DD211581A5 - Verfahren zur herstellung eines fusionsproteins - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das die Aminosaeuresequenz von Rinder-Praewachstumshorm oder die Aminosaeuresequenz von Rinderwachstumshorm an seinem C-Terminalende und einen Teil eines prokaryotischen Proteins an seinem N-Terminalende aufweist, gekennzeichnet durch Inkubieren eines Mikroorganismus, der durch einen Expressionstransfervektor transformiert wurde, der eine fuer das Rinderwachstumshormon oder das Rinder-Praewachstumshormon kodierende Desoxynukleotidsequenz aufweist, die durch Reaktion einer fuer Rinder-Praewachstumshormon oder Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynukleotidsequenz mit einem DNS-Molekuel hergestellt wurde, das seinerseits durch Spalten eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym an einen Punkt innerhalb einer Expressionskontrollorgan worden ist.
Description
Berlin, den 6.7.1983 II. Ausscheidung aus 59 677/18
AP G 12 ίί/232 811/2 62 585/18
Verfahren zur Herstellung eines Pusionsproteins
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herateilung eines Fusionsproteins, das- die Aminosäuresequenz von Rinder-Präwachstumshorm oder die Aminosäuresequenz von Rinderwachstumshorm an seinem C-Terminalende und einen Teil eines prokaryοtischen Proteins an seinem M-Terminalende aufweist.
Wachstumshormon ist ein Polypeptid-Hortnon, welches in der Adenohypophyse (Hypophysen-Vorderlappen) synthetisiert und durch die Adenohypophyse sekretiert wird. Das Wachstumshormon wird als ein Vorläuferprotein (Prä-V/ach st ums hormon) mit einem U-terminalen Signalpeptid und der Wachstumshormon-Sequenz synthetisiert.
Die Aminosäuresequenz für bovines Wachstumshormon ist ermittelt worden (Dayhoff, M. D. et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5S lachtr. 3, 245 - 352, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C, (1978) ).
Normalerweise wird Wachstumshormon während des gesamten Lebens produziert, wenngleich die Produktion der größten Mengen während der Periode vor dem Brwachsenenstadium erfolgt. Das Hormon wird für das Wachstum in dieser Periode benötigt. Obwohl sein Mechanismus noch nicht bis ins Detail
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geklärt ist, so ist doch, bekannt, daß Wachstumshormon das Skelettwachstum, die Stickstoffretention und die Proteinsynthese fördert sowie den Glukose- und Lipidmetabolismus beeinflußt* Mit anderen Worten: Wachstumshormon ist ein allgemein anabolisch wirkendes Agens,
Die Verwendungen von bovinem Wachstumshormon basieren auf· seiner oben beschriebenen bekannten biologischen Aktivität· Bovines Wachstumshormon'kann Jungrindern zwecks Steigerung ihrer Wachstunisgeschwindigkeit und ihres Massezuwachses verabreicht werden, wodurch die zwischen Geburt und Rindfleischvermarktung liegende Zeitspanne verkürzt wird. Der daraus resultierende Anstieg der Fleischproduktion könnte, beträchtlich sein. Des weiteren unterscheidet sich bovines Wachstumshormon von ovinem Wachstumshormon durch lediglich einige wenige Aminosäuren, Polglich kann bovines Wachstumshormon an Schafe verabreicht werden, um dort die gleichen Ziele wie beim Rind, also steigende Wachstumsrate, steigenden Zuwachs und damit steigende Fleischprodukt ion zu erreichen. Ss ist darüber hinaus möglich, in Verfolgung der eben genannten Zwecke bovines Wachstumshormon auch an Schweine und andere Tierarten zu verabfolgen.
Inzwischen sind grundsätzliche Techniken zur Klonung von DlTS-Sequenzen bekannt. So beschreiben beispielsweise Seeburg, P.H. et al., Hat ure, 270« 486 (1977) das Klonen des Ratten-Wachstumshörrnon-Gensi Shine, J· etal., Uature, 270» 494 (1977) beschreiben das xilonen des humanen Somatomammotropin-Gens; Derynck, R. et al.., Ufa tare, 285» 542 (1980) schließlich beschreiben das Klonen des humanen Fibroblast-Interferon-Gensβ
Methoden zur Darstellung heterologer DIiS in einem Mikroorga-
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nismus sind nunmehr ebenfalls bekannt· Im Prinzip wird die die heterologe DUS codierende Sequenz an einem Punkt innerhalb eines darstellbaren Operons in einen DKS-Übertragungsvektor inseriert. Fir die Produktion eines Hybridproteins muß sich die inserierte Sequenz mit der codierenden Sequenz des Operons in der Ableserahmen-Phase befinden und hinsichtlich der Translation gleichartig ausgerichtet sein. Sind diese Bedingungen gegeben, dann resultiert die Translation des Operons in einem "Durchlesen" zur inserierten codierenden Sequenz dergestalt, daß es. sich bei dem so erzeugten Protein um ein Fusionsprotein handelt, welches eine durch das expressible Operon codierte M-terminale Aminosäuresequenz enthält, der sich wiederum eine durch die Einlagerung codierte Aminosäuresequenz anschließt. Siehe hierzu Polisky, 3. et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 73. 3900 (1976) sowie Itakura, K. et al., Science« 198, 1056 (1979). Verschiedene expressible Operons sind bereits verwendet worden, darunter jene für ß-Galaktosidasej ß-Laktamase und Tryptophan.
Die im vorliegenden Text verwendeten Abkürzungen werden allgemein anerkannt und von kompetenten Fachleuten benutzt. So sind beispielsweise diese Abkürzungen durch das J. Biol. Chenu ohne weitere Erläuterung angenommen worden.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Fusions· proteinwird zur Steigerung der Fleischproduktion angewendet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sur Herstellung eines Fusionsproteins, das die Aminosäuresequenz von Rinder-Prä wachst ums ho rtn oder die Aminosäure-
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sequenz von Rinderwachatumshorm an seinem C-Terminalende und einen Teil eines prokaryotischen Proteins an seinem !1T-Terminalende aufweist, zur Verfügung, zu stellen.
In einer der vorliegenden Verkörperung ist das Verfahren zur Herstellung eines die Riüderpräwachstumshormon-Sequenz enthaltenden DHS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß eine das Rinderpräwachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz mit einem DETS-Molekül reagiert, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restrik- · tionsenzym hergestellt wurde»
In einer anderen Verkörperung ist die Methode weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Rinderpräwachstumshormon codierende Desocynukleotidsequenz einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
5! - ATG ATG GGT GCA GGG GCG GGG AGG TCG CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CTG GCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCG TTC CCA GCC ATG TCG TTG TCC GGC GTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC GGG GGT CAG CAC CTG CAG CAG CTG GGT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT AGC TAC ATC GGG GAG GGA GAG AGA TAG TGC ATC CAG AAC ACC GAG GTT GGG TTC TGG TTC TCG GAA AGC ATC CCG GCC GCG AGG GG-C AAG AAT GAG GCG GAG GAG AiU TGA GAC TTG GAG GTG CTT GGG ATG TCA GTG CTC CTG ATC GAG TGG TGG CTT GGG GGC GTG GAG TTT CTG AGC AGA GTC TTG ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGG AGC TCG GAG CGT GTG TAT GAG AAG CTG AiIG GAC CTG GAG GAA GGG ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG GTG GAA GAT GGC ACC CCC GGG GCT GGG CAG ATC CTG AAG GAG AGC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAG ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TGG TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAG GTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC CTC TAG - 3' ,
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A = Desoxyadenyl, G = Desoxyguanyl, G = Desoxyzytosyl und T » Thymidyl
In einer zusätzlichen Verkörperung wird eine Methode zur Herstellung einer bovinea Rinderwachatumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß eine bovines Rinderpräwachatumahormon codierende cDiTS-Desoaiynukleotidsequenz mit dem Reatriktionaenzym Hae II gespalten und das gespaltene Produkt mit einem Bnzym inkubiert wird, daa aus der das iÜLenow-iragment von DlTS-PoIymerase I, T4-DUS-Polymerase oder 3'•••5I-Sxonuklaase enthaltenden Gruppe ausgewählt wurde.
In einer wieder anderen Verkörperung ist die Methode der Herstellung der bovinen Wachstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genannten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP durchgeführt und daa daraus resultierende Produkt mit 31-Nuklease verdaut, wird, wobei eine die Aminosäuren 2»♦.191 von bovinem Wachstumshormon codierende Deaoxynukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Deaosynukleotidaequenz resultiert, weiche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
5» - TTC GCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAC- CTG GCT GCT GAC ACC TTC AiIA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG C-GA GAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC
-β- 6.7.1983
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CAG GAG AAA TGA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CCT ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC Ti1G GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AiIG CTG MG GAC CTG GAG GAA G-GC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAG ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACC PAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 31,
A = Desoxyadenyl, G = Desoxyguanvl, C = Desoxyzytosyl und
T = Thvmidyl
In noch, einer anderen Verkörperung die Methode zur Herstellung der bovinen Wachst ums hormon-Sequenz weiter dadurch-, gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genannten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP,. dGTP, dCTP und dTTP durchgeführt wird und das daraus entstehende Produkt in Anwesenheit von dCTP mit einem Bnzvm inkubiert v/ird, welches aus der aus dem genannten Klenow-Fragment, T4-DH3-Polymerase oder 3f,,,5'-BxOnUkIease bestehenden Gruppe ausgewählt wird und schließlich gekennzeichnet dadurch, daß das hieraus resultierende Produkt mit S1-Endonuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäuren 1...191 des bovinen Wachstumshormons codierende Desocvnukleotidsequenz gewonnen v/ird, was wiederum in einer bovines Wachstumshorrnon codierenden Desoxvnukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
-7- 6.7.1933
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5» - GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GOT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC AGC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC TGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG GTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG CAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAG CTG CxIT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3»,
A = Desoxyadenyl, G = Desoxyguanyl, C =s Desoxyzytosyl und T = Thymidyl
In einer zusätzlichen Verkörperung ist das die bovine'. Prä— Wachstumshormon-Sequenz enthaltende Plasmid pBP348 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem durch Spalten eines übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DliS-Molekül um pBR322 und bei dem Restriktionsenzym um Pst I handelt.
In einer wieder anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Hersteilung eines die bovine Wachstumshormon-Sequena enthaltenden Di'iS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellte, das bovine Wachstumshormon codierende
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Desoxynukleotid-Sequenz mit einem DJtfS-Molekül zur Reaktion gebracht wird, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.
In einer noch anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Expressions-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß das durch Spalten eines Übertragungavektors mit einem Restriktionsenzym erzeugte DHS-MoI ekiil an einem Punkt innerhalb einer expressiblen Kontrollregion gespalten wird·
In einer zusätzlichen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteine, welches die Aminosäuresequenz von bovinem Prä-Wachstumshormon oder die Aminosäuresequenz von bovinem Wachstumshormon als O-terminales Ende und einen Teil eines prokaryotiachen Proteins als U-terminales Ende umfaßt, durch Inkubieren eines Mikroorganismus gekennzeichnet, welcher durch einen Sxpressions-Übertragungsvektor transformiert wurde, wobei dieser eine das genannte bovine Prä-Wachstumshormon oder das genannte bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleot.idsequenz enthält.
In wieder einer anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Synthese von bovinem Wachstumshormon durch Inkubieren eines durch einen Bxpressions-Übertragungsvektor transformierten Mikroorganismus sowie durch Herausreinigen des bovinen Wachstumshormons aus dem Lysat oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus gekennzeichnet, wobei der genannte übertragungsvektor eine Desoxynukleotidsequenz enthält, welche das genannte bovine Wachstumshormon unter Bedingungen codiert, die für die Darstellung der genannten bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz geeignet sind.
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Die vorliegende Erfindung offenbart insbesondere das Klonen einer das bovine Prä-Wachstumshormon oder das bovine Wachstumshormon codierenden DHS sowie die Garstellung der geklonten DIiS in einem Mikroorganismus.
Aus bovinen Hypohysen wird mRETS isoliert, welche das bovine Prä-Wachstumshormon codiert. Eine umgekehrte Abschrift (eine cDHS-Kopie) der mRHS wird hergestellt und in einen Übertragungsvektor inseriert» Sine das bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotid-Sequens wird durch Hydrolisieren der die Prä-Sequenz der cDHS für bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz zubereitet. Der Übertragungsvektor wird zur Transformierung von Bakterien verwendet, mit deren Hilfe die geklonte cDITS dargestellt wird«
Durch Anwendung der cDHS-Methode wird eine das bovine Wachstumshormon codierende DHS-Sequenz gewonnen. Die grundlegenden Techniken der cDITS-Methode sind bekannt und können den Darlegungen von Seeberg, P. H. et al. (siehe oben) sowie Derynck, R0 et al, (siehe oben.) entnommen werden» Die cDITS wird unter Verwendung einer RltfS-Präparation synthetisiert, welche aus bovinen Hypophysen - als Schablone - extrahiert wurde.
Die RImS wird mittels herkömmlicher Techniken aus bovinen Hypophysen isoliert. Polyadenylierte RIiS wird mittels Affinität s-Chromatografie isoliert. Die Reinheit der polyadenylierten RHS wird durch Vornehmen einer zellfreien Translation der polyadenylierten RlJS gemäß Beschreibung von Miller, W. L. und McCarthy, B. J., J. Biol. Chem. 254, 742 (1979) sowie Martial, J. Λ. et al., Proc. !fet. Acada Sei. USA, 74, 1816 (1977) und durch Analysieren der produzierten Proteine durch SBS-Akrylamid-Gel~31ektrophorese gemäß Beschreibung
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von Laemmli, U. K., Ifature. 227« 680 (1970) abgeschätzt· Bovines Wachstumshormön wird des weiteren durch eine von Martial, J. Α.. et al., Proc. Hat. Acad. Sei« USA (siehe oben) beschriebene Irninunpräzipitations-Reaktion identifiziert.
Die polyadenylierte RlTS wird als Schablone unter Anwendung herkömmlicher Techniken zur Herstellung einer doppelständigen cDUS-Kopie verwendet» Der erste cDHS-Strang wird mittels umgekehrter Transkriptase, mittels eines öligo-dT-Primers und der polyadenylierten RlTS gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Monahan, J» J. et al«, Bioehem., J^, "223 (1976) synthetisiert. Die RNS wird durch Alkaliverdäüung entfernt, und die einstrangige cDItfS wird zur Selbst-Primung der Synthese des aweiten Stranges durch umgekehrte Transkriptase verwendet» Die einst rangige Haarnadelschleife wird durch Verdauung mit S1-Fuklease (Leong, J. A. et al., J. Tirol»» 9» 891 (1972) beseitigt,"wie dies von Ullrich, A."et al., Science« Ί96« 1313 (1977) beschrieben wurde·
Die cDIiS ist nun zur Insertion in einen geeigneten Übertragungsvektor bereit» Zu den geeigneten Übertragungsvektoren gehören jene, welche in der Lage sind, Bakterien wie etwa Escherichia coli und Bacillus 3ubtilis, Hefe (Saccharom:/ces CSREYISIAE), die inl-, csp- und esp-mutanten Stämme von Heurospora crassa und tierische Seilen in Gewebekultur au transformieren. Beispiele für Übertragungsvektoren, die aur Anwendung im Rahmen der vorliegenden Srfindung geeignet sind und B> coli transformieren können, umfassen die Plasmide pSC101, ρϊ£Β9, p3R313, p3R315, p3R3i6 und pBR322 sowie die vom Bakteriophagen abgeleiteten Vektoren, d. h. Charon
.6.7.1933 62 585/18
A und gtWES
B.
In Tabelle 1 sind Quellen aufgeführt, in denen die Präparation und die kennzeichnenden Merkmale dieser Übertragungsvektoren beschrieben werden.
Übertragungsvektor
Quelle/en
pSC1O1
pBR 313 pBR 315 pBR 316 pBR 322
Charon 3A Charon 4A Charon 16A
Cohen, et al«» Proc. Hatl. Acad. Sei« USA,
20, 1293 und 3240 (1977)·
Boyer, et al. Re comb inant Mole c ule s ? Beers,
et al., Eds. Raven Press, EI9 Seite
(1977).
Cohen et al·, Recombinant Molecules, Seite
91 Rodriguez et al., Molekular Mechanismus in
Control of Gene Sxpression (ICiT-UCLA
Simposium on Mol. & Cell, Biol. Bd. 5),
Ilieslich et al., Eds«, Academic Press,
Ff, Seite 471 (1976).
Bolivar, et al., Gene, 2, 75 (1977).
Bolivar et al., (siehe oben)
Rodriguez et al., (siehe oben)
Rodriguenz et al., (siehe oben)
Bolivar et al., Gene, 2,95 (1977).
Bolivar et al., Gene, 4, 121 (1978).
Sut cliff e, Cold S or ing" Harbor 'Sysrp. on Quant,
Biol.« 41, 77 (1978).
Blat-sner et al,, Science, 196, 161 (1977).
Blattner et al., (siehe oben).
Blattner et al., (siehe oben).
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üb ert ragungs-
vektor Quelle/en
gtWES . B Tremeier et al,, Hature, 263, 526 (1976). Leder et al., Science, 196« 175 (1977).
Andere zur 'Transformierung von S. coli geeignete Vektoren sind bei Sinaheiiner, R, L., Ann, Rev. Biochem« 46,, 415 (1977) beschrieben· Zur Transformierung von B. subtilis geeignete Übertragungsvektoren sind von lordanescu, S., J. Bacteriol, 124» 597 (1964) und Ehrlich, S. D., Proc. Hatl. Acad« Sei. USA 74, 1680 (1977) beschrieben worden. Sin derartiger Vektor ist als Plasmid pC194 identifiziert worden, Hvbridplasniide mit Gehalt an Hefe-DHS —> sowohl Plasmidals auch/oder chromosomaler DNS — und bakterieller DiIS — z. B, Plasmid ,· werden zur Transfonnierung von Hefe verwendet. Derartige Plaemide sind von Beggs," J, D,, !'Tature, 275,104 (1978); Asiav, G. L. und Carbon, J., Proc. rJatl, Acad> Sei. USA 76, 3829 (1979) sowie von xiingsman, A. K, et, al., Gene 7t "141 (1979) beschrieben worden, Su den übertragungsvelctoren, die zur Traasforniierung von Tierzellen in Gewebkultur verwendet werden können, gehören das Adeno— defektive Virus, das SV-defektive Virus und das Polvoma-Virus*
Unter Anwendung konventioneller Techniken wird die cDHS in einen Übertragungsvektor inseriert. Die cDiTS wird gewöhnlich in irgendeine im Übertragungsvektor nur einmal existierende Restriktionsstelle inseriert. Charon 3A und 4A sowie auch gt :'I/SS . B enthalten keine solchen einmaligen Stellen; für diese Vektoren werden dSEufolge Restriktionsstellen von begrenzter Anzahl herangezogen. Die einmaligen Restiktionssteilen in den verschiedenen übertra-
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gungsvektor und die nutzbaren Restriktionsstellen in den Vektoren Charon 3A und 3A sowie gt WES . B sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Übertragungavektor OSG101
pBR313
pBR315, pBR 322
pBR3i6 pC194 Charon 16A Charon 3A Charon 4A gt WES . B
ScORI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpä I, Sma I " " " EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpa I, Sma I, Xma I EcoRI, Hind III,'Sal I, Bam HI,
Pst I .
Hind III, Sal I, Bam HI, Ps_t I Hind III "
EcoRI, Sat I
BcoRI
ScoRI
ScöRI
Generell wird die cDlTS zur Erleichterung der Selektion in eine innerhalb eines phänotypischen Merkmals gelegene Restriktionsstelle inseriert. So befinden sich beispielsweise Hind III, ,Sal I, und Barn HI in pSC101, pMB9> pBR313, pBR315, pBR3i6 und pBR322 innerhalb des Gens für Tetrasyklin-Widerstandsfähigkeit oder dessen Kontrollregion« Die Einlagerung an dieser Stelle resultiert in einem Verlust an Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit. Die cDITS kann in den Qbertragungsvektor durch Anwendung von Restriktionsstellen-VerbIndern oder durch Desocynukleotid-Schwansbildung inseriert werden« Bei der erstgenannten Methode kann ein synthetisches Itfukleotid, welches eine Rekognitionssteile für eine einzelne
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Restriktions-Endonuklease von der oben diskutierten Art enthält, am stumpfen Ende mit der cDHS verbunden werden« Die cDliS und der Übertragungsvektor werden separat mit der Restriktions-Endonuklease inkubiert und sodann gekühlt, um den die cDSTS enthaltenden Übertragungsvektor zu formieren. Bei der letztgenannten Methode kann die cDUS unter Verwendung eines Desoxynukleotida und terminaler Transferase, wie sie von Roychoudhury, R. et al.,. CTucl. Acids Res., 3> 863 (1976) beschrieben wurde, zur Schwanzbildung gebracht werden. In der gleichen Vorgehensweise kann der Übertragungsvektor nach Verdauung mit einer Restriktions-Endonuklease bei Verwendung des komplementären Desosynukleotids zur Schwanzbildung gebracht werden* Der geschwänzte Übertragungsvektor und die geschwänzte cDIS werden dann gekühlt, um den cDMS-haltigen Übertragungsvektor zu formieren. So kann die cDitfS- beispielsweise dC-geschwänzt sein, und der Übertragungsvektor kann an der Pst-I-Stelle ,geöffnet und dG-ges c hwänzt s e in »
Der cDIiS-haltige Übertragungsvektor wird nun zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet. Zu den für die verschiedenen Übertragsungsvektoren geeigneten Wirten gehören S. coli, B. subtilis« Hefe, IT. crassa und 'Tierzellen in Gey/ebekultür,»' Die zur Trans formierung jedes dieser Wirte befähigten Übertragungsvektoren sind bereits oben beschrieben worden. Herkömmlicherweise werden drei mutante Stämme von B. coli.verwendet. Bs handelt sich hierbei um 1776, RRI und HB101.. Ξ. coli 1776 ist bei Curtis, R., Ann. Rev» Microbiol. JK), 507 (1976) und im US-PS üjr. 4 190 495 beschrieben worden, S. coli RRI ist bei Dugaiczyk, A. et al., Molecular Mechanismus in Control of Gene Expressions, Seite 543 beschrieben wordenj B. coli HS101 schließlich ist bei !Cedes, D. H* und Thomas, C. A., Sroc. Ifetl. Acad. Sei.
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USA 22t 1537 (1976) beschrieben worden« Die geeigneten Wirte werden vermittels herkömmlicher Techniken transformiert* Beispielsweise wird 2. coli 1776 durch den von Cooke, IST. E. et al·, J. Biol. Chem.. 255, 6502 (I98O) beschriebenen cDHS-haltigen übertragungsvektor transformiert· Ebenfalls durch konventionelle Techniken werden Kolonien selektiert und/oder einen Screening unterworfen. So können Kolonien beispielsweise auf der Basis des Verlustes von einem phänotypischen Merkmal wie etwa der Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit selektiert werden. Das Screening der Kolonien kann (1) durch Beseitigen der cDHS durch eine geeignete Restriktions-Bndonuklease sowie Analyse mittels Elektrophorese und Hybridisation (Southern, E. M,, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975) oder (2) Replika-Plattieren nach der Beschreibung von Grünstein, M. und Hogeness, D. 3., Proc. !fet. Acad, Sei. USA, 72, 3961 (1975) und Hybridisieren" mit einer geeigneten Sonde oder schließlich (3) durch Prüfung der Kolonien direkt hinsichtlich ihrer Darstellung mittels Radioimmunoassay oder anderen Techniken vorgenommen werden«
Die bovines Wachstumshormon codierende DWS kann aus jener Einlagerung gewonnen werden, welche bovines Prä—Wachstumhormon codiert. Die das Prä-Hormon codierende DHS wird durch eine geeignete Restriktions-Endonuklease beseitigt. Ist zum Beispiel die cDHS in die Pst-I-Steile des Plasrnids pBR322 eingelagert, dann kann die"cDUS-Einlagerung durch teilweise Verdauung mit Pst I entfernt werden, da die cDHS für bovines Wachstumshormon awei interne PsJb-I-Steilen enthält. Andererseits kann das von pBR322 abgeleitete rekombinante Plasmid mit Hae II verdaut werden, um einen Teil der cDNS-Einlagerung zu entfernen. Die Hae-II-Verdauung beseitigt die das ii-terminale Signalpeptid codierende DIiS sowie zwei der
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drei Basen, die das ST-terminale AIa des Wachstumshormons codieren* Diese Basen werden durch Inkubieren der Einlagerung mit dem Klenow-Fragment der DfifS-Polymerase I und der Desocynukleotide ersetzt. Andererseits können die Ala codierenden Basen durch Inkubieren der cDJtfS mit Klenow-Fragment, T4-DiiS-Polymerase oder 3f...S'-Sxonuklease in Anwesenheit von dATP ausgestrichen werden. Das Klenow-Fragment ist von Klenow, H. und Henningsen, I., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 4 65« 168 (1970) beschrieben worden. Die Wachstumshormon codierende cDSTS wird nun in der oben beschriebenen Weise in einen geeigneten Übertragungsvektor inseriert.
Die geklonte DHS.wird in Bakterien dargestellt, um entweder ein Fusionsprotein zu erbringen, welches das durch die inserierte Sequenz codierte bovine Wachstumshormon enthält, oder aber um das Wachstumshormon selbst zu erbringen» Verschiedene mögliche Techniken stehen zur Wahl, sie können beinhalten (a) die Modifikation der codierenden Sequenzen zwecks Erlangung eines genau erwünschten übertragenden Startpunkt esϊ (b) die Selektion oder Konstruktion eines optimalen Expressionsvektors und (c) die nach der Übertragung erfolgende Bearbeitung entweder durch Ausnutzung der ln-vivo-Bearbeitungsaktivität des Wirtes oder in vitro durch chemische Mittel und (d) die direkte Darstellung,
Wo ein Fusionsprotein hervorgebracht wird, wird die Modifikation der geklonten ITukleotidsequenz im allgemeinen solange unnötig sein, solange die resultierende Sequenz die Translation·der'Einfügung im richtigen Ableserahmen ermöglicht und keine Stop-Kodone vor dem Anfangskodon der inserierten Sequenz intervenieren. Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden als ein Fusionsprotein durch Insertion der cDflS in geeignete Stellen innerhalb ausgeprägter
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Qperons (Expresaionsvektoren) dargestellt, so etwa unter Einbeziehung der Pst-I-Steile im ß-Laktaniase-Gen von pBR322 (Villa-Komaroff, L. et al., Proc. !Tat. AcacU Sei. USA, 75, 3727 (1978) j Serburg, P.. et al., Hat ure 274, 795 (1978)), der EcoRI-3teile von P3R322, die die lac-Kontrollregion und ß-Galaktosida3e codierende Sequenz trägt (Itakura, K*, siehe oben) oder unter Einbeziehung der Hind-III-Steile des trpD-Gens von Plasmid ptrpED50 (Martial, J. et al., Science,"205, 602 (1979)).
Modifikation der Sequenzlänge durch ein oder zwei STukle'otide zwecks Erreichung der korrekten Ablesungspha.se sind im Fachgebiet weithin bekannt. Einfügungen an der Pst-I-3telle von pBR322 aiit dem Ziel der Schwanzbildung kommen mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 : 6 in korrektem Phaaenzustand und Ableserahmen vor. dachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden aus Fusionsproteinen hergestellt, die einer spezifischen Spaltung in vitro zugänglich sind. Die geklonte ITukleotidsequenz wird modofiziert, um jene Aminosäuresequenzen zu codieren, welche die Spezifität für ein proteolytisch.es Enzym erbringen. Eine dafür geeignete Sequenz ist AspAspAsp Asplys, die vorzugsweise durch das Enzym Enterokinase gespalten wird. Hierzu liegt die Beschreibung in der Anmeldungsschrift der Serien-Fr. 125 878, eingereicht am 29. Februar 1980, vor. Wie dort ausgeführt, wird eine die oben genannte Aminosäuresequenz codierende koppelnde Itfukleotidsequenz nächst der den erwünschten Aminoterminus von Wachstums-Prähormon codierenden liukleotidsequenz inseriert.
Sine derartige Insertion erfordert beim Wachstums-Prähormon. die Modifikation der originalen cDiiS-Einlagerung durch Beseitigen der liukleotide auf dem 5'-Ende der das Wachstums«« Prähormon codierenden Sequenz. Die cDIiS-Sinlagerung für
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Wachstumshormon - oben beschrieben - bedarf keiner Modifikation» Die Modifikation der Einlagerung für Wachstums-Prähormon erfolgt entweder durch kontrollierte Verdauung des 3'-Endes der Einfügung mittels 3'-Sndonuklease oder 14-DiSTS-Polymerase, oder aber durch die Kombination von Restriktions-Endonukleasespaltung an einem Punkt an der 5'-Seite des gewünschten Startρunktes gemeinsam mit chemischer Synthese zum Zwecke der Wiederherstellung jenes so entfernten Teiles der gewünschten Sequenz. Weitere Einzelheiten dieser Vorgehensweisen sind der U.S»-Patentanmeldung der Serien— Hr, 125 878.au entnehmen. Bei Anwendung dieser Methodikvorzugsweise unter Einsatz von T4-DE3-Polymerase und S1-Muklease — wird die das Wachtums-Prähormon codierende cDSfS-Sequenz ohne die nichtübersetzte 5'-Hegion gewonnen. Die die vorangehende Aminosäuresequenz codierende Verbinder— itfukleotidsequenz wird durch DHS-Ligase gemäß Beschreibung von Valenzuela et al., Hature, 280, 815 (1979) jener cDUS stumpfendig verbunden, welche entweder Wachstums—Prähormon oder Wachstumshormon codiert. Die modifizierte cDNS-Sequenz wird in der oben beschriebenen Weise in einen Fusionsprotein-Expressionsvektor inseriert. Wirtsbakterien wie etwa Ξ. coli ΞΒ101. RRI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen. Transformanten werden hinsichtlich Ampizillin-Resistenz selektiert. Die Transformanten werden sodann unter Bedingungen angebaut, die für die Darstellung des Fusionsproteine günstig sind. Nach der Darstellung des Pusionsproteins wird das Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon durch enzymatische Hydrolyse mittels'Enterokinase herausgespalten*
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Durch. Verwendung geeigneter Expressions-Übertragungsvektoren wird das Wachstums-Prähormon der vorliegenden Erfindung auch direkt dargestellt, d. h. nicht an irgendein prokaryotisches Protein angeschmolzen. Das der-direkten Darstellung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß das inserierte DUS-Segment vollständig jenes codierende Segment ersetzt, welches normalerweise durch die bakterielle Kontrollregion transkribiert und übersetzt wird. Die zu bewahrende essentielle Komponente der Kontrollregion wird als Expressionseinheit bezeichnet. Die Expressionseinheit umfaßt einen Promotor und eine zum Wirken im Wirtsorganismus befähigte ribosomale Bindungsstelle. Bs ist nicht erforderlich, die den Wirtsanteil des Pusionsproteins codierenden ITukleotide in ihrer Gesamtheit zu beseitigen. Die Beziehung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startkodon (AUG) ist solcherart, daß der Startkodon irgendwo innerhalb der 3 bis 11 liukleotide der ribosomalen BLadungsstelle angesiedelt werden kann (Shine, J» et al., Proc» Hat» Acad. Sei. USA, 71» 1342 (1974) und Steitz, J., Proc. Hat. Acad. Sei. USA 4 72, 4734 (1975). In dieser 3...11-ITukleotidregion setzt' das zuerst angetroffene AUG den Ableserahmen fur die Translation, Im Falle des vom oben beschriebenen ptrpEDSO abgeleiteten ptrp_E3O, das den Operator, Promotor, Attenuator und die Ribosom-Bindungssequensen des Tryptophan-Operons gemeinsam mit der üiukleotidsequenz enthält, welche sieben Aminosäuren des trpE-Proteins ait anschließender Hind-III-Steile codiert, schafft die Beseitigung eines Minimums von 23.,.29 nucleotiden von der Hind-III-Stelle einen Platz für die Insertion in eine Expressionseinheit unter Tryptophan-Operonkontrolle,
Pur die direkte Darstellung von Wachstums-Prähormon wird die orginale cDNS-Einfügung in oben beschriebener Weise
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modifiziert, um die unübersetzte 5'-Region zu entfernen. Ein Vektor für die direkte Darstellung kann durch Modifikation von ptrpB3Q konstruiert werden, indem die 23..O29-JJukleotide unter Verwendung von T4-DiJS-Polymerase und S1-IJuklease in der oben beschriebenen Weise entfernt werden«-. Eine die Reatriktionssequenz für Bam-HJ-Endonuklease enthaltende Verb inder-Iiukleotidsequehz "wird stumpf endig durch die von Valenzuela et al« (siehe oben) beschriebene Vorgehenaweise sowohl mit der'modifizierten cDSTS-Einfügung als auch mit dem modifizierten ptrpB3Q verbunden« Dies erfolgt zur Erleichterung der Insertion, welche im wesentlichen in der von Ullrich, A. et al«, Science, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise vorgenommen wird. Geeignete Wirte wie etwa 2« coli HB101, HRI oder 1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachsturns-Prähormon codierende Region tragen« Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin ausgewählt und dann unter Bedingungen angezogen, die für die Darstellung von Wachstums-Prähormon günstig sind»
Wachstumshormon kann direkt mit der von Goeddel D. V. et al., !Tature, 281, 544 (1979) beschriebenen Methode dargestellt werden. Andererseits kann eine die Bam-HI-Stelle und den Startkodon (AUG) enthaltende Verbinder-iiukleotidsequenz stumpfendig mit der Wachstumshormon codierenden cDüS verbunden werden. Diese modifizierte cD£TS wird denn in der oben beschriebenen Weise in das modifizierte ptrpE30 iso riert.
Wachstums-Prähormon wird durch Entfernen der ίί-terminalen Sequenz der signalpeptidha.ltigen hydrophoben Aminosäuren zu Wachstumshormon umgewandelt. Die in-vitro-Beseit igung
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des Signalpeptids könnte durch. Behandlung des aus transformierten, induzierten Zellen extrahierten Proteins mit einer Präparation von "rohen" Mikrosomen ausgeführt werden, wie dies von «Jackson, R. C. und Blobel, G., Proc. Nat« Acad. Sei, USA, 74« 5598 (1977) beschrieben wurde. Die in-vivo-Beseitigung"des Signalpeptids kann während der direkten bakteriellen Ausbildung der Wachstums-Prähormon codierenden Sequenz vorkommen. Bakterielle und von Säugern stammende Signalpeptide weisen Sequenzähnlichice it en auf* Proteine mit Säuger-Signalpe pt iden können durch bakterielle Zellen bearbeitet werden; dies resultiert in einer Sxkretion von Wachstumshormon in den periplasmatischen Raum oder in das Medium*
Wachstums-Prähormon und Wachstumshormon, in der beschriebenen Weise synthetisiert, werden durch bekannte Techniken wie beispielsweise Gel-Filtration, lonen-Austauschchromatografie, Affinitäts-Chromatografie und Differential-Loslichkeitstechniken gereinigt»
Die Einzelheiten der vorliegenden Erfindung sollen weiter durch die folgenden Ausführungsbe ispiele beschrieben werden. In diesen Ausführungsbeispielen wurden die Verdauungen mit Restriktions-Endonukleasen unter Bedingungen ausgeführt, die für jedes Enzym optimiert worden waren* Re3triktions-Endonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellen-Spezifität sind im einzelnen von Roberts, R., Grit. Rev. 3iochemo t4> 123 (1976) beschrieben worden. Die Enzyme wurden auf kommerziellem Wege bezogen und -3ofern nicht anders angegeben unter optimalen Bedingungen gemäß den Empfehlungen der Hersteller eingesetzt. Umgekehrte Transkriptase wurde ebenfalls kommerziell bezogen. Die Verwendung von umgekehrter Transkriptase sowie geeignete Reaktionsbedingungen sind vor dem bereits von Seeburg, P. H. et al., Nature, 276, 795 (1978),
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Seeburg, P. H. et al. (siehe oben) sowie Shine, J. et al. (siehe oben) beschrieben worden. Weiterhin wurde '14-DiJS-Polymerase kommerziell bezogen. Die Verwendung von T4-DND-Polymerase sowie geeignete Reactionsbedingungen sind bereits in der Annie 1 dung der Serien-Sir. 125 378 beschrieben worden. Einsatz von S1-ITuklease, welche ebenfalls auf kommerziellem Wege bezogen wurde, und geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits von Ullrich, Ae (siehe oben) beschrieben worden. Weiterhin wurde terminale Desoxynukleotid-Transferase auf handelsüblichem Wege bezogen. Die Anwendung dieses Enzyms sowie die hierfür passenden Reaktionsbedingungen sind von Roychoudhury et al. (siehe oben) mitgeteilt worden. Auch das Klenow-Fragment von DUS-Polymerase I wurde handelsüblich bezogen*
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläuterte
Weibliche bovine Hypophysen wurden kurz nach Schlachtung der Spendertiere gesammelt und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren« Die Gesamt-RITS wurde durch Homogenisieren der Hypophysen in einer Guanidin-Thiozynant-Lö'sung hergestellt (Ghirgwin, J, M. et al., Bioehem., J-S, 5294 (1979)). Die "RIiS wurde entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) durch 5,7 M CsGl zentrifugiert. Sodann wurde die RIiS mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Polyadenylierte RltfS wurde unter Anwendung
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der Oligo-dT-Zellulose-Affinitätschromatografie gereinigt (Miller und McCarthy - siehe oben - sowie Aviv, E9 and -Leder, P., Proc. Hat. Acad« Sei. USA, 69 1408 (1972)).
Die polyadenlierte RIJS wurde gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Martial, J. A» et al (siehe oben - 1977) unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten in ein zellfreies System umgesetzt. Das in diesem System synthetisierte bovine Wachstuma-Prähormon wurde mittels eines heterologen antiovinen Wachstumshormon-Antiserums immunpräzipitiert und durch Adsorption an formalinfixierten Staphylococcus aureus Cowan Stamm I gemäß Beschreibung von Martial, J· A, et al. (siehe oben - 1977) präpariert. Die 35 S-Proteine wurden gemäß Beschreibung von Laeminli (siehe oben) der Elektrophorese auf plattenartigen 12,5-%-SDS-Polyakrylamid-Gelen unterzogen. Diese Analyse zeigte, daß die bovines V/a ch.3 turns -Prähormon codierende polyadenylierte RlTS etwa 12,6 % der gesamten pituitären polyadenylierten RNS ausmacht»
Polyadenylierte RiTS wurde unter Einsatz von Urnkehrtran3kriptase nach der von Miller und McCarthy (siehe oben) beschriebenen Methode sowie nach der von Monahan et al, (siehe oben) beschriebenen Methode in einzelstrangige cDETS umgekehrt transkribiert. RIiS wurde durch alkalische Hydrolyse beseitigt,, Die einzelstrangige cDHS wurde mit Phenol extrahiert, über G-50 Sepadex (Handelsmarke) chromatografiert und einer Sthanolpräsipitation unterzogen. Die einzelstrangige cDIiS wurde dazu benutzt, die Synthese des zweiten cDlTS-St ranges mittels Umkehrtranskriptase in. oben beschriebener Weise selbst in Gens zu setzen. Die einzelstrangige "Haarnadelschleife1' am 3'-Ende des ersten cDUS-Stranges wurde entsprechend"der Beschreibung von Leong et al. (siehe
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oben) und Ullrich, A» et al. (siehe oben) durch Verdauung mit 31-Nuklease beseitigt. Die doppelstrangige cDIS wurde mittels Phenolextraktion, Chromatografie über G-50 Sephadex und Ethanolpräzitation gereinigt. Die doppelstrangige cDNS wurde laut Beschreibung von Roychoudhury et al. (siehe oben) unter Verwendung von dCTP und terminaler Transferase 3' dCMP-ge s chwänzt ♦
Das Plasmid pBR322 wurde durch Pst-I-Sndonuklease gespalten und mit dGMP vermittels der oben"beschriebenen Schwansbildungspro se dur geschwänzt, wobei allerdings anstelle von dCTP dGTP eingesetzt wurde. 50 ng des dG—geschwänzten, Pst-I-gespaltenen Plasmids pBR322 sowie 20 ng der dC-geschwänzten doppelstrangigen cDUS wurden in einer 50-/Ul-Reaktion gemäß Cook et al. (siehe oben) gekühlt.
Die Transformation von S. coli 1776 mit der Plasmid-Präparation wurde folgendermaßen ausgeführt; B. coli 1776 wurde durch 20minütige Inkubation bei 4 0C in 75 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 und 10 mM Tr is (pH 7,5) für Dl\f8 permeabel gemacht. Plasmid und Bakterien wurden 60 min bei 4 0C und daran anschließend 2 min bei 41 0C inkubiert. Die transformierten Kolonien wurden hinsichtlich Tetrazyklin-Resistenz selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DHS wurde durch
32
liolonie-Hybridisierung an frisch präparierte J P-markierte bovine Hypophysen-cDHS gemäß Beschreibung von Grunstein und Hogness (siehe oben) nachgewiesen. Au3 selektierten Kolonien v/urde Plasmid-DHS präpariert, mit Pst I zerschnitten, auf 1%iger Agarose einer Elektrophorese Unterzogen, mit Bthidiumbromid gefärbt, fotografiert und schließlich nach der Methode von Southern (siehe oben) auf iiitrozellulosefilt er übertragen. Das Vorhandensein von 77ä cha turns ho rmonsequenzen in der übertragenen DHS wurde durch Hybridisa-
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tion an geklönte Raktenhormon-DItfS voller Länge abgeschätzt (Seeburg, P. H, et al» - siehe oben) welche durch Einschnitt-Translation markiert worden war (LIaniatis, R, et al., Proc. Sat· Acad. Sei, USA 72, 1184 (1975))· Sin Klon wurde gewonnen, welcher mit der durch Einschnitt-Translation markierten DITS hybridisierte· Dieser Klon erhielt die Bezeichnung pB348· Die Einlagerung enthält 831 Basenpaare.
Sequenz anal,7 se der cDIIS. Pla3mid pBP34S wurde mit Pst I zerschnitten, das Phosphat an den 5'-Enden des DiTS-Fragments wurde mit alkalischer Phosphatase entfernt und unter Ver-
32 wendung von Polynukleotid-Kinase durch P-Phosphat ersetzt« Weiteres Zerschneiden mit einer Reihe anderer Restriktions-Sndonukleasen, Polyakrylamidgel-Elektrophorese sov/ie Färben und autoradiografische Untersuchung der DNS-Banden ergeben eine Restriktionskarte der geklonten DITS. Nun wurde eine große Charge pBP348 präpariert und mit Pst I, Pvu II oder
32 ——
Sau 3A zerschnitten sowie mit P ATP und Polynukleotid-Kinase markiert und dann mit anderen Enzymen zerschnitten, um DiJS-Fragment e zu erbringen, die an einem einzelnen Ende markiert sind. Diese Fragmente wurden durch Blution aus Polyakrylamidgel präpariert und nach der Beschreibung von Cooke et al. (siehe oben) sowie Maxam, A. M9 und Gilbert, W., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 74, 1560 (1977) in ihrer Sequenz dargestellt. Die Sequenz für die inserierte cDIiS ist in Abbildung 1 gemeinsam mit der entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenz dargestellt, welche durch den Empfindungsstrang, d. h. den sequentiell der jeweiligen mRIiS entsprechenden Strang codiert wird«
Der korrekte Ableserahmen wird an einem Fehlen von Termina-
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tionskodonen über einen.beträchtlichen Anteil der Einlagerung hinweg wiedererkannt. Die Numerierung der Aminosäurepositionen erfolgt mit der amino-terminalen Aminosäure von bovinem Wachstumshormon beginnend und in der positiven Richtung fortsetzend bis zum Karboxy-terminalen Endej in der negativen Richtung läuft die Uumerierung bis zum ersten AUG-Kodon, vorausgesetzt, daß ea sich dabei um den Punkt der Translationsinitiation handelt.
Unsere Befunde deuten darauf hin, daß - gemeinsam mit vielen anderen Hormonen - die Synthese von Wachstumshormon eine nach der Translation erfolgende Unisetzung mit einschloß· Die Translation von Wachstumshormon-mRIiS erbringt einen Vorläufer (Wachstums-Prähormon), welcher ein Signalpeptid enthält, das während des Transits .in das endoplasmatische Retikulum freigesetzt werden kann»
(A) Ausfü'hrungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid p3R315 verwendet wird. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion der rekombinanten Klone entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung. Die Einlagerung wird entfernt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Als Ausbeute wird eine DlTS von etwa 831 Basenpaaren mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen«
(3) Ausführungsbeispiel- 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i6 verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen identisch. Die Beseitigung und Analyse der Einlagerung gemäß Ausführungsbeispiel 2 erbringt eine DiJS mit der
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in Abbildung 1 gezeigten Sequenz,
j?ür dieses Ausfuhrungsbeispiel wird die das bovine Prä-Wachst ums hormon codierende cDlTS in der im Ausführungabeispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. All in diesem und den folgenden Ausfuhrungsbeispielen verwendeten Restriktionsstellen-Verbinder werden nach der von Scheller, R. H. et.al., Science 196, 177 (1977) beschriebenen Methode zubereitet. Die in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktions-Endonukleasen sind im Handel zu beziehen} die gewählten optischen Bedingungen richten sich, nach, den Empfehlungen der Hersteller. Die Transformation von S, coli 1776 erfolgt in der in Ausführungsbeispiel beschriebenen Weise»
(A) Hind-III-Yerbinder mit der Sequenz 5f - COAAGCTTGG - 3' werden der in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten cDii'S durch stumpfendige Ligation unter Sinsatζ von T4-DliS-Lignase verbunden, wie dies von Yalenzuela, P. et alo, üiature, 280, 815 (1979) beschrieben worden ist. Mach der Ligation wird das Produkt mit Hind III oder Hsu I entsprechend der von Ullrich, A. et alo Science 196, 1313 (1977) beschriebenen Yorgehensweise verdaut. Ebenfalls nach der von Ullrich, A« et al. (siehe oben) beschriebenen Yorgehensweise wird Plasmid pBR322 an der Hind-III-Restriktionsstelle entweder mit Hind III oder Hsu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt, iiach der ethanol a us fällung wird das phosphatasebehandelte gespaltene pBR322 der kohäsive Hind-III-Termini' enthaltenden cDjÜS gemäß Beschreibung von Ullrich, A« et al (siehe oben) verbunden. Ξ« GoIi 1776 wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und die transformierten
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Kolonien werden hinsichtlich ihrer Tetrazyklin-Resistenz selektiert· Das Vorhandensein von geklönter DHS wird entsprechend der Beschreibung in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt. Gewonnen wird eine Kolonie, welche eine Einlagerung enthält, die mit der durch Einschnitt-Translation markierten DiiS hybridisierte. Die Einlagerung wird durch . Verdauung mit Hind III oder Hsu I beseitigt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Die Einlagerung enthält etwa 830 Basenpaare und weist die in Abbildung 1 dargestellte Sequenz auf.
(B) Ausführuagsbeispiel 4 (A) wird wiederholt, wobei anstelle von pBR322 verschiedene Vektoren verwendet v/erden. Im vorliegenden Ausflihrungsbeispiel werden die Plasmide p3C101, pMB9, pBR313, pBR315 und ρΒΗ31β anstelle von pBR322 verwendet. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten Alonen entsprechen der in (A) gegebenen Beschreibung, Für alle Plasmide werden identische Ergebnisse erzielt, d. h«, in jedem Falle wird ein rekombinantes Plasmid gewonnen, welches eine Einlagerung mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz aufweist.
(C) Ausführungsbeispiel 4 (A) wird wiederholt, wobei verschiedene andere Restriktionsstellen-Verbinder und Restrik-'tions-Endonukleasen verwendet 'werden. In diesem Ausführungsbeispiel werden anstelle der Verbinder für Hind III die Verbinder für Sal I und Barn HI verwendet. Die Sequenz dieser Verbindung sind 5' - GGTGGAGG - 3» und 5' - GGGGAi1GGGG 3', Werden Sal-I-Verbinder eingesetzt, dann werden die verbinderbehandelte cDKTS und pBR322 mit Restriktions-Endonuklease Sal I gespalten, und werden Basn-HI-Verbinder eingesetzt, dann ist die Restriktions-Sndonuklease 3am HI, Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten
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Klonen entsprechen der in Ausführungsbeispiel 4(A) gegebenen Beschreibung. Für beide Verbinder und Restriktions-Endonukleasen werden identische Ergebnisse gewonnene
(D) Ausführungsbeispiel.4(G) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasmide pSC1O1, pMB9, pBR313,. pBR315 und pBR3i6 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen den in Ausführungsbeispiel 4(C) beschriebenen; es werden identische Resultate erzielt, d. h·, in jedem Falle wird eine Einlagerung gewonnen, welche in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist«»
(Ξ) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Eco-RI-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 5' - GGGaIAi1TCGG- V "anstelle des Hind-III-Verbinders sowie EcoRI anstelle von Hind III (Hsu I) verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den bereits beschriebenen identisch, mit Ausnahme dessen, daß die transformierten Kolonien nicht hinsichtlich Tetrazyklin-Sensitivität selektiert werden,« Das Vorhandensein von geklönter DIiS wird in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise erreichto Gewonnen wird ein rekominanter Klon, welcher eine Einlagerung enthält, die die in Abbildung 1 gezeigte Sequena aufweist.
(F) Ausführungsbeispiel 4(3) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasmide p3C101, pM39, pBR313 und pBR315 verwendet werden. Beibehalten werden die in Ausführungsbeispiel 4(3) beschriebenen Bedingungen; für jedes Plasmid werden identische Resultate erzielte
(G) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Pst-I-Restriktionsverb Inder mit der Sequenz 5f - GCTGCAGC-3'und Pst I anstelle des Hind-III-Verbinders bzw. Hind-III
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(Hsu. I) eingesetzt werden. Die gleichen Bedingungen werden beibehalten, mit der Ausnahme, daß die Selektion rekombinanter ülone in. der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Y/eise vorgenommen wird. Gewonnen wird ein recombinanter Klon mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.
(H) Ausfiihrungsbeiapiel 4(G) wird wiederholt, wobei anstelle von pBH322 die Plasmide pBR315 und pBR3i6 verwendet v/erden. Ss werden die gleichen Bedingungen wie in Ausführungsbeispiel 4(G) beibehalten und identische Resultate erzielt.
(I) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B) und 4(A)...(H) werden wiederholt, wobei £. coli RRI oder 5<,coli EB101 anstelle von 3a coli 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung; es' werden identische Ergebnisse erzielt.
Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die cDItfS wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt. Sco-RI-Restriktionsstellenverbinder werden gemäß der von Välensuela, P. et al. (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise stumpfendig an die cDHS angelagert und entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) niit Ec£ RI gespalten.
(A) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Gharon-i6-MS v/ird als übertragungsvektor verwendet. Die kohäsiven Enden werden durch 60ininütige Inkubation bei 42 0G in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM MgGIp gekühlt. Der Vektor wird an der IDco-RI-Restriktionssteile mit Sco-RI-Endonuklease gespalten und dann in der
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von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise mit alkalischer Phoaphatase behandelt. Fach der Sthanclauafällung wird die phosphataaebehandelte Vektor-DITS zu cDIJS hinzugegeben, welche kohäsive Sco—RI-Termini in einem molaren Verhältnis von 2 Mol Vektor"zu 1 Mol cDitfS enthält. Das Gemisch wird gemäß Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) mit T4-DliS-Ligase verbunden« Das Ligationagemiach wird direkt einer Suspension von Ξ. coli- 1776-Zellen zugesetzt, welche entsprechend Ausführungsbeispiel 1 für die Transformation vorbereitet wurden» Ebenfalls nach der im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise wird die Transformation vorgenommen. Die rekombinanten Phagen werden zurückgewonnen und auf Lac" auf Platten angelegt, welche 5-Chlor-4~ brom.-3-indolyl-ß-D-Galaktosid (X6), (80 g/ml) enthalten. Für die Herstellung von farblosen Belägen werden rekombinante Phagen selektiert, welche die in die Bco-RI-Stelle von Charon 16A inserierte cDiTS enthalten. Ein ausgewählter Rekombinat wird isoliert und mit einem Überschuß an Bco-RI-Endonukleaae verdaut j aas Aufschlußprodukt wird in"der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise analysiert. Zurück gewonnen wird eine DlTS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz. Anderenfalls wird die Ligationsmischung dazu benutzt, rekombinante Phagen durch in-vitro-Vei-packen gemäß der Beschreibung von Sternberg. IT, et alo, Gene J., 255 (1977) zu bilden. Rekombinate Phagen können darüber hinaus durch Anwendung der von Benton, W. D, und Davis, R. W,, Science 196, 180 (1977) berichteten in-situ-Plaque-K:;bridisationstechnik ausgelesen werden.
(B) In der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen V/eise hergestellte Ch.aron-3A-DI7S oder Charon-4A-DlTS wird anstelle der im vorangegangenen Ausführungsbeispiel genannten Charon-16A-DNS als Übertragungsvektor verwendet. Alle
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Bedingungen sind mit den für Charon- 16A-MS beschriebenen identisch. Die Selektion recombinanter Ptiagen erfolgt durch (a) Plattieren der Phagen auf Lac+-Bakterien auf X6-haltigen Platten und Isolieren farbloser Plaques sowie darauffolgend entweder Hybridisation an eine geeignete Sonde oder Restriktions-Bndonuklease-Verdauung in der von Blattner et al« (siehe oben) beschriebenen Weise* Die Einlagerung wird nach der bereits dargestellten Methode entfernt; als Ausbeute wird eine DHS von etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen.
(C) Als Übertragungsvektor wird anstelle der weiter oben verwendeten Charon—16A die nach Beschreibung von Tiniier et al· (siehe oben) hergestellte gt WSS , B-DlSTS genutzt. Alle'Bedingungen entsprechen den für Charon 16A beschriebenen. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt nach der Hybridisationsmethode von Benton und Davis (siehe oben). Die Einlagerung wird in der oben beschriebenen Weise entfernt und erbringt eine DITS von etwa 830 Basenpaaren länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.
(D) Die Ausführungsbeispiele 5(A).,.(C) werden wiederholt, wobei Ξ. coli RRI, R. coli HB1Ö1, E, coli DP50 oder 5. coli DP50SupP anstelle von B.cöli 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen sind identisch;'es werden identische Ergebnisse erzielt.
Ydr dieses Ausführungsbeispiel wird die bovines Prä-Wachs-' tumshormon codierende DiTS in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet. Es werden Hind-HI-Restriktionsstellenverbinder zugesetzt, und die cDITS wird mit
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Hind III oder Hag I in der in Ausführungsbeispiel 4(A) beschriebenen Weise verdaut»
Als übertragungsvektor wird das Plasmid pC194 verwendet, das - wie von Sarlich, S. D. (siehe oben) beschrieben - aus S. auraua isoliert worden war, pC194 wird an der Hind-III-Stelle mit Hind III oder Hsu I gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase in der"von Ullrich, A, et al» (siehe oben) beschriebenen Weise behandelt. Ebenfalls in der von 'Ullrich, A, et al. (siehe oben) beschriebenen Weise wird die cDItfS mit Hind-III-kohäsiven Termini mit dem gespaltenen pC194 verbunden. Entsprechend der Beschreibung von Sgaramella, Y. et al., J. Mol, Biol.. 105, 587 (1976) sowie Berenstein, S, und Sphrati-Elizue, 3,, J. Mol. Biol.. 45, (1969) erfolgt eine Kompetenz-Induktion von B, subtilis RÜB331· Die Transformation von B. subtilis RUB331 erfolgt oater Verwendung der ebenfalls von Sgaramella et al, und Borenstein et al, beschriebenen Ligationsmischung. Die ZeIlsuspension wird direkt auf L-Platten angelegt, welche 3 g Chloramphenikol enthalten. Ein selektierter Rekombinant wird isoliert und mit Hind III verdaut j das Aufschlußpro-. dukt wird gemäß Ausfiihrungsbeispiel 2 analysiert» Zurückgewonnen wird eine DWS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz,
(A) Plasmid pBR348 wird mit Hae-II-Sndonuklease verdaut, woraus ein Fragment mit 1 6OO Basenpaaren entsteht. Sine Hae-II-Stelle befindet sich innerhalb der das Wachstuma-Prähormon codierenden cDiJS-Sanlagerung, die zv/eite Stelle
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befindet sich, innerhalb des pBR322-Anteils des Plasmids. Die "Verdauung erbringt
+1 +2
| 5» - | G | G | CTlITI i. A. | G .. | .· V |
| 3f - | GGG | AA | G .. | .. 5f | |
Bovines Wachstumshormon kann entweder mit dem +1-ala- oder dem +2-phe-Rest am M^-terminalen Ende beginnen (Dayhoff et al· aiehe oben), so daß der eine versuchen könnte, den ala-Kodon zu komplettieren, während ein anderer versuchen könnte, den als Ivodon auszulöschen. Der Versuch des Auslöschens erfolgt durch Inkubieren der DlJS mit dATP und dein xCLenow-Pragment von DxTS-PoIytnerase I, da die erste Base des +2-phe-Kodons (auf dem 31 «*>— 5'-Strang) A ist. Diese Reaktion ergibt
| +1 | +2 | ...» V | |
| 5« - | C | TTG | O · » » 5 |
| 3» - | AAG | ||
Die DiTS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällte Überschüssiges dATP und die verdauten Basen werden durch ,Chromatografie auf G-50 Sephadez beseitigt. Das verbleibende 5' überstehende C des +1-ala-Kondons wird sodann gemäß Beschreibung von Shine et al., gat ure 285, 45ο (1980) mit SI-iTuklease entfernt. Diese Verdauung erbringt
+2 - 5f - TTC .... V
V - AAG .,.. 51
(B) Ausführungsbeispiel 7(A) -wird wiederholt, wobei die das bovine Prä-Wachst urns hormon codierende Desoxynukleotidsequena durch Verdauung derjenigen übertraguagsvektoren entfernt
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wird, die in den Ausführungsbeiapielen 3, 4, 5 und β durch das geeignete Restriktionsenzym vor der Verdauung mit Hae II hergestellt worden waren. Die verwendeten Übertragungsvektoren und Rekrilctionsenzyme sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Mach Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym wird die bovine Prä-V/achstumshormon-Sequenz mittels Gel-Blektrophorese isoliert und dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) weiterbehandelt. Sa werden identische Resultate erzielt.
Pst 1 3A, 3B, 4G, 4H
Hind III 4A, 4B, 6
Sal I 4C, 4D
Bam HI 4G, 4D
Sco RI 4Ξ, 4F, 5A, 5B, 50
' · .
(C) Die Ausführungsbeispiele '7(A) und 7(B) werden wiederholt, wobei anstelle des Klenow-Fragments von DNS-Polymerase I T4-D£fS-Polymerase oder 3'...S'-Sxonuklease verwendet wird. Alle anderen Bedingungen sind identisch} in jedem Falle wird die identische Sequenz des Fragments von bovinem Wachstumshormon gewonnen.
(A) Das bovine Wachstumshormon-Fragment
+1 +2 5f - C TTC .... V
3» - C CGG AAG .... 5f
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wird durch Hae-II-Verdaaung gemäß Beschreibung in Aasführungsbeispiel 7(A) 'oder 7(3) hergestellt, Der Komplettierungsversuch wird folgendermaßen durchgeführt: Die DHS wird mit dATP, dGTP, dTTP und dein IQ enow-Fragment von DiTS-PoIymerase I inkubiert
Diese Reaktion erbringt
+1 +2 5» - G GGC TTG #.o. V
V - G GGG AAG .... 5'·
Die DUS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt. Die Sequenz wird sodann in Anwesenheit von dCTP mit dem Klenow Fragment von DIS-Polymerase I inkubiert. Danach wird die Sequenz laut Beschreibung von Shine et al., Ifature, 285» (1980) mit S1~iJuklease verdaut; dies erbringt die Sequenz
51 - GGG TTG „... V
V - GGG AAG ..... 51.
(B) Ausführungsbeiapiel 8(A) wird wiederholt, wobei im zweiten Inkubationsschritt, d„ h. unter Anwesenheit von dCTP T4-DI\rS-Polymerase oder 31 *..5f-2xonuklease anstelle des Xlenow-Fragments vei".vendet wird. Die anderen Bedingungen sind identisch; in jedem Falle wird die identische bovine Wachstumshormonsequenz erlangt.
Die das bovine Wachstumshormon codierende Desoxvnukleotid-Sequenz wird in Ünertragungsvelctoren inseriert, wie dies im vorangegangenen Test für die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Sequenz beschrieben wurde.
(A) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I),
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(D) und β werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DlTS jene DlTS verwendet wird, die in den Ausführungsbeispielen 7(A), 7(B) oder 7(G) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DlTS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restructionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 darge- ~) legt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert.
In jedem Falle wird eine DlTS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Phe-Kodon auf Position 2 beginnt und sich zum Snde der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt.
(B) Die Ausführungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I), 5(A)...(D) und 6 werden wiederholt, v/obei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DITS jene DiTS verwendet wird, die in den Ausführungsbeispielen 8(A) oder 8(B) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DiTS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Reätr&kt ions enzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analy- J siert. In jedem Falle wird eine DiTS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Ala-Kodon auf Position 1 beginnt und sich zum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt.
Bovines Wachst umshermon icann durch jedwede der oben beschriebenen Methoden dargestellt werden.
(A) Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon als ein E1U-
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sionsprotein wurde mittels eines Radioimmunoassay-Versuches und eines Hinizell-Versuches demonstriert» Im Radioimmunoassay -Versuch wurden pBP348-haltige Ξ« coli 1776 oder pBR322-haltige S«coli als KontrollVariante in Itfährbouillon angebaut und mittels Zentrifugatlon gesammelt· Die Zellen wurden resuspendiert und lysiert, sodann wurden strahlenmarkierte ovines Wachstumshormon sowie oviner (oder boviner) Wachstumshormon-Antikörper hinzugegeben» Der Immunkomplex -wurde ausgefüllt und hinsichtlich Radioaktivität gemessen» Dieser Versuch zeigt, daß das Pusionsprotein einen Teil der bovinen Wachstumshormon-Immunoaktivität zurückhält. Um darüber hinaus die Produktion eines Pusionsproteins zu veranschaulichen, wurde ein Minizell-Versuch nach der von Meagher, R. B. et al., Gell, JjO, 521 (1977) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt* Abbildung 2 zeigt die aus B»-coli— 1776-Minizellen resultierenden Gelelektrophorese-Banden» Bande (A) wurde von 3, coli 1776 gewonnen, das mit pBP348 transformiert worden"war· Bande (b) wurde von Ξ. coli 1776 gewonnen, das mit pBR322 transformiert worden war» Bande (c) sind Molekülmas3e-Marker0 (A) zeigt das fusionsprodukt von ß-Laktamase und bovinem Wachstums-Prähormon, (B) zeigt Prä-Laktamase, und (C) zeigt ß-Laktamase» Dieser Versuch zeigt, daß pBP348 ein Pusionsprotein erzeugt, welches aus 1 S3 Aminosäuren von ß-Laktamase, 217 Aminosäuren von bovinem Wachstum-Prähormon und einigen durch die normalerweise nichtübersetste 5'-Region codierten verbindenden Aminosäuren besteht. Die ermittelte gesamte relative Molekülmasse annähernd 45 000 - stimmt mit der vorausberechneten relativen Molekülmasse des Hybridproteins überein.
(3) Zur direkten Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon wird die Sinlagerangs-DiTS zunächst durch teilweise Pst-I-Sndonukleaseverdauung von pBP343 separiert und mittels
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präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt« Sodann wird eine 15- g-Probe der gereinigten Einlagerungs-DIiS modifiziert, indem die DNS in Wasser suspendiert wird, welchem eine konzentrierte Salzlösung zugesetzt wird, so daß die endgültige Zusammensetzung 70 mM Tris (pH, 8,8) 70 mM MgGl2, 10 ml Dithiothreitol und 13,75 Einheiten T4-DI\TS-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 250 1 enthält«. Das Reaktionsge-
O misch wird für einige Minuten bei 37 0C inkubiert, sodann
wird dATP bis zu einer Konzentration von 50 mM zugesetzt, um die endonukleolytische Verdauung am nächstgelegenen Adenin-Rest zu beenden. Uach 30 s zusätzlicher Inkubation wird das Enzym durch S&inütige Wärmebehandlung bei 65 0C. inaktiviert. Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt, wobei einmal dCTP anstelle von dATP und beim zweitenmal erneut d'TTP verwendet wird. Die behandelte DHS wird mittels Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Die Verdauung mit S1-Huklease zur Erlangung von stumpfen Enden wird in der von Ullrich, A. et al· (siehe oben) beschriebenen Weise ausgeführt. Dieses Vorgehen dient dazu, ein DITS-Molekül zu erzeugen, das am Startkolben auf Position ITr. -26 abschließt,
:J Derartige Moleküle werden übersetzt, wenn sie in einen Expressionsvektor inseriert werden, dessen Insert ionssteile sich etwa 3··.11 iTukleotide von der Ribosom-Bindungsstellensequenz einer Expressionseinheit entfernt befindet»
Ein Vektor für die direkte Darstellung wird durch Modifikation des Plasmids ptrp_E30 vermittels Beseitigen von 23·« ,29 IJukleotiden unter Einsatz von T4-DiTS-Polymerase und S1-ITuklease gemäß obiger Beschreibung konstruiert»
Sowohl die modifizierte cDitfS als auch der modifizierte Expressionsvektor werden mit einem spezifischen Verbinder mit der Sequenz 5f-CGGGATCGGG-3' an einem Strang und seiner
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komplementären Sequenz am anderen Strang versorgt; dies erfolgt durch stumpf endige Ligation unter Verwendung von DlJS-Ligase, wie dies von Valenzuela (siehe oben) beschrieben wurde· Die Verbinder liefern gegenüber Bam-HI-Bndonuklease sentitive Restriktionsstellen -, letztere wird zur Erleichterung der Insertion verwendet. Die Insertionsreaktion wird in der von Ullrich, A. et al, (siehe oben) beschriebenen Weise durchgeführt. Die Wirtsbakterien E. coli HB101, RRI oder 1776 werden durch die die inserierte modifizierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragenden rekombinanten Vektoren transformiert, und die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin selektiert« Sin einzelner, für die weitere Analyse ausgewählter Transformant wird als ptrpE3Q/bGH bezeichnet.
Durch ptrpS30/bGH transformierte Bakterienzellen werden bei 37 0C in einem mit Leuzin, Prolin, Vitamin B1 und Ampizillin angereichertem Standard-Minimalmedium (M9) angebaut. In der-frühen log-Phase wird das trp-Operon durch Zusetzen von ß-Indolylakry!säure (30 g/ml Medium) iduziert. Die Kontrollkulturen bleiben uninduziert, Nach drei weiteren Stunden Wachstum werden 1,5 ml Zellen durch Hinzugeben von 20 Ci ^5S-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert· Die Zellen werden sodann durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 250 /ul Pufferlösung - 10 % (V/V) Glvkol, 5 h (V/V) ß-Merksptoethanol und 2,3 % (M/V) SDS in O,O625M Tris (pH 6,8) - resuspendiert. Die Suspension wird 5 min gekocht, dann einem 10-/ä-(M/V)-3DS-Polyakrylamid-GeI appliziert und elektrophoretisch "fraktionierto Die Proteinbanden werden autoradiografisch sichtbar gemacht. Die Ergebnisse lassen da3 Vorhandensein einer neuen Proteinbande von etwa 24 000 Dalton erkennen, weiche in nichtinduzierten oder nichttransformoerten Kulturen nicht beobachtet
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Das bovine Wachst ums-Prähormon wird durch, herkömmliche Techniken einschließlich beispielsweise Gelfiltration, lonenaustauscJhchromatografie, Affinitätschromatografie und Mfferential-Löslichkeitatechniken gereinigt. Die Überführung von Wachstums-Prähormon in Wachstumshormon erfolgt durch das von Jackson, R. G. et al, (siehe oben) beschriebene Verfahren*
(G) Ein spezifischer Verbinder mit der Sequenz 5'-CGGGATGGG GATG-3' auf einem Strang und seiner komplementären Sequenz auf dem anderen wird der des bovine Wachstumshormon codierenden DITS, wie sie in den Ausführungsbeispielen 7(A)·.. (G) und 8(A) ·.·(B) hergestellt wurde, stumpfendig verbunden» Diese modifizierte DXiS wird dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 10(B) in das modifizierte Plasmid ptrpE30 inseriert· Wirtsbakterien werden laut Ausführungsbeispiel 10(B) transformiert, kultiviert, und das resultierende bovine 7/achst ums hormon wird gereinigt·
Wenn auch die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, so versteht es sich von selbst, daß sie weiterer Modifikationen fähig ist· Mit der vorliegenden Anmeldung sollen einige Variationen, Anwendungen oder Bearbeitungen der Erfindung bezüglich ihrer Grundsätze geschützt werdenj dies schließt auch solche Abweichungen von der hier dargestellten Qffenlegung ein, die sich aus der bekannten und üblichen Praxis in jenem Fachgebiet ergeben, auf das sich die Erfindung besieht.
Claims (1)
- -42- 6.7.198362 585/18SrfindungsanspruchVerfahren zur Herstellung eines Fusionsproteine, das die Aminosäuresequenz von R;üider-Präwachstumshorm oder die Aminosäuresequenz von Rinderwachstumshorci an seinem C-Terminalende und einen Teil eines prokaryotischen Proteins an seinem EF-Terniinalende aufweist, gekennzeichnet durch Inkubieren eines Mikroorganismus, der durch einen Sxpressionstransfervektor transformiert wurde, der eine für das Rinderwachstumshormon oder das Rinder-Präwachstumshormon kodierende Desoxynukleotidsequenz aufweist, die durch Reaktion einer für Rinder-Präwachstumshormon oder Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynukleotidsequenz mit einem DNS-Ivlolekül hergestellt wurde, das seinerseits durch Spalten.-eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzyrn. an einem Punkt innerhalb einer -Expressionskontrollregion hergestellt worden ist.Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| US18134880A | 1980-08-26 | 1980-08-26 |
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Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD81252962A DD211581A5 (de) | 1980-08-26 | 1981-08-26 | Verfahren zur herstellung eines fusionsproteins |
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