DE102012008759A1

DE102012008759A1 - Nukleosid-Triphosphat-Konjugate und Methoden zu deren Anwendung

Info

Publication number: DE102012008759A1
Application number: DE102012008759A
Authority: DE
Inventors: Dmitry Cherkasov; Prof. Dr. Becker Claus; Norbert Basler; Andreas Müller-Hermann
Original assignee: Genovoxx GmbH
Current assignee: Genovoxx GmbH
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2012-11-08
Also published as: WO2012150035A1; EP2705161A1; US20150086981A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur enzymatischen Markierung von Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) mit Nukleotid-Konjugaten. Diese Nukleotid-Konjugate sind in der Lage, unter Reaktionsbedingungen an eine Zielsequenz zu binden und durch eine Polymerase in den komplementären wachsenden Strang eingebaut zu werden. Die Nukleotid-Konjugate können zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten verwendet werden.

Description

Einleitung
1.1 Stand der Technik und Aufgaben der Erfindung
In der modernen Biotechnologie sind hochleistungsfährige Sequenzierungsverfahren bekannt („second generation sequencing technologies”, z. B. Solexa-Technologie von Illumina. Diese Verfahren basieren auf Sequenzierung durch Synthese und verwenden reversible Terminatoren. Im Zusammenhang mit der Entwicklung der Verfahren zur Sequenzierung mittels Synthese ist die Bereitstellung neuer reversibel terminierenden Nukleotid-Modifikationen von entscheidender Bedeutung. Bessere Signal-Eigenschaften spielen eine große Rolle bei der Sequenzierung besonders auf Einzelmolekülebene.
1.2 Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt in einer vorteilhaften Ausführungsform neue Strukturen von Nukleotid-Konjugaten, sowie Verfahren zu deren Anwendung. Solche Nukleotid-Konjugate können in Markierungsreaktionen von Nukleinsäureketten verwedet werden oder bei einer Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform werden solche Konjugate als reversible Terminatoren bei einer Sequenzierung durch die Synthese verwendet.
Es werden neuartige Nuk-Makromoleküle mit neuen Strukturen der Marker-Kompontente und mit neuen Funktionen bereitgestellt. Die Nukleotid-Strukturen stellen neue Kompositionen von Nuk-Makromolekülen mit der Grundstuktur, beschrieben in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 . Diese Anmeldungen sind hier als Referenzen eingeschlossen und werden als „incorporated by reference” im vollen Umfang zitiert.
Nuk-Makromoleküle schließen mindestens eine Nuk-Komponente, z. B. ein 2'-deoxinukleosid-triphosphat, mindestens einen makromolekularen Marker und mindens einen Linker zwischen diesem Marker und der Nuk-Komponente.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung, werden Nukleotid-Konjugate beschrieben, die mindestens ein Nukleosid-triphosphat, mindestens ein Oligonukleotide, sowie einen Linker zwischen dem Nukleosid-Triphosphat und dem Oligonukleotid einschließen. Das Oligonukleotid in einem solchen Nukleotid-Konjugat ist vorzugsweise ein Teil des Markers.
Die Kopplung des Linkers an das Nukleosid-triphosphat (Nuk-Komponente des Nukleotid-Konjugates) kann in einer Ausführungsform an der Base erfolgen (z. B. an 5-Position der Pyrimidine oder an 7-position von 7-deazapurinen).
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Kopplung des Linkers an die endständige Phosphat-Gruppe des Nukleotids (z. B. Gamma-Phosphat-Gruppe bei einem Nukleosid-Triphosphat).
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Kopplung des Linkers an die 3'-Position des Zuckers des Nukleotids (z. B. an 3'-OH-Gruppe einer 2'-deoxi-ribose).
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Linker vorzugsweise mindestens eine spaltbare Gruppe ein, z. B. eine Disulfid-Gruppe.
Die Kopplung des Linkers an das Oligonukleotid erfolgt in einer Ausführungsform am 5'-Ende des Oligonukleotids. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Kopplung des Linkers an das Oligonukleotid am 3'-Ende des Oligonukleotids. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Kopplung des Linkers an das Oligonukleotid an einer internen Position des Oligonukleotids.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zusammensetzung des Oligonukleotides dermassen gewählt, dass es nicht an die zu markierenden Nukleinsäuresequenzen binden kann. Dies kann beispielsweise durch eine vollständige oder partielle Doppelstrang-Bildung innerhalb des Oligonukleotids erreicht werden (z. B. Haarnadel-Strukruren) oder durch entsprechende Reaktionsbedigungen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Zusammensetzung des Oligonukleotides dermassen gewählt, dass es mindestens an eine zu markierende Nukleinsäuresequenz binden kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten beschrieben, bei dem mindestens vier Arten von Nukleotid-Konjugaten (z. B. dATP-Konjugat, dCTP-Konjugat, dGTP-Konjugat, dUTP-Konjugat) gleichzeitig in Kontakt mit mindestens einem Primer-Matrizen-Komplex und mindestens einer DNA Polymerase gebracht werden und unter Bedingungen inkubiert, die einen Einbau eines komplementären Nukleosid-Triphosphates der Nukleotid-Konjugate an den Primer zulässt.
Nuk-Makromoleküle mit vorwiegend oder absolut sequenzspezifischen Bindung an eine Zielsequenz sind in Cherkasov et al WO2011050938 beschrieben.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung schließt Nukleotid-Konjugate mit einer verstärkten Bindung an eine zu markierende Nukleinsäuereketten ein, wobei diese Bindung vorwiegend nicht sequenzspezifisch erfolgt. Nukleotid-Konjugate haben vielmehr die Fähigkeit, sequenzunspezifisch an mehrere verschiedene zu markierende Nukleinsäureketten zu binden. Eine solche sequenzunspezifische Bindung von Nukleotid-Konjugaten an zu markierende ermöglicht unerwartete Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise können deutlich geringe Konzentrationen von Nukleotid-Konjugaten verwendet werden, um einen Einbauereignis einer Nuk-Komponente zu erzielen. Einsatz geringer Konzentrationen von Nukleotid-Konjugaten ist beispielsweise bei Verfahren zur Einzelmolekül-Analyse von Nukleinsäuren vom Vorteil. Geringe Konzentrationen verursachen einen deutlich geringeres Hintergrundsignal. Das kann zur Steigerung der Qualität der Signale in einem Assay führen.
In einer Ausführungsform erfolgt diese sequenzunspezifische Bindung an Nukleinsäureketten beispielsweise unter Ausbildung der Basenpaarung zwischen dem Oligonukleotid des Nukleotid-Konujgates und der zu markierende Nukleinsäurekette, wobei eine solche Basenpaarung nur über einen relativ kurzen Abschnitt (z. B. 3–15 Basen) der Nukleinsäurekette erfolgt und daher vorzugsweise eine geringe Sequenzspezifität hat. In dieser Ausführungsform der Erfindung schließt die Sequenz des Oligonukleotides innerhalb des Nukleotid-Konjugates mindestens einen Sequenzabschnitt, der an die Nukleinsäureketten unter Basenpaarung binden kann. Vorzugsweise ist dieser Sequenzabschnitt des Oligonukleotids einzelsträngig. Die Länge dieses Fragments ist vorzugsweise so gewählt, dass das Oligonukleotid über Ausbildung von beispielsweise 3 bis 6, 7 bis 10, 10 bis 15 Basenpaaren (durchgehend oder auch getrennt durch nicht komplementäre Bereiche) an die zu markierende Nukleinsäuekette binden kann.
In einer weiteren Ausführungsform werden Nukleotid-Konjugate mit Nukleinsäureketten unter Bedingungen inkubiert, die eine sequenzunspezifische Bindung zwischen ihnen zulässt. Beispielswiese können Nukleotid-Konjugate mit längeren Oligonukleotiden (z. B. zwischen 15 und 50 Nukleotiden) an Nukleinsäureketten unter nicht stingenten Bedingungen wenig sequenzspezifisch binden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließen Nukleotid-Konjugate positiv geladene Abschnitte, z. B. polylysine-Abschnitt oder Polyethylenimin (PEI), welche an die Nukleinsäureketten über elektrostatische Ladung binden. Diese Abschnitte können als Linker zwischen der Nuk-Komponente und der Oligonukleotid-Komponente funktionieren (z. B. 2–10 Lysin-Reste als kurzes Peptid). Beispielsweise können Peptid-Nuklein-Säuren (PNA) mit einem positiv geladenen Rückgrad als Oligonukleotid innerhalb des Nuk-Makromoleküls verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließen Nukleotid-Konjugate Proteine ein, die in der Lage sind an Nukleinsäureketten sequenzunspezifisch zu binden, z. B. ein Single-Strand-Binding Protein.
Zur Anschaulichkeit werden in dieser Anmeldung Varianten der Nukleotid-Konjugate in Details beschrieben, die mindestens ein Oligonukleotid zur Verstärkung der Bindung an eine zu markierende Nukleinsäurekette einschließt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird mindestens eine Komposition aus mehreren Nuk-Makromolekülen mit gleicher Nuk-Komponente verwendet. Eine solche Komposition schließt vorzugsweise eine gleiche bzw. einheitliche Art der Nuk-Komponente ein, z. B. dATP-Analog, die an unterschiedliche Oligonukleotide gekoppelt ist.
Jedes der Oligonukleotide aus solchen Komposition schließt mindestens einen Sequenzabschnitt ein, der an mindestens eine zu markierende Nukleinsäurekette binden kann. Vorzugsweise ist dieser Sequenzabschnitt einzelsträngig. Die Länge dieses Fragments ist vorzugsweise so gewählt, dass jedes Oligonukleotid über Bildung von 3 bis 20, vorzugsweise unter Bildung von 3 bis 10, noch bevorzugter unter Bildung von 3 bis 6 Basenpaaren an die zu markiertende Nukleinsäuekette binden kann.
Solche Sequenzabschnitte können auch als Bindungsabschnitte der Oligonukleotide genannt werden. Sie werden als „B-Abschnitte” bezeichnet. Solche B-Abschnitte von Oligonukleotiden unterscheiden sich zwischen einzelnen Oligonukleotiden einer Population von Nukleotid-Konjugaten (Abschnitt B(1), B(2), B(3) usw. bis B(n)). In einer Ausführungsform der Erfindung bildet die Zusammensetzung der B-Abschnitte innerhalb einer Population sämtlich mögliche Varianten ab (z. B. randomisierte Hexamere mit 4^n Varianten, wobei (n) die Anzahl der Nukleotid-Monomere in einem Oligonukleotid darstellt). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung der B-Abschnitte innerhalb einer Population auf einige ausgewälte Varianten der Oligonukleotide beschränkt, wobei die Anzahl der verschiedenen Varianten der Oligonukleotdie zwischen 10 und 100.000 liegen kann.
Weiterhin schließt jedes der Oligonukleotide einer solchen Komposition einen für diese Komposition charakteristischen signal-gebenden oder signal-vermittelnden Marker ein, z. B. einen Farbstoff oder einen weiteren, für alle Oligonukleotide einheitlichen Sequenzabschnitt des Oligonukleotids.
Zusammenfassend, schließt eine Komposition von Nukleotid-Konjugaten eine einheitliche Art der Nuk-Komponente, z. B. ein einheitliches Nukleosid-Triphosphat, und einen für diese Population charakteristischen signal-gebenen oder signal-vermitteldnen Marker, und eine Vielzahl von Oligonukleotiden ein. Oligonukleotide innerhalb einer Komposition unterscheiden sich untereinander in der Struktur des B-Abschnitts. Die Gesamtzahl der Variationen von Oligonukleotiden innerhalb einer solchen Komposition schließt Bereiche von 4^3 bis 4^50, vorzugsweiese von 4^5 bis 4^20, noch bevorzugter 4^6 bis 4^15 ein. Die Länge der Oligonukleotide ist entsprechend so gewählt, dass eine solche Anzahl an Variationen erreicht werden kann. Beispielsweise bei der Länge von 3 Basen des B-Abschnitts beträgt die Komplexität der Population 64 (= 4^3), bei der Länge von 4 Basen des B-Abschnitts beträgt die Komplexität der Population 256 (= 4^4), bei der Länge von 5 Basen des Abschnitt B beträgt die Komplexität der Population 1024 (= 4^5), bei der Länge von 6 Basen des Abschnitt B beträgt die Komplexität der Population 4096 (= 4^6) usw.
Durch eine vollständige Abdeckung von potenziellen Kombinationen der Basenabfolge innerhalb der Komposition kann eine solche Population an weitere einzelsträngige Nukleinsäuereketten mit beliebiger Zusammensetzung binden.
Die genannte Komposition von Nukleotid-Konjugaten wird vorzugsweise mit einer zu markierenden Nukleinsäurekette unter Reaktionsbedingungen inkubiert, die eine reversible Bindung zwischen Oligonukleotiden und der zu markierenden Nukleinsäurekette zulassen. Dies kann man beispielsweise durch Reaktions-Temperatur steuern.
Unter geeigneten Temperatur-Bedingungen kommt es zu Bindung von Oligonukleotiden der Nuk-Makromolekülen und Einzelsträngen der zu markierenden Nukleinsäureketten. Es entstehen Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexe.
In einer Ausführungsform liegt die Reaktionstempertur unter der Tm (z. B. Tm minus 5°C) von potenziellen Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexen. Unter solchen Bedingungen wird die Ausbildung von Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexe bevorzugt.
In einer weiteren Ausführungsform liegt die Reaktionstempertur um die Tm (z. B. Tm plus/minus 5°C) von potenziellen Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexen. Unter solchen Bedingungen liegt ein Gleichgewicht zwischen der Bildung und Auflösung von Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexe. Dies ermöglicht einen regen Austausch an Nukleotid-Konjugaten an einer Matrize. Die Bindung innerhalb von potenziellen Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexen ist reversibel und wird mehrmals gebildet und aufgehoben dank Reaktionsbedingungen.
In einer weiteren Ausführungsform liegt die Reaktionstempertur vorzugsweise über Tm (z. B. Tm + 5°C) von potenziellen Nukleotid-Konjugat-Matrizen-Komplexen. Durch eine relativ kurze Strecke des B-Abschnitts (vorzugsweise 3 bis 15 Basen-Paaren) ist eine solche Bindung zwischen einem Oligonukleotid und einer weiteren einzelsträngigen Nukleinsäuerekette nicht besonders stabil. Dies ermöglicht einen regen Austausch von Nukleotid-Konjugaten an einer zu markierenden Nukleinsäurekette.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden mindestens vier Kompositionen verwendet, wobei jede Komposition Nuk-Makromoleküle mit gleicher Nuk-Komponente, mindestens einem gleichen Marker und unterschiedlichen Oligonukleotiden einschließt. Es werden beispielsweise vier Kompositonen von Nuk-Makromolekülen verwenden, wobei eine Komposition eine dATP-Nuk-Komponente einschließt, eine zweite Komposition eine dCTP-Nuk-Komponente einschließt, eine dritte Komposition eine dGTP-Nuk-Komponente einschließt, eine vierte Komposition eine dUTP-Nuk-Komponente einschließt,
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird mindestens eine Komposition solcher Nukleotid-Konjugate in Kontakt mit mindestens einem Primer-Matrizen-Komplex und mindestens einer Polymerase gebracht und unter Bedingungen inkubiert, die eine reversibe Bindung der Oligonukleotid-Anteile der Konjugate an den einzelsträngigen Abschnitt der Primer-Matrizen-Komplexe, sowie einen Einbau eines komplementären Nukleosid-Triphosphates an den Primer zulässt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden mindestens vier Kopositionen von Nukleotid-Konjugaten (z. B. dATP-Population, dCTP-Population, dGTP-Population, dUTP-Population) in Kontakt mit mindestens einem Primer-Matrizen-Komplex und mindestens einer Polymerase gebracht und unter Bedingungen inkubiert, die eine reversibe Bindung der Oligonukleotid-Anteile der Konjugate an den einzelsträngigen Abschnitt der Primer-Matrizen-Komplexe, sowie einen Einbau eines komplementären Nukleosid-Triphosphates an den Primer zulässt. Jede der genannten Populationen schließt mindestens ein Nukleosid-Triphosphat-Anteil, sowie eine für dieses Nukleosid-Triphosphat charakteristische Oligonukleotid-Population ein (4-7) Einzelne Ausführungsformen der Erfindung lassen sich untereinader kombinieren, so dass Strukturen von Nukleotid-Konjugaten bereitgestellt werden können, die vorteilhaften Kombinationen einschließen. Beispielsweise können Nukleotid-Konjugate mit Oligonukleotiden bereitgestellt werden, die teilweise selbstkomplementräre doppeltsträngige Abschnitte einschließen und gleichzeitig B-Abschnitte zur Bindung an zu markierende Nukleinsäureketten.
In einer Ausführungsform werden noch weitere Nukleotide verwendet. Beispielsweise können natürliche dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) oder deren Analoga (z. B. ddNTP) oder markierte Nukleotdie (z. B. dUTP-16-Biotin) verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden noch weitere Nuk-Makromoleküle verwendet, beschrieben in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO2008043426 .
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleotid-Konjugate in Konzentrationen eingesetzt, die in folgenden Bereichen liegen: 10 pmol/l–1 nmol/l, 1 nmol/l–10 nmol/l, 10 nmol/l–100 nmol/l, 100 nmol/l–1 μmol/l, 1 μmol/l–10 μmol/l, 10 μmol/l–1 mmol/l. Besonders bevorzugt sind Bereiche zwischen 10 pmol/l und 10 μmol/l. Diese Konzentrationen können sich auf die Konzentration der Nuk-Komponente der Nukleotid-Konjugate beziehen.
Die erfindungsgemäßen Nukleotide-Konjugaten können in Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäuereketten verwendet werden. Besonders bevorzugt werden diese Nukleotid-Konjugate in Verfahren zur Markierung und zur Sequenzierung von Nukleinsäuereketten verwendet. Beispiele für Durchführung von Verfahren zur Markierung oder zur Sequenzierung-durch-Synthese sind einem Fachmann bekannt.
Beispielsweise schließt ein solches Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte ein:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von Nukleotid-Konjugate mit komplementären Nukleobasen (Nuk-Komponenten) zulassen, wobei jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugaten
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugaten
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

In einer Ausführungsform können die zu sequenzierenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung fixiert sein und zumindes ein Teil der NSK-Primer-Komplexen optisch einzeln adressierbar ist (Sequenzierung-durch-Synthese Verfahren nach Helicos Biosiences oder Genovoxx GmbH).
In einer Ausführungsform können die zu sequenzierende Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung fixiert sein und bilden Mikrokolonien mit identischen Sequenzen in jeder Kolonie (Sequenzierung-durch-Synthese Solexa-Verfahren von Illumina).
Der Ablauf von solchen Verfahren ist einem Fachmann bekannt.
1.3 Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen und Begriffe
1.3.1 Makromolekulare Verbindung – ein Molekül, oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2 kDa und 20 kDa, 2 kDa und 50 kDa, 2 kDa und 100 kDa, 100 kDa und 200 kDa, 200 kDa und 1000 kDa oder 1 MDa und 100 MDa oder 100 MDa und 100 GDa liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 7 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanogold-Partikel aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.
1.3.2 Niedermolekulare Verbindung – ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2 kDa) beträgt, z. B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP.

1.3.3 Ein Nuk-Makromolekül (ein Nukleotid-Konjugat) im Sinne dieser Anmeldung ist eine chemische Struktur (ein Nukleotid-Analog, ein Nukleotid-Konjugat), die eine oder mehrere Nuk-Komponenten, eine oder mehrere Linker-Komponenten und zumindest eine Marker-Komponente einschließt:
(Nuk-Linker)_n-Marker
wobei:
Nuk – eine Nuk-Komponente ist
Linker – eine Linker-Komponente ist
Marker – eine Marker-Komponente ist
n – eine Zahl von 1 bis 100 ist

Nuk	– ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
Linker	– Seine Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange die Substrat-Eigenschaften der Nukleotide nicht verloren gehen. Seine Länge liegt zwischen 5 und 100 Kettenatome.
Marker	– eine Marker-Komponente, die mindestens eine Nukleinsäuresequenz mit der Länge zwischen 3 und 200 Nukleobasen Einschließt (ein Oligonuklqeotid)
n	– eine Zahl von 1 bis 100, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.

Weitere Beispiele für Synthesen und Verwendung von Nuk-Makromolekülen sind in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 angegeben.
1.3.3.1 Nuk-Komponente
Nuk-Komponente ist ein Substrat für Nukleotid- bzw. Nukleosid-akzeptierendes Enzym. Nuk-Komponente kann sowohl ein Nukleotid als auch ein Nukleosid darstellen. Im Folgenden werden bei der Beschreibung Nukleotide stellvertretend für beide Klassen betrachtet. Nukleotiside können mittels entsprechender Enzyme oder chemischer Methoden in eine Nukleotidform umgewandelt werden.
In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid-akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk-Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert werden. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt („Nucleoside Triphosphates and their Analogs", Morteza Vaghefi, 2005, ISBN 1-57444-498-0; "Deoxynucleoside analogs in cancer therapy" Godefridus J. Peters, 2006, ISBN 1-58829-327-0; "Chemistry of nucleosides and nucleotides" Leroy B. Townsend, 1991, ISBN 0-306-43646-9; "Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4; "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2; "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben.
Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker-Komponente (Zucker) und wahlweise eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d. h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447–).
In einer bevorzugten Ausführungsform, ist die Nuk-Komponente ein Substrat für DNA-Polymerasen. In einer anderen Ausführungsform, ist die Nuk-Komponente ein Substrat für RNA-Polymerasen. Variationen von Nukleotiden, die solche Substrat-Eigenschaften zulassen, können als Nuk-Komponente eingesetzt werden. Beispielsweise, Substrate für Nukleotid-akzeptierende Enzyme, denen ein Bestandteil eines konventionellen Nukleotids fehlt, z. B. azyklische Nukleotid-analoga, können ebenfalls als Nuk-Komponente eingesetzt werden.
1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat
In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Monophosphat dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Diphosphat dar. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat, Pentaphosphate usw.) können verwendet werden.
Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5'-Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3'-Position.
Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363–, A. Draganescu et al. J. Biol. Chem. 2000 v. 275, 4555–). In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798–).
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente geschützte Phosphat-Gruppen (z. B. Phosphoroamidite) ein.
In einer Ausführungsform stellt die Phosphat-Komponente die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.
13.3.1.2 Variationen an der Base
Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson-Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z. B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thioadenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447–, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363–, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857–, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, dargestellt bzw. in "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0.
1.3.3.1.3 Variationen am Zucker
Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z. B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z. B. Ribose, 2'-Deoxyribose oder 2',3'-Dideoxyribose ein. Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259–, Tsien WO 91/06678 ), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker-Komponente gekoppelt sein (Hovinen et al. J. Chem. Soc. Prking Trans. 1994, S. 211–, Canard US Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Ju et al. US Pat. 6664079 , Fahnestock et al. WO 91066678 , Cheeseman US Pat. 5302509 , Parce et al. WO 0050642 , Milton et al. WO 2004018493 , Milton et al. 2004018497 ).
In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z. B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3'- oder die 2'-OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v. 868, 136–, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185–).
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein (A. Holy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567–, G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447–). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen. In der Anmeldung werden 2'-Deoxynukleotide, beispielsweise 2'-Deoxyuridin-Triphosphat, 2'-Deoxycytidin-Triphosphat, 2'-Deoxyadenosin-Triphosphat, 2'-Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.
Anwesenheit oder Abwesenheit der Fähigkeit der Nuk-Komponente zur weiteren Kopplung von Nukleotiden durch eine Polymerase ist entscheidend für die Eigenschaften von Nukleotid-Konjugaten.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Analoga als Nuk-Komponte eingesetzt, die als Terminatoren der enzymatischen Synthese auftreten. Ein Beispiel dafür stellen ddNTP-Analoga dar, z. B. 2',3'-dideoxy-UTP. Einem Fachmann sind weitere Beispiele für Terminatoren bekannt.
1.3.3.1.4 Kopplung der Nuk-Komponente und Linker
Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente liegt in einer Ausführungsform an der Base.
In einer anderen Ausführungsform wird Linker an Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose) gekoppelt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird der Linker an der endständigen Phosphat-Gruppe des Phosphat-Anteils der Nuk-Komponenten gekoppelt.
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent.
Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6, 7, 8 bei den Purin-Basen (Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447–, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363–, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857–, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). Weitere Beispiele für Modifikationen an der Base sind in "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0; angegeben. Am Zucker können die Positionen 2', 3', 4' oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann beispielweise an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082 , Balasubramanian WO 03048387 , Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche, Trilink Technologies, Jena Bioscience), an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Parce WO 0050642 ., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.
Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der Nuk-Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für Markierungen von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet.
Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des Nuk-Makromoleküls freigesetzt werden soll.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z. B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z. B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker-Komponenten. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210 , Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V. 18 S. 1021, Metzker et al. NAR 1994, V. 22, S. 4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V. 18, S. 19, Milton et al. WO 2004018493 , Odedra at al. WO 0192284 ) oder single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382 . Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z. B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter ”milden Bedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z. B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen 0°C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z. B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).
Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Tartrat-, Disulfid-, Diol- (z. B. -CH2(OH)-CH2(OH)-), Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082 , „Chemistry of Protein conjugation and crosslinking Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V. 184 S. 584, Lomant et al. J. Mol. Biol. 1976 V. 104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S. Patai 1969 Interscience Publ., Pierce Katalog). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429 , "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S. 1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V. 9 S. 225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H. Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S. M. Bühler, 1999, Konstanz).
1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100 Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.
1.3.3.2 Linker-Komponente
Die Funktion des Linkers ist, unter anderem, eine Nuk-Komponente und eine Marker-Komponente in Art und Weise zu verbinden, dass die Substrateigenschaften der Nuk-Komponente für nukleotid-akzeptierende Enzyme trotz Kopplung eines makromolekularen Markers nicht verloren gehen. Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf den gesamten strukturellen Abschnitt des Nuk-Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren. In einer Ausführungsform ist der Linker vorzugsweise hydrophil.
1.3.3.2.1 Linker-Länge
Die durchschnittliche Linkerlänge schließt folgende Bereiche ein: zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 1000 Ketten-Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 1000 Angström (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).
Falls ein Nuk-Makromolekül mehrere Linker-Komponenten einschließt, können diese Linker-Komponenten untereinander gleiche oder auch unterschiedlich lang sein.
Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.
1.3.3.2.2 Kurzer Linker
In einer bevorzugten Form haben Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge schließt Bereiche zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 Kettenatomen ein. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto-, Hydroxygruppen, Alkyn-, Isothiocyanat-, Aldehyd- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. An diese Gruppen können weitere Moleküle gekoppelt werden. In einer Ausführungsform werden Cross-Linker an den kurzen Linker der Nuk-Komponente gekoppelt, so dass die resultierende Nuk-Komponente an weitere Substanzen gebunden werden kann, z. B. an makromolekulre Linker-Komponente oder Marker-Komponenten. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt ("Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0, Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447–, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363–, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857–, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren, Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s. u. Beispiele für Cross-Linker sind. einem Fachmann bekannt („Chemistry of Protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993). Viele Cross-Linker sind kommerziell erhältlich, z. B. von Invitrogen (Lifescience Technologies, Pierce Biotech, Iris-Biotech). Beispiele von Kopplungen von verschiedenen Substanzen an Makromoleküle, z. B. an Oligonukleotide sind ebenfalls bekannt (Y. Singh et al Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 2054–). Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass der Linker zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente in mehreren chemischen Schritten aufgebaut werden kann.
Noch weitere Beispiele für kurze Linker zwischen einer Nuk-Komponente und einem Marker sind am Beispiel der Verbindung zwischen einem Nukleosidtriphsophat (NUK) und einem Oligonukleotid (OLN) dargestellt.
NUK-NH-OLN, NUK-O-OLN, NUK-S-OLN, NUK-SS-OLN, NUK-CO-NH-OLN, NUK-NH-CO-OLN, NUK-CO-O-OLN, NUK-O-CO-OLN, NUK-CO-S-OLN, NUK-S-CO-OLN, NUK-(PO₂)n-OLN, NUK-Si-OLN, NUK-(CH₂)_n-OLN, NUK-(CH₂)-OLN, NUK-A-(CH₂)_n-OLN, NUK-(CH₂)_n-B-OLN, NUK-(CH=CH-)_n-OLN, NUK-(A-CH=CH-)_n-OLN, NUK-(CH=CH-B-)_n-OLN, NUK-A-CH=CH-(CH₂-)_n-OLN, NUK-(-CH=CH-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-CH=CH-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-O-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-A-(-O-CH₂-CH₂)_n-OLN, NUK-A-(-O-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(C≡C-)_n-OLN, NUK-(A-C≡C-)_n-OLN, NUK-(C≡C-B-)_n-OLN, NUK-A-C≡C-(CH₂-)_n-OLN, NUK-(-C≡C-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-OLN,
wobei Nuk – die Nuk-Komponente ist, OLN – ein Oligonukleotid ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Diese Beispiele sind lediglich zur Anschaulichung dargestellt, ohne die Struktur des Linkers einzuschränken.
1.3.3.2.3 Langer Linker
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit einer Länge von mehr als 50 Ketten-Atomen. Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile:

1) Kopplungseinheit L
2) hydrophiles bzw. wasserlösliches Polymer
3) Kopplungseinheit T

Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.
Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk-Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z. B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082 , Balasubramanian WO 03048387 , Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Ju et al. US Pat. 6664079 , Parce WO 0050642 ., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363.
Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R₆-NH-R₇, R₆-O-R₇, R₆-S-R₇, R₆-SS-R₇, R₆-CO-NH-R₇, R₆-NH-CO-R₇, R₆-CO-O-R₇, R₆-O-CO-R₇, R₆-CO-S-R₇, R₆-S-CO-R₇, R₆-P(O)₂-R₇, R₆-Si-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-A-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CH=CH-)_n-R₇, R₆-(A-CH=CH-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-B-)_n-R₇, R₆-A-CH=CH-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-)_n-R₇, R₆-(C≡C-B-)n-R₇, R₆-A-C≡C-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-R₇,
wobei R₆ – die Nuk-Komponente ist, R₇ – de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente kovalent verbunden. Auf der anderen Seite können weitere Teile des Linkers, z. B. ein hydrophiles Polymer oder direkt die Kopplungseinheit T oder direkt der Marker gebunden werden.
Im Folgenden, wird die Kopplung eines Polymers, als Bestandteil des Linkers exemplarisch erläutert. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-, Alkyn-, Isothiocyanat- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z. B. Fluka, Iris-Biotech, Nanocs inc, Pierce Biotech). Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind unter Beispielen angegeben.
Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z. B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta-hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.
Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.
1.3.3.2.4 Linker-Kopplung in einem Nuk-Makromolekül
Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk-Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-, Alkyn-, Isothiocyanat- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z. B. Sigma-Aldrich, Iris-Biotech, Nanocs Inc.,). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind angegeben in Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 . Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0; „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen s. Anmeldungen Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 .
Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.
1.3.3.3 Marker-Komponente
Beispiele für Signal-gebende Marker-Komponente und die Zusammensetzung der Marker–Komponente von Nuk-Makromolekülen sind in Anmeldungen, Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 angegeben,
Oligonukleotid-Anteil des Nukleotid-Konjugates
In einer Ausführungsform schließt eine Marker-Komponente mindestens ein Oligonukleotid ein (1). Dieses Oligonukleotid kann DNA, PTO, RNA, PNA, LNA oder auch weitere, zur Basenpaarung fahrige Modifikationen der Nukleinsäureketten einschließen.
In einer Ausführungsform ist das Oligonukleotid teilweise oder vollständig doppesträngig. Dies kann beispielsweise über selbstkomplementäre Abschnitte innerhalb des Oligonukleotids erreicht werden oder durch Hybridisierung eines weiteren vorwiegend oder vollständig komplementären Oligonukleotids.
Solche doppelsträngige Oligonukleotid-Strukturen können eine Polymerase daran hindern, zwei und mehr Nukleotid-Konjugate an benachbarten Positionen hintereinader einzubauen. Es kommt zu einem Stopp in der Synthese durch die sterische Wirkung des Oligonukleotids. Viele Beispiele eines Synthese-Stopps durch Haarnadel-Strukturen der Matrizen bei einer Replikation sind einem Fachmann bekannt. Ein überraschendes Ergebnis dieser Erfindung liegt unter anderem darin, dass solche Haarnadelstrukuren oder auch vollständig doppelsträngige Oligonukleotide innerhalb eines Nukleotid-Konjugats ebenfalls zu einem Stopp führen können.
Nach Spaltung des Linkers eines eingebauten Nukleotid-Konjugats kann ein solches sterisches Hindernis entfernt werden, so dass Polymerase die Synthese fortsetzen kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt das Oligonukleotid mindestens einen einzelsträngigen Sequenzabschnitt ein, der komplementär an einzelsträngige Nukleinsäureketten binden kann. Diese Bindung erfolgt vorzugsweise über Hybridisierung an eine zu markierende Nukleinsäurekette. Die Länge des Abschnittes des Oligonukleotids muss an die jeweiligen Assay-Bedingungen angepasst werden. Diese Länge schließt folgende Bereiche ein (gemessen in Nukleobasen): 2 bis 4, 4 bis 6, 6 bis 8, 8 bis 10, 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100.
In einer weiteren Ausführungsform schließt ein Oligonukleotid mehr als einen solchen Sequenzabschnitt ein.
Die Zusammensetzung der Nukleobasen dieses Abschnitts ist vorzugsweise dermassen gewählt, dass die Differenzierungsfähigkeit eines solchen Sequenzabschnitts des Oligonukleotids unter Reaktionsbedingungen absichtlich gering gehalten wird.
Dies kann beispielsweise durch kurze Strecken von 4 bis zu 8 DNA Nukleotid-Monomeren und Raumtemperatur-Bedingungen erreicht werden. Fachmann kennt ähnliche Beispiele einer geringen Differenzierung, z. B. mit Hexamer-Primern.
In einer anderen Ausführungsform schließt das Oligonukleotid eine oder mehrere Strecken von Homopolymeren ein (z. B. 5 bis 50 Adenosin-Nukleobasen oder 5 bis 50 Cytosin-Nukleobasen oder 5 Guanosin-Nukleobasen oder 5 bis 50 Thymidin-Nukleobasen). Solche Homopolymer-Strecken können mit anderen Homopolymerenthaltenden Sequenzbereichen relativ unspezifisch eine Basenpaarung eingehen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt das Oligonukleotid eine oder mehrere kurze repetitive Sequenzabschnitte ein, z. B. 2 bis 100 Abschnitte mit einer sich wiederholenden Sequenz, z. B. AATCC. Auch solche Reapeats können an entsprechend komplementäre Abschnitte der Nukleinsäuren realtiv unspezifisch binden, da ihre eindeutige Positionierung
Je nach Natur des Oligonukleotid-Anteils (also z. B. DNA, PTO, RNA, PNA oder LNA) kann die Spezifität der Bindung an die jeweilige Nukleinsäurekette variieren. Einem Fachmann ist beispielsweise bekannt, dass PNA-basierte Oligonukleotide eine stärkere Affinität zu komplementären Bereichen aufweisen, als die DNA-basierte Oligonukleotide der gleichen Zusammensetzung und Länge.
Die Kopplung des Oligonukleotide im Nuk-Makromolekül erfolgt in einer Ausführungsform an einem der beiden Enden des Oligonukleotids (11), z. B. am 5'-Ende oder am 3'-Ende. Beispiele für Kopplung eines Oligonukleotides an einem seiner Enden sind einem Fachmann bekannt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kopplung von anderen Bestandteilen des Nuk-Makromoleküls (z. B. Nuk-Komponente) im inneren Bereich des Oligonukleotids.
Beispielweise kann der jeweilige Linker zwischen einer Nuk-Komponente und einem Oligonukleotid an einer der Basen des Oligonukleotids oder an einem Monomer des Rückgrandes (z. B. am Zucker oder Phosphat bei einem DNA-Rückgrad oder an einer Aminosäure bei einem PNA-Rückgrad, oder am Schwefel-Atom eines PTO-Rückgrades) gekoppelt werden. Einem Fachmann sind verschiedene Möglichkeit der Kopplung von Substanzen an ein Oligonukleotid an verschiedenen Positionen bekannt.
Der Abschnitt des Oligonnukleotids, der unspezifisch an Nukleinsäureketten binden kann, kann am 5'-Ende oder am 3'-Ende von weiteren Sequenzabschnitten flankiert sein. Diese flankierenden Bereiche können aus gleichen Monomenren bestehen (z. B. DNA, PTO, PNA, LNA, RNA) oder sich in der Zusammensetzung von dem bindenden Abschnitt unterscheiden. Diese flankierenden Sequenzabshcnitte können in der Länge von 1 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 15, 15 bsi 20, 20 bis 30, 30 bis 100 oder länger als 100 Nukleobasen betragen. Sie können als Abstandhalter dienen oder beispielsweise Funktionen der Marker-Komponente ausführen siehe Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 .
Ein Linker, der eine Nuk-Komponente mit dem Oligonukleotid verbindet, kann beispielsweise an einen solchen flankierenden Bereich gekoppelt sein.
Das Oligonukleotid kann teilweise selbst-komplementäre Abschnitte einschließen, z. B. als Haarnadelstrukturen (engl. Hairpins) oder Schleifen (Engl. Loops) (8). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Oligonukleotid an der Bildung einer Struktur vom Typ des so genannten „Molecular Beacon” beteilgt (zu Eigenschaften von Molecular Beacons: Bonnet et al. PNAS 1999, v 96. 6171–). Die selbstkomplementären Bereiche eines solchen Molecular-Beacons sind in der Regel zwischen 4 bis 6, 6 bis 8, 8 bis 10, 10 bis 15, 15 bis 30 Nukleotiden lang. Es können mehrere selbstkomplementäre Abschnitte innerhalb eines Oligonukleotids vorkommen, z. B. 1 bis 10. Die Sequenz-Zusammensetzung dieser selbstkomplementären Abschnitte ist beispielsweise unterschiedlich.
Einem Fachmann sind Oligonukleotid-Modifikationen bekannt, welche die Bindung an die Nnukleinsäureketten beeinflussen können. Zu solchen Modifikationen gehören z. B. „Minor-Groove-Binder”.
In einer Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des Oligonukleotids, (oder des flankierenden Oligonukleotids) durch eine chemische Gruppe geblockt. Einem Fachmann sind viele Beispiele von Modifikationen von 3'-OH-Gruppe bei Oligonukleotiden bekannt. Sie schließen beispielsweise folgende Substanzen ein: eine 2'.3'-Dideoxy-Ribose, eine Phosphat-Gruppe, einen Biotin-Rest, einen Amino-Linker, einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Peptid-Kette, einen Quencher. Anstelle von 3'-OH Gruppe können verschiedene Modifikationen in ein Oligonukleotid inkorporiert sein, z. B. eine Amino-Gruppe, eine Halogen-Atom, eine Azid-Gruppe usw. In dieser Ausführungsform kann ein solches Oligonukleotid nicht weiter durch eine Polymerase extendiert werden, es hat also keine Primer-Funktion.
In einer anderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des Oligonukleotids nicht blockiert und kann von einer Polymerase verlängert werden.
Vorzugsweise schließen ein Oligonukleotid von Nuk-Makromolekülen Nukleinsäureketten mit einer Gesamt-Länge in folgenden Bereichen ein: von 3 bis 6, 6 bis 9, 9 bis 12, 12 bis 14, 14 bis 16, 16 bis 18, 18 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 100, 100 bis 200 Nukleobasen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Sequenzen der Oligonukleotide dermassen ausgewählt, dass sie nicht in der Lage sind, unter verwendeten Reaktionsbedinungen an andere Arten von Nuk-Makromolekülen zu binden. Jede Art von Nuk-Makromolekülen hat somit eine eigene, nicht zu anderen Oligonukleotiden komplementäre Oligonukleotid-Sequenz.
Das Oligonukleotid kann zusätzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise signalgebende oder signalvermittelnde Moleküle, z. B. Farbstoffe, Fluoresenzfarbstoffe oder Biotin, oder makromolekulare Substanzen, wie Enzyme oder Nanokristalle.
Bezüglich der chemischen Synthese von Oligonukleotiden und deren Modifikation kann ein Fachmann an folgende Quellen verwiesen werden:
Singh et al Chem Soc Rev, 2010, v. 39, 2054–, "Oligonucleotide synthesis, methods and applications" Piet Herdewijn, 2004, ISBN 1-58829-233-9, "Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and analytical techniques" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-252-3, "Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and properties" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-247-7, "The aptamer handbook" Sven Klussmann, 2006, ISBN 10: 3-527-31059-2, "Pharmaceutical aspects of oligonucleotides" Patrick Couvreur, 2000, ISBN 0-748-40841-X, "Triple Helix forming Oligonucleotides" Claude Malvy, 1999, ISBN 0-7923-8418-0, "Artificial DNA, methods and applications" Yury E. Khudyakov, ISBN 0-8493-1426-7
Komplementäre Sonden (z. B. Oligonukleotide) zu Oligonukleotidsequenz des Nuk-Makromoleküls (Fig. 9).
In einer Ausführungsform der Erfindung schließen Nukleotid-Konjugate weitere Nukleinsäurekette ein, die zum Oligonukleotidanteil sequenzspezifische komplementäre Abschnitte aufweisen. (8–10). Solche Nukleinsäureketten können als komplementäre Oligonukleotide bezeichnet werden.
Struktur von komplementäre Oligonukleotiden
In einer Ausführungsform besteht das komplementäre Oligonukleotid aus Nukleobasen. Die Nukleobasen wie Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil (abgekürzt als A, C, G, T, U) oder deren Analoga gekoppelt an einen Zucker-Phosphatrückgrad in Form von DNA oder RNA oder deren Analoga, z. B. PTO, PNA, LNA, können sequenzspezifisch an die Nukleinsäurestränge binden.
Falls mehrere komplementäre Oligonukleotide innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen vorkommen, können einzelne Sequenzabschnitte unterschiedliche Arten von Bausteinen vorweisen, z. B. ein Antagonisten-Oligonukleotid besteht aus DNA, ein anderes aus PNA, usw.
Zur Vereinfachung der Darstellung werden komplementäre Oligonukleotide in Form der DNA in Details besprochen. Andere Arten der Nukleinsäureketten können entsprechend den einem Fachmann bekannten Regeln nach dem Muster der DNA-Oligonukleotide konstruiert und eingesetzt werden.
Die Länge des komplementären Oligonukleotids schließt vorzugsweise folgende Bereiche ein: 15 und 25, 25 bis 50, 50 bis 100, länger als 100 Basenpaaren.
Das komplementäre Oligonukleotid kann am 5'-Ende oder am 3'-Ende von weiteren Sequenzabschnitten flankiert sein, die nicht an das Oligonukleotid des Nukleotid-Konjugates binden. Diese flankierenden Sequenzabshcnitte können in der Länge von 1 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 15, 15 bsi 20, 20 bis 30 oder länger als 30 Nukleobasen betragen. Sie können als Abstandhalter oder Maerker dienen.
Einem Fachmann sind weitere Oligonukleotid-Modifikationen bekannt, welche die Bindung komplementärer Nukleinsäureketten unetreinander beeinflussen können. Zu solchen Modifikationen gehören z. B. „Minor-Groove-Binder”.
In einer Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des komplementären Oligonukleotids (oder des flankierenden Oligonukleotids) durch eine chemische Gruppe geblockt. Einem Fachmann sind viele Beispiele von Modifikationen von 3'-OH-Gruppe bei Oligonukleotiden bekannt. Sie schließen beispielsweise folgende Substanzen ein: eine 2'.3'-Dideoxy-Ribose, eine Phosphat-Gruppe, einen Biotin-Rest, einen Amino-Linker, einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Peptid-Kette, einen Quencher. Anstelle von 3'-OH Gruppe können verschiedene Modifikationen in ein Oligonukleotid inkorporiert sein, z. B. eine Amino-Gruppe, eine Halogen-Atom, eine Azid-Gruppe usw. In dieser Ausführungsform kann ein solches Oligonukleotid nicht weiter durch eine Polymerase extendiert werden, es hat also keine Primer-Funktion.
Die komplementären Oligonukleotide können teilweise selbst-komplementäre Abschnitte einschließen, z. B. als Haarnadelstrukturen (engl. Hairpins) oder Schleifen (Engl. Loops). In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Antagonisten-Oligonukleotid an der Bildung einer Struktur vom Typ des so genannten „Molecular Beacon” beteilgt (zu Eigenschaften von Molecular Beacons: Bonnet et al. PNAS 1999, v 96. 6171–).
In einer Ausführungsform erfolgt die Bindung von komplementären Oligonukleotiden an Nukleotid-Konjugate vor einer Einbaureaktion. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung von komplementären Oligonukleotiden an Nukleotid-Konjugate erst nach einer Einbaureaktion.
1.3.3.3.3 Signal-Domäne (Funktionen und Zusammensetzung)
Funktion einer Signal-Domäne
Die Signal-Domäne kann in einer Ausführungsform eine signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat die Signal-Domäne mehr als nur eine Funktion, sondern z. B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere Kombinationen sind nahe liegend.
Bei der signalgebenden Funktion enthält die Signal-Domäne Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an Nuk-Makromoleküle gebunden werden, s. Beispiele in Anmeldungen Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 .
In einer Ausführungsform hat das Oligonukleotid des Nukleotid-Konjugates eine Signal-Funktion: es kann beispielsweise einen oder mehrere Fluorescenzfarbstoffe einschließen.
In einer weitren Ausführungsform hat das Oligonukleotid des Nukleotid-Konjugates eine signalvermittelnde Funktion: es schließt beispielsweise mindestens einen Biotin-Rest ein oder hat einen Sequenzabschnitt, an den noch weitere markierte Oligonukleotide binden können.
1.3.3.3.4 Die Kern-Komponente des Markers
Die Kernkomponente hat die Funktion, mehrere strukturelle Elemente der Nuk-Makromoleküle zu binden. Beispielsweise bindet die Kern-Komponente mehrere Marker-Einheiten zusammen oder einzelne Domänen können mittels Kern-Komponente verbunden sein. In einer weiteren Ausführungsform können Linker-Komponenten an die Kern-Komponente gebunden werden. Der Begriff der Kern-Komponente ist funktionell und dient zur Erläuterung von möglichen Strukturen von Nuk-Makromolekülen. Unterschiedliche chemische Strukturen, die Linker und Marker-Einheiten zusammenhalten, können als Kern-Komponente bezeichnet werden. Im Folgenden sind Beispiele für Bestandteile der Kernkomponente angegeben.
Beispiele für Kernkomponente sind in Anmeldungen Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 angegeben,
1.3.3.3.6 Kopplung zwischen Linker und Marker
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab. In einer Ausführungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden. Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern-Komponente des Markers gebunden.
Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z. B. "Bioconjugation: Protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of Protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z. B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z. B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s. o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s. o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.
1.3.3.3.7 Das Verhältnis der Nuk-Komponenten in einem Nuk-Makromolekül
Ein Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100 Nuk-Komponenten einschließen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von Nuk-Linker-Komponenten, eine einheitliche Population an Nuk-Makromolekülen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Anzahl von Nuk-Komponenten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk-Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk-Komponenten pro Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.
1.3.3.3.8 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül
Die Zahl der Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000, mehr als 100000.
In einer Ausführungsform der Erfindung haben Nuk-Makromoleküle eine feste Anzahl von signalgebenden Einheiten pro Marker.
In einer anderen Ausführungsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.
Weitere Beispiele sind in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO2008043426 , angegeben.
1.3.6 Polymerasen
In einer Ausführungsform können die Nuk-Makromoleküle als Substrate für Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z. B. DNA- oder RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizen-unabhängig, z. B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001).
Falls RNA als Substrat (z. B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z. B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Auch für Klenow Fragment DNA Polymerase ist die Tätigkeit als Reverse Transcriptase beschrieben. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), z. B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.
Falls DNA als Substrat (z. B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5 Exonuklease-Aktivität (DNA-Replication" 1992. Ed. A. Kornberg, Freeman and company NY), z. B. modifizierte T7-Polymerase z. B. vom Typ ”Sequenase Version 2” (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (New England Biolabs), T4 DNA Polymerase, phi29 DNA Polymerase, Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase (New England Biolabs), Vent Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pfu Polymerase, Tli Polymerase, Tfl Polymerase, Tth Polymerase, Thermosequenase, Pwo-Polymerase, Terminator, Terminator I, Terminator II, Terminator III, Bst DNA Polymerase, Bst DNA Polymerase, Large Fragment, Phusion^® High-Fidelity DNA Polymerase, Phusion^® High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase, Phire^® Hot Start DNA Polymerase, Phire^® Hot Start II DNA Polymerase, Phusion^® Flash High-Fidelity DNA Polymerase, Crimson Taq DNA Polymerase, DyNAzyme^TM EXT DNA Polymerase, DyNAzyme^TM II Hot Start DNA Polymerase, 9°N_m DNA Polymerase usw. (von z. B. New England Biolabs oder von Promega oder von Roche oder von Qiagen).
Durch moderne gentechnische Methoden ist es möglich, Polymerasen zu konstruieren, die sich in ihren Fähigkeiten von in der Natur vorkommenden Enzymen unterscheiden, z. B. durch Fehlen bestimmter Aktititäten oder durch verbesserte enzymatische Parameter, wie z. B. Präzision, Prozessivität usw. Eine zunehmende Anzahl von Firmen stellt solche thermolabile und thermostabile Polymerase her, die als optimierte Enzyme für PCR oder andere Amplifikationsverfahren bzw. Markierungsverfahren vermarktet werden. Die Grundfunktionen der Polymerasen bleiben allerdings beibehalten: sie sind in der Lage, Nukleotide einzubauen und dadurch komplementäre Stränge synthetisieren. Solche Polymerasen können ebenfalls für die beschriebenen Methoden eingesetzt werden. Eine entsprechende Optimierung der Reaktionsbedingungen ist einem Fachmann bekannt.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen ohne eine 5'-3'-exonuklease-Aktivität bevorzugt, z. B. Klenow Fragment exo minus, Vent exo minus,, Bst-Polymerase großes Fragment.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen ohne eine 3'-5'-exonuklease-Aktivität bevorzugt, z. B. Klenow-Fragment exo minus.
1.3.7. Spaltbare Verbindung
Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z. B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, oxidativ spaltbare. Verbindungen (z. B. Linker, die eine Tartrat-Verbindung einschließen) oder eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082 , Tcherkassov WO 02088382 ) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429 ) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284 ), spaltbar durch Peptidasen, eine Poly- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann.
Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Parce WO 0050642 .).
Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makrer-Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente.
1.3.8 DNA Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z. B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
1.3.9 RNA – Ribonukleinsäure
1.3.10 PNA – Peptide Nucleic Acid
1.3.11 LNA – locked nucleic acids
1.3.12 Nükleotide:
Nukleotide dienen als Substrate für Polymerasen in einer matrizenabhängigen Synthese-Reaktion. Sie können in einen komplementären Strang eingebaut werden.

• dNTP – 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate oder deren Analoga, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z. B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP, dITP oder deren Analoga wie 7-Deaza-dATP oder 7-Deaza-dGTP. Auch weitere Analoga von natürlichen 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphaten können von DNA-Polymerasen als Substrate verwendet werden.
• NTP – Ribonukleosid-Triphosphate oder deren Analoga, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.
• Abkürzung ”NT” wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z. B. 1.000 NT. In diesem Fall steht ”NT” für Nukleosid-Monophosphate. Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes ”s” gebildet, ”NT” steht zum Beispiel für ”Nukleotid”, ”NTs” steht für mehrere Nukleotide.

1.3.13 NSK – Nukleinsäurekette. DNA oder RNA, PNA, LNA
1.3.14 Gesamtsequenz – Summe aller Sequenzen zu analysierenden Nukleinsäureketten im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder Äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z. B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen. Gesamtsequenz kann eine oder mehrere Zielsequenzen einschließen.
1.3.15 NSKF – Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs – Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) – Teil der Zielsequenz, an den ein Primer binden kann
1.3.17 Referenzsequenz – eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z. B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z. B. aus der NCBI-Datenbank.
1.3.18 Tm – Schmelztemperatur
1.4. Nachfolgend sind wichtige Aspekte der Erfindung aufgeführt.
Aspekt 1: Nukleotid-Konjugate, die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest ein Oligonukleotid und mindesten einen Linker zwischen der Nukleotid-Komponente und dem Oligonukleotid
In einer Ausführungsform ist die Nukleotid-Komponente über einen Linker an das Oligonukleotid an einem seiner Enden gekoppelt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleotid-Komponente über einen Linker an einer internen Position an das Oligonukleotid gekoppelt. In einer Ausführungsform ist der Linker beispielsweise an die Base der Nukleotid-Komponente gekoppelt. In einer weiteren Ausführungform ist der Linker an den Zucker-Anteil der Nukleotid-Komponente gekoppelt.
Aspekt 2: Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 1, wobei der jeweilige Linker spaltbar ist. Beispielsweise schließt der Linker eine Disulfid-Bindung oder eine photolabile Bindung ein.
Aspekt 3: Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 1, wobei das Oligonukleotid selbstkomplementäre Sequenzabschnitte einschließt. Diese Sequenzabschnitte können von 4 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 40, oder länger als 40 Basen sein. Vorzugsweise sind sie zwischen 4 und 15 Basen lang.
Aspekt 4: Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 1, wobei mindestens ein weiteres komplementäres Oligonukleotid an das Oligonukleotid gekopplet ist. In einer Ausführungsform erfolgt die Kopplung zwischen beiden Oligonukleotiden durch Hybridisierung von komplementären Bereichen der Oligonukleotide.
Aspekt 5: Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 1 bis 4, wobei mindestens eines der Oligonukleotide spezifisch markiert ist. Der Marker kann beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das 3'-Ende der genannten Oligonukleotide durch eine chemische Gruppe, z. B. eine Phosphat-Gruppe oder einen Farbstoff blokiert.
Aspekt 6: Ein Reaktionsgemisch bzw. eine Komposition für enzymatische Synthese von Nukleinsäureketten, das mindestens eines der Nukleotid-Konjugate nach oben genannten Aspekten einschließt
Aspekt 6: Ein Reaktionsgemisch bzw. eine Komposition für enzymatische Synthese von Nukleinsäureketten, das mindestens vier Arten von Nukleotid-Konjugaten nach oben genannten Aspekten einschließt, wobei Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate in einer Komposition folgende Basen oder deren Analoga einschließen: Adenin, Guanin, Cytidin, Uridin, undjede Art dieser Nukleotid-Konjugaten einen für sie charakteristischen Marker einschließt.
Aspekt 7: Ein Reaktionsgemisch bzw. eine Komposition für enzymatische Synthese von Nukleinsäureketten, das mindestens vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten nach oben genannten Aspekten einschließt, wobei eine Population von Nukleotid-Konjugaten durch eine einheitliche Nukleobase der Nukleotid-Komponente oder deren Analoga (z. B. Adenin, Guanin, Cytidin, Uridin) charakterisiert ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt eine Population von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nukleobase der Nuk-komponente mehrere Oligonukleotide ein. Die Anzahl der Oligonukleotide in einer Population von Nukleotid-Konjugaten schließt folngende Bereiche ein: 4 bis 50, 50 bis 500, 500 bis 5000, 5000 bis 10000, 10000 bis 1000000, mehr als 1000000. Vorzugsweise schließt sie Bereiche von 4 bis 5000 ein.
Die zu einer Population gehörenden Nukleotid-Konjugate haben vorzugsweise mindestens einen für diese Population charakteristischen Marker. Dieser Marker schließt in einer Ausführungsform einen Fluoreszenzfarbstoff ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt dieser Marker einen einheitlichen Sequenzabschnitt der Oligonukleotide ein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließen die Oligonukleotide einer Population mindestens einen variablen Sequenzabschnitt ein. Dieser variable Sequenzabschnitt unterscheidet sich von Oligonukleotid zu Oligonukleotid einer Population. Die Vielzahl der Varianten in diesem Abschnitt hängt von der Länge des Abschnittes ab. Je länger der Sequenzabschnitt desto größer kann die Variabilität in diesem Abschnitt sein. In einer Ausführungsform schließt die Vielzahl der variablen Sequenzabschnitte der Oligonukleotide einer Population sämtlich mögliche Abfolgen der Nukleobasen in diesem Abschnitt ein (randomisierte Sequenzen). Die Anzahl der möglichen Sequenzabfolgen hängt von der Länge des variablen Sequenzabschnittes ab und wird berechnet als 4^n, wobei (n) die Länge des variablen Abschnittes in Nukleobasen ist. Beispielsweise schließt eine Population 256 Oligonukleotide bei einer Länge des variablen Abschnittes von vier Nukleobasen oder 4096 Oligonukleotide bei einer Länge des variablen Abschnittes von sechs Nukleobasen.
Der variable Sequenzabschnitt der Oligonukleotide ist vorzugsweise einzelsträngig. Durch diesen Abschnitt können Oligonukleotide einer Population von Nukleotid-Konjugaten an einen Strang einer Nukleinsäurekette binden. Eine solche Bindung erfolgt über Hybridisierung eines variablen Abschnittes eines Oligonukleotides einer population von Nukleotid-Konjugaten an eine komplementäre Sequenz einer Nukleinsäurekette. Dank der Vielzahl von variablen Abschnitten innerhalb einer Population von Oligonukleotiden hat eine Population von Nukleotid-Konjugaten das Potenzial, an Nukleinsäuereketten mit beliebiger Zusammensetzung zu binden.
Aspekt 8: Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Konjugate eingesetzt werden.
Aspekt 9: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt:

– Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen
– Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der Nukleotid-Konjugate enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um ein Nukleotid-Konjugate erlauben, wobei jede Art von Nukleotid-Konjugate charakteristisch markiert ist.

Aspekt 10: Kit zur Durchführung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt:

– Eine oder mehrere Arten der Polymerasen
– Zumindes eine Art von Nukleotid-Konjugaten

Aspekt 11A: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten durch die Synthese, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11B: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Oligonukleotidsequenz besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Zugabe mindestens eines markierten Oligonukleotids zu verlängerten NSK-Primer-Komplexen und Inkubation unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung markierter Oligonukleotide an die Oligonukleotide der Nukleotid-Konjugate zulassen
e) Entfernung der nicht hybridisierten, markierten Oligonukleotide von den NSK-Primer-Komplexen
f) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate mit hybridisierten markierten Oligonukleotiden h) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11C: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei das Oligonukleotid der Nukleotid-Konjugate nicht zur Nukleinsäurekette komplementär ist und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11D: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei mindestens ein Abschnitt des Oligonukleotids der Nukleotid-Konjugate an die zu sequenzierende Nukleinsäurekette binden kann und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11E: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens vier Arten der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei das Oligonukleotid der Nukleotid-Konjugate mindestens einen einzelsträngigen Abschnitt einschließt, der an die zu sequenzierenden Nukleinsäureketten binden kann und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11F: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens vier Arten der Nukleotid-Konjugate zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei jede Art der Nukleind-Konjugate eine Komposition bestehend aus einer Vielzahl von Nukleotid-Konjugaten darstellt, wobei diese Komposition ein einheitliches Nukleosid-Triphosphat (Nuk-Komponeten) und eine Vielzahl von Oligonukleotiden einschließt, welche jeweils mindestens einen einzelsträngigen Abschnitt einschließen, wobei diese Abschnitte eine unterschiedliche Sequenzzusammensetzung haben und in der Lage sind an die zu sequenzierenden Nukleinsäureketten zu binden, und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Aspekt 11G: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten nach dem vorherigen Aspekt, wobei die jeweilige Komposition der Nukleind-Konjugate Oligonukleotide einschließt, die an die zu sequenzierende Nukleinsäureketten über einzelsträngige Absschnitte von ca. 3 bis 15 Nukleobasen binden.
Ein weiterer Aspekt 12 der Erfindung betrifft makromolekulare Nukleotid-Verbindungen nach einem der Aspekte 1 bis 11, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (12):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO₃, SH, N₃, NH₂, O-R_3-1, P(O)_m-R_3-1 (m ist 1 oder 2 ist), NH-R_3-1, S-R_3-1, Si-R_3-1 wobei R_3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH₂-O-Y, -CH₂-S-Y, -CH₂-N₃, -CO-O-Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH₂-CH=CH₂, wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH₂)_n-CH₃ wobei n zwischen 0 und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy-Gruppen).
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.
Ein weiterer Aspekt 13 der Erfindung betrifft makromolekulare Nukleotid-Verbindungen nach einem der Aspekte 1 bis 11, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (12):
Wobei:
Base- ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH₂, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O-R_3-2-L, P(O)_m- R_3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R_3-2-L, S-R_3-2-L, Si-R_3-2-L oder, wobei R_3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L – die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.
Ein weiterer Aspekt 14 der Erfindung betrifft makromolekulare Nukleotid-Verbindungen nach einem der Aspekte 1 bis 11, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (12):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, PO₃, SH, NH₂, O-R_3-1, P(O)m- R_3-1, NH-R_3-1, S-R_3-1, Si-R_3-1 wobei R_3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R_5-1-L, oder P-(O)₃- R_5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)₃-P-(O)₃-R_5-1-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe)
oder P-(O)₃-P-(O)₃-P-(O)₃- R_5-1-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R₅ die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist.
Ein weiterer Aspekt 15 der Erfindung betrifft makromolekulare Nukleotid-Verbindungen nach Aspekten 12 bis 14, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R₆-NH-R₇, R₆-O-R₇, R₆-S-R₇, R₆-SS-R₇, R₆-CO-NH-R₇, R₆-NH-CO-R₇, R₆-CO-O-R₇, R₆-O-CO-R₇, R₆-CO-S-R₇, R₆-S-CO-R₇, R₆-P(O)₂-R₇, R₆-Si-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-A-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CH=CH-)_n-R₇, R₆-(A-CH=CH-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-B-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-CH₂-B-)_n-R₇, R₆-A-CH=CH-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CC≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-CH₂)_n-R₇, R₆-(C≡C-B-)_n-R₇, R₆-(C≡C-CH₂-B-)_n-R₇, R₆-A-C≡C-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-R₇
wobei R₆ – die Nuk-Komponente ist, R₇ – der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Ein weiterer Aspekt 16 der Erfindung betrifft makromolekulare Nukleotid-Verbindungen nach Aspekten 12 bis 15 wobei die Linker-Komponente ein hydrophiles, wasserlösliches Polymer einschließt.
Ein weiterer Aspekt 17: Kit zur Markierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren nach einem der Aspekte, das folgende Elemente einschließt:

– Eine oder mehrere Arten der Polymerasen
– Zumindes eins der Nukleotid-Analoga (Nuk-Makromoleküle), nach Aspekten 1 bis 16
– Eine feste Phase zu Bindung von markierten Nukleinsäureketten

Ein weiterer Aspekt 18: Kit zur Markierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Aspekte, das einer oder mehrere der folgenden Kompositionen – vorliegend als Lösung in konzentrierter oder in verdünter Form oder auch als Gemisch von trockenen Substanzen – aus der folgenden Liste einschließt:

– Eine oder mehrere Arten der Polymerasen
– Zumindes eins der Nukleotid-Analoga (Nuk-Makromoleküle), nach einem der Aspekte 1 bis 16
– Lösungen zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen
– Komposition für Einbaureaktion, einschließlich mindestens einer erforderliche Art von weiteren Nukleosid-Triphosphaten
– Komposition für die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase
– Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion
– Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase

Ein weiterer Aspekt 19: Kit zur Amplifikation und Markierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte, das eine oder mehrere Elemente aus der folgende Liste einschließt:

– Eine oder mehrere Arten der Polymerasen
– Eine oder mehrere Primer für die Amplifikation von Nukleinsäureketten
– Zumindes eins der Nukleotid-Analoga (Nuk-Makromoleküle), nach einem der Aspekte 1 bis 16
– Lösungen zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen
– Komposition aus vier dNTPs oder NTPs
– Komposition für die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase
– Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion
– Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase

Ein weiterer Aspekt 20: Kit zur Amplifikation und Markierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt:

– Reverse Transcriptasen: M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV
– DNA Polymerasen: Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase, Tli DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase

Ein weiterer Aspekt 21: Kit zur Markierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte in dem die Bestandteile der Kompositionen breits vorgemischt vorliegen.
1.5 Beispiele für Ausführungsformen
Beispiele für Kopplungen von einzelnen Komponenten von Nuk-Makromolekülen sind in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 102004009704 angegeben. Nuk-Makromoleküle werden von der Firma Genovoxx GmbH als Auftragssynthese entwickelt und vermarktet.
Material:

dUTP-AA (dUTP-Allylamine, Jena-Bioscience oder Trilink Biotechnologies), dCTP-PA (dCTP-Propargyl-Amin, Jena Bioscience), dATP-PA (7-(3-Amino-1-propynyl)-2' deoxy-7-deazaadenosi n-5'-Triphosphat) (Auftragssynthese von JenaBioscience), dGTP-PA (7-(3-Amino-1-propynyl)-2' deoxy-7-deazaguanosin-5'-Triphosphat, (Auftragssynthese von JenaBioscience), PDTP (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure, Fluka), 7-(3-Phthalimido-1-propynyl)-2'-desoxy-7-deazaguanosin und 7-(3-Phthalimido-1-propynyl)-2'-desoxy-7-deazaadenosin (Chembiotech), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma, TCEP – (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma, J-Ac (Indoacetat, Sigma, Iodacetamid (Sigma), Gamma-((6-aminohexyl)-imido)-dUTP (Jena Bioscience). Lieferanten und Firmenverzeichnis:

Aldrich	– s. Sigma
Fluka	– s. Sigma
Jena-Bioscience	– Jena-Bioscience, Jena, Deutschland
Molecular Probes	– Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande
MWG	– MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland,
Roche	– Roche, Mannheim, Deutschland
Sigma	– Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland,
Trilink	– Trilink Biotechnologies Inc. San Diego, CA, USA,

Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).
1.5.14 Beispiele von Synthesen von Nuk-Makromolekülen
Es sind viele Methoden für eine kovalente Kopplung von Substanzen an Nukleinsäureketten bekannt. Die Kopplung kann an verschiedene Positionen in der Nukleinsäurekette (5'-Position, 3'-Position, innere Abschnitte) erfolgen. Mehrere Markierungen pro eine Nukleinsäurekette sind ebenfalls möglich. Die Modifikation kann durch chemische oder auch enzymatische Reaktionen erfolgen. „Protocols for Oligonuccleotide and Analogs" S. Agrawal, 1993, „Protocols for Oligonucleotide conjugates" S. Agrawal 1994, Y. Singh et al Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 2054–. Einerseits, kann kann die Kopplung einer Substanz bereits während der chemischen/enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren durchgeführt werden (z. B. durch Nutzung von Phosphoroamiditen oder durch Nutzung modifizierter Nukleotide und einer Polymerase oder durch Nutzung von Ligase-Reaktion). Andererseits, kann die Kopplung über einen oder mehrere Zwischenschritte, z. B. durch Einführung einer reaktiven Gruppe, erst nach der Synthese erfolgen.
Nachfolgend werden einige Beispiele vorgestellt, die zur Demonstrationszwecken einige dieser Varianten beschreiben.
Synthese von Nuk-Linker-Komponenten mit reaktiven Gruppen.
Die Kopplung von Nuk-Komponenten und Oligonukleotiden, kann durch viele Methoden erreicht werden. Beispielsweise, sind viele Methoden bekannt, wie man zwei Strukturen, die reaktive Amino-Gruppen vorweisen, mittels eines Cross-Linkers koppelt. Mit einer oder mehreren Amino-Gruppen modifizierte Oligonukleotide können kommerziell erworben werden. Die Amino-Gruppe kann wahlweise am 5'-Ende, 3'-End, oder auch im internen Bereich eines Oligonukleotides vorkommen. In folgenden Beispielen sind amino-reaktive Nuk-Komponenten beschrieben, die als Vorstufen bereitgestellt werden. Solche amino-reaktive Nukleotide können an die Oligonukleotide gekoppelt werden. Ebenfalls können Oligonukleotide synthetisiert werden, welche eine Merkapto-Gruppe an einem der Enden enthalten (z. B. von ThermoFischer Scientific Deutschland). Auch andere Beispiele für Einführung von reaktiven Gruppen in Oligonukleotide sind einem Fachmann bekannt.
Beispiel 1
Synthese von dUTP-AA-PDTP, dGTP-PA-PDTP, dATP-PA-PDTP, dCTP-PA-PDTP (Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005 044836 beschrieben)
20 mg dUTP-AA wurden in 1 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA – Lösung wurde PDTP-NHS 60 mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 40°C durchgeführt.
Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.
Weitere Nukleotidanaloga, 7-Deaza-Aminopropargyl-2'-Desoxy-Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl-2 Desoxy-Adenosin-triphosphat, 5-Amino-Propargyl-2'-Desoxy-Cytidin-Triphosphat wurden ebenfalls modifiziert wie oben angeführt. Es resultierten dGTP-PA-PDTP, dATP-PA-PDTP, dCTP-PA-PDTP entsprechend.
Beispiel 2
Synthese von dUTP-PEG(9)-NHS, dUTP-DTBP-NHS und dUTP-Tartrat-NHS
Betspiel 2A: Kopplung eines kurzen Linkers an die Base eines Nukleotids.
5 mg dUTP-AA (Aminoallyl-dUTP, von Trilink Biotechnologies), pH 7.0 wurden getrocknet und im trockenen DMSO bis zur berechneten Konzentration von 20 mmol/l suspendiert. PEG(9)-(NHS)2 (BS(PEG)9 erhalten von Thermo Scientific Deutschland) wurde in DMSO bis zur Konzentration von 150 mmol/l gelöst.
Die dUTP-AA Suspension wurde zur PEG(9)-(NHS)2 Lösung zugegeben und 2 h bei 37°C unter kräftigem Rühren inkubiert, bis die Lösung durchsichtig wurde. Die Umsetzung von dUTP-AA wurde mittels DC-Kontrolle kontrolliert.
Die Aufreinigung von dUTP-PEG(9)-NHS erfolgte mittels Präzipitation durch Diethyläther/DMF-Gemisches (v:v 90:10). Das Pellet enthält das Produkt. Das Produkt wurde in DMSO gelöst und eingefroren.
In änlicher Art und Weise können weitere dUTP-R-X Analoga synthetisiert werden, wobei (R) einen beliebigen Linker und (X) eine beliebige reaktive Gruppe darstellen kann. Die reaktive Gruppe kann beispielsweise mit Amino-Gruppen oder Thio-Gruppen oder Carboxy-Gruppen reagieren: Beispiele für weitere käuflich erhältliche kurze Linker (Cross-Linker) sind im Cross-Linker Guide von Thermo Scientific (www.Diercenet.com) präsentiert.
Linker können auch eine spaltbare Verbindung einschließen, z. B. eine reduktiv spaltbare Bindung (z. B. Dithiobispropionsäure-(NHS)2) oder eine oxidativ spaltbare Bindung (z. B. Tartrat-(NHS)2). Beide Krosslinker wurden von Thermo Scientific gekauft.
dUTP-DTBP-NHS wurde in einer ähnlicher Weise wie dUTP-PEG(9)-NHS synthetisiert. Anstatt von PEG(9)-(NHS)2 wurde Dithiobispropionsäure-(NHS)2 verwendet, DTBP-(NHS)2. Dieses dUTP-Analog hat einen Linker mit einer Disulfid-Bindung, der unter reduktiven Bedingungen, z. B. durch TCEP, gespalten werden kann.
dUTP-Tartrat-NHS wurde in einer ähnlicher Weise wie dUTP-PEG9-NHS synthetisiert. Anstatt von PEG(9)-(NHS)2 wurde Tartrat-(NHS)2 verwendet. Dieses Nukleotid hat einen Linker mit einer Diol-Bindung (-CH2(OH)-CH2(OH)-) die unter oxidativen Bedingungen (z. B. mit KClO4) gespalten werden kann.
NHS-Gruppe am Linker kann nun an Amino-Gruppe eines anderen Moleküls, z. B. eines Oligonukleotids gekoppelt werden.
Beispiel 2B: Kopplung eines kurzen Linkers an die Gamma-Phosphat-Gruppe eines Nukleotids.
Kopplung von PEG(9)-(NHS)2 bzw. Dithiobispropionsäure-(NHS)2 an die Amino-Gruppe des Gamma-((6-aminohexyl)-imido)-dUTP erfolgte unter ähnlichen Bedingugnen. Es resultierten Derivate von dUTP, die eine reaktive NHS-Gruppe an Gamma-Phosphat-Rest tragen: NHS-PEG(9)-ppp-dUTP und NHS-DTBP-ppp-dUTP.
Beispiele für Modifikaiton von Oligonukleotiden.
Oligonukleotide mit einer Aminogruppe an einem der beiden Ende können beispielsweise mit aktiven Estern (z. B. NHS-Ester modifiziert werden) modifiziert werden.
Beispiel 3
Synthese von PDTP-Oligo 1.
Oligo 1:
5'-NH2-taatacgactcactatagg-3'Phosphat
Oligo 1 wurde durch Überschuß von PDTP-NHS in einem Phosphat-Puffer/DMSO (20% DMSO), pH 8, modifiziert, so dass eine Disulfid-Gruppe am 5'-Ende von Oligo 1 eingeführt wurde (PDTP-Oligo 1). Das modifizierte Oligonukleotid wurde über DEAE Chromatographie gereinigt.
Kopplung von Nuc-Komponenten an das Oligonukleotid.
Beispiel 4
Synthese von dUTP-AA-SS-Oligo 1, dATP-PA-SS-OIigo1, dGTP-PA-SS-Oligo1, dCTP-PA-SS-Oligo1 durch Bildung einer Disulfid-Bindung
Synthese von dUTP-AA-SS-Oligo 1.
Zehn Äquivalente von dUTP-AA-PDTP wurden zu einem Äquivalent von PDTP-Oligo 1 (1 mmol/l) in einer Puffer-Lösung zugegeben. Zur Reduktion von Disulfid-Gruppen wurde TCEP in diese Lösung zugegeben (bis 10 mmol/l Endkonzentration), so dass dUTP-AA-SH und SH-Oligo 1 gebildet wurden. Anschließend wurde gesättigte J2 haltige Lösung (J2 gelöst in KJ-Lösung) zum Reaktionsansatz solange zugegeben, bis die gelbe Farbe von J2 sichtbar blieb. Durch J2-Zugäbe erfolgt eine Oxidation unter Ausbildung von Disulfid-Brücken. Das Produkt wurden mittels DEAE-Säule gereinigt.
dATP-PA-SS-Oligo1, dGTP-PA-SS-Oligo1, dCTP-PA-SS-Oligo1 wurden in ähnlicher Weise erhalten, wobei dGTP-PA-PDTP, dATP-PA-PDTP, dCTP-PA-PDTP anstatt von dUTP-AA-PDTP verwendet wurden.
Beispiel 5
Synthese von dUTP-PEG(9)-Oligo 2-Fluorescein, dUTP-AA-SS-Oligo2-Fluorescein
Oligo-2 Fluorescein,
5' NH2-cgt att acc gcg gct gct gg cac AAAAAAAAAA FAM
Am 5'-Ende ist eine NH2-Gruppe über C6-Linker gekoppelt und am 3'-Ende ist ein Farbstoff (Fluorescein) gekoppelt (siehe Liste der Sequenzen):
Das Oligonukleotid wurde in einem Phosphat-Puffer, pH 8.0, gelöst (1 mmol/l). Zu dieser Lösung wurde 5× Überschuß von dUTP-PEG(9)-NHS gelöst in DMSO zugegeben. Die Reaktion verlief bei RT. Die anschließende Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-C18 Säule. Das Produkt, dUTP-PEG(9)-Oligo2-Fluorescein, wurde getrocknet und anschließend in Wasser in 50 μmol/l Konzentrationen gelöst und eingefroren.
In ähnlicher Weise wurde auch dUTP-AA-SS-Oligo2-Fluorescein synthetisiert, wobei dUTP-DTBP-NHS anstelle von dUTP-PEG(9)-NHS verwendet wurde.
In ähnlicher Weise wurde auch dUTP-ppp-SS-Oligo2-Fluorescein synthetisiert, wobei NHS-DTBP-ppp-dUTP anstelle von dUTP-PEG(9)-NHS verwendet wurde. Ebenfalls wurde in ähnlicher Weise auch dUTP-ppp-PEG(9)-Oligo2-Fluorescein synthetisiert, wobei NHS-PEG(9)-ppp-dUTP anstelle von dUTP-PEG(9)-NHS verwendet wurde. Bei diesen Nukleotid-Konjugaten sind Oligonukleotide via Linker an die endständige Phosphat-Gruppe der Nuk-Komponente gekoppelt.
Beispiel 6
Synthese von dUTP-AA-SS-Oligo4-Fluorescein
(Oligonukleotid mit selbstkomplementären Sequenzen vom Typ „Molecular Beacon”)
Es wurde ein modifiziertes Oligonukleotid gekauft (Auftragssynthese Eurofins MWG), das selbstkomplementäre Sequenzabschnitte einschließt (Oligo 4) Eine solches Oligonukleotid kann in Lösung vollständig oder teilweise als doppelsträngiges Oligonukleotid vorliegen, genannt auch „Molecular Beacon”.
Oligo-4, Fluorescein,
5' NH2-cgt att acc gcg gct gct GTAATAC AAAAA AAAAA FAM (Stem-Bereiche sind unterstrichen)
Als Nuk-Komponente mit einem Linker wurde dUTP-DTBP-NHS verwendet (Synthese sieht oben). Das Oligonukleotid wurde in einer Phosphat-Puffer-Lösung, pH 8, aufgelöst (1 mmol/l) und zu 5× Äquivalenten von dUTP-DTBP-NHS (gelöst in DMSO) zugegeben. Die Reaktion läuft an NH2-Gruppe am 5'-Ende in guten Ausbeuten ab. Die Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-18-Säule.
Beispiel 7
Synthese von dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3.
Zunächst wurde dUTP-AA-SS-Oligo2-Fluorescein synthetisiert (siehe oben) und in einer Puffer-Lösung aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde ein Äquivalent eines komplementären Oligonukleotids mit der folgenden Struktur gegeben:
Oligo-3,
5' gtg cc agc agc cgc ggt aat acg 3' Phosphat
Das Oligo 3 kann an die Sequenz von Oligo 2 komplementär binden und blockiert somit einen Teil des Oligo2 am 5'-Ende (hier unterstrichen)
5' NH2-cgt att acc gcg gct gct gg cac AAAAAAAAAA Fluorescein
3'Phosphat' gca taa tgg cgc cga cga cc gtg
Die Lösung mit dUTP-AA-SS-Oligo2-Fluorescein und Oligo 3 (50 mmol/l Tris-HCl, pH 8,0) wurde auf 90°C für 1 min erhitzt und dann auf RT abgekühlt. Durch die Abkühlung binden die beiden komplementären Sequenzabschnitte aneinander unter Ausbildung eines Doppelstrangs.
Beispiel 8
Spaltung einer spaltbaren Gruppe des Linkers und gegebenenfalls Blockade der freien SH-Gruppe.
Für eine reduktive Spaltung einer Disulfid-Bindung können beispielsweise folgende Bedingungen verwendet werden: TCEP 10 bis 50 mmol/l pH 6.0 bis 8.0 bei RT für ca. 5 bis 30 min. Eine solche Spaltung kann beispielsweise bei spaltbaren Nukleotid-Konjugaten mit einem Linker mit Dithiobispropion-Säure verwendet werden.
Für eine oxidative Spaltung von Diol-haltiven Linkern (z. B. Tartrat-Linker) können beispielsweise folgende Bedingungen verwendet werden: KClO4 5 bis 50 mmol/l pH 6.0 bis 8.0 bei RT für ca. 5 bis 20 min
Blockade einer freien SH-Gruppe nach der Spaltung einer Disulfid-Bindung kann beispielsweise mit Jodacetamid erfolgen: 0,1 bis 0,5 mol/l Jodacetamid in Puffer pH 7,0 bis 8.0 für ca. 5–15 min bei RT.
Enzymatischer Einbau von Nukleotid-Konjugaten:
Beispiel 9
Die enzymatischen Einbaureaktionen werden bei üblichen Bedingungen für die Einbaureaktionen von modifizierten Nuk-Makromolekülen durchgeführt. Beispielsweise können folgende Bedingnugen eingesetzt werden: Puffer-Lösungen:

Tris-HCl (20 mM–100 mM), pH 7–8,5

MgCl₂ z. B. 1,5 bis 10 mM (oder auch Mn 0,2–1 mM)

NaCl 10 bis 100 mM

Glycerin ca. 10–30%

DMSO ca. 5 bis 30%

• Primer (Oligonukleotide) mit einer Länge von 17 bis 50 Nukleotide, die eine ausreichende spezifische Hybridisierung an die Matrize aufweisen. Konzentration ca. von 0,02 bis 2 μM
• Matrizen (z. B. Oligonukleotide)
• DNA-Polymerasen (Klenow-Fragment exo minus, Vent exo minus Polymerase).
• Nukleotid-Konjugate werden vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,1 μM bis 10 μM verwendet.

Enzymatische Reaktionen wurden für ca. 2 bis 60 min bei Temperaturen zwischen RT bis 60°C durchgeführt.
Beispiel 9
Materialien:

Reaktionsuffer 1: 50 mmol/l Tris HCl, pH 8,5; 50 mmol/l NaCl, 5 mmol/l MgCl₂, Glycerin 10% v/v
Reaktionsuffer 2: 10 mmol/l Tris HCl, pH 8,5; 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgCl₂, Glycerin 2%, DMSO 20% v/v

Beispiel 10
Herstellung eines modifizierten Klenow-Fragments Exo minus der DNA-Polymerase I der E. coli (im Weiteren bezeichnet als modifiziertes Klenow Exo minus). In einer Ausführungsform der Modifikation wurden zu 70 μl einer Puffer-Lösung mit Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase (New England Biolabs) 100 μl einer Puffer-Lösung (200 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 9.0, 60% Glycerin) zugegeben, der pH-Wert der Lösung mit Polymerase betrugt nun 8,5–9.0. Anschließend wurden 20 μl einer 1 mol/l wässrigen Iod-Acetamid-Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde 5 min bei RT durchgeführt. Auf diese Weise erfolgte eine selektive Modifizierung der Polymerase an der SH-Gruppe des Cysteins und das DTT im Hersteller-Puffer wurde inaktiviert. Die modifizierte Polymerase wurde bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 11
Enzymatischer Einbau und Terminierung der Synthese durch dUTP-AA-SS-Oligo1, dATP-PA-SS-Oligo1, dGTP-PA-SS-Oligo1, dCTP-PA-SS-Oligo1.
Reversible Terminierung der Synthese an einem homopolymeren Abschnitt einer Sequenz stellt eine besondere Herausforderung für die Sequenzierung-durch-Synthese Verfahren dar. Die Fähigkeit der Nukleotid-Analoga, enzymatische Reaktion nach ihrem Einbau reversibel zu blockieren, wird am Beispiel mit Matrizen mit homopolymeren Sequenzabschnitten demonstriert.
Nukleotid-Konjugate wurden in 2 und 0,2 μmol/l Konzentration eingesetzt (wie in Legende beschrieben). Es wurde modifiziertes Klenow Exo minus Fragment verwendet (1 Unit/ 20 μl Ansatz). Als Primer wurde T7-19-Cy verwendet (1 μmol/l). Als Matrizen wurden Oligonukleotide verwendet (1 μmol/l), welche einen einmaligen oder auch mehrfachen Einbau von entsprechend komplementären Nukleotid-Konjugaten zulassen. Bei einigen Rektionen wurden natürliche Substrate (dNTPs) in die Reaktion zugegeben (200 μmol/l), siehe Legende.

Die Reaktion verlief im Reaktioinspuffer 1 bei 37°C für 1 hr. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf ein 10% Polyacrylamid-Gel aufgetragen und Reaktionsprodukte bei 150 V (70°C) getrennt. Die Visualisierung erfolgte mittels einer Gel-Dokumentations-Anlage mit UV-Lichtquelle. Legende:

Lane 1: dATP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 4
Lane 2: dATP=PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 4
Lane 3: dATP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 5
Lane 4: dATP-PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 5
Lane 5: dCTP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 6
Lane 6: dCTP-PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 6
Lane 7: dCTP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 7
Lane 8: dCTP-PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 7
Lane 9: dGTP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 5, dATP, dCTP
Lane 10: dGTP-PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 5, dATP, dCTP
Lane 11: dGTP-PA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 8, dATP
Lane 12: dGTP-PA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 8, dATP
Lane 13: dUTP-AA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 2
Lane 14: dUTP-AA-SS-Oligo1 (0,2 μmol/l),	Matrize 2
Lane 15: dUTP-AA-SS-Oligo1 (2 μmol/l),	Matrize 3

Die hier verwendeten Nukleotid-Analoga haben freie 3'-OH-Gruppen. An diese Gruppen können potenziell weitere Nukleotide durch die Polymerase gekoppelt werden. In 13 sieht man einen Einbau von nur einem Nukleotid-Konjugat an allen verwendeten Matrizen (Pfeil A). Pfeil (B) zeigt die Position vom markierten Primer an.
dATP-PA-SS-Oligo1 wird an Matrize 4 (Homopolymer-Abschnitt) nur einmal eingebaut (Lane 1). Der Einbau eines dATP-PA-SS-Oligo1 führte zur Blockade des Einbaus eines weiteren dATP-PA-SS-Oligo1 an der benachbarten, zur Matrize komplementären Position (N + 1). Als Kontrolle diente Einbaureaktion an Matrize 5. In dieser Reaktion konnte nur ein dATP-PA-SS-Oligo1 eingebaut werden (Lane 3), da die Matrize keine weiteren komplementären Basen zum Einbau von dATP-PA-SS-Oligo1 bietet. Ebenfalls als Kontrolle diente der Einbau von dATP-PA-SS-Oligo1 an Matrize 4 und 5 bei limitierenden Substrat-Konzentrationen (0,2 μmol/l dATP-PA-SS-Oligo1 vs. 1 μmol/l T7-19-Cy3 und Matrize) (Lane 2 und 4).
dCTP-PA-SS-Oligd1 wird an Matrize 6 (Homopolymer-Abschnitt) nur einmal eingebaut (Lane 5). Der Einbau eines dCTP-PA-SS-Oligo1 führte zur Blockade des Einbaus eines weiteren dCTP-PA-SS-Oligo1 an der benachbarten Position. Als Kontrolle diente Einbaureaktion an Matrize 7. In dieser Reaktion konnte nur ein dCTP-PA-SS-Oligo1 eingebaut werden (Lane 7), da die Matrize keine weiteren komplementären Basen zum Einbau von dCTP-PA-SS-Oligo1 bietet. Ebenfalls als Kontrolle diente der Einbau von dCTP-PA-SS-Oligo1 an Matrize 6 und 7 bei limitierenden Substrat-Konzentrationen (0,2 μmol/l dCTP-PA-SS-Oligo1 vs. 1 μmol/l T7-19-Cy3 und Matrize) (Lane 6 und 8).
dGTP-PA-SS-Oligo1 wird an Matrize 5 und 8 nur einmal eingebaut (Lane 9 und 11). Matrize 5 enthält die Sequenz -CGC- und Matrize 8 enthält die Sequenz -CTC-. Beide Matrizensequenzen enhalten somit nicht benachbarte Positionen für den Einbau von dG-Analoga. Der Einbau eines dGTP-PA-SS-Oligo1 führte dennoch zur Blockade des Einbaus eines weiteren dGTP-PA-SS-Oligo1 an Position N + 2. Als Kontrolle diente der Einbau von dGTP-PA-SS-Oligo1 an Matrize 5 und 8 bei limitierenden Substrat-Konrentrationen (0,2 μmol/l dGTP-PA-SS-Oligo1 vs. 1 μmol/l T7-19-Cy3 und Matrize) (Lane 10 und 12).
dUTP-AA-SS-Oligo1 wird an Matrize 2 (Homopolymer-Abschnitt) nur einmal eingebaut (Lane 13). Der Einbau eines dUTP-AA-SS-Oligo1 führte zur Blockade des Einbaus eines weiteren dUTP-AA-SS-Oligo1 an der benachbarten Position. Als Kontrolle diente Einbaureaktion an Matrize 3. In dieser Reaktion konnte nur ein dUTP-AA-SS-Oligo1 eingebaut werden (Lane 15), da die Matrize keine weiteren komplementären Basen zum Einbau von dUTP-AA-SS-Oligo1 bietet. Ebenfalls als Kontrolle diente der Einbau von dUJTP-AA-SS-Oligo1 an Matrize 2 bei limitierenden Substrat-Konzentrationen (0,2 μmol/l dUTP-AA-SS-Oligo1 vs. 1 μmol/l T7-19-Cy3 und Matrize) (Lane 14).
Man sieht, dass an homopolymeren Abschnitten der Matrize nur ein Nukleotid-Konjugat eingebaut wurde, der Einbau von weiteren gleichen Nukleotid-Konjugaten wurde gehemmt. Diese Hemmung erstreckt sich auf die benachbarte Position (N + 1) und sogar auf die weiterliegende Positionen (N + 2). Die verwendeten Analoga können somit als Terminatoren der Synthese auftreten. Dank einer Disulfid-Brücke im Linker der Nukleotid-Konjugate können Oligonukleotide von den eingebauten Nuk-Kompontenen abgespalten werden.
Nach der Abspaltung des Oligonukleotid-Anteils vom bereits eingebauten Nukleotid-Konjugat (n) und Blockade der freien Gruppe mit Jodacetamid kann nun ein weiteres Nukleotid-Konjugat (n + 1) eingebaut werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden alle vier Arten der Nukleotid-Konjugate (z. B. dATP-Konjugate, dCTP-Konjugate, dGTP-Konjugate, dUTP-Konjugate) in einer Reaktion gleichzeitig eingesetzt. Vorzugsweise werden keine natürlichen Nukleotide (z. B. dNTPs) in die Reaktion zugegeben. Die Matrizen können an einer festen Phase fixiert sein. Eine solche Reaktion verläut oft in Zyklen, so dass die Matrize zwischen einzelnen Reaktionsschritten gewaschen werden kann.
Anstelle von Dithiobis-propionsäure-Linker können auch andere Linker mit ähnlicher Länge, z. B. Tartrat-Linker, oder auch längere Linker, z. B. PEG(9) verwendet werden. Solche Nukleotid-Konjugate weisen ebenfalls terminierende bzw. reversibel terminierende Eigenschaften auf.
Beispiel 12
Einbau von Nukleotid-Konjugaten mit einem doppelsträngigen Sequenzabschnitt: dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein (Oligonukleotid enthält selbstkomplementären Sequenzen vom Typ „Molecular Beacon”) und dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3.
Nukleotid-Konjugate wurden in jeweils 1 μmol/l Konzentration eingesetzt. Es wurde modifiziertes Klenow Exo minus verwendet (1 Unit/20 μl Ansatz). Als Primer wurde T7-19-Cy verwendet (1 oder 0,2 μmol/l). Als Matrizen wurden Oligonukleotide verwendet (1 oder 0,2 μmol/l), welche einen einmaligen (Matrize 3) oder mehrfachen (Matrize 2) Einbau von entsprechend komplementären Nukleotid-Konjugaten zulassen. Die Reaktion verlief im Reaktioinspuffer 1 oder Reaktionspuffer 2 bei 37°C für 1 hr. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mittels Capillar-Elektrophorese analysiert (ABI 310 Kapillar-Sequenzer, POP6 Gel-Matrix). Elektrophorese wurde bei 12 kV (50°C) durchgeführt. Signale von Cy3-Farbstoff als auch von Fluorescein-Farbstoff wurden detekiert. Die CE-Elektrohorogramme sind in 14–21 dargestellt.
14 nur T7-19-Cy3 Primer (Kontrolle)
15 nur dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3
16 nur dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein
17 B1: dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (1 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (1 μmol/l), Reaktionspuffer 1
17 B3: dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (0,2 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (0,2 μmol/l), Reaktionspuffer 1
18 B5: dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (0,2 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (0,2 μmol/l), Reaktionspuffer 2
18 B6: dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 3 (0,2 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (0,2 μmol/l), Reaktionspuffer 2
19 C1: dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (1 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (1 μmol/l), Reaktionspuffer 1
20 C3: dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (0,2 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (0,2 μmol/l), Reaktionspuffer 1
21 C5: dUTP-AA-SS-Oligo 2-Fluorescein/Oligo 3, modifiziertes Klenow Exo minus, Matrize 2 (0,2 μmol/l), Primer T7-19-Cy3 (0,2 μmol/l), Reaktionspuffer 2
Die hier verwendeten Nukleotid-Analoga haben freie 3'-OH-Gruppen. An diese Gruppen können potenziell weitere Nukleotide durch die Polymerase gekoppelt werden. Pfeil (A) zeigt die Position vom markierten Primer und nicht eingebauten Nukleotid-Konjugaten an. Man sieht, dass die beiden verwendeten Nukleotid-Konjugate an einer Homopolymer-Strecke (Matrize 2) nur einmal eingebaut werden (Pfeil B). Kontrollen: Primer und Nukleotid-Konjugate alleine, einmaliger Einbau von dUTP-AA-SS-Oligo 4-Fluorescein an Matrize 3,
Beispiel 13
Zusammensetzung von Kit für Verwendung von Nukleotid-Konjugaten
Generell, ein oder mehrere Kits schließen Komponenten (z. B. Einzelsubstanzen, Kompositionen, Reaktionsgemische) ein, die für die Durchführung von enzymatischen Einbaureaktionen mit erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromolekülen notwendig sind.
Die Zusammensetzung der Kits kann nach Anwendung variieren, wobei die Anwendugen können von einfacher Primer-Extensionsreaktion bis zu zyklischen Sequenzierung auf Einzelmolekülebene reichen.
Beispielsweise Kits, die für zyklische Sequenzierung verwendet werden, können Polymerasen, modifizierte Nuk-Makromoleküle sowie Lösungen für die zyklischen Schritte einschließen.
Die Kits können wahlweise positive und/oder negative Kontrollen einschließen, Anleitungen zur Durchführung von Verfahren.
Die Kit-Komponenten sind üblicherweise in handelsüblichen Reaktionsgefäßen bereitgestellt, wobei das Volumen der Gefäße zwischen 0,2 ml und 1 l variieren kann. Es können auch Gefäßarrays, z. B. Mikrotiter-Platten mit Komponenten beladen sein, was eine automatische Zufuhr von Reagentien ermöglicht.
Ein Kit kann folgende Komponenten einschließen:

– Eine oder mehrere, Polymerasen, z. B. modifiziertes Klenow Fragment exo minus
• Eine oder mehrere Arten bzw. eine oder mehrere Populationen von Nukleotid-Konjugaten, die als Säure oder. als Salze vorliegen können (beisielsweise Natrium, Kalium, Ammonium oder Litium können als Ionen verwendet werden). Die Nukleotid-Konjugate können in trockender Form oder in Form einer Lösung bereitgestellt werden, z. B. im Wasser oder in einem Puffer, z. B. Tris-HCl, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat, oder in einer Aufbewahrungslösung, die folgende Komponenten einzeln oder in Kombination einschließen kann:
– Puffer Tris-HCl, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (in Konzentration die beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM liegt)
– Salze, z. B. NaCl, KCl, NH4Cl, MgCl2,
– PEG oder anderes inertes Polymer, z. B. Mowiol in Konzentration von 1 bis 20% (w/v)
– Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 50%
– Marker oder Marker-Einheiten von modifizierten Nuk-Makromolekülen, insbesondere in den Ausführungsformen, in denen zwischen Linker und Marker oder Marker und Kore-Komponente affine Kopplung besteht.
• Buffer-Kompositionen für enzymatische Reaktion, Spaltung, Blockade, Detektion, Waschschritte:
– Spaltungsreagentien, bereitgestellt z. B. als Konzentrierte gepufferte Lösung. Z. B. DTT oder TCEP in Ausführungsformen, in denen Nukleotid-Konjugate einen Linker mit einer spaltbaren Disulfid-Brücke einschließen.
– Modifizierende Reagentien bereitgestellt z. B. als Konzentrierte gepufferte Lösung. Z. B. Iodacetamid oder Iodacetat für Ausführungsformen, in denen der Linker eine Mercaptogruppe nach der Spaltung hat.
– Detektionsreagentien, z. B. markierte Oligonukleotide, die an Nukleotid-Konjugate hybridisiert werden können.

Beispiele von Sequenzen:
Primer

Primer T7-19-Cy3: 5'-Cy3-taatacgactcactatagg
Beispiele für Oligonukleotid-Komponente der Nukleotid-Konjugate Oligo 1
Dieses Oligonukleotid kann beispielsweise in folgenden Kombinationen mit Nuk-Komponenten verwendet werden: Kopplung eines PEG-Linkers an der Base:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an der Base:
Kopplung eines PEG-Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Oligonukleotid-Anteil kann als charakteristische Marker-Sequenz für dUTP als Marker-Komponente dienen. Für eine andere Nuk-Komponente kann eine andere charakterischtische Sequenz verwendet werden.
Ein Teil dieses Oligonukleotids kann als Eindungs-Abschnitt (B-Abschnitt) dienen.
Oligo-2, Fluorescein,
Der homopolymere Abschnitt von diesem Oligonukleotid (AAAAAAAAAA) stellt ein Beispiel für variablen Abschnitt dar. Er kann an einen Abschnitt einer anderen Nukleinsäurekette binden, der mehrere Thymidin-Reste (z. B. TTTTTT) einschließt. Unter Reaktionsbedinungen, z. B. Reaktionspuffer 1 oder 2 und Raumtemperatur oder 37°C, erfolgt nur eine lose, vorübergehende Bindung, da die Tm von AAAAAAAAAAA unter 25°C liegt. Die Sequenzspezifität ist sehr gering.
Dieses Oligonukleotid kann beispielsweise in folgenden Kombinationen mit Nuk-Komponenten verwendet werden: Kopplung eines PEG-Linkers an der Base:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an der Base:
Kopplung eines PEG-Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Oligo-3,
Dieses Oligonukleotid kann an ein Sequenzfragment von Oligo 2 sequenzspezifisch binden. Die Tm von diesem Oligonukleotid liegt bei ca. 70°C (gemessen in Reaktionspuffer 1). Nach einer Hybridisierung an Oligo 2 bleibt dieses Oligonukleotid an Oligo 2 auch unter Reaktionbedingungen (RT oder 37°C) gebunden und kann die Interaktion zwischen dem Oligo 2 und einer weiteren, vorwiegend komplementären zu diesem Oligo2-Abschnitt Sequenz blockieren.
Dieses Oligonukleotid kann weitere Modifikationen einschließen, z. B. Fluorescenzfarbstoffe. Bei Verwendung von Farbstoffen mit einem Anregungsspektrum wie z. B. Rhodamin kann es zwischen Fluorescein und Rhodamin zu FREI kommen, Oligo-4, Fluorescein,
(Stem-Bereiche sind unterstrichen)
Dieses Oligonukleotid hat selbstkomplementäre Sequenzen (unterstrichen) und liegt unter Reaktionsbedingungen (Reaktionspuffer 1 oder 2, RT oder 37°C) vorwiegend in Form von Molecular Beacon. Die Interaktion dieses Sequenzabschnitts und einer weiteren, zu diesem Abschnitt komplementären Nukleinsäuresequenz ist dadurch blockiert oder stark reduziert. Der homopolymere Abschnitt von diesem Oligonukleotid (AAAAAAAAAA) kann an einen Abschnitt einer anderen Nukleinsäurekette binden, der mehrere Thymidin-Reste (z. B. TTTTTT oder TTTTTTTTTT) einschließt. Unter Reaktionsbedinungen, z. B. Reaktionspuffer 1 oder 2 und Raumtemperatur oder 37°C, erfolgt nur eine lose, vorübergehende Bindung, da die Tm von AAAAAAAAAAA unter 25°C liegt.
Dieses Oligonukleotid kann beispielsweise in folgenden Kombinationen mit Nuk-Komponenten verwendet werden: Kopplung eines PEG-Linkers an der Base:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an der Base:
Kopplung eines PEG-Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Komposition Oligo 5 (4096 Oligonukleotide mit einem einheitlichen Sequenzabschnitt, unterstrichen, und einem variablen, randomisierten Sequenzabschnitt (X) mit der Länge 6)
Durch die Hybridisierung von Oligo 3 an die Oligonukleotide dieser Population kann ein Sequenzfragment (unterstrichen) von der Interaktion mit einzelsträngigen Nukleinsäureketten ausgeschlossen werden. Nur variabler Abschnitt (X)n (Hexamer-Abschnitt) und AAAAAAAAAA stehen für die Interaktion mit weiteren Nukleinsäureketten zur Verfügung. Da die Bindung von Hexameren an einzelsträngige Nukleinsäureketten unter angegebenen Reaktionsbedingungen (RT bis 37°C, Reaktionspuffer 1 oder 2) instabil ist, kommt es nur zu einer vorübergehenden Bindung von Nukleotid-Konjugaten an Nukleinsäuresequenzen. Wegen einer kurzen Länge des variablen Abschnitts besitzen solche Oligonukleotide eine sehr geringe Sequenzspezifität.
Diese Komposition von Oligonukleotiden kann beispielsweise in folgenden Kombinationen mit Nuk-Komponenten verwendet werden: Kopplung eines PEG-Linkers an der Base:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an der Base:
Kopplung eines PEG-Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Sequenzabschnitt (cgt att acc gcg gct gct gg cac) kann als eindeutige charakteristische Marker-Sequenz dienen, an die sequenzspezifische, markierte Oligonukleotide gebunden werden können.
Komposition Oligo 6 (4096 Oligonukleotide mit einem einheitlichen Sequenzabschnitt, unterstrichen, und einem Variablen Sequenzabschnitt (X) mit der Länge 6)
Komposition von Oligo 6 unterscheidet sich von Komposition Oligo 5 durch Anordnung von einzelnen Sequenzabschnitten. Durch die Änderung der Anordnung kann die Nuk-Komponente unterschiedlich weit von einem bestimmten Abschnitt des Oligonukleotids separiert werden. In diesem Beispiel können Nuk-Komponenten näher an die Homopolymer-Strecke (TTTTTTTTTT) gebunden werden.
Diese Komposition von Oligonukleotiden kann beispielsweise in folgenden Kombinationen mit Nuk-Komponenten verwendet werden: Kopplung eines PEG-Linkers an der Base:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an der Base:
Kopplung eines PEG-Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Kopplung eines spaltbaren Linkers an Gamma-Phosphat-Gruppe:
Matrizen: Matrize 1 (M1):
Matrize 2 (M2):
Matrize 3 (M3):
Matrize 4 (M4):
Matrize 5 (M5):
Matrize 6 (M6):
Matrize 7 (M7):
Matrize 8 (M8):
(angegeben sind Primerbindungsstelle für T7-19-Primer sowie die für Einbau von Nukleotid-Konjugaten relevante Positionen der Matrize)
Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert wurden, sind eingebaut in diese Anmeldung in vollem Umfang (auch wenn dies bei jeweiliger Publikation nicht expliziert genannt wurde) und unterliegen laut USPTO den Regelungen für „incorporated by reference” für alle Zwecke in den USA.
Einzelne Ausführungsformen sollten zur Veranschaulichung der Erfindung dienen und können vom Fachmann weiter miteinander kombiniert werden. Die Kombinationen aus einzelnen Ausführungsformen stellen ebenfalls gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Legenden zu Figuren
Fig. 1

A) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem variablen Abschnitt des Oligonukleotids (3)
B) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (4)
C) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nuk-Komponente (1), einem Linker (2), einem variablen Abschnitt des Oligonukleotids (3) und einem einheitlichen Abschnittdes Oligonukleotids (4)
D) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nuk-Komponente (1), einem Linker (2), einem einheitlichen Abschnitt des Oligonukleotids (4) und einem weiteren komplementären Oligonukleotid (5) mit einem variablen Abschnitt (3). Das komplementäre Oligonukleotid ist an das einheitliche Oligonukleotid hybridisiert

Fig. 2

A) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (3). Das Oligonukleotid ist nicht komplementär zu Nukleinsäurekette, die analysiert werden muss.
B) Schematische Darstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Polymerasen: Primer (4), Polymerase (5), Matrize (6)
C) Schematische Darstellung des Einbauereignisses von Nukleotid-Konjugaten in den Primer durch eine Polymerase
D) Schematische Darstellung des eingebauten Nukleotid-Konjugates zusammen mit Primer und Matrize vor der Abspaltung des Linkers und Oligonukleotids
E) Schematische Darstellung des eingebauten Nukleotides nach der Spaltung
F) Schematische Darstellung eines neuen Einbauereignisses von einem zweiten Nukleotid-Konjugat

Fig. 3

A) Schematische Darstellung von vier Arten von Nukleotid-Konjugaten, die in einer Sequenzierungsreaktion verwendet werden: Jede Art von Nukleotid-Konjugaten ist durch eine einheitliche Nuk-Komponente (entsprechend der vier Base) und ein einheitliches, für die jeweilige Art der Nukleotid-Konjugate spezifisches Oligonukleotid charakterisiert.
B) Schematische Darstellung eines Sequenzierungs-Zyklus: Inkubation von Primer-Plymerase-Matrize-Komplexen mit vier verschiedenen Arten von Nukleotid-Konjugaten, Einbau eines zu jeweiligen Position der Matrize komplementären Nukleotid-Konjugats (Nuk-Komponente ist eingebaut). Anschließende Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids an die eingebauten Nukleotid-Konjugate und Detektion des Einbauereignisses, abschließende Abspaltung des Linkers, des Oligonukleotids mit dem hybridisierten Oligonukleotid mit Markierung.

Fig. 4

A) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nuk-Komponente (1), einem Linker (2), einem variablen Abschnitt des Oligonukleotids (3) und einem einheitlichen Abschnitt des Oligonukleotids (4)
B) Schematische Darstellung des Einbauereignisses von Nukleotid-Konjugaten in den Primer durch eine Polymerase. Das Nukleotid-Konjugat ist über sein variablen Abschnitt des Oligonukleotids (3) an die Matrize gebunden.
C) Schematische Darstellung des eingebauten Nukleotid-Konjugates zusammen mit Primer und Matrize vor der Abspaltung des Linkers und Oligonukleotids. Da das Nukleotid-Konjugat nur vorübergehend an die Matrize über seinen variablen Abschnitt binden kann, kann ein Gleichgewicht zwischen einer gebundenen und einer freien Form bestehen.
E) Schematische Darstellung des eingebauten Nukleotides nach der Spaltung
F) Schematische Darstellung eines neuen Einbauereignisses von einem zweiten Nukleotid-Konjugat

Fig. 5

A) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist (N) Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^n. Die einheitlichen Abschnitte von Oligonukleotide können beispielsweise spezifisch für eine jeweilige Population von Nukleotid-Konjugaten sein (z. B. OligoA-Sequenz ist einheitlich für sämtliche Oligonukleotide innerhalb der Population mit der Nuk-Komponente dATP usw.). Vorzugsweise sind die einheitlichen Abschnitte verschiedener Nukleotid-Konjugate einander nicht komplementär.
B) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist 3 Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^3 = 64. Die einheitlichen Abschnitte von Oligonukleotide können beispielsweise spezifisch für eine jeweilige Population von Nukleotid-Konjugaten sein. Vorzugsweise sind die einheitlichen Abschnitte verschiedener Nukleotid-Konjugate einander nicht komplementär.
C) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist 4 Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^4 = 256.

Fig. 6

A) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist 5 Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^5 = 1024.
B) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist 6 Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^6 = 4096.

Fig. 7

A) Schematische Darstellung von vier Populationen von Nukleotid-Konjugaten mit einer jeweils einheitlichen Nuk-Komponente (entsprechend den vier Nukleobasen, dA, dC, dG, dU) und Oligonukleotiden mit einem variablen Abschnitt und einem einheitlichen Abschnitt. Die Länge des variablen Abschnitts ist 4 Basen. Dadurch errechnet sich die Gesamtmenge von unterschiedichen Oligonukleotiden innerhalb einer Population 4^4 = 256. Die einheitlichen Abschnitte von Oligonukleotide können beispielsweise spezifisch für eine jeweilige Population von Nukleotid-Konjugaten sein (z. B. OligoA-Sequenz ist einheitlich für sämtliche Oligonukleotide innerhalb der Population mit der Nuk-Komponente dATP usw.). Vorzugsweise sind die einheitlichen Abschnitte verschiedener Nukleotid-Konjugate einander nicht komplementär. Jede Population von Nukleotid-Konjugaten ist mit einem für diese Population charakteristischen Marker (1 bis 4) markiert, z. B. ein Fluorescenzfarbstoff, z. B. Alexa 488, Cy3, Cy5, Cy7.
B) Schematische Darstellung eines Sequenzierungs-Zyklus: Inkubation von Primer-Plymerase-Matrize-Komplexen mit vier verschiedenen Populationen von Nukleotid-Konjugaten (siehe 7A), Einbau einer zu jeweiligen Position der Matrize komplementären Nuk-Komponente des Nukleotid-Konjugates (Nuk-Komponente ist eingebaut). Anschließende Detektion des Einbauereignisses anhand des spezifischen Fluoreszenzfarbstoffs, abschließende Abspaltung des Linkers und des Oligonukleotids mit Markierung.

Fig. 8

A–C) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einem komplementären Oligonukleotid. Die Hybridisierung kann an verschiedenen Positionen des komplementären Oligonukleotids erfolgen (A: in der Mitte, B oder C: an einem der Enden). Nuk-Komponenten (1).
D) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit mehreren komplementären Oligonukleotiden.
E) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einem komplementären Oligonukleotid, der in sich einen geschlossenen Kreis bildet
F) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit selbstkomplementären Abschnitten des Oligonukleotids, die unter einander eine Haarnadel-ähnliche Struktur bilden.

Fig. 9

A) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (3)
B) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (3) und einem komplementär gebundenen Oligonukleotid (4)
C) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (3) und einem komplementär gebundenen Oligonukleotid (4), das eine Markierung einschließt (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest).
D) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (6), das eine Markierung einschließt (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest).
E) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem einheitlichen Oligonukleotid (3), das eine Markierung einschließt (7) (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest) und einem komplementär gebundenen Oligonukleotid (8), das ebenfalls eine Markierung einschließt (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest). Die beiden Markierungen können gleich oder unterschiedlich sein. Bei Fluoreszenzfarbstoffen können sie ein FREI-Paar bilden.
F) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem langen einheitlichen Oligonukleotid (9) und mehreren (hier zwei) komplementär gebundenen Oligonukleotiden (10 und 11), wobei jedes der hybridisierten Oligonukleotiden eine Markierung einschließt (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest). Die beiden Markierungen können gleich oder unterschiedlich sein. Bei Fluoreszenzfarbstoffen können sie ein FREI-Paar bilden.
G) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer Nuk-Komponente (1), einem Linker (2) und einem langen einheitlichen Oligonukleotid (12) und einem komplementär gebundenen Oligonukleotid (13), wobei das hybridisierte Oligonukleotiden zwei Markierungen einschließt (z. B. einen Fluorescenzfarbstoff oder ein Biotin-Rest). Die beiden Markierungen können gleich oder unterschiedlich sein. Bei Fluoreszenzfarbstoffen können sie ein FREI-Paar bilden. Das hybridisierte Oligonukleotid hat einen zum Oligonukleotid 12 komplementären Sequenzabschnitt und weitere flankierende Sequenzbereiche, die nicht zu Oligonukleotid 12 komplementär sind. Diese flankierende Bereiche können unter einander komplementär sein.

Fig. 10
Schematische Darstellung einer Nachweismethode mit Rnase und komplementären RNA-Oligonukleotiden

A) Schematische Darstellung eines eingebauten Nukleotid-Konjugates
B) Bindung einer hybridisierenden Sonde aus RNA mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (RNA-Sonde)
C) Zugabe einer Rnase und Spaltung eines RNA-DNA-Hybrids
D) Freisetzung von gespaltenen Bruchteilen von RNA-Sonde und Regenirierung der Bindungsfähigkeit des Oligonukleotids

Fig. 11
Schematische Darstellung von unterschiedlichen Positionen der variablen Abschnitte innerhalb des Oligonukleotids

A–C) Schematische Darstellung von Nukleotid-Konjugaten mit einer einheitlichen Nuk-Komponente (1), einem Linker (2), einem variablen Abschnitt des Oligonukleotids (3) und einem einheitlichen Abschnitt des Oligonukleotids (4). Der variable Abschnitt kann am 5'-Ende von Oligonukleotid (A), in der Mitte (B) oder am 3'-Ende (C) von Oligorukleotid positioniert sein. Die Nuk-Komponente ist über den Linker an 5'-Position des Oligonukletids gekoppelt.
D) Der variabler Abschnitt ist intern positioniert und die Nuk-Komponente mit dem Linker ist ebenfalls intern positioniert, und zwar am 5'-Ende des variablen Abschnitts.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Nukleotid-Konjugate, die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest ein Oligonukleotid und mindesten einen Linker zwischen der Nukleotid-Komponente und dem Oligonukleotid
Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens einen einzelsträngigen Sequenzabschnitt einschließt.
Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens einen selbstkomplementären Sequenzabschnitt einschließt
Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 1, wobei mindestens ein weiteres vorwiegend komplementäres Oligonukleotid an das genannte Oligonukleotid gekopplet ist.
Ein Reaktionsgemisch bzw. eine Komposition für enzymatische Synthese von Nukleinsäureketten, das mindestens eines der Nukleotid-Konjugate nach einem der oben genannten Ansprüche einschließt
Verfahren zur enzymatischen Synthese von komplemetären Strängen von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingesetzt werden.
Ein Verfahren zur Markierung von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: A. Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen B. Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der Nukleotid-Konjugate nach einem der oben genannten Ansprüche 1 bis 5 einschließt, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um mindestens eine Nuk-Komponente eines Nukleotid-Konjugats erlauben, wobei jede Art von Nukleotid-Konjugate charakteristisch markiert ist und Oligonukleotid der Nukleotid-Konjugate zur unter (A) bereitgestellten Nukleinsäurekette an mindestens 3 Basen und maximum an 10 Basen komplementär ist
Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe) b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate nach einem der oben genannten Ansprüche zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt. c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),
Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe) b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate nach einem der oben genannten Ansprüche zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei das Oligonukleotid der Nukleotid-Konjugate nicht zur unter (a) bereitgestellten Nukleinsäurekette komplementär ist und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt. c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),
Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritce einschließt: a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe) b) Inkubation von mindestens einer Art der Nukleotid-Konjugate nach einem der oben genannten Ansprüche zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Komponenten der Nukleotid-Konjugate zulassen, wobei das Oligonukleotid der Nukleotid-Konjugate zur unter (a) bereitgestellten Nukleinsäurekette an mindestens 3 Basen und maximum an 10 Basen komplementär ist und jede Art der Nukleotid-Konjugate eine für sie charakteristische Markierung besitzt. c) Entfernung der nicht eingebauten Nukleotid-Konjugate von den NSK-Primer-Komplexen d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und Oligonukleotid-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nukleotid-Konjugate f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),