DE10054093A1

DE10054093A1 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests

Info

Publication number: DE10054093A1
Application number: DE2000154093
Authority: DE
Inventors: Uwe Kempin
Original assignee: Pe Diagnostik GmbH
Current assignee: Pes Gesellschaft Fuer Medizinische Diagnose Systeme
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2020-11-02
Also published as: DE10054093B4

Abstract

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests zu finden, bei dem der Verfahrensablauf optimiert ist. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass DOLLAR A - analytspezifische Antikörper in der Art eines Paares verwendet werden; DOLLAR A - eine bekannte Menge des mit einem Fluorophor markierten Antikörpers mit einem Analyten unbekannter Antigenkonzentration gemischt wird; DOLLAR A - der nichtmarkierte Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert ist und das Antigen mit den gebundenen fluorophormarkierten Antikörpern gebunden wird; DOLLAR A - die Anzahl der auf der Oberfläche gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge aufzeigt; DOLLAR A - die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht werden, auf der das Antigen immobilisiert ist; DOLLAR A - die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper an das immobilisierte Antigen gebunden werden; DOLLAR A - die Anzahl der an das immobilisierte Antigen gebundenen fluorophormarkierten Antikörper aufgezeigt und DOLLAR A - die Antigenkonzentration im Analyten ermittelt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests, wobei analytspezifische Antikörper, die sich an Antigene binden und auf Oberflächen immobilisiert werden, mit einem Fluorophor markiert sind und durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die gebundene Antigenmenge ermittelt wird.

Die internationale Anmeldung WO 98/02732 beschreibt Vorrichtungen für Fluoreszenzimmuntest mit verschiedenen Prozessverläufen (Assays). Dabei können kompetitive Assays und Sandwichassays genutzt werden. Bei dem kompetitiven Assays wird eine bekannte Menge analytspezifischer Antikörper, die mit Fluorophor markiert sind, mit einer unbekannten zu quantifizierenden Menge Antigenen gemischt. Dabei muss die Menge der Antikörper größer sein als die Menge der Antigene. Die Antikörper binden an die Antigene an. Da die Menge der Antikörper größer ist als die Menge der Antigene, verbleiben ungebundene Antikörper im Analyten. Das so entstandene Gemisch aus nicht gebundenen markierten Antikörpern und an die Antigenen gebundenen Antikörpern wird mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht, auf der das Antigen immobilisiert wurde. An die immobilisierten Antigene binden die noch freien markierten Antikörper auf der Oberfläche an, während die schon gebundenen markierten Antikörper im Analyten oberhalb der Oberfläche verbleiben. Die Menge, der an der Oberfläche gebundenen Antikörper kann durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität quanitifziert werden. Die Menge der Antikörper, die an das auf der Oberfläche immobilisierte Antigen gebunden ist, verhält sich umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration, die nachgewiesen werden soll. Zum Anderen wird der sogenannte Sandwichassay vorgestellt. Voraussetzung hierfür ist, dass ein Paar von analytspezifischen Antikörpern existiert, die beide gleichzeitig an das Antigen binden können, ohne dass diese analytspezifischen Antikörper sich gegenseitig behindern. Dabei wird einer der beiden analytspezifischen Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Der andere der analytspezifischen Antikörper ist auf einer Oberfläche immobilisiert. Nach der Reaktion und Oberflächenanbindung des zweiten Antikörpers werden die Fluorophore bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und es wird ein Fluoreszenzsignal erhalten, das bei dieser Form des Immuntests direkt proportionale zur Antigenkonzentration ist.

Es ist allgemein bekannt, dass beim Sandwichassay die Nachweisgrenze kleiner und die Empfindlichkeit größer als beim kompetitiven Assay ist. Der Sandwichassay hat den Vorteil, dass bereits eine kleinere Antigenkonzentration ein erfassbares Signal erzeugt und auch kleine Änderungen bei geringen Antigenkonzentration ein erfassbares Signal empfindlich erkannt werden können. Demgegenüber hat der kompetitive Assay den Nachteil, dass kleine Antigenkonzentrationen bereits ein großes Signal erzeugen und entsprechend kleine Änderungen nur schwer gemessen werden können. Bei hohen Antigenkonzentrationen ist dieses Verhältnis gerade umgekehrt. Hierbei wird beim Sandwichassay ein kaum erfassbares Signal erzeugt, da die feste Phase zu schnell abgesättigt wird, und im zeitlichen Verlauf kein weiterer Anstieg der Fluoreszenz mehr erfolgt. Der kompetitive Assay ist hier bei den hohen Antigenkonzentrationen wegen der angesprochenen umgekehrten Proportionalität von Antigenkonzentration und Fluoreszenzintensität vorteilhafter. In der Praxis ist die Konzentration eines Analyten vor seiner Messung unbekannt, und daher nicht klar, welche Assayform, der Sandwich oder der kompetitive Assay, für die Bestimmung optimal ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests, wobei analytspezifische Antikörper, die sich an Antigene binden und auf Oberflächen immobilisiert sind, mit einem Fluorophor markiert sind und durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die gebundene Antigenmenge ermittelt wird, zu finden, bei der der Verfahrensablauf optimiert ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass

- analytspezifische Antikörper in der Art eines Paares verwendet werden, die beide an das Antigen, das mehr als eine Bindungsstelle aufweist, binden können, und eines der beiden Antikörper des Paares mit einem Fluorophor markiert ist;
- eine bekannte Menge des mit einem Fluorophor markierten Antikörpers mit einem Analyten unbekannter Antigenkonzentration gemischt wird, wobei die Anzahl der Bindungsstellen für diesen Antikörper größer ist als die Anzahl der Bindungsstellen auf dem Antigen;
- der andere nichtmarkierte Antikörper des Paares auf einer Oberfläche immobilisiert ist und das Antigen mit den daran gebundenen fluorophormarkierten Antikörpern gebunden wird;
- die Anzahl der auf der Oberfläche gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge nachfolgend aufzeigt;
- die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht wird, auf der das Antigen immobilisiert ist;
- die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper an das immobilisierte Antigen gebunden werden;
- die Anzahl der an das immobilisierte Antigen gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge aufzeigt und
- die Antigenkonzentration im Analyten aus den Werten der Sandwichassay-Messung und aus den Werten des kompetitiven Assays ermittelt wird.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand zweier Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die dazugehörige Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung eines kombinierten Sandwich-kompetitive-Assays für β-HCG und HCG.

1. Ausführungsbeispiel Bestimmung von Analyten mit stark unterschiedlichem Konzentrationsbereich

Das C-reactive Protein (Antigen) ist ein Protein aus der Familie der Pentraxine. Es besteht aus 5 nicht kovalent verbundenen Untereinheiten und hat eine Molmasse von 105 kDa. Seine mittlere Serumkonzentration liegt bei etwa 800 µg/l, und 99% der normalen Bevölkerung hat eine CRP-Konzentration von unter 10 mg/l. Dieser CRP-Wert kann bei Patienten mit bakteriellen Infektionen auf über 300 mg/l ansteigen, und daher ist seine Bestimmung für die medizinische Diagnostik interessant.

Zur Bestimmung wird ein definiertes Probenvolumen (z. B. 35 µl Serum), welches den zu bestimmenden CRP-Analyten enthält, mit einer definierten Messlösung, welche einen fluoreszenzmarkierten Anti-CRP spezifischen Antikörper (z. B. der Anti CRP-Antikörper Clone C6 der Firma Biodesign, der nachträglich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde) enthält versetzt und eine bestimmte Zeit (z. B. 2 Minuten) bei einer festgelegten Temperatur (z. B. Raumtemperatur) inkubiert. Hierdurch bindet der markierte Anti-CRP-Antikörper an den Analyten.

Diese inkubierte Lösung wird nun über zwei unterschiedliche Oberflächenbereiche geleitet. Auf dem einen Oberflächebereich ist für die Durchführung eines Sandwichassays ein weiterer Anti-CRP-Antikörper (wie z. B. der Anti-CRP-Antikörper Clone C2 der Firma Biodesign) immobilisiert. In diesem Bereich bindet das mit dem ersten Anti-CRP-Antikörper (Clone C6) verbundene CRP-Antigen (Analyt). Auf dem anderen Oberflächenbereich ist für die Durchführung eines kompetitiven Assays das Antigen CRP immobilisiert. In diesem Bereich bindet der fluorophormarkierte Anti-CRP-Körper, der nicht an das CRP-Antigen aus der Probe gebunden hat. An beiden Oberflächen wird nun durch Evanescentfeldanregung mit einer Lichtquelle und mit Hilfe eines Detektors das jeweilige Fluoreszenzlicht gemessen. Der CRP-Gehalt der Probe lässt sich nun mittels einer zuvor ermittelten Kalibrationskurve feststellen.

2. Ausführungsbeispiel Bestimmung von hCG

Das Protein hCG (Antigen) besteht aus einer α und einer β Polypeptid Untereinheit. Die α Untereinheiten der menschlichen hormonellen Glycoproteine (hLH, hFSH, hTSH, hCG) sind nahezug identisch. Die β Untereinheiten, welche ebenso einige identische Aminosäuresequenzen untereinander besitzen, sind unterschiedlich genug, um die biologische und immunologische Spezifität dieser Hormone zu erzeugen.

Zur Bestimmung des Protein hCG (Antigen) wird ein definiertes Probenvolumen (z. B. 35 µl Serum), welches den zu bestimmenden Analyten (hCG und β-hCG) enthält, mit einer definierten Messlösung, welche einen fluorophormarkierten Anti-β-HCG spezifischen Antikörper (z. B. der Anti hCG-Antikörper Clone 2F4/3 der Firma DPC Bierman, Kat. Nr. BM 290, der nachträglich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde) versetzt, und eine bestimmte Zeit (z. B. 2 Minuten) bei einer festgelegten Temperatur (z. B. Raumtemperatur) inkubiert. Hierdurch bindet der markierte Anti-β-HCG-Antikörper an das β-HCG, sowohl beim freien, wie auch beim gebundenen β-HCG der Probenlösung (siehe Fig. 1).

Diese inkubierte Lösung wird nun über zwei unterschiedliche Oberflächenbereiche geleitet. Auf dem einen Oberflächebereich ist für die Durchführung eines Sandwichassays ein weiterer Anti-β-hCG-Antikörper (wie z. B. der Anti-β-hCG-Antikörper Clone Bio-BCG-005 der Firma DPC Bierman) immobilisiert. In diesem Bereich bindet das mit dem ersten fluorophormarkierte Anti-β-hCG-Antikörper verbundene β-hCG-Antigen der Probenlösung (Analyt). Auf dem anderen Oberflächenbereich ist für die Durchführung eines kompetitiven Assays das Antigen HCG (oder alternativ auch β-HCG) immobilisiert. In diesem Bereich bindet der markierte Anti-β-hCG-Antikörper, der weder an das freie β-hCG noch an das hCG aus der Probe gebunden hat. An beiden Oberflächen wird nun durch Evanescentfeldanregung mit einer Lichtquelle und mit Hilfe eines Detektors das jeweilige Fluoreszenzlicht gemessen. Der β-hCG-Gehalt dieser Probe lässt sich nun mittels einer zuvor ermittelten Kalibrationskurve ermitteln. Aus dem Sandwichassay ist die Konzentration des β-hCGs in der Probe zu ermitteln, während aus dem kompetitiven Assay die gesamte hCG-Konzentration, d. h. β-hCG und hCG ermittelt werden kann. Auch die Konzentration von hCG ist hiermit bestimmt. Sie entspricht der Gesamt-hCG-Konzentration minus der β-hCG-Konzentration.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests, wobei analytspezifische Antikörper, die sich an Antigene binden und auf Oberflächen immobilisiert sind, mit einem Fluorophor markiert sind und durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die gebundene Antigenmenge ermittelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass
analytspezifische Antikörper in der Art eines Paares verwendet werden, die beide an das Antigen, das mehr als eine Bindungsstelle aufweist, binden können, und eines der beiden Antikörper des Paares mit einem Fluorophor markiert ist;
eine bekannte Menge des mit einem Fluorophor markierten Antikörpers mit einem Analyten unbekannter Antigenkonzentration gemischt wird, wobei die Anzahl der Bindungsstellen für diesen Antikörper größer ist als die Anzahl der Bindungsstellen auf dem Antigen;
der andere nichtmarkierte Antikörper des Paares auf einer Oberfläche immobilisiert ist und das Antigen mit den daran gebundenen fluorophormarkierten Antikörpern gebunden wird;
die Anzahl der auf der Oberfläche gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge nachfolgend aufzeigt;
die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht wird, auf der das Antigen immobilisiert ist;
die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper an das immobilisierte Antigen gebunden werden;
die Anzahl der an das immobilisierte Antigen gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge aufzeigt und
die Antigenkonzentration im Analyten aus den Werten der Sandwichassay-Messung und aus den Werten des kompetitiven Assays ermittelt wird.