DE10107707A1

DE10107707A1 - Antagonisten für alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin

Info

Publication number: DE10107707A1
Application number: DE2001107707
Authority: DE
Inventors: Horst Kessler; Bernhard Holzmann
Original assignee: Wilex Biotechnology GmbH
Current assignee: Heidelberg Pharma AG
Priority date: 2001-02-19
Filing date: 2001-02-19
Publication date: 2002-08-29
Also published as: WO2002066500A3; AU2002247725A1; WO2002066500A2

Abstract

Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin-Zelladhäsionsmolekül-1(MAdCAM-1) hemmen. Die neuen Integrin-Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin vermittelten Zelladhäsion an MAdCAM-1 assoziiert sind.

Description

Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive α₄β₇-Integrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin- Zelladhäsionsmolekül-1(MAdCAM-1) hemmen. Die neuen Integrin- Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch α₄β₇-Integrin vermittelten Zelladhäsion an MAdCAM-1 assoziiert sind.

Integrine sind heterodimere Transmembranglykoproteine, die aus einer α- und einer β-Untereinheit bestehen. Sie sind an Zell-Zell- und Zell-Matrix- Wechselwirkungen beteiligt (Hynes, Cell 69 (1992), 11-25). Gegenwärtig sind 15 unterschiedliche α- und β-Untereinheiten bekannt, aus denen nach heutigem Kenntnisstand mindestens 23 unterschiedliche Integrinrezeptoren gebildet werden können (Eble, Integrin-Ligand Interaction, Springer-Verlag Heidelberg (1997) 1-40). Die Familie der Integrine zeigt erhebliche Unterschiede in ihren biologischen Funktionen und Ligandenspezifitäten.

Die Gruppe der α₄-Integrine wird aus α₄β₇-Integrin und α₄β₁-Integrin gebildet. Beide Rezeptoren werden auf den meisten Typen von Leukocyten exprimiert und vermitteln als Leukocytenrezeptoren sowohl Zell-Zell- als Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Die wichtigsten endogenen Liganden für α₄- Integrine sind das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und Fibronektin (Fn) (Hemler, Annu. Rev. Immunol. 8 (1990), 365-400; Postigo et al., J. Immunol. 151 (1993), 2471-2483) sowie MAdCAM-1, das unter physiologischen Bedingungen ausschließlich an α₄β₇-Integrine bindet (Berlin et al., Cell 74 (1993), 185-195; Kilger und Holzmann, J. Mol. Med. 73 (1995), 347-354).

MAdCAM-1 gehört wie VCAM-1 zur Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und besitzt drei Immunglobulin (Ig) Domänen. Eine kohlenhydratreiche mucinartige Domäne ist zwischen der zweiten und dritten Ig-Domäne inseriert. Die Bindung von α₄β₇-Integrinen an MAdCAM-1 wird hauptsächlich durch die erste N-terminale Ig-Domäne vermittelt, es sind jedoch auch Sequenzen aus der zweiten Ig-Domäne beteiligt. Durch Peptidepitop-Kartierung und ortsspezifische Mutagenese bei MAdCAM-1 konnte das Leu-Asp-Thr-Motiv aus der N-terminalen Ig-Domäne als notwendig für die Bindung an α₄β₇-Integrine identifiziert werden (Shroff et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6 (1996), 2495-2500; Briskin et al., J. Immunol. 156 (1996), 719-726; Viney et al., J. Immunol. 157 (1996), 2488-2497).

MAdCAM-1 ist der wichtigste Gegenrezeptor für α₄β₇-Integrine auf mukosalen Endothelzellen (Strauch et al., Int. Immunol. 6 (1994), 236- 275). Die organspezifische Adhäsion normaler Lymphocyten und Lymphomzellen an endotheliale Venulen von Peyer's-Flecken wird durch α₄β₇-Integrine vermittelt (Holzmann et al., Cell 56 (1989), 37-46; Holzmann und Weissmann, EMBO 8 (1989), 1735-1741; Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8254-8288). Im Maus-Modell konnte gezeigt werden, dass β₇-Integrin und/oder MAdCAM-1 spezifische Antikörper die Rekrutierung von Lymphocyten im entzündeten Darmgewebe blockieren und signifikant den Verlauf von entzündlichen Darmerkrankungen lindern (Picarella et al., J. Immunol. 158 (1997), 2099- 20106). Weiterhin können Antikörper gegen β₇-Integrine Mäuse vor der Ausbildung von Insulin-abhängigem Diabetes schützen (Yang et al., Diabetes 46 (1997), 1542-1574).

Peptidische Integrin-Inhibitoren sind bekannt. US-A-6,037,324 offenbart Dipeptide als Inhibitoren von Integrin-MAdCAM-1-Wechselwirkungen. WO 97/25351 offenbart peptidische Substanden mit an den N- und C- Terminus gebundenen Gruppen als Mimotope des konservierten Aminosäuremotivs LDTSL von MAdCAM-1. WO 98/06248 beschreibt humanisierte Immunglobuline mit hoher Spezifität für Integrine, welche eine Antigen bindende Region von nichthumanem Ursprung und mindestens einen Teil eines Immunglobulins von humanem Ursprung aufweisen. US-A- 5,510,332 offenbart Peptide mit einer Länge von 4-13 Aminosäuren umfassend die LDV-Domäne des CS1-Peptids, welche die Bindung von α₄β₁-Integrinen an VCAM-1 oder Fibronektin hemmen. US-A-6,087,330 offenbart zyklische Peptide mit 5-13 Aminosäuren abgeleitet vom CS1- Peptid, welche die Bindung von α₄β₇-Integrinen an VCAM-1, Fibronektin oder Invasin selektiv hemmen. Inhibitoren der Bindung von α₄β₁-Integrin an seine Rezeptoren, z. B. VCAM-1, werden auch in US-A-6,096,773 offenbart. Ein Verfahren zur Identifizierung von α₄β₇-Antagonisten wird in WO 00/30681 beschrieben.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, neue Antagonisten von α₄β₇-Integrinen bereitzustellen, die insbesondere eine hohe Selektivität für MAdCAM-1 besitzen. Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung neuer zyklischer Peptide gelöst.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit peptidische Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (Ia) oder (Ib):

c(X₁-D-X₂-X₃-X₄-X₅) (Ia)

c(X₁-D-X₃-X₃-X₅-X₄) (Ib)

worin
X₁ ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X₂ ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X₃ ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X₄ ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D-Konfiguration vorliegt und
X₅ ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen, deren Salze und Derivate eine überraschend hohe und selektive inhibitorische Wirkung auf die Wechselwirkung von α₄β₇-Integrin mit seinem Rezeptor, insbesondere MAdCAM-1 zeigen.

Die monomeren Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind Aminosäuren, vorzugsweise α-Aminocarbonsäuren. Es können jedoch auch andere Aminosäuren, beispielsweise β- Aminocarbonsäuren, Aza-Aminosäuren (Derivate von α- Aminocarbonsäuren, bei denen die α-CH-Gruppe durch ein N-Atom ersetzt ist) oder/und Peptoid-Aminosäuren (Derivate von α-Aminocarbonsäuren, bei denen die Aminosäureseitengruppe nicht an das α-C-Atom sondern an die Aminogruppe gebunden ist) verwendet werden.

Die Aminosäure-Bausteine X₁, D, X₂, X₃ und X₅ liegen - sofern sie ein optisch aktives Zentrum aufweisen - vorzugsweise in der L-Konfiguration vor. Der Baustein X₄ liegt hingegen - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - vorzugsweise in der D-Konfiguration vor. Von den erfindungsgemäßen Verbindungen sind solche mit einer Struktur der Formel (Ia) besonders bevorzugt.

Die bevorzugten Bedeutungen der monomeren Bausteine in den peptidischen Verbindungen sind wie folgt:
X₁ ist ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette, vorzugsweise mit einer Leucin-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X₁ die α-Aminocarbonsäure L-Leucin.
D ist ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette, besonders bevorzugt die α-Aminocarbonsäure L-Asparaginsäure.
X₂ ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette, die vorzugsweise 1-3 C-Atome, insbesondere 2 C-Atome aufweist, vorzugsweise mit einer Threonin- oder Valin-Seitenkette. Besonders bevorzugt wird X₂ aus den α- Aminocarbonsäuren L-Threonin und L-Valin ausgewählt.
X₃ ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren, die beispielsweise 1-4 C-Atome aufweist, oder mit einer aromatischen Seitenkette, vorzugsweise mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X₃ eine α- Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Alanin, L-Asparaginsäure, L- Phenylalanin und D- oder/und L-Ph.
X₄ ist ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette, die günstigerweise ein optisches aktives Zentrum aufweist, das in D- Konfiguration vorliegt. Beispielsweise kann X₄ ein α- Aminocarbonsäurerest ausgewählt aus D-Prolin, D-Phenylalanin und anderen beliebigen D-α-Aminocarbonsäureresten sein.
X₅ kann an sich beliebiger Aminosäurerest sein, wobei Aminosäurereste mit einer aromatischen Seitenkette, wie etwa einer Phenylalanin-, Tyrosin-, Histidin-, Benzoylphenylalanin (Bpa)- oder Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic)-Seitenkette bevorzugt sind. Andererseits kann X₅ auch andere Bedeutungen wie etwa Methionin oder Arginin aufweisen. Besonders bevorzugt ist X₅ eine α-Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Histidin, L-Bpa, L-Tic, L-Methionin oder L-Arginin.

Besonders bevorzugte konkrete Beispiele für erfindungsgemäße peptidische Verbindungen sind im folgenden angegeben:
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)

Neben Peptiden der Strukturformeln (Ia) und (Ib) sind auch pharmazeutisch verträgliche Salze und Derivate davon als α₄β₇-Integrin-Inhibitoren geeignet. Als Derivate kommen dabei insbesondere solche Verbindungen in Betracht, die an reaktiven Gruppen der Seitenkette, z. B. an Hydroxyl-, Amino- oder Carbonsäuregruppen, modifiziert sind. Beispiele für eine solche Modifizierung sind eine Acylierung, z. B. eine Acetylierung von Aminogruppen oder/und eine Amidierung oder Veresterung von Carbonsäuregruppen.

Die Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind über Säure-Amid-Bindungen -CONR¹- oder -NR¹CO- verknüpft, d. h. die Peptidsequenzrichtung kann umgekehrt werden (Retropeptide). R¹ kann wie in nativen Polypeptiden Wasserstoff bedeuten. Andererseits kann R¹ jedoch auch eine Alkylrest, z. B. ein C₁ bis C₃-Alkylrest wie etwa Methyl oder Ethyl insbesondere Methyl bedeuten, da durch eine N-Alkylierung der Amidbindung oftmals eine starke Aktivitätsbeeinflussung bewirkt werden kann (vgl. z. B. Levian-Teitelbaum et al., Biopolymers 28 (19891, 51-64). Darüber hinaus kann - wie bereits ausgeführt - R¹ bei Peptoid- Aminosäurederivaten auch die eigentliche Aminosäuren-Seitenkette enthalten.

Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind zyklische Verbindungen, worin bei Struktur (Ia) die Bausteine X₁ und X₅ und - bei Struktur (Ib) - die Bausteine X₁ und X₄ miteinander verbrückt sind. Diese Verbrückung erfolgt vorzugsweise über N- und C-Terminus des Peptids.

Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind durch chemische Synthese, wie in den Beispielen erläutert, erhältlich. Die Verbindungen können in isolierter Form oder gegebenenfalls gekoppelt an makromolekulare Trägersubstanzen, z. B. Dextran oder Polypeptide vorliegen. Die Kopplung an Trägersubstanzen kann über Spacer oder/und Aminosäure-Seitenketten, z. B. über X₄, erfolgen.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eine peptidische Verbindung wie zuvor definiert, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- oder Verdünnungsmitteln enthält. Insbesondere werden die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen zur Herstellung von α₄β₇- Integrin-Inhibitoren verwendet, die sich auch zur Diagnose, Prävention oder/und Bekämpfung von mit α₄β₇ assoziierten Krankheiten, z. B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, aber auch Autoimmunerkrankungen, insbesondere Asthma, Typ-I Diabetes und rheumatoider Arthritis sowie Nahrungsmittelallergien eignen. (Kilger, G., Holzmann, J., J. Mol. Med. 1995, 73, 347 ff.). Weitere Anwendungsgebiete stellen strahlungs- und strahlentherapiebedingte Magen-Darm-Trakt-Schädigungen dar. Zusätzlich sind Tumore mit α₄β₇- Beteiligung wie z. B. Non Hodgkin Lymphom, lymphoblastisches T-Zell Lymphom sowie MALT-Lymphome besonders bevorzugte Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Verbindungen. Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur selektieren Inhibierung der Wechselwirkung von α₄β₇-Integrin mit MAdCAM-1 verwendet, wobei für diesen Zweck besonders bevorzugt solche Verbindungen eingesetzt werden, die bezüglich der Wechselwirkung zwischen α₄β₇-Integrin und MAdCAM-1 eine mindestens um den Faktor 2 höhere Hemmwirkung als bezüglich der Wechselwirkung zwischen α₄β₇- Integrin und VCAM-1 haben.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung von α₄β₇-Integrin, wobei man eine erfindungsgemäße peptidische Verbindung in einer wirksamen Dosis in ein α₄β₇-Integrin enthaltendes biologisches System, beispielsweise eine Zelle oder einen Organismus einbringt. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die Verabreichung des Wirkstoffs an ein bedürftiges Subjekt, insbesondere einen menschlichen Patienten.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, als beschichtete Tabletten oder in Form von Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmitteln. Die peptidischen Verbindungen werden vorzugsweise oral oder parenteral in einer flüssigen oder festen Form verabreicht. Bei Verabreichung in flüssiger Form wird Wasser vorzugsweise als Trägermedium verwendet, das gegebenenfalls Stabilisatoren, Löslichkeitsvermittler und/oder Puffer enthält, die üblicherweise für Injektionslösungen verwendet werden. Solche Zusatzstoffe sind beispielsweise Tartrat- oder Boratpuffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Komplexierungsmittel wie etwa EDTA, Polymere wie etwa flüssiges Polyethylenglycol, etc.

Bei Verabreichung in fester Form können feste Trägersubstanzen wie etwa Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, hochdisperses Siliciumoxid, hochmolekulare Fettsäuren wie etwa Stearinsäure, Gelatine, Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische oder pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere wie etwa Polyethylenglykole eingesetzt werden. Weiterhin können die Formulierungen zur oralen Applikation, sofern gewünscht, auch Aroma- und Süßstoffe enthalten.

Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen können auch in Komplexen vorliegen, z. B. mit Cyclodextrinen wie etwa α, β oder γ- Cyclodextrin.

Für therapeutische Anwendungen hängt die verabreichte Dosis vom Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, von der Art und der Schwere der Erkrankung, von der Art der Behandlung, von der Häufigkeit der Verabreichung und der Art der gewünschten Wirkung ab. Die tägliche Dosis der aktiven Verbindung ist üblicherweise 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht. Normalerweise sind 0,1 bis 40 und vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/kg/Tag in einer oder mehreren Dosen ausreichend, um die gewünschten Wirkungen zu erzielen.

Weiterhin soll die Erfindung durch die im nachfolgenden beschriebenen Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigt:

Fig. 1 die Bindung von 38-β7 Lymphomzellen (α₄β₇) und Jurkat-Zellen (α₄β₁) nach Inkubation mit zyklischen Peptiden an immobilisiertes VCAM-1 und MAdCAM-1. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben.

Beispiele Beispiel 1 1. Material und Methoden 1.1 Peptidsynthese

Lineare Peptide wurden unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese nach Merrifield an einem Tritylchlorid (Trt)-Harz (Rapp-Polymere, Tübingen, Deutschland) unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurederivaten (Fields und Noble, Int. J. Pept. Prod. Res. 35 (1990), 161-214) hergestellt. Die Fmoc-geschützten Aminosäuren wurden mit O-(1-H-Benzotriazol-1-yl)- N,N,N',N'-Tetramethyluroniumtetrafluoroborat(Richelieu, Biotechnologies, Montreal, Kanada), 1-Hydroxybenzotriazol (Novabiochem, Läufelfingen, Schweiz) und Diisopropylethylamin als Base in N-Methylpyrrolidon als Lösungsmittel durchgeführt. Die vollständig geschützten linearen Aminosäuren wurden vom Harz unter Verwendung einer Mischung aus Dichlormethan, Trifluorethanol und Essigsäure (8 : 1 : 1) abgespalten. Die Zyklisierung der linearen Sequenzen erfolgte bei hoher Verdünnung in Dimethylformamid (cirka 1,25 × 10^-3 M) mittels in situ Aktivierung unter Verwendung von Diphenylphosphorazidat unter Verwendung von Natriumbicarbonat als fester Base (Brady et al., Peptides'83: Structures and Function, 8th Ann. Pept. Symp.; Pierce Chemical Company, Illinois, USA (1983), 127-130). Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte durch Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 6% Triisopropylsilan und 4% Wasser. Nach Aufreinigung durch Reverse Phase-HPLC wurden Peptide mit einer Reinheit < 98% erhalten. Die Peptide wurden durch ESI- Massenspektroskopie und 1D, 2D¹H, ¹³C-NMR Spektroskopie charakterisiert (Kessler und Seip: NMR of peptides. In: Two-Dimensional NMR Spectroscopy: Applications for Chemists and Biochemists; Croasmun, Carlson, Hrsg. VCH Publishers: New York (1994), 619-654).

1.2 Zelladhäsionstest

Mit MAdCAM-1 transfizierte CHO-Zellen (2-3 × 10⁴/Loch) wurden in 96- Lochplatten gegeben und für 24 h kultiviert. Konfluente Zell-Monoschichten wurden einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend mit Adhäsionstest-Puffer (24 mM Tris, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM Glucose und 1% Rinderserumalbumin) gewaschen. Für Adhäsionstests mit MAdCAM-Immunglobulin wurden die 96 Lochplatten mit Maultier-Anti-Human IgG (0,5 µg in 100 µl PBS/Loch) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit Adhäsionstest-Puffer (Click's RPMI, 1% Rinderserumalbumin, 1,0 mM Ca²⁺, 1,0 mM Mg²⁺) gewaschen und mit 100 ng MAdCAM-Immunglobulin für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die Platten mit Adhäsionstest-Puffer für 1 h bei 37°C blockiert. Alternativ wurden die Platten für 16 h bei 4°C mit 400 ng/Loch VCAM-1 oder 2 µg/Loch gereinigtem Laminin in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,4 beschichtet.

38-β7 Lymphomzellen (Strauch et al. (1994) Supra; Hu et al., (1992) Supra), Jurkat-Lymphomzellen oder humane periphere Blutlymphocyten wurden für 30 min bei 37°C mit 12 µg/mL des Farbstoffs H33342 (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) in Zelladhäsionspuffer markiert und mit PBS enthaltend 1 mM EDTA und anschließend nochmals mit PBS gewaschen. Die Zellen (8 × 10⁵ Zellen/mL) wurden in Zelladhäsionspuffer mit 1,0 mM Ca²⁺ und 1,0 mM Mg²⁺ resuspendiert. Die zyklischen Peptide wurden mit den Zellen bei einer Endkonzentration von 1 mg/mL für 10 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine 30-minütige Adhäsion der Zellen bei 37°C. Nicht adhärente Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 50 g entfernt. Die Adhäsionstests wurden quantitativ durch Fluorimetrie unter Verwendung eines Cytofluor 2300 Gerätes (Millipore, Bedford, Massachussets) ausgewertet.

2. Ergebnisse 2.1 Ermittlung einer Leitstruktur

Zunächst wurden 5 zyklische Pentapeptide mit der Sequenz cyclo(L-D-T-A- A) synthetisiert, worin jeweils eine Aminosäure in D-Konfirmation vorliegt. An Stelle von D-Alanin wurde jedoch D-Prolin verwendet. Auf diese Weise wurden die zyklischen Pentapeptide P1 bis PS (Tabelle 1) erhalten. Anschließend wurde dieselbe Methode für das Hexapeptid cyclo(L-D-T-A-A- A) verwendet, wobei die 6 Verbindungen P6 bis P11 (Tabelle 1) erhalten wurden. Die zyklischen Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Adhäsion von α₄β₇-Integrin exprimierenden 38-β7 Lymphomzellen an stabil mit MAdCAM-1 transfizierten CHO-Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Nur die 2 Hexapeptide P10 und P11 zeigten eine wirksame Hemmung der Bindung von α₄β₇-Integrinen an MAdCAM-1. Die Verbidung P10 zeigte eine höhere Aktivität als P1 l. Die lineare Vorstufe des zyklischen Hexapeptids P10 H₂N-L-D-T-A-p-A-OH zeigte keine Aktivität selbst bei einer hohen Konzentration von 2 mg/ml.

Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die zyklische Peptidstruktur P10 (entsprechend der peptidischen Verbindung Ia) als Leitstruktur für weitere Optimierungen verwendet.

2.2 Optimierung der Leitstruktur

Nach Ermittlung der Leitstruktur wurde systematisch jeder Aminosäurerest in P10 optimiert. In diesen Experimenten wurde die biologische Aktivität durch Hemmung der Adhäsion von 38-β7 Lymphomzellen an ein immobilisiertes MAdCAM-Ig Fusionsprotein bestimmt. Verglichen mit CHO- MAdCAM-1 Transfektanten als Substrat ergibt die Beschichtung von Platten mit dem MAdCAM-Ig Protein eine höhere Ligandendichte und bewirkt stringentere Bedingungen für die Selektion nach biologisch aktiven Verbindungen. Die Hemmung der 38-β7 Zelladhäsion an MAdCAM-Ig mit 1 mg/ml des Inhibitors P10 war daher weniger wirksam als die Hemmung der Bindung an CHO-MAdCAM-1 (38% restliche Adhäsion für MAdCAM-Ig gegenüber 7% für CHO-MAdCAM Zellen; vgl. Tabellen 1 und 2).

Innerhalb des LDT-Motivs von Peptid P10 wurden Modifikationen unter Verwendung funktionell verwandter Aminosäuren durchgeführt. Leucin (P10 und P18) wurde durch Valin (P13), Isoleucin (P14), Phenylalanin (P20), D- und L-Phenylglycin (P21 und P22) und auch durch Glycin (P12) ersetzt. Threonin (P10 und P18) wurde durch Glycin (P15), Serin (P16) und Valin (P17 und P19) ersetzt. Die Substitution von Leucin durch Glycin (P12), Valin (P13), Phenylalanin (P20) oder D- und L-Phenylglycin (P21 und P22) führte zu inaktiven Verbindungen. Bei Ersetzen von Leucin durch Isoleucin (P14) konnte noch Aktivität nachgewiesen werden. Auch bei Austausch von Threonin durch Valin (P17 und P19) blieb die Aktivität erhalten, während bei Glycin (P15) und Serin (P16) keine Aktivität gefunden wurde (Tabelle 2).

Die Aminosäuren an den Positionen 4 bis 6 von P10 (cyclo(L¹-D²-T³-A⁴-p⁵- A⁶) wurden ebenfalls systematisch variiert. Alanin an Position 6 wurde durch saure (Asparaginsäure, Glutaminsäure), basische (Arginin) oder aromatische (Phenylalanin, Tyrosin, Histidin) Reste sowie durch Threonin und Methionin ersetzt. Weiterhin wurden die nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäuren Benzoylphenylalanin (Bpa), Cyclohexylglycin (Chg) und Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic) verwendet.

Der Austausch von Alanin an Position 6 durch Asparaginsäure (P23) und Glutaminsäure (P24) führte zu einem Aktivitätsverlust. Im Einklang mit diesem Befund steht auch die geringe inhibitorische Wirkung der Peptide P37, P38 und P42 bis P45. Im Gegensatz dazu konnte durch Ersetzen von Alanin durch aromatischen Aminosäurereste Phenylalanin (P25 und P28), Tyrosin (P30), Histidin (P29), Bpa (P32) oder Tic (P34) die Aktivtät stark erhöht werden. Auch Verbindungen mit Methionin (P31) und Arginin (P26) zeigten eine erhöhte Aktivität. Peptide, die Threonin (P27) und Chg (P33) an Position 6 enthalten, zeigen eine ähnliche Aktivität wie die Ausgangsmoleküle.

Das Ersetzen von D-Prolin (P18) an Postition 5 durch D-Phenylalanin (P35) hatte einen keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung. Offensichtlich ist die D-Aminosäure nicht direkt an der Bindung an den Integrin-Rezeptor beteiligt. Ihre Funktion scheint ausschließlich darin zu bestehen, die aktive Komformation der pharmakophoren Reste zu induzieren. Daher ist diese Position frei zur weiteren Manipulation, z. B. zur Kopplung an Trägersubstanzen, Markierungsgruppen wie Fluoreszenzfarbstoffe oder zur D1- oder Multimerisierung.

Das Ersetzen von Alanin an Position 4 durch Asparaginsäure führte zu keiner Beeinträchtigung der inhibitorischen Wirkungen der Verbindungen (P10 bis P18, P17 bis P19 und P25 bis P28). Das Vorhandensein von Lysin (P39 bis P41) führte jedoch zu einer erheblichen Verringerung der Aktivität.

2.3 Selektivität für α₄β₇-Integrin

Neben der biologischen Aktivität ist auch die Selektivität eine wichtige Eigenschaft bei der Entwicklung von pharmakologischen Wirkstoffen. Zunächst wurde daher der Einfluss der Peptide P28 bis P31 auf die Bindung von humanen peripheren Blutlymphocyten (PBL) an Laminin untersucht. Diese Wechselwirkung wird hauptsächlich durch das Integrin α₆β₁ vermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die getesteten Verbindungen keinen Einfluss auf die α₆β₁ abhängige PBL-Adhäsion an Laminin zeigten (Tabelle 3). Kontrollexperimente zeigten, dass die Bindung PBL an MAdCAM-Ig durch diese Verbindungen stark gehemmt wurde.

Zur weiteren Bestimmung der Selektivität wurde die Fähigkeit der Peptide zur Hemmung der Bindung von α₄β₇-Integrin und des strukturelle verwandten α₄β₇-Integrins an VCAM-1 untersucht. Die durch α₄β₁-Integrin vermittelte Adhäsion wurde unter Verwendung von Jurkat-Lymphomzellen (α₄β₁+, α₄β₁-) getestet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass α₄β₇/VCAM-1 Wechselwirkungen auch durch Peptide P25 und P28 bis P31 inhibiert wurden, allerdings mit erheblich geringerer Stärke als die α₄β₇-Bindung an MAdCAM-1. Im Gegensatz dazu hatten die untersuchten zyklischen Peptide keinen Einfluss auf die Adhäsion von α₄β₁-Integrin an VCAM-1 (P25, P28 und P31) oder sie zeigten nur eine sehr geringe inhibitorische Wirksamkeit (P29 und P30). Die inhibitorische Wirksamkeit von P28 bis P30 für die α₄β₁ vermittelte Zelladhäsion an VCAM-1 waren jedoch erheblich geringer als die diejenige für die α₄β₇/MAdCAM-1 Wechselwirkung. Das negative Kontrollpeptid P46 hatte keinerlei inhibitorische Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Fig. 1 zusammengefasst.

3. Schlussfolgerungen

Die Verwendung von zyklischen Peptiden führte zur Identifizierung des zyklischen Hexapeptids P10 cyclo(L-D-T-A-p-A), welches ein Inhibitor der MAdCAM-1/α₄β₇-Integrinwechselwirkung ist. Die aktive Komfirmation der Verbindung P10 besteht aus 2 gegenüberliegenden β-Kehren mit dem D- Prolin an der Position i + 1 einer βII-Kehre und der Asparaginsäure an der Position i + 1 einer βI und/oder βII-Kehre. Ein systematischer Austausch der Aminosäurereste unter Beibehalt der Rückgratstruktur ergab mehrere zyklische Hexapeptide mit verbesserter Aktivität (P25, P28 bis P30). Die hohe Selektivität dieser Peptide zeigte sich durch ihre starke Hemmung der α₄β₇/MAdCAM-1 Wechselwirkung ohne signifikante Hemmung der α₄β₁/VCAM Wechselwirkung.

Die erfindungsgemäß identifizierten zyklischen Peptide, Salze und Additionsverbindungen sowie davon abgeleitete peptidische Verbindungen sind als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung oder Prävention von α₄β₇-Integrin assoziierten Krankheiten geeignet.

Beispiel 2

Neben den im Beispiel 1 angegegenen zyklischen Peptiden konnten noch weitere zyklische Peptide als aktiv identifiert werden. Es sind dies die Peptide DG403 c(L-D-F-D-p-F) und DG404-2 c(L-D-Phg-D-p-F), wobei Phg in D- oder/und L-Konfiguration vorliegen kann.

Die biologische Aktivität dieser Peptide ist in Tabelle 5 gezeigt. Es ist zu erkennen, dass die Peptide eine hohe und selektive inhibitorische Wirkung auf die α₄β₇/MAdCAM-Wechselwirkung besitzen.

Tabelle 1

Wirkung zyklischer Peptide auf die Bindung von 38-β7 Lymphomzellen an CHO-MAdCAM-1 Zellen

Tabelle 2

Wirkung zyklischer Peptide auf die Bindung von 38-β7 Lymphomzellen an MADcAM-Ig

Tabelle 3

Adhäsion von PBL-Zellen an Laminin in Gegenwart zyklischer Peptide

Tabelle 4

Spezifische Wirkung von zyklischen Peptiden auf die α₄β₇- und α₄β₁-Integrin vermittelte Zelladhäsion an MAdCAM-Ig und VCAM-1

Tabelle 5

Claims

1. Peptidische Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (Ia) oder (Ib):
c(X₁-D-X₂-X₃-X₄-X₅) (Ia)
c(X₁-D-X₃-X₃-X₅-X₄) (Ib)
worin
X₁ ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin- Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist ist - in L- Konfiguration vorliegt,
X₂ ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X₃ ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X₄ ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- Konfiguration vorliegt,
X₅ ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur der Formel (Ia) aufweisen.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass X₁ ein Aminosäurerest mit einer Leucin-Seitenkette ist.

4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass X₂ ein Aminosäurerest mit einer Threonin- oder Valin- Seitenkette ist.

5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass X₃ ein Aminosäurerest mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)-Seitenkette ist.

6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X₄ ein Aminosäurerest mit einer Prolin- oder Phenylalanin- Seitenkette ist.

7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X₅ ein Aminosäurerest mit einer aromatischen Seitenkette ist.

8. Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass X₅ ein Aminosäurerest mit einer Phenylalanin-, Tyrosin-, Histidin-, Bpa- oder Tic-Seitenkette ist.

9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X₅ ein Aminosäurerest mit einer Methionin- oder Arginin- Seitenkette ist.

10. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste jeweils unabhängig aus α- Aminocarbonsäureresten, β-Aminocarbonsäureresten, Aza- Aminosäureresten und Peptid-Aminosäureresten ausgewählt sind.

11. Verbindungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste aus α-Aminocarbonsäureresten ausgewählt sind.

12. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ausgewählt aus:
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln enthält.

14. Verwendung einer peptidischen Verbrückung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines α₄β₇-Inhibitors.

15. Verwendung nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Inhibitors, der für die Wechselwirkung zwischen α₄β₇-Integrinen und MAdCAM-1 selektiv ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15 zur Inhibierung von α₄β₇- Integrin vermittelten Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Wirkungen.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Diagnose, Prävention oder/und Therapie von Erkrankungen, die mit α₄β₇- Integrinen assoziiert sind.

18. Verfahren zur Inhibierung von α₄β₇-Integrinen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer wirksamen Dosis in ein α₄β₇-Integrin enthaltendes biologisches System einbringt.

19. Verfahren zur Diagnose, Prävention oder/und Therapie von Erkrankungen, die mit α₄β₇-Integrinen assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer wirksamen Dosis an ein bedürftiges Subjekt, z. B. einen Patienten, verabreicht.