DE10055368A1

DE10055368A1 - Verfahren zur Kennzeichnung von DNA enthaltenden Proben mittels Oligonukleotiden

Info

Publication number: DE10055368A1
Application number: DE10055368A
Authority: DE
Inventors: Gottfried Brem
Original assignee: Agrobiogen GmbH Biotechnologie
Current assignee: Agrobiogen GmbH Biotechnologie
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2002-05-29
Also published as: EP1332230A1; US20040072199A1; CA2428196A1; WO2002038804A1; AU2002221820A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kennzeichnung von DNA-enthaltenden Proben, bei dem mindestens ein Kennzeichnungs-Oligonukleotid mit der Probe zusammengebracht wird und die Probe zusammen mit dem Kennzeichnungs-Oligonukleotid einer Untersuchung unterworfen wird, wobei das Kennzeichnungs-Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus artifiziellen Mikrosatelliten-Oligonukleotiden oder artifiziellen Single-Nukleotide-Polymorphismus-Oligonukleotiden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kennzeichnung von DNA-enthaltenden Proben, bei dem mindestens ein Oligonukleotid als internes Kennzeichnungsmittel mit der Probe zusammengebracht wird und zusammen mit der Probe einer nachfolgenden Untersuchung unterworfen wird. Das Oligonukleotid ist dabei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus artifiziellen Mikrosatelliten-Oligonukleotiden oder artifiziellen Single Nukleotide Polymorphis mus-Oligonukleotiden.

Die zunehmende Bedeutung der Molekulargenetik und der damit einhergehende steigende Umfang an labordiagnostischen Untersuchungen führen dazu, daß eine immer größer werdende Zahl an Proben gewonnen, transportiert, gelagert und analysiert werden. Dabei tritt das Problem von Verwechslungen der Proben oder des Verlustes der Identität durch Verlust oder Un entzifferbarkeit der Kennzeichnung auf. So können insbesondere bei der Gewinnung und Lagerung von Proben im Rahmen von Reihenuntersuchungen oder bei der Erstellung von genetischen Ressourcen-Sammlungen Verwechslungen auftreten, welche die vorgenommenen Maßnahmen nichtig werden lassen. Dadurch können enorme Kosten entstehen beziehungsweise Werte verloren gehen.

Derzeit werden in vielen Bereichen des täglichen Lebens Proben gewonnen, gesammelt und für eine spätere Untersuchung eingelagert, wie beispielsweise bei der Kennzeichnung/Typisierung von Tieren, bei der Lebensmittelüberwachung, im human- und tiermedizinischen Bereich usw. In all diesen Fällen ist es erforderlich, eine zuverlässige Individualkennzeichnung der jeweils gewonnenen Proben vorzunehmen.

Dies wird derzeit im allgemeinen dadurch erreicht, daß die Behälter, in die die Proben eingebracht werden, gekennzeichnet werden, wie beispielsweise mit einem Barcode oder einfach von Hand, und der Behälter einem Individuum zugeordnet wird. Diese Art der Kennzeichnung weist jedoch Nachteile auf, da die Kennzeichnung auf dem Behälter verloren gehen oder unleserlich werden kann und nur solange mit den Proben verbunden bleibt, wie diese in den Behältern vorliegen.

Im Stand der Technik wurden verschiedene Verfahren zur Überwindung dieser Nachteile vorgeschlagen. So offenbart die WO 96/17954 ein Verfahren zur chemischen Kennzeichnung eines Objekts, wobei erfindungsgemäß mindestens zwei chemische Markierungen zum Einsatz kommen. Eine Markierung zeigt an, daß der Behälter selbst markiert ist, während die andere Markierung die eigentliche Kennzeichnung darstellt.

In der US-P-5,776,737 wird weiter ein Verfahren zur Identifikation von Proben offenbar, bei der der gewonnenen Probe Oligonukleotide zugesetzt werden, die nach einem anschließenden Amplifikationsschritt zusammen mit der Probe sequenziert werden. Die Oligonukleotide bestehen aus einem Primerbindungsbereich und einem Kennzeichnungsbereich, der aus einer alternierenden Abfolge der Nukleotide (MN)_x bzw. (MNN)_x besteht, wobei N das Nukleotid des Primerbindungsbereichs ist. Durch Sequenzierung des Kennzeichnungsbereich kann die Probe identifiziert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß die gewählten Oligonukleotide, insbesondere der Primerbindungsbereich, keine Sequenzen enthalten dürfen, die in dem Individuum selbst vorkommen, da andernfalls die Sequenzierung dieser Kennzeichnungs-Oligonukleotide durch endogene Sequenzen gestört werden würde.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein alternatives und vereinfachtes Verfahren zur Kennzeichnung von Proben bereitzustellen, das die im Stand der Technik vorhandenen Nachteile überwindet.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, bei dem eine Probe von einem Individuum gewonnen, die Probe mit einem Kennzeichnungs-Oligonukleotid zusammengebracht und die Probe dann zusammen mit dem Kennzeichnungs-Oligonukleotid einer Untersuchung unterworfen wird, wobei das Kennzeichnungs-Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus artifiziellen Mikrosatelliten-Oligonukleotiden (AMS-Oligonukleotide) oder artifiziellen Single Nukleotide Polymorphismus-Oligonukleotiden (ASNP-Oligonukleotide).

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Decodifizierung der Kenn zeichnungs-Oligonukleotide im gleichen Schritt und mit der gleichen Nachweismethode erfolgt, wie die Untersuchung der Proben-DNA und auf ein zeit- und kostenaufwendiges Sequenzierungsverfahren verzichtet werden kann. Hierdurch werden nicht nur die Arbeitsabläufe vereinfacht, sondern auch Fehlerquellen ausgeschlossen, die sich trotz üblicher Vorsichtsmaßnahmen bei zwei Arbeitsschritten ergeben können. Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß auch möglich, endogene Sequenzen in den Oligonukleotiden zu verwenden, was deren Auswahl erleichtert und die Fehlerhäufigkeit senkt.

In den Figuren sind,

Fig. 1 zeigt artifizielle Mikrosatelliten zur Herstellung von AMS-Typen zwecks Probenindivi dualisierung. Aus einem Satz von hier beispielhaft gewählt 20 Längen sind vier Beispiele (AMS(CTTC23)#1; AMS(CTTC23)#5, AMS(CTTC23)#12, AMS(CTTC23)#20 aufge führt.

Fig. 2 zeigt schematisch anhand von zwei Proben die Verwendung eines Oligo-Codes mit drei Längenstandards und 37 Variablen, der für die Typisierung von 137 Millionen Individualproben ausreicht. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, sind die drei Längenstandards #1, #20 und #40 in allen Proben enthalten.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Probengewinnungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe be stehend aus artifiziellen Mikrosatelliten-Oligonukleotiden (AMS-Oligonukleotiden) oder artifi ziellen Single-Nukleotide-Polymorphismus-Oligonukleotiden (ASNP-Oligonukleotiden).

Als artifizielle Mikrosatelliten-Oligonukleotide (AMS) im Sinne der vorliegenden Erfindungen werden Oligonukleotide verstanden, die zwei spezifische Randsequenzen enthalten (gleich oder verschieden am 3'- und 5'-Ende), zwischen denen sich eine uniforme DNA-Sequenz bestimmter Länge befindet, die mindestens 1 Base aufweist (die Verwendung von Tetrameren führt zu leicht auswertbaren Ergebnissen). Die Randsequenzen dienen bei der Decodifizierung als Primerbindungsstellen (PBS) für die PCR-Amplifikationen und weisen eine Länge auf, die eine Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden bei den jeweils gewählten Bedingungen ermöglicht, beispielsweise zwischen 10 und 15 bp. Die Fig. 1 zeigt einige artifizielle Mikrosatelliten mit internen Längen.

Eine Individualitätskennzeichnung wird nun durch unterschiedliche Kombinationen von AMS- Oligonukleotiden erhalten. So werden in einem ersten Schritt beispielsweise 40 verschiedene AMS-Oligonukleotide synthetisiert. Eine computergesteuerterte Vorrichtung wird nun mit diesen 40 AMS-Oligonukleotiden beladen und pipettiert aus diesen AMS nach einem EDV-Programm Individualkennzeichnungen zusammen, indem unterschiedliche Kombinationen aus diesen 40 AMS-Oligonukleotiden zusammengeführt werden, d. h. bestimmte AMS werden einpipettiert und andere werden weggelassen. Diese AMS-Oligonukleotid-Gemische werden entweder direkt in ein nachfolgend als Probenbehälter genutztes Gefäß eingebracht, das entweder bereits vorbe schriftet ist oder beim Befüllen markiert wird, oder in einem gekennzeichneten Vorratsbehälter zwischengelagert. Die Verbindung von AMS-Typ und direkt lesbarer Kennzeichnung erfolgt im EDV-Programm.

Durch unterschiedliche Kombinationen dieser artifiziellen Mikrosatelliten kann eine extrem hohe Variabilität erreicht werden. Bei einer Kombination von beispielsweise 64 verschiedenen AMS, können mehr als 2⁶⁴(< 18 Trilliarden) individuelle Kombinationen erstellt werden. Um für alle derzeit auf dem Globus lebenden Nutztiere individuelle AMS bereitzustellen ist lediglich eine Kombination von 32 verschiedenen AMS-Oligonukleotiden erforderlich. Die dafür benötigten Oligonukleotide sind leicht und kostengünstig zu synthetisieren.

Wenn die Probenbehälter befüllt werden, kommt der AMS-Typ, d. h. das bestimmte Gemisch der AMS-Oligonukleotide, in direkten Kontakt mit der Probe und vermischt sich mit dieser. Bei biologischen Proben sind die Oligonukleotide immer mindestens solange haltbar wie die Probe (DNA) selbst. Die Oligonukleotide können zudem auf Gegenstände aufgebracht werden, wobei in diesem Fall die Stabilität der Kennzeichnungs-Oligonukleotide vom Material und der Behand lung abhängen wird.

Zu Überprüfungszwecken bei der Analyse kann die Anwesenheit der AMS-Oligonukleotide relativ leicht und kostengünstig festgestellt werden, indem beispielsweise eine PCR mit zu den PBS komplementären Primern durchgeführt und die dabei erhaltenen Fragmente aufgetrennt und in geeigneter Weise dargestellt werden. Das so entstehende Muster (siehe Fig. 2) ist einzigartig und erlaubt die Zuordnung der Identität einer Probe zu einem Individuum.

Um die Sicherheit der Auswertung zu erhöhen, können Längenstandards eingesetzt werden, das sind Allele, die in jedem AMS-Typ vorkommen und damit durch ihr Vorhandensein beim Nachweis anzeigen, daß die PCR funktioniert hat und gleichzeitig einen Längenstandard bilden, in dem ein AMS der kürzeste, einer der längstmögliche und einer genau in der Mitte liegt. Eine weitere zusätzliche Sicherheit kann dadurch bereitgestellt werden, daß jedes AMS-Gemisch eine Mischung von zwei unterschiedlichen PBS enthält, die daher mit unterschiedlichen Primern amplifiziert werden. Ein Vergleich der beiden Muster, die identisch sein müssen, bestätigt die Richtigkeit und gibt zusätzlich Sicherheit. Sollte diese Aussagesicherheit noch nicht genügen, kann ein dritter AMS-Locus genutzt werden, der zwei Allele umfaßt, die für die Zahl der vorhandenen und für die Zahl der fehlenden Allele in den AMS-Typen stehen (z. B. bei Probe 1 in Fig. 2 18 Allele vorhanden und 22 fehlen).

Der Nachweis kann, wie vorstehend aufgeführt, über PCR-Amplifikation erfolgen. Eine Sequen zierung ist nicht erforderlich. Je nach Anwendung ist es zudem möglich, die vorher einge brachten AMS-Oligonukleotide direkt nachzuweisen, d. h. ohne Amplifikation den Längen polymorphismus der DNA-Fragmente gelelektrophoretisch, kapillarelektrophoretisch, massen spektrometrisch oder mit ähnlichen Verfahren nachzuweisen. Dieser Nachweis kann sehr schnell (einschließlich Isolation in weniger als 1 Stunde) und kostengünstig durchgeführt werden und kann zusammen mit einem Nachweis der Probe selbst erfolgen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, einen Code, beispielsweise einen Barcode oder auch Buchstabenkombinationen, direkt in DNA-Fragmente zu codieren. Dies erfolgt erfindungsgemäß mit artifiziellen Single Nukleotide Polymorphismus-Oligonukleotiden (ASNP-Oligonukleotide).

Als ASNP-Oligonukleotide werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Oligonukleotide verstanden, die an einer bestimmten Stelle des Oligonukleotids unterschiedlich sind. Diese ASNP-Oligonukleotide sind derart ausgestaltet, daß ein bestimmtes Nukleotid, das entweder endständig sein oder auch mitten im Oligonukleotid vorliegen kann, alternativ entweder ein C oder T bzw. ein A oder G ist. Damit können mit einem Oligo drei unterscheidbare Typen vorge geben werden (als Beispiel eines endständigen Polymorphismus):

TYP-homozygot CC

TYP-heterozygot CT

TYP-homozygot TT

Wenn mehrere verschiedene Oligonukleotide eingesetzt werden, können entsprechend der Formel 3ⁿ z. B. bei 10 Oligonukleotiden 59049 Typen codifiziert werden. Damit können bei Verwendung von Oligonukleotidsequenzen, die in der DNA der Spezies, von der die Sequenz stammt, vorkommen und die an dieser Position keine Variabilität oder die eine endogene A und G Variabilität aufweisen, artifizielle Kennzeichnungen vorgenommen werden.

Verwendet man Oligonukleotide, deren Sequenz in der Spezies nicht vorkommt, können auch die anderen beiden Nukleotide verwendet werden. Damit ergeben sich mit dem gleichen Oligo nukleotid aber dem anderen Nukleotidpaar drei weitere Typen:

TYP-homozygot AA

TYP-heterozygot AG

TYP-homozygot GG

Aus einer Kombination dieser Oligonukleotide mit 4 verschieden Nukleotiden können bei diallelischer Verwendung (d. h. zwei Oligonukleotide pro Probe) insgesamt 10 verschiedene Kombinationen realisiert werden:

AA, AC, AG, AT, CC, CG, CT, GG, GT, TT.

Damit ist es möglich, jede Zahl direkt in einen DNA-Code zu transformieren, indem Oligo nukleotide definiert werden, die für die Einer-, Zehner-, Hunderter-, Tausender-Stelle etc. stehen, z. B.:

Oligonukleotid für Einerstelle

Oligonukleotid für Zehnerstelle

Oligonukleoild für Hundertstelle

Oligo für Tausenderstelle

Die Oligos können zusätzlich zu der unterschiedlichen Sequenz auch in der Länge variabel gestaltet werden.

Für eine Codifizierung der Ziffern wird immer die gleiche Basenkombination verwendet (die variable Position, mit der die Ziffern kodifiziert werden, können an einer beliebigen Stelle der Oligonukleotide vorgesehen werden, d. h. auch in der Mitte).

So kann beispielsweise folgende Codifizierung für die Ziffern verwendet werden:

Gemäß diesem System kann z. B. die Zahl 2103 durch folgende Oligokombinationen codiert werden:

Mit 8 verschiedenen Oligonukleotiden kann somit jede 4-stellige Zahl dargestellt werden. Für eine 7-stellige Zahl würden entsprechend 14 Oligonukleotide benötigt. Durch diese Kopplung von einer Zahl zu einem Oligonukleotid kann eine Nummer, die mit der Probe assoziiert ist, beispielsweise auf der Ohrmarke aufgedruckt ist, direkt in einen Oligo-Code umgesetzt werden. Damit sind eine Ohrmarkennummer und die Probe, die sich in einem dazugehörigen Behälter befindet, untrennbar miteinander verbunden.

Aus der Genetik ist eine Anzahl von DNA-Polymorphismen bekannt, beispielsweise Satelliten DNA oder SNPs, die auch zur Typisierung von Individuen herangezogen wird. An jedem Genort, mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen oder bei chromosomalen Aberrationen, besitzt ein Individuum zwei Allele. Diese Allele können identisch oder verschieden sein. Durch die Analyse der Allele an mehreren bis vielen dieser Genorten erhält man ein für jedes Individuum charakteristisches Muster, einen Genotyp, der dieses Tier unverwechselbar kennzeichnet. Jedes Tier kann an einem Locus immer maximal nur zwei verschiedene Allele besitzen, aber in der Population können natürlich viele verschiedene Allele an einem Genort auftreten (multiple Allele). Dieser Polymorphismus ist die Grundlage für die DNA-Individualität von Organismen und kann zur Identifizierung von Individuen herangezogen werden.

Bei der Analyse einer Gewebe-/DNA-Probe eines Individuums auf ASNP-Genotypen, werden die ASNP-Oligonukleotide, die die Zahl kodifizieren, mit dem gleichen Verfahren, mit dem endogene SNPs identifiziert werden, automatisch mitanalysiert. Da das Nachweisverfahren identisch ist, sind die Kosten für die Analyse der Identitätsnummern vernachlässigbar gering. In einer gegenwärtig eingesetzten SNP-Analyse eines Rindes werden etwa 1 bis 200 SNPs analysiert. Mit nur 10% dieser Zahl kann eine Ohrmarkennummer mitidentifiziert werden und somit aus dem Ergebnis der SNP-Analyse nicht nur der Genotyp des Tieres an den SNP-Loci festgestellt werden, sondern quasi gleichzeitig seine Ohrmarkennummer abgelesen werden. Durch Vergleich dieser DNA-internen Nummer mit der vorgegebenen Nummer des Tieres, von dem die Probe gezogen wurde, kann sofort festgestellt werden, ob diese Angabe richtig ist, oder ob die Probe von einem anderen Tier gewonnen wurde. Indem die Zuordnung der Oligonukleotide zu den Ziffern frei gewählt werden kann, kann bei Geheimhaltung dieser Zuordnung eine Fälschung verhindert werden.

Beim Beladen der Probebehälter wird so vorgegangen, daß eine computergestützte Vorrichtung die Kombination für die Zehner-, Hunderter- und Tausenderzahlen entsprechend zusammenpipe ttiert und dann für die fortlaufende Nummer jeweils die beiden Oligonukleotide für die Einsernummer hinzufügt. Beim nächsten Zehner-, Hunderter-Sprung etc. wird das Stammge misch entsprechend vorbereitet und verwendet. Damit wird der Pipettieraufwand pro Sammelbehälter klein gehalten und der Vorgang ist schnell durchführbar. Zudem muß auch keine extra Protokollierung bzw. z. B. elektronische Datenkombination erfolgen, da der DNA-Code gemäß der Zuordnung später direkt aus den ASNPs abgelesen werden kann.

Ein für die vorliegende Erfindung besonders geeignetes System ist in der WO 99/61822 be schrieben, deren Inhalt hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird. Bei der in dieser Druck schrift offenbarten Ohrmarke können die Oligonukleotide in die Hohlspitze des Ohrmarkendorns eingebracht werden, und ggf. kann diese mit einer Schutzschicht versehen werden, um eine Verunreinigung zu vermeiden. Beim Gewinnen der Probe, das beispielsweise Durchstoßen eines Ohrs eines Nutztiers umfaßt, kommen die in dem Ohrmarkendorn vorliegenden Oligonukleotide mit der Probe in Kontakt, so daß die Probe immer anhand der Oligonukleotide identifiziert werden kann. Gleichermaßen können die Oligonukleotide in dem Probenbehälter vorgelegt werden.

Gemäß einer Ausführungsform kann der Probenbehälter zudem eine stark hygroskopische Substanz enthalten, wie in der DE 199 57 861.3 beschrieben ist, um die Lagerbeständigkeit der Probe zu verlängern.

Weiterhin kann die vorliegende Erfindung auch in einem Verfahren zur Untersuchung von Individuen einer Population eingesetzt werden, bei dem genomische DNA der Individuen, auf einer Matrix fixiert wird, so daß jedem Individuum ein bestimmtes identifizierbares Segment auf der Matrix zugeordnet wird (siehe DE 100 00 001). Bei der Probenentnahme wird der auf der Matrix zu fixierenden DNA ein Kennzeichnungsoligonukleotid zugesetzt und dieses gleichzeitig auf der Matrix fixiert. In der Folge kann über die Kennzeichnungsoligonukleotide immer festgestellt werden, welches Segment einem bestimmten Individuum zugeordnet ist.

Das folgende Beispiel dient der Veranschaulichung der mit der Erfindung einhergehenden Vorteile und soll den Bereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.

Beispiel

Ein zur Probengewinnung bei Nutztieren entwickeltes System, das eine mit der Entnahme des Probengewebes gleichzeitige Gewinnung von DNA-haltigen Proben ermöglicht und in der WO 99/61822 vorbeschrieben ist, wurde dazu verwendet werden, von 10 Rindern Proben zu nehmen. Anhand des in der vorstehend aufgeführten WO-Schrift beschriebenen Systems konnte eine Kennzeichnung der Rinder mit gleichzeitiger entsprechender Kennzeichnung der Probenbehälters erfolgen, wobei jeweils vorbeschriftete Teile für die Ohrmarke und den Behälter verwendet wurden.

Anschließend wurden in die Behälter unterschiedliche Gemische (100 pg) an vorab hergestellten Kennzeichnungs-Oligonukleotiden eingebracht, die mit den an den Ohrmarken und den Behäl tern assoziierten Markierungen assoziiert wurden und die Behälter wurden bei -80°C für 1 Woche gelagert.

Anschließend wurden aus 2 Behältern Proben entnommen und einer Amplifikation mittels PCR unterworfen (Reaktionsvolumen 15 µl, 0,5 µmol Primer, 0,2 µmol dNTPs, 2,5 U Taq (Hotstart- Polymerase von Applied Biosystems); 30 Zyklen; Annealen bei 60°C 30 Sek; Reaktion bei 72°C für 120 Sek; Denaturierung bei 95°C für 30 Sek) und die so erhaltenen Fragmente wurden auf einem Polyacrylamidgel (6%) aufgetrennt. Die Fig. 2 zeigt schematisch die Ergebnisse der Auftrennung. Die Codierung konnte aufgrund der vorab im Computer gespeicherten Zuordnung zu einem Behälter/zu einer Ohrmarke/zu einem Rind problemlos vorgenommen werden.

Claims

1. Verfahren zur Kennzeichnung von DNA-enthaltenden Proben, bei dem mindestens ein Kennzeichnungs-Oligonukleotid mit einer zu kennzeichnenden Probe zusammengebracht wird und die Probe zusammen mit dem Kennzeichnungs-Oligonukleotid einer Untersuchung unterworfen wird, wobei das Kennzeichnungs-Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus artifiziellen Mikrosatelliten-Oligonukleotiden oder artifiziellen Single- Nukleotide-Polymorphismus-Oligonukleotiden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die artifiziellen Mikrosatelliten eine Nukleotidsequenz bestimmter Länge aus Wiederholungen von Nukleotidfolgen aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ASNP-Oligonukleotide eine Nukleotidsequenz aufweisen, die für die Spezies, von der die Probe genommen wird exogen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ASNP-Oligonukleotide eine Nukleotidsequenz aufweisen, die für die Spezies, von der die Probe genommen wird endogen ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe in einen Behälter eingebracht wird, der ein Kennzeichnungs-Oligonukleotid enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Oligonukleotide in die Hohlspitze eines Ohrmarkendorns eingebracht werden, mit einer Schutzschicht versehen und beim Gewinnen der Probe mit dieser in Kontakt kommen.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Kennzeichnungs- Oligonukleotide einem numerischen oder alphanumerischen System zugeordnet werden.