DE10014412A1 - Expressionsvektoren zur Anreicherung eines rekombinant hergestellten Proteins in unterschiedlichen Zellkompartimenten - Google Patents
Expressionsvektoren zur Anreicherung eines rekombinant hergestellten Proteins in unterschiedlichen ZellkompartimentenInfo
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Abstract
Beschriebne wird ein Expressionsvektor (A), der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens zwei Kopien eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens jeweils mit einem Promotor funktionell verknüpft enthält, oder eine Zusammensetzung (B), die mindestens zwei Expressionsvektoren umfaßt, die jeweils mindestens eine Kopie eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft enthalten, wobei die einzelnen Genkopien dadurch gekennzeichnet sind, daß sie (a) für das gewünschte Protein (I) als Fusionsprotein mit einem gewünschten Lokalisierungssignal (II) kodieren; wobei (b) bei den einzelnen Genkopien der für (I) kodierende Anteil im wesentlichen identisch, der für (II) kodierende Anteil jedoch unterschiedlich ist, wobei nach Einschleusen des Expressionsvektors (A) oder der Zusammensetzung (B) in einen Wirt das gewünschte Protein in unterschiedliche Kompartimente des Wirts transportiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung (C), die mindestens einen in Plastiden lokalisierten und einen in Mitochondrien lokalisierten Expressionsvektor umfaßt, die jeweils mindestens eine Kopie eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft enthalten, wobei die einzelnen Expressionsvektoren dadurch gekennzeichnet sind, daß die einzelnen Genkopien im wesentlichen identisch sind und das gewünschte Protein in den Plastiden und Mitochondrien des Wirts exprimiert wird. Die ...
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor (A), der dadurch gekennzeichnet
ist, daß er mindestens zwei Kopien eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens
jeweils mit einem Promotor funktionell verknüpft enthält, oder eine Zusammensetzung (B),
die mindestens zwei Expressionsvektoren umfaßt, die jeweils mindestens eine Kopie eines
für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft
enthalten, wobei die einzelnen Genkopien dadurch gekennzeichnet sind, daß sie (a) für das
gewünschte Protein (I) als Fusionsprotein mit einem gewünschten Lokalisierungssignal (II)
kodieren; wobei (b) bei den einzelnen Genkopien der für (I) kodierende Anteil im
wesentlichen identisch, der für (II) kodierende Anteil jedoch unterschiedlich ist, wobei nach
Einschleusen des Expressionsvektors (A) oder der Zusammensetzung (B) in einen Wirt das
gewünschte Protein in unterschiedliche Kompartimente des Wirts transportiert wird. Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung (C), die mindestens einen in
Plastiden lokalisierten und einen in Mitochondrien lokalisierten Expressionsvektor umfaßt,
die jeweils mindestens eine Kopie eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens mit
einem Promotor funktionell verknüpft enthalten, wobei die einzelnen Expressionsvektoren
dadurch gekennzeichnet sind, daß die einzelnen Genkopien im wesentlichen identisch sind
und das gewünschte Protein in Plastiden und Mitochondrien des Wirts exprimiert wird. Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Kombination der vorstehenden Ausführungsformen.
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren/Zusammensetzungen finden Verwendung in
einem Verfahren, das die Steigerung der Produktionsrate für rekombinante Proteine erlaubt.
Inzwischen werden die meisten Proteine von kommerziellem Interesse in pro- oder
eukaryotischen Wirtsorganismen rekombinant hergestellt. Während die Expressionsraten in
prokaryotischen Organismen, insbesondere in Bakterien, oft sehr hoch sind (bis zu 50% des
Gesamtproteins), werden in eukaryotischen Zellen oft nur geringe Expressionsraten erzielt
(deutlich unter 1% bis höchstens zu wenigen Prozenten im Vergleich zu dem löslichen
Gesamtprotein). Somit ist die Expression eines gewünschten Proteins in Bakterien in vielen
Fällen bevorzugt. Allerdings tritt hier oft das Problem der Bildung von "inclusion bodies"
(Einschlußkörpern) auf, in denen das überproduzierte Protein in denaturierter Form vorliegt.
Die natürlichen Biosynthese-Apparate von Pflanzenzellen sind in der Lage, auch solche,
z. T. komplexe, Proteine zu synthetisieren, die der Expression in prokaryotischen Zellen
nicht zugänglich sind. Allerdings sind die Expressionsraten in Pflanzenzellen oft sehr gering
und in verschiedenen Kompartimenten dieser Zellen auch unterschiedlich. Dies wurde z. B.
bei rekombinanten scFv-Antikörpern in transgenen Pflanzen hinsichtlich der Kompartimente
Cytoplasma, Apoplast und endoplasmatisches Retikulum (ER) untersucht (Conrad und
Fiedler, Plant Molecular Biology 38 (1998), 101-109). Es zeigte sich, daß eine
cytoplasmatische Expression von scFv-Antikörpern kaum realisierbar war, nur in
Einzelfällen konnten überhaupt Expressionsraten nachgewiesen werden, wobei diese
allerdings extrem gering waren. Die subzelluläre Lokalisation im endoplasmatischen
Retikulum (ER) führte dagegen sowohl in Samen von Tabak oder Arabidopsis (Conrad und
Fiedler, supra) als auch in Kartoffelknollen (Artsaenko et al., Molecular Breeding 4 (1998),
313-319) zu einer effizienteren Produktion des Fremdproteins. Apoplastische Expression
konnte ebenfalls nachgewiesen werden, wenn auch nur mit etwa einem Zehntel der Menge
im Vergleich zur Lokalisation im ER.
Andererseits ist bekannt, daß in der Natur bestimmte Proteine in mehrere subzelluläre
Kompartimente einer Zelle gleichzeitig sortiert werden. So wird z. B. in Erbsen die
Glutathion-Reduktase aufgrund des Vorhandenseins einer einzigen Prosequenz sowohl in
Chloroplasten als auch in Mitochondrien transportiert (Creissen et al., Plant Journal 8
(1995), 167-175). Bezüglich der rekombinanten Produktion von Proteinen, beispielsweise in
Pflanzenzellen, ist allerdings zu betonen, daß ein bestimmtes Kompartiment einer
Pflanzenzelle aus biologischen und physikalischen Gründen nur eine begrenzte
Speicherfähigkeit für ein zu produzierendes Protein aufweist, da der notwendige
physikalische Speicherplatz mit anderen Proteinen geteilt werden muß. Außerdem sind
teilweise bei Proteinfaltung und -transport Chaperone und Rezeptoren beteiligt. Bei hohen
Expressionsraten kann demzufolge eine Überlastung des Transportapparates oder der
Speicherkapazität der Pflanzenzelle eintreten. Dies hat zur Folge, daß deren maximal
mögliche Fremdproteinbiosynthese-Kapazität aufgrund der eingeschränkten
Leistungsfähigkeit des Transkriptions- und Translationsapparates nicht vollständig
ausgenutzt wird. Schließlich gibt es in Pflanzenzellen neben dem Kerngenom und dessen
Transkriptions- und Translationsapparat zwei weitere Genome mit (zumindest teilweise)
eigenständigen Transkriptions- und Translationsapparaten, nämlich die der Plastiden und
Mitochondrien. Erfolgt eine Integration des Fremdgens allerdings ausschließlich in eines
dieser Genome, so wird nur ein Teil der maximal möglichen Fremdproteinbiosynthese-
Kapazität des zellulären Stoffwechsels genutzt. Außerdem wird durch ein
Expressionskonstrukt mit nur einem definierten Targetting-Signal nur das Speicherpotential
eines subzellulären Kompartimentes genutzt. Die vorstehend beschriebenen Probleme
hinsichtlich der Effizienz der rekombinanten Herstellung von Proteinen in Eukaryoten,
insbesondere Pflanzen, wirdn bisher nicht bzw. nur wenig zufriedenstellend gelöst. Auch
beschränkte sich die Fachliteratur bisher nur auf die Schilderung von Experimenten
hinsichtlich der vergleichenden Bestimmung der Expressionsraten in einzelnen
subzellulären Kompartimenten.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel zur
Steigerung der Ausbeute von in Eukaryoten rekombinant hergestellten Fremdproteinen zur
Verfügung zu stellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den
Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das die bisher im Stand der Technik
vorhandenen Beschränkungen in der Effizienz der Fremdproteinbiosynthese in Eukaryoten,
insbesondere in Pflanzenzellen, minimiert. So bietet sich für das "Molecular Farming" in
transgenen Pflanzen durch die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, wesentliche
Erhöhungen der Expressionsraten fremder Proteine zu erreichen. Im Gegensatz zu den
bisherigen Vorgehensweisen wird dabei das zu produzierende Protein nicht in ein einziges
subzelluläres Kompartiment geleitet und nur das Speicherpotential dieses einen
Kompartimentes genutzt, vielmehr werden in einer Ausführungsform zwei oder mehrere
homologe Gene für die Expression eines definierten Proteins in die Wirtszelle eingebracht,
wobei sich die dadurch kodierten Proteine darin unterscheiden, daß sie Targetting-Signale
(Lokalisierungssignale) für unterschiedliche subzelluläre Kompartimente enthalten.
Beispielsweise kann ein diagnostischer scFv-Antikörper durch Fusion mit einem
Signalpeptid in den Apoplasten, gleichzeitig aber auch durch Fusion mit einem anderen
Signalpeptid und mit dem KDEL-Targetting-Signal im ER lokalisiert werden. Somit werden
beispielsweise die Speicherpotentiale des ER und des Apoplasten gleichzeitig genutzt.
Weiterhin können zusätzlich Gene eingebracht werden, die für vakuolär oder im Golgi-
Apparat lokalisierte scFv-Antikörper kodieren. Somit können in diesem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung die Speicherpotentiale von vier subzellulären Kompartimenten
miteinander kombiniert werden. In einer alternativen Ausführungsform werden die
Fremdproteine nicht durch nukleäre Expression und Transport in Organellen, d. h. Plastiden
oder Mitochondrien, produziert, sondern die entsprechenden Gene werden durch direkte
Transformation von Plastiden oder Mitochondrien mittels geeigneter Vektoren in diese
Organellen eingeschleust und das für das betreffende Protein kodierende Gen direkt in
diesen Kompartimenten exprimiert. Beide Vorgehensweisen können kombiniert werden, d. h.
in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Speicherpotential
von bestimmten Kompartimenten, z. B. von Plastiden oder Mitochondrien, dadurch
effizienter ausgenutzt, daß sowohl eine Organellen- als auch eine Kerntransformation mit
den entsprechenden Genen durchgeführt wird, also die direkte Proteinsynthese in
Organellen mit der nukleären Proteinsynthese und nachfolgendem Transport des Proteins
in die Organellen, d. h. Plastiden und Mitochondrien, mittels geeigneter Signalsequenzen
kombiniert wird. Mit der vorliegenden Erfindung können somit die einzelnen
Speicherkapazitäten typischer Speicherkompartimente, wie z. B. der Plastiden, des
endoplasmatischen Retikulums oder von Speichervakuolen, kombiniert und synergistisch
ausgenutzt werden.
Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen Expressionsvektor
(A), der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens zwei Kopien eines für ein
gewünschtes Protein kodierenden Gens jeweils mit einem Promotor funktionell verknüpft
enthält, oder eine Zusammensetzung (B), die mindestens zwei Expressionsvektoren
umfaßt, die jeweils mindestens eine Kopie eines für ein gewünschtes Protein kodierenden
Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft enthalten, wobei die einzelnen Genkopien
dadurch gekennzeichnet sind, daß sie (a) für das gewünschte Protein (I) als Fusionsprotein
mit einem gewünschten Lokalisierungssignal (II) kodieren, wobei (b) bei den einzelnen
Genkopien der für (I) kodierende Anteil im wesentlichen identisch, der (II) kodierende Anteil
jedoch unterschiedlich ist, wobei nach Einschleusen des Expressionsvektors (A) oder der
Zusammensetzung (B) in einen Wirt das gewünschte Protein in unterschiedliche
Kompartimente des Wirts transportiert wird.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine
Zusammensetzung (C), die mindestens einen in Plastiden lokalisierten und einen in
Mitochondrien lokalisierten Expressionsvektor umfaßt, die jeweils mindestens eine Kopie
eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Gans mit einem Promotor funktionell
verknüpft enthalten, wobei die einzelnen Expressionsvektoren weiter dadurch
gekennzeichnet sind, daß die einzelnen Genkopien im wesentlichen identisch sind und das
gewünschte Protein in den Mitochondrien und Plastiden des Wirts exprimiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die beiden
vorstehenden Ausführungsformen kombiniert, d. h., es wird sowohl eine Organellen- als
auch eine Kerntransformation mit den für das gewünschte Protein kodierenden Genen
durchgeführt, also die direkte Proteinsynthese in Organellen, d. h. in Plastiden und
Mitochondrien, mit der nukleären Proteinsynthese und nachfolgendem Transport des
Proteins in die Organellen durch die Verwendung von Expressionsvektoren, bei denen das
gewünschte Protein mit geeigneten Signalsequenzen verknüpft ist, kombiniert. Vektoren
bzw. Vektorsequenzen, die die Expression des gewünschten Proteins in Organellen, d. h. in
Plastiden oder Mitochondrien, erlauben, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird
auf Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 8526-8530; Khan and Maliga,
Nature Biotechnology 1 (1999), 910-915; Sidorov et al., Plant Journal 19 (1999), 209-
216 verwiesen.
Der hier gebrauchte Ausdruck "im wesentlich identisch" bezüglich der einzelnen Genkopien
bedeutet, daß die davon kodierten Proteine zumindest über die gleiche biologische Aktivität
verfügen. Die einzelnen Genkopien können z. B. Modifikationen enthalten, die für die
Expression des Gens, beispielsweise in Abhängigkeitt von der Expression in bestimmten
Organellen, von Vorteil sind; vgl. dazu auch den nachstehenden Abschnitt zu "gene
silencing".
Verfahren zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die für das gewünschte Gen in
exprimierbarer Form enthalten, sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise auch in
gängigen Standardwerken beschrieben (vgl. z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY). Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können auf einem Plasmid, Cosmid,
Virus, Bacteriophagen oder einem anderen in der Gentechnik üblichen Vektor basieren.
Diese Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des
Vektors im Wirtsorganismus bewirken. Ferner können bei Verwendung einer Pflanze als
Wirtsorganismus "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA
enthalten sein, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird.
Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der
Transkription sowie der Addition einer Poly-A-Sequenz an das Transkript dient. Derartige
Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und
beliebig austauschbar.
Die mit dem gewünschten Protein zu fusionierende Signalsequenz richtet sich nach dem
Zellkompartiment, in das der Transport des Proteins erfolgen soll. Geeignete
Signalsequenzen (Signalpeptide) und für diese kodierenden DNA-Sequenzen sowie
Verfahren zur Verknüpfung mit dem gewünschten Protein, z. B. einem scFv-Antikörper, auf
eine solche Weise, daß sowohl das Protein noch aktiv ist als auch der Transport in das
gewünschte Zellkompartiment erfolgt, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird auf
das Signalpeptid der α-Amylase aus Gerste hinsichtlich des Apoplasten (Düring et al., Plant
Journal 3 (1993), 587-598), auf die Kombination aus Maus-Signalpeptid und KDEL-ER-
Retentionssignal hinsichtlich des ER (Artsaenko et al., supra), auf das Targetting einer
Säuger-α-2,6-Sialyltransferase hinsichtlich des Golgi-Apparats (Wee et al., Plant Cell IV
(1998), 1759-1768, auf das Vakuolen-Lokalisierungssignal einer vakuolären Chitinase aus
Gurke hinsichtlich der Vakuolen (Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
10362-10366), auf das Ferredoxin-Transitpeptid hinsichtlich der Chloroplasten und
Plastiden, und auf das Transitpeptid von Tryptophanyl-t RNA-Snthetase aus Hefe
hinsichtlich der Mitochondrien (Schmitz and Lonsdale, Plant Cell 1 (1989), 783-791)
verwiesen.
Für die Expression des für das gewünschte Protein kodierenden Gens geeignete
Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise bei der
Verwendung einer Pflanze als Wirtsorganismus der Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor
(Odell et al., Nature 313 (1995), 810-812) der Agrobacterium tumefaciens Nopalin
Synthase Promotor und der Mannopin Synthase Promotor (Harpster et al., Molecular and
General Genetics 212 (1988), 182-190). Das für das gewünschte Protein kodierende Gen
kann auch mit einem induzierbaren Promotor verknüpft sein, was z. B. die Steuerung der
Synthese des gewünschten Proteins z. B. in einer transgenen Pflanze, zu einem
gewünschten Zeitpunkt erlaubt, wie bei der nachstehend beschriebenen Nach-Ernte-
Produktionstechnologie. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu
zählen beispielsweise der anaerob induzierbare Gap C4 Promotor aus Mais (Bülow et al.,
Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 182-188), PR-Promotoren, wie L-
Phenylalanin Ammonium Lyase-, Chalcon Synthase- und "Hydroxyproline rich glycoprotein"-
Promotoren induzierbar durch Ethylen (Ecker and Davies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84
(1987), 5202-5210) und durch Dexamethason induzierbares chimäres Transkriptions-
Induktionssystem (Kunkel et al., Nature Biotechnology 17 (1990), 916-918), IncW-
Promotor aus Mais, induzierbar durch Sucrose oder D-Glucose (Chen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96 (1999), 10512-10517. Ergänzend wird auf Datla et al., Biotechnology
Annual Review 3 (1997), 269-290 und Gatz and Denk, Trends in Plant Science 3 (1998),
352-358 verwiesen.
Zur Herstellung der Expressionsvektoren zur Einführung in Wirtsorganismen, z. B. Pflanzen,
stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein
Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen
enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien,
pACYC184, etc.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden
Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Der erhaltene Vektor wird für die
Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem
geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Der Vektor wird dann
wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Vektor-DNA
werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch
molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Vektor-DNA
gespalten und gewonnene DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft
werden. Jede Vektor-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Vektoren kloniert
werden.
Für die Einführung der vorstehenden Expressionsvektoren in eine Pflanzzelle stehen eine
Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von
Pflanzenzellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die
Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen
Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine
speziellen Anforderungen an die verwendeten Vektoren gestellt. Es können einfache
Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig
transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker
vorhanden sein. Geeignete selektierbare Marker sind dem Fachmann bekannt und dazu
zählen beispielsweise das Neomycinphosphotransferase II-Gen aus E. coli (Beck et al.,
Gene 19 (1982), 327-336), das Sulfonamid-Resistenzgen (EP-369637) und das
Hygromycin-Resistenzgen (EP-186425). Je nach Einführungsmethode für die gewünschten
Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird z. B. für
die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß
mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch müssen die rechte und linke Begrenzung
der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen
verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in
spezielle Vektoren kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder
in einen binären Vektor (vgl. dazu auch die nachstehenden Beispiele 1 bis 3). Die
intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in
der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak
terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA
notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren.
Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens
übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien
replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker,
welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können
direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium
sollte ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer
der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das
derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen
verwendet.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate
zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes
cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmen
te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können
dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion
transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so
erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht
werden. Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die
Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte
DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die
Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und
Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in
Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe
von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß
auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels auf Agrobacterium basierender
Vektoren sehr wohl zugänglich sind.
Bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren/Zusammensetzungen
(Kombinationen) ist zu beachten, daß bei der Produktion therapeutischer Proteine die
Homogenität des produzierten Proteins nicht beeinträchtigt wird und nur solche
subzellulären Kompartimente miteinander gekoppelt werden, die keine Beeinträchtigung der
Qualität des produzierten Proteins herbeiführen. Andererseits ist bei diagnostischen
Proteinen oder Proteinwerkstoffen hierhin a priori keine Beeinträchtigung gegeben, so daß
sich das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
insbesondere für derartige Proteine mit niedrigeren wirtschaftlichen Gewinnspannen eignen,
weil hierbei die Expressionsraten einen wesentlich höheren Einfluß auf die wirtschaftliche
Realisierbarkeit haben als bei therapeutischen Proteinen. Dem Problem eines potentiellen
"gene silencing" bei Vorhandensein mehrerer gleicher Gene, z. B. in einer transgenen
Pflanzenzelle/einer transgenen Pflanze, kann der Fachmann dadurch entgegengewirken,
daß z. B. bei mehreren Kern-kodierten Fremdgenen für dasselbe Protein der Einsatz der
möglichen unterschiedlichen Codons für eine Aminosäure unter Berücksichtigung der in
einem bestimmten Organismus bevorzugten Codons eine unterschiedliche
Nucleinsäuresequenz für die verschiedenen Gene z. B. in Form synthetisch hergestellter
Gene benutzt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen
Expressionsvektoren bzw. die diese umfassenden Zusammensetzungen (Kombinationen)
Lokalisierungssignale für die Lokalisierung im endoplasmatischen Retikulum (ER), im
Apoplasten, im Golgi-Apparat, in Plastiden, in Peroxisomen, in Mitochondrien und/oder in
Vakuolen. Es wird auf vorstehende Ausführungen hinsichtlich Signalsequenzen
(Signalpeptide) verwiesen. Besonders bevorzugt sind als Lokalisierungssignale das KDEL-
ER-Targeting-Peptid, das Golgi-Lokalisierungssignal der β-1,2-N-
Acetylglucosamintransferase (GnTI), die kleine Untereinheit der Ribulose-Biphosphat-
Carboxylase und/oder das vakuoläre Targeting-Signal SKNPIN.
Bei den in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Eukaryoten handelt es sich
vorzugsweise um Pflanzen. Dabei kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen
Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Der hier
verwendete Begriff "Pflanze" umfaßt auch Pilze, Moose und Algen. Bevorzugt handelt es
sich um Nutzpflanzen, z. B. um Pflanzen wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe,
Zuckerrohr, Brassicaceen, Leguminosen, Tabak oder Kartoffel. Besonders bevorzugt als
transgene Pflanzen sind Brassicaceen, Leguminosen und Kartoffel. Die für die Expression
des gewünschten Proteins gewünschten Pflanzenteile betreffen im Prinzip jedes beliebige
Pflanzenteil, jedenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte dieser Pflanzen,
beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzensamen, eine Pflanzenzelle oder eine
Pflanze, die einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor oder eine erfindungsgemäße
Zusammensetzung enthält.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der
Produktionsrate eines gewünschten Proteins in einem Wirt, vorzugsweise einer Pflanze,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur simultanen Expression des für das gewünschte
Protein kodierenden Gens in verschiedenen Kompartimenten des Wirts und/oder zum
simultanen Transport des gewünschten Proteins in verschiedene Kompartimente des Wirts
der Wirt mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor und/oder der erfindungsgemäßen
Zusammensetzung transformiert und das gewünschte Protein aus dem Wirt gewonnen wird.
Geeignete Verfahren zur Gewinnung des Proteins und der am besten geeigneten
Pflanzenteile in Abhängigkeit von der Lokalisierung des Proteins sind dem Fachmann
bekannt und z. B. auch in den nachstehenden Beispielen 1 bis 3 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß in einem Wirt, insbesondere
einer Pflanze, eine hohe Expressionsrate eines gewünschten Proteins erreicht werden
kann, ohne daß es zu physiologischen Störungen im Zellhaushalt und damit im Wachstum
und der Lebensfähigkeit des Wirts kommt. Dies wird durch die Verwendung der
vorstehenden Expressionsvektoren bzw. Zusammensetzungen (Kombinationen) erreicht,
vor allem aber auch durch die Kombination der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der
multiplen subzellulären Lokalisation des gewünschten Proteins beispielsweise mit der
Nach-Ernte-Produktionstechnologie (vgl. dazu das nachstehende Beispiel 3), bei der die
Expression des für das gewünschte Protein kodierenden Gens erst nach Ernte der Pflanze
bzw. bestimmter Pflanzenteile erfolgt. Bei dieser durch den Anmelder entwickelten
Technologie erfolgt die Induktion der Expression, beispielsweise die Induktion des zu
aktivierenden Promotors, über chemische Stimuli (z. B. Veränderung der Zusammensetzung
der umgebenden Gasphase, vorzugsweise anaerobe Induktion, Vernebelung von Lösungen
fester induzierender (Bio-)chemikalien oder Verwendung flüchtiger Substanzen und deren
gleichmäßige Verteilung im Reaktionsraum) oder Aufhebung der funktionellen Inhibition der
Transkription des betreffenden Fremdgens im transgenen Wirtsorganismus (z. B. durch
Insertion von transkriptionsinhibierenden Sequenzen zwischen Promotor und zu
exprimierendem Gen, welche extern steuerbar entfernt oder inaktiviert werden können).
Diese Vorgehensweise ist vor allem im Hinblick auf transgene Pflanzen von Interesse, die
hierfür ein hervorragend geeignetes Bioreaktor-System darstellen, vor allem da der
großflächige Anbau von Kulturpflanzen und die großtechnische Verarbeitung großer
Pflanzenmengen, z. B. für die Öl - und Stärkegewinnung, etabliert sind. Solches, unter
Einbezug der Nach-Ernte-Produktions-Technologie beispielsweise für die Produktion
hochwertiger Proteine oder anderer (bio-)chemischer Substanzen in großem Maßstab
eröffnet neue (bio)medizinische und technologische Anwendungsgebiete. Außerdem kann
bei dieser Vorgehensweise das Pflanzengewebe, beispielsweise beim Einsatz eines
gasförmigen Induktionsstimulus, intakt und unzerstört bleiben, da es nicht zerkleinert
werden muß. Ferner kommt es zu einer sehr gleichmäßigen und schnellen Verteilung des
Induktionsstimulus um das Gewebe herum, wie auch zwischen den Zeilen im Zellverband.
Somit ist eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch
gekennzeichnet, daß die Expression des für das gewünschte Protein kodierenden Gens
erst nach der Ernte des Wirts erfolgt, wobei das für das gewünschte Protein kodierende
Gen so auf den Expressionsvektoren inseriert ist, daß dessen Expression erst in
Anwesenheit einer induzierenden Verbindung (Induktor) erfolgt und das Inkontaktbringen
mit dem Induktor nach der Ernte des Wirts erfolgt. Geeignete Vorgehensweisen sind dem
Fachmann bekannt. Der Induktor kann z. B. über die Veränderung der den Wirtsorganismus
umgebenden Gasphase, eine Vernebelung einer Lösung eines Induktors oder ein aktives
Überströmen mit einem flüchtigen Induktor erfolgen. Bei der Veränderung der Gasphase
kann es sich z. B. um einen Sauerstoffentzug handeln, wobei dann für die Expression ein
unter anaeroben Bedingungen aktiver Promotor verwendet wird, z. B. der GapC4-Promotor
aus Mais (Bülow et al., supra). Die Induktion der Expression des für das gewünschte Protein
kodierenden Gens kann auch durch Aufhebung der funktionellen Hemmung der
Transkription und/oder Translation erfolgen, beispielsweise dadurch, daß bei den
erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zwischen dem Promotor und dem Gen eine
Nucleinsäure inseriert ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Transkription
und/oder Translation des Gens verhindert und nach Induktion exzisiert werden kann, was
zur Expression des Gens führt. Diese Nucleinsäure kann z. B. eine durch eine induzierbare
Rekombinase exzisierbare Nucleinsäure sein. Die exzisierbare Nucleinsäure und die
Rekombinase können Bestandteile des Rekombinase-LBD-Systems (WO 95100555) sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die in Artsaenko et al. (supra) beschriebene cDNA, die für einen im endoplasmatischen
Retikulum (ER) lokalisierten scFv(ox)-Antikörper mit KDEL-ER-Targetting-Sequenz kodiert,
wird mittels einer Linker-Ligation (am 5'-Ende mit CATGCCATGGCATG [5'-
phosphoryliertes Oligonucleotid]), am 3'-Ende mit GCTCTAGAGC [5'-phosphoryliertes
Oligonucleotid] derart modifiziert, daß sie am 5'-Ende eine NcoI-Restriktionsschnittstelle und
am 3'-Ende eine XbaI-Restriktionsschnittstelle aufweist. Nach Verdau des Plasmids pRT
100 (Töpfer et el. (1987) Nucleic Acids Research 15, 5890) mit NcoI und XbaI wird das
scFv-kodierende DNA-Fragment in diesen Expressionsvektor inseriert. Es wird das Plasmid
pRT 100/scFv(ox)ER erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die Expressionskassette
35S-scfv(ox)ER Isoliert.
In einer weiteren Klonierung wird die cDNA für den scFv(ox)-Antikörper ohne die kodierende
Sequenz für das KDEL-ER-Targetting-Signal (Artsaenlko et al., (supra)) mittels einer Linker-
Ligation (am 5'-Ende mit CATGCCATGGCATG [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid]; am 3'-
Ende mit GCTCTAGAGC [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid]) derart modifiziert, daß sie am
5'-Ende eine NcoI-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine
XbaI-Restriktionsschnittstelle aufweist. Nach Verdau des Plasmids pRT 100 mit NcoI und
XbaI wird das scFv-kodierende DNA-Fragment in diesen Expressionsvektor inseriert. Es
wird das Plasmid pRT 100/scFv(ox)AP erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die
Expressionskassette 35S-scFv(ox)AP isoliert.
Für die Lokalisierung des scFv(ox)-Antikörpers im Golgi-Apparat wird das Signalpeptid in
Plasmid pRT 100/scFv(ox)AP durch das Golgi-Lokalisierunggssignal der β-1,2-N-
Acetylglucosaminyltransferase (GnTI) aus Kaninchen (Burke et el., J. BioLChem. 267
(1992), 24433-24440) ersetzt. Dazu wird mittels einer PCR-Reaktion die dafür kodierende
DNA-Sequenz so modifiziert, daß sie am 5'-Ende eine NcoI-Schnittstelle und am 3'-Ende
die GTCGAC-Sequenz aufweist, für die eine SaII-Schnittstelle codiert. Für die PCR-
Reaktion wird das folgende Primerpaar verwendet:
5'-GnTI-Primer: CCATGGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCTGG
3'-GnTI-Primer: GTCGACACGTGTCCAGAAGAAGAGGAGGAG
5'-GnTI-Primer: CCATGGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCTGG
3'-GnTI-Primer: GTCGACACGTGTCCAGAAGAAGAGGAGGAG
Die cDNA für den reifen scFv(ox)-Antikörper wird mittels einer Linker-Ligation (am 5'-Ende
mit CCGTCGACAT [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid] und am 3'-Ende mit GCTCTAGAGC
[5'-phosphoryliertes Oligonucleotid]) derart modifiziert, daß sie am 5'-Ende eine
SaII-Schnittstelle und am 3'-Ende eine XbaI-Restriktionsschnittstellle aufweist. Beide
cDNA-Fragmente werden mit NcoI + SaII bzvv. SaII + XbaI verdaut, so daß überhängende
Enden entstehen. Die erhaltenen cDNA-Fragmente werden gleichzeitig in den mit NcoI und
XbaI geöffneten Vektor pRT 100 inseriert. Es wird das Plasmid pRT 100/scFv(ox)GO
erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die Expressionskassette 35S-scFv(ox)GO isoliert.
Für den Transport des cytoplasmatisch synthetisierten scFv(ox)-Antikörpers in
Chloroplasten wird eine für ein Transitpeptid-scFv(ox) kodierendes cDNA-Fragment erzeugt.
Dazu wird die cDNA für das Transitpeptid aus dem für die kleine Untereinheit der Ribulose-
Bisphosphat-Carboxylase kodierenden Gens (Anderson et al., Biochemical Journal 240
(1986), 709-715) mittels einer PCR-Peaktion so modifiziert, daß am 5'-Ende eine
NcoI-Schnittstelle und am 3'-Ende die GTCGAC-Sequenz, die für eine SaII-Schnittstelle
kodiert, eingefügt werden. Dafür wird das folgende Primerpaar verwendet:
5'-rbcI Primer: CCATGGCTTCTATGATATCCTCTTCAG
3'-rbcI Primer: GTCGACGCACTTTACTCTTCCACCATTGC
5'-rbcI Primer: CCATGGCTTCTATGATATCCTCTTCAG
3'-rbcI Primer: GTCGACGCACTTTACTCTTCCACCATTGC
Die cDNA für den reifen scFv(ox)-Antikörper wird mittels einer Linker-Ligation am 5'-Ende
mit CCGTCGACAT [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid] und am 3'-Ende mit GCTCTAGAGC
[5'-phosphoryliertes Oligonucleotid]) derart modifiziert, daß sie am 5' Ende eine
SaII-Schnittstelle und am 3'-Ende eine XbaI-Restriktionsschnittstelle aufweist. Beide
cDNA-Fragmente werden mit NcoI + SaII bzw. SaII + XbaI verdaut, so daß überhängende
Enden entstehen. Die erhaltenen cDNA-Fragmente werden gleichzeitig in den mit NcoI und
XbaI geöffneten Vektor pRT 100 inseriert. Es wird das Plasmid pRT 100/scFv(ox)CH
erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die Expressionskasette 35S-scFv(ox)CH isoliert.
Der binäre Vektor pSR 8-30 (Düring et al., Plant Journal 3 (1993), 587-589; Porsch et al.,
Plant Molecular Biology 37 (1998), 581-585) wird mit HindIII geöffnet. Alle vier vorstehend
beschriebenen Expressionskassetten (35S-scFv(ox)ER, 35S-scFv(ox)AP, 35S-scFv(ox)GO"
und 35S-scFv(ox)CH) werden gleichzeitig In die HindIII-Schnittstelle des binären Vektors
ligiert Die eindeutige Identifizierung positiver Klone, die alle vier Fragmente enthalten,
erfolgt durch DNA-Sequenzierung. Es wird der binäre Vektor pSR 8-30/scFv(ox)EAGC
erhalten.
Der Expressionsvektor pSR 8-30/scFv(ox)EAGC wird zur Transformation von E. coli SM10
verwendet. Transformanten werden mit Agrobacterium GV 3101 gemischt und über Nacht
bei 28°C inkubiert (Koncz und Schell, Molecular and General Genetics 204 (1986), 383-396;
Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 131-135). Es wird auf Carbenicillin
selektioniert, wobei das hierfür notwendige bIa-Gen in den vorstehenden
Expresssionsvektoren vorliegt. Selektionsklone von Agrobacterium tumefaciens werden auf
abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrippe eingeritzten Blättern der Kartoffelpflanze
cv. Désirée aufgebracht und die Blätter werden 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert.
Danach werden die Agrobakterien abgewaschen und den Kartoffelblättern
Pflanzenwuchsstoffe zugesetzt, so daß bevorzugt Sprosse regenerieren. Ferner werden
durch die Zugabe von Kanamycin 100 mg/l in das Pflanzenmedium nicht-transformierte
Zellen in den Kartoffelblättern abgetötet. Heranwachsende Sprosse werden abgeschnitten
und auf das Medium ohne Pflanzenwachstumsstoffe, aber mit Kanamycin, bewurzelt. Die
weitere Kultivierung der Kartoffelpflanzen erfolgt in üblicher Weise.
Der Nachweis des exprimierten scFv-Antikörpers in transgenem Blatt- und Knollenmaterial
wird durch Antikörper, die an scFv oder Protein L binden, im Western Blot bzw. ELISA
erbracht. Hierzu wird das Gesamtprotein des Kartoffelmaterials isoliert und in die
entsprechenden Nachweisverfahren eingesetzt. Im Vergleich zu den in Artsaenko et al.
(supra) publizierten Ergebnissen zur Knollen-Expression von scFv(ox) ausschließlich im ER
(Expressionsraten von bis zu 2% des löslichen Gesamtproteins) werden durch die simultane
Expression in insgesamt vier Kompartimenten bis zu 5% scFv(ox)-Antikörper-Protein vom
löslichen Gesamtprotein erreicht.
Für die Herstellung eines Plastiden-Transformationsvektors wird Chloroplasten-DNA
(cp-DNA) aus 8 Wochen alten Tabakpflanzen, angezogen im Gewächshaus, nach dem
Verfahren von Koladner und Tewarl (Biochim. Biophys. Acta 404 (1975), 372-390) isoliert.
Die isolierte Chloroplasten-DNA wird mit BgIII verdaut und die entstandenen BgIII-
Fragmente werden "shot gun" in den mit BarnHI geöffneten Vektor pBluescriptKS
(Stratagene) kloniert. Über Kolonie-Hybridisierung wird ein Klon identifiziert, der das BgIII-
Fragment mit den ndhF-, rpI32 und trnL-Genen enthält (Shinozaki et al., EMBO J. 5 (1986),
2043-2049; 4.656bp-Fragment, Nucleotide Nr. 111515-116171). Es wird das Plasmid
pBKSnrt erhalten.
In die HincII-Schnittstelle des 4.656bp-BgIII-Fragments im Plasmid pBKSnrt wird das Gen für
den scFv(ox)-Antikörper aus Artsaenka et al. (supra) unter die Kontrolle des
psbA-Promotors und des psbA-Terminationssignals (Shinozaki et al., supra) aus Tabak
kloniert. Dafür wird die cDNA für den reifen scFv(ox)-Antikörper mittels einer Linker-Ligation
am 5'-Ende mit CGCGAATTC [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid] und am 3'-Ende mit
GACTAAGCTT [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid] derart modifiziert, daß sie am 5'-Ende
eine EcoRI-Schnittstelle und am 3'-Ende eine HindIII-Restriktionsschnittstelle aufweist.
Dieses cDNA-Fragment wird nach Verdau mit EcoRI und HindIII in das Plasmid
pBluescriptSK (Stratagene) kloniert. Es wird das Plasmid pBSK/scFv(ox) erhalten. Der 5'-
Bereich des psbA-Gens (Plastiden-spezifischer Promotor) wird aus Chloroplasten-DNA von
Tabak durch eine PCR-Reaktion amplifiziert. Dafür wird folgendes phosphoryliertes
Primerpaar verwendet:
psbA1 Primer: GTCATGTTATACTGTTG (Nucleotide 1700-1684, Shinozaki et al., supra)
psbA2 Primer: GGTAAAATCTTGGTTTATTTAATCATC (Nucleotide 1596-1622, Shinozaki et al., supra)
psbA1 Primer: GTCATGTTATACTGTTG (Nucleotide 1700-1684, Shinozaki et al., supra)
psbA2 Primer: GGTAAAATCTTGGTTTATTTAATCATC (Nucleotide 1596-1622, Shinozaki et al., supra)
Das PCR-Produkt wird "blunt end" in die SmaI-Schnittstetle des Vektors pBSK/scFv(ox)
kloniert. Es wird das Plasmid pBSK/psbA-scFv(ox) erhalten. Der 3'-Bereich des psbA-Gens
(Terminationssignal) wird ebenfalls über eine PCR-Reaktion amplifiziert. Dazu wird
folgendes phosphoryliertes Primerpaar verwendet:
psbA3 Primer: AGTCTATGTAAGTAAAATAC (Nucleotide 401-420, Shinozaki et al., supra)
psbA4 Primer: CCTGGCCTAGTCTATAGGAG (Nucleotide 530-511, Shinozaki et al., supra)
psbA3 Primer: AGTCTATGTAAGTAAAATAC (Nucleotide 401-420, Shinozaki et al., supra)
psbA4 Primer: CCTGGCCTAGTCTATAGGAG (Nucleotide 530-511, Shinozaki et al., supra)
Das PCR-Produkt wird "blunt end" in die aufgeschnittene und aufgefüllte SaII-Schnittstelle
des Vektors pBSK/psbA-scFv(ox) inseriert. Es wird das Plasmid pBSK/psbA-scFv(ox)-PgbA
erhalten. Die Expressionskassette wird aus diesem Plasmid durch Verdau mit BamHI und
KpnI herausgeschnitten, aufgefüllt und "blunt end' in die HincII-Schnittstelle des Vektors
pBSKnrt kloniert. Es wird das Plasmid pBSKnrt/scFv(ox) erhalten. In die SnaBI-Schnittstelle
des 4.656bp-BgIII-Fragments des Plasmids pBSKnrt/scFv(ox) wird weiterhin als
Selektionsmarker das nptII-Gen unter die Kontrolle des psbA-Promotors und des
psbA-Terminationssignals aus Tabak kloniert. Dafür wird das nptII-Gen mit einer PCR-
Amplifizierung aus dem Vektor pCR2.1 (Invitrogen) isoliert. Dazu wird folgendes Primerpaar
verwendet:
Kan1-Primer: CCGAATTCCAAGAGACAGGATGAGGATC
Kan2-Primer: CGCGAAGCTTCAATTCAGAAGAACTCAAG
Kan1-Primer: CCGAATTCCAAGAGACAGGATGAGGATC
Kan2-Primer: CGCGAAGCTTCAATTCAGAAGAACTCAAG
Das PCR-Produkt wird über EcoRI- und HindIII-Verdau in das Plasmid pBluescriptSK
(Stratagene) kloniert. Es wird das Plasmid pBSK/NPT erhalten. Der 5'-Bereich des
psbA-Gens (wie vorstehend beschrieben isoliert) wird "blunt end' in die SmaI-Schnittstelle
des Vektors pBSK/NPT kloniert. Es wird das Plasmid pF3SK/psbA-NPT erhalten. Der 3'-
Bereich des pshA-Gens (Terminationssignal) wird (wie vorstehend beschrieben) ebenfalls
"blunt end' in die aufgeschnittene und aufgefüllte SaII-Schnittstelle des Vektors
pBSK/psbA-NBT inseriert, wobei das Plasmid pBSK/psbA-NPT-psb erhalten wird. Die
Expressionskassette wird aus diesem Plasmid mit BamHI und KpnI herausgeschnitten,
aufgefüllt und "blunt end" in die SnaBI-Schnittstelle des Vektors pBKSnrt/scFv(ox) kloniert,
wodurch das Plasmid pBKSnrt/scFv(ox)-NPT erhalten wird.
Die Transformation von Kartoffelplastiden und die Selektion von transgenen
Kartoffelpflanzen, die das vorstehend beschriebene Konstrukt in das Plastidengenom
eingebaut haben, erfolgt nach den von Svab et al., supra, Carrer et al. (Mol. Gen. Genet. 241
(1993), 49-56) und Sidorov et al. (Plant J. (1999), supra beschriebenen Protokollen
(biolistischer DNA-Transfer) mit dem Helium-betriebenen "Particle-Gun" Gerät PDS-1000/He
(Du Pont Willmington, USA). Der Nachweis der Plastidentransformation erfolgt durch
Isolierung plastidärer DNA und Hybridisierung mit dem scFv(ox)-Gen. Der Nachweis des
produzierten scFv(ox)-Antikörpers erfolgt analog zu vorstehendem Beispiel 1.
Die vorstehend beschriebene transgene Kartoffellinie, die das Gen für die plastidäre
Expression des scFv(ox)-Antikörpers in den Plastiden enthält, wird weiterhin mit den beiden
Expressionskassetten 35S-scFv(ox)ER aus Beispiel 1 und einer weiteren
Expressionskassette 35S-scFv(ox)VA für die vakuoläre Lokalisation des produzierten
scFv(ox)-Antikörpers transformiert.
Für die Klonierung der Expressionskassette 35S-scFv(ox)VA wird das Plasmid pSR9-12 ein
Derivat des Plasmids pRT 100, welches stromabwärts vom CaMV 35S-Promotor die
kodierende Sequenz für ein Maus IgG-Signalpeptid enthält, mit SaII und XbaI geöffnet. Die
cDNA für den reifen scFv(ox)-Antikörper wird mittels einer Linker-Ligation (am 5'-Ende mit
CCGTCGACTCTAAGAACCCAATTAAC [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid) und am 3'-
Ende mit GCTCTAGAGC [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid]) derart modifiziert, daß sie am
5'-Ende eine SaII-Schnittstelle und am 3'-Ende Ende eine XbaI-Restriktionsschnittstelle
aufweist. Gleichzeitig wird damit die für das vakuoläre Targetting-Signal SKNPIN aus dem
20 kDa-Protein aus der Kartoffelknolle kodierende DNA-Sequenz (PT20; Kolde, Plant Cell
Physiol. 40 (1999), 1152-1159) integriert. Dieses cDNA-Fragment wird mit SaII und XbaI
verdaut, so daß überhängende Enden entstehen, und in den geöffneten Vektor inseriert. Es
wird das Plasmid pSR9-12/scFv(ox)VA erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die
Expressionskassette 35S-scFv(ox)VA isoliert.
Die beiden Expressionskassetten 35S-scFv(ox)ER und 35S-scFv(ox)VA werden gleichzeitig
als HindIII-Fragmente in den mit HindIII geöffneten binären Vektor pSR 8-30hyg, ein Derivat
des Vektors pSR 8-30, der anstelle des Neomycinphosphotransferare II-Gens das
Hygromycinphosphotransferare-Gen enthält, ligiert. Die eindeutige Identifizierung positiver
Klone, die beide Fragmente enthalten, erfolgt durch DNA-Sequenzierung. Es wird der
binäre Vektor pSR 8-30hyg/scFv(ox)EV erhalten. Die Kartoffeltransformation erfolgt wie im
vorstehenden Beispiel 1 beschrieben, wobei die Selektion mit 5 mg/l Hygromycin erfolgt. Der
Nachweis des produzierten scFv(ox)Antikörpers erfolgt wie im vorstehenden Beispiel 1
beschrieben. Die Integration des vorstehend beschriebenen Konstrukts in das Kerngenom
wird durch Isolierung kerngenomischer DNA und Hybridisierung mit dem scFv(ox)-Gen
gemäß Standardverfahren nachgewiesen. Gegenüber Beispiel 1 kann die Menge des
exprimierten scFv(ox) nochmals gesteigert werden, nämlich auf 8% scFv(ox)-Antikörper-
Protein vom löslichen Gesamtprotein.
Der anaerob induzierbare GapC4-Promotor aus Mais (DE 195 47 272) wird mittels einer
PCR-Reaktion derart modifiziert, daß er am 5'-Ende eine HincII-Restriktionsschnittstelle und
am 3'-Ende eine NcoI-Restriktionschnittstelle erhält. Für die PCR-Reaktion wird folgendes
Primerpaar verwendet:
HincII-pGapC4 Primer: CATGTCAACACATAAGGAAGAAGAGGTAGAAAG
pGapC4-NcoI Primer: CATGCCATGGATCGATGACGGGGTTGGCGAGTGTG
HincII-pGapC4 Primer: CATGTCAACACATAAGGAAGAAGAGGTAGAAAG
pGapC4-NcoI Primer: CATGCCATGGATCGATGACGGGGTTGGCGAGTGTG
Die in Artsaenko et al. (supra) beschriebene cDNA, die für den im endoplasmatischen
Retikulum (ER) lokalisierten scFv(ox)-Antikörper kodiert, wird mittels einer Linker-Ligation
am 5'-Ende mit CATGCCATGGCATG [5'-phosphoryliertes Oligonucleotid] und am 3'-Ende
mit GCTCTAGAGC [5'-phosphoryliertes Oligonucieotid] derart modifiziert, daß sie am 5'-
Ende eine NcoI-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine XbaI-Restriktionsschnittstelle
aufweist. Aus dem Plasmid pRT 100 wird der CaMV 35S-Promotor mittels
Restriktionsverdau mit HincII und XbaI entfernt. Stattdessen werden die beiden oben
beschriebenen Nucleinsäurefragmente, die für den GapC4-Promotor und den
scFv(ox)-Antikörper kodieren, inseriert. Es wird das Plasmid pRT 100GAP/scFv(ox)ER
erhalten. Nach partieller Spaltung mit HindIII wird die Expressionskassette GAP-scFv(ox)ER
isoliert.
Für die anaerobe Expression des im Golgi-Apparat lokalisierten scFv(ox)-Antikörpers wird
das Plasmid pRT 100/seFv(ox)GO aus Beispiel 1 mit HincII und NcoI verdaut. Dadurch wird
der CaMV-35S Promotor entfernt. Statt dessen wird das vorstehend beschriebene
PCR-modifizierte pGapC4-Promotorfragment inseriert. Es wird das Plasmid pRT
100GAP/scFv(ox)GO erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wird die Expressionskassette
GAP-scFv(ox)GO isoliert.
Der binäre Vektor pSR 8-30 wird mit HindIII geöffnet. Beide vorstehend beschriebenen
Expressionskassetten (GAP-scFv(ox)ER und GAP-scFv(ox)GO) werden gleichzeitig in die
HindIII-Schnittstelle des binären Vektors ligiert. Die eindeutige Identifizierung positiver
Klone, die beide Fragmente enthalten, erfolgt durch DNA-Sequenzierung. Es wird der
binäre Vektor PSR 8-30GAP/scFv(ox)EG erhalten.
Der Expressionsvektor pSR 8-30GAP/seFv(ox)EG wird wie im vorstehenden Beispiel 1
beschrieben zur Transformation von Kartoffeln verwendet. Zum Nachweis der Expression
des scFv-Antikörpers wird abgeschnittenes Blattmaterial bzw. intaktes (oder geschnittenes)
Knollenmaterial mittels des "Anaerocult"-Systems (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) wie
bei Bülow et al. Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 192-198 beschrieben
induziert. Nach 40 Stunden wird das Blattmaterial entnommen und gemörsert. Der
Nachweis des exprimierten scFv-Antikörpers wird wieder durch Antikörper, die an den scFv-
Antikörper oder Protein L binden im Western Blot bzw. ELISA erbracht. Hierzu wird das
Gesamtprotein des Kartoffelmaterials isoliert und in die entsprechenden Nachweisverfahren
eingesetzt.
Als expressions-positiv ermittelte transgene Kartoffelpflanzen werden im Gewächshaus (im
Topf oder im Erdbeet) oder im Freiland unter üblichen gartenbaulichen bzw.
landwirtschaftlichen Bedingungen angebaut. Die Knollen werden nach üblicher
Handhabung geerntet und gelagert. Für die Nach-Ernte-Produktion des scFv-Antikörpers
werden die Knollen in einen Reaktionsbehälter aus Stahl (oder Kunststoff) verbracht, der
unten ein Gaszufuhrventil und oben ein Gasabführventil aufwies. Die Raumluft im Behälter
wird schnell durch Zufuhr von beispielsweise technischem Stickstoff (oder Kohlendioxid)
verdrängt. Unter langsamem Luftstrom (1 m3 Gaszufuhr pro Stunde pro m2 Grundfläche)
wird eine konstante Zusammensetzung der Gasphase im Reaktionsbehälter eingestellt.
Nach 40 Stunden werden die Knollen aus dem Reaktionsbehälter entnommen,
homogenisiert, der Festanteil wird abzentrifugiert und der wäßrige Überstand der
chromatographischen Aufreinigung des scFv-Antikörpers zugeführt. Durch Vergleich von
Proben vor und nach Sauerstoffentzug dieser transgenen Kartoffellinie mit den transgenen
Kartoffellinien, die den scFv(ox)-Antikörper nur im ER exprimieren, zeigt sich, daß durch die
kombinierte Expression in zwei Zellkompartimenten (hier: ER und Golgi-Apparat) deutlich
höhere Expressionsraten erzielt werden.
Claims (11)
1. Expressionsvektor (A), dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens zwei Kopien eines
für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens jeweils mit einem Promotor funktionell
verknüpft enthält, oder Zusammensetzung (B), umfassend mindestens zwei
Expressionsvektoren umfassend, die jeweils mindestens eine Kopie eines für ein
gewünschtes Protein kodierenden Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft enthalten,
wobei die einzelnen Genkopien dadurch gekennzeichnet sind, daß sie
- a) für das gewünschte Protein (I) als Fusionsprotein mit einem gewünschten Lokalisierungssignal (II) kodieren; wobei
- b) bei den einzelnen Genkopien der (I) kodierende Anteil im wesentlichen identisch, der (II) kodierende Anteil jedoch unterschiedlich ist,
2. Zusammensetzung (C), umfassend mindestens einen in Plastiden lokalisierten und einen
in Mitochondrien lokalisierten Expressionsvektor, die jeweils mindestens eine Kopie eines
für ein gewünschtes Protein kodierenden Gens mit einem Promotor funktionell verknüpft
enthalten, wobei die einzelnen Expressionsvektoren dadurch gekennzeichnet sind, daß die
einzelnen Genkopien im wesentlichen identisch sind und das gewünschte Protein in
Plastiden und Mitochondrien des Wirts exprimiert wird.
3. Kombination, enthaltend den Expressionsvektor (A) nach Anspruch 1, und/oder die
Zusammensetzung (B) nach Anspruch 1 und die Zusammensetzung (C) nach Anspruch 2.
4. Expressionsvektor (A), Zusammensetzung (B) oder (C) bzw. Kombination nach einem der
Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lokalisierungssignal ein solches für die Lokalisierung im
endoplasmatischen Retikulum (ER), Apoplasten, Golgi-Apparat, in Plastiden, Mitochondrien,
Peroxisosomen und/oder in Vakuolen ist.
5. Expressionsvektor (A), Zusammensetzung (B) oder (C) bzw. Kombination nach Anspruch
4, wobei das Lokalisierungssignal das KDEL-ER-Targetting-Peptid ist, das Golgi-
Lokalisierungssignal der β-1,2-N-Acetylglucosamintransferase (GnTI), die kleine
Untereinheit der Ribulose-Biphosphat-Carboxylase und/oder das vakuoläre Targetting-
Signal SKNPIN ist.
6. Expressionsvektor (A), Zusammensetzung (B) oder (C) bzw. Kombination nach einem der
Ansprüche 1 bis 5, wobei der Wirt eine Pflanze ist.
7. Expressionsvektor (A), Zusammensetzung (B) oder (C) bzw. Kombination nach Anspruch
6, wobei die Pflanze eine Brassicacee, Leguminose oder Kartoffel ist.
8. Verfahren zur Steigerung der Produktionsrate eines gewünschten Proteins in einem Wirt,
dadurch gekennzeichnet, daß zur simultanen Expression des das gewünschte Protein
kodierenden Gens in verschiedenen Kompartimenten des Wirts und/oder zum simultanen
Transport des gewünschten Proteins in verschiedene Kompartimente des Wirts der Wirt mit
dem Expressionsvektor (A), der Zusammensetzung (E) oder (C) bzw. der Kombination nach
einem der Ansprüche 1 bis 7 transformiert und das gewünschte Protein aus dem Wirt
gewonnen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des das
gewünschte Protein kodierenden Gens erst nach der Ernte des Wirts erfolgt, wobei das das
gewünschte Protein kodierende Gen so vorliegt, daß dessen Expression erst in
Anwesenheit einer induzierenden Verbindung erfolgt und das Inkontaktbringen mit der
Verbindung nach der Ernte des Wirts erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Wirt eine Pflanze ist.
11. Pflanzensamen, Pflanzenzelle oder Pflanze, die einen Expressionsvektor (A), eine
Zusammensetzung (B) oder (C) bzw. eine Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7
enthält.
Priority Applications (3)
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| DE2000114412 DE10014412A1 (de) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | Expressionsvektoren zur Anreicherung eines rekombinant hergestellten Proteins in unterschiedlichen Zellkompartimenten |
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