CZ92198A3

CZ92198A3 - Short forms of beta-8 chemokin

Info

Publication number: CZ92198A3
Application number: CZ98921A
Authority: CZ
Inventors: John White; Edward Appelbaum; Daniel O´Shannessy; James Allan Fornwald; Kevin O´Donnell
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1998-07-15
Also published as: CN1405180A; JPH11512610A; HUP9802699A3; WO1997012041A1; NO981387L; KR20030096447A; EP0859842A4; EA199800352A1; KR19990063834A; EP0859842A1; BR9610671A; ZA968204B; HUP9802699A2; PL326080A1; AU711573B2; NZ320932A; TR199800575T1; MX9802380A; AU7379096A; CN1198186A

Abstract

Novel polypeptides of the truncated form of human Ck beta -8 are provided. Methods for using the polypeptides are also provided.

Description

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká polypeptidu a polynukleotidových sekvencí, které kódují, krátkou formu chemokinu beta-8 (Ckp8) .The invention relates to polypeptide and polynucleotide sequences that encode the short form of chemokine beta-8 (Ckp8).

Dosavadní stav technikyCurrent state of the art

Vynález se týká polypeptidu a polynukleotidových sekvencí, které kódují krátkou formu chemokinu beta-8 (Ckp8). Zvláště pak vynález popisuje použití polynukleotidových a polypeptidových sekvencí, produkci polynukleotidových a polypeptidových sekvencí a inhibici působení polypeptidu. Chemokiny, které se také nazývají interkrinní cytokiny, jsou podrodinou strukturálně a funkčně příbuzných cytokinů. Tyto molekuly jsou malé, indukovatelné, prozánětlivé proteiny. Obecně chemokiny vykazují na úrovni aminokyselin 20% až 75% homologii a jsou charakterizovány čtyřmi konzervativními cysteinovými zbytky, které tvoří dvě disulfidové vazby. Na základě uspořádání prvních dvou cysteinových zbytků se chemokiny dělí do dvou podrodin označovaných alfa a beta. U podrodiny alfa jsou první dva cysteiny odděleny jednou aminokyselinou a proto se označuje jako podrodina C-X-C. U podrodiny beta spolu dva cysteiny sousedí a proto se nazývá podrodinou C-C. První cystein tvoří disulfidovou vazbu se třetím cysteinem a druhý se čtvrtým, což vede k tomu, že většina citokinů má podobnou terciální strukturu. U řady chemokinů dochází k proteolytickému zpracování, přičemž vzniká zralý (mature) protein. Toto zpracování obvykle zahrnuje štěpení krátké vedoucí sekvence na N-konci proteinu. Nejméně 14 rozličných α-chemokinů a 12 β-chemokinů je popsáno na úrovni proteinu a/nebo cDNA.The invention relates to polypeptide and polynucleotide sequences that encode the short form of chemokine beta-8 (Ckp8). In particular, the invention describes the use of polynucleotide and polypeptide sequences, the production of polynucleotide and polypeptide sequences and the inhibition of polypeptide action. Chemokines, also called intercrine cytokines, are a subfamily of structurally and functionally related cytokines. These molecules are small, inducible, pro-inflammatory proteins. In general, chemokines show 20% to 75% homology at the amino acid level and are characterized by four conservative cysteine residues that form two disulfide bonds. Based on the arrangement of the first two cysteine residues, chemokines are divided into two subfamilies designated alpha and beta. In the alpha subfamily, the first two cysteines are separated by one amino acid and is therefore referred to as the C-X-C subfamily. In the beta subfamily, two cysteines are adjacent to each other and is therefore called the C-C subfamily. The first cysteine forms a disulfide bond with the third cysteine and the second with the fourth, resulting in most cytokines having a similar tertiary structure. A number of chemokines undergo proteolytic processing, resulting in a mature protein. This processing usually involves cleavage of a short leader sequence at the N-terminus of the protein. At least 14 different α-chemokines and 12 β-chemokines have been described at the protein and/or cDNA level.

·· • · ··· • · ·

·· «··· «·

Interkrinní cytokiny vykazují široký rozsah funkcí. Jedním důležitým rysem je jejich schopnost stimulovat chemotaktickou migraci rozdílných typů buněk, jako jsou monocyty, neutrofily, T lymfocyty, bazofily a fibroblasty. a a β podrodiny chemokinů se liší selektivitou cílových buněk. Většina a chemokinů působí na neutrofily, fibroblasty, T buňky a NK buňky, β-chemokiny primárně působí na monocyty a T lymfocyty. Řada chemokinů vykazuje prozánětlivou aktivitu a jsou zahrnuty do více kroků zánětlivého procesu. Mezi tyto aktivity patří stimulace uvolnění histaminu, uvolnění lysozomálního enzymu a leukotrienu, vzrůst adherence cílových imunních buněk k endoteliálním buňkám, zvýšení vázání komplementárních proteinů, indukovaná exprese granulocytových adhezních molekul a komplementárních receptorů a respirační prasknutí. Vedle role při zánětlivých reakcích, jisté chemokiny vykazují další aktivity. Například makrofágový zánětlivý protein (MIP-1) je schopen potlačit proliferaci hematopoietinových kmenových buněk, faktor červených krvinek4 (PF-4) je potencionální inhibitor růstu endoteliálních buněk, interleukin-8 (IL-8) podporuje množení keratinocytů a GRO je autokrinní růstový faktor buněk melanomu. Chemokiny se uplatňují při řadě fyziologických a nefyziologických stavů, zvláště dochází-li k zánětům. Mezi tyto stavy patří, ale nejsou omezeny na přístup lymfocytů, hojení ran, hematopoietinová regulace a imunologické poruchy, jako jsou alergie, astma a artritida. Zpočátku se řada chemokinů izolovala jako produkty zánětlivé odezvy. Například MIP-1 se původně izoloval jako prozánětlivý cytokin indukovaný endotoxinem a produkovaný makrofágy. Jiní členové této podrodiny se identifikovaly podobně na základě indukce zánětu a na sekvenční homologii aminokyselin. V této souvislosti seIntercrine cytokines exhibit a wide range of functions. One important feature is their ability to stimulate chemotactic migration of different cell types such as monocytes, neutrophils, T lymphocytes, basophils and fibroblasts. The α and β subfamilies of chemokines differ in target cell selectivity. Most α chemokines act on neutrophils, fibroblasts, T cells and NK cells, β-chemokines primarily act on monocytes and T lymphocytes. A number of chemokines exhibit pro-inflammatory activity and are involved in multiple steps of the inflammatory process. These activities include stimulation of histamine release, lysosomal enzyme and leukotriene release, increased adherence of target immune cells to endothelial cells, increased binding of complement proteins, induced expression of granulocyte adhesion molecules and complement receptors, and respiratory burst. In addition to a role in inflammatory reactions, certain chemokines exhibit other activities. For example, macrophage inflammatory protein (MIP-1) is able to suppress the proliferation of hematopoietic stem cells, red blood cell factor 4 (PF-4) is a potential inhibitor of endothelial cell growth, interleukin-8 (IL-8) promotes keratinocyte proliferation, and GRO is an autocrine cell growth factor melanoma. Chemokines are used in a number of physiological and non-physiological conditions, especially when there is inflammation. These conditions include but are not limited to lymphocyte access, wound healing, hematopoietin regulation, and immunological disorders such as allergies, asthma, and arthritis. Initially, a number of chemokines were isolated as products of the inflammatory response. For example, MIP-1 was originally isolated as a proinflammatory cytokine induced by endotoxin and produced by macrophages. Other members of this subfamily were similarly identified based on inflammasome induction and amino acid sequence homology. In this context,

0 0 • 00 • a · • · · · • 0 0 0 ·*·0 0 • 00 • and · • · · · • 0 0 0 ·*·

0 0· uvádí polypeptid Ck3~8 v plné délce, tak i jeho zkrácené formy podle vynálezu.0 0· lists the full-length Ck3~8 polypeptide as well as its shortened forms according to the invention.

použitelné nukleovýchapplicable nuclear

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Vynález poskytuje směs nových polypeptidů, které jsou zkrácenými formami lidského Ckp-8, stejně jako biologicky aktivní a diagnosticky nebo terapeuticky fragmenty, jejich analogy a deriváty.The invention provides a mixture of novel polypeptides that are truncated forms of human Ckp-8, as well as biologically active and diagnostically or therapeutically fragments, analogs and derivatives thereof.

Vynález dále popisuje izolované molekuly kyselin, které kódují takové polypeptidy, mezi něž patří mRNA, DNA, cDNA, genomová DNA, stejně jako biologicky aktivní a diagnosticky nebo terapeuticky použitelné fragmenty, analogy a jejich deriváty.The invention further describes isolated acid molecules that encode such polypeptides, which include mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, as well as biologically active and diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs and derivatives thereof.

Vynález dále popisuje rekombinační postup produkce takových polypeptidů, který zahrnuje kultivaci rekombinantních prokaryontních a/nebo eukaryontních hostitelských buněk, jenž obsahují sekvence nukleové kyseliny, za podmínek, které podporují expresi uvedených proteinů, a následnou izolaci uvedených proteinů.The invention further describes a recombinant procedure for the production of such polypeptides, which includes the cultivation of recombinant prokaryotic and/or eukaryotic host cells containing nucleic acid sequences under conditions that support the expression of said proteins, and the subsequent isolation of said proteins.

Vynález dále uvádí způsob využití takových polypeptidů nebo polynukleotidů, které kódují takové polypeptidy, pro terapeutické účely například pro ochranu kmenových buněk kostní dřeně proti chemoterapeutickým chemoterapie a stimulace léčení ran.The invention further provides a method of using such polypeptides or polynucleotides that encode such polypeptides for therapeutic purposes, for example for protecting bone marrow stem cells against chemotherapeutic chemotherapy and stimulating wound healing.

Vynález dále popisuje protilátky polypeptidů.The invention further describes polypeptide antibodies.

Vynález dále popisuje antagonisty takového polypeptidů, které se mohou použít při inhibici působení uvedeného polypeptidů, například při léčbě aplastické anémie, myelodysplastického syndromu, astma a artritidy.The invention further describes antagonists of such polypeptides, which can be used in inhibiting the action of said polypeptides, for example in the treatment of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, asthma and arthritis.

Vynález také popisuje sondy nukleových kyselin, které obsahují molekuly nukleových kyselin, které mají dostatečnou délku pro specifickou hybridizaci se sekvencí Ckp-8.The invention also describes nucleic acid probes that contain nucleic acid molecules that are of sufficient length to specifically hybridize to a Ckp-8 sequence.

činidlům během proti takovému * · • · ··· 1 · · · • · · i · · · ·«agents during against such * · • · ··· 1 · · · • · · i · · · ·«

Vynález dále zahrnuje diagnostické testy vhodné pro detekci onemocnění, které se spojuje s nedostatečnou nebo nadměrnou expresí polypeptidu, a pro detekci mutací v sekvencích nukleových kyselin, jenž kódují takový polypeptid.The invention further includes diagnostic tests suitable for detecting a disease that is associated with insufficient or excessive expression of a polypeptide, and for detecting mutations in nucleic acid sequences that encode such a polypeptide.

Dále vynález zahrnuje způsob využití polypeptidu nebo polynukleotidů, které kódují takový polypeptid, jako činidla sloužícího k in vitro výzkumným účelům, pro syntézu DNA a k přípravě vektorů DNA, pro účely vývoje terapeutických a diagnostických činidel při léčbě nemocí u lidí.Furthermore, the invention includes a method of using a polypeptide or polynucleotides that encode such a polypeptide as a reagent used for in vitro research purposes, for DNA synthesis and for the preparation of DNA vectors, for the purposes of developing therapeutic and diagnostic agents in the treatment of diseases in humans.

Popisují se sekvence DNA kódující polypeptidy, které jsou strukturálně příbuzné s podrodinou prozanětlivého interkrinního chemokinu. Polynukleotidová sekvence kódující Ck0-8 v plné délce (120 aminokyselin) se získala z knihovny cDNA endotelia aort. Vynález popisuje nové zkrácené formy Ckp-8, které obsahují pouze 82, 76, 75 nebo 74 aminokyselin C-konce dlouhé formy. Štěpí se aminokyseliny N-konce stejně jako 21 zbytková sekvence signálního peptidu. Stejně jako u dlouhé formy Ck0-8 i v těchto klonech spolu sousedí první dva cysteinové zbytky, což je řadí do beta nebo C-C podrodiny chemokinů. Přítomností tohoto motivu se odlišují od podrodiny chemokinů C-X-C, kde první dva cysteinové zbytky jsou odděleny jednou aminokyselinou.DNA sequences encoding polypeptides that are structurally related to the pro-inflammatory intercrine chemokine subfamily are described. The full-length polynucleotide sequence encoding Ck0-8 (120 amino acids) was obtained from an aortic endothelium cDNA library. The invention describes new truncated forms of Ckp-8 that contain only 82, 76, 75 or 74 amino acids of the C-terminus of the long form. The N-terminal amino acids are cleaved as well as the 21 residue sequence of the signal peptide. As with the long form of Ck0-8, the first two cysteine residues are adjacent to each other in these clones, placing them in the beta or C-C subfamily of chemokines. The presence of this motif distinguishes them from the C-X-C chemokine subfamily, where the first two cysteine residues are separated by one amino acid.

Polynukleotidové sekvence kódující zralé polypeptidy (SEQ ID č. 1, 2, 3 a 4) mohou být tvořeny libovolnými nukleovými kyselinami, jako jsou RNA, ssDNA, genomová DNA, atd., které zahrnují další kódující a nekódující sekvence spojené s polypeptidem. Vynález může zahrnovat libovolnou kódující sekvenci DNA, která kóduje stejný zraký protein a může se použít pro degeneraci aminokyselinového kódu. Mezi ně se zahrnují libovolné varianty této sekvence ve formě alel nebo ty, které se nevyskytují přirozeně. Vynález také popisuje polynukleotidy, ve kterých kódující sekvence fúzuje ve stejném čtecím rámci s jinou sekvencí DNA, což vede k • · • · · · 4 • · « ·· ·· ·» • ·· expresi nebo sekreci proteinu v buňce nebo slouží jako markér pro identifikaci proteinu v buňkách (například HA tag).The polynucleotide sequences encoding the mature polypeptides (SEQ ID Nos. 1, 2, 3 and 4) can be made up of any nucleic acids such as RNA, ssDNA, genomic DNA, etc., which include other coding and non-coding sequences associated with the polypeptide. The invention may include any DNA coding sequence that encodes the same visual protein and may be used to degenerate the amino acid code. These include any variants of this sequence in the form of alleles or those that do not occur naturally. The invention also describes polynucleotides in which the coding sequence is fused in the same reading frame to another DNA sequence, resulting in • · • · · · 4 • · « ·· ·· ·» • ·· protein expression or secretion in the cell or serving as a marker to identify a protein in cells (for example, an HA tag).

Vynález dále zahrnuje polynukleotidové sekvence, které hybridizují s popisovanou sekvencí, která je nejméně z 50% a s výhodou z 70% sekvenčně identická. Tyto polynukleotidy kódují polypeptidy, které si s výhodou udržují stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako konečný polypeptid. V jiném případě sekvence může být polynukleotid, který má s výhodou 50 baží identických se sekvencemi podle vynálezu, s kterými také hybridizuje, ale není aktivní. Takové sekvence se mohou použít jako sonda nebo jako primer pro PCR.The invention further includes polynucleotide sequences that hybridize with the described sequence, which is at least 50% and preferably 70% sequence identical. These polynucleotides encode polypeptides that preferably retain the same biological function or activity as the final polypeptide. In another case, the sequence can be a polynucleotide, which preferably has 50 bases identical to the sequences according to the invention, with which it also hybridizes, but is not active. Such sequences can be used as a probe or as a primer for PCR.

Polypetidy podle vynálezu mohou být rekombinantními polypeptidy, přirozenými polypeptidy nebo syntetickými polypeptidy. Deriváty těchto polypeptidů jsou ty, ve kterých dochází ke substituci jedné nebo více aminokyselin; ty, ve kterých jedna nebo více aminokyselin obsahuje substituované skupiny; ty, kde konečný protein fúzoval s jinou látkou; nebo ty, kde další aminokyseliny fúzovaly s konečnými proteiny.Polypeptides according to the invention can be recombinant polypeptides, natural polypeptides or synthetic polypeptides. Derivatives of these polypeptides are those in which one or more amino acids are substituted; those in which one or more amino acids contain substituted groups; those where the final protein has fused to another substance; or those where additional amino acids have fused to the final proteins.

Polypetidy se s výhodou získávají v izolované formě a upřednostňuje se čistota odpovídající až homogenitě.Polypeptides are preferably obtained in isolated form and a purity corresponding to homogeneity is preferred.

Vynález se také týká vektorů, které zahrnují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky upraveny tímto vektorem, a rekombinantní produkce polypeptidu podle vynýlezu. Do hostitelských buněk se zavádí vektory podle vynálezu (klonování nebo exprese). Odborníkům jsou zřejmé kultivační podmínky, které jsou vhodné pro aktivaci promotorů, selekci transformantů nebo amplifikaci zkráceného genu Ckp~8.The invention also relates to vectors that include polynucleotides according to the invention, host cells that are genetically modified by this vector, and recombinant production of the polypeptide according to the invention. The vectors according to the invention are introduced into the host cells (cloning or expression). Cultivation conditions that are suitable for activation of promoters, selection of transformants or amplification of the truncated Ckp~8 gene are obvious to those skilled in the art.

Tato polynukleotidová sekvence může být obsažena v libovolném expresivním vektoru, který je tak dlouhý, aby se mohl replikovat a je vhodný pro hostitele. Polynukleotidová sekvence začleněná v expresivním vektoru je řízena promotorem vhodným pro syntézu mRNA (například promotor LTR). Expresivní 'Γ ··♦ vektor také obsahuje vazebné místo pro ribozóm, které slouží pro iniciaci translace, terminátor transkripce, zesilovací elementy, které zesilují transkripci (například pozdní zesilovač SV40) a vhodně vybraný selekční markér, který slouží k prokázání stability vektoru v hostiteli (například gen pro rezistenci na ampicilin). Hostitelskými buňkami mohou být buňky výšších eukaryontů, jako jsou savčí nebo hmyzí buňky, buňký nižších eukaryontů, jako jsou kvasinky nebo prokaryontní buňky, jako jsou bakterie. Zavedení této konstrukce do hostitelské buňky lze provést podle řady protokolů. Všechny zhora zmiňované kroky jsou odborníkům zřejmé. V oboru jsou známy jednotlivé kroky klonování, výběr vektoru a hostitele (Sambrook et al., Moleculara Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)).This polynucleotide sequence can be contained in any expression vector that is long enough to replicate and suitable for the host. The polynucleotide sequence incorporated in the expression vector is driven by a promoter suitable for mRNA synthesis (for example, an LTR promoter). The expression 'Γ ··♦ vector also contains a ribosome binding site that serves to initiate translation, a transcription terminator, enhancer elements that enhance transcription (such as the SV40 late enhancer), and an appropriately selected selection marker that serves to demonstrate the stability of the vector in the host ( for example the ampicillin resistance gene). Host cells can be cells of higher eukaryotes such as mammalian or insect cells, cells of lower eukaryotes such as yeast or prokaryotic cells such as bacteria. Introduction of this construct into a host cell can be accomplished by a number of protocols. All the steps mentioned above are obvious to experts. Cloning steps, vector and host selection are known in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)).

Syntéza proteinů v hostitelských buňkách se může řídit vhodným promotorem. Pro produkci takových proteinů, za použití RNA získaných z konstrukcí DNA podle vynálezu, se mohou také použít bezbuněčné translační systémy. V jiném případě polypeptid podle vynálezu se může produkovat synteticky pomocí obecně přístupných syntetizátorů peptidu.Protein synthesis in host cells can be controlled by a suitable promoter. Cell-free translation systems can also be used to produce such proteins using RNA obtained from DNA constructs according to the invention. Alternatively, the polypeptide of the invention can be produced synthetically using generally available peptide synthesizers.

Následuje transformace nebo transfekce vhodného hostitelského kmene a kultivace hostitelského kmene až do dosažení vhodné hustoty buněk, indukce vybraného promotoru vhodným způsobem (například změnou teploty nebo chemickou indukcí) a pokračující kultivace buněk. Buňky se v typickém případě izolují centrifugací, chemicky nebo fyzikálně se narušuje stěna a čistí se různými způsoby až do dosažení homogenity (například chromatografií, HPLC). V závislosti na použité hostitelské buňce se může polypeptid modifikovat stejným způsobem (například glykozylací). Polypeptidy podle vynálezu mohou také zahrnovat iniciační methioninový zbytek.This is followed by transformation or transfection of a suitable host strain and cultivation of the host strain until a suitable cell density is reached, induction of the selected promoter by a suitable method (for example by temperature change or chemical induction) and continued cultivation of the cells. Cells are typically isolated by centrifugation, the wall is disrupted chemically or physically, and purified by various methods until homogeneity is achieved (for example, chromatography, HPLC). Depending on the host cell used, the polypeptide can be modified in the same way (for example, by glycosylation). Polypeptides of the invention may also include an initiating methionine residue.

·· ·» · ·* ·» • ««9 9 9 9 9·· ·» · ·* ·» • ««9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 99 • ·«« «····« · · · · · ·«··· · · ·99 9 9 9 9 9 9 99 • ·«« «····« · · · · · ·«··· · · ·

99 ·-* · * · · ·99 ·-* · * · · ·

Dlouhá forma Ckp-8 působí jako chemické činidlo na leukocyty a proto se může použít v různých imunoregulačních a zánětlivých procesech, stejně jako u řady onemocnění. Tento protein se exprimoval převážně v tkáni hemopoietinového původu. Jeden důležitý biologický účinek polypeptidu Ckp-8 na leukocyty je stimulace mobilizace rezerv Ca++. Tato mobilizace se dotýká funkční aktivaci buňky. Zjistilo se, že stimulace diferenciovaných buněk EOL-3 směsí, která obsahuje čtyři zkrácené formy Ckp-8 (SEQ ID č.: 1 až 4), vede k bezprostřednímu zvýšení obsahu intracelulárního Ca++, což závisí na dávce. Při testování jednotlivých forem se nej aktivnější jeví krátká forma, která má sekvenci SEQ ID č.: 4. Naopak dlouhá forma byla ve srovnání s krátkými formami CkP~8 při mobilizaci Ca++ 1000 krát méně potentní. Potence krátkých forem podle vynálezu může mít vliv na účinnost při terapeutické aplikaci tohoto chemokinu při stavech, které zahrnují, ale nejsou omezeny na ochranu kmenových buněk kostní dřeně proti chemoterapeutickým činidlům během chemoterapie, odstranění buněk leukemie, stimulace imunitní odezvy, regulaci hematopoietiny a dopravu lymfocytů, léčbu psoriazy, pevné nádory, zesílení obrany hostitele proti rezistentním chronickým a akutním infekcím a stimulaci hojení ran.The long form of Ckp-8 acts as a chemical agent on leukocytes and can therefore be used in various immunoregulatory and inflammatory processes, as well as in a number of diseases. This protein was mainly expressed in tissue of hemopoietin origin. One important biological effect of the Ckp-8 polypeptide on leukocytes is the stimulation of the mobilization of Ca ++ reserves. This mobilization affects the functional activation of the cell. Stimulation of differentiated EOL-3 cells with a mixture containing four truncated forms of Ckp-8 (SEQ ID NO: 1 to 4) was found to result in an immediate dose-dependent increase in intracellular Ca++. When testing the individual forms, the short form, which has the sequence SEQ ID No. 4, appears to be the most active. On the contrary, the long form was 1000 times less potent in mobilizing Ca++ compared to the short forms of CkP~8. The potency of the short forms of the invention may influence efficacy in the therapeutic application of this chemokine in conditions that include, but are not limited to, protection of bone marrow stem cells against chemotherapeutic agents during chemotherapy, elimination of leukemia cells, stimulation of the immune response, regulation of hematopoietin and lymphocyte trafficking, treatment of psoriasis, solid tumors, enhancement of host defense against resistant chronic and acute infections and stimulation of wound healing.

Polynukleotidy a polypeptidy podle· vynálezu se mohou použít jako činidla pro výzkum, při syntéze DNA a přípravě vektorů DNA a pro účely vývoje terapeutických a diagnostických činidel pro léčbu onemocnění u lidí (například expanze nezralých hematopoietinových progenitorových buněk). Fragmenty této zkrácené polynukleotidové sekvence Ckp-8 se mohou také použít jako hybridizační sondy pro izolaci jiných genů, které mají vysokou sekvenční podobnost. V oboru jsou metody pro tento druh experimentů dobře známy.The polynucleotides and polypeptides of the invention can be used as agents for research, in the synthesis of DNA and the preparation of DNA vectors, and for the purposes of developing therapeutic and diagnostic agents for the treatment of diseases in humans (for example, expansion of immature hematopoietic progenitor cells). Fragments of this truncated Ckp-8 polynucleotide sequence can also be used as hybridization probes to isolate other genes that have high sequence similarity. Methods for this type of experiment are well known in the art.

• fl flflfl • · • ·· · • fl flfl ř « · ’ • flfl • •flfl <• fl flflfl • · • ·· · • fl flfl ø « · ’ • flfl • •flfl <

• fl « flfl ·»• fl « flfl ·»

Vynález popisuje použití těchto sekvencí jako součást diagnostického testu pro detekci onemocnění nebo náchylnost k onemocněním spojených s mutacemi v sekvencích nukleové kyseliny. Takové nemoci se spojují s nedostatečnou expresí polypeptidů chemokinu. Například jedinci, kteří nesou mutace v genu Ckp-8 se mohou určit na úrovni DNA za použití různých metod, jako je PCR. Detekcí alterací elektroforetické mobility fragmentů DNA v gelu bez nebo za použití denaturačních činidel se může dosáhnout genetického testování, které je založeno na rozdílech sekvencí DNA. Použitím metod, jako je hybridizace,ochrana RNázou, chemické štěpení, přímé sekvenování DNA, analýza RFLP a Southernův přenos DNA, se může určit specifická sekvence DNA. Použitím analýzy in šitu se mohou také určit mutace.The invention describes the use of these sequences as part of a diagnostic test for the detection of diseases or susceptibility to diseases associated with mutations in nucleic acid sequences. Such diseases are associated with insufficient expression of chemokine polypeptides. For example, individuals carrying mutations in the Ckp-8 gene can be determined at the DNA level using various methods such as PCR. By detecting alterations in the electrophoretic mobility of DNA fragments in a gel without or with the use of denaturing agents, genetic testing that is based on DNA sequence differences can be achieved. Using methods such as hybridization, RNase protection, chemical digestion, direct DNA sequencing, RFLP analysis, and DNA Southern blotting, the specific DNA sequence can be determined. Mutations can also be determined using in situ analysis.

Vynález také popisuje diagnostický test pro detekci změn hladin proteinu Ckp~8 v různých tkáních, přítomnosti onemocnění nebo náchylnosti k například v případě nádorového onemocnění, se může detekovat nadměrná exprese proteinů ve srovnání se vzorkami normální kontrolní tkáně. Testy užívané pro detekci hladin proteinu Ckp-8 ve vzorku, který se získal z hostitele, jsou v oboru dobře známy. Mezi ně patří radioimunotest, test kompetativního navázání, analýza westernovým přenosem, test ELISA a sendvičové testy.The invention also describes a diagnostic test for detecting changes in Ckp~8 protein levels in various tissues, the presence of disease or susceptibility to, for example, in the case of cancer, an overexpression of proteins can be detected compared to normal control tissue samples. Assays used to detect Ckp-8 protein levels in a sample obtained from a host are well known in the art. These include radioimmunoassay, competitive binding assay, western blot analysis, ELISA and sandwich assays.

Vynález popisuje způsob identifikace receptorů pro chemokinové polypeptidy. Gen kódující receptor se může určit řadou způsobů, které jsou v oboru dobře známy, mezi něž patří panoramování ligandu a FACS dělení.The invention describes a method of identifying receptors for chemokine polypeptides. The gene encoding the receptor can be determined by a number of methods well known in the art, including ligand panning and FACS fractionation.

Jiný přístup k identifikaci receptoru zahrnuje navázání značeného polypeptidů na buněčnou membránu na základě fotoafinity nebo přípravu extraktu, kde je exprimována molekula receptoru. Značený komplex se může izolovat a podrobí se proteinovému mikrosekvenování. Získaná protože za onemocnění, aminokyselinová sekvence se použije pro vytvořeni sady degenerovaných oligonukleotidových sond pro účely testováni knihovny cDNA, přičemž se mají určit geny kódující putativní receptory.Another approach to receptor identification involves binding a labeled polypeptide to a cell membrane based on photoaffinity or preparing an extract where the receptor molecule is expressed. The labeled complex can be isolated and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained because of the disease is used to generate a set of degenerate oligonucleotide probes for the purpose of screening a cDNA library to identify genes encoding putative receptors.

Vynález popisuje způsob testování látek za účelem identifikace agonistů a antagonistu k polypeptidu chemokinu podle vynálezu. Chemotaxe se může testovat tak, že umístíme buňky, na které chemicky působí tyto polypeptidy na povrch filtru s póry, které jsou dostatečně velké, aby propustily buňky (5mm). Roztoky potencionálních agonistů a antagonistů jsou umístěny na dně komory tak, že buňky migrují nebo je jim bráněno migrovat skrz membránu v určitém časovém úseku. V jiném případě receptory CkP~8 se inkubují se značeným polypeptidem v přítomnosti uvedené látky. Může se měřit schopnost látky buď blokovat interakci nebo vzájemně s receptorem reagovat za nepřítomnosti polypeptidu.The invention describes a method of testing substances for the purpose of identifying agonists and antagonists to the chemokine polypeptide according to the invention. Chemotaxis can be tested by placing cells chemically acted upon by these polypeptides on the surface of a filter with pores large enough to pass the cells (5mm). Solutions of potential agonists and antagonists are placed at the bottom of the chamber so that the cells migrate or are prevented from migrating through the membrane for a certain period of time. In another case, the CkP~8 receptors are incubated with the labeled polypeptide in the presence of said substance. The ability of a substance to either block the interaction or interact with the receptor in the absence of the polypeptide can be measured.

Příklady potencionálních antagonistů zkráceného Ckp-8 zahrnují protilátky, oligonukleotidy, které se vážou na polypeptidy, nebo polypeptidy, které se vážou na receptor polypeptidu divokého typu, ale ztrácí biologickou aktivitu. Antisense technologie, která se používá pro řízení exprese genu, může také být potencionálním antagonistou. Schopnost shora zmiňovaných technologií je odborníkům zřejmá.Examples of potential antagonists of truncated Ckp-8 include antibodies, oligonucleotides that bind to polypeptides, or polypeptides that bind to the wild-type polypeptide receptor but lose biological activity. Antisense technology, which is used to control gene expression, can also be a potential antagonist. The capability of the above-mentioned technologies is obvious to experts.

Anatagonisty tím, že brání produkci polypeptidu podle vynálezu, se mohou použít pro léčbu infekčních onemocnění, jako je silikóza, sarkoidóza, idiopatická pulmonární fibróza, idiopatická hyper-eozinofilní syndrom a endotoxický šok. Antagonisty, které brání infiltraci monocytů do stěny arterií, se mohou dále použít při léčbě arteriosklerózy. Dále se mohou použít při léčbě alergických reakcí, které jsou zprostředkovány histaminem, a různých imunologických poruch, mezi něž patří dermitida.Antagonists, by preventing the production of the polypeptide of the invention, can be used for the treatment of infectious diseases such as silicosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic hyper-eosinophilic syndrome and endotoxic shock. Antagonists that prevent monocyte infiltration into the arterial wall may further be used in the treatment of arteriosclerosis. They can also be used in the treatment of allergic reactions that are mediated by histamine and various immunological disorders, which include dermatitis.

Antagonisty se mohou, na základě jejich schopnosti zabránit přitahování monocytů do oblasti poranění, použít také pro léčbu chronických a akutních zánětů. Na základě zabránění přítoku monocytů do určené oblasti se mohou dále použít při léčbě zánětlivého pulmonárního onemocnění, všeobecných zánětů a revmatoidní artritidy.Antagonists, based on their ability to prevent the attraction of monocytes to the area of injury, can also be used for the treatment of chronic and acute inflammation. By preventing the influx of monocytes into the designated area, they can be further used in the treatment of inflammatory pulmonary disease, general inflammation and rheumatoid arthritis.

Antagonisty se mohou použít při léčbě případů porušení kostní dřeně u aplastické anémie nebo myelodysplastického syndromu. Mohou se také použít při léčbě astma a alergie, stejně jako fibrózy subepiteliální základní membrány, která je příznakem astmatu plic.Antagonists can be used to treat cases of bone marrow failure in aplastic anemia or myelodysplastic syndrome. They can also be used in the treatment of asthma and allergies, as well as fibrosis of the subepithelial basement membrane, which is a symptom of pulmonary asthma.

Chemokinový polypeptid, agonisty a antagonisty se mohou použít v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem, jako je fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextróza, voda, glycerol, etanol a jejich kombinace. Formulace by měla být vhodná pro daný způsob aplikace. Vynález také popisuje farmaceutický balíček nebo kit, který obsahuje jednu nebo více nádob naplněných jednou nebo více ingrediencemi farmaceutických kompozic podle vynálezu. Polypeptidy, agonisty a antagonisty se mohou použít spolu s dalšími terapeutickými látkami.The chemokine polypeptide, agonists, and antagonists may be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier such as saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The formulation should be suitable for the given method of application. The invention also describes a pharmaceutical package or kit that contains one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions according to the invention. Polypeptides, agonists, and antagonists may be used in conjunction with other therapeutic agents.

Farmaceutické kompozice se mohou aplikovat vhodným způsobem, a to povrchově, intravenózně, intraperitonálně, intramuskulárně, přímo do nádoru, podkožně, intranasálně nebo intradermálně v množství, které je účinné pro léčbu specifické indikace. Tyto aplikace jsou odborníkům známy.The pharmaceutical compositions may be administered by any convenient route, namely, topically, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, directly into the tumor, subcutaneously, intranasally, or intradermally in an amount effective to treat the specific indication. These applications are known to those skilled in the art.

Chemokinové polypeptidy, agonisty nebo antagonisty, které jsou polypeptidy, se mohou použít v souladu s vynálezem pomocí exprese takového polypeptidu in vivo. Tento typ genové terapie je v oboru dobře znám. Například, do buněk získaných od pacienta se může vnést DNA nebo RNA kódující krátkou formu polypeptidu Ckp-8 ex vivo a tyto buňky exprimující uvedený polypeptid se aplikují zpět pacientovi. Podobně se buňkyChemokine polypeptides, agonists or antagonists that are polypeptides can be used in accordance with the invention by expressing such a polypeptide in vivo. This type of gene therapy is well known in the art. For example, DNA or RNA encoding a short form of a Ckp-8 polypeptide can be introduced ex vivo into cells obtained from a patient, and these cells expressing said polypeptide are administered back to the patient. Similarly, the cells

mohou geneticky upravit in vivo pro expresi polypeptidu in vivo.they can be genetically engineered in vivo to express the polypeptide in vivo.

Jak je známo v oboru, mohou se použit retrovirové partikule, které obsahuji RNA kódující polypeptid podle vynálezu. Pro transdukci balící se buněčné linie (například PE501), která může probíhat různými způsoby (například elektroporací), za účelem vytvoření buněčné linie producentů se mohou použít retrovirové plazmidové vektory. V preferovaném provedení vynálezu retrovirové expresivní vektory obsahují polynukleotidové sekvence, které jsou řízeny promotorem, jako je LTR, a obsahují selekční markér rezistence na léky (například neo). Příprava takových vektorů a vzniklé buněčné linie jsou odborníkům známy. Buněčná linie producentů tvoří infekční retrovirové partikule obsahující vektor, které zahrnují sekvenci(e) nukleové kyseliny, jenž kóduje polypeptidy. Takové retrovirové partikule obsahující vektor se pak mohou použít pro transdukci eukaryontních buněk, například fibroblastů nebo endoteliálních buněk buď in vitro nebo in vivo. Transdukované eukaryontní buňky pak budou exprimovat sekvenci(e) nukleové kyseliny kódující protein.As known in the art, retroviral particles can be used which contain RNA encoding a polypeptide of the invention. Retroviral plasmid vectors can be used to transduce a packaging cell line (eg PE501), which can be done by various methods (eg electroporation), to create a producer cell line. In a preferred embodiment of the invention, retroviral expression vectors contain polynucleotide sequences that are driven by a promoter, such as an LTR, and contain a selectable drug resistance marker (eg, neo). The preparation of such vectors and the resulting cell lines are known to those skilled in the art. The producer cell line forms infectious retroviral particles containing a vector that includes the nucleic acid sequence(s) that encodes the polypeptides. Such vector-containing retroviral particles can then be used to transduce eukaryotic cells, for example fibroblasts or endothelial cells, either in vitro or in vivo. The transduced eukaryotic cells will then express the nucleic acid sequence(s) encoding the protein.

Sekvence podle vynálezu jsou také vhodné pro identifikaci chromozomu. Sekvence jsou specificky cíleny do chromozomu a mohou také hybridizovat s určitými oblastmi na jednotlivých chromozomech. Mapování DNA chromozomu je důležitý krok při korelaci genů, které jsou spojovány s onemocněním. Jeden způsob dobře známý v oboru zahrnuje přípravu primerů používaných pro testování hybridů somatických buněk, které obsahují jednotlivé lidské chromozomy, pomocí PCR. Pouze ty hybridy, které obsahují lidský gen odpovídající primeru, dají vzniku amplifikovanému fragmentu. Jiné mapovací strategie, které jsou známy v oboru, jsou například hybridizace in šitu, pretestování se značenými chromozomy, sublokalizace fragmentů specifických chromozomů flfl «The sequences according to the invention are also suitable for chromosome identification. The sequences are specifically targeted to a chromosome and can also hybridize to certain regions on individual chromosomes. Chromosomal DNA mapping is an important step in correlating genes that are associated with disease. One method well known in the art involves the preparation of primers used to test somatic cell hybrids that contain individual human chromosomes by PCR. Only those hybrids that contain the human gene matching the primer will give rise to the amplified fragment. Other mapping strategies known in the art are, for example, in situ hybridization, pretesting with labeled chromosomes, sublocalization of fragments of specific chromosomes flfl «

♦ ·· * fl • flfl · fl <· « ♦ flfl « • fl fl· <♦ ·· * fl • flfl · fl <· « ♦ flfl « • fl fl· <

účelem pozice geny a se může fyzická mapy. Vztah mezi za použití stejných primerů PCR a předvýběr hybridizací za účelem konstrukce knihovny chromozomové specifické cDNA. Za použití fluorescenční hybridizace in šitu (FISH) u klonů cDNA pro metafázové rozmístění chromozomů se může určit přesné umístění chromozomu v jednom kroku.purpose of position genes and can physical maps. Relationship between using the same PCR primers and hybridization preselection to construct a chromosome-specific cDNA library. Using fluorescence in situ hybridization (FISH) of cDNA clones for metaphase distribution of chromosomes, the exact position of a chromosome can be determined in one step.

Po té, co se zmapovala jedna sekvence za upřesnění umístění chromozomu, sekvence sladit s daty genové onemocněním se může stanovit vazebnou analýzou. Libovolné rozdíly na cDNA nebo ve sekvencích genů u postižených a zdravých jedinců mohou indikovat onemocnění. Například mutace DNA, které se nacházejí pouze u postižených jedinců mohou být způsobeny kauzativním agents onemocnění.After one sequence has been mapped to refine the chromosome location, sequence alignment with gene disease data can be determined by linkage analysis. Any differences in cDNA or gene sequences between affected and healthy individuals may indicate disease. For example, DNA mutations that are found only in affected individuals may be caused by causative agents of the disease.

Polypeptidy, jejich fragmenty nebo jejich deriváty nebo analogy nebo buňky je exprimující se mohou použít jako imunogeny pro produkci protilátek. Tyto protilátky mohou být například polyklonální nebo monoklonální. Vynález také popisuje chimérní, jednořetězcové a humanizované protilátky, jako jsou Fab fragmenty nebo produkt exprese Fab knihovny. Pro produkci uvedených protilátek a fragmentů se mohou použít různé metody známé v oboru. Polyklonální protilátky, které jsou připraveny standardními postupy, se mohou použít pro izolaci polypeptidů z tkáně, která exprimuje tento polypeptid. Pro přípravu monoklonálních protilátek se může použít libovolná metoda, která poskytuje protilátky kontinuální kultivaci buněčné linie. Způsob popsaný pro produkci jednořetězcových protilátek účelem produkce jednořetězcových imunogennímu polypeptidů podle humanizovaných protilátek proti se může upravit za protilátek proti vynálezu. Pro expresi imunogennímu polypeptidů podle vynálezu se mohou také použít transgenní myši.Polypeptides, fragments thereof or derivatives or analogs thereof or cells expressing them can be used as immunogens for the production of antibodies. These antibodies can be, for example, polyclonal or monoclonal. The invention also describes chimeric, single-chain and humanized antibodies, such as Fab fragments or the expression product of a Fab library. Various methods known in the art can be used to produce said antibodies and fragments. Polyclonal antibodies that are prepared by standard procedures can be used to isolate polypeptides from tissue that expresses that polypeptide. For the preparation of monoclonal antibodies, any method can be used that provides antibodies in continuous culture of a cell line. The method described for the production of single-chain antibodies for the purpose of producing single-chain immunogenic polypeptides according to humanized anti-antibodies can be adapted to the anti-antibody of the invention. Transgenic mice can also be used for the expression of immunogenic polypeptides according to the invention.

Zde uvedené počáteční plazmidy jsou běžně dostupné nebo se mohou konstruovat z dostupných plazmidů podle ♦ ** • « · 9 • · ♦ ·The starting plasmids listed here are commercially available or can be constructed from available plasmids according to ♦ ** • « · 9 • · ♦ ·

9 9 99 9 9

9 9 · · publikovaných instrukcí. Plazmidy ekvivalentní s těmi zde popsanými jsou známy v oboru. Různé zde popsané restrikční enzymy používané pro štěpení DNA jsou běžně dostupné a reakční podmínky, kofaktory a jiné požadavky jsou také v oboru známy. Separace štěpených fragmentů na základě velikosti probíhá na 8% polyakrylamidovém gelu.9 9 · · published instructions. Plasmids equivalent to those described herein are known in the art. The various restriction enzymes described herein used for DNA digestion are commercially available, and the reaction conditions, cofactors, and other requirements are also known in the art. Size-based separation of the cleaved fragments takes place on an 8% polyacrylamide gel.

Oligonukleotidy, které se zde zmiňují, jsou buď jednořetězcové polydeoxynukleotidy nebo dva komplementární polydeoxynukleotidové řetězce, které je možné chemicky syntetizovat. Takové syntetické oligonukleotidy nemají žádný fosforečnan na 5'-konci a tak se nebudou ligovat s jiným oligonukleotidem bez přidání uvedeného fosforečnanu pomocí ATP za přítomnosti kinázy. Syntetický oligonukleotid se bude ligovat k fragmentu, který nebyl defosforylyzován. Pokud není jinak uvedeno transformace probíhá, jak se popisuje v publikaci Graham, F and Van der Eb, A., Virology 1973, 52, 456-457.Oligonucleotides referred to herein are either single-stranded polydeoxynucleotides or two complementary polydeoxynucleotide chains that can be chemically synthesized. Such synthetic oligonucleotides have no phosphate at the 5'-end and thus will not ligate to another oligonucleotide without addition of said phosphate by ATP in the presence of kinase. The synthetic oligonucleotide will ligate to the fragment that has not been dephosphorylated. Unless otherwise stated, transformation is carried out as described in Graham, F and Van der Eb, A., Virology 1973, 52, 456-457.

Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention

Příklad 1: Bakteriální exprese a izolace Ck3~8Example 1: Bacterial expression and isolation of Ck3~8

Sekvence DNA kódující Ckp-8, ATCC# 7567 6, se na začátku amplifikovala za použití primerů PCR, které odpovídají sekvencím 5'- a 3'-konce zpracovaného proteinu Ckβ-8 (bez sekvence signálního peptidu) a vektorové sekvence 3'-konce genu Ckp~8. 5'oligonukleotidový primer má sekvenciThe DNA sequence encoding Ckp-8, ATCC# 7567 6, was initially amplified using PCR primers that correspond to the 5'- and 3'-end sequences of the processed Ckβ-8 protein (without the signal peptide sequence) and the 3'-end vector sequence of the Ckp~8 gene. The 5' oligonucleotide primer has the sequence

5'-TCA GGA TCC GTC ACA AAA GAT GCA GA-3'(SEQ ID č.:5) a 3'primer má sekvenci 5'-CGC TCT AGA GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' (SEQ ID č.:6). Tyto primery obsahují restrikční místa BamHI a Xbal užívané pro klonování do oblasti polylinkru s rezistencí na ampicilin expresivního vektoru PQE-9 (Qiagen, lne., Chatsworth, CA). Amplifikované sekvence se ligovaly do rámce PQE-9 se sekvencí kódující histidin tag a vazebné místo pro ·· ·5'-TCA GGA TCC GTC ACA AAA GAT GCA GA-3' (SEQ ID No: 5) and the 3' primer has the sequence 5'-CGC TCT AGA GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' (SEQ ID No: 6). These primers contain the BamHI and XbaI restriction sites used for cloning into the ampicillin resistance polylinker region of the PQE-9 expression vector (Qiagen, lne., Chatsworth, CA). Amplified sequences were ligated in-frame to PQE-9 with the sequence encoding the histidine tag and the binding site for ·· ·

4 ·4·

4 · ·4

4 444* • 4 4 • 4 44,444* • 4 4 • 4 4

44 • 4 « «44 • 4 « «

4 44 • 44 4 I4 44 • 44 4 I

4 I *· ribozom (RBS). Tato ligační směs se použila pro transformaci E.coli kmene M15/rep4 (Qiagen), který obsahuje plazmid pREP4 s větším počtem kopií. Plazmid pREP4 exprimuje láci represor a také nese rezistenci na kanamycin. Transformanti se identifikovaly na základě jejich schopnosti růst na LB plotnách, které obsahují ampicilin/kanamycin. Klony, které obsahují požadované konstrukce (izolované a potvrzené pomocí restrikční analýzy), se kultivovaly přes noc v kapalné kultuře v LB médiu doplněném ampicilinem (10C^g/ml) a kanamycinem (25μg/ml). Tato kultura se používá pro inokulaci velkoobjemové kultury v poměru 1:100 až 1:250. Buňky se kultivovaly až kultura dosáhla optické hustoty mezi 0,4 a 0,6 při vlnové délce 600. Přidal se IPTG (izopropyl-B-Dthiogalaktopyranozid) v konečné koncentraci lmM. Buňky se kultivovaly další 3 až 4 hodiny, pak se izolovaly centrifugací. Buněčný pelet se rozmíchal v chaotropním činidle, kterým je 6M guanidin HCI, vyčeřil se a podrobil se chromatografií na nikl-chelátové koloně za podmínek, které umožňují pevné navázání proteiny obsahující 6-His tag (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 1984, 411, 177-184). Zkrácený CkP-8 (čistota 95%) je eluován z kolony 6M guanidinem HCI pH5 a za účelem renaturace se působí 3M guanidinem HCI, lOOmM fosforečnanem sodným, lOmM glutathionem (redukován) a 2mM glutathionem (oxidován). Po inkubaci v roztoku po dobu 12 hodin se protein dialyzoval do lOmM fosforečnanu sodného.4 I *· ribosome (RBS). This ligation mixture was used to transform E.coli strain M15/rep4 (Qiagen), which contains the pREP4 plasmid with a higher copy number. Plasmid pREP4 expresses the lac repressor and also carries kanamycin resistance. Transformants were identified based on their ability to grow on LB plates containing ampicillin/kanamycin. Clones containing the desired constructs (isolated and confirmed by restriction analysis) were grown overnight in liquid culture in LB medium supplemented with ampicillin (10 µg/ml) and kanamycin (25 µg/ml). This culture is used to inoculate a bulk culture at a ratio of 1:100 to 1:250. Cells were cultured until the culture reached an optical density between 0.4 and 0.6 at a wavelength of 600. IPTG (isopropyl-B-Dthiogalactopyranoside) was added at a final concentration of 1mM. Cells were cultured for an additional 3-4 hours, then isolated by centrifugation. The cell pellet was resuspended in the chaotropic agent of 6M guanidine HCl, clarified and chromatographed on a nickel-chelate column under conditions that allow for the firm binding of proteins containing the 6-His tag (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 1984, 411, 177-184). Truncated CkP-8 (purity 95%) is eluted from the column with 6M guanidine HCl pH5 and treated with 3M guanidine HCl, 100mM sodium phosphate, 10mM glutathione (reduced) and 2mM glutathione (oxidized) for renaturation. After incubation in solution for 12 hours, the protein was dialyzed into 10mM sodium phosphate.

Příklad 2: Exprese rekombinantního Ckp~8 v buňkách COSExample 2: Expression of recombinant Ckp~8 in COS cells

Plazmid CMV-Ckp-8 HA je odvozen od vektoru pcDNAI/Amp (Invitrogen) obsahující gen pro ampicilinovou rezistenci a promotor CMV, po kterém následuje oblast polylinkru, intron SV40 a polyadenylační místo. Fragment DNA kódující sekvenceThe CMV-Ckp-8 HA plasmid is derived from the pcDNAI/Amp vector (Invitrogen) containing the ampicillin resistance gene and the CMV promoter followed by a polylinker region, an SV40 intron, and a polyadenylation site. Fragment of DNA coding sequence

* · • 4 · • ·444 4 ·* · • 4 · • ·444 4 ·

·· 4« » * 9 • 99 · · • · * ·» ·♦ zkráceného Ckp-8 a HA tag fúzovaný do rámce se 3'-koncem je klonován do oblasti polylinkru vektoru; exprese rekombinantního proteinu se řídí promotorem CMV. HA tag odpovídá epitopu odvozeného od hemaglutininového proteinu chřipky, jak se popisuje v publikaci (I.Wilson et al., Cell 1984, 37:767). Infúze HA tag s cílovým proteinem umožňuje jednoduchou detekci rekombinantního proteinu protilátkou, která rozeznává epitop HA.·· 4« » * 9 • 99 · · • · * ·» ·♦ truncated Ckp-8 and an HA tag fused in-frame with the 3'-end is cloned into the polylinker region of the vector; expression of the recombinant protein is driven by the CMV promoter. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein as described in (I. Wilson et al., Cell 1984, 37:767). Infusion of the HA tag with the target protein allows simple detection of the recombinant protein by an antibody that recognizes the HA epitope.

Za účelem exprese rekombinantní krátké formy CkP~8 jsou buňky COS transfektovány exprimujícím vektorem za použití metody DEAE-Dextran (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Buňky se značí dva dny po transformaci 35S-cysteinem po dobu osmi hodin. Shromáždí se kultivační medium a buňky se lyžují detergentem (pufrem RIPA (150mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50mM Tris, pH7,5) (Wilson, I. Et al., ID. 1984, 37:767). Buněčný lyzát a kultivační medium se vysrážely monoklonální protilátkou specifickou pro HA. Vysrážené proteiny se analyzovaly na 15% SDS-PAGE gelech.To express the recombinant short form of CkP~8, COS cells are transfected with the expression vector using the DEAE-Dextran method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) ). Cells are labeled two days after transformation with 35S-cysteine for eight hours. Culture medium is collected and cells are lysed with detergent (RIPA buffer (150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH7.5) (Wilson, I. et al., 1984, 37:767) The cell lysate and culture medium were precipitated with HA-specific antibody.

Příklad 3: Exprese a izolace krátké formy chemokinu CkP~8 za použití bakulovirového expresivního systémuExample 3: Expression and isolation of a short form of the chemokine CkP~8 using a baculovirus expression system

Buňky SF9 se infikovaly rekombinantním bakulovirem, která se vytvořil za účelem exprese cDNA CkP~8. Buňky se infikovaly v kultuře o objemu 10 litrů při MOI 2 a kultivovaly se při nízké koncentraci séra při teplotě 28°C po dobu 72 až 96 hodin. Buněčný odpad z infikovaných buněk se odstranil centrifugací při malé rychlosti. Do supernatantu se přidal koktejl inhibitorů proteázy v konečné koncentraci 20pg/ml (lpg/ml leupeptinu, lgg/ml E-64 a lmM EDTA) . Za těchto zvláštních kultivačních podmínek (to je nízkáSF9 cells were infected with a recombinant baculovirus engineered to express the CkP~8 cDNA. Cells were infected in a 10 liter culture at an MOI of 2 and cultured in low serum at 28°C for 72 to 96 hours. Cellular debris from infected cells was removed by low-speed centrifugation. A cocktail of protease inhibitors was added to the supernatant at a final concentration of 20 pg/ml (lpg/ml leupeptin, lgg/ml E-64 and 1mM EDTA). Under these special cultivation conditions (that is, low

9 ♦ « · ♦ 9 9 99 ♦ « · ♦ 9 9 9

9 999999999

9 99 9

9 ··9··

9 9 99 9 9

9 999 99

9 9 99 9 9

9 99 9

99 koncentrace séra) vzniklo několik na NH₂-konci zkrácených forem polypeptidu Ck0-8. Obsah Ckp-8 v supernatantu se monitorovala nanesením 20 až 30μ1 supernatantu na 15% SDSPAGE gel. Zkrácené formy Ckp-8 se detekovaly jako viditelné pruhy, které odpovídají síle exprese několika miligramů na litr. Zkrácený Ckp~8 se dále čistil třístupňovým čistícím procesem: 1) Afinitní chromatografie vázající heparin. Supernatant bakulovirové kultury se smíchal s 1/3 objemu pufru, který obsahuje lOOmM HEPES/MEM/NaOAc pH6, a filtroval se membránou s póry 0,22pm. Vzorek se pak aplikoval na kolonu vázající heparin (HE1 poros 20, ΒΙΟ-Perceptive System lne.). Krátká forma Ckp-8 se eluovala NaCl o přibližné koncentraci 300mM v lineárním gradientu 50 až 500mM NaCl v 50mM HEPES/MES/NaOac při pH6; 2) Katexová chromatografie. Protein získaný z heparinové chromatografie se 5 krát naředil pufrem, který obsahoval 50mM HEPES/MES/NaOAc pH6. Výsledná směs se pak aplikovala na katexovou kolonu (S/M poros 20, BIOPerceptive System lne.). Zkrácený CkP~8 se eluoval 250mM NaCl v lineárním gradientu 25 až 300mM NaCl v 50mM HEPES/MES/NaOac při pH6; 3) Chromatogafické dělení na základě velikosti. Následuje po katexové chromatografií, zkrácený Ck3~8 se dále čistil nanesením na kolonu dělící na základě velikosti (HW50, TOSO HAAS, 1,4 x 4,5 cm). Sekvenování aminokyselin izolovaného vzorku ukazuje, že jde o směs nejméně čtyř dominantních sekvencí, které odpovídají čtyřem zkráceným formám proteinu (SEQ ID č.: 1, 2, 3 a 4).99 serum concentration) resulted in several truncated forms of the Ck0-8 polypeptide at the NH ₂ -end. The content of Ckp-8 in the supernatant was monitored by loading 20 to 30 μl of the supernatant on a 15% SDSPAGE gel. Truncated forms of Ckp-8 were detected as visible bands corresponding to an expression strength of several milligrams per liter. The truncated Ckp~8 was further purified by a three-step purification process: 1) Heparin-binding affinity chromatography. The baculovirus culture supernatant was mixed with 1/3 volume of buffer containing 100 mM HEPES/MEM/NaOAc pH6 and filtered through a 0.22 µm pore membrane. The sample was then applied to a heparin-binding column (HE1 poros 20, ΒΙΟ-Perceptive System lne.). The short form of Ckp-8 was eluted with approximately 300 mM NaCl in a linear gradient of 50 to 500 mM NaCl in 50 mM HEPES/MES/NaOac at pH6; 2) Cathexis chromatography. The protein obtained from heparin chromatography was diluted 5 times with a buffer containing 50 mM HEPES/MES/NaOAc pH6. The resulting mixture was then applied to a cathexis column (S/M poros 20, BIOPerceptive System lne.). Truncated CkP~8 was eluted with 250 mM NaCl in a linear gradient of 25 to 300 mM NaCl in 50 mM HEPES/MES/NaOac at pH6; 3) Chromatographic separation based on size. Following cation exchange chromatography, the truncated Ck3~8 was further purified by applying to a size-separating column (HW50, TOSO HAAS, 1.4 x 4.5 cm). Amino acid sequencing of the isolated sample shows that it is a mixture of at least four dominant sequences that correspond to four truncated forms of the protein (SEQ ID NO: 1, 2, 3 and 4).

Příklad 4: Stimulace buněk EOL-3 a PBL směsí, která obsahuje krátkou formu Ck3~8Example 4: Stimulation of EOL-3 and PBL cells with a mixture containing the short form of Ck3~8

Buňky EOL-3 se kultivovaly za standardních kultivačních podmínek a diferenciovaly se po dobu dvou týdnů s ΙμΜ • 1 9 99EOL-3 cells were cultured under standard culture conditions and differentiated for two weeks with ΙμΜ • 1 9 99

99

99999999

9999

9 9 19 9 1

9 99 butyrátem sodným. PBL (periferní krevní leukocyty) se získaly z lidského dárce punkcí cévy. PBL se čistily standardním postupem. Obě preparace buněk se odděleně kultivovaly s ΙμΜ FURA-2 po dobu 45 minut. Buňky v množství lxlO⁶ na ml (celkově 2ml) se vnesly do plastických kyvet. Fluorescentní spektrofotometr se nastavil, aby vykázal bazální měření před tím, než se přidaly krátké formy (871a, 871b, 871c, 871RP) nebo dlouhá forma (889) Ck3~8 v koncentraci 0,33 až 33nM. Na spektrofotometru se monitoroval vzestup fluorescence. Změny volného Ca++ uvnitř buňky se vypočítaly z první lyže buněk Tritonem xlOO v přítomnosti nadbytku Ca++ (získala se hodnota Fmax) a pak po přidání 5mM EGTA se získala hodnota Emin. Poměr volného Ca++ se může vypočítat z minimálních a maximálních hodnot. MCP-1 (chemotaktický protein-1 monocytů) je známý chemokin a použil se jako pozitivní kontrola.9 99 sodium butyrate. PBLs (peripheral blood leukocytes) were obtained from a human donor by venipuncture. PBLs were purified using a standard procedure. Both cell preparations were separately cultured with ΙμΜ FURA-2 for 45 min. Cells in an amount of 1x10 ⁶ per ml (total 2 ml) were introduced into plastic cuvettes. The fluorescence spectrophotometer was set to read the basal reading before the short forms (871a, 871b, 871c, 871RP) or the long form (889) of Ck3~8 were added at a concentration of 0.33 to 33 nM. The rise in fluorescence was monitored on a spectrophotometer. Changes in intracellular free Ca ++ were calculated from first lysing the cells with Triton x100 in the presence of excess Ca ++ (Fmax value was obtained) and then after addition of 5mM EGTA the Emin value was obtained. The ratio of free Ca++ can be calculated from the minimum and maximum values. MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) is a known chemokine and was used as a positive control.

9 ·* *** ·9 ·* *** ·

SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:SEQUENCE PROTOCOL (2) Data on SEQ ID NO: 1 (i) Sequence characteristics:

(A) délka: 82 (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1(A) length: 82 (B) type: amino acid (D) topology: linear (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 1

GLU GLU ASN ASN PRO FOR VAL WALL LEU LEU LEU LEU ASP ASP ARG ARG PHE PHE HIS HIS ALA Alas THR THR SER SER ALA Alas ASP ASP 1 1 5 5 10 10 15 15 CYS CYS CYS CYS ILE ILE SER SER TYR TYR THR THR PRO FOR ARG ARG SER SER ILE ILE PRO FOR CYS CYS SER SER LEU LEU LEU LEU 20 20 25 25 30 30 GLU GLU SER SER TYR TYR PHE PHE GLU GLU THR THR ASN ASN SER SER GLU GLU CYS CYS SER SER LYS LYS PRO FOR GLY GLY VAL WALL 35 35 40 40 45 45 ILE ILE PHE PHE LEU LEU THR THR LYS LYS LYS LYS GLY GLY ARG ARG ARG ARG PHE PHE CYS CYS ALA Alas ASN ASN PRO FOR SER SER 50 50 55 55 60 60 ASP ASP LYS LYS GLN GLN VAL WALL GLN GLN VAL WALL CYS CYS MET MET ARG ARG MET MET LEU LEU LYS LYS LEU LEU ASP ASP THR THR 65 65 70 70 75 75 ARG ARG ILE ILE LYS LYS THR THR ARG ARG LYS LYS ASN ASN 80 80

(2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:(2) Data on SEQ ID NO: 2 (i) Sequence characteristics:

(A) délka: 77 (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2(A) length: 77 (B) type: amino acid (D) topology: linear (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2

LEU ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS ILE SER TYR 15 10 15LEU ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS ILE SER TYR 15 10 15

THR PRO ARG SER ILE PRO CYS SER LEU LEU GLU SER TYR PHE GLUTHR FOR ARG SER ILE FOR CYS SER LEU LEU GLU SER TYR PHE GLU

25 30 • ··25 30 • ··

9 99 9

9 9 99 9 9

9 9 99999999

999999

19 19 THR ASN SER GLU CYS SER LYS PRO GLY THR ASN SER GLU CYS SER LYS FOR GLY VAL ILE PHE LEU THR LYS VAL ILE PHE LEU THR LYS 35 35 40 45 40 45 LYS GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO LYS GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER ASP LYS GLN VAL GLN SER ASP LYS GLN VAL GLN 50 50 55 60 55 60 VAL CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP VAL CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR ARG ILÉ LYS THR ARG THR ARG ILÉ LYS THR ARG 65 65 70 75 70 75 LYS ASN LYS ASN (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (2) Data for SEQ ID NO: 3

(i) Charakteristika sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) délka: 76 (B) typ: aminokyselinová(A) length: 76 (B) type: amino acid

(D) topologie: lineární (D) topology: linear 3 3 (xi) Popis sekvence: SEQ (xi) Sequence description: SEQ ID NO: ID NO: ASP ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS CYS CYS ILE SER TYR THR ILE SER TYR THR 1 1 5 5 10 10 15 15 PRO FOR ARG SER ILE PRO CYS SER LEU LEU ARG SER ILE FOR CYS SER LEU LEU GLU SER GLU SER TYR PHE GLU THR TYR PHE GLU THR 20 20 25 25 30 30 ASN ASN SER GLU CYS SER LYS PRO GLY VAL SER GLU CYS SER LYS FOR GLY VAL ILE PHE ILE PHE LEU THR LYS LYS LEU THR LYS LYS 35 35 40 40 45 45 GLY GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER ARG ARG PHE CYS ALA ASN FOR SER ASP LYS ASP LYS GLN VAL GLN VAL GLN VAL GLN VAL 50 50 55 55 60 60 CYS CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR ARG ILE ARG ILE LYS THR ARG LYS LYS THR ARG LYS 65 65 70 70 75 75

ASN (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvence:ASN (2) Data on SEQ ID NO: 4 (i) Sequence characteristics:

(A) délka: 75 (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4(A) length: 75 (B) type: amino acid (D) topology: linear (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 4

♦ * *♦ * *

• · ·** • · · ·· ··• · ·** • · · ·· ··

ARG ARG PHE PHE HIS HIS ALA Alas THR THR SER SER ALA Alas ASP ASP CYS CYS CYS CYS ILE ILE SER SER TYR TYR THR THR PRO FOR 1 1 5 5 10 10 15 15 ARG ARG SER SER ILE ILE PRO FOR CYS CYS SER SER LEU LEU LEU LEU GLU GLU SER SER TYR TYR PHE PHE GLU GLU THR THR ASN ASN 20 20 25 25 30 30 SER SER GLU GLU CYS CYS SER SER LYS LYS PRO FOR GLY GLY VAL WALL ILE ILE PHE PHE LEU LEU THR THR LYS LYS LYS LYS GLY GLY 35 35 40 40 45 45 ARG ARG ARG ARG PHE PHE CYS CYS ALA Alas ASN ASN PRO FOR SER SER ASP ASP LYS LYS GLN GLN VAL WALL GLN GLN VAL WALL CYS CYS 50 50 55 55 60 60 MET MET ARG ARG MET MET LEU LEU LYS LYS LEU LEU ASP ASP THR THR ARG ARG ILE ILE LYS LYS THR THR ARG ARG LYS LYS ASN ASN 65 65 70 70 75 75

(2) Údaje k SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvence:(2) Data on SEQ ID NO: 5 (i) Sequence characteristics:

(A) délka: 26 (B) typ: nukleová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (iv) Pozitivní: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5(A) length: 26 (B) type: nuclear (C) chain type: single-stranded (D) topology: linear (iv) Positive: no (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 5

TCAGGATCCG TCACAAAAGA TGCAGA 26TCAGGATCCG TCACAAAAGA TGCAGA 26

Údaje k SEQ ID NO: 6 Data for SEQ ID NO: 6 (i) (and) Charakteristika sekvence: (A) délka: 26 (B) typ: nukleová (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární Sequence characteristics: (A) length: 26 (B) type: nuclear (C) chain type: single chain (D) topology: linear (iv) (iv) Pozitivní: ne Positive: no

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6(xi) Sequence description: SEQ ID NO: 6

CGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGTCGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGT

Claims

A polypeptide comprising SEQ ID NO: 1.

A polypeptide comprising SEQ ID NO: 2.

A polypeptide comprising SEQ ID NO: 3.

A polypeptide comprising SEQ ID NO: 4.

A composition comprising a mixture of the polypeptides of claims 1, 2, 3 and 4.

6. A vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4.

7. A host cell characterized in that it is genetically manipulated by the vector of claim

6.

8. A method of producing a polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4, wherein the polypeptide is expressed in a host cell that is genetically manipulated by a vector comprising a polynucleotide that encodes the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4.

A polypeptide agonist according to claim 1, 2, 3 or 4.

A polypeptide antagonist according to claim 1, 2, 3 or 4.

· 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9,999 9

9 t • * • 4 ··

11. A method of treating a patient in need of CkP ~ 8, comprising administering to the patient an effective amount of the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4.

12. A method of treating a patient in need of Ck0-8, comprising administering to the patient an effective amount of the composition of claim 5.

13. A method of treating a patient in need of inhibiting CkP ~ 8, comprising administering to the patient an effective amount of the antagonist of claim 10.

14. A method for identifying antagonists and agonists of a polypeptide according to claim 1, 2, 3 or 4, characterized in that the selected test cells, the substance to be tested and the polypeptide according to claim 1, 2, 3 or 4 are combined and whether the agent is a potent agonist or antagonist based on test cell response.

A method of diagnosing a disease or susceptibility to a disease that is associated with under-expressed polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4, characterized in that it is determined whether there is a mutation in the nucleic acid sequence that encodes the polypeptide.