DE10144251A1

DE10144251A1 - Device for directed immobilization of proteins, useful for diagnosis or therapy, e.g. of tumors, includes surface with two types of functional groups for immobilization

Info

Publication number: DE10144251A1
Application number: DE2001144251
Authority: DE
Inventors: Thomas Schiestel; Guenter Tovar; Herwig Brunner
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2003-03-27

Abstract

Device (A) for immobilizing at least one protein (I) comprises a carrier having a surface with functional groups 1A and 1B and at least one (I) imobilized on it. (I) includes functional groups 2A and 2B, complementary to 1A and 1B, and are immobilized by covalent bonds formed between both pairs of complementary groups. Independent claims are also included for the following: (1) Method for targeted immobilization of (I) on (A); (2) Method for identification and/or detection of the binding partner of (I) or substances that modify interaction between (I) and its binding partner; and (3) Pharmaceutical or diagnostic compositions that comprise (A).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, insbesondere Nanopartikel, Membranen oder planare oder poröse Bindematrices, mit mindestens einem daran immobilisierten Protein, wobei das Protein sowohl über eine kovalente Bindung als auch eine nicht-kovalente Bindung und dadurch gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an der Vorrichtung immobilisiert ist, Verfahren zur Herstellung derartiger Vorrichtungen, Verfahren zur. Identifizierung und/oder Detektion von Bindungspartnern des immobilisierten Proteins und zur Identifizierung und/oder Detektion einer Substanz, die die Interaktion zwischen dem immobilisierten Protein und dessen Interaktionspartner modifiziert, die Verwendung einer derartigen Vorrichtung zur Identifizierung und/oder Isolierung eines Bindungspartners des immobilisierten Proteins sowie zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion des immobilisierten Proteins mit seinen Bindungspartnern, die Verwendung einer derartigen Vorrichtung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Tumortherapie, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Vorrichtung mit einem immobilisierten Protein umfasst. The present invention relates to a Device, in particular nanoparticles, membranes or planar or porous binding matrices, with at least a protein immobilized thereon, the Protein both via a covalent bond as well a non-covalent bond and thereby directed and while maintaining its biological Activity is immobilized on the device, method for the production of such devices, methods to. Identification and / or detection of Binding partners of the immobilized protein and Identification and / or detection of a substance, the interaction between the immobilized Modified protein and its interaction partner, the use of such a device for Identification and / or isolation of a Binding partner of the immobilized protein and Identification and / or isolation of inhibitors the interaction of the immobilized protein with its attachment partners, the use of a such device for producing a pharmaceutical composition, in particular for Tumor therapy, and a pharmaceutical composition, the one device with an immobilized Protein includes.

In der angewandten Biotechnologie ist es seit längerem bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen und Zellen als Biokatalysatoren durch Immobilisierung an oder in einem Trägersystem zu stabilisieren, so dass diese über einen langen Zeitraum eine möglichst hohe Aktivität unter den unterschiedlichsten Belastungen beibehalten. Es existieren daher verschiedene Verfahren zum Fixieren von Enzymen, Enzym-produzierenden Mikroorganismen und Zellen auf unterschiedlichen Trägersystemen. Das Ziel einer solchen Immobilisierung besteht insbesondere darin, die Enzyme beziehungsweise Zellen so zu stabilisieren und so an einen Träger zu binden, dass ihre biologische Aktivität nicht verändert wird oder verloren geht. Dabei wird angestrebt, dass Proteine so immobilisiert werden, dass die für die biologische Aktivität erforderliche dreidimensionale Proteinstruktur nicht verändert wird. Bei Enzymen darf insbesondere die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum des Enzyms nicht verändert werden. It has been in applied biotechnology known for a long time, enzymes, enzyme-producing Microorganisms and cells as biocatalysts Immobilization on or in a carrier system stabilize so this over a long Period of activity as high as possible among the maintain different loads. It there are therefore various methods for fixing Enzymes, enzyme-producing microorganisms and Cells on different carrier systems. The The aim of such immobilization is especially in the enzymes or cells like this stabilize and thus bind to a carrier, that their biological activity doesn't change will or is lost. The aim is that proteins are immobilized so that the for the biological activity required three-dimensional protein structure is not changed. at Enzymes are particularly allowed to be three-dimensional No structure at the active center of the enzyme to be changed.

Die Bindung eines Proteins an einen Träger erfolgt im Allgemeinen durch Adsorption oder kovalente Bindung. Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Proteinen an festen Oberflächen von Trägern basieren auf Reaktionen unter Beteiligung komplementärer funktioneller Gruppen als Reaktionspartner zwischen Proteinen und Oberflächen der Träger. Dabei stellen beispielsweise die natürlich vorkommenden Aminosäuren beziehungsweise die in ihnen vorkommenden funktionellen Gruppen die in Frage kommenden Reaktionspartner der Proteine dar. Problematisch ist allerdings, dass die unterschiedlichen, für Immobilisierungsreaktionen in Frage kommenden Aminosäuren häufig mehrfach in Zielproteinen vorhanden sind, so dass eine gerichtete Immobilisierung eines Proteins nicht oder nur teilweise möglich ist. A protein is bound to a carrier generally by adsorption or covalent Binding. Process for the covalent immobilization of Proteins on solid surfaces of supports are based on reactions involving complementary functional groups as reaction partners between Proteins and surfaces of the carrier. Put it there for example the naturally occurring ones Amino acids or those found in them functional groups in question Reaction partner of the proteins is problematic however, that the different, for Immobilization reactions in question amino acids are often present multiple times in target proteins that directional immobilization of a protein is not or only partially possible.

Die für die Immobilisierung in Frage kommenden Aminogruppen kommen am N-terminalen Ende eines Proteins sowie in allen Lysinresten vor. Auch Arginin mit seiner Guanidinium-Gruppe reagiert häufig, wenn primäre Amine zur Reaktion geführt werden sollen. So können in einem Protein mittlerer Größe, das heißt einem Protein von etwa 50 kDa mit ca. 500 Aminosäuren, 20 bis 30 solcher reaktiven Gruppen vorkommen. Dementsprechend ist die Immobilisierung unspezifisch beziehungsweise kaum oder nicht definierbar. Eine Identifizierung der reagierenden Reste nach der Immobilisierung ist messtechnisch praktisch nicht durchzuführen. Those eligible for immobilization Amino groups come at the N-terminal end of a Protein as well as in all lysine residues. Arginine too with its guanidinium group often reacts when primary amines are to be led to the reaction. So in a medium-sized protein, that is called a protein of about 50 kDa with about 500 Amino acids, 20 to 30 such reactive groups occurrence. Accordingly, the immobilization unspecific or hardly or not definable. An identification of the responding Residues after immobilization is metrological practically not to be carried out.

Bekannt ist auch eine Anzahl "semi-gerichteter" Immobilisierungsstrategien. Einige dieser Strategien basieren auf der Bildung nicht-kovalent verbundener Komplexe und werden, insbesondere unter Zuhilfenahme von molekularen Markierungen, wie beispielsweise der Oligohistidin-Markierung, häufig eingesetzt. Oligohistidin-Markierungen an Proteinen, die meist als Fusionen am N- oder C-Terminus vorliegen und unter Verwendung gentechnischer Verfahren generiert werden, sind weit verbreitet. Oligohistidin- Markierungen lassen sich auch in der Mitte der Sequenz einbringen. Auch andere C- oder N-terminale Markierungen, die auch als "Tags" bezeichnet werden, sind bekannt. Insgesamt können diese Tags oder analog dazu die als Liganden fungierenden Gruppen in gewisser Weise ortspezifisch an Proteinen angebracht werden und so eine gewisse gerichtete Protein-Immobilisierung ermöglichen. A number of "semi-directed" are also known Immobilization. Some of these strategies are based on the formation of non-covalently linked Complex and are, especially under Using molecular markers, such as the oligohistidine label, frequently used. Oligohistidine labels on proteins, mostly exist as fusions at the N or C terminus and generated using genetic engineering techniques are widespread. Oligohistidin- Markers can also be found in the middle of the Introduce sequence. Other C or N terminals Markers, also known as "tags" are known. In total, these tags or analogously, the groups functioning as ligands in a way site-specific on proteins be attached and so a certain directed Enable protein immobilization.

Ein Nachteil solcher Verfahren bleibt jedoch die Tatsache, dass nicht-kovalente Komplexe dem Massenwirkungsgesetz unterliegen und somit bei wechselnden externen Bedingungen, die beispielsweise Puffer, Medien und. Temperatur betreffen, unterschiedlich stark auf der Oberfläche gebunden werden. Immobilisierungen, die auf einer solchen nichtkovalenter Bindung beruhen, erreichen daher niemals die Stabilität einer Immobilisierung, die auf einer kovalenten Bindung beruht. However, a disadvantage of such methods remains The fact that non-covalent complexes are Subject to the law of mass action and thus at changing external conditions, for example Buffers, media and. Temperature, bound differently on the surface. Immobilizations based on such non-covalent bond, never reach the stability of an immobilization based on a covalent bond.

Ein weiterer Nachteil besteht insbesondere darin, dass molekulare Markierungen in der Regel nur am N- oder C-terminalen Molekülende angebracht werden können. Diese Positionen können im Hinblick auf eine gerichtete Immobilisierung aus sterischen und funktionellen Gründen stören. C- oder N-terminale Molekülenden zeichnen sich darüber hinaus bei vielen Proteinen durch eine strukturelle Flexibilität und weniger stringente Konfirmationseinschränkungen aus. Dies kann von Vorteil sein, wie im Fall von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen nach dem "Induced fit"-Prinzip. In der Regel ist dies jedoch nachteilig, wenn eine bestimmte Ausrichtung der immobilisierten Proteine auf dem Träger angestrebt wird. Another disadvantage is in particular that molecular markings are usually only on the N- or C-terminal molecule end can be attached can. These positions can be viewed with regard to directional immobilization from steric and disturb functional reasons. C or N terminals Molecular ends also stand out many proteins due to structural flexibility and less stringent confirmation restrictions out. This can be an advantage, as in the case of Receptor-ligand interactions according to the "Induced fit "principle. But usually it is disadvantageous if a certain orientation of the immobilized proteins on the carrier is sought.

Im medizinisch-pharmazeutischen Bereich sind Controlled Release-Systeme bekannt, deren Wirkungsweise auf einem anderen Prinzip als vorstehend ausgeführt basiert. Diese Systeme werden durch Immobilisierung von therapeutischen Wirkstoffen oder Arzneistoffen, beispielsweise durch deren Einschluß in eine Matrix, hergestellt. Nach Verabreichung werden dann die Arzneistoffe durch Degradationsprozesse innerhalb des lebenden Körpers kontrolliert freigesetzt. Bei diesen Systemen ist die Konformation des Wirkstoffes im immobilisierten Zustand nicht entscheidend. Wichtig ist vielmehr, dass nach der Freisetzung der Wirkstoff im aktiven Zustand erreicht vorliegt. Are in the medical-pharmaceutical field Controlled release systems known, their mode of action on a different principle than the above based. These systems are through immobilization of therapeutic agents or drugs, for example by including them in a Matrix. After administration then the drugs through degradation processes released in a controlled manner within the living body. In these systems, the conformation of the Active ingredient not in the immobilized state crucial. Rather, it is important that after the Release of the active ingredient reached in the active state is present.

Bei solchen Controlled-Release-Systemen ist auch die Immobilisierung von Proteinen an partikuläre Systeme bekannt (Cell Separation and Protein Purification, Technical Handbook, 2. Ausgabe (1996), Dynal, Oslo), wobei die Proteinbindung an die Partikel jedoch unselektiv, beispielsweise mittels Adsorption, und nicht gerichtet erfolgt (Michaelis et al., Anticancer Drugs, 11 (5) (2000), 369-376). Darüber hinaus ist eine einfache Übertragung der dabei gewonnenen Erkenntnisse auf die Immobilisierung an Nanopartikeln nicht ohne weiteres möglich, da eine Variation der funktionellen Oberflächengruppen immer mit einem Eingriff in das kolloidale System verbunden ist und beispielsweise eine unerwünschte Koagulation auslösen kann. With such controlled release systems too the immobilization of proteins on particulate Systems known (Cell Separation and Protein Purification, Technical Handbook, 2nd edition (1996), Dynal, Oslo), the protein binding to the However, particles are non-selective, for example by means of Adsorption, and not directed (Michaelis et al., Anticancer Drugs, 11 (5) (2000), 369-376). In addition, the transfer is easy thereby gained knowledge on the Immobilization on nanoparticles not easily possible because a variation of the functional Surface groups always with an intervention in the colloidal System is connected and for example a can trigger unwanted coagulation.

Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen an einer Trägeroberfläche zur Verfügung zu stellen, wobei die Proteine so immobilisiert werden, dass sie ihre vor der Immobilisierung vorhandene biologische Aktivität auch im immobilisierten Zustand beibehalten, beispielsweise mit ihren Rezeptoren wechselwirken und die gewünschten Signale auslösen können oder/und Eigenschaften erhalten, die sie vorher nicht aufwiesen. Im immobilisierten Zustand, also gemeinsam mit ihrem Träger, sollen die Proteine dann sowohl für in vitro-Untersuchungen, beispielsweise bezüglich ihrer Wechselwirkungen mit anderen zellulären Bestandteilen, als auch als Arzneistoffe zur Behandlung von Krankheiten einsetzbar sein. Im Zeitraum der Verwendung soll keine nennenswerte Degradation der Trägersysteme und der daran immobilisierten Proteine stattfinden beziehungsweise bei einer in vivo-Anwendung soll die Degradation erst nach Entfaltung der biologischen Aktivität des immobilisierten Proteins zu einem späteren Zeitpunkt stattfinden. The present invention is technical Underlying problem, means and procedures for Immobilization of proteins on a carrier surface to provide, the proteins so to be immobilized in front of the Immobilization of existing biological activity also in the maintain immobilized state, for example interact with their receptors and the can trigger desired signals or / and Get properties that they did not have before. In the immobilized state, i.e. together with their carrier, the proteins are then intended for both in vitro studies, for example regarding their interactions with other cellular Ingredients, as well as drugs Treatment of diseases can be used. In the period the use should not result in any noteworthy degradation the carrier systems and those immobilized on them Proteins take place or at one in Degradation should only be used after vivo Development of the biological activity of the immobilized protein at a later date occur.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung von einer Vorrichtung, zum Beispiel von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer erste funktionelle Gruppen 1 A und zweite funktionelle Gruppen 1 B aufweisenden Oberfläche und mindestens einem an dem Träger immobilisierten Protein, das die ersten funktionellen Gruppen 1 A bindende, komplementäre funktionelle Gruppen 2 A und die zweite funktionelle Gruppen 1 B bindende, komplementäre funktionelle Gruppen 2 B aufweist, wobei das Protein über eine kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1 A und 2 A und eine nicht-kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1 B und 2 B an dem Träger immobilisiert ist. The present invention solves this lying technical problem by the Provision of a device, for example of Nanoparticles comprising a carrier with a first functional groups 1 A and second functional Group 1 B surface and at least a protein immobilized on the carrier, the binding the first functional groups 1 A, complementary functional groups 2 A and the second functional groups 1 B binding, complementary has functional groups 2 B, which Protein via a covalent bond between the groups 1 A and 2 A and a non-covalent bond between groups 1 B and 2 B on the support is immobilized.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in einer bevorzugten Ausführungsform als Nanopartikel, Membran, Oberfläche, poröses Trägersystem, poröse Strukturen, zum Beispiel Feststoffschäume, Gel, Aerogele, Xerogele, planares Trägersystem, Hohlmembran oder eine ähnliche für die Immobilisierung von Proteinen geeignete Einrichtung ausgeführt sein. The device according to the invention can in one preferred embodiment as nanoparticles, Membrane, surface, porous carrier system, porous Structures, for example solid foams, gel, Aerogels, xerogels, planar carrier system, Hollow membrane or similar for the immobilization of Proteins suitable device can be executed.

Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt planare, poröse und/oder nanopartikuläre Vorrichtungen, insbesondere Trägersysteme, insbesondere Nanopartikel, zur Verfügung, die sowohl eine kovalente als auch eine nicht-kovalente Bindung eines zu immobilisierenden Proteins an der Vorrichtung erlauben. Dabei erfolgt zunächst eine die Orientierung des Proteins determinierende nicht-kovalente Bindung zwischen einer zweiten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppe 1 B und einer im Protein vorhandenen komplementären funktionellen Gruppe 2 B. Die anschließende kovalente Bindung erfolgt über eine erste funktionelle Gruppe 1 A der Trägeroberfläche und eine dazu komplementäre funktionelle Gruppe 2 A des Proteins. Auf diese Weise ist es erfindungsgemäß möglich, das Protein gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität auf dem Träger zu immobilisieren. Durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Bindungsgruppen, die eine zweifache Bindung des Proteins an den Träger ermöglichen, wird außerdem eine äußerst stabile Immobilisierung des Proteins am Träger erreicht. That is, the present invention provides planar, porous and / or nanoparticulate devices, especially carrier systems, in particular Nanoparticles, available that are both covalent and also a non-covalent bond to one Allow immobilizing protein on the device. The orientation of the Protein-determining non-covalent binding between a second on the support surface existing functional group 1 B and one in Protein present complementary functional Group 2 B. The subsequent covalent bond takes place via a first functional group 1A Carrier surface and a complementary to it functional group 2 A of the protein. To this According to the invention it is possible to use the protein directed and while maintaining its biological activity on the carrier too immobilize. By using two different binding groups, the one double binding of the protein to the carrier enable, will also be an extremely stable Immobilization of the protein on the carrier achieved.

Erfindungsgemäß verhalten sich die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, zum Beispiel Nanopartikel, an deren Oberfläche Proteine oder auch andere biologische oder zelluläre Moleküle, beispielsweise Nucleinsäuren, fixiert sind, bezüglich der immobilisierten Moleküle wie Zellen. Das heißt, sie können beispielsweise mit Zellen, insbesondere mit anderen Zellbestandteilen auf der Oberfläche dieser Zellen, in Kontakt treten und zellanaloge Signale auslösen. Da die Nanopartikel zumindest in einer Dimension kleiner als 1 µm sind, werden sie erfindungsgemäß auch als "Nanocytes" bezeichnet. According to the behavior Devices according to the invention, for example nanoparticles the surface of which is proteins or others biological or cellular molecules, for example Nucleic acids are fixed with respect to the immobilized molecules like cells. That means they can for example with cells, especially with others Cell components on the surface of these cells, get in contact and trigger cell-analog signals. Because the nanoparticles at least in one dimension are smaller than 1 micron, they are according to the invention also called "Nanocytes".

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe 2 B des Proteins, die mit einer komplementären funktionellen Gruppe 1 B der Trägeroberfläche eine nicht-kovalente Bindung eingeht, bei dem eigentlichen Immobilisierungsvorgang das Protein so vororientiert, dass die funktionelle Proteingruppe 2 A, die mit ihrem Bindungspartner 1 A auf der Trägeroberfläche eine kovalente Bindung eingehen soll, so in Position gebracht wird, dass diese kovalente Bindung schnell und ungehindert ausgebildet werden kann. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die beiden funktionellen Gruppen 2 A und 2 B des Proteins innerhalb des Proteinmoleküls so positioniert sind, dass sie außerhalb der für die biologische Proteinaktivität verantwortlichen Protein-Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen angeordnet sind. Ferner ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die beiden funktionellen Gruppen 2 A und 2 B des Proteins auch einen entsprechenden Abstand zueinander aufweisen, so dass sie einerseits die Bindung der jeweils anderen funktionellen Gruppe aus sterischen Gründen nicht behindern und andererseits bei Bindung an die Trägeroberfläche die Konformation des Proteins nicht verändern. Der Abstand der beiden funktionellen Gruppen 2 A und 2 B innerhalb des Proteins kann je nach Anforderung frei gewählt und variiert werden. According to the invention it is provided that the functional group 2 B of the protein, which with a complementary functional group 1 B the Carrier surface forms a non-covalent bond, in the actual immobilization process Protein so pre-oriented that the functional Protein group 2 A, with its binding partner 1 A a covalent bond on the carrier surface is to be positioned so that this covalent bond quickly and unhindered can be trained. According to the invention provided that the two functional groups 2 A and 2 B of the protein within the protein molecule are positioned so that they are outside of for responsible for the biological protein activity Protein domains at an appropriate distance to these are arranged. It is also according to the invention provided that the two functional groups 2 A and 2 B of the protein also a corresponding one Have a distance from each other so that they on the one hand the binding of the other functional Do not hinder group for steric reasons and on the other hand, when bound to the support surface do not change the conformation of the protein. The Distance between the two functional groups 2 A and 2 B within the protein can be as required freely chosen and varied.

Erfindungsgemäß ist daher auch vorgesehen, dass die auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen 1 A und 1 B eine Dichte und einen Abstand zueinander aufweisen, dass das zu immobilisierende Protein kovalent und nicht-kovalent gebunden werden kann, ohne dass Konformation und sterische Ausrichtung des Proteins verändert werden. Auch hier kann der Abstand der beiden funktionellen Gruppen 1 A und 1 B je nach Anforderung frei gewählt und variiert werden. In besonders vorteilhafter Weise kann auch die Umgebung der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B auf der Trägeroberfläche hinsichtlich einer elektrostatischen und sterischen Ausstattung für eine möglichst effiziente, gerichtete Immobilisierung vorbereitet werden. According to the invention it is therefore also provided that the functional existing on the support surface Groups 1 A and 1 B have a density and a distance to each other that the immobilized Protein can be bound covalently and non-covalently can without conformation and steric Orientation of the protein can be changed. Here too the distance between the two functional groups 1 A and 1 B freely selected according to requirements and can be varied. Can in a particularly advantageous manner also the environment of the functional groups 1 A and 1 B on the support surface with respect to a electrostatic and steric equipment for the most efficient, targeted immobilization to get prepared.

Nach Immobilisierung des Proteins ist das Protein erfindungsgemäß so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Protein- Domäne(n) gegenüber dem nicht-immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese Protein- Domäne(n bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind. After immobilization of the protein, the protein is according to the invention on the carrier surface fixed that the three-dimensional structure of the for the biological activity required protein Domain (s) versus the non-immobilized State is not changed and that this protein Domain (s upon contact with cellular Reaction partners are / are freely accessible to them.

Erfindungsgemäß ist insbesondere in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass es sich bei diesen Trägersystemen um kompakte oder hohle Nanopartikel mit Größen zwischen 5 und 500 nm handelt. Diese bestehen entweder aus organischen oder anorganischen Partikelmaterialien. Die Art des Materials kann erfindungsgemäß entsprechend der späteren Anwendung variiert werden, wobei der Träger der Nanopartikel vorzugsweise aus biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubare Materialien besteht. According to the invention, in particular preferred embodiment provided that it these carrier systems around compact or hollow Nanoparticles with sizes between 5 and 500 nm. These are either organic or inorganic particle materials. The type of According to the invention, the material can be made later Application can be varied, with the carrier of the Nanoparticles preferably from biological compatible and / or biodegradable materials consists.

Da die erfindungsgemäßen Nanocytes einerseits in Analogie zu membranständigen Signalen reagieren, andererseits aber auch vollkommen neue überraschende Funktionen entwickeln, eröffnet sich ein sehr breites Anwendungspotential. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikel als Werkzeuge für die molekularbiologische, zellbiologischen und klinischen Forschung eingesetzt werden. Dabei bietet der Einsatz kolloidaler nanopartikulärer Träger den Vorteil, das etablierte Verfahren für die Bioaktivitätsbestimmung verwendet werden können und somit ein schnelles Materialscreening durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemäßen Nanocytes können auch in Form poröser Filme abgeschieden werden. Mikroporöse Systeme besitzen ein großes Potential für extrakorporale therapeutische Anwendungen, beispielsweise auf dem Gebiet der Tumortherapie, um frei zirkulierende maligne Zellen selektiv zu erkennen und gegebenenfalls abzutöten. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nanopartikel auf der Basis biologisch verträglicher Trägersysteme direkt in vivo appliziert werden. Mit solchen Systemen können daher prinzipiell Krankheiten therapiert werden, bei denen die normale Zell-Zell-Interaktion gestört ist, also insbesondere Tumorerkrankungen und Erkrankungen des Immunsystems. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikel in vitro eingesetzt werden, um die Wirkungsweise membranständiger Signale zu untersuchen. Gegenüber der direkten Zell-Zell-Interaktion gewinnen die erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, dass einzelne Effekte isoliert untersucht werden können. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel bieten sich daher für die in vitro-Diagnostik an, um beispielsweise bestimmte Zellen zu erkennen und/oder zu markieren. Darüber hinaus können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel gezielt Zellen in einen erwünschten Zustand überführt werden beziehungsweise besteht die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Zell-Zuständen hin- und herzuschalten. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch dazu verwendet werden, bestimmte Zellen aus komplexen biologischen Matrices, beispielsweise biologischen Flüssigkeiten wie Blut, zu isolieren oder direkt in diesen Matrices bei diesen Zellen entsprechende Reaktionen auszulösen, wie beispielsweise Differenzierung, Proliferation oder auch Apoptose. Darüber hinaus können auch technische Systeme konstruiert werden, die eine gezielte und kontinuierliche Separation bestimmter Zellen erlauben. Die erfindungsgemäßen Nanocytes, insbesondere solche mit biologisch verträglichen Trägersystemen, können für die Therapie verschiedener Krankheiten in vivo eingesetzt werden. Mit, solchen Systemen können prinzipiell alle Krankheiten therapiert werden, bei denen die normale Zell-Zell-Interaktion gestört ist, also insbesondere Tumorerkrankungen, Wundheilungsprozesse und ähnliche. Erfindungsgemäße Nanocytes können aber auch prinzipiell für Aufgaben, die normalerweise Zellen des Immunsystems übernehmen, verwendet werden. Since the nanocytes according to the invention are React analogy to membrane-related signals, but also completely new ones Developing surprising functions opens up a lot broad application potential. For example, you can the nanoparticles according to the invention as tools for molecular biological, cell biological and clinical research. there offers the use of colloidal nanoparticulate carriers the advantage of the established process for the Bioactivity determination can be used and thus a quick material screening was carried out can be. The nanocytes according to the invention can can also be deposited in the form of porous films. Microporous systems have great potential for extracorporeal therapeutic applications, for example in the field of tumor therapy selectively circulating malignant cells recognize and kill if necessary. Furthermore can the nanoparticles of the invention on the Based on biologically compatible carrier systems directly can be applied in vivo. With such systems can treat diseases in principle in which the normal cell-cell interaction is disturbed, in particular tumor diseases and diseases of the immune system. For example can the nanoparticles of the invention in vitro used to the mode of action to study membrane-related signals. Opposite the direct cell-cell interaction win the nanoparticles according to the invention have the advantage that individual effects can be examined in isolation. The Nanoparticles according to the invention therefore offer themselves for in vitro diagnostics, for example recognize and / or mark certain cells. In addition, using the Nanoparticles according to the invention target cells into one be transferred to the desired state or it is possible to choose between different Switch cell states back and forth. The Nanoparticles according to the invention can also do this used certain cells from complex biological matrices, for example biological Liquids such as blood, isolate or directly in corresponding to these matrices in these cells Trigger reactions, such as Differentiation, proliferation or apoptosis. About that technical systems can also be constructed be a targeted and continuous Allow separation of certain cells. The Nanocytes according to the invention, in particular those with biologically compatible carrier systems, can be used for Therapy of various diseases in vivo be used. With, such systems can in principle all diseases are treated in which the normal cell-cell interaction is disturbed, so especially tumor diseases, Wound healing processes and the like. Nanocytes according to the invention can but also principally for tasks that normally take over cells of the immune system become.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei den Proteinen um solche Moleküle handelt, die sich zumindest zeitweise an einer Zelloberfläche befinden und die Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung steuern. According to the invention it is particularly provided that the proteins are such molecules that is, at least temporarily, on a Cell surface and cell communication control with their surroundings.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "Nanopartikeln" Bindematrices verstanden, die einen Träger mit einer Oberfläche umfassen, an dem chemisch reaktive funktionelle Gruppen angeordnet sind, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Molekülen, beispielsweise Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate etc., affine Bindungen, also kovalente und/oder nichtkovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Moleküle an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die Träger der Nanopartikel bestehen aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien und besitzen eine Größe von weniger als 1 µm, vorzugsweise von 5 bis 500 nm. In connection with the present invention are understood as "nanoparticles" binding matrices, comprising a support with a surface the chemically reactive functional groups are arranged with complementary functional Groups of molecules to be bound, for example Proteins, nucleic acids, carbohydrates etc., affine bonds, i.e. covalent and / or noncovalent bonds, enter into and do so fix the molecules stably on their surfaces can. The carriers of the nanoparticles consist of chemically inert inorganic or organic Materials and are less than 1 µm, preferably from 5 to 500 nm.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Protein" ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Protein also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein Teil davon, beispielsweise eine Domäne oder eine Bindungstasche, sein. Ein derartiges Protein kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Das Protein kann gegenüber der Wildtyp-Form derivatisiert sein, beispielsweise Glycosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusioniert sein oder mit Molekülen anderer Art, beispielsweise Kohlenhydraten, verbunden sein. In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Protein eine Verbindung, die sich zumindest zeitweise an einer Zelloberfläche innerhalb eines natürlichen Zellverbandes befindet und die Kommunikation der Zelle in ihrer Umgebung steuert. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Proteinen um ein Cytokin, das heißt eine von einer Vielzahl von Zellarten gebildete und sezernierte Substanz, die als interzellulärer Mediator zur Aktivierung von Zellen beiträgt, beispielsweise ein Lymphokin, Interleukin, Monokin oder Wachstumsfaktor, insbesondere Tumor-Nekrose-Faktor (TNF). In connection with the present invention a "protein" means a molecule that at least two via an amide bond with one another linked amino acids. In connection with Thus, in the present invention, a protein also a peptide, for example an oligopeptide Polypeptide or a part thereof, for example one Domain or a binding pocket. On such protein can be natural or synthetic Be of origin. It can be done through genetic engineering modified from the wild-type protein and / or unnatural and / or unusual Contain amino acids. The protein can be compared to the Wild-type form can be derivatized, for example Have glycosylations, it can be shortened, it can be fused with other proteins or with molecules of another kind, for example Carbohydrates. Particularly preferred This is the embodiment of the present invention Protein a compound that is at least at times on a cell surface within a natural cell structure and the Controls communication of the cell in its environment. Especially the proteins are preferably a Cytokine, that is one of a variety of Cell types formed and secreted substance that as an intercellular mediator to activate Cells, such as a lymphokine, Interleukin, monokin or growth factor, especially tumor necrosis factor (TNF).

Unter der "biologischen Aktivität" eines Moleküls, insbesondere Proteins, werden alle Funktionen verstanden, die dieses in einem Organismus in seiner natürlichen zellulären Umgebung ausübt. Dabei kann es sich um spezifische katalytische oder enzymatische Funktionen, Funktionen in der Immunabwehr, Transport- und Speicher-Funktionen, Regulationsfunktionen, Transkriptions- und Translationsfunktionen und ähnliche handeln. "Beibehaltung der biologischen Aktivität" bedeutet, dass ein Molekül, insbesondere Protein, nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben kann wie das gleiche Molekül im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen beziehungsweise das gleiche Molekül in seiner natürlichen zellulären Umgebung. Under the "biological activity" of a molecule, especially protein, all functions understood that this in an organism in its natural cellular environment. It can it is specific catalytic or enzymatic functions, functions in immune defense, Transport and storage functions, Regulatory functions, transcription and Act translation functions and the like. "Maintaining the biological activity "means that a molecule especially protein, after immobilization on the Surface of a nanoparticle the same or almost the same biological functions in at least can exercise similar extent as the same Molecule in the non-immobilized state below suitable in vitro conditions or that same molecule in its natural cellular Surroundings.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "gerichtet immobilisiert" oder "gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere Protein, an definierten Positionen innerhalb des Moleküls so an einem Träger immobilisiert wird. Nach Immobilisierung des Proteins ist das Protein erfindungsgemäß so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Protein-Domäne(n) gegenüber dem nichtimmobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese Protein-Domäne(n), beispielsweise Bindungstaschen für zelluläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind. "Gerichtet immobilisiert" bedeutet auch, dass die Fixierung des Proteins auf der Trägeroberfläche so erfolgt, dass das immobilisierte Protein bei einer späteren Verwendung in einer zellulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Protein-degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann, das heißt, das fixierte Protein bietet so wenig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen. "Gerichtet immobilisiert" bedeutet auch, dass bei der Immobilisierung einer Molekülspezies alle oder nahezu alle individuellen Moleküle, mindestens jedoch mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 85% aller Moleküle auf einer Trägeroberfläche eine identische oder nahezu identische Position reproduzierbar einnehmen. In connection with the present invention means "directionally immobilized" or "directional immobilization" that a molecule especially protein, at defined positions within the molecule so on a support is immobilized. After the protein is immobilized the protein according to the invention on the Support surface that fixes the three-dimensional structure the one required for biological activity Protein domain (s) against the non-immobilized state is not changed and that this protein domain (s), for example Binding pockets for cellular reactants, at Contact with cellular reactants for this is / are freely accessible. "Directionally immobilized" also means fixing the protein on it the carrier surface so that the immobilized protein for later use in a cellular or cell-like one Environment by protein-degrading enzymes or not can be degraded very slowly, that is, the fixed protein offers as little as possible Attack points for proteases. "directedness immobilized "also means that when immobilized all or almost all of a molecular species individual molecules, but at least more than 80%, preferably more than 85% of all molecules on one Carrier surface an identical or almost reproducible identical position.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "ersten funktionellen Gruppe 1 A" eine auf der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers aufgebrachte chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2 A, die beispielsweise auf dem zu immobilisierenden Protein vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann, wobei diese Bindung im Anschluss an die nicht-kovalente Bindung der Bindungspartner 1B und 2B stattfindet und der Fixierung des Proteins dient. In connection with the present invention under a "first functional group 1A" on the surface of the nanoparticle carrier applied chemical group understood in the Is able to use a complementary functional Group 2 A, for example on the to immobilizing protein is present, too interact that a covalent bond between the both binding partners can take place, whereby this bond following the non-covalent Binding of binding partners 1B and 2B takes place and serves to fix the protein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "zweiten funktionellen Gruppe 1 B" eine chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe , die in einem zu immobilisierenden Protein vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine nichtkovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann, wobei diese Bindung der Orientierung des Proteins dient und vor der konkreten Bindung der Bindungspartner 1A und 2A stattfindet. In connection with the present invention under a "second functional group 1 B" one understood chemical group that is able with a complementary functional group, which are present in a protein to be immobilized is to interact in such a way that a noncovalent bond between the two Binding partners can take place, this binding of Orientation of the protein serves and before the concrete Binding of the binding partners 1A and 2A takes place.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die erste funktionelle Gruppe 1 A der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. In a preferred embodiment of the invention the first functional group 1 A the Carrier surface selected from the group consisting of Amino group, carboxy group, epoxy group, Maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, Hydrazine group, hydrazide group, thiol group and Thioester.

Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2 A des zu immobilisierenden Proteins ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 A der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1 A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2 A des zu immobilisierenden Proteins verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine andere Gruppe als die funktionelle Protein- Gruppe 2 A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1 A und 2 A müssen dabei komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen. According to the functional group 2A of the protein to be immobilized selected from a Group that the same species as for the contains functional group 1A of the carrier surface. A nanoparticle according to the invention therefore has in on its surface a first functional group 1 A on that covalently with a functional group 2 A of the protein to be immobilized linked is, the functional surface group 1 A a different group than the functional protein Group 2A is. The two in bond kicking groups 1 A and 2 A must do so to be complementary to each other, that is to be able to form a covalent bond with each other.

Wird erfindungsgemäß als funktionelle Gruppe 1 A beispielsweise eine Aminogruppe verwendet, ist die funktionelle Gruppe 2 A des zu immobilisierenden Proteines eine Carboxygruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Carboxygruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A eine Aminogruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Thiolgruppe gewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre Protein-Gruppe eine Maleinimidogruppe. Wird umgekehrt eine Maleinimidogruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A ausgewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre funktionelle Protein-Gruppe 2 A eine Thiolgruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Alkylketongruppe, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre Protein- Gruppe 2 A eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A eine Alkylketon-, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe. According to the invention as a functional group 1A for example, an amino group is used functional group 2 A of the immobilized Protein a carboxy group. Is according to the invention conversely a carboxy group as a functional Surface group 1A used is according to the invention the functional complementary protein group 2A an amino group. According to the invention as functional surface group 1 A a thiol group selected, the complementary is according to the invention Protein group is a maleimido group. Is reversed a maleimido group as functional Surface group 1 A selected, is the invention complementary functional protein group 2 A a Thiol group. According to the invention as a functional Surface group 1 A is an alkyl ketone group, especially methyl ketone or aldehyde group used is the functional complementary protein Group 2 A is a hydrazine or hydrazide group. Becomes according to the invention a hydrazine or Hydrazide group as a functional surface group 1 A used, the functional is according to the invention complementary protein group 2 A an alkyl ketone, especially methyl ketone or aldehyde group.

Ein erfindungsgemäßes Nanopartikel weist an seiner Oberfläche ferner mindestens eine zweite funktionelle Gruppe 1 B auf, die nicht-kovalent mit einer komplementären funktionellen Gruppe eines zu immobilisierenden Proteins verknüpft ist. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1 B der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. A nanoparticle according to the invention has at its Surface further at least a second functional group 1 B that is non-covalent with a complementary functional group one too immobilizing protein is linked. In preferred embodiment of the invention is the second functional group 1 B of the support surface selected from the group consisting of Oligohistidine group, strep day I, strep day II, Desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, Streptactin, avidin and neutravidin.

Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe des zu immobilisierenden Proteins ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 B der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßes Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1 B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2 B des zu immobilisierenden Proteins verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B eine andere Gruppe als die funktionelle Protein-Gruppe 2 B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen. According to the functional group of the protein to be immobilized selected from a Group that the same species as for the contains functional group 1 B of the support surface. A nanoparticle according to the invention therefore has in a functional group 1 B on its surface, the non-covalent with a functional group 2 B of the protein to be immobilized is linked, where the functional surface group 1 B a different group than the functional protein group 2 B is. The two together in non-covalent Binding groups must be complementary to each other, that is, to be able to enter into a non-covalent bond with each other.

Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B ein Metallionenchelatkomplex verwendet, ist die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 B eine Oligohistidingruppe. Wird als funktionelle Oberflächengruppe 1 B eine Oligohistidingruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre Protein- Gruppe ein Metallchelatkomplex. Is used according to the invention as a functional surface Group 1 B uses a metal ion chelate complex, is the functional complementary protein group 2 B an oligohistidine group. Is considered functional Surface group 1 B is an oligohistidine group used is the functional complementary protein Group a metal chelate complex.

Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B Strep- Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin verwendet, wird als komplementäre funktionelle Protein-Gruppe Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt, wird als komplementäre funktionelle Protein-Gruppe Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt. Is used as a functional surface group 1 B strep Day I, Strep Day II, biotin or desthiobiotin is used as a complementary functional Protein group streptavidin, streptactin, or avidin Neutravidin used. Is considered functional Surface group 1 B streptavidin, streptactin, Avidin or neutravidin is used as complementary functional protein group strep-tag I, Strep Day II, biotin or desthiobiotin used.

Wird in einer weiteren Ausführungsform Chitin oder ein Chitinderivat als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre Protein-Gruppe eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre Protein- Gruppe Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt. In a further embodiment, chitin or a chitin derivative as a functional surface Group 1 B is used as a functional complementary protein group one Chitin binding domain used. Is considered functional Surface group 1 B a chitin binding domain is used as a functional complementary protein Group chitin or a chitin derivative used.

Die vorstehend genannten funktionellen Gruppen der Trägeroberfläche und/oder des Proteins werden erfindungsgemäß vorzugsweise mittels eines Spacers mit dem zu immobilisierenden Protein beziehungsweise der Trägeroberfläche verbunden beziehungsweise unter Verwendung eines Spacers an den Träger oder in das Protein eingeführt. Der Spacer dient somit einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppen zu dem Träger beziehungsweise dem Protein, andererseits aber auch als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann erfindungsgemäß Alkylengruppen oder Ethylenglykololigomere mit 2 bis 50 C-Atomen darstellen, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Erfindungsgemäß kann der Spacer flexibel und/oder linear sein. Bei Verwendung eines Spacers im Zusammenhang mit der ersten, funktionellen Gruppe 1 A der Oberfläche bindet der Spacer kovalent an eine Seitenkette einer Aminosäure des Proteins, wobei die Aminosäure, an die die Bindung erfolgt, eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure sein kann. Sofern die Aminosäure eine natürliche Aminosäure ist, wird sie durch Bindung an den Spacer und die damit verbundene funktionelle erste Oberflächen-Gruppe 1 A zu einer unnatürlichen Aminosäure im Sinne der Erfindung. The above functional groups of Carrier surface and / or the protein according to the invention preferably by means of a spacer with the protein to be immobilized or the carrier surface connected respectively using a spacer on the support or introduced into the protein. The spacer thus serves on the one hand as a spacer of the functional Groups for the carrier or the protein, but also as a carrier for the functional group. Such a spacer can alkylene groups according to the invention or Represent ethylene glycol oligomers with 2 to 50 carbon atoms, which in preferred embodiment is substituted and Has heteroatoms. According to the invention, the spacer be flexible and / or linear. When using a Spacers related to the first, The spacer binds functional group 1A of the surface covalently to a side chain of an amino acid of the Protein, the amino acid to which the binding occurs, a natural or unnatural Can be amino acid. If the amino acid is a is natural amino acid, it is bound to the Spacer and the associated functional first Surface group 1 A to an unnatural Amino acid in the sense of the invention.

Sofern der Spacer eine funktionelle Protein-Gruppe 2 A mit einem Träger verbindet, geschieht dies vorzugsweise über eine auf dem Träger angeordnete Ankergruppe, die in besonders bevorzugter Ausführung als Silan mit reaktiven Gruppen ausgeführt ist, beispielsweise die mit Si-OH-Gruppen der Oberfläche des vorzugsweise oxidischen Si-Trägers kovalente Si-O-Si-Bindungen (Silox-Anbindungen) ausbilden kann. If the spacer is a functional protein group 2 A connects to a carrier, this happens preferably via one arranged on the carrier Anchor group, the most preferred version is designed as a silane with reactive groups, for example those with Si-OH groups on the surface of the preferably oxidic Si carrier covalent Form Si-O-Si bonds (silox bonds) can.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung verbindet der Spacer entweder eine funktionelle Gruppe der Trägeroberfläche mit dem Protein oder eine funktionelle Gruppe des Proteins mit dem Träger, wobei die funktionelle Gruppe auch als Bestandteil des Spacers, das heißt eine seiner funktionellen Gruppen, angesehen werden kann. For the purposes of the present invention, the Spacer either a functional group of the Carrier surface with the protein or a functional group of the protein with the carrier, the functional group also as part of the Spacers, that is one of its functional Groups that can be viewed.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als erste funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A die Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe oder Thioestergruppe verwendet, die mittels eines Spacers, beispielsweise im Falle einer Alkylketongruppe mittels Lävulinsäure, mit einer Seitenkette einen dem zu immobilisierenden Protein vorhandenen natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure verbunden werden beziehungsweise durch den Spacer in das Protein eingeführt werden. Sofern die Verbindung zu einer natürlichen Aminosäure erfolgt, wird diese durch die Bindung mit dem die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer zu einer unnatürlichen Aminosäure. In a particularly preferred embodiment of the Invention become the first functional Surface group 1 A the amino group, carboxy group, Epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, Aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, Thiol group or thioester group used that by means of a spacer, for example in the case of a Alkyl ketone group using levulinic acid, with a Side chain to the one to be immobilized Protein present natural or unnatural Amino acid can be linked or through insert the spacer into the protein. Provided the connection to a natural amino acid takes place, this is through the bond with the functional spacer to a unnatural amino acid.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Träger" einer Vorrichtung, insbesondere eines Nanopartikels, ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Gerüst für das zu immobilisierende Molekül, insbesondere Protein, dient. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung besteht der Träger aus einem biologisch verträglichen Material. Erfindungsgemäß ist der Träger ein kompaktes oder hohles Partikel mit einer Größe von 5 nm bis 500 nm. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "biologisch verträglich", dass der Träger beziehungsweise die Oberfläche des Nanopartikels sowohl hinsichtlich seiner Materialzusammensetzung als auch hinsichtlich seiner Struktur weder im Körper eines Rezipienten noch in isolierten biologischen Geweben oder Flüssigkeiten eine immunologische, tokische oder sonstige Reaktion hervorruft und zelluläre oder molekulare Prozesse nicht oder kaum stört. Wenn ein biologisch verträglicher Träger "biologisch abbaubar" ist, bedeutet dies, dass ein Träger im Körper eines Rezipienten beziehungsweise in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten langsam abgebaut beziehungsweise metabolisiert werden kann, vorzugsweise, nachdem das am Träger immobilisierte Molekül, insbesondere Protein seine biologische Aktivität entfaltet hat, wobei die Produkte des Abbaus beziehungsweise der Metabolisierung keine immunologischen, toxischen oder sonstigen Reaktionen hervorrufen und darüber hinaus im Körper des Rezipienten gut resorbierbar sind. In connection with the present invention under a "carrier" of a device, especially a nanoparticle, a chemically inert substance understood that as a framework for that too immobilizing molecule, especially protein, is used. In preferred embodiment of the invention is the Carrier made from a biologically compatible material. According to the carrier is a compact or hollow particle with a size of 5 nm to 500 nm. In connection with the present invention the term "biocompatible" means that the carrier or the surface of the Nanoparticle both in terms of its Material composition as well as its structure neither in the body of a recipient nor in isolated biological tissues or liquids immunological, tokish or other reaction evokes and cellular or molecular processes not or hardly bothered. If a biological compatible carrier is "biodegradable" means this being a carrier in a recipient's body or in biological tissues or Liquids slowly broken down respectively can be metabolized, preferably after that on Carrier immobilized molecule, especially protein has developed its biological activity, whereby the products of the dismantling or the Metabolism no immunological, toxic or other reactions and beyond are well absorbable in the recipient's body.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Träger der Vorrichtung, insbesondere des erfindungsgemäßen Nanopartikels, ein biologisch verträgliches, vorzugsweise ein anorganisches oder ein organisches, Material enthält oder aus diesem besteht. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der erfindungsgemäße Nanopartikel aus einem anorganischen Trägermaterial wie Silizium, SiO₂, SiO, einem Silikat, Al₂O₃, SiO₂.Al₂O₃, ZrO₂, Fe₂O₃, Ag₂O, Zr₂O₃, Ta₂O₅, Zeolith, TiO₂, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxylapatit oder ein Gemisch davon. Bei einem organischen, biologisch verträglichen Trägermaterial kann es sich um Stoffe wie Polyproylen, Polystyrol, PMMA, Polymethacrylat oder ein Gemisch davon handeln. In a preferred embodiment of the invention it is provided that the carrier of the device, in particular of the nanoparticle according to the invention, contains or consists of a biologically compatible, preferably an inorganic or an organic, material. In a preferred embodiment of the present invention, the nanoparticle according to the invention consists of an inorganic carrier material such as silicon, SiO ₂ , SiO, a silicate, Al ₂ O ₃ , SiO ₂ .Al ₂ O ₃ , ZrO ₂ , Fe ₂ O ₃ , Ag ₂ O, Zr ₂ O ₃ , Ta ₂ O ₅ , zeolite, TiO ₂ , glass, indium tin oxide, hydroxyapatite or a mixture thereof. An organic, biologically compatible carrier material can be substances such as polypropylene, polystyrene, PMMA, polymethacrylate or a mixture thereof.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Träger der Vorrichtung, insbesondere des erfindungsgemäßen Nanopartikels, aus einem biologisch abbaubaren Material oder enthält dieses. Die biologisch abbaubaren Materialien müssen für den Zeitraum der Anwendung stabil sein, können danach jedoch so abgebaut werden, dass ausscheidbare Bruchstücke erhalten werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Polyester der Polymilchsäure, die durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert wurden und dadurch in besonderer Weise kontrolliert biologisch abbaubar sind. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Polyesters von Polymilchsäure, insbesondere Poly(D,L-milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA). In a particularly preferred embodiment there is the carrier of the device, in particular the nanoparticle according to the invention, from a biodegradable material or contains it. The Biodegradable materials must be used for the Period of application may be stable afterwards however, be broken down in such a way that separable Fragments can be obtained. In particular acts it is polyester of polylactic acid, the were additionally stabilized by cross-linking and thereby controlled in a special way are biodegradable. This is particularly preferred Use of a polyester of polylactic acid, especially poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA).

Die Herstellung der Träger der erfindungsgemäßen Nanopartikel kann unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie Sol-Gel- Synthese-Verfahren, Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation erfolgen. The preparation of the carrier of the invention Nanoparticles can be made using conventional ones processes known in the art, such as sol-gel Synthesis process, emulsion polymerization, Suspension polymerization take place.

Die Oberflächen des Trägers werden durch chemische Modifizierungsreaktionen mit spezifischen funktionellen Gruppen ausgebildet. Diese funktionellen Gruppen weisen dabei eine chemische Reaktivität auf, die geeignet ist, mit spezifischen in Proteine eingebrachten funktionellen Gruppen zu reagieren. Die Bindung dieser Proteine erfolgt dabei sowohl kovalent als auch nicht-kovalent über eine chemische Reaktion zwischen Protein und Oberfläche. Die Träger, insbesondere deren Oberflächen, werden daher nach ihrer Herstellung unter Verwendung üblicher Verfahren, beispielsweise Propfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung etc. mit geeigneten funktionellen Gruppen 1 A und 1 B versehen. Die Dichte der funktionellen Gruppen und der Abstand dieser Gruppen zueinander können dabei für jedes zu immobilisierende Molekül, insbesondere Protein, optimiert werden. Auch die Umgebung der funktionellen Gruppen kann hinsichtlich einer möglichst effizienten gerichteten Immobilisierung vorbereitet werden. The surfaces of the carrier are covered by chemical Modification reactions with specific functional groups. These functional Groups exhibit chemical reactivity on that is suitable with specific in proteins introduced functional groups to react. The binding of these proteins takes place both covalently as well as non-covalently via one chemical reaction between protein and surface. The Carriers, especially their surfaces, become hence after using them after their manufacture usual processes, for example graft polymerization, Silanization, chemical derivatization etc. with suitable functional groups 1 A and 1 B Mistake. The density of the functional groups and the The distance between these groups can be used for any molecule to be immobilized, in particular Protein to be optimized. Even the environment of the functional groups can with respect to one directional immobilization as efficient as possible to get prepared.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der anorganische Träger, beispielsweise der in Form von Quarz, Kieselerde, Kieselgur, Silikagel und/oder SiO₂-Pulver vorliegende Träger vor Ausbringen der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B silanisiert, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung. In a particularly preferred embodiment of the invention, the inorganic carrier, for example the carrier in the form of quartz, silica, kieselguhr, silica gel and / or SiO ₂ powder, is silanized before application of the functional groups 1A and IB, preferably after prior hydrophilization.

In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Anzahl der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B der Oberfläche durch Zugabe von Verdünnersilanen bei der vorzugsweise vorgesehenen Silanisierung variiert werden kann. Unter dem Begriff Verdünnersilan wird ein keine funktionellen Gruppen tragendes Organosilan verstanden, das überdies nicht in der Lage ist, einen die funktionellen Oberflächen-Gruppen tragenden Spacer zu binden. Vorzugsweise wird das Verdünnersilan eingesetzt, um neben dem Verdünnungseffekt auch die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche des Trägers zu reduzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Verdünnersilan von der Silankopfgruppe ausgehend 2 bis 20 Alkylengruppen auf, an die sich vorzugsweise 2 bis 6 Oxoethylengruppen anschließen und durch beispielsweise eine Hydroxygruppe oder Methylethergruppe terminiert sind. In a particularly preferred embodiment, can be provided that the number of functional Groups 1 A and 1 B of the surface by adding Diluent silanes in the preferably provided Silanization can be varied. Under the Term thinner silane becomes a non-functional one Organosilane bearing groups understood that moreover, is unable to provide the functional To bind surface groups bearing spacers. The diluent silane is preferably used to in addition to the dilution effect, the non-specific Binding of proteins to the surface of the carrier to reduce. In a preferred embodiment has the diluent silane from the silane head group starting from 2 to 20 alkylene groups to which preferably connect 2 to 6 oxoethylene groups and by, for example, a hydroxy group or Methyl ether group are terminated.

In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Verdünnersilane der Trägeroberfläche durch entsprechende Alkylkettenlänge den Self- Assembly-Effekt begünstigen. Zudem kann vorgesehen sein, dass diese Verdünnersilane, die bei der Silanisierung des Trägers verwendet werden, die unspezifische Adsorption von Proteinen an der Nanopartikel-Oberfläche durch zugefügte entsprechende funktionelle Einheiten, wie zum Beispiel Oligoethylenglykol-Einheiten, verringern. Erfindungsgemäß können auch andere chemische Verbindungen eingesetzt werden, sofern sie bezüglich ihres unspezifischen Bindungsverhaltens Protein-abweisend wirken. In a particularly preferred embodiment provided that the diluent silanes the Support surface by appropriate alkyl chain length the self- Favor assembly effect. It can also be provided be that these thinner silanes used in the Silanization of the carrier can be used nonspecific adsorption of proteins on the Nanoparticle surface by added appropriate functional units, such as Reduce oligoethylene glycol units. According to the invention can also use other chemical compounds are used, provided that they are related to their non-specific binding behavior protein-repellent.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Vorrichtung, insbesondere die Nanopartikel, zusätzliche Funktionalitäten aufweisen. Erfindungsgemäß kann der Träger insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetische Funktionen, ferromagnetische Funktionen und/oder radioaktive Markierungen aufweisen. Aufgrund der erfindungsgemäß eingesetzten Funktionalitäten können entsprechend ausgestattete Nanopartikel unter Verwendung geeigneter Vorrichtungen leicht detektiert und/oder isoliert werden. According to the invention it is provided that the Device, especially the nanoparticles, additional Have functionalities. According to the invention the carrier in particular fluorescent labels, UV / Vis markings, superparamagnetic Functions, ferromagnetic functions and / or have radioactive markings. Due to the Functionalities used according to the invention can appropriately equipped nanoparticles under Use of suitable devices easily detected and / or isolated.

Die Oberfläche des Trägers kann erfindungsgemäß aber auch zusätzliche chemische Verbindungen aufweisen. Diese zusätzlich aufgebrachten chemischen Funktionalitäten richten sich unter anderem nach der späteren Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen. Sollen diese beispielsweise zur Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten verwendet werden, können die Vorrichtungen geeignete chemische Verbindungen mit therapeutischer und/oder diagnostischer Wirkung enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Vorrichtungen Arzneistoffe wie Cytostatika enthalten. Sie sind dementsprechend zur Therapie von Tumorerkrankungen geeignet. The surface of the carrier can be according to the invention but also additional chemical compounds exhibit. This additionally applied chemical Functionalities depend among other things the later use of the invention Devices. Should these be used, for example Therapy and / or diagnosis of diseases used the devices can be suitable chemical compounds with therapeutic and / or diagnostic effect included. Especially preferred embodiment it is provided that the Devices according to the invention drugs such as Contain cytostatics. Accordingly, they are for Therapy of tumor diseases suitable.

Erfindungsgemäß kann aber auch vorgesehen sein, dass die Funktionalisierung des Trägers unter Verwendung einer oder mehrerer chemischer Verbindungen erfolgt, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung des immobilisierten Proteins und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung an den Träger dient. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist, dass es sich bei dieser chemischen Verbindung um ein Polyethylenglykol, ein Oligoethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon handelt. According to the invention, however, it can also be provided that that the functionalization of the carrier under Use of one or more chemical compounds takes place for steric stabilization and / or to prevent a change in conformation of the immobilized protein and / or for prevention the addition of another biologically active Connection to the carrier serves. According to the invention it is particularly preferred that this chemical compound around a polyethylene glycol Oligoethylene glycol, dextran or a mixture thereof is.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Oberfläche der planaren Bindematrix Mikrostrukturen mit unterschiedlichen Funktionalitäten aufweist, hergestellt beispielsweise durch Photolithografie oder Prägetechniken. Schließlich kann vorgesehen sein, dass die Mikrostrukturen der planaren Biomatrix-Oberfläche mit photolithisch oder thermolithisch aktivierbaren Schutzgruppen versehen sind, die eine lithographische Modifizierung der Oberfläche erlauben. In a particularly preferred embodiment, can be provided that the surface of the planar Binding matrix microstructures with different Has functionalities, manufactured for example by photolithography or embossing techniques. Finally, it can be provided that the Microstructures of the planar biomatrix surface with can be activated photolithically or thermolithically Protection groups are provided, the one allow lithographic modification of the surface.

Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende Protein natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann auch durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. According to the invention, the one to be immobilized Protein of natural or synthetic origin. It can also be done through genetic engineering modified against the wild-type protein and / or unnatural and / or unusual amino acids contain.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das zu immobilisierende Protein nach peptidsynthetischen Verfahren oder durch in vitro-Translation hergestellt. Dabei werden in einer möglichen Ausführungsform bei der Herstellung unnatürliche, vorzugsweise Linker-Spacer-tragende Aminosäuren gezielt eingebaut, so dass nachfolgend eine gerichtete und mit dem Erhalt der biologischen Aktivität des Proteins kompatible Immobilisierung des Proteins an den Träger möglich ist. Die Anwendung des Prinzip des Einbaus unnatürlicher Aminosäuren ermöglicht darüber hinaus den gezielten und selektiven Einbau von Fluophoren oder anderen Markern an diesen unnatürlichen Aminosäuren. According to a preferred embodiment of the The present invention is the one to be immobilized Protein by peptide synthetic methods or by produced in vitro translation. Thereby in a possible embodiment in the manufacture unnatural, preferably linker-spacer-bearing Amino acids incorporated specifically, so that subsequent a directed and with the preservation of the biological Activity of the protein compatible immobilization of the protein to the carrier is possible. The Application of the principle of incorporating unnatural Amino acids also enables targeted and selective incorporation of fluophores or others Markers on these unnatural amino acids.

In besonders bevorzugter Weise können diese Modifikationen darin bestehen, dass in dem Protein natürlicherweise vorkommende Aminosäuren durch unnatürliche Aminosäuren ausgetauscht sind, das heißt, in einer bestimmten Position eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure entfernt und an gleicher Stelle eine unnatürliche Aminosäure insertiert wird. Das Einfügen einer unnatürlichen Aminosäure kann durch das Einfügen eines Stopp-Colons an der gewünschten Stelle, durch das Verwenden beziehungsweise den Einsatz einer mit der entsprechenden unnatürlichen Aminosäure beladenen Supressor-tRNA und eines damit durchgeführten in vitro- Translationsansatzes erfolgen. Solche unnatürlichen Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, zum Beispiel L-(6,7-Dimethyloxycoumaryl)-Alanin. In bevorzugter Weise weisen diese Aminosäuren eine Alkylketongruppe oder eine Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Thiolgruppe, Hydrazingruppe oder Hydrazidgruppe auf. Diese unnatürlichen Aminosäuren können durch gentechnologische Verfahren oder während einer chemischen Synthese des Proteins in das Protein eingefügt werden, vorzugsweise zusammen mit einem Spacer oder Linker. In a particularly preferred manner, these can Modifications are that in the protein naturally occurring amino acids unnatural amino acids are exchanged, that is, in a certain position a natural one occurring amino acid removed and at the same Place an unnatural amino acid inserted becomes. The insertion of an unnatural amino acid can be done by inserting a stop colon at the desired place by using or the use of one with the corresponding unnatural amino acid-loaded suppressor tRNA and of an in vitro Translation approach take place. Such unnatural Amino acids are compounds that one Have amino acid function and a radical R and not over a naturally occurring genetic code are defined, for example L- (6,7-Dimethyloxycoumaryl) alanine. These preferably point Amino acids an alkyl ketone group or a Aldehyde group, thioester group, thiol group, Hydrazine group or hydrazide group. This unnatural amino acids can be caused by genetic engineering Process or during a chemical synthesis of the protein are inserted into the protein, preferably together with a spacer or linker.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also zumindest eine Aminosäure des Proteins derivatisiert, insbesondere durch Einführung einer Alkylketongruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe und/oder Hydrazidgruppe. Insbesondere wird eine der vorhergehenden Funktionen über einen Spacer mit der Seitenkette einer unnatürlichen oder natürlichen Aminosäure verbunden beziehungsweise der Spacer weist eine solche Funktion auf. Der Spacer kann in bevorzugter Ausführungsform flexibel oder linear sein und beispielsweise eine Kettenlänge von 2 bis 50 Atomen aufweisen. Der Spacer ist in weiterer bevorzugter Ausführungsform durch gegebenenfalls substituierte und/oder Heteroatome enthaltende Alkylengruppen gebildet. In a particularly preferred embodiment of the Invention is at least one amino acid of the Protein derivatized, especially by Introduction of an alkyl ketone group, thiol group, Aldehyde group, thioester group, hydrazine group and / or Hydrazide. In particular, one of the previous functions via a spacer with the Side chain of an unnatural or natural Amino acid connected or the spacer has such a function. The spacer can be in preferred embodiment be flexible or linear and for example a chain length of 2 to 50 Have atoms. The spacer is in another preferred embodiment by optionally substituted and / or containing heteroatoms Alkylene groups formed.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spacer durch die Bindung einer Seitenkette einer Aminosäure des Proteins, beispielsweise Lysin, an Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) gebildet, wobei gleichzeitig eine Methylketongruppe eingeführt wird und der Spacer dem gemäß aus Seitenkette und Lävulinsäure gebildet wird. In a further preferred embodiment the spacer by binding a side chain an amino acid of the protein, for example lysine, on levulinic acid (4-oxopentanoic acid), where at the same time a methyl ketone group is introduced and the spacer according to the side chain and Levulinic acid is formed.

Sofern die einzusetzende unnatürliche Aminosäure bereits eine Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Hydrazidgruppe oder Hydrazingruppe aufweist, ist eine vorgenannte Derivatisierung nicht mehr nötig. Es kann also vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, beispielsweise durch Derivatisierung von deren Seitenkette, insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion der Lävulinsäure. Proteine, die eine solche natürlicherweise vorkommende Aminosäure mit unnatürlicher Derivatisierung aufweisen, sind im Sinne der vorliegenden Lehre modifiziert. Der Einbau von beispielsweise Lävulinsäure in eine unnatürliche oder natürliche Aminosäure ermöglicht es, an definierter Stelle der Sequenz eine Ketofunktion einzubauen, die dann selektiv beispielsweise mit einem Hydrazin oder Hydrazid zu Hydrazon reagieren kann. If the unnatural amino acid to be used already an alkyl ketone group, aldehyde group, Thiol group, thioester group, hydrazide group or Hydrazine group is one of the aforementioned Derivatization is no longer necessary. So it can be provided, a naturally occurring To modify amino acid, for example lysine, for example by derivatizing them Side chain, especially their primary amino group, with the carboxylic acid function of levulinic acid. proteins, which is one that occurs naturally Have amino acid with unnatural derivatization, are modified in the sense of the present teaching. The installation of, for example, levulinic acid in a enables unnatural or natural amino acid it, at a defined point in the sequence Install keto function, which is then selective for example with a hydrazine or hydrazide to hydrazone can react.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modifikation des Proteins dadurch, dass dem Protein Tags, also Markierungen, insbesondere mindestens drei Histidin- Reste, vorzugsweise Oligohistidine, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C-Terminus oder den N- Terminus. Solche Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. In einer derartigen Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, beispielsweise die silanisierte Oberfläche des Trägers, durch Aufbringen von Metallchelatkomplexen mit funktionellen Gruppen zu versehen. Auf diese Weise wird eine nicht-kovalente Bindung der Metallchelatkomplexe mit dem Oligohistidin-Rest des zu immobilisierenden Proteins erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Metallkomponente des Metallchelatkomplexes ein zweiwertiges Metallkation, insbesondere Nickel²⁺, dar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Metallchelatkomplex Nickel-NTA (NTA: Nitrilotriessigsäure), insbesondere ein Derivat davon. Der Metallchelatkomplex, insbesondere Ni-NTA oder ein Derivat davon, ist in bevorzugter Ausführungsform an der Oberfläche des Trägers gebunden, beispielsweise mittels einer Bindung zwischen einer primären Aminogruppe des NTA- Derivats und einer Oberflächen-gebundenen Epoxygruppe. In a further preferred embodiment of the present invention, the modification of the protein is carried out by adding tags, ie labels, in particular at least three histidine residues, preferably oligohistidines, to the protein, preferably to the C-terminus or the N-terminus. However, such tags can also be arranged intramolecularly. In such an embodiment it is provided to provide the surface of the carrier, for example the silanized surface of the carrier, with functional groups by applying metal chelate complexes. In this way, non-covalent binding of the metal chelate complexes to the oligohistidine residue of the protein to be immobilized is achieved. In a particularly preferred embodiment of the invention, the metal component of the metal chelate complex is a divalent metal cation, in particular nickel ²⁺ . In a particularly preferred embodiment, the metal chelate complex is nickel-NTA (NTA: nitrilotriacetic acid), in particular a derivative thereof. In a preferred embodiment, the metal chelate complex, in particular Ni-NTA or a derivative thereof, is bonded to the surface of the support, for example by means of a bond between a primary amino group of the NTA derivative and a surface-bonded epoxy group.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Modifizierung des Proteins dadurch vorzunehmen, dass diesem, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Biotin oder Desthiobiotin hinzugefügt wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter einem "Strep-Tag" auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern Streptavidin und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff "Streptavidin" erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, vorzugsweise eines anorganischen Trägers, insbesondere die silanisierte Oberfläche des Trägers, mit Streptactin, Avidin, Neutravidin oder Streptavidin zu versehen. Die erfindungsgemäß vorgesehene Bindung zwischen zu immobilisierenden Proteinen und Oberfläche des Trägers erfolgt also durch eine Affinitätsbindung zwischen beispielsweise Strep-Tag und beispielsweise Streptavidin. Es ist auch möglich, dass beispielsweise Streptavidin am Protein und beispielsweise das Strep-Tag als funktionelle Gruppe des Trägers vorgesehen ist. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß auch möglich, mehrere der genannten Modifikationen an einem zu immobilisierenden Protein vorzunehmen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure, die Oligohistidin- und/oder Strep-Tags enthält, in ein Protein einzuführen. According to the invention it can also be provided that Modify the protein by doing that this, preferably at the C-terminus or N-terminus, at least one strep day, for example strep day I or Strep Day II or biotin or desthiobiotin will be added. In connection with the present invention are called a "strep tag" also functional and / or structural equivalents understood, provided streptavidin and / or its Can bind equivalents. The term "Streptavidin" in the sense of the present invention thus also its functional and / or structural Equivalents. In this embodiment provided the surface of the carrier, preferably one inorganic carrier, especially the silanized surface of the carrier, with streptactin, avidin, Neutravidin or streptavidin. The bond according to the invention between to immobilizing proteins and surface of the carrier is done through an affinity bond between for example strep day and for example Streptavidin. It is also possible that, for example Streptavidin on the protein and for example that Strep tag as a functional group of the carrier is provided. Of course it is according to the invention also possible several of the above Modifications to a protein to be immobilized for example, an unnatural amino acid, which contains oligohistidine and / or strep tags, in to introduce a protein.

Die Erfindung sieht also vor, beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, jedoch unnatürlich derivatisierten Aminosäuren, spezifischen Histidin- und/oder Strep-Tags modifizierte Proteine mit dazu komplementär reaktiven Oberflächen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete Anbindung der Proteine und damit eine Immobilisierung dieser erfolgt. The invention therefore provides, for example with unnatural amino acids, natural, however unnaturally derivatized amino acids, specific Proteins modified by histidine and / or strep with complementary reactive surfaces like this to bind that a suitable one Connection of the proteins and thus immobilization this is done.

In vorteilhafter Weise behalten die gebundenen Proteine dabei vollständig ihre biologische Funktionen bei. Durch die bereitgestellten Linker beziehungsweise Spacer zwischen Träger- und Proteinoberfläche wird den sterischen Anforderungen für eine Immobilisierung von Proteinen unter Erhalt von deren Aktivität genüge getan. Zudem ermöglicht die Erfindung auch den ortsspezifischen Einbau von Reporter- oder Markergruppen, zum Beispiel Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln für Lichtstreuung etc. in Positionen, die die funktionellen Eigenschaften der Proteine nicht beeinträchtigen. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Nanopartikel und des erfindungsgemäßen Verfahrens zur spezifischen und gerichteten Immobilisierung und Markierung von Proteinen im Vergleich zum Stand der Technik resultieren aus den spezifischen chemischen Reaktionen zwischen Proteinen, die mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Gruppen modifiziert wurden und komplementär reaktiven Festphasen sowie aus der selektiven Modifikation des zu immobilisierenden Proteins. Die immobilisierten und gegebenenfalls auch markierten Proteine sind durch den Erhalt ihrer nativen Konformation stabiler gegen enzymatischen oder chemischen Abbau und behalten ihre biologischen Funktionen bei. Dabei werden insbesondere die biologischen Aktivitäten, die auf Protein-Protein- Wechselwirkung beruhen, durch die immobilisierten Proteine weitervermittelt. Insbesondere bei konformationell empfindlichen Proteinen, deren Struktur durch Veränderungen in der Umgebung, wie zum Beispiel bei der Immobilisierung, gegeben, möglicherweise geändert wird, kann die Wahrscheinlichkeit und Vorhersagbarkeit der Immobilisierung bei Erhalt der biologischen Aktivität drastisch verbessert werden. Advantageously keep the bound ones Proteins fully perform their biological functions at. Through the provided linker or spacer between the carrier and protein surface will meet the steric requirements for a Immobilization of proteins while maintaining their Activity done enough. In addition, the Invention also the site-specific installation of reporter or marker groups, for example fluorophores, Spin labels, gold particles for light scattering etc. in positions that reflect the functional properties of the proteins do not interfere. The advantages the inventive nanoparticles and Method according to the invention for specific and directed immobilization and labeling of Proteins compared to the prior art result from the specific chemical reactions between Proteins with unnatural amino acids or specific groups have been modified and complementary reactive solid phases as well as from the selective modification of the protein to be immobilized. The immobilized and possibly also labeled proteins are preserved by their native conformation more stable against enzymatic or chemical breakdown and retain their biological Functions at. In particular, the biological activities based on protein-protein Interaction based on the immobilized Proteins passed on. Especially at conformationally sensitive proteins, their structure through changes in the environment, such as Example in immobilization given may be changed, the Probability and predictability of the Immobilization upon receipt of the biological Activity can be improved dramatically.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das Protein mit Markern, die seinen Nachweis erlauben, markiert ist. Dabei kann es sich beispielsweise um Fluorophore, Spin-Label, Goldpartikel, radioaktive Marker oder ähnliches handeln. In besonders bevorzugter Weise sind diese Marker, beispielsweise die Fluorophore, in der Lage, bei der Bindung eines in einem Test nachzuweisenden Bindungspartners an das gebundene Protein eine spezifische Änderung der Fluoreszenzemission zu zeigen. Die Fluorophore können in das zu immobilisierende Protein mittels Aminosäuren, insbesondere unnatürlicher Aminosäuren, eingefügt werden. Erfindungsgemäß geeignet Fluoreszenzmarker sind beispielsweise N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarinderivate, wie DCA(6,7-Dimethoxy-4-coumaryl) oder NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N-diaminopropionsäure). Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende Protein auch mit Fluorophoren markiert sein, die eine Einzelmoleküldetektion ermöglichen, zum Beispiel die Fluoreszenzfarbstoffe CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) oder Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA). In a further preferred embodiment of the Invention is provided that the protein with Markers that allow its detection is marked. These can be, for example, fluorophores, Spin label, gold particles, radioactive markers or act similarly. In a particularly preferred manner are these markers, for example the fluorophores, able to bind one in a test binding partner to be detected to the bound Protein a specific change in To show fluorescence emission. The fluorophores can be in the protein to be immobilized using amino acids, especially unnatural amino acids become. Fluorescent markers suitable according to the invention are, for example, N-methyl-aza-tryptophan or Coumarin derivatives such as DCA (6,7-dimethoxy-4-coumaryl) or NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N-diaminopropionic acid). According to the invention, this can be done immobilizing protein also labeled with fluorophores be that enable single-molecule detection, for example the fluorescent dyes CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) or Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA).

Die erfindungsgemäß ermöglichte Detektion von oberflächengebundenen Liganden des immobilisierten Proteins, beispielsweise eines Cytokins, also zum Beispiel der Nachweis eines Zelloberflächen-Rezeptors, kann zum Beispiel durch Matrix-unterstützte Laser- Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDITOF) erfolgen. Der massenspektroskopische Nachweis umfasst die Identifizierung und Charakterisierung der gebundenen Liganden in situ sowie die ortsaufgelöste Analytik. Der Nachweis der oberflächengebundenen Liganden kann durch Fluoreszenzspektroskopie erfolgen. Die Bindung des Liganden an den erfindungsgemäß immobilisierten Festphasen-Liganden, also das Protein, ruft eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker hervor, die eine Quantifizierung der Bindungsereignisse ermöglicht. Die Fluoreszenzanregung kann mit monochromatisiertem Weißlicht oder Laserlicht erfolgen. Erfindungsgemäß kann der Nachweis mittels einer Fernfeldoptik oder einer Nahfeldoptik erfolgen, die durch Lichtleiter auf die Oberfläche der Bindematrix geführt wird oder wobei die Bindematrix direkt auf dem Lichtleiter fixiert ist. The detection of surface bound ligands of the immobilized Protein, for example a cytokine, so to Example the detection of a cell surface receptor, can, for example, by matrix-assisted laser Desorption / ionization mass spectrometry (MALDITOF). Mass spectroscopic detection includes identification and characterization the bound ligands in situ and the spatially resolved analytics. Evidence of surface bound ligands can by Fluorescence spectroscopy is done. Binding of the ligand to the solid phase ligands immobilized according to the invention, so the protein calls a change in Fluorescence properties of those used according to the invention Fluorescent markers indicate a quantification that enables binding events. The Fluorescence excitation can be done with monochromatized white light or laser light. According to the Detection using far field optics or Near-field optics are made by light guides the surface of the binding matrix is guided or with the binding matrix directly on the light guide is fixed.

Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfähren zum Nachweis von Protein-Protein- Interaktionen, insbesondere zum Nachweis einer Interaktion des immobilisierten Proteins mit beispielsweise Liganden wie Rezeptoren, funktionellen oder strukturellen Äquivalenten, Analoga, Agonisten, Antagonisten oder ähnlichen, insbesondere zum Zweck der medizinischen Forschung und Diagnostik, wobei die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingesetzt werden, um die vorgenannten Bindungspartner des immobilisierten Proteins, beispielsweise eines Cytokins, insbesondere von TNF, zu identifizieren. Gemäß diesem Verfahren wird mindestens eine erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere Nanopartikel mit einem daran immobilisierten Protein mit einer zu untersuchenden Lösung, die potentielle Bindungspartner enthält, in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung oder eine Hemmung dieser Wechselwirkung nachgewiesen. The present invention also relates to Method for the detection of protein-protein Interactions, especially to prove a Interaction of the immobilized protein with for example ligands such as receptors, functional or structural equivalents, analogues, Agonists, antagonists or the like, in particular for the purpose of medical research and Diagnostics, the devices according to the invention, in particular the nanoparticles according to the invention used to the aforementioned Binding partner of the immobilized protein, for example a cytokine, in particular TNF identify. According to this procedure, at least a device according to the invention, in particular Nanoparticles with a protein immobilized on them with a solution to be examined, the potential Contains binding partners, brought in contact and an interaction or an inhibition of this Interaction demonstrated.

Das vorgenannte Verfahren zum Nachweis von Protein- Protein-Interaktionen stellt also auch ein Verfahren zum Identifizieren oder Screenen von potentiellen Bindungspartnern, beispielsweise potentiellen Liganden, des erfindungsgemäß immobilisierten Proteins dar. The aforementioned method for the detection of protein Protein interactions also stop Methods for identifying or screening potential binding partners, for example potential Ligand of the immobilized according to the invention Protein.

Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zum quantitativen Isolieren von mit dem erfindungsgemäß immobilisierten Protein reagierenden, das heißt bindenden Substanzen, insbesondere weiteren Proteinen. The invention also relates to methods for quantitative isolation of with the invention immobilized protein reacting, that is binding substances, especially other proteins.

In besonders bevorzugter Weise können die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere Nanopartikel, auch eingesetzt werden, um Stoffe zu identifizieren, die beispielsweise als Modulatoren, das heißt Verstärker, Induktoren oder Hemmstoffe für die, insbesondere physiologischen, Interaktionen der Proteine untereinander fungieren. Derartige nachzuweisende Hemmstoffe können beispielsweise gentechnisch veränderte, körpereigene Proteine, chemische synthetisierte Verbindungen aus Substanzbibliotheken oder andere auch unbekannte Substanzen sein, die gegebenenfalls therapeutischen Nutzen mit sich bringen können. In a particularly preferred manner, the inventive methods and the inventive Devices, especially nanoparticles, too are used to identify substances that for example as modulators, that is Amplifiers, inductors or inhibitors for especially physiological, protein interactions act with each other. Such demonstrable Inhibitors can be genetically engineered, for example modified, endogenous proteins, chemical synthesized compounds from substance libraries or other also be unknown substances that may bring therapeutic benefits can.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, ein Protein zu immobilisieren, das einen ersten von zwei Reaktanten trägt oder diesen darstellt und die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten durch eine geeignete Nachweismethode nachweist. Dabei kann vorzugsweise auch vorgesehen sein, dass die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten in Gegenwart oder Abwesenheit eines potentiellen Modulators, zum Beispiel Induktors oder Inhibitors durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird und so potentielle Induktoren oder Inhibitoren in ihrer Wirksamkeit, beispielsweise als Arzneimittel, überprüft werden können. Die zu überprüfenden potentiellen Induktoren oder Inhibitoren können beispielsweise aus Substanzbibliotheken stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Inhibitor oder der zweite Reaktant, also zum Beispiel ein Protein, eine in Genom- Sequenzier-Projekten identifiziertes Protein ist. In a further embodiment can be provided be immobilizing a protein that carries or represents the first of two reactants and the interaction of the second reactant with the first reactant by an appropriate one Detection method. It can preferably also be provided that the interaction of the second reactant with the first reactant in Presence or absence of a potential Modulator, for example inductor or inhibitor suitable detection methods are demonstrated and so potential inducers or inhibitors in their Effectiveness, for example as a medicament, can be checked. The ones to be checked potential inducers or inhibitors for example, come from substance libraries. In particularly preferred embodiment can be provided that the inhibitor or the second Reactant, for example a protein, one in genomic Protein is identified by sequencing projects.

Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer eine Interaktion zwischen einem immobilisierten Protein und dessen Interaktionspartner modifizierenden, insbesondere fördernden oder hemmenden Substanz, wobei ein an einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, insbesondere einem Nanopartikel, immobilisiertes Protein zusammen mit dessen, vorzugsweise aufgereinigten und isolierten, Interaktionspartner, in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung dieser. Substanz auf die Interaktion zwischen dem immobilisierten Protein und dessen Bindungspartner nachgewiesen wird. The present invention also relates to Method for identifying and / or detecting a an interaction between an immobilized Protein and its interaction partner modifying, especially promoting or inhibiting Substance, one on an inventive Device, in particular a nanoparticle, immobilized protein together with its, preferably purified and isolated, interaction partners, in the presence or absence of those to be tested Incubated substance and an impact of this. substance on the interaction between the immobilized Protein and its binding partner detected becomes.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur gerichteten Immobilisierung eines Proteins an einer Vorrichtung, insbesondere einem Nanopartikel unter Beibehaltung der biologischen Aktivität des Proteins, wobei die Oberfläche eines anorganischen oder organischen Trägers durch Aufbringen einer ersten funktionellen Gruppe 1 A und einer zweiten funktionellen Gruppe 1 B modifiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2 A und 2 B aufweisende modifizierte Proteine mit der modifizierten Nanopartikel-Oberfläche derart in Kontakt gebracht, dass zuerst eine nicht-kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 B und 2 B und anschließend eine kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1 A und 2 A dergestalt stattfindet, dass das Protein gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet. The present invention also relates to methods for the directed immobilization of a protein a device, in particular a nanoparticle while maintaining the biological activity of the Protein, the surface of an inorganic or organic carrier by applying a first functional group 1A and a second functional group 1 B modified and complementary functional groups 2 A and 2 B having modified proteins with the modified Brought the nanoparticle surface into contact that first a non-covalent bond between the functional groups 1 B and 2 B and then a covalent bond between the groups 1 A and 2 A takes place in such a way that the Protein directed and maintaining its protein biological activity binds to the nanoparticle.

Zu bevorzugen für die gerichtete Immobilisierung ist die sorgfältige Auswahl der funktionellen Gruppen 1 A, 1 B, 2 A und 2 B und eine exakte Kontrolle der Reaktionsbedingungen. To be preferred for directional immobilization is the careful selection of the functional Groups 1 A, 1 B, 2 A and 2 B and an exact control the reaction conditions.

Die Immobilisierung sollte in zwei Schritten erfolgen: Beim Zusammengeben der beiden Komponenten (Nanopartikel und Protein) kommt es unter den eingestellten Reaktionsbedingungen zu einer nichtkovalenten Bindung zwischen 1 B und 2 B. Dadurch wird das Protein auf der Oberfläche ausgerichtet. Durch eine Veränderung der Reaktionsbedingungen (zum Beispiel pH-Veränderung, T-Änderung, Zugabe von Redox-Agentien, oder ähnliches) kommt es dann in einem zweiten Schritt zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen 1 A und 2 A. Eine Änderung der Reaktionsbedingungen kann dann entfallen, wenn sich die beiden Schritte bezüglich ihrer Kinetik deutlich unterscheiden, das heißt die Reaktion zwischen 1 B und 2 B sehr viel schneller verläuft, als zwischen 1 A und 2 A. Immobilization should be done in two steps done: When combining the two components (Nanoparticles and protein) it comes under the set reaction conditions to a noncovalent bond between 1 B and 2 B. This the protein is aligned on the surface. By changing the reaction conditions (for example pH change, T change, addition of redox agents, or the like) then it comes in a second step to form a covalent bond between 1 A and 2 A. A change the reaction conditions can be omitted if the two steps regarding their kinetics distinguish clearly, that is the reaction between 1 B and 2 B is much faster than between 1 A and 2 A.

Eine gerichtete Immobilisierung eines CysHisProteins wird zum Beispiel auf einer Thiol-NTA- Oberfläche so durchgeführt, dass die Ausbildung des His-NTA-Komplexes im PBS-Puffer unter reduktiven Bedingungen (O₂-Ausschluss) durchgeführt wird. Ändert man dann die Reaktionsbedingungen durch die Einleitung von Sauerstoff oder Zugabe eines Oxidationsmittels, kommt es zur Ausbildung einer Disulfid-Brücke zwischen Protein und Nanopartikel. Directed immobilization of a CysHis protein is carried out, for example, on a thiol-NTA surface such that the formation of the His-NTA complex in the PBS buffer is carried out under reductive conditions (O ₂ exclusion). If you then change the reaction conditions by introducing oxygen or adding an oxidizing agent, a disulfide bridge is formed between the protein and the nanoparticles.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen 1 A und 2 A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B sind erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Erfindungsgemäß können die funktionellen Gruppen 1 A, 1 B, 2 A und/oder 2 B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder Protein verbunden sein. According to the invention it is particularly provided that the functional groups 1 A and 2 A selected are from the group consisting of amino group, Carboxy group, epoxy group, maleimido group, Alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, Hydrazide group, thiol group and thioester group. The are functional groups 1 B and 2 B. selected from the group consisting of Oligohistidine group, strep day I, strep day II, Desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, Streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin. According to the invention, the functional groups 1A, 1 B, 2 A and / or 2 B using a spacer be associated with the carrier and / or protein.

In bevorzugter Ausführungsform werden die funktionellen Gruppen 1 A und 1 B mittels Propfpolymerisation, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Beispielsweise kann der Träger nach seiner Herstellung zunächst hydrophylisiert und dann silanisiert wird. Die Silanisierung der Trägeroberfläche erfolgt beispielsweise mit einem Organosilan, insbesondere SiR₁R₂R₃R₄, wobei R₁ bis R₃ hydrolisierbare Gruppen wie Alkoxygruppen oder Halogenide, bevorzugt Chloride, und R₄ ein organischer Rest ist, der als Spacer mit einer ersten funktionellen Gruppe 1 A oder als Bindestelle für einen die erste funktionelle Gruppe 1 A tragenden Spacer ausgeführt sein kann. Sofern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung R₄ als Bindestelle, zum Beispiel als Epoxygruppe, für den die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer ausgeführt ist, werden im Anschluss an die Silanisierung die funktionellen Gruppen auf die Oberfläche aufgebracht, das heißt zum Beispiel die Maleinimidogruppe usw. In a preferred embodiment, the functional groups 1 A and 1 B are applied to the support surface by means of graft polymerization, silanization or chemical derivatization. For example, the carrier can first be hydrophylized after its production and then silanized. The support surface is silanized, for example, with an organosilane, in particular SiR ₁ R ₂ R ₃ R ₄ , where R ₁ to R _{3 are} hydrolyzable groups such as alkoxy groups or halides, preferably chlorides, and R _{4 is} an organic radical which acts as a spacer with a first functional group 1A or as a binding site for a spacer carrying the first functional group 1A. If, in another embodiment of the invention, R _{4 is used} as a binding site, for example as an epoxy group, for which the spacer having the functional group is carried out, the functional groups are applied to the surface after the silanization, that is to say for example the maleimido group, etc.

Die Dichte der funktionellen Gruppen oder der Abstand der funktionellen Gruppen von der Oberfläche und damit die Flexibilität werden für jeden zu immobilisierenden Zellbestandteil, das heißt für jedes zu immobilisierende Protein, optimiert. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Umgebung der funktionellen Gruppen auf der Trägeroberfläche bezüglich elektrostatischer und sterischer Ausstattung für eine möglichst effiziente, gerichtete Immobilisierung vorbereitet wird. Darüber hinaus können die Trägeroberflächen zusätzlich mit Molekülen wie Polyethylenglykolen, Oligoethylenglykolen, Dextranen und ähnlichen ausgestattet werden, um eine unerwünschte Konformationsänderung der immobilisierten Proteine zu verhindern, die unspezifische Adsorption anderer biologischer Verbindungen zu minimieren und/oder die Trägersysteme sterisch zu stabilisieren. The density of the functional groups or the Distance of the functional groups from the surface and hence the flexibility will be for everyone immobilizing cell component, that is for every protein to be immobilized, optimized. According to the invention, the environment of the functional groups on the support surface regarding electrostatic and steric Equipment for the most efficient, targeted Immobilization is being prepared. Furthermore the carrier surfaces can also use molecules such as polyethylene glycols, oligoethylene glycols, Dextrans and the like are equipped to an undesirable change in conformation of the immobilized proteins to prevent the non-specific Adsorption of other biological compounds too minimize and / or sterically to the carrier systems stabilize.

In einem weiteren Schritt wird das Protein an der modifizierten Oberfläche des Nanopartikelträgers immobilisiert, wobei je nach Oberflächenmodifikation die entsprechende Proteinmodifikation zu wählen ist. Dabei wird das zu immobilisierende Protein erfindungsgemäß mit der modifizierten Oberfläche unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass ein Abbau des Proteins minimiert oder verhindert wird. In a further step, the protein on the modified surface of the nanoparticle carrier immobilized, depending on Surface modification to choose the appropriate protein modification is. The protein to be immobilized according to the invention with the modified surface brought into contact under such conditions that degradation of the protein is minimized or prevented becomes.

Nach der Immobilisierung des Proteins an der Trägeroberfläche ist erfindungsgemäß vorgesehen, die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere Nanopartikel, gegebenenfalls mit Hilfe eines Stealth- Verfahrens, insbesondere durch Verpacken in beispielsweise Liposomen, zu maskieren, um bei späterer Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere Nanopartikel eine ausreichende biologische Zirkulation zu erreichen. After immobilization of the protein on the The carrier surface is provided according to the invention Devices according to the invention, in particular Nanoparticles, possibly with the help of a stealth Process, in particular by packaging in for example liposomes, to mask at later use of the devices according to the invention, sufficient nanoparticles in particular to achieve biological circulation.

Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, die Vorrichtung, zum Beispiel Nanopartikel, mit den immobilisierten Proteinen auf einer Membran abzuscheiden, wobei der entstehende Film durch Quervernetzung mechanisch stabilisiert wird. According to the invention there is also the possibility of Device, for example nanoparticles, with the immobilized proteins on a membrane deposit, the resulting film through Cross-linking is mechanically stabilized.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, insbesondere Nanopartikel, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Tumortherapie. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "pharmazeutischen Zusammensetzung" ein zu diagnostischen, therapeutischen und/oder prophylaktischen Zwecken verwendetes Gemisch verstanden, das natürliche oder synthetisch hergestellte Wirkstoffe in einer beim Patienten gut applizierbaren Form enthält. Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass die herzustellende pharmazeutische Zusammensetzung den Wirkstoff, das heißt ein Protein, in einer an einer vorliegenden Vorrichtung, insbesondere Nanopartikel, immobilisierten Form enthält. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ein festes oder flüssiges Gemisch sein. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutische Träger sowie weitere Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Verdickungsmittel, Trennmittel, Gleitmittel, Sprengmittel, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Geschmacksstoffe, Gerüststoffe, Emulgatoren oder ähnliche enthalten. The present invention also relates to Use of the device according to the invention, in particular nanoparticles, for the production of a pharmaceutical composition, in particular for Tumor therapy. In connection with the present invention is under a "pharmaceutical composition" a diagnostic, therapeutic and / or mixture used for prophylactic purposes understood, the natural or synthetic manufactured active ingredients in one good for the patient Applicable form contains. According to the invention provided that the pharmaceutical to be manufactured Composition the active substance, that is Protein, in one on a present device, especially nanoparticles, immobilized form contains. The pharmaceutical composition can be a solid or liquid mixture. A pharmaceutical composition can optionally one or more pharmaceutical carriers as well other additives such as stabilizers, Thickeners, release agents, lubricants, disintegrants, Colorings, odorants, flavorings, Contain builders, emulsifiers or the like.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, zum Beispiel Nanopartikel, enthält, das heißt also, die einen Wirkstoff, insbesondere ein Protein, in immobilisierter Form an einer erfindungsgemäßen Vorrichtung enthält. The present invention therefore also relates to pharmaceutical composition that the devices according to the invention, for example Contains nanoparticles, that is, that contains an active ingredient, especially a protein, in immobilized form contains on a device according to the invention.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen. Further advantageous embodiments of the present invention result from the subclaims.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. The invention is illustrated by the following examples explained in more detail.

example 1

Eine Silizium-Wafer-Oberfläche wird zuerst 90 Minuten bei 40°C mit alkalischer Tensid-Lösung behandelt und anschließend zur Hydroxylierung 30 Minuten bei 70°C mit einer 3 : 1 Mischung von 25% Ammoniak und Wasserstoffperoxid. Anschließend gibt man eine 5 Gew.-% ethanolische Aminopropyltriethoxysilan- Lösung, die 10 Vol. % Ammoniak enthält, zu und lässt 2 Stunden bei Raumtemperatur einwirken. Man wäscht anschließend zweimal mit Wasser und trocknet bei 130°C. Die Oberfläche trägt kovalent gebundene Aminogruppen für weitere Umsetzungen. Diese Umsetzungen können in Analogie zu den im folgenden beschriebenen Reaktionen an nanopartikulären Oberflächen durchgeführt werden. A silicon wafer surface first turns 90 Minutes at 40 ° C with alkaline surfactant solution treated and then for 30 minutes for hydroxylation at 70 ° C with a 3: 1 mixture of 25% ammonia and hydrogen peroxide. Then you give one 5% by weight of ethanolic aminopropyltriethoxysilane Solution containing 10 vol.% Ammonia to and leaves for 2 hours at room temperature. you then wash twice with water and dry at 130 ° C. The surface is covalently bound Amino groups for further reactions. This Implementations can be made in analogy to the following described reactions on nanoparticulate Surfaces are carried out.

Manufacture of nanoparticulate carriers Silica support

Zu 200 ml Ethanol wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH₃ gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurden die gebildeten Partikel durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Dabei wurden 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm erhalten. 12 mmol of tetraethoxysilane and 90 mmol of NH _{3 were} added to 200 ml of ethanol. The mixture was stirred at room temperature for 24 hours and then the particles formed were purified by repeated centrifugation. 650 mg of silica particles with an average particle size of 125 nm were obtained.

Magnetic iron oxide carriers

200 ml einer 1 M FeCl₃-Lösung und 5 ml einer 2 M FeSO₄-Lösung in 2 M HCl wurden unter kräftigem Rühren zu 250 ml einer 0,7 M NH₃-Lösung gegeben. Anschließend wurde 30 Minuten gerührt und der gebildete schwarze Feststoff wurde mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag 30 Minuten mit 100 ml 2 M HNO₃ gerührt und dreimal mit jeweils 100 ml Wasser gewaschen. Die superparamagnetischen Eisenoxid-Träger wurden in 50 ml einer 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid-Lösung resuspendiert. Dabei wurden 2 g Eisenoxid-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 10 nm erhalten. 200 ml of a 1 M FeCl ₃ solution and 5 ml of a 2 M FeSO ₄ solution in 2 M HCl were added to 250 ml of a 0.7 M NH ₃ solution with vigorous stirring. The mixture was then stirred for 30 minutes and the black solid formed was washed with 200 ml of water. The precipitate was then stirred for 30 minutes with 100 ml of 2 M HNO ₃ and washed three times with 100 ml of water each time. The superparamagnetic iron oxide supports were resuspended in 50 ml of a 0.1 M tetramethylammonium hydroxide solution. This gave 2 g of iron oxide particles with an average particle size of 10 nm.

Magnetic composite carrier

50 mg der in Beispiel 1.2 erhaltenen magnetischen Eisenoxid-Partikel wurden zweimal mit 5 ml Ethanol gewaschen und anschließend in 200 ml Ethanol aufgenommen. Zu der Lösung wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH₃ gegeben. Anschließend wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 600 mg magnetische Komposit- Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 150 nm erhalten. 50 mg of the magnetic iron oxide particles obtained in Example 1.2 were washed twice with 5 ml of ethanol and then taken up in 200 ml of ethanol. 12 mmol of tetraethoxysilane and 90 mmol of NH _{3 were} added to the solution. The mixture was then stirred at room temperature for 24 hours. The particles were then cleaned by multiple centrifugation. 600 mg of magnetic composite particles with an average particle size of 150 nm were obtained.

Fluorescent supports

190 µMol Fluoresceinamin und 170 µMol Isocyanatopropyltriethoxysilan in 50 ml Acetonitril wurden 3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Zu 50 ml Ethanol wurden 3 mMol Tetraethoxysilan und 880 µl einer Silan-Farbstoff-Lösung gegeben. Nach Zugabe von 22,5 mMol NH₃ wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die erhaltenen Partikel durch mehrfache Zentrifugation aufgereinigt. Dabei wurden 160 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 110 nm erhalten. 190 μmol fluoresceinamine and 170 μmol isocyanatopropyltriethoxysilane in 50 ml acetonitrile were boiled under reflux for 3 hours. 3 mmol of tetraethoxysilane and 880 μl of a silane dye solution were added to 50 ml of ethanol. After addition of 22.5 mmol NH ₃ , the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The particles obtained were then purified by repeated centrifugation. 160 mg of silica particles with an average particle size of 110 nm were obtained.

Organic polymer carrier

50 mg des Emulgators p-(11-Acrylamido)- undecenoyloxyphenyl-dimethylsulfonium-methylsulfat wurden in 30 ml Wasser unter Rühren gelöst. Anschließend wurde eine Stunde lang Argon durch die Lösung geleitet. Unter Rühren erfolgte dann die Zugabe von 1,8 ml Methylmethacrylat. Die entstandene Emulsion wurde auf 60°C erwärmt. Durch Zugabe von 10 mg 2,2'-Azobis-(2-Amidinopropan)dihydrochlorid wurde die Polymerisation gestartet. Nach 5 Stunden wurde die Partikelsuspension abgekühlt und die Partikel wurden durch Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 1,6 g Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 145 nm erhalten. Die erhaltenen Partikel tragen kovalent verknüpfte Sulfoniumgruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im Phosphat Puffer, pH 7,0: +22 mV) und sind zur Anbindung von Nukleophilen befähigt. 50 mg of the emulsifier p- (11-acrylamido) - undecenoyloxyphenyl-dimethylsulfonium methylsulfate were dissolved in 30 ml of water with stirring. Argon was then bubbled through the Solution headed. Then, with stirring Add 1.8 ml of methyl methacrylate. The The resulting emulsion was heated to 60 ° C. By encore of 10 mg The polymerization was started with 2,2'-azobis- (2-amidinopropane) dihydrochloride. After 5 The particle suspension was cooled and hours the particles were cleaned by centrifugation. 1.6 g of particles with a medium Obtained particle size of 145 nm. The received Particles carry covalently linked Sulphonium groups on their surface (zeta potential in the Phosphate buffer, pH 7.0: +22 mV) and are for connection enabled by nucleophiles.

Example 2 Surface modification of the beams 2.1 Amino-functionalized surface

Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der in den Beispielen 1.1 bis 1.4 erhaltenen Träger wurde mit 10 Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. 20 Gew.-% Aminpropyltriethoxysilan, bezogen auf die Träger, wurden zugegeben und es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel wurden durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Partikel tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: +35 mV). A 1 wt .-% aqueous suspension in the Examples 1.1 to 1.4 were obtained with 10 vol .-% 25% ammonia added. 20% by weight Aminpropyltriethoxysilan, based on the carrier, were added and it was an hour at Room temperature stirred. The particles were caused by multiple Centrifuged cleaned. The particles obtained carry functional amino groups on their Surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: +35 mV).

2.2 Amino-functionalized organic polymer carrier

10 mg der in Beispiel 1.5 erhaltenen Träger wurden in 50 µl eines 10 mMol Phosphatpuffers (pH 7,8) gegeben. Anschließend wurden 950 µl einer 1 M Ethylendiamin-Lösung in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,8) zugegeben. Dann wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Partikel wurden dann durch Zentrifugation aufgereinigt. Die so erhaltenen Träger tragen kovalent gebundene Amino-Gruppen auf ihrer Oberfläche. 10 mg of the carrier obtained in Example 1.5 were in 50 µl of a 10 mmol phosphate buffer (pH 7.8) given. Then 950 µl of a 1st M ethylenediamine solution in 10 mmol phosphate buffer (pH 7.8) added. Then was at two hours Shaken at room temperature. The particles were then through Centrifugation cleaned. The so obtained Carriers apply covalently bound amino groups their surface.

2.3 Carboxy-functionalized surface

Zunächst wurde eine 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Träger in Tetrahydrofuran hergestellt. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5- minütigen Behandlung mittels Ultraschall wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Träger durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Silica-Träger tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -35 mV) auf ihrer Oberfläche und besitzen eine mittlere Partikelgröße von 170 nm. First, a 2 wt .-% suspension amino functionalized carrier in tetrahydrofuran manufactured. 260 mg were added to 10 ml of this solution Succinic anhydride. After a 5- minute ultrasound treatment was a Stirred for one hour at room temperature. After that the carriers by centrifuging several times cleaned. Wear the silica supports obtained functional carboxy groups (zeta potential in 0.1 M Acetate buffer: -35 mV) on its surface and have an average particle size of 170 nm.

2.4 Carboxydextran modified carriers

10 mg aminofunktionalisierte Nanopartikel und 1 mg Carboxydextran (Sigma, >55 cps) wurden zu 1 ml 0,1 M Morpholinoethansulfonsäure-Puffer (MES, pH 5,0) gegeben. Dazu wurden 30 µl einer N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC)-Lösung mit einer Konzentration von 500 µMol/ml zugegeben. Anschließend wurde 30 Minuten bei Räumtemperatur geschüttelt. Die Träger wurden abwechselnd mit MES- und TBE-Puffer (89 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 89 mM Borsäure, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,3) gewaschen. Anschließend wurden die gewaschenen Partikel in 1 ml MES- Puffer aufgenommen. Die erhaltenen Silica-Partikel tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -25 mV) auf ihrer Oberfläche und weisen eine mittlere Partikelgröße von 160 nM auf. Diese Dextran-Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen geeignet, deren Tertiärstruktur durch Adsorptionsprozesse auf der Trägeroberfläche gestört wird. 10 mg amino functionalized nanoparticles and 1 mg Carboxydextran (Sigma,> 55 cps) became 1 ml 0.1 M morpholinoethanesulfonic acid buffer (MES, pH 5.0) given. 30 µl of an N-ethyl-N '- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) solution with a concentration of 500 µmol / ml was added. This was followed by 30 minutes at room temperature shaken. The carriers were alternated with MES and TBE buffer (89 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 89 mM boric acid, 2 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.3). The washed particles were then in 1 ml of MES Buffer added. The silica particles obtained carry functional carboxy groups (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: -25 mV) on your Surface and have an average particle size of 160 nM on. This dextran surface is special suitable for the immobilization of proteins whose Tertiary structure through adsorption processes on the Carrier surface is disturbed.

2.5 amino functionalization of carboxy- (dextran) - carriers

Zunächst wurde eine 1 M Ethylendiamin-Lösung in 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0) hergestellt. Dazu wurden 500 µg der Carboxy-(Dextran)-modifizierten Träger und 30 µl einer 500 µMol/ml EDC-Lösung in MES-Puffer gegeben. Anschließend wurde drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Träger wurden danach mehrmals mit MES-Puffer gewaschen. Dabei wurden Träger mit einer mittleren Partikelgröße von 160 nm und einem Zetapotential von + 25 mV im 0,1 M Acetat-Puffer erhalten. First, a 1 M ethylenediamine solution in 0.1 M MES buffer (pH 5.0) prepared. In addition 500 µg of carboxy (dextran) modified carriers and 30 µl of a 500 µmol / ml EDC solution in MES buffer given. Then was three hours at Shaken at room temperature. The porters were afterwards washed several times with MES buffer. Thereby Carrier with an average particle size of 160 nm and a zeta potential of + 25 mV in 0.1 M Get acetate buffer.

Zur Variation der Spacerlänge beziehungsweise der Dichte der funktionellen Gruppen können auch andere Amine in analoger Weise eingesetzt werden, beispielsweise 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (oder höhere Homologe) oder Tris(2-aminoethyl)-amin. To vary the spacer length or the Density of functional groups can also be different Amines are used in an analogous manner, for example 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine (or higher homologues) or tris (2-aminoethyl) amine.

2.6 Nitrilotriacetic acid (NTA) surface

10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 µMol Dicyclohexylcarbodiimid und 10 µMol N-Hydroxysuccinimid gegeben. Anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Partikel wurden anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 4 µMol N,N-Bis- Carboxymethyl-L-Lysin gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. 10 mg carboxy-modified carriers were used twice washed with 1 ml of acetonitrile (MeCN) and then taken up in 1 ml of MeCN. For this 10 µmol Dicyclohexylcarbodiimide and 10 µmol Given N-hydroxysuccinimide. Then was two hours shaken at room temperature. After that, once with 1 ml cyclohexane and once with 1 ml MeCN washed. The particles were then poured into 1 ml MeCN added. For this, 4 µmol of N, N-bis Given carboxymethyl-L-lysine and three hours Shaken at room temperature. After that was once with 1 ml acetonitrile and twice with 1 ml 10 mM Phosphate buffer (pH 7.0) washed.

Durch diese Umsetzung wird einerseits die Dichte der funktionellen Carboxy-Gruppen erhöht und andererseits können mit dieser Oberfläche Ni²⁺-Ionen durch Komplexierung gebunden werden. Diese Oberfläche ist dann zur Bindung von His-Tag-modifizierten Proteinen befähigt. This reaction on the one hand increases the density of the functional carboxy groups and, on the other hand, Ni ²⁺ ions can be bound to this surface by complexation. This surface is then capable of binding His-tag modified proteins.

2.7 thiol surface

10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 µMol Dicyclophexylcarbodiimid und 10 µMol N-Hydroxysuccinimid gegeben und anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Träger wurden dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 500 µg Cystein gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss daran wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. 10 mg carboxy-modified carriers were used twice washed with 1 ml of acetonitrile (MeCN) and then in 1 ml MeCN added. For this 10 µmol Dicyclophexylcarbodiimide and 10 µmol N-hydroxysuccinimide was given and then was at two hours Shaken at room temperature. Then once with 1 ml of cyclohexane and washed once with 1 ml of MeCN. The carriers were then taken up in 1 ml of MeCN. 500 µg of cysteine were added and three hours shaken at room temperature. After that was once with 1 ml of acetonitrile and twice with 1 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) washed.

Diese Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen über Disulfid-Brücken geeignet. This surface is especially for Immobilization of proteins suitable for disulfide bridges.

2.8 Maleimido activated surface

500 µg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1,25 µMol Sulfo-Succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen. 500 µg amino-functionalized carriers were in 1 ml 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) resuspended. To 1.25 µmoles of sulfo-succinimidyl-4- (N- maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate and shaken for one hour at room temperature. It was then washed once with cold 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) and the supports were washed in 1 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was added.

2.9 Iodoacetyl activated surface

500 µg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1,25 µMol Succinimidyl-(4-iodoacetyl)- aminobenzoat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen. 500 µg amino-functionalized carriers were in 1 ml 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) resuspended. To 1.25 µmol succinimidyl- (4-iodoacetyl) - given aminobenzoate and one hour at Shaken at room temperature. After that, once with cold 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and washed Carriers were placed in 1 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) added.

Diese Oberflächen von 2.8 und 2.9 sind zur Ankopplung von Proteinen geeignet, die freie Thiol- Gruppen tragen. These surfaces from 2.8 and 2.9 are for Coupling of proteins suitable, the free thiol Wear groups.

2.10 Surface with NH ₂ and COOH groups

Die Belegung mit funktionellen Gruppen ist in den Beispielen 2.1 bis 2.9 so beschrieben, dass sie quantitativ verläuft. Diese Belegungen lassen sich üblicherweise aber auch durch die Wahl der Reaktionsbedingungen, insbesondere über die Konzentration des Modifikationsmittels, so steuern, dass sie nur teilweise erfolgen. Durch eine entsprechende Wahl der Modifikationsmittel wird erreicht, dass verschiedene funktionelle Gruppen nebeneinander auf der Trägeroberfläche vorliegen. The assignment of functional groups is in the Examples 2.1 to 2.9 described so that they runs quantitatively. These assignments can be but usually also by the choice of Reaction conditions, especially about the concentration of the modifier so that they control only partially done. Through an appropriate choice the modification means is achieved in that different functional groups side by side of the carrier surface.

Beispielsweise wird in Beispiel 2.3 die Konzentration an Bernsteinsäureanhydrid verringert. Durch eine geeignete Wahl des Verhältnisses NH₂/COOH variiert der isoelektrische Punkt des Trägersystems in einem weiten Bereich, beispielsweise zwischen 8 und 3. Dies ist bei der Umsetzung mit Proteinen ein entscheidender Parameter zur Steuerung der Reaktivität, da sich gleichgeladene Systeme abstoßen. For example, in Example 2.3 the concentration of succinic anhydride is reduced. The isoelectric point of the carrier system varies within a wide range, for example between 8 and 3, by a suitable choice of the ratio NH ₂ / COOH. This is a crucial parameter for controlling the reactivity when reacting with proteins, since systems with the same charge repel each other.

2.11 Carrier surfaces with SH and NTA groups

Die Reaktion wird wie in den Beispielen 2.6 oder 2.7 durchgeführt, wobei allerdings ein Gemisch der beiden Modifikationsmittel eingesetzt wird. Dadurch werden His-Tag-tragende Proteine in einem ersten Schritt nicht-kovalent ausgerichtet, wobei dieser Zustand durch Ausbildung einer kovalenten Disulfid- Brücke anschließend dauerhaft fixiert wird. The reaction is carried out as in Examples 2.6 or 2.7 carried out, although a mixture of Both modifiers are used. Thereby are His-tag-bearing proteins in a first Step non-covalently aligned, this one State due to the formation of a covalent disulfide Bridge is then permanently fixed.

Auf beschriebene Weise kann zum Beispiel ein Cys- His-Protein auf einer Maleinimido/NTA Oberfläche immobilisiert werden. In the manner described, for example, a cys- His protein on a maleinimido / NTA surface be immobilized.

Claims

1. Device for immobilization at least of a protein comprising a carrier with a first functional groups 1 A and second functional group 1 B surface and at least one immobilized on the carrier Protein that is the first functional surface groups 1 A binding, complementary functional groups 2 A and the second functional surface groups 1 B binding, complementary functional groups 2 B has, the protein via a covalent Binding between groups 1A and 2A and one non-covalent bond between groups 1 B and 2 B directed immobilized on the carrier.

2. Device according to claim 1, wherein the Device a nanoparticle, a membrane, a gel Solid foam, a xerogel, an airgel, or is a planar or porous binding matrix.

3. Device according to claim 1 or 2, wherein the Protein while maintaining its biological Activity is immobilized on the carrier.

4. Device according to one of the preceding Claims, wherein the first functional group 1 A is selected from the group consisting of Amino group, carboxy group, epoxy group, Maleimide group, alkyl ketone group, aldehyde group, Hydrazine group, hydrazide group, thiol group and Thioester.

5. Device according to one of the preceding Claims, wherein the second functional group 1 B is selected from the group consisting of Oligohistidine group, strep day I, strep day II, Desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, Streptactin, avidin and neutravidin.

6. Device according to one of the preceding Claims, wherein the first functional 1 A binding, complementary functional group 2 A is selected from the group consisting of amino group, Carboxy group, epoxy group, maleimide group, Alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, Hydrazide group, thiol group and thioester group.

7. Device according to one of the preceding Claims, wherein the second functional group 1 B binding, complementary functional group 2 B is selected from the group consisting of Oligohistidine group, strep day I, strep day II, Desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, Chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, Streptactin, avidin and neutravidin.

8. Device according to one of the preceding Claims, wherein the functional group 1A and / or 1 B via spacer with the surface of the Nanoparticle connected or part of a spacer is / are.

9. Device according to one of the preceding Claims, wherein the functional group 2A and / or 2 B connected to the protein via spacers or Is / are part of a spacer.

10. Device according to one of the preceding Claims, wherein the functional group 2 A structural component of an unnatural amino acid of the protein, especially one with one Spacer derivatized amino acid.

11. Device according to one of the preceding Claims, wherein the functional group 2A and / or 2 B connected to an anchor group of the carrier is / are.

12. Device according to one of the preceding Claims, wherein the metal ion chelate complex contains divalent cation as a metal component.

13. Device according to one of the preceding Claims, wherein the metal ion chelate complex Ni-NTA (nickel nitrilotriacetic acid) derivative.

14. Device according to one of the preceding Claims, wherein the carrier from a biological compatible material.

15. The apparatus of claim 14, wherein the carrier contains or consists of an inorganic material consists.

16. The apparatus of claim 15, wherein the inorganic carrier material silicon, SiO ₂ , SiO, a silicate, Al ₂ O ₃ , SiO ₂ .Al ₂ O ₃ , ZrO ₂ , Fe ₂ O ₃ , Ag ₂ O, Zr ₂ O ₃ , Ta ₂ O ₅ , zeolite, TiO ₂ , glass, indium tin oxide, hydroxyapatite or a mixture thereof.

17. The apparatus of claim 14, wherein the carrier an organic biodegradable Contains or consists of material.

18. The apparatus of claim 17, wherein the Carrier material polypropylene, polystyrene, polyacrylate, or a mixture thereof.

19. The apparatus of claim 14, wherein the carrier contains or consists of a biodegradable material this exists.

20. The apparatus of claim 19, wherein the Carrier material a polyester of polylactic acid, especially poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA) is.

21. The apparatus of claim 20, wherein the Polyester additionally stabilized by cross-linking is.

22. Device according to one of the preceding Claims, wherein the carrier is compact or hollow and has a size of 5 nm to 500 nm.

23. Device according to one of the preceding Claims wherein the surface is a planar Binding matrix has microstructures, in particular by Lithography or embossing techniques Microstructures.

24. Device according to one of the preceding Claims, with the carrier additional Has functionalities.

25. The apparatus of claim 24, wherein the carrier a fluorescent label, a UV / Vis label, a superparamagnetic function, a ferromagnetic function and / or a radioactive Has marking.

26. The apparatus of claim 24 or 25, wherein the Carrier one for therapy and / or diagnosis suitable chemical compound.

27. The apparatus of claim 26, wherein the chemical compound is a cytostatic.

28. Device according to one of claims 24 to 27, the carrier being a chemical compound has that for steric stabilization and / or to prevent a change in conformation of the immobilized protein and / or for prevention the addition of another biologically active Connection to the carrier serves.

29. The apparatus of claim 28, wherein the chemical compound a polyethylene glycol, a Oligoethylene glycol, dextran or a mixture thereof is.

30. Device according to one of the preceding Speeches, wherein the immobilized protein one Has markers.

31. The apparatus of claim 30, wherein the marker a fluorophore, a spin label, a radioactive Marking and / or a gold particle, especially attached to amino acids of the protein, preferably on its side chains.

32. The apparatus of claim 31, wherein the Fluorophore N-methyl-aza-tryptophan or a coumarin Derivative such as DCA (6,7-dimethoxy-4-coumaryl) or NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N-diaminopropionic acid) is.

33. The apparatus of claim 31, wherein the Fluorophore is CyDye or Alexa.

34. Device according to one of the preceding Claims, wherein the immobilized protein Is cytokine.

35. Procedure for the directed immobilization of a Protein on an immobilization device at least one protein while maintaining the biological activity of the protein, the Surface of an inorganic or organic particulate carrier by applying a first functional group 1 A and a second functional group 1 B modified and complementary functional groups 2 A and 2 B modified proteins with this surface in such a way Be brought in contact that first noncovalent aligning bond between the functional group 1 B of the surface and the functional group 2 B of the protein and then a covalent bond between the functional Group 1 A of the surface and the functional Group 2A of the protein takes place in such a way that the protein is directed and maintaining its biological activity on the nanoparticle binds.

36. The method of claim 35, wherein the functional groups 1 A and 2 A are selected from the Group consisting of amino group, carboxy group, Epoxy group, maleimide group, alkyl ketone group, Aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, Thiol group and thioester group.

37. The method of claim 35 or 36, wherein the functional groups 1 B and 2 B are selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep day I, strep day II, desthiobiotin, biotin, Chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, Metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, Avidin and neutravidin.

38. The method according to any one of claims 35 to 37, where the functional groups 1 A, 1 B, 2 A and / or 2 B using a spacer with the Carrier and / or protein are linked or Are part of the spacer.

39. The method according to any one of claims 35 to 38, the modification of the surface by means of Graft polymerization, silanization or chemical Derivatization takes place.

40. The method according to any one of claims 35 to 39, the conditions under which the proteins are are brought into contact with the surfaces, so are selected to minimize degradation of the protein or is prevented.

41. The method according to any one of claims 35 to 40, with additional chemical compounds for steric stabilization and / or for prevention a change in the conformation of the immobilized Protein and / or to prevent deposition a further biologically active compound and / or with biological activity on the surface be applied.

42. The method according to any one of claims 35 to 41, where a protein is a cytokine on the nanoparticle is immobilized.

43. The method according to any one of claims 35 to 42, the device after immobilization of the Protein using a stealth procedure to be masked to an adequate To achieve biocirculation.

44. The method of claim 43, wherein the Device is packaged in liposomes.

45. Methods of identification and / or Detection of binding partners of a protein, whereby a on a device according to one of claims 1 up to 35 immobilized protein with one potential contact partner brought into contact and a Binding is detected.

46. Methods of identification and / or Detection of an interaction between one immobilized protein and its interaction partner modifying, especially promoting or inhibitory substance, one on a device immobilized according to any one of claims 1 to 35 Protein together with its interaction partner in Presence or absence of those to be tested Incubated substance and an impact of the substance on the interaction between immobilized Protein and its binding partner is detected.

47. Use of a device according to one of the Claims 1 to 35 for identification and / or Isolation of a binding partner immobilized protein.

48. Use of a device according to one of the Claims 1 to 35 for identification and / or Isolation of inhibitors of the interaction of the immobilized protein with its binding partners.

49. Use of a device according to one of the Claims 1 to 35 for the production of a pharmaceutical composition, in particular for Tumor therapy.

50. A pharmaceutical composition comprising a Device according to one of claims 1 to 35.

51. Diagnostic composition comprising a Device according to one of claims 1 to 35.