DD269399A1 - Biosensor und verfahren zur bestimmung von glyoxylat - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zur schnellen Bestimmung von Glyoxylat. Sie kann in der Pflanzenproduktion, Lebensmittelindustrie, Biotechnologie und biochemischen Forschung angewendet werden. Der Biosensor besteht aus einer Enzymelektrode, die in eine gepufferte Messloesung getaucht ist. Erfindungsgemaess sind auf der Oberflaeche einer Elektrode, gegebenenfalls neben einer oder mehreren Membranen, Lactatdehydrogenase und Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase immobilisiert. Zur Bestimmung von Glyoxylat wird der Messloesung NAD zugesetzt. Der Biosensor ermoeglicht die enzymelektrochemische, schnelle Bestimmung von Glyoxylat in Loesungen, ohne dass eine Probenvorbehandlung erforderlich ist.
Description
Zur Bestimmung einer Fruchtsaftprobe werden 6OuI der Probe in die Meßlösung gegeben. Aus der Stromdifferenz kann mit Hilfe der Elchkurve die gesuchte Qlyoxylatkonzentration ermittelt werden.
2. Beispiel
In einer Polyurethanmembran (Durchmesser 6mm) werden 10 U Laqtatdehydrogenase und 4 U Oxalatoxidase immobilisiert. Di' Membran befindet sich zwischen zwei Dialysemembranen. Diese Anordnung wird mittels eines O-Rlnges auf der Oberfläche einer Pd/Au-gesputterten Kohleelektrode befestigt, die an einen auf »derivativ" geschalteten Polar graphen angeschlossen und gegen eine Ag/AgCI-Elektrode auf +0,4 V polarisiert Ist. Diese Enzymelektrode taucht in 2 ml 0,1 M Na-Citrat/ CronensBurepuffer, pH 5,6, der 2mM NAD4 enthält. Die Aufnahme der Eichkurve erfolgt wie in Beispiel 1, nur daß anstelle eines Stromabfalls die erste Abteilung des Stromanstieges nach der Zeit als Meßsignal dient. Nach Zugabe von 5OuI einer Lebensmittelprobe kann aus dem derivativen Signal und der Eichkurve die gesuchte Glyoxylatkonzentration ermittelt werden.
3. Beispiel
In einer Gelatinemembran werden Lactatdehydrogenase (50U/cm1) und Oxalatdecarboxylase (20U/cm2) immobilisiert. Ein 8 χ 8 mm großes Membranstück wird vor einer COj-Gaselektrode angebracht, die an ein pH/mV-Meter angeschlossen ist und in 5 ml Puffer wio in Beispiel 2 »lucht. Zur Aufnahme einer Eichkurve werden jeweils 0,5 ml von Glyoxylat-Standardlösungen von 0,5mM, 1 mM, 5mM, 1OmM und 3OmM gemessen, wobei die Potentialänderung als Meßsignal gegen den Logarithmus der Konzentration aufgetragen wird. Dann werden 0,5ml einer mikrobiologischen Probe zugegeben und aus der Potentialänderung und der Elchkurve wird die Glyoxylatkonzentration erhalten.
Claims (2)
1. Biosensor zur Bestimmung von Glyoxylat, bestehend aus einer Enzymelektrode, die in eine gepufferte Meßlösung mit Zusätzen getaucht ist, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche einer O2-, H2Or oder CO2-anzeigenden Elektrode Lactatdehydrogenase und Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase immobilisiert sind, die gegebenenfalls sterisch gekoppelt sind, und gegebenenfalls eine oder mehrere Dialysemembranen fixiert sind.
2. Verfahren zur Bestimmung von Glyoxylat mittels Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der gepufferten Meßlösung NAD+ in Konzentrationen von 0,2 mM bis 5 mM zusetzt.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Bio sensor und ein Verfahren zur schnellen Bestimmung der Konzentration von Glyoxylat (Glyoxylat, Ethanalsäure). Der Biosensor kann in der Pflanzenproduktion, Lebensmittelindustrie, Biotechnologie und biochemischen Forschung angewendet werden.
Charakteristik des bekannten Standet der Technik
Glyoxylat wird üblicherweise durch Reaktion mit NADH in Anwesenheit des Enzyms Glyoxylatreduktase durch spektralphotometrische Messung der Abnahme der NADH-Konzentration bestimmt (G.G.Guilbault, Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, New York 1976). Dieses Verfahren ist zeitaufwendig, für getrübte Lösungen erst nach Probenvorbehandlung anwendbar und, wegen des hohen Verbrauchs an Enzym, reagenzienintensiv und deshalb kostenaufwendig. Der Einsatz von Biosensoren für die Bestimmung von Glyoxylat wurde bisher nicht beschrieben.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, mit geringem Reagenzien· und Zeitaufwand und ohne die Notwendigkeit einer Probenvorbehandlung die Konzentration von Glyoxylat in Lösungen zu bestimmen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biosensor und ein Verfahren zu schaffen, mit denen die enzymelektronische, schnelle Messung von Glyoxylat möglich ist.
Der erfindungsgemäße Biosensor besteht aus einer Elektrode, auf deren Oberfläche Lactatdehydrogenase und Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase immobilisiert sind, die gegebenenfalls sterisch gekoppelt sind, und gegebenenfalls einer oder mehreren Dialysemembranen. Die Elektrode ist eine Oj-anzeigende, eine H2O2-anzeigende oder eine CO2-anzeigende Elektrode. Die Bestimmung von Glyoxylat mit dem erfindungsgemäßen Biosensor erfolgt in einer gepufferten Meßlösung, in die die Enzymelektrode getaucht ist. Der gepufferten Meßlösung wird erfindungsgemäß NAD+ in Konzentrationen von 0,2 mM bis 5 mM zugesetzt. Das Verfahren zur Bestimmung von Glyoxylat soll im weiteren in seiner Funktion erläutert werden. Taucht die erfindungsgemäße Enzymelektrode in die gepufferte Meßvorlage, der NAD+ zugesetzt ist, und wird eine glyoxylathaltige Probe zugegeben, so wird Glyoxylat überraschenderweise durch vor der Elektrode immobilisierte Lactatdehydrogenase zu Oxalat umgesetzt. Das Oxalat wird entweder durch die coimmobilisierte Oxaiatoxidase unter O2-Verbrauch und H2O2- und CO2-Bildung oxidiert oder durch die coimmobilisierte Oxalatdecarboxylase unter CO2-Bildung umgesetzt. Die elektrochemische Anzeige erfolgt dementsprechend an einer O2-, H2O2- oder CO2-anzeigenden Elektrode. Die Auswertung der Elektrodensignale erfolgt durch Bestimmung der absoluten Strom- bzw. Potentialänderungen oder der ersten Ableitung dieser Änderungen nach der Zeit.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Biosensors und Verfahrens besteht in der Möglichkeit der schnellen und, aufgrund der Wiederverwendbarkeit der eingesetzten Enzyme, kostengünstigen Bestimmung des Glyoxylats in Lösungen ohne die Notwendigkeit einer Probenvorbehandlung.
Ausführungsbeispiele
I.Beispiel
In einer Gelatinemembran werden Lactatdehydrogenase (50 U/cm2) und Oxalatoxidase (5 U/cm2) immobilisiert. Ein 6 χ 6 mm großes Stück der Membran wird auf der Polyethylenfolie einer an einen Polarographen mit Schreiber angeschlossenen, auf -0,6V polarisierten Ag/AgCI-Elektrode mittels einer Dialysemembran und eines O-Ringes fixiert. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in 2ml auf 25eC thermostatierten, gerührten 0,1 M Na-Citrat/Citronensäurepuffer, pH 6,0. Dem Puffer wird 2,5mM NAD+ zugesetzt. Wenn sich ein stationärer Grundstrom eingestellt hat, werden 50 ul einer wäßrigen Glyoxylatlösung zugegeben. Der Strom fällt bis zu einem neuen stationären Wert. Die Meßzelle wird entleert, gespült und für die nächste Messung gefüllt. Auf diese Weise werden Glyoxylat-Standardlösungenvon1mM,2mM,5mM, 1OmM und 5OmM gemessen und ausden jeweiligen Differenzen der stationären Stromendwerte und des Grundstroms wird eine Eichkurve für Glyoxylat erstellt.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP2656074A4 (de) * | 2010-12-23 | 2014-10-29 | Metanomics Health Gmbh | Mittel und verfahren zur vorhersage von diabetes |
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1988
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