DE10042840A1

DE10042840A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmikroskopmarkern bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie

Info

Publication number: DE10042840A1
Application number: DE2000142840
Authority: DE
Inventors: Werner Knebel; Juergen Hoffmann
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2002-03-14
Also published as: US20020024015A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie mit mindestens einem Beleuchtungsstrahlengang (1) einer das Beleuchtungslicht (26) erzeugenden Lichtquelle (2) und mindestens einem Detektionsstrahlengang (3) eines Detektors (4), wobei zu untersuchende Objekte (5) mit Fluoreszenzmarkern markiert sind. Damit nicht notwendigerweise die Beleuchtungsleistung der Lichtquelle erhöht werden muss, um eine Erhöhung der Fluoreszenzphotonenausbeute zu erzielen, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts (26), insbesondere während des Beleuchtungsvorgangs, mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts (26) beeinflussendes Mittel (11, 12) vorgesehen ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie mit mindestens einem Beleuchtungsstrahlengang einer das Beleuchtungslicht erzeugenden Lichtquelle und mindestens einem Detektionsstrahlengang eines Detektors, wobei zu untersuchende Objekte mit Fluoreszenzmarkern markiert sind.

Vorrichtungen der gattungsbildenden Art sind seit geraumer Zeit in der Praxis bekannt, lediglich beispielhaft wird auf den Artikel "Two-Photon Molecular Excitation in Laser-Scanning Microscopy" von W. Denk, D. W. Piston und W. W. Web, in: Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed.: J. B. Pawley, 1995, Seiten 445 bis 458, verwiesen. Dieser Artikel gibt einen umfangreichen Überblick über die Möglichkeiten und Vorteile der Mehrphoton- Rastermikroskopie. In der Mehrphoton-Rastermikroskopie werden Fluoreszenzmarker mit zwei- oder Mehrphotonen-Anregungsprozessen angeregt. Beispielsweise ist die Wahrscheinlichkeit eines Drei- Photonenübergangs von der dritten Potenz der Anregungslichtleistung abhängig. Solch hohe Lichtleistungen können beispielsweise mit gepulsten Lichtquellen erzielt werden, die Lichtpulse weisen hierbei eine Pulsdauer auf, die im Piko- oder Femtosekundenbereich liegen.

Die Anregung von Fluoreszenzmarkern mit Licht der Lichtquelle erfolgt üblicherweise durch die Beleuchtung des Objekts mit einem durch das Mikroskopobjektiv fokussierten Laserstrahl in einem Spot. Eine Beleuchtung des Objekts mit mehreren Spots ist ebenfalls üblich, wie es beispielsweise in der EP 0 539 691 A1 ausgeführt ist.

Lichtpulse bestehen prinzipiell immer aus Licht mehrerer Wellenlängen. Beispielsweise führt eine phasenstarre Überlagerung von Licht mehrerer Wellenlängen in einem Laser zur Pulsausbildung. Je höher die Anzahl der überlagerten Komponenten ist, desto kürzer ist der resultierende, von der Lichtquelle emittierte Puls.

Eilen Lichtanteile einer Wellenlänge in einem Laserpuls zeitlich den Lichtanteilen einer anderen Wellenlänge voraus, so handelt es sich hierbei um einen "gechirpten" Puls. Wenn die niedrigen Frequenzkomponenten eines Pulses vorauseilen, handelt es sich um einen positiven Chirp, während umgekehrt beim Vorauseilen von höheren Frequenzkomponenten es sich um einen negativen Chirp handelt.

Die aus kommerziell erhältlichen Lasersystemen stammenden Lichtpulse sind in der Regel ungechirpt, insbesondere dann, wenn es sich um Laserlicht aus einem modenverkoppelten Pulslaser handelt. Modenverkoppelte Pulslaser erzielen nur dann eine kurze Pulsdauer, wenn resonatorintern Elemente zur Gruppengeschwindigkeitsdispersionskompensation vorgesehen sind, die einen Chirp gerade vermeiden.

Aus den DE 196 22 359 A1 sowie DE 198 33 025 A1 sind jeweils optische Anordnungen bekannt, die zur Übertragung kurzer Laserpulse in Lichtleitfasern dienen. Diese optischen Anordnungen kompensieren die durch die Glaserfaser verursachten Gruppengeschwindigkeitsdispersionen (GVD: Group velocity dispersion), so dass die anzuregenden Fluoreszenzmarker mit Lichtpulsen beaufschlagt werden, die eine Pulsform aufweisen, die weitgehend der vom Laser emittierten Pulsform entspricht. Bei diesen Anordnungen ist der Grund für die GVD-Kompensation in der Maximierung der zur Mehrphonten-Fluoreszenz anregenden Pulslichtleistung gegeben, da die maximale Pulslichtleistung eines Lichtpulses in der Fokusregion eines Rastermikroskops bei vorgegebener mittlerer Lichtleistung um so größer ist, desto kürzer der Lichtpuls zeitlich ist. Die Fluoreszenzphotonenausbeute ist jedoch durch eine Erhöhung der Ausgangslichtleistung der Lichtquelle nicht beliebig steigerbar. Ab einer in der Regel von der Probe bzw. von den Fluoreszenzmarkern abhängigen Sättigungsinsentität befinden sich alle anregenbaren Fluoreszenzmarker im angeregten Zustand, so dass ein Laserpuls höherer Leistung keine Steigerung der Fluoreszenzphotonenausbeute erzielt, sondern dem zu untersuchenden Objekt thermischen Schaden zufügt.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie anzugeben, mit dem nicht notwendigerweise die Beleuchtungsleistung der Lichtquelle erhöht werden muss, um eine Erhöhung der Fluoreszenzphotonenausbeute zu erzielen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung der gattungsbildenden Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist eine solche Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts, insbesondere während des Beleuchtungsvorgangs, mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts beein flussendes Mittel vorgesehen ist.

Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass die Fluoreszenzausbeute nicht nur von der Lichtleistung eines Anregungspulses abhängt, sondern auch durch optimale Chirp-Anpassung an das Absorptionsverhalten der Fluoreszenzmarker auch bei gleichbleibender Lichtleistung optimiert werden kann. Weiterhin ist erkannt worden, dass Fluoreszenzmarker ein unterschiedliches Anregungsverhalten aufweisen, wenn die unmittelbare Umgebung der Fluoreszenzmarker sich verändert. Somit kann durch eine erfindungsgemäße Beeinflussung der spektralen Verteilung/ Zusammensetzung des Beleuchtungslichts zum einen die Fluoreszenz signalausbeute hinsichtlich der jeweiligen Umgebungseingenschaften optimiert bzw. angepasst werden, zum anderen können mit Hilfe geeigneter Messungen mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher spektraler Verteilung/ Zusammensetzung Rückschlüsse auf die unmittelbare Umgebung der Fluoreszenzmarker gezogen werden.

Die erfindungsgemäße Beeinflussung der spektralen Verteilung/ Zusammensetzung des Beleuchtungslichts bzw. des Chirps der Lichtpulse wird vorzugsweise während des Beleuchtungsvorgangs durchgeführt, d. h. während des Detektionsvorgangs der zu untersuchenden Objekte. Hierbei könnte die Beeinflussung der spektralen Verteilung/Zusammensetzung variabel erfolgen, d. h. sie wird während des Beleuchtungs- bzw. Detektionsvorgangs verändert.

Im Gegensatz zu der Vorgehensweise, Mittel zum Beeinflussen des Beleuchtungslichts derart vorzusehen, dass diese Mittel lediglich eine Pulsformveränderung der Lichtpulse kompensieren, die durch die Übertragung des Lichts durch eine Faser oder andere optische Elemente des Mikroskops hervorgerufen werden, ist hier in erfindungsgemäßer Weise vorgesehen, gezielt Veränderungen der spektralen Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts zu induzieren, um hierdurch beispielsweise die Fluoreszenzphotonenausbeute zu erhöhen.

In besonders vorteilhafter Weise ist vorgesehen, die erfidungsgemäße Beeinflussung variabel auszugestalten, d. h. während der Objektdetektion werden mehrere Beeinflussungsvorgänge durchgeführt bzw. angewendet, so dass hierdurch abhängig von der jeweiligen Beeinflussung gegebenenfalls unterschiedliche Signalantworten gemessen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lichtquelle eine Mehrphotonen lichtquelle, hiermit ist eine zur Mehrphotonenanregung geeignete Lichtquelle gemeint. Diese emittiert einzelne Pulse bzw. Pulszüge hoher Leistung, so dass die mit Fluoreszenzmarkern markierten Objekte, die in ein Mehrphotonen-Rastermikroskop eingebracht werden, über einen Mehrphotonenanregungsprozess zur Fluoreszenz angeregt werden können. Bei der Mehrphotonen-Lichtquelle handelt es sich im Konkreten um einen Titan:Saphir-Laser, der beispielsweise von einem Argon-Ionen-Laser gepumpt wird. Auch die Verwendung eines OPO's (Optisch parametrischer Oszillator) ist denkbar, ganz allgemein kann jede Laserlichtquelle geeigneter Wellenlängen und hinreichender Anregungslichtleistung eingesetzt werden.

In einer Ausführungsform ist das Mittel zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungslichts im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet. Beispielsweise kann das Mittel zwischen Lichtquelle und Objekt angeordnet sein, eine Anordnung des Mittels in einem Strahlengangabschnitt, der lediglich das Beleuchtungslicht umfasst, nicht jedoch das Detektionslicht, wird bevorzugt.

Das Mittel zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungslichts beeinflusst bevorzugt den Chirp. Hierbei könnte vorgesehen sein, dass den Lichtpulsen ein positver und/oder ein negativer Chirp aufgeprägt wird, wenn diese zunächst ungechirpt die Lichtquelle verlassen. Eine Beeinflussung von gechirpten, die Laserlichtquelle verlassenden Pulse ist ebenfalls vorgesehen.

Eine Alternative Realisierung der variablen Beeinflussung des Beleuchtungslichts könnte dadurch erzielt werden, dass das in modengekoppelten Lasern ursprünglich zur Dispersionskompensation vorgesehene Mittel zur Beeinflussung des Beleuchtungslichts dient. Hierbei wird das vorhandene Mittel zur Beeinflussung des Beleuchtungslichts der Laserlichtquelle verwendet, was in ganz besonders vorteilhafter Weise die Verwendung bzw. den Einsatz zusätzlicher optischer Komponenten nicht erforderlich macht. Es sind lediglich Vorkehrungen vorzusehen, die das Mittel zur Dispersionskompensation des modengekoppelten Lasers entsprechend ansteuern, regeln bzw. einstellen.

Als beeinflussendes Mittel könnte auch ein Gires-Tournois-Interferometer vorgesehen sein. Weiterhin könnte das beinflussende Mittel als Material ausgeführt sein, das eine geeignete Dispersion aufweist und dessen optisch wirksame Länge variierbar ist. Hierbei könnte es sich beispielsweise um eine aus der DE 198 33 025 A1 bekannte Vorrichtung handeln, nämlich beispielsweise um zwei zueinander verschiebbare Doppelkeile, wobei die äußeren Grenzflächen des Materials vom Beleuchtungslicht vorzugsweise orthogonal durchtreten werden, um einen Strahlversatz zu vermeiden.

Weiterhin könnte das beeinflussende Mittel mindestens einen Spiegel aufweisen, der den Chirp der Lichtpulse beinflusst. Ein solcher Spiegel besteht aus einem mit mehreren dielektrischen Beschichtungen versehenen Substrat, wobei Licht unterschiedlicher Wellenlängen unterschiedlich tief in die dielektrische Schicht eintreten kann, bevor es reflektiert wird.

Alternativ könnte als beinflussendes Mittel mindestens ein Gitter- und/oder Prismenpaar vorgesehen sein. Durch ein erstes Gitter bzw. Prisma wird das Beleuchtungslicht zunächst spektral aufgefächert, mit einem geeignet angeordneten zweiten Gitter bzw. Prisma kann der spektral aufgefächerte Beleuchtungsstrahl kollimiert werden. Durch die spektrale Auffächerung werden für die einzelnen spektralen Anteile optische Weglängenunterschiede erzeugt, die zu einer gezielten Beeinflussung der spektralen Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts genutzt werden. Um den kollimierten Beleuchtungslichtstrahl wieder in seine ursprüngliche Strahlform zu bringen, ist ein weiteres Gitter- und/oder Prismenpaar vorgesehen, das hinsichtlich der Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichts spiegelsymmetrisch zu dem ersten Gitter- bzw. Prismenpaar angeordnet ist. Das Gitter- bzw. Prismenpaar erzeugt vorzugsweise ein negative Gruppengeschwindigkeitsdispersion.

In einer alternativen Ausführungsform ist das beeinflussende Mittel des Beleuchtungslichts zwischen einem Gitterpaar und/oder einem Prismenpaar angeordnet. Hierbei wird das Beleuchtungslicht von einem ersten Gitter bzw. Prisma spektral aufgefächert und durchläuft das Mittel zur Beeinflussung des Beleuchtungslichts. Das beeinflusste Beleuchtungslicht wird von dem zweiten Gitter bzw. Prisma wieder zu einem kollimiert verlaufenden Lichtstrahl vereinigt.

In vorteilhafter Weise ist das Mittel zur räumlichen Modulation des Lichts in Abhängigkeit der Ortskoordinaten vorgesehen. Hierdurch können mehrere Bereiche des spektral aufgefächerten Lichts oder lediglich ein Bereich unabhängig moduliert bzw. beeinflusst werden.

Das Mittel zur räumlich Modulation könnte als LCD-Element (Liquid-Crystal- Device) ausgeführt sein, insbesondere in Form eines LCD-Rasters oder LCD- Streifenmusters, mit mehreren unabhängig voneinander ansteuerbaren bzw. einstellbaren Segmenten. Dieses LCD-Element ist in vorteilhafter Weise Pixel- oder streifenförmig ansteuerbar, so dass einzelne räumliche Bereiche gezielt variiert werden können. Das Mittel zur räumlichen Modulation dient zur Beinflussung der Phase, der Intensitiät und/oder der Polarisation des das Mittel durchlaufenden Lichts. In besonders vorteilhafter Weise ist das Mittel zur räumlichen Modulation in Abhängigkeit des detektierenden Fluoreszenzlichts regelbar. Insbesondere dient die Regelung zur Optimierung der Fluoreszenzlichtausbeute. Zur konkreten Ansteuerung der Mittel zur räumlichen Modulation ist der Einsatz genetischer Algorithmen vorgesehen, die nach der Vorgehensweise bei genetischen Algorithmen eine optimale Einstellung des Mittels zur räumlichen Modulation erzielt.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind mehrere Beleuchtungs teilstrahlengänge vorgesehen, in denen jeweils mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts beeinflussendes Mittel vorgesehen ist. Demgemäß wird der Beleuchtungsstrahlengang in mindestens zwei Teilstrahlengänge aufgeteilt. In einer konkreten Ausführungsform ist in jedem der Teilstrahlengänge ein Mittel zur Beeinflussung des Beleuchtungslichts vorgesehen. Beispielsweise könnte in einem Teilstrahlengang ein Prismenpaar als Mittel zur Beeinflussung des diesen Teilstrahlengang durchlaufenden Lichts vorgesehen sein, wohingegen in einem anderen Teilstrahlengang als beinflussendes Mittel ein Material geeigneter Dispersion vorgesehen ist, dessen optisch wirksame Länge variierbar ist. Die Beleuchtungsteilstrahlengänge beinilussen das die jeweiligen Beleuchtungsteilstrahlengänge durchlaufende Licht demgemäß jeweils unterschiedlich. Es könnte auch vorgesehen sein, das ein Beleuchtungsstrahlgang nicht beeinflusst wird. Die unterschiedlichen Beleuchtungsteilstrahlengänge werden an geeigneter Stelle mit einem Strahlteiler wiedervereinigt, so dass das unterschiedlich beinflusste Beleuchtungslicht letztendlich zur Objektbeleuchtung eingesetzt werden kann. Hierbei können die optischen Wege der einzelnen Beleuchtungsteilstrahlengänge derart gewählt werden, dass bei einer ursprünglich periodisch wiederkehrenden, definierten Pulsfolge der Lichtquelle nach der Wiedervereinigung der Beleuchtungsteilstrahlengänge eine definierte Pulsfolge der unterschiedlich beinflussten Pulse vorliegt.

Für bestimmte Applikationen ist eine Selektion der einzelnen Beleuchtungsteilstrahlengänge bzw. eines einzelnen Beleuchtungs teilstrahlengangs vorgesehen, so dass das jeweilige Objekt mit Licht angeregt wird, das einen Teilstrahlengang durchlaufen hat. Eine Selektion der einzelnen Beleuchtungsteilstrahlengänge mit einem schnellen optischen Schalter, beispielsweise in Form von akusto- oder elektrooptisch aktiven Komponenten, wäre ebenfalls denkbar. Diese Komponente wäre vorzugsweise jeweils in einem Beleuchtungsteilstrahlengang oder als Strahlvereinigunskomponente einzusetzen. In diesem Fall ist das Licht der Beleuchtungsteilstrahlengänge einander gegenseitig ausschließend selektierbar, d. h. das Objekt wird jeweils nur mit Beleuchtungslicht beaufschlagt, das jeweils nur einen Beleuchtungsteilstrahlengang durchlaufen hat.

In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die Eingangs genannte Aufgabe durch die Merkmale des nebengeordneten Patentanspruchs 22 gelöst. Danach ist ein Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen- Rastermiksroskopie dadurch gekennzeichnet, dass zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts, insbesondere während des Beleuchtungsvorgangs, mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts beinflussendes Mittel vorgesehen ist. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21 verwendet. Insbesondere zur Analyse der unmittelbaren Umgebung der Fluoreszenzmarker ist vorgesehen, dass die Fluoreszenzsmarker abwechselnd mit Lichtpulsen eines positiven und eines negativen Chirps angeregt werden. Die Erzeugung dieser unterschiedlich beinflussten Lichtpulse könnte mit einer bereits beschriebenen Vorrichtung erfolgen, die mehrere Beleuchtungsteilstrahlangänge aufweist, die das Beleuchtungslicht jeweils unterschiedlich beinflussen.

Das von den Lichtpulsen unterschiedlicher Chirps angeregte Fluoreszenzlicht wird entweder zeitlich und/oder räumlich unabhängig voneinander detektiert. Hierzu ist ein Synchronisationsschaltung zwischen der Lichtquelle und dem Detektor des Mehrphotonen-Rastermikroskops vorgesehen, so dass bei Kenntnis der Abfolge der unterschiedlich beinflussten Lichtpulse eine entsprechende detektorseitige Zuweisung der Detektionssignale in unterschiedliche Kanäle erfolgen kann. Sodann könnten die detektierten und getrennt registrierten Fluoreszenzsignale zu einer Weiterverarbeitung zueinander ins Verhältnis gesetzt werden, wodurch beispielsweise auf die Eigenschaften der Umgebung der Fluoreszenzmarker geschlossen werden kann.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 22 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels,

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels,

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines dritten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels und

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines alternativen Ausführungsbeispiels zu Fig. 3.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie mit einem Beleuchtungsstrahlengang 1 einer das Beleuchtungslicht 26 erzeugenden Lichtquelle 2 und einem Detektionsstrahlengang 3 eines Detektors 4. Die zu untersuchenden Objekte 5 sind mit Fluoreszenzmarkern markiert.

Bei dem Mehrphotonen-Rastermikroskop handelt es sich um ein konfokales Laser-Scanningmikroskop, wobei das Beleuchtungslicht 26 ein Anregungspinhole 6 passiert, und an einem dichroitischen Strahlteiler 7 in Richtung einer Strahlablenkvorrichtung 8 reflektiert wird. Der Beleuchtungslichtstrahl 1 wird von Strahlablenkvorrichtung 8 in zwei im wesentlichen senkrecht zueinander stehenden Richtungen gescannt und in Richtung der - lediglich schematisch dargestellten - Mikroskopoptik 9 reflektiert. Die Strahlablenkung der Strahlablenkvorrichtung 8 erfolgt mit Hilfe eines kardanisch aufgehängten und um zwei Achsen drehbaren Spiegels, der den Strahl in X- und in Y-Richtung ablenkt bzw. scannt.

Das Beleuchtungslicht 26 wird von der Mikroskopoptik 9 in bzw. auf das Objekt 5 fokussiert, wobei das Anregungspinhole 6 optisch zum Beleuchtungsfokus des Mikroskopobjektivs 9 korrespondierend angeordnet ist. Das vom Objekt 5 ausgesandte Fluoreszenzlicht durchläuft in umgekehrter Reihenfolge den Beleuchtungsstrahlengang 1, also zunächst das Mikroskopobjektiv 9, die Strahlablenkvorrichtung 8, bis hin zum dichroitischen Strahlteiler 7.

Der Detektionsstrahlengang 3 verläuft zwischen dem Objekt 5 und dem Detektor 4. Das Fluoreszenzlicht passiert den dichroitischen Strahlteiler 7. Zwischen dichroitischem Strahlteiler 7 und Detektor 4 ist ein Detektionspinhole 10 angeordnet, das optisch zum Beleuchtungsfokus des Mikroskopobjektivs 9 sowie zum Anregungspinhole 6 korrespondiert.

Die Verwendung eines Detektionspinholes 10 ist bei der Mehrphotonen- Rastermikroskopie nicht zwingend erforderlich, da aufgrund der Natur der Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung lediglich im Beleuchtungsfokus des Mikroskopobjektivs die Lichtinsentität genügend hoch ist, um dort mit genügend hoher Wahrscheinlichkeit Mehrphotonen-Fluoresezenzanregung zu induzieren. Demgemäß liefert der Mehrphotonen-Anregungsprozess eine Tiefenschärfendiskriminierung, die bei einer Einphotonen-Fluoreszenz anregung nur mit Hilfe eines Detektionspinholes erzielt werden kann.

Erfindungsgemäß ist zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts 26 während des Beleuchtungsvorgangs ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts 26 beinflussendes Mittel 11 vorgesehen. In Fig. 2 sind zwei unterschiedliche Mittel 11, 12 zur Beinflussung des Beleuchtungslichts 26 vorgesehen.

Bei der Lichtquelle 2 handelt es sich um einen modenverkoppelten Titan:Saphir-Laser, der als Mehrphotonenlichtquelle dient. Das Mittel 11 zur Beinflussung des Beleuchtungslichts 26 ist im Beleuchtungsstrahlengang 1 angeordnet. Die in den Fig. 1 und 2 gezeigten Mittel 11 bzw. 12 beinflussen den Chirp des Beleuchtungslichts 26.

Das beinflussende Mittel 11 der Fig. 1 und 2 ist als Material geeigneter Materialdispersion ausgeführt, dessen optisch wirksame Länge varierbar ist. Das Material ist hierbei in Form von zueinander verschiebaren Doppelkeilen 13 ausgeführt, die quer zur Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungsstrahls 26 verschoben werden können, so dass hierdurch die wirksame Dicke des Materials verändert werden kann. Der Zwischenraum zwischen den beiden Doppelkeilen 13 dient lediglich zur anschaulichen Darstellung, er ist zur Vermeidung von einer spektraler Auffächerung des Beleuchtungsstrahls 26 mit einem Immersionsmedium gefüllt, das nahezu den gleichen Brechungsindex sowie die gleichen Dispersionseigenschaften wie das Material des Mittels 11 aufweist.

In der Fig. 2 ist als beinflussendes Mittel 12 ein Prismenpaar 16, 17 vorgesehen.

In Fig. 2 ist gezeigt, dass der Beleuchtungsstrahl 26 auf ein erstes Prisma 16 auftrifft, das den Beleuchtungsstrahl 26 spektral auffächert. Das spektral aufgefächerte Licht trifft auf ein zweites Prisma 17, das den spektral aufgefächerten Beleuchtungsstrahl kollimiert. Zwei weitere Prismen 17, 16 überführen den Beleuchtungsstrahl 26 in seine ursprüngliche Form. Das die Prismenanordnung 16, 17 durchlaufende Beleuchtungslicht 26 wird in seiner Pulsform und seiner spektralen Zusammensetzung verändert, da die längerwelligen Anteile des Lichtpulses einen anderen optischen Weg durchlaufen als die kürzerwelligen Anteile des Pulses des räumlich spektral aufgefächerten Beleuchtungslichtstrahls 26. Die Veränderung der Pulsform ist hierbei auf die zurückgelegten Wege des Beleuchtungslichts 26 in den Prismen 17 zurückzuführen, da die von dem Prisma 16 spektral aufgefächerten Lichtanteile jeweils eine unterschiedlich lange Strecke in den Prismen 17 zurücklegen und dementsprechend unterschiedlich lang eine ihrer jeweiligen Wellenlänge entsprechende unterschiedliche Ausbreitungs geschwindigkeit in den Prismen aufweisen.

In den Fig. 3 und 4 ist das beeinflussende Mittel 19 zwischen einem Gitterpaar 14, 15 angeordnet. Das Beleuchtungslicht 26 wird von dem Gitter 14, das als Reflexionsgitter ausgeführt ist, reflektiert und spektral aufgefächert. Dieses Licht wird von dem Hohlspiegel 18 kollimiert und von einem weiteren Hohlspiegel 18 wieder zusammengeführt. Die spektrale Auffächerung des Beleuchtunglichtstrahls 26 wird durch das Gitter 15 rückgängig gemacht, so dass der Beleuchtungsstrahl 26 nach Durchlauf der Gitter- und Hohlspiegelanordnung 14, 15, 18 nahezu die ursprüngliche Strahlform aufweist. Anstelle der Verwendung der beiden Hohlspiegel 18 können zu einer vergleichbaren Strahlführung des in den Fig. 3 und 4 gezeigten Beleuchtungsstrahlabschnitts planare Spiegel in Verbindung mit Fokussierlinsen eingesetzt werden.

Bei dem Mittel 19 zur räumlichen Modulation handelt es sich um ein LCD- Streifenmuster, das die Phase des das Mittel 19 durchlaufenden Lichts 26 beinflusst. In dem spektral aufgefächerten Bereich erfolgt durch das Mittel 19 eine Modulation bzw. Beeinflussung des Lichts in Abhängigkeit der Ortskoordinate, d. h. durch gezielte Veränderung einzelner LCD-Streifen. Das LCD-Streifenmuster 19 wird mit Hilfe einer Ansteuereinheit 20 angesteuert.

In Fig. 4 ist gezeigt, dass das Mittel 19 zur räumlichen Modulation in Abhängigkeit von der Leistung des detektierten Fluoreszenzlichts geregelt wird. Hierzu ist zur Optimierung des Fluoreszenzlichtausbeute der Detektor 4 mit der Regeleinheit 21 des Mittels 19 verbunden. Danach wird das Mittei 19 zur räumlichen Modulation solange von der Regeleinheit 21 unterschiedlich angesteuert, bis der Detektor 4 maximale Fluoreszenzlichtleistung detektiert. Unterschiedlich in diesem Zusammenhang bedeutet, dass unterschiedliche Kombinationen der Einstellungen der Segmente des LCD-Streifenmusters eine jeweils unterschiedliche Phasenverzögerung der einzelnen spektralen Komponenten der das Mittel 19 durchlaufenden Lichtpulse bewirkt.

In Fig. 2 ist gezeigt, dass mehrere Beleuchtungsteilstrahlengänge 22, 23 vorgesehen sind, in denen jeweils ein die spektrale Verteilung/ Zusammensetzung des Beleuchtungslichts 26 beinflussendes Mittel 11, 12 vorgesehen ist. So ist im Beleuchtungsteilstrahlengang 22 ein Mittel 11 vorgesehen, das aus Material geeigneter Dispersion besteht und in seiner optisch wirksamen Länge variierbar ist. Im Teilstrahlengang 23 sind zwei Prismenpaare 16, 17 vorgesehen, die den Beleuchtungsteilstrahlengang 23 beinflussen. Die beiden Spiegel 24, 25 können - wie in Fig. 2 gezeigt - im Beleuchtungsstrahlengang 1 angeordnet werden Das Beleuchtungslicht 26 durchläuft dann den Beleuchtungsteilstrahlengang 23. Werden die beiden Spiegel 24, 25 in die gestrichelt gezeigte Position der Fig. 2 gebracht, so durchläuft das Beleuchtungslicht 26 der Lichtquelle 2 den Beleuchtungs teilstrahlengang 22. Dementsprechend sind die Beleuchtungsteil strahlengänge 22, 23 einander gegenseitig ausschließend selektierbar, d. h. entweder wird das Objekt 5 mit Licht beaufschlagt, das den Beleuchtungsteilstrahlengang 22 durchlaufen hat oder es wird mit Licht beaufschlagt, das den Beleuchtungsteilstrahlengang 23 durchlaufen hat.

Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Bezugszeichenliste

1

Beleuchtungsstrahlengang

2

Lichtquelle

3

Detektionsstrahlengang

4

Detektor

5

Objekt

6

Anregungspinhole

7

Dichroitischer Strahlteiler

8

Strahlablenkvorrichtung

9

Mikroskopoptik

10

Detektionspinhole

11

Mittel zur Beinflussung des Beleuchtungslichts

12

Mittel zur Beinflussung des Beleuchtungslichts

13

Doppelkeil von (

11

)

14

Gitter

15

Gitter

16

Prisma

17

Prisma

18

Hohlspiegel

19

Mittel zur räumlichen Modulation

20

Ansteuereinheit von (

19

)

21

Regeleinheit von (

19

)

22

Beleuchtungsteilstrahlengang

23

Beleuchtungsteilstrahlengang

24

Spiegel

25

Spiegel

26

Beleuchtungslicht

Claims

1. Vorrichtung zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen- Rastermikroskopie mit mindestens einem Beleuchtungsstrahlengang (1) einer das Beleuchtungslicht (26) erzeugenden Lichtquelle (2) und mindestens einem Detektionsstrahlengang (3) eines Detektors (4), wobei zu untersuchende Objekte (5) mit Fluoreszenzmarkern markiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts (26), insbesondere während des Beleuchtungsvorgangs, mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts (26) beeinflussendes Mittel (11, 12) vorgesehen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (2) eine Mehrphotonen-Lichtquelle ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (11) im Beleuchtungsstrahlengang (1) angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (11) den Chirp des Beleuchtungslichts (26) beeinflusst.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das in modengekoppelten Lasern zur Dispersionskompensation vorgesehene Mittel zur Beeinflussung des Beleuchtungslichts (26) dient.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als beeinflussendes Mittel ein Gires-Tournois-Interferometer vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das beeinflussendes Mittel (11) als Material geeigneter Dispersion ausgeführt ist, dessen optisch wirksame Länge variierbar ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in Form von zueinander verschiebbaren Doppelkeilen (13) ausgeführt ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das beeinflussendes Mittel mindestens einen Spiegel aufweist, der den Chirp des Beleuchtungslichts (26) beeinflusst.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als beeinflussendes Mittel (12) mindestens ein Gitterpaar (14, 15) und/oder Prismenpaar (16, 17) vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gitterpaar (14, 15) oder Prismenpaar (16, 17) eine negative oder positive Gruppengeschwindigkeitsdispersion aufweist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das beeinflussende Mittel (19) zwischen einem Gitterpaar (14, 15) und/oder einem Prismenpaar (16, 17) angeordnet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (19) zur räumlichen Modulation des Lichts in Abhängigkeit der Ortskoordinaten vorgesehen ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur räumlichen Modulation (19) als LCD-Element (Liquid-Crystal- Device) ausgeführt ist, insbesondere in Form eines LCD-Rasters oder LCD-Streifenmusters.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (19) zur räumlichen Modulation die Beeinflussung der Phase, der Intensität und/oder der Polarisation des das Mittel (19) durchlaufenden Lichts (26) bewirkt.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (19) zur räumlichen Modulation in Abhängigkeit des detektierten Fluoreszenzlichts regelbar ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Regelung zur Optimierung der Fluoreszenzlichtausbeute dient.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Beleuchtungsteilstrahlengänge (22, 23) vorgesehen sind, in denen jeweils mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts beeinflussendes Mittel (11, 12) vorgesehen ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsteilstrahlengänge (22, 23) das die jeweiligen Beleuchtungsteilstrahlengänge (22, 23) durchlaufende Licht jeweils unterschiedlich beeinflussen.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Beleuchtung dienende Licht aus den einzelnen Beleuchtungsteilstrahlengängen (22, 23) selektierbar ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der Beleuchtungsteilstrahlengänge (22, 23) einander gegenseitig ausschließend selektierbar ist.

22. Verfahren zur Anregung von Fluoreszenzmarkern bei der Mehrphotonen- Rastermikroskopie mit mindestens einem Beleuchtungsstrahlengang (1) einer das Beleuchtungslicht (26) erzeugenden Lichtquelle (2) und mindestens einem Detektionsstrahlengang (3) eines Detektors (4), wobei zu untersuchende Objekte (5) mit Fluoreszenzmarkern markiert sind, vorzugsweise unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur variablen Beeinflussung des die Fluoreszenzmarker anregenden Beleuchtungslichts (26), insbesondere während des Beleuchtungsvorgangs, mindestens ein die spektrale Verteilung/Zusammensetzung des Beleuchtungslichts (26) beeinflussendes Mittel (11, 12) vorgesehen ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzmarker abwechselnd mit Lichtpulsen eines positiven und negativen Chirps angeregt werden.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das von Lichtpulsen unterschiedlicher Chirps angeregte Fluoreszenzlicht räumlich und/oder zeitlich unabhängig voneinander detektiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der getrennt detektierten Fluoreszenzlichtintensitäten gebildet wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Umgebung der Fluoreszenzmarker gezogen werden.