molarem Acetathaltige wäßrige Lösung vom Mycel und anderen festen puffer (p_H 4,6). Das Aktivitätsmaximum findet sich nun Bestandteilen. in Stufe 66. Die Fraktionen 64 bis 68 werden alkalisiert Je 1501 Kulturfiltrat werden bei p_H 8,5 mit 901 Äthyl- 45 und mit Chloroform extrahiert. Man erhält 80 mg Foromacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen. Den Extrakt acidin B, das aus einem Äther-Petroläther-Gemisch engt man in einem Dünnschichteneindampfer auf etwa kristallisiert. F. = 130 bis 132°, [o]d = 61° (in Chloro-21 ein und schüttelt den Rückstand 8mal mit je 100 cm³ form) und —83° (in Methanol). Die Elementaranalyse 0,5 η-wäßriger Essigsäure, wobei die gesamte Aktivität liefert folgende Werte:

in die wäßrige Phase übergeht. Der essigsaure Auszug 50 C₄₇H₈₀O₁₆N₂ Berechnet Gefunden

wird mit konzentrierter Sodalösung alkalisch gestellt und q ^q 75 ₀; gg 38 °/

5mal mit je 100cm³ Essigester ausgeschüttelt. Die jj 888°/° 8*99°/°

Essigesterlösung wird gewaschen, mit Natriumsulfat ge- -^ g'02 0;° 2*97 °/°

trocknet und im Vakuum bei 40° zur Trockne verdampft. ^ OCH 334 °/° 3 69 °/°

Es bleiben 1,48 g eines gelblichen amorphen Produktes. 55 4 n^\£jf 677 °l° 514°/°

1,18 g dieses Materials wird nach Craig über 90 Stufen 6 (C) CH³ 9*71 ^of° 8*48 °/°

im Lösungsmittelsystem Chloroform und 0,2 n-Citrat- 5 akt H 0*54°/° 054°/°

puffer (p_H 5,0) verteilt. Es bilden sich drei Aktivitäts- ' °

maxima aus in den Stufen 0 und 28 sowie 66. Die Frak- UV-Spektrum: λ max 231 πιμ, log ε = 4,43. Im Infra-

tionen 58 bis 75 mit der Hauptaktivität werden vereinigt, 60 rotspektrum, in Kaliumbromid aufgenommen, zeigen

mit Soda alkalisiert und mehrmals mit Chloroform ausge- sich Banden unter anderem bei den Wellenlängen 2,86 μ,

zogen. Der organische Extrakt wird mit wenig Wasser 3,42 μ, 3,63 μ, 6,78 μ, 6,85 μ, 7,06 μ, 7,24 μ, 7,66 μ, 7,82 μ,

gewaschen und eingedampft. Es werden 330 mg rohes 8,06μ, 8,54μ, 8,86μ, 9,44μ, 9,76μ, 9,98μ, 10,96μ, 11,58μ,

Foromacidin A als gelbes zähflüssiges Öl erhalten. 11,82 μ, 12,28 μ und 12,68 μ.

Dieses Produkt verteilt man erneut im gleichen Lö- 65 In Methylcellosolve-Wasser (80:20) gelöst, weist sungsmittelsystem über 52 Stufen, wobei es sich als Foromacidin B einen p_K-Wert von 6,82 auf, Äquivalentweitgehend einheitlich erweist. Die Aufarbeitung der gewicht 467. Bei der Hydrierung in Äthanol mit einem aktiven Fraktionen wird in drei Portionen durchgeführt, Palladiumkatalysator werden, bezogen auf das Molekular-Fraktionen 33 bis 39 (65 mg), Fraktionen 40 bis 44 gewicht, 929,2 Mol Wasserstoff, mit Platinkatalysator in (120 mg) und Fraktionen 45 bis 52 (46 mg). Die Frak- 7° Eisessig 3 Mol Wasserstoff aufgenommen.

11 12

Die das dritte Aktivitätsmaximum enthaltenden Frak- F. = 134 bis 138^J, Foromacidin B vom F. = 130 bis

tionen 0 bis 20 der ersten Gegenstromverteilung werden 132°, Foromacidin C vom F. = 124 bis 128° und Forom-

vereinigt und wie beschrieben aufgearbeitet, wobei man acidin D vom F. = 135 bis 140⁼.

450 mg eines zähflüssigen Öls erhält. Dieses wird noch- .

mais über 290 Stufen im Lösungsmittelsystem Chloro- 5 Beispiel ά

form-lmolarem Acetatpuffer (p_H 4,5) verteilt. Es finden 1 Gewichtsteil Foromacidin (A, B, C oder D) läßt man

sich nun zwei Aktivitätsmaxima bei Stufe 135 (Forom- mit 50 Volumteilen 0,75 η-Salzsäure bei Zimmert empe-

acidin C) bzw. bei Stufe 73 (Foromacidin D). ratur stehen. Nach 24 Stunden neutralisiert man die

Die Fraktionen 130 bis 140 werden vereinigt und wie Lösung mit einem geringen Überschuß von Natriumoben beschrieben aufgearbeitet. Man erhält 150 mg io hydrogencarbonat und schüttelt sie dreimal mit Chloro-

Foromacidin C, das aus einem Äther-Petroläther-Ge- form aus.

misch kristallisiert wird, F. = 124 bis 128°, [α]ο = — 62^; Die wäßrige Phase wird im Vakuum bei 30^c zur Trockne

(in Chloroform) und —79^C (in Methanol). Die Elemen- eingedampft, worauf der Rückstand dreimal mit heißem

taranalyse liefert folgende Werte: Benzol ausgezogen wird. Man filtriert die Benzollösungen

CHON Berechnet Gefunden ^{15 und dam}P^{ft sie im} Vakuum ein. Die papierchromato-

, graphische untersuchung des Ruckstandes (System:

~. s 7fio''° « nfto'⁰ Butanol-Eisessig 10 : 1, mit Wasser gesättigt) zeigt die

r: 9Q7 0 9Qfto^/O Anwesenheit von zwei Substanzen, die Silberdiammin

nr'tr 't'oQo⁰ f',^'.⁰ reduzieren. Die erste dieser Substanzen wandert im

1 OCH₃ ft'oQo^/o t'dT.0'⁰ ²⁰ Chromatogramm l,7raal so rasch wie das durch Hydro-

ί ;Sv„³ Q^₀''⁰ RQAo''⁰ lyse von Narbomycin erhaltene Desosamin, während sich

6 (C)CH₈ y,5O/o °'*'o die zweite Substanz gleich wie die durch Hydrolyse von

^{5 akt}· ^H ^U'⁵³ Io ^U'⁴⁶ Io Carbomycin erhaltene Mycarose verhält.

UV-Spektrum: λ max 231 ΐημ, löge = 4,45. Im Infra- Der Rückstand der Benzolauszüge wird in wenig rotspektrum, in Kaliumbromid aufgenommen, zeigen sich 25 Aceton gelöst, wobei die Mycarose in kristalliner Form

Banden unter anderem bei den Wellenlängen 2,88 μ, erhalten wird. F. = 126,5 bis 127,5°, Misch-Schmp. mit

3,42 μ, 5,77 μ, 6,86 μ, 7,24 μ, 7,68 μ, 7,82 μ, 8,04 μ, 8,59 μ, authentischer Substanz ebenso.

8,90 μ, 10,02 μ, 10,98 μ, 11,56 μ, 11,84 μ, 12,30 μ und Die Chloroformextrakte des ursprünglichen Hydroly-

12,74μ. sierungsgemisches werden getrocknet und eingedampft. In Methylcellosolve-Wasser (80: 20) gelöst, weist 30 Aus dem Rückstand gewinnt man die Forocidine durch

Foromacidin C einen p_K-Wert von 6,8 auf, Äquivalent- Kristallisation aus Äther oder aus einem Aceton-Äther-

gewicht 478. Bei der Hydrierung nimmt Foromacidin C, Gemisch in reiner Form. Das Forocidin A erhält man

bezogen auf das Molekulargewicht 943, in Äthanol mit durch saure Hydrolyse von Foromacidin A, die Foro-

einem Palladiumkatalysator 2 Mol Wasserstoff und in cidine B, C bzw. D durch saure Hydrolyse von Forom-Eisessig mit einem Platinkatalysator 3 Mol Wasser- 35 acidin B, C bzw. D.

stoff auf. Forocidin A: UV-Spektrum: λ max 232 mμ.

Das Foromacidin D wird durch Aufarbeitung der Forocidin B: F. =227 bis 231', ~α].β = —6° (Alko-

Fraktionen 70 bis 76 der oben beschriebenen Gegenstrom- hol). Die Elementaranalyse liefert folgende Werte:

verteilung als farbloses, mikrokristallines Pulver, F. = 135 C 59,50, H 8,70, N 2,22," OCH₃ 5,03, (N)CH₃ 4,03,

bis 140°, la\_D = — 75° (in Alkohol). Die Elementar- 40 (C)CH₃ 9,61, akt. H 0,70° ₀. UV-Absorptionsspektrum:

analyse liefert folgende Werte: C = 59,85, H 8,48, ΑΐΜχ232πιμ, log ε = 4,41. Im Infrarotspektrum, in

N 3,35%. UV-Spektrum: λ max 231 ΐημ, log ε = 4,44. Kaliumbromid aufgenommen, zeigen sich Banden unter

Im Infrarotspektrum, in Kaliumbromid aufgenommen, anderem bei 2,93 μ, 3,42 μ, 5,78 μ, 6,13 μ, 6,86 μ, 7,25 μ,

zeigen sich Banden unter anderem bei den Wellenlängen 7,65 μ, 8,05 μ, 8,51 μ, 8,84 μ, 9,16 μ, 9,34 μ, 10,00 μ,

2,90μ, 3,45μ, 5,82μ, 6,10μ., 6,86μ, 7,08μ, 7,25μ, 7,32μ, 45 10,58μ, 11,60μ und 12,73μ."

8,05 μ, 8,66 μ, 8,88 μ, 9,46 μ, 9,82 μ, 10,05 μ, 11,05 μ, In Methylcellosolve-Wasser (80:20) gelöst, weist

11,50μ, 11,82μ, 12,30μ, 12,72μ und 14,00μ.' * Forocidin B einen p_K-Wert von 7,5 auf, Äquivalentge-

In Methylcellosolve -Wasser (80 : 20) gelöst, weist wicht 633. Bei der katalytischen Hydrierung mit Palla-

Foromacidin D einen ρκ-Wert von 6,8 auf, Äquivalent- diumkatalysator werden 2 Mol Wasserstoff aufgenommen,

gewicht 452. Bei der Hydrierung in Äthanol mit einem 50 Forocidin C: F. = 217,5", α^Ίβ = —7° (Alkohol). Die

Palladiumkatalysator werden 2 Mol Wasserstoff aufge- Elementaranalyse liefert folgende Werte: C 60,40, H 8,68,

nommen. " N 2,25, OCH₃ 5,12, (N)CH₃ 4,52, (C)CH₃ 9,61, akt.

Die Foromacidine geben mit konzentrierter Salzsäure H0,73°/_o. UV-Absorptionsspektrum: /Imax232n^, log

die gleiche Färbung, wie sie von Fischbach und Levine ε = 4,41. Im Infrarotspektrum, in Kaliumbromid aufge-

(Antibiotics and Chemotherapy, 3, S. 1159 "1953]) für 55 nommen, zeigen sich Banden unter anderem bei 2,93 μ,

Erythromycin angegeben wurde. Die von den gleichen 3,42μ, 5,77μ, 6,13μ, 6,86μ, 7,24μ, 7,44μ, 7,63μ, 7,82μ,

Autoren beschriebene Farbreaktion auf Carbomycin 8,10 μ, 8,35 μ, 8,54 μ, 8,85 μ, 9,22 μ, 9,43 μ, 10,50 μ, 11,24 μ,

verläuft mit den Forornacidinen ähnlich wie mit Carbo- 11,50 μ, 11,90 μ und 12,33 μ.

mycin, die Farbtöne sind etwas weniger intensiv und rein. In Methylcellosolve-Wasser (80 : 20) gelöst, weist

. 60 Forocidin C einen ρκ-Wert von 7,6 auf, Äquivalentge-

Beispiel 2 wicht 665. Bei der katalytischen Hydrierung mit Palla-

Man beimpft eine sterile Nährlösung, die die im Bei- diumkatalysator werden 2 Mol Wasserstoff aufgenommen,

spiel 1 angegebene Zusammensetzung hat, mit bis zu Forocidin D: UV-Spektrum: λ max 232 mμ.

10°/₀ einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur .

des Stammes A 9427 und inkubiert, wie im Beispiel 1 65 Beispiel 4

beschrieben ist. Nach 48 Stunden zeigt die Kultur anti- 310 mg Foromacidin B werden mit 450 mg Kaliumbiotische Wirksamkeit. Gemäß den Angaben im Bei- hydroxyd in 15 cm³ Wasser und 15 cm³ Methanol 1 Stunde spiel 1 wird die Kultur filtriert und extrahiert und der am Rückfluß gekocht, wobei Dimethylamin in Freiheit Rohextrakt mittels Gegenstromverteilung gereinigt und gesetzt wird. Dann wird das Methanol durch Eindampfen aufgetrennt. Man gewinnt so Foromacidin A vom 7o im Vakuum entfernt. Man versetzt die zurückbleibende

Lösung mit so viel Phosphorsäure, daß sie eben auf Kongo sauer reagiert, und destilliert sie bei 70° Badtemperatur bei 80 mm Hg. Das sauer reagierende Destillat wird mit 0,1 η-Natronlauge gegen Phenolphthalein titriert, wobei die verbrauchte Menge Lauge, bezogen auf das eingesetzte Foromacidin, 1,3 Mol Säuren entspricht. Man dampft die neutrale Lösung im Vakuum zur Trockne ein. Im Rückstand kann papierchromatographisch nach der Methode von Jones (Annal. Chem., 25, S. 394 [1953]) neben wenig Ameisensäure einzig Essigsäure nachgewiesen werden. Er wird mit p-Phenyl-phenacylbromid umgesetzt, wobei p-Phenyl-phenacyl-acetat vom F. = 110,5 bis 111,5° erhalten wird.

Bei der entsprechenden Hydrolyse von Foromacidin A bzw. C werden 0,4 bzw. 1,3 Mol Säuren erhalten, die im Falle von Foromacidin A nur aus Ameisensäure bestehen, während im Falle des Foromacidins C neben wenig Ameisensäure viel Propionsäure erhalten wird. Letztere wird durch Umsetzung mit p-Phenyl-phenacylbromid in das p-Phenyl-phenacyl-propionat vom F. = 101,5 bis 102° übergeführt.

Bei analoger Hydrolyse von Forocidin B und C werden 1,1 Mol Essigsäure bzw. 1,0MoI Propionsäure erhalten.

Beispiel 5

Eine Lösung von 50 mg Foromacidin A in 5 cm³ Äthanol wird nach Zusatz von 50 mg eines Palladium-Calciumcarbonat-Katalysators in einer Wasserstoffatmosphäre 1 Stunde lang geschüttelt. Der aufgenommene Wasserstoff entspricht, bezogen auf das eingesetzte Foromacidin, einer Menge von 2 Mol. Darauf filtriert man die Lösung und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Man erhält das Tetrahydro-foromacidin A als farbloses Pulver. Es besitzt antibiotische Wirksamkeit.

Hydriert man in gleicher Weise das Foromacidin B, C bzw. D, so erhält man Tetrahydro-foromacidin B, Tetrahydro-foromacidin C bzw. Tetrahydro-foromacidin D. Diese Substanzen sind antibiotisch wirksam. Aus Forocidin A, B, C bzw. D erhält man auf analoge Weise Tetrahydro-forocidin A, Tetrahydro-forocidin B, Tetrahydroforocidin C bzw. Tetrahydro-forocidin D.

Beispiel 6

Eine Lösung von 50 mg Foromacidin A in 5 cm³ Eisessig wird nach Zusatz von 50 mg eines Platinkatalysators in einer Wasserstoffatmosphäre 1 Stunde lang geschüttelt. Der aufgenommene Wasserstoff entspricht, bezogen auf das eingesetzte Foromacidin, einer Menge von 3 Mol. Darauf filtriert man die Lösung und dampft das Filtrat nach Zusatz von etwas Wasser im Vakuum bei 45° zur Trockne ein. Man erhält das Hexahydro-foromacidin A als farbloses Pulver.

Hydriert man Foromacidin B, C bzw. D in gleicher Weise, so erhält man Hexahydro-foromacidin B, Hexahydro-foromacidin C bzw. Hexahydro-foromacidin D. Aus Forocidin A, B, C bzw. D erhält man auf analoge Weise Hexahydro-forocidin A, Hexahydro-forocidin B, Hexahydro-forocidin C bzw. Hexahydro-forocidin D.

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung von Pilzstämmen aus der Gruppe der Streptomyceten, insbesondere von Streptomyces A 8703 oder A 9427 oder diesen äquivalenten Stämmen, zur Herstellung von mindestens einem von vier neuen kristallinen Antibiotika, die Foromacidin A, B, C und D genannt werden und folgende Eigenschaften besitzen:

Foromacidin A: F. = 134 bis 138^C, [a]_D = — 81° (Methanol);

F. = 130 bis 132°, [a]_D = —83°

F. == 124 bis 128^C, [a]_D = —79° F. = 135 bis 140°, \a]_D = —75°

Foromacidin B

(Methanol);
Foromacidin C

(Methanol) ;
Foromacidin D

(Methanol),

in an sich bekannter Weise auf biologischem Wege, vorzugsweise durch Züchtung des Pilzes im Submersverfahren, Extraktion des Kulturfiltrates, zweckmäßig oberhalb p_H 7 und mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, Isolierung mindestens eines der vier Antibiotika in kristalliner Form aus dem Extrakt, gegebenenfalls Überführung der freien Basen in ihre Salze oder Hydrierung der Basen oder ihrer Salze zu Tetra- oder Hexahydroderivaten oder Hydrolysierung der Basen oder ihrer Salze.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschrift Nr. 934 715.

© 703 810/312 12.