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DE10114537A1 - Array von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften, Verfahren zur Herstellung und Verwendung - Google Patents

Array von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften, Verfahren zur Herstellung und Verwendung

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Publication number
DE10114537A1
DE10114537A1 DE10114537A DE10114537A DE10114537A1 DE 10114537 A1 DE10114537 A1 DE 10114537A1 DE 10114537 A DE10114537 A DE 10114537A DE 10114537 A DE10114537 A DE 10114537A DE 10114537 A1 DE10114537 A1 DE 10114537A1
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Germany
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separation
membranes
array
filtration membranes
membrane
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Mathias Ulbricht
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Elipsa GmbH
Original Assignee
Elipsa GmbH
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Publication date
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit einem auf das Trennproblem abgestimmten System untereinander variierender Filtrationsmembranen zur Trennung von stark heterogenen Substanzgemischen, z. B. Biomolekülgemischen, in Forschung, Klinik, Diagnostik und Umweltanalytik, ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Membranen untereinander und den Array selbst.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit einem auf das Trennproblem abgestimmten System untereinander variierender Filtrationsmembranen zur Trennung von stark heterogenen Substanzgemischen, z. B. Biomolekülgemischen, in Forschung, Klinik, Diagnostik und Umweltanalytik, ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Membranen untereinander und den Array selbst.
Heterogene Substanzgemische sind beispielsweise Biomolekülgemische, bei denen sich einzelne Bestandteile oder Komponenten des Gemisches in dem Molekulargewicht, der Ladung und/oder der Affinität stark unterscheiden. Ein Beispiel hierfür ist ein Proteingemisch, das Komponenten im Bereich von 1 bis 90 kDa umfasst.
Trennungen von Substanzgemischen in der Biologie, Medizin oder Chemie mit Hilfe von Chromatographie-Säulen sind dem Fachmann bekannt. Unter Trennen sollen verfahrenstechnische Maßnahmen verstanden werden, durch die stoffliche Substanzgemische entsprechend den physikalischen und chemischen Eigenschaften ihrer Komponenten zerlegt werden.
Durch Trennungen können Fraktionierungen vorgenommen, aber auch reine Substanzen aus Gemischen abgetrennt bzw. gewonnen werden. Die Auswahl geeigneter chromatographischer Säulen für ein spezielles Trennproblem orientiert sich an den Angaben des Herstellers und muss durch Tests verifiziert werden.
Bekannte Trennverfahren zur Fraktionierung von Substanzgemischen sind chromatographische Säulentechniken, wie z. B. die HPLC-(high performance liquid chromatography)­ Technik oder die FPLC-(fast protein liquid chromatography)­ Technik. Fraktioniert werden die Substanzgemische, insbesondere Biomolekülgemische, beispielsweise nach den Größenunterschieden der einzelnen Bestandteile des Gemisches, wobei die Säulen nach einem bestimmten Trennbereich ausgewählt werden, beispielsweise 40 bis 80 kDa oder 1 bis 20 kDa.
Weitere bekannte Trennverfahren sind die Ammoniumsulfatfällung, die Ionenaustausch-Chromatographie, die isoelektrische Fokussierung, die Chromatofokussierung und die Affinitätschromatographie.
Da die Chromatographie-Säulen nur in einem bestimmten Molekulargewichts- bzw. einem definierten pH-Wert- oder Affinitätsbereich mit der erforderlichen Trennschärfe trennen, sind zur Trennung von heterogenen Substanzgemischen mehrere Säulen erforderlich. So sind beispielsweise für ein Proteingemisch, das Komponenten im Bereich von 1 bis 80 kDa enthält, mehrere Säulen erforderlich, um das Gemisch mit einer ausreichenden Trennschärfe zu fraktionieren.
Das Probenvolumen des Gemisches darf bei der Verwendung der bekannten Säulen nicht mehr als 5 Prozent des Säulenvolumens einnehmen, daher sind die bekannten Trennungen sehr verlustreich. Weiterhin ist es nachteilig, dass alle eingesetzten Puffer entgast werden müssen.
Das Säulenmaterial ist nur bei bestimmten pH-Werten stabil und weist die notwendigen Trenneigenschaften auf. Außerdem muss eine definierte Fließgeschwindigkeit des Säulen- Puffers eingehalten werden, um eine effektive Trennung zu ermöglichen.
Die biologische Aktivität der Moleküle wird bei zahlreichen bekannten Verwendungen von Trenntechniken nachteilig beeinflusst; bei der präparativen Gelelektrophorese kommt es regelmäßig sogar zu einer völligen Inaktivierung der zu trennenden Substanzen.
Traditionelle Trennungen von Substanzgemischen sind auch nicht auf das jeweils zu trennende bzw. fraktionierende Substanzgemisch speziell einzustellen. Ein weiterer Nachteil ist, dass die zu untersuchenden Proben jeweils immer nur mit ein und derselben Trennmethode und dem gleichen Trennparameter separiert oder fraktioniert werden können. Es ist beispielsweise nicht möglich, mit der Verwendung einer Trennvorrichtung, beispielsweise einer Gel-Filtrationssäule, die optimalen Trennbedingungen für ein Proteingemisch zu bestimmen. Für jeweils jede Probe oder jedes Gemisch muss eine neue Säule verwandt werden.
Variationen bei der Herstellung der einzelner Säulen können nicht ausgeschlossen werden, so dass Variationen der durchgeführten Trennungen sowohl auf die zu untersuchende Probe, also das Biomolekülgemisch, als auch auf Unterschiede der einzelnen Säulen zurückgeführt werden müssen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei der Verwendung bekannter Trennvorrichtungen zur Trennung von heterogenen und komplexen Biomolekülgemischen das Verhältnis von Anreicherung, Ausbeute und Arbeitsaufwand nachteilig ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Trennvorrichtung bereitzustellen, durch deren Verwendung heterogene und komplexe Substanzgemische kostengünstig, einfach und effizient getrennt werden können.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Verwendung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Filtrationsmembranen untereinander zur effizienten Trennung von stark heterogenen und komplexen Substanzgemischen.
Erfindungsgemäß werden unter einem Array Träger für Filtrationsmembranen verstanden. Die Arrays können beispielsweise Membranfiltermikrotiterplatten sein. Diese "Filter Plates" haben typischerweise die äußeren Ausmaße von Mikrotiterplatten und sind so mit etablierten LiquidHandling-Geräten und Verbrauchsmaterialien zur Laborautomatisierung kompatibel. Die parallele Trennung von z. B. 12, 24, 96 oder 384 verschiedenen Lösungen bzw. Proben wird typischerweise derart realisiert, daß die Proben in die einzelnen Kavitäten einer 12er-, 24er-, 96er- oder 384er-Membranfilterplatte pipettiert, dann mittels Unterdruck in einer Absaugkammer oder Zentrifugalkraft mit einer Zentrifuge mit speziellem Halter durch die Membranen filtriert und letztlich die Filtrate in einer 12er-, 24er-, 96er- oder 384er-Mikrotiterplatte, die als Sammelplatte konzipiert ist, aufgefangen werden. Die Arrays können hierbei so konzipiert sein, dass mehrere parallele Filtrationsmembranen auf dem Array positioniert sind, d. h. dass entweder alle Membranen unterschiedliche Trenneigenschaften besitzen oder dass mindestens zwei Membranen identische Trenneigenschaften aufweisen. Trenneigenschaften bezeichnen die Art der Trennung durch die Membran, z. B. nach Größe, Ladung und/oder Affinität der Komponenten des Proteingemisches.
Beispiele für die erfindungsgemäßen Arrays sind Arrays mit Ultra- oder Nanofiltrationsmembranen mit systematisch variierten CutOff, abgestimmt auf die Zusammensetzung von Fraktionen bzw. mit variierter Steilheit der Trennkurve für die Trennschärfe der Fraktionierung. Weiterhin kann die Ladung der Trennschicht der Membran variiert werden. Auch wenn aufgrund unterschiedlicher Filtrationsgeschwindigkeiten in den verschiedenen Filtereinsätzen die Filtration der Rohlösungen typischerweise nur so lange läuft, bis die ersten Filtereinsätze leer sind, kann aus der Analyse der Fraktion in den unterschiedlichen Filtereinsätzen eine eindeutige Information über die Wechselwirkung zwischen den Komponenten des Stoffgemisches und der Membran (Größenausschluss, Einfluss von Ladung bzw. Affinität) gewonnen werden, wenn z. B. die Anfangsfraktion für Membranen mit kleinem CutOff und entsprechend geringer Permeabilität einer quantitativen Filtratausbeute von Membranen mit großem CutOff und entsprechend hoher Permeabilität folgt.
Es ist beispielsweise möglich, von einem Array mit Filtrationsmembranen mit gleichen Trenneigenschaften, z. B. bedingt durch die gleiche Porengröße in den Membranen, auszugehen. Es sind verschiedene Methoden bekannt, die Porengröße der Membran - und somit die Trenneigenschaften dieser - zu variieren. In die Membranen können zusätzlich auch funktionelle Gruppen oder Moleküle eingeführt werden. Es konnte überraschend gezeigt werden, dass Filtrationsmembranen in einem Array, die systematisch variiert wurden, stark heterogene Proteingemische effizient und einfach trennen.
Erfindungsgemäß kann man beispielsweise von Flitrationsplatten ausgehen, die Kavitäten aufweisen, deren Böden als Membran ausgebildet sind. Derartige Membranen weisen in jeweils einer Platte die gleichen Trenneigenschaften auf. Die Modifizierung der Filtrationsmembranen in den unterschiedlichen Kavitäten erfolgt beispielsweise parallel und gleichzeitig. Dies kann auf dem Wege einer photoinitiierten Pfropfcopolymerisation reaktiver Monomere realisiert werden. Dabei werden in die unterschiedlichen Kavitäten Reaktionslösungen unterschiedlicher, graduell variierter Zusammensetzung eingefüllt, z. B. mit unterschiedlicher Monomerkonzentration bzw. -zusammensetzung. Als Monomere können Verbindungen eingesetzt werden, deren Moleküle eine oder mehrere konstitutionelle Einheiten bilden, deren Wiederholung als konstitutionelle Repetiereinheiten ein regelmäßiges Polymer ergibt. Monomere im Sinne der Erfindung sind daher alle Verbindungen, aus denen über Polyreaktionen Polymere aufgebaut werden können. Diese Polyreaktionen können als Ketten- als auch als Stufenreaktion, z. B. Polyaddition und Polykondensation, ablaufen. Die eingesetzten Monomere können Verbindungen mit Kohlenstoff bzw. Kohlenstoff- Mehrfachbindungen - z. B. Olefine, Acetylene, Vinyl- oder Methacryl-Verbindungen - sein oder cyclische Ether, Ester oder Amide, ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffe, sowie solche mit Isocyanat-, H-aciden Amino-, Hydroxy- und/oder Carboxy-Gruppen. Beispiele für derartige Monomere sind Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure. Durch die Wahl der Konzentration der Monomere kann die Porengröße der Membranen und somit ihre Wirkung als Molekularsieb bestimmt werden. Durch die unterschiedliche Wahl der Zusammensetzung der Monomere können die Ladung und die Affinität der entstehenden Membranen variiert werden. Die Affinität der Membranen kann jedoch auch in weiteren Schritten durch das Aufbringen von funktionellen Gruppen, Enzymen oder Antikörpern zusätzlich verändert werden. Die Monomere können selbstverständlich auch so ausgewählt werden, dass Ladung, Affinität und/oder Ladung gleichzeitig variiert werden, so dass die Membranen in der Mikro-, Ultra- und Nanofiltration genutzt werden können.
Nachdem in die Kavitäten der Filterplatte Monomere eingefüllt wurden, wird die gesamte Filterplatte mit einem UV-Strahler belichtet, wobei die Modifizierungsreaktion ausgelöst wird. Selbstverständlich kann auch bei gleicher Zusammensetzung der Reaktionslösung in den unterschiedlichen Kavitäten die Belichtungsdauer von Kavität zu Kavität variiert werden. Auch beide Parameter, Zusammensetzung der Reaktionslösung und Belichtungsdauer, können simultan variiert werden. Durch die photoinitiiert gebildeten Pfropfcopolymere an der Membranoberfläche kommt es zu einer Verengung der Poren, deren Ausmaß vom Modifizierungsgrad abhängt. Dieser Modifizierungsgrad kann z. B. durch die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen der photoinitiierten Pfropfcopolymerisation gezielt in prinzi­ piell bekannter Weise eingestellt und damit variiert werden [M. Ulbricht, A. Oechel, C. Lehmann, G. Tomaschewski, H. G. Hicke, J. Appl. Polym. Sci. 55 (1995) 1707-1723; M. Ulbricht, Reactive & Functional Polymers 31 (1996) 165-­ 177]. Die Schichtdicke der Pfropfpolymere kann zwischen weniger als 1 nm und einigen µm eingestellt werden; somit lassen sich die Porengrößen von NF-Membranen (< 5 nm), UF- Membranen (ca. 1 bis 100 nm) und MF-Membranen (50 nm bis 10 µm) gezielt variieren. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, Ladung, Affinität und Porengröße in jeder Filtrationsmembran im Array zu verändern.
Das Array kann aber auch mit Hilfe anderer Verfahren zur Membranmodifizierung hergestellt werden, so z. B. mit allen zur Membranmodifizierung geeigneten chemischen Reaktionen, physikalischen Behandlungen (z. B. Plasmabehandlung) oder Beschichtungen (z. B. mit Polymeren).
Zusätzlich können auch Ladungseffekte zur Trennung unterschiedlicher Substanzen mit den Filtrationsmembranen genutzt werden, z. B. mit Ionenaustauscher- oder ladungsmodifizierten Membranen. Typischerweise wird hier bei engporigen Membranen, z. B. für die Nanofiltration, aufgrund des DONNAN-Effektes ein Rückhalt von Substanzen beobachtet, die die gleiche Ladung wie die Membranoberfläche aufweisen. Weiterhin kann die Affinität der Filtrationsmembranen geändert werden, wobei eine mehr oder weniger spezifische Wechselwirkung zwischen den Komponenten des Biomolekülgemisches und den an der Membranoberfläche fixierten funktionellen Gruppen, z. B. Ionenaustauschergruppen oder Chelatliganden, oder Molekülen, z. B. Farbstoffe, Proteine, Antikörper oder Nukleinsäuren, während der Membranfiltration genutzt werden kann.
Der Array kann erfindungsgemäß auch so hergestellt werden, dass er Filtrationsmembranen mit verschiedenen Membranen mit variiertem CutOff und unterschiedlicher Steilheit der Trennkurve enthält, die jeweils eine variierte Fraktionierung eines Wirkstoffextraktes bewirken, z. B. Mistelextrakte für die traditionelle chinesische Medizin mit Proteinen, Peptiden, Poly- und Oligosacchariden als cell wesentlichen Komponenten. Dies kann für eine vereinfachte anschließende Identifizierung von pharmakologisch wirksamen Komponenten oder für eine optimale Einstellung der Mischung genutzt werden, z. B. die optimale Wirkung durch einen hohen Gehalt wirksamer Komponenten oder Verbesserung der Bioverfügbarkeit und Stabilität.
Die Modifizierung in oder an den Filtrationsmembranen kann parallel und/oder gleichzeitig erfolgen. Dies kann z. B. auf dem Wege der photoinitiierten Pfropfcopolymerisation reaktiver Monomere realisiert werden. Dabei werden in die unterschiedlichen Filtereinsätze Reaktionslösungen unterschiedlicher, graduell variierter Zusammensetzung, wie z. B. unterschiedliche Monomerkonzentrationen bzw. - mischungen, eingefüllt, und danach wird die gesamte Platte mit einem UV-Strahler belichtet, wodurch die Modifizierungsreaktion ausgelöst wird. Selbstverständlich kann auch bei gleicher Zusammensetzung der Reaktionslösung in den unterschiedlichen Filtereinsätzen die Belichtungsdauer von Filtereinsatz zu Filtereinsatz variiert werden. Auch beide Parameter, Zusammensetzung der Reaktionslösung und Belichtungsdauer, können simultan variiert werden. Durch die photoinitiiert gebildeten Pfropfcopolymere an der Membranoberfläche kommt es z. B. zu einer Verengung der Poren, deren Ausmaß vom Modifizierungs­ grad abhängt. Dieser Modifizierungsgrad kann z. B. durch die beschriebenen Reaktionsbedingungen der photoinitiierten Pfropfcopolymerisation gezielt eingestellt und damit variiert werden.
Die Modifizierung der Membranen kann sowohl mit Methoden der chemischen bzw. Strukturanalytik (Gravimetrie, IR- Spektroskopie, Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse, Kontaktwinkelmessungen, Bindung von Farbstoffen und Quantifizierung, Messung der spezifischen Oberfläche durch Adsorptionsisothermen, Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie) als auch in Tests der Membrantrennleistung (Bestimmung der Permeabilität für Wasser bzw. andere Lösungsmittel, Rückhaltevermögen, wie z. B. der CutOff, für Testsubstanzen definierter Molekülgröße und -struktur, spezifische Bindung von Substanzen in der Membran und anschließende Identifizierung bzw. Quantifizierung) eindeutig charakterisiert werden. Die qualitative und quantitative Analyse von Roh- bzw. Filtratlösungen vor bzw. nach Membrantrennung erfolgt z. B. mit analytischen Verfahren wie UV/Vis-Spektroskopie, Messung von Brechungsindex, Leitfähigkeit oder Trennung mittels Chromatographie (z. B. HPLC unter Nutzung von Trennmechanismen wie Adsorption, Verteilung, Größenausschluß, Affinität) oder Elektrophorese. Weiterhin kann zur Identifizierung von Substanzen auch die Massenspektrometrie eingesetzt werden. Aus den Daten eines Größenausschluß-Chromatogramms kann rechnerisch die Steilheit der Trennkurve ermittelt werden.
Eine Fraktionierung im Sinne der Erfindung ist eine Bezeichnung der stufenweisen Trennung eines Gemisches in seine Komponenten, die sogenannten Fraktionen. Mit Hilfe der Fraktionierung des Gemisches können Einzelkomponenten effektiv identifiziert werden. Über die Kombination von Variationen des Größenauschlusses, der Affinität und der Ladung der Membranen ist es möglich, schnell und sicher effektive Lösungen für Trennprobleme bei komplexen Stoffen zu finden.
Es ist beispielsweise vorgesehen, Einzelkomponenten aus einem Biomolekülgemisch mit Hilfe des Arrays zu identifizieren. Die Identifizierung von Einzelkomponenten kann beispielsweise durch die Optimierung der Separationsschritte durch Kombination oder durch variierende Modifizierung der Trennparameter der Membran erfolgen, z. B. bei der Identifizierung von unbekannten Proteinen aus biologischem Material für Proteomics- Anwendungen. Hierbei kann beispielsweise die Steilheit der Trennkurve, die eine Verbesserung der Trennschärfe zur Folge hat, durch unterschiedliche Trennparameter der Membran erfolgen. Die Änderung der Porengröße der Membran kann insbesondere bei der Mikro-, Ultra- und Nanofiltration eingesetzt werden; wenn die Ladung der Membran variiert, ist ebenfalls eine Kombination mit der Ultra-, Nano- oder Mikrofiltration möglich. Vorteilhafte Anwendungen finden sich insbesondere bei der Mikro- und Ultrafiltration, wenn die Affinität der Membranen unterschiedlich ist. Weiterhin können die Membraneigenschaften auch durch eine Erweiterung auf andere Filtermaterialien mit größeren Porengrößen, z. B. Glasfaser oder gesintertem Polypropylen, modifiziert werden.
Es ist weiterhin möglich, dass das Array verwendet wird, um die Zusammensetzung eines Gemisches effektiv, insbesondere beim sogenannten "blending", einzustellen. Die Verwendung des Arrays gestattet z. B. die einfache Identifizierung der optimalen Zusammensetzung eines Gemisches, z. B. von Wirkstoffextrakten aus biologischem Material für Anwendungen in der traditionellen Medizin.
In einer Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass Biomolekülgemische getrennt werden. Durch die Trennung der Biomolekülgemische können Einzelkomponenten identifiziert werden. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, die Membranen so herzustellen, dass sie sich hinsichtlich der Größe der Poren in der Membran unterscheiden. Die Porengröße der Membran ist dafür verantwortlich, bis zu welcher Größe bzw. bis zu welchem Molekulargewicht eine Biomolekülkomponente aus einem komplexen Biomolekülgemisch die Membran passieren kann. Die Membran würde in einem solchen Falle als Molekularsieb für Biomoleküle fungieren. Die Sieb- bzw. Adsorptionswirkung dieser Molekular- bzw. Molekülsiebe beruht darauf, dass von ihnen nur solche Proteine des Gemisches hindurchgelassen oder adsorbiert werden, deren Molekülgröße es gestattet, in die Poren eindringen zu können. Es ist jedoch auch möglich, dass beispielsweise nicht nur für das Durchdringen, sondern für die Adsorption auch elektrostatische Wechselwirkungen und andere zwischenmolekulare Kräfte eine Rolle spielen. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass Membraneneigenschaften genutzt werden, die sich hinsichtlich ihrer Ladung in bezug auf die Biomoleküle unterscheiden. In einem solchen Falle würden einzelne Biomoleküle des Gemisches je nach Ihrer Ladung mit der Ladung der Membran dergestalt wechselwirken, dass sie angezogen, abgestoßen bzw. gebunden werden. Die Trennung der Biomoleküle oder Biomolekülkomponenten des heterogen und komplexen Gemisches würde dabei auf unterschiedlichen Ladungen zu jeweiligen Membran beruhen.
Weiterhin kann vorgesehen sein, dass sich die Membran hinsichtlich ihrer Affinität zu einzelnen Biomolekülen des Gemisches unterscheiden. Unter Affinität im Sinne der Erfindung wird diejenige chemische Triebkraft verstanden, mit Hilfe derer chemische Elemente, das heißt einzelne Komponenten des Gemisches und Verbindungen, mit der Membran wechselwirken. Derartige Membranen können beispielsweise zur Isolierung oder Anreicherung von speziellen Molekülen aus biologischen Gemischen benutzt werden. Die Affinität zwischen den Komponenten und der Membran beruht beispielsweise auf der Fähigkeit bestimmter zusammengehöriger Partner wie beispielsweise Antigene- Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Hormon, Kohlenhydrat- Lektin, Nukleinsäure-komplementäre Nukleinsäure, sich gegenseitig zu erkennen und miteinander in Wechselwirkung zu treten.
Erfindungsgemäß wird so beispielsweise die biospezifische Affinität eines Partners ausgenutzt, der als reaktiver Ligand oder Effektor an der Membran fixiert ist, aus einem aufgebrachten Gemisch die spezifische, passende Komponente zu binden, während die übrigen Anteile die Membran unverändert passieren.
Vorteilhafterweise kann hierbei mit hohen Ionenstärken gearbeitet werden, um unspezifische Adsorptionen und Assoziationen zu vermeiden. Es ist beispielsweise möglich, die Elution der spezifisch gebundenen Komponenten durch Änderung des ph-Wertes, der Ionenstärke oder biospezifischer, mit einem kompetiven, löslichen Inhibitor oder Ligandenanalogen durchzuführen. Mit Hilfe dieser Technik können beispielsweise nicht nur einzelne Biomoleküle oder Proteine bzw. Peptide, sondern auch ganze Biomolekül- oder Proteinfamilien oder aber auch Zellpopulationen bzw. andere Komponenten fraktioniert und isoliert werden. Eine weitere Anwendung für Membranen, die sich hinsichtlich ihrer Affinität unterscheiden, besteht in der Möglichkeit der gerichteten Anströmung spezifischer Gruppen, wie z. B. Liganden und Rezeptoren, die sich in großer Dichte in Poren befinden können. Damit wird eine vorteilhafte Verbesserung der Effektivität im Vergleich zu analogen Prozessen mit Partikeln ermöglicht.
Eine weitere Möglichkeit der Biomolekül-Affinitätstrennung ist die Nutzung von spezifischen, aber sehr robusten funktionellen molekularen Abdrücken in synthetischen Polymeren, die in der Membran enthalten sein können. Die synthetischen Polymeren werden beispielsweise durch molekularprägende Polymerisation hergestellt. Dazu kann beispielsweise eine Polymerisation von Monomeren in Gegenwart von Templatmolekülen, die mit einem funktionellen Monomer einen während der Polymerisation relativ stabilen Komplex bilden, genutzt werden. Nach dem Auswaschen des Templats können die so hergestellten Materialien Templatmoleküle wieder spezifisch binden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass Proteingemische getrennt werden. Beispiel für derartige Proteingemische sind Gemische aus Enzymen, Hormonen, Stütz bzw. Gerüstproteinen, Strukturproteinen, Plasmaproteinen, Transportproteinen, Antikörpern, Alloantigenen und Reservesubstanzen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass der Array verwendet wird, um bei der Trennung festzustellen, welche präparativen Trennbedingungen optimal sind. Die Filtrationsmembranen werden wie beschrieben modifiziert und zur Trennung des Gemisches verwendet. Anhand der erzielten Trennleistung und Trennschärfe kann dann ermittelt werden, welche Modifizierung der Filtrationsmembranen besonders vorteilhaft ist und beispielsweise für einen großtechnischen Einsatz präparativ genutzt werden kann. Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, mit der Verwendung des Arrays auch die optimalen Modifizierungsbedingungen zu identifizieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Array, das nach einem auf das Trennproblem abgestimmten System in den Trenneigenschaften untereinander variierende Trennmembranen aufweist.
In einer vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass die Trenneigenschaften die Porengröße, die Ladung und/oder Affinität sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Filtratlonsmembranen aus Polysulfon, Polypropylen, Polyethylen, Polyolefinen, Polyamiden, Polyester, Cellulosederivate, Teflon, PVDF, fluorierten Polymeren PAN und/oder Glasfasern bestehen und an der Oberfläche durch Copolymere modifiziert sind. Es ist selbstverständlich möglich, dass die Filtrationsmembran aus anderen Bestandteilen besteht, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Cellulose-Mischester, Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyamid, regenerierte Cellulose, Polycarbonat, Nylon und/oder Polybren. Nitrocellulose im Sinne der Erfindung sind anorganische Celluloseester. Weiterhin ist es möglich, dass als Filtrationsmembran Nylon eingesetzt wird, wobei Nylon im Sinne der Erfindung lineare aliphatische Polyamide sind, die insbesondere einen hohen Schmelzpunkt aufweisen. Zweckmäßigerweise können auch Polyvinylidenfluoride als Filtrationsmembran eingesetzt werden. Polyvinylidenfluoride sind thermoplastische, leicht zu verarbeitende Kunststoffe, die vorteilhafterweise eine hohe Beständigkeit gegen Temperatur- und Chemikalieneinwirkung aufweisen. Selbstverständlich ist es möglich, Polyvinylidenfluoride mit unterschiedlichem Kristallinitätsgrad zu verwenden, der durch schnelles bzw. langsames Abkühlen, insbesondere während der Herstellung, erreicht werden kann. Vorteilhafterweise zeichnen sich Polyvinylidenfluoride durch eine hohe mechanische Festigkeit, Steifheit und Zähigkeit auch bei tiefen Temperaturen aus. Zweckmäßigerweise kann die Filtrationsmembran auch Celluloseacetat umfassen, wobei im Sinne der Erfindung als Celluloseacetat Celluloseester bezeichnet werden, die durch Umsetzung von Linters oder Zellstoff mit Essigsäureanhydrid in Essigsäure oder Methylenchlorid als Lösungsmittel unter Einsatz von starken Säuren als Katalysatoren im diskontinuierlichen Verfahren hergestellt werden. Vorteilhafterweise zeichnen sich Celluloseacetate durch eine hohe Festigkeit, Schlagzähigkeit, Kratzunempfindlichkeit, Lichtdurchlässigkeit und Oberflächenglanz aus und sie können leicht durch bedrucken, lackieren, heißprägen oder metallisieren oberflächenver­ edelt werden. Mit Vorteil kann die Filtrationsmembran auch Celluloseester bzw. andere Cellulosederivate umfassen.
Cellulosederivate im Sinne der Erfindung sind Substanzen, die durch polymeranaloge Reaktionen chemisch modifizierter Cellulose entstanden sind. Sie umfassen sowohl Produkte, bei denen ausschließlich über Veresterung und/oder Verethe­ rungsreaktionen Hydroxy-Wasserstoffatome der Anhydroglu­ cose-Einheiten der Cellulose durch organische oder anorga­ nische Gruppen substituiert sind, als auch solche, die un­ ter formalem Austausch von Hydroxy-Gruppen der natürlichen Polymeren gegen funktionelle Gruppen, die nicht über ein Sauerstoffatom gebunden sind bzw. über intramolekulare Was­ serabspaltung oder Oxidationsreaktionen gebildet werden. Celluloseester im Sinne der Erfindung sind Cellulosederi­ vate, die durch Veresterung von Linters oder Zellstoff mit organischen und/oder anorganischen Säuren bzw. Säurederiva­ ten, die auch als Gemisch eingesetzt werden können, herstellbar sind. Insbesondere Cellulosemischester können gute wasserunslösliche und/oder thermoplastische Eigenschaften aufweisen. Selbstverständlich ist es möglich, dass die Filtrationsmembran auch andere Kunststoffe und/oder Polymerisate umfasst. Zu den Kunststoffen im Sinne der Erfindung gehören abgewandelte Naturstoffe, wie Duroplaste und Thermoplaste ebenso wie synthetische Kunststoffe, beispielsweise Polykondensate, Polymerisate und Polyaddukte. Beispiele für derartige Verbindungen sind: Acrylnitril-Butadien-Styrol, Acrylnitril-Methylmethacrylat, Celluloseacetobutyrat, Kresol-Formaldehyd, Carboxymethylcellulose, Casein, Diallylphthalat, Ethylcellulose, Epoxid, expandierbares Polystyrol, Ethylen- Vinylacetat, Ethylen-Vinylalkohol, Tetrafluorethylen- Hexafluorpropylen, Polyethylen hoher Dichte (Hart-PE), Polyethylen niederer Dichte (Weich-PE), Methylmethacrylat- Butadien-Styrol, Methylcellulose, Melamin-Formaldehyd, Polyamid, Polymeres aus γ-Carprolactam, Polykondensat aus Hexamethylendiamin u. Adipinsäure, Polyacrylnitril, Polybuten, Polybutylenterephthalat, Polycarbonat, Polychlortrifluorethylen, Polyethylen, chloriertes Polyethylen, Ethylen-Propylen, Polyethylenterephthalat, Phenol-Formaldehyd, Polyimid, Polylsobutylen, Polymethylmethacrylat, Polyoxymethylen, Polyacetal, Polypropylen, Polyphenylenoxid, Polyphenylensulfid, Polystyrol, Polytetrafluorethylen, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Polyvinylchlorid, Polyvinylcarbazol, Polyvinylpyrrolidon, Styrol-Acrylnitril, Polystyrol mit Elastomer auf der Basis von Butadien modifiziert, Silicon, Styrol-α-Methylstyrol, Harnstoff- Formaldehyd und/oder ungesättigte Polyester.
Vorteilhafterweise weisen derartige Kunststoffe ein niedriges spezifisches Gewicht, eine hohe Beständigkeit gegen Korrosion auf sowie eine hohe elektrische Isolierfähigkeit, leichte Formgebung und eine gute Bedruckbarkeit, insbesondere für Detektionsmoleküle, auf. Polymerisate im Sinne der Erfindung sind Produkte, die aus Polyreaktionen, beispielsweise Polymerisation, Polyaddition und/oder Polykondensation bzw. polymeranalogen Reaktionen hervorgegangen sind. Monomere, die zu polymeren Verbindungen führen, können beispielsweise Ethylen, Styrol, Vinylchlorid, Vinylacetat, Methylmethacrylat und/oder Ethylenoxid sein.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass die Filtrationsmembran durch bestimmte Substanzen stabilisiert wird, z. B. durch Metallgitter, Polypropylen, Teflon, Polyethylen, Polyester, Polystyren, Keramik und/oder poröses Glas. Metalle im Sinne der Erfindung sind alle Verbindungen, deren Zusammenhalt durch ein Kristallgitter entsteht. Die Grenze zwischen Metallen und Nichtmetallen ist fließend, so dass auch die Elemente Ce, Sn, As und Sb im Sinne der Erfindung Metalle sind. Zu den Metallen gemäß der Erfindung gehören auch die metallischen Gläser, das heißt Werkstoffe, die sich in einem metastabilen, weitgehend amorphen Zustand befinden. Selbstverständlich sind auch metallisch leitfähige Polymere Metalle im Sinne der Erfindung. Vorteilhafterweise weisen Metalle im Sinne der Erfindung insbesondere eine gute Festigkeit, eine gute Härte und Verschleißbeständigkeit, eine hohe Zähigkeit und eine gute elektrische und thermische Leitfähigkeit auf. Polypropylene im Sinne der Erfindung sind thermoplastische Polymere des Propylens. Polypropylene zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Härte, Rückstellfähigkeit, Steifheit und Wärmebeständigkeit aus. Die Stabilisierung der Filtrationsmembran kann jedoch auch Teflon umfassen. Teflon gemäß der Erfindung sind Polytetrafluoroethylene, die vorteilhafterweise gute thermoplastische Eigenschaften aufweisen. Polyethylene entstehen insbesondere durch eine Polymerisation von Ethylen nach im wesentlichen zwei unterschiedlichen Methoden, dem Hochdruck- und dem Niederdruckverfahren. Polyethylene, die im Hochdruckverfahren hergestellt werden, weisen vorteilhafterweise eine geringe Dichte auf. Die Eigenschaften von Filtrationsmembranstabilisatoren, die Polypropylen umfassen, werden im wesentlichen durch den Charakter des Polyethylen als partiell kristallinem Kohlenwasserstoff bestimmt. Vorteilhafterweise sind Polyethylene bis zu 60° in allen üblichen Lösungsmitteln praktisch unlöslich. Vorteilhafterweise bewirken polare Flüssigkeiten wie Alkohol, Ester und Ketone bei Zimmertemperatur kaum eine Quellung von Polyethylenen. Gegen Wasser, Laugen und Salzlösungen sowie anorganischen Säuren verhalten sich Polyethylene vorteilhafterweise völlig indifferent. Stabilisatoren, die Polyethylene umfassen, haben z. B. eine sehr geringe Wasserdampfdurchlässigkeit. Der Stabilisator kann jedoch zweckmäßigerweise auch Polyester umfassen. Polyester im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die durch Ringöffnungspolymerisation von Lactonen oder durch Polykondensation von Hydroxycarbonsäuren bzw. von Diolen und Dicarbonsäuren bzw. Dicarbonsäurederivaten hergestellt werden. Polyester im Sinne der Erfindung umfassen auch Polyesterharze, Polyesterimide, Polyesterkautschuke, Polyesterpolyole und Polyesterpolyuretane. Polyester sind vorteilhafterweise Thermoplaste und besitzen ausgesprochenen Werkstoffcharakter. Sie zeichnen sich beispielsweise durch eine hohe Thermostabilität aus und können zu Legierungen mit Metallen, wie beispielsweise Kupfer, Aluminium und Magnesium, verarbeitet werden. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die Filtrationsmembran zusätzlich durch Keramik stabilisiert wird. Keramik im Sinne de Erfindung ist eine Sammelbezeichnung für insbesondere anorganische und überwiegend nicht-metallische Verbindungen und Elementen aufgebaute und insbesondere zu mehr als 30 Vol. kristalline Materialien umfassende Stoffklasse. Dem Fachmann sind verschiedene Keramiken bzw. keramische Werkstoffe bekannt, die er einsetzen kann. Es kann sich beispielsweise um sogenannte Töpferware, Steingutgeschirr, Spaltplatten, Laborporzellan, Geschirrporzellan, Knochenporzellan, Aluminiumoxidkeramik, Dauermagnetwerkstoffe, Silicasteine und Magnesiasteine handeln.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Filtrationsmembranen untereinander, wobei von einem Array von Filtrationsmembranen gleicher Größe ausgegangen wird und die Membranen nach einem vorgegebenen System hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften modifiziert werden.
In einer Ausführungsvariante betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften, wobei von einem Array von Filtrationsmembranen gleicher Größe ausgegangen wird, die Membranen nach einem vorgegebenen System durch photoinitiierte Propfcopolymerisation reaktiver Monomere unter Anwendung von in den Kavitäten variierenden Monomerkonzentrationen und/oder -mischungen und/oder Reaktionsbedingungen. So kann es vorteilhaft sein, dass Filtrationsmembranen mit einheitlichen Trennparametern in einer Membranfilterplatte variierend modifiziert werden. Es ist auch möglich, bereits vorgefertigte Membranfilterplatten zu nutzen, die derart modifiziert werden, dass die Membranen unterschiedliche Trenneigenschaften aufweisen. Bei der Modifizierung von Mikrofiltrationsmembranen können auch Filtrationsmembranen mit vollständig blockierten oder "gefüllten" Poren resultieren, die insbesondere für Ultra- oder Nanofiltrations-Trennungen genutzt werden können.
Weiterhin sind auch vollständig sequentielle Modifizierungen der Membranen in den unterschiedlichen Filtereinsätzen möglich. Auch alle weiteren bekannten Modifizierungsreaktionen für Membranmaterialien, polymeranaloge oder Pfropf-Reaktionen, chemisch oder physikalisch initiiert, können dann genutzt werden, wenn damit die Trenneigenschaften der Membranen systematisch variiert werden können. Typischerweise werden auch dabei v. a. die Zusammensetzung der Reaktionslösung sowie die Reaktionsdauer bei der Modifizierung variiert. Weiterhin können auch Beschichtungen von Membranen, ohne chemische Reaktion, für die erfindungsgemäße Modifizierung genutzt werden. Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung eines Arrays von Membranfiltern (Membranfilterplatte) mit systematisch variierten Trenneigenschaften besteht darin, dass zuvor hergestellte unterschiedliche Membranfilter mit variierter Trenncharakteristik zu einer Membranfilterplatte verarbeitet werden, d. h., dass unterschiedliche Filtrations­ membranen in die verschiedenen Kavitäten eingebaut werden.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die Arrays durch die Synthese von molekular geprägten Membranen, Oberflächenmodifizierung, herzustellen. Dabei können in unterschiedlichen Kavitäten für ein Templat die Synthese­ bedingungen variiert werden, aber auch Variationen von Templaten, eingeschlossen auch Variationen ihrer Menge, bei gleichen oder ebenfalls variierten Synthesebedingungen durchgeführt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass auf die Filtrationsmembranen Affinitätsliganden fixiert werden. Beispiele für unterschiedliche Affinitätsliganden sind synthetische Moleküle wie z. B. Biotin oder Cibachrom Blue bzw. Biomoleküle wie z. B. Antikörper, Protein A, Streptavidin oder Nukleinsäuren. Eingeschlossen sind hierbei auch Variationen der Beladung mit Affinitätsliganden in den verschiedenen Kavitäten einer Membranfilterplatte, die mit einer zur kovalenten Immobilisierung geeigneten Membran bestückt ist.
Ein spezielles so hergestelltes Array von Filtrationsmembranen enthält in unterschiedlichen Kavitäten verschiedene an der Membran immobilisierte Proteasen bzw. Proteasemischungen, systematisch über das Array variiert, die jeweils einen spezifischen Verdau eines Proteingemisches bewirken, was für eine anschließende Identifizierung von Komponenten des Proteingemisches, z. B. mit Hilfe von MALDI-MS, genutzt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass auf die Filtrationsmembran Ladungsträger fixiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, dass die Filtrationsmembran durch molekulares Prägen modifiziert werden. Molekular geprägte Membranen gestatten es beispielsweise auch für technische Stoffauftrennungen eine Membranauswahl vorzunehmen, in dem die optimalen Trennbedingungen für verschiedene Membranen mit ihren unterschiedlichen Trennparametern in einem Array identifiziert werden. Beispielsweise ist es möglich, eine Membranfilterplatte mit Affinitätsmembranen durch molekular geprägte Polymere als affine Beschichtung mit systematisch variierten Substanzspezifitäten einzusetzen, um so die optimalen Bedingungen für die Fraktionierung eines Gemisches zu identifizieren. So ist es möglich, eine Vorauswahl durch das Screening von optimalen Trennbedingungen für bestimmte molekular geprägte Membranen vorzunehmen. Die optimalen Trennbedingungen bzw. die unterschiedlichen Trennparameter der Membranen können beispielsweise auch die Katalyse bei der Filtration durch einen Array an den Filtermembranen immobilisierter Enzyme einschließen. Hierzu ist es beispielsweise möglich, in einer Membranfilterplatte mit einer Reaktivmembran ein Array unterschiedlicher Biomoleküle, beispielsweise Enzyme, in verschiedenen Filtereinsätzen zu positionieren und optimale Bedingungen für die Trennung oder für die Katalyse bzw. optimale Bedingungen für die Modifizierung der Membranen zu identifizieren.
Die erfindungsgemäße Verwendung des Arrays und das Verfahren zur Herstellung des Arrays weist mehrere Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf. Es ist beispielsweise möglich, die Filtrationsmembranen in ein und demselben Array mit systematisch kombinatorisch variierten Trenneigenschaften und Trennparametern herzustellen. Membraneigenschaften können in Größe, Ladung und Affinität verändert werden und so in der Mikro-, Ultra- und Nanofiltration in Kombination oder einzeln eingesetzt werden. Durch die Funktionalisierung und Modifizierung von Filtermembranen ist es möglich, die Trennparameter gezielt auf ein Gemisch so einzustellen, dass entweder Einzelkomponenten besonders effektiv identifiziert werden können oder das die Zusammensetzung eines Gemisches effektiv eingestellt werden kann. Weiterhin können die optimalen Trennbedingungen, in Form einer Vorauswahl für das upscaling, gescreent werden. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Verwendung des Arrays ist es, dass bereits bekannte Membranfilterplatten mit ihrem homogen Membranfilterparametern bzw. Membranfiltereigenschaften systematisch und kombinatorisch variiert werden können. Selbstverständlich kann es aber auch vorteilhaft sein, verschiedene Membranen in bestehende Membranfilterplatten einzubauen. Durch die variierte Funktionalisierung einer ursprünglich zunächst homogen modifizierten Membranfilterplatte kann gezielt auf die Anforderungen in einem pharmakologischen Labor oder zur Umweltdiagnostik abgestimmt eine optimalen Modifizierung der Trenneigenschaften vorgenommen werden, bzw. eine optimale Trennung von Einzelkomponenten erfolgen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass Membranfilterplatten mit Mikrofiltrationsmembranen systematisch variierter Porenblockierung, beispielsweise bis zum vollständigen Füllen der Poren, auch in Kombination mit einer variierter Ladung oder Substanzspezifität - Affinität - eingesetzt werden können. Membranfilterplatten mit Affinitätsmembranen können jedoch auch systematisch mit einer variierten Substanzspezifität hergestellt werden, in dem beispielsweise molekular geprägte Polymere als affine Beschichtung eingesetzt werden.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken ist.
Beispiel 1 Array von UF-Membranen mit systematisch variierter Trenngrenze und Steilheit der Trennkurve
Modifizierung mit systematischer Variation (hier 8 verschiedene Modifizierungen mit jeweils 12 Wiederholungen). Als Ausgangsmaterial wird eine Membranfilterplatte mit 96 Filtereinsätzen (Volumen pro Filtereinsatz 350 bzw. 800 ml), bestückt mit Polysulfon-UF- Membranen einer nominalen Trenngrenze (CutOff) von 100.000 g/mol (Unifilter 350 bzw. 800, 96 well, 100 K; Whatman), verwendet. Zuerst wird in alle Filtereinsätze 200 µl einer Lösung von Benzophenoncarbonsäure (BPC; Photoinitiator) in Methanol pipettiert, nach 30 min. wird die Lösung mittels einer Vakuum-Absaugkammer abgesaugt. Anschließend werden jeweils 200 µl Reaktionslösungen von 2-Hydroxy­ ethylmethacrylat (HEMA) in Wasser (mit 0.5 mmol/l BPC) unterschiedlicher Konzentration (cHEMA) in die verschiedenen Filtereinsätze pipettiert (s. Tab. 1).
Nach 15 min. Kontaktzeit mit der Reaktionslösung erfolgt die Belichtung mit einer UV-Lampe (UVA-Spot 1000 mit Tief- UV-Filter H2; Dr. Hönle GmbH, Planegg) für 10 min. Danach werden die Reaktionslösungen abgesaugt, und die Membranen werden mehrmals mit Wasser und Methanol unter Filtration gewaschen. Anschließend wird die modifizierte Membranfilterplatte bis zum Test der Trenneigenschaften wasserfeucht aufbewahrt.
Tab. 1
Zusammensetzung der Reaktionslösung für die systematisch, von Reihe zu Reihe, variierte Modifizierung einer Membranfilterplatte
Charakterisierung der Trenneigenschaften. In die en der Membranfilterplatte (800 ml) werden jeweils 500 µl Lösung mit einer Mischung von drei Standardtestsubstanzen unterschiedlicher mittlerer Molekülmasse Mav (PEGs bzw. Dextrane, jeweils 0.1 g/l in Wasser) pipettiert und mittels einer Vakuum-Absaugkammer mit Filtratsammelplatte solange filtriert, bis in den unterschiedlichen Filtereinsätzen zwischen 100 und 300 µl Filtrat angefallen sind. Danach wird die Zusammensetzung der Filtrate mittels HPLC-GPC (GFC-Phase, Wasser; RI-Detektion) analysiert. Aus den Differenzen der jeweiligen Konzentrationen der Rohlösung und des Filtrates wird das Rückhaltevermögen berechnet (s. Tab. 2).
Tab. 2
Rückhaltevermögen der Membranen in den Filtereinsätzen der Membranfilterplatte nach systematisch variierter Modifizierung (s. Tab. 1; unmodifizierte Membranfilterplatte zum Vergleich)
Als Ergebnis der Modifizierung ist eine schrittweise Variation der Trenngrenze durch schrittweise variierte Modifizierungsbedingungen zu erkennen: Die effektivste Modifizierung (Reihe A; vgl. Tab. 1) führt zum höchsten Modifizierungsgrad und damit zur stärksten Verringerung der trennwirksamen Porengröße (vgl. Tab. 2).
Beispiel 2 Array von UF-Membranen mit systematisch variierter Trenngrenze und Steilheit der Trennkurve sowie Ladung in der Trennschicht
Die Modifizierung erfolgt in allen Schritten analog zu Beispiel 1, lediglich die Zusammensetzung der Reaktionslösung wird durch die zusätzliche Verwendung von Acrylsäure (AA), die bei pH-Werten von < 4.5 negativ geladen vorliegt, weiter variiert (s. Tab. 3).
Tab. 3
Zusammensetzung der Reaktionslösung für die systematisch, von Reihe zu Reihe, variierte Modifizierung einer Membranfilterplatte
Die Charakterisierung der Trenneigenschaften erfolgt mit einer Mischung von drei Standardtestsubstanzen mit unterschiedlicher mittlerer Molekülmasse Mav und unterschiedlichem isoelektrischem Punkt pI (ein PEG, zwei Proteine, jeweils 0.1 g/l in Puffer, pH = 7.0) wie in Beispiel 1 beschrieben; die Ergebnisse sind in Tab. 4 dargestellt.
Tab. 4
Rückhaltevermögen der Membranen in den Filtereinsätzen der Membranfilterplatte nach systematisch variierter Modifizierung (s. Tab. 2; unmodifizierte Membranfilterplatte zum Vergleich)
Als Ergebnis der Modifizierung ist eine simultane schrittweise Variation der Trenngrenze sowie der Ladung der Trennschicht durch schrittweise variierte Modifi­ zierungsbedingungen zu erkennen, wobei die Effekte der verringerten Porengröße analog zu Beispiel 1 wirken: Die zusätzliche Einführung negativ geladener Gruppen (Reihen B, D bzw. F, G, H, jeweils im Vergleich mit Reihen A, C bzw. E; vgl. Tab. 3) führt zu einem erhöhten Rückhalt für das ebenfalls netto-negativ geladene Protein Lysozym, während das Rückhaltevermögen für das netto-positiv geladene Protein BSA sowie das neutrale PEG kaum beeinflusst werden (vgl. Tab. 4).
Beispiel 3 Array von MF-Membranen für Festphasenextraktion mit systematisch variierter Affinität
Modifizierung mit systematischer Variation (hier 8 verschiedene Modifizierungen mit jeweils 12 Wiederholungen). Als Ausgangsmaterial wird eine Membranfilterplatte mit 96 Filtereinsätzen (Volumen 350 ml), bestückt mit hydrophilen PVDF-MF-Membranen einer nominalen Porengröße von 0.45 µm (Unifilter 350, 96 well, PVDF, 0.45 µm; Whatman), verwendet. Zuerst wird in alle Filtereinsätze 300 µl einer Lösung von Benzophenon (BP; Photoinitiator) in Methanol pipettiert, wobei die Lösung innerhalb von ca. 1 min durch die Membran hindurchläuft. Innerhalb von 30 min. wird noch die Zugabe von BP-Lösung noch zweimal wiederholt; dann wird die Platte im Trocken­ schrank bei 40°C für 30 min. getrocknet. Anschließend wird der Filtratauslauf der Platte dicht verschlossen, und es werden jeweils 200 µl Reaktionslösung in die verschiedenen Filtereinsätze pipettiert, wobei die folgenden Komponenten enthalten waren (s. Tab. 5):
  • - Templat - Terbumeton, Desmetryn; c = 10 mmol/l,
  • - Funktionelles Monomer - AA, Methacrylsäure (MAA) oder 2-Acryloylamino-propan-2-sulfonsäure (AMPS),
  • - Vernetzermonomer - N,N'-Methylenbisacrylamid (MBAA),
  • - Lösungsmittel - Methanol, mit BP, c = 5 mmol/l.
Nach 15 min. Kontaktzeit mit der Reaktionslösung erfolgt die Belichtung mit einer UV-Lampe (UVA-Spot 1000 mit Tief- UV-Filter H2; Dr. Hönle GmbH, Planegg) für 10 min. Danach werden die Reaktionslösungen abgesaugt, und die Membranen werden mehrmals mit Methanol, danach mit 50 mmol/l HCl und mit Wasser sowie zuletzt noch einmal mit Methanol unter Filtration gewaschen. Anschließend wird die modifizierte Membranfilterplatte bei Raumtemperatur getrocknet.
Tab. 5
Zusammensetzung der Reaktionslösung für die systematisch, von Reihe zu Reihe, variierte Modifizierung einer Membranfilterplatte (alle Konzentrationen in mmol/l)
Charakterisierung der Trenneigenschaften. In die Filtereinsätze der Membranfilterplatte werden jeweils 200 µl Lösung mit einer Mischung von zwei Testsubstanzen (Desmetryn und Terbumeton, jeweils 0.01 mmol/l in Wasser) pipettiert, wonach die innerhalb von ca. 2 min. das Filtrat in der Sammelplatte erhalten wird. Danach wird die Zusammensetzung der Filtrate mittels HPLC (RP-Phase; Phosphat/Acetonitril 70/30, v/v; UV-Detektion) analysiert. Aus den Differenzen der jeweiligen Konzentrationen der Rohlösung und des Filtrates wird die Sorption in der Membran berechnet (s. Tab. 6).
Tab. 6
Herbizidsorption (Membranfestphasenextraktion) in den Filtereinsätzen der Membranfilterplatte nach systematisch variierter Modifizierung (s. Tab. 5; Sorption in unmodifizierte Membranfilterplatte < 5%)
Als Ergebnis der Modifizierung ist eine simultane schrittweise Variation der Affinität der molekular geprägten Membranen durch schrittweise variierte Modifizierungsbedingungen zu erkennen: Für alle Synthesen ohne Templat (Terbumeton oder Desmetryn) werden nur sehr geringe Sorptionswerte erhalten; dagegen haben sowohl das Templat als auch das funktionelle Monomer sowie deren Konzentrationen Einfluß auf die Sorptionswerte. Daraus können sowohl optimale Synthesebedingungen für molekular geprägte Affinitätsmembranen ermittelt werden; es kann aber auch die zu bindende Menge/Mischung einer Substanz aus einem Gemisch pro Filtereinsatz eingestellt werden.

Claims (12)

1. Verwendung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Membranen untereinander zur effizienten Trennung von stark heterogenen Substanzgemischen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Substanzgemische Biomolekülgemische getrennt werden.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Biomolekülgemische Proteingemische getrennt werden.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung zur Feststellung der Trennbedingungen für eine präparative Fraktionierung dient.
5. Array von Filtrationsmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass es nach einem auf das Trennproblem abgestimmten System in den Trenneigenschaften untereinander variierende Filtrationsmembranen aufweist.
6. Array nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneigenschaften durch die Porengröße, Ladung und/oder Affinität charakterisiert werden.
7. Array nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrationsmembranen aus Polysulfon, Polyethersulfon, Polypropylen, Polyethylen, Polyolefinen, Polyamiden, Polyestern, Cellulosederivaten, Teflon, PVDF, fluorierten Polymern, PAN und/oder Glasfasern bestehen und an der Oberfläche durch Copolymere modifiziert sind.
8. Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Filtrationsmembranen mit systematisch variierenden Trenneigenschaften der Filtrationsmembranen untereinander, dadurch gekennzeichnet, dass von einem Array von Filtrationsmembranen gleicher Größe ausgegangen wird und die Membranen nach einem vorgegebenen System hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften modifiziert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass von einem Array von Filtrationsmembranen gleicher Größe ausgegangen wird, die Membranen nach einem vorgegebenen System durch photoinitiierte Pfropfcopolymerisation reaktiver Monomere unter Anwendung von in den Kavitäten variierenden Monomerkonzentrationen und/oder -mischungen und/oder Reaktionsbedingungen modifiziert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Filtrationsmembranen Affinitätsliganden fixiert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Filtrationsmembranen Ladungsträger fixiert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrationsmembranen durch molekulares Prägen modifiziert werden.
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