CZ90897A3 - Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů a prostředků pro kontrolu škůdců rostlin a škůdců na jiných materiálech než rostlinách. Konkrétně jsou popsány nové pesticidní proteiny, které lze izolovat z bakterií rodu Bacillus ve stádiu vegetativního růstu. Popsány jsou kmeny rodu Bacillus, proteiny a geny, které tyto proteiny kódují. Způsoby a prostředky podle vynálezu lze použít v řadě systému pro kontrolu škůdců rostlin a škůdců na jiných materiálech než rostlinách.

Dosavadní stav techniky

Škůdci rostlin jsou hlavním faktorem způsobujícím ztráty světově komerčně významných zemědělských plodin. Používá se rozsáhlá řada chemických pesticidů pro kontrolu nebo hubení škůdců, kteří mají v zemědělství význam. Existuje' však velký zájem na vyvinutí účinných alternativních pesticidů.

Jako alternativy k chemické kontrole škůdců hrají významnou roli mikrobiální pesticidy. Nejrozsáhleji používaný mikrobiální produkt je založen na bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Bacillus thuringiensis je gram-pozitivním druhem rodu Bacillus vytvářejícím spory, který produkuje během sporulace insekticidní krystalický protein (ICP).

Je známá řada variet Bacillus thuringiensis, které produkují více než 25 různých, avšak podobných insekticidních krystalických proteinů. Většina insekticidních krystalických proteinů produkovaných Bacillus thuringiensis je toxická pro larvy některých druhů hmyzu z řádů Lepidoptera (motýli), Diptera (dvoukřídlí) a Coleoptera (brouci). Obecně se v případě, že je insekticidní krystalický protein pozřen citlivým hmyzem, krystal solubilizuje a je přeměněn na toxický zbytek proteasami ve střevě hmyzu. Žádný z insekticidních krystalických proteinů účinných proti larvám brouků, jako je mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata) nebo potemník moučný (Tenebrio molitor), nevykazoval podstatné účinky na členy rodu Diabrotica, zejména na Diabrotica virgifera virgifera nebo Diabrotica longicornis barberi.

Bacillus cereus (Bc) je blízce příbuzný Bacillus thuringiensis. Hlavním odlišným znakem mezi těmito druhy je nepřítomnost parasporálního krystalu u Bacillus cereus. Bacillus cereus je široce rozšířenou bakterií, která se běžně nachází v půdě a byla izolována z řady potravin a léčiv. Tento organismus se podílí na kažení potravin.

Ačkoli je Bacillus thuringiensis velmi užitečný při kontrole hmyzích škůdců, existuje potřeba rozšířit počet potenciálních biologických kontrolních činidel.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje prostředky a způsoby pro kontrolu škůdců rostlin. Popisují se zejména nové pesticidní proteiny, které jsou produkovány během vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus. Tyto proteiny jsou vhodné jako pesticidní činidla.

Konkrétněji se vynález týká v podstatě purifikovaného kmene rodu Bacillus, který produkuje v průběhu vegetativního růstu pesticidní protein, přičemž uvedeným kmenem rodu Bacillus není Bacillus sphaericus SSII-1. Výhodný je kmen Bacillus cereus s přírůstkovým číslem č. NRRL B-21058 a kmen Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem č. NRRL B-21060. Výhodné jsou rovněž kmeny rodu Bacillus vybrané ze skupiny zarhnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228,

NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.

Vynález se dále týká pro hmyz specifického proteinu, izolovatelného z Bacillus spp., výhodně však z kmene Bacillus thuringiensis nebo Bacillus cereus, během fáze vegetativního růstu, a jeho složek, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. Pro hmyz specifický protein podle vynálezu je výhodně toxický pro hmyz z řádů Coleoptera (brouci) nebo Lepidoptera (motýli) a má molekulovou hmotnost přibližně 30 kDa nebo větší, výhodně přibližně 60 až přibližně 100 kDa a ještě výhodněji přibližně 80 kDa.

Pro hmyz specifický protein podle vynálezu vykazuje zejména spektrum insekticidní účinnosti, které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.

Pro hmyz specifický protein podle vynálezu lze výhodně izolovat například z kmene Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058 nebo z kmene Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem NRRL B-21060.

Pro hmyz specifický protein podle vynálezu lze rovněž výhodně izolovat z kmene Bacillus spp vybraného ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.

Vynález zejména zahrnuje pro hmyz specifické proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 5 a SEQ ID č. 7, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Dále jsou výhodné pro hmyz specifické proteiny, které mají sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID

č. 20, SEQ ID č. 21, SEQ ID č. 29, SEQ ID č. 32 a SEQ ID č.

2, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Zejména výhodné jsou pro hmyz specifické proteiny, které mají sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 29 a SEQ ID č. 32, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Dalším výhodným provedením vynálezu je pro hmyz specifický protein podle vynálezu, ze kterého byly odstraněny nebo ve kterém byly inaktivovány sekvence představující sekreční signál.

Vynález dále zahrnuje pomocné proteiny, které zvyšují pro hmyz specifickou účinnost pro hmyz specifického proteinu. Uvedené pomocné proteiny mají výhodně molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa a lze je izolovat například z kmene Bacillus cereus, zejména však z kmene Bacillus cereus AB78, ve fázi vegetativního růstu.

Výhodné provedení vynálezu se týká pomocného proteinu, ze kterého byly odstraněny nebo ve kterém byly inaktivovány sekvence představující sekreční signál.

Vynález se dále týká pesticidních proteinů z více jednotek (multimerních pesticidních proteinů), které obsahují více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.

Multimerní pesticidní proteiny podle vynálezu mají výhodně molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa až přibližně 200 kDa.

Vynález zejména zahrnuje multimerní pesticidní proteiny, které obsahují pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.

Vynález se dále týká fúzních proteinů, které obsahují několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu, vytvořených genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.

Konkrétní provedení vynálezu se týká fúzního proteinu, který obsahuje ribonukleasový S-protein, pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu.

Další konkrétní provedení vynálezu se týká fúzního proteinu, který obsahuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, kterýžto uvedený fúzní protein má na svém N-konci buď tento pro hmyz specifický protein nebo tento pomocný protein.

Výhodný je fúzní protein, který obsahuje pro hmyz specifický protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 5 a pomocný protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 2, přičemž vzniká protein uvedený v sekvenci SEQ ID č. 23, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologické.

Výhodný je rovněž fúzní protein, který obsahuje pro hmyz specifický protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 35 a pomocný protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 27, přičemž vzniká protein uvedený v sekvenci SEQ ID č. 50, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologickě.

Vynález se dále týká fúzních proteinů, které obsahují pro hmyz specifický protein podle vynálezu nebo/a pomocný protein podle vynálezu fúzovaný k signální sekvenci, výhodně sekreční signální sekvenci nebo sekvenci způsobující cílení (targeting sequence), která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky, kterážto signální sekvence je heterologního původu vzhledem k proteinu, ke kterému je fúzována.

Zejména výhodný je v rámci vynálezu fúzní protein, který má sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID č. 43 nebo SEQ ID č. 46, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologickě.

Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi aminokyselin. Podstatně homologickě proteiny mohou být například homologickě ze 4 0 %, výhodně z 50 % a nejvýhodněji homologické z 60 % nebo 80 % nebo více. Homologickě jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí aminokyselin nebo jsou do nich vloženy subsekvence dalších aminokyselin.

Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. Zejména se vynález týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, kde spektrum insekticidní účinnosti zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.

Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Výhodné jsou rovněž molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 1, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódujíc! pomocný protein podle vynálezu, který zvyšuje pro hmyz specifickou účinnost pro hmyz specifického proteinu.

Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto nukleotidová sekvence byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.

Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahuji nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 17 nebo SEQ ID č. 18, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Výhodné jsou rovněž molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 27 nebo SEQ ID č. 30, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující multimerní pesticidní protein, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.

Výhodně jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.

Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1 nebo SEQ ID č. 19, včetně všech nukleotidových sekvencí, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu, vytvořenou genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze které se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.

Výhodným provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, přičemž uvedený fúzní protein má na svém N-konci bud' tento pro hmyz specifický protein nebo tento pomocný protein. Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nuk1eotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu nebo/a pomocný protein podle vynálezu fúzovaný k signální sekvenci, výhodně sekreční signální sekvenci nebo sekvenci způsobující cílení (targeting sequence), která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky, kterážto signální sekvence je heterologního původu vzhledem k DNA, ke které je fúzována.

Vynález dále zahrnuje molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein nebo multimerní protein podle vynálezu, které byly optimalizované pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.

Výhodné jsou optimalizované molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 42, SEQ ID č. 45 nebo SEQ ID č. 49, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Vynález se dále týká optimalizovaných molekul DNA, z jejichž 5'-konce byly odstraněny sekvence kódující sekreční signál, zejména však optimalizovaných molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 35 nebo SEQ ID č. 39, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.

Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi nukleotidů. Podstatně homologické molekuly DNA mohou být například homologické ze 60 %, výhodně z 80 % a nejvýhodněji homologické z 90 % nebo 95 % nebo více. Homologické jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí nukleotidů nebo aminokyselin nebo jsou do nich vloženy subsekvence dalších nukleotidů nebo aminokyselin.

Vynález rovněž zahrnuje molekuly DNA, které hybridizují s molekulami DNA podle vynálezu, jak jsou definovány výše, výhodně však s oligonukleotidovou sondou, kterou lze získat z uvedených molekul DNA, která obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů, za mírně přísných podmínek, a kteréžto molekuly vykazují pro hmyz specifickou účinnost a rovněž jsou jimi kódovány pro hmyz specifické proteiny.

Výhodné jsou molekuly DNA, u kterých dochází k hybridizací při teplotě 65 °C v pufru obsahujícím 7 % SDS (dodecylsulfátu sodného) a fosforečnan sodný v 0,5M koncentraci.

Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein podle vynálezu, které lze získat způsobem který zahrnuje:

(a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizací uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou popsanou níže, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30 nebo SEQ ID č. 31, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.

Vynález se dále týká pro hmyz specifických proteinů, které jsou kódovány molekulami DNA podle vynálezu.

Vynález rovněž zahrnuje expresívní kazetu, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu operabilně spojenou s expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, výhodně mikroorganismu nebo rostlině, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.

Vynález se dále týká vektorové molekuly obsahující expresívní kazetu podle vynálezu.

Expresívní kazeta nebo/a vektorová molekula podle vynálezu výhodně tvoří součást genomu rostliny.

Dalším provedením vynálezu je hostitelský organismus, výhodně organismus vybraný ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresívní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresívní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.

Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně však rostliny kukuřice, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresívní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresívní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.

Výhodná je transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která byla stabilně transformována molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.

Výhodná je rovněž transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu.

Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně rostliny kukuřice, podle vynálezu, jak je definována výše, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, výhodně však δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis. Uvedenou rostlinou je výhodně hybridní rostlina.

V rámci rozsahu vynálezu se rozumí, že mezi části transgenických rostlin patři například rostlinné buňky, protoplasty, tkáně, kalus, embrya jakož i květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných molekulou DNA podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň z části tvořeny transgenickými buňkami. Tyto části jsou rovněž předmětem vynálezu.

Vynález se dále týká rostlinného propagačního materiálu rostlin podle vynálezu, který je ošetřen obalem chránícím semena.

Vynález dále zahrnuje mikroorganismus transformovaný molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu, přičemž je tímto mikroorganismem výhodně mikroorganismus, který se množí na rostlinách a výhodněji bakterie kolonizující kořeny.

Vynález se dále týká enkapsulovaného pro hmyz specifického proteinu. Toto provedení zahrnuje mikroorganismus obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.

Vynález se rovněž týká insekticidního prostředku obsahujícího hostitelský organismus podle vynálezu, výhodně však purifikovaný kmen rodu Bacillus, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.

Vynález dále zahrnuje insekticidní prostředek obsahující izolovanou molekulu proteinu podle vynálezu, samotnou nebo v kombinaci s hostitelským organismem podle vynálezu nebo/a enkapsulovaný pro hmyz specifický protein podle vynálezu, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.

Vynález se dále týká způsobu získání purifikovaného pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje nanesení roztoku obsahujícího uvedený pro hmyz specifický protein na NAD-kolonu a eluci navázaného proteinu .

Vynález zahrnuje rovněž způsob identifikace účinnosti pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu na hmyz, kterýžto způsob zahrnuje:

pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supernatantu z uvedené kultury, poskytnutí potravy s uvedeným supernatantem larvám hmyzu, a vyhodnocení mortality.

Dalším provedením vynálezu je způsob izolace pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuj e:

pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supernatantu z uvedené kultury, a izolaci uvedeného pro hmyz specifického proteinu z uvedeného supernatantu.

Vynález rovněž zahrnuje způsob izolace molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein vykazující insekticidní účinnost proteinů podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje:

získáni molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, hybridizaci uvedené molekuly DNA s DNA získanou z druhu rodu

Bacillus, a izolaci uvedené hybridizované DNA.

Vynález se dále týká způsobu zvýšení rozsahu cílového hmyzu použitím pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu v kombinaci s alespoň jedním dalším insekticidním proteinem, který se liší od tohoto pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, výhodně však s insekticidním proteinem vybraným ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacilus thuringiensis, inhibitory proteas, lektiny, α-amylasy a peroxidasy.

Vynález rovněž zahrnuje způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně však druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem vybraným ze skupiny zahrnující Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, při kterém se aplikuje na rostlinu nebo na plochu, na které tato rostlina roste, insekticidní prostředek nebo toxinový protein podle vynálezu.

Vynález se dále týká způsobu ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně však druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem vybraným ze skupiny zahrnující Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, který spočívá v tom, že se v oblasti, kde se může vyskytnout uvedený hmyzí škůdce, pěstuje transgenická rostlina exprimující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.

Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření hostitelského organismu, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do svého genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedený hostitelský organismus transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.

Vynález se dále týká způsobu vytvoření transgenické rostliny nebo rostlinné buňky, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do rostlinného genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedená rostlina respektive rostlinná buňka transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy insekticidního prostředku, který spočívá v tom, že se smíchá izolovaný kmen rodu Bacillus nebo/a hostitelský organismus nebo/a izolovaná molekula proteinu nebo/a enkapsulovaný protein podle vynálezu v insekticidně účinném množství s vhodným nosičem.

Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření transgenického potomstva transgenické rodičovské rostliny, které obsahuje, stabilně začleněnou do rostlinného genomu, molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedená rodičovská rostlina transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu a pesticidní znak se přenese na potomstvo uvedené transgenické rodičovské rostliny za použití známých postupů množení rostlin.

Vynález rovněž zahrnuje oligonukleotidovou sondu schopnou specificky hybridizovat s nukleotidovou sekvencí kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto sonda obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů, a použití uvedené oligonukleotidové sondy pro screening libovolného kmene rodu Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen pro hmyz specifický protein nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje tento gen.

Podle vynálezu bylo zjištěno, že v průběhu vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus jsou produkovány pesticidní proteiny. Vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že existuje takováto skupina proteinů, zahrnuje vynález všechny vegetativní insekticidní proteiny, dále označované VIP, s výjimkou toxinu usmrcujíciho komáry z Bacillus sphaericus.

Vegetativní insekticidní proteiny podle vynálezu nejsou přítomné ve velkém množství po sporulaci a jsou zejména exprimovány během logaritmické fáze růstu před stacionární fází. Pro účely vynálezu je vegetativní růst definován jako období před nastoupením sporulace. Geny kódující takové vegetativní insekticidní proteiny lze izolovat, klonovat a transformovat do různých nosičů pro použití v programech pro kontrolu škůdců.

Pro účely vynálezu mezi škůdce patří hmyz, houby, bakterie, háďátka, roztoči, klíštzata, patogenní prvoci, motolice parazitující na zvířatech a podobně, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet. Mezi hmyzí škůdce patří hmyz vybraný z řádů Coleoptera (brouci), Diptera (dvoukřídlí), Hymenoptera (blanokřídlí), Lepidoptera (motýli), Mallophaga (všenky), Homoptera (stejnokřídlí), Hemiptera, Orthroptera (rovnokřídlí) , Thysanoptera (třásnokřídlí) , Dermaptera (škvoři), Isoptera (všekazi), Anoplura (vši), Siphonaptera,

Trichoptera (chrostíci) Lepidoptera (motýli).

atd., zejména Coleoptera (brouci)

Tabulky 1 až 10 uvádějí seznam škůdců na hlavních plodinách a škůdců s lékařským a veterinárním významem. Tito škůdci patří do rozsahu vynálezu.

Tabulka 1

Lepidoptera (motýli a můry)

Kukuřice

Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon Helicoverpa zea Spodoptera frugiperda Diatraea grandiosella

- 17 Pokračování Tabulky 1

Kukuřice

Elasmopalpus lignosellus Diatraea saccharalis

Čirok

Chilo partellus Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea Elasmopalpus lignosellus Feltia subterranea

Pšenice

Pseudaletia unipunctata Spodoptera frugiperda Elasmopalpus lignosellus Agrotis orthogonia Elasmopalpus lignosellus

Slunečnice

Suleima helianthana Homoeosoma electellum

Bavlník

Heliothis virescens Helicoverpa zea Spodoptera exigua Pectinophora gossypiella

Rýže

Diatraea saccharalis Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea

Sój a

Pseudoplusia includens Anticarsia gemmatalis Plathypena scabra

Pokračování Tabulky 1

Sója

Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon Spodoptera exigua Heliothis virescens Helicoverpa zea

Ječmen

Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon

Tabulka 2

Coleoptera (brouci)

Kukuřice

Diabrotica virgifera virgifera Diabrotica longicornis barberi Diabrotica undecimpunctata howardi Melanotus spp.

Cyclocephala borealis Cyclocephala immaculata Popilia japonica Chaetocnema pulicaria Sphenophorus maidis

Čirok

Phyllophaga crinita

Eleodes, Conoderus a Aeolus spp.

Oulema melanopus

Chaetocnema pulicaria Sphenophorus maidis

Pšenice

Oulema melanopus Hypera punctata

Pokračování Tabulky 2

Pšenice

Diabrotica undecimpunctata howardi

Slunečnice

Zygogramma exclamationis Bothyrus gibbosus

Bavlník

Anthonomus grandis

Rýže

Colaspis brunnea Lissorhoptrus oryzophiius Sitophilus oryzae

Sój a

Epilachna varivestis

Tabulka 3

Homoptera (melice, mšice apod.)

Kukuřice

Rhopalosiphum maidis Anuraphis maidiradicis

Čirok

Rhopalosiphum maidis Sipha flava

Pšenice

Diuraphis noxia Schizaphis graminum Macrosiphum avenae

Bavlník

Aphis gossypii Pseudatomoscelis seriatus

Pokračování Tabulky 3

Bavlník

Trialeurodes abutilonea

Rýže

Nephotettis nigropictus

Sój a

Myzus persicae Empoasca fabae

Ječmen

Schizaphis graminum

Řepka olejka

Brevicoryne brassicae

Tabulka 4

Hemiptera (ploštice)

Kukuřice

Blissus leucopterus leucopterus

Čirok

Blissus leucopterus leucopterus

Bavlník

Lygus lineolaris

Rýže

Blissus leucopterus leucopterus Acrosternum hilare

Sój a

Acrosternum hilare

Ječmen

Blissus leucopterus leucopterus Acrosternum hilare

Pokračování Tabulky 4

Ječmen

Euschistus servus

Tabulka 5

Orthoptera (kobylky, cvrčci a švábi)

Kukuřice

Melanoplus

Melanoplus

Pšenice

Melanoplus

Melanoplus

Melanoplus

Bavlník

Melanoplus

Melanoplus

Sója

Melanoplus

Melanoplus femurrubrum sanguinipes femurrubrum differentialis sanguinipes femurrubrum differentialis femurrubrum differentialis

Stavby a domácnosti

Periplaneta americana Blattella germanica Blatta orientalis

Tabulka 6

Diptera (mouchy a komáři)

Kukuřice

Hylemya platura Agromyza parvicornis

Pokračování Tabulky 6

Čirok

Contarinia sorghicola

Pšenice

Mayetiola destructor Sitodiplosis mosellana Meromyza americana Hylemya coarctata

Slunečnice

Neolasioptera murtfeldtiana

Só j a

Hylemya platura

Ječmen

Hylemya platura Mayetiola destructor

Hmyz napadající člověka a zvířata a přenašeči nemocí Aedes aegypti Aedes albopictus Phlebotomus papatasii Musea domestica Tabanus atratus Cochliomyia hominivorax

Tabulka 7

Thysanoptera (třásněnky)

Kukuřice

Anaphothrips obscurus

Pšenice

Frankliniella fusca

Pokračování Tabulky 7

Bavlník

Thrips tabaci Frankliniella fusca

Sój a

Sericothrips variabilis Thrips tabaci

Tabulka 8

Hymenoptera (pilatky, mravenci, vosy atd

Kukuřice

Solenopsis milesta

Pšenice

Cephus cinctus

Tabulka 9

Další řády a reprezentativní druhy

Dermatoptera (škvoři)

Forficula auricularia

Isoptera (termiti)

Reticulitermes flavipes

Mallophaga (všenky)

Cuclotogaster heterographa Bovicola bovis

Anoplura (vši)

Pediculus humanus

Siphonaptera (blechy)

Ctenocephalides felis

Tabulka 10

Acari (roztoči a kliščata)

Kukuřice

Tetranychus urticae

Čirok

Tetranychus cinnabarinus Tetranychus urticae

Pšenice

Aceria tulipae

Bavlník

Tetranychus

Tetranychus cinnabarinus urticae

Só j a

Tetranychus

Tetranychus turkestani urticae

Ječmen

Petrobia latens

Důležití roztoči škodící člověku a zvířatům

Demacentor variabilis

Argas persicus

Dermatophagoides farinae

Dermatophagoides pteronyssinus

Nyní, když bylo zjištěno, že lze izolovat pesticidní proteiny z druhů rodu Bacillus ve fázi vegetativního růstu, lze za použiti standardních postupů izolovat jiné kmeny a testovat jejich účinnost proti konkrétním škůdcům rostlin a škůdcům na jiných materiálech než rostlinách. Obecně lze kmeny rodu Bacillus izolovat ze vzorku libovolného materiálu, ve kterém žijí, včetně půdy, rostlin, hmyzu, prachu ze zrnového dopravníku, a vzorků jiných materiálů, za použití způsobů známých v oboru, viz například Travers a kol. (1987)

Appl.	Environ.	Microbiol.	53 :	1263	1266; Saleh	a	kol.
(1969)	Can J.	Microbiol.	15 :	1101 -	1104; DeLucca	a	kol.
(1981)	Can J.	Microbiol.	27 :	865 -	870; a Norris	a	kol.
(1981)	The genera Bacillus	and	Sporolactobacillus v	Starr a

kol. (editoři), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, svazek II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Po izolaci je možné u kmenů testovat pesticidní účinnost v průběhu vegetativního růstu. Tímto způsobem lze identifikovat nové pesticidní proteiny a kmeny.

Mezi mikroorganismy rodu Bacillus, které nacházejí uplatnění ve vynálezu, patří Bacillus cereus a Bacillus thuringiensis, jakož i druhy rodu Bacillus uvedené v tabulce 11.

Tabulka 11

Seznam druhů rodu Bacillus

Morfologická skupina 1 B. megaterium B. cereus*

B. cereus var. mycoides B. thuringiensis*

B. licheniformis B. subtilis*

B. pumilus B. firmus*

B. coagulans

Morfologická skupina 2 B. polymyxa B. macerans

B. circulans

Pokračováni Tabulky 11

Morfologická skupina 2

B. stearothermophilus B. alvei*

B. laterosporus*

B. brevis B. pulvifaciens B. popilliae*

B. lentimorbus*

B. larvae*

Morfologická skupina 3 B. sphaericus*

B. pasteurii

Nezařazené kmeny

Podskupina A

B. apiarus*

B. filicolonicus B. thiaminolyticus B. alcalophilus

Podskupina B

B. cirroflagellosus B. chitinosporus B. lentus

Podskupina C

B. badius

B. aneurinolyticus

B. macroides

B. freundenreichii

Podskupina D

B. pantothenticus B. epiphytus

Pokračování Tabulky 11

Podskupina El

B. aminovorans

B. globisporus

B. insolitus

B. psychrophilus

Podskupina E2

B. psychrosaccharolyticus

B. macquariensis

Legenda k tabulce 11:

* o těchto kmenech rodu Bacillus bylo dříve zjištěno, že souvisí s hmyzem

Rozdělení do skupin je provedeno podle práce Parry, J. M. a kol. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, Londýn

Podle vynálezu lze z druhů rodu Bacillus izolovat pesticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Podle jednoho provedení lze izolovat insekticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Způsoby izolace proteinů jsou v oboru známé. Obecně lze proteiny purifikovat pomocí běžných chromatografiekých postupů, včetně gelové filtrace, iontové výměny a imunoafinitní chromatografie, pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie, jako je vysoceúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi, vysoceúčinná kapalinová chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací vysoceúčinná kapalinová chromatografie, vysoceúčinný chromatofokusing a hydrofobní interakční chromatografie atd., pomocí elektroforetického rozdělení, jako je jednorozměrná gelová elektroforéza, dvourozměrná gelová elektroforéza atd. Tyto způsoby jsou známé v oboru, viz například Current Protocols in Molecular Biology, svazky a 2, Ausubel a kol. (editoři) , John Wiley and Sons, New York (1988). Dále lze připravit protilátky proti v podstatě čistým připraveným proteinům, viz například Radka a kol. (1983) J. Immunol. 128: 2804, a Radka a kol. (1984) Immunogenetics 19: 63. Pro purifikací proteinu vykazujícího pesticidní vlastnosti lze použít libovolnou kombinaci způsobů. Při vytváření postupu se po každém purifikačním stupni stanovuje pesticidní účinnost.

Těmito purifikačními stupni se získá v podstatě purifikovaná proteinová frakce. Termín v podstatě purifikovaný nebo v podstatě čistý označuje protein, který v podstatě neobsahuje žádnou sloučeninu normálně doprovázející protein v jeho přírodním stavu. Skutečnost, že je připravený protein v podstatě čistý lze stanovit z nepřítomnosti jiných detekovatelných proteinových pásů po elektroforéze v SDS-polyakrylamidovém gelu, což se určí vizuálně nebo denzitometricky. Alternativně může být stupeň čistoty indikován nepřítomností jiných amino-koncových sekvencí nebo N-koncových zbytků v purifikované látce. Čistotu lze ověřit novou chromatografií čistých proteinů, kterou se zjistí nepřítomnost jiných píků při iontoměničové elektroforéze, elektroforéze s obrácenými fázemi nebo kapilární elektroforéze. Termíny v podstatě čistý nebo v podstatě purifikovaný nejsou míněny tak, že by vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s jinými sloučeninami. Tyto termíny rovněž nejsou míněny tak, že by vylučovaly přítomnost malého množství nečistot, které nejsou na překážku biologické účinnosti proteinu, a které mohou být přítomny například v důsledku neúplné purifikace.

Jakmile je izolován purifikovaný protein, je možné tento protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, charakterizovat a sekvenovat pomocí standardních způsobů známých v oboru. Purifikovaný protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, lze například fragmentovat pomocí bromkyanu, nebo proteasami jako je papain, chymotrypsin, trypsin, lysyl-C-endopeptidasa atd. (Oike a kol. (1982) J. Biol. Chem. 257: 9751 - 9758, Liu a kol. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209 - 215) . Výsledné peptidy se oddělí, výhodně pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), nebo roztavením gelů a elektroblotováním na póly(vinylidenfluoridové) membrány (PVDF-membrány), a podrobí se sekvenování aminokyselin, při kterém se peptidy výhodně analyzují pomocí automatických sekvenátorů. Lze stanovit N-koncové, C-koncové nebo vnitřní aminokyselinové sekvence. Z aminokyselinové sekvence purifikovaného proteinu lze syntetizovat nukleotidovou sekvenci, kterou lze použít jako sondu při izolaci genu kódujícího pesticidní protein.

Pesticidní proteiny mohou být oligomerní a lišit se v molekulové hmotnosti, počtu protomerů, peptidech které je tvoří, účinnosti proti konkrétním škůdcům a dalších vlastnostech. Pomocí zde popsaných způsobů lze však izolovat a charakterizovat proteiny účinné proti řadě škůdců.

Jakmile je purifikovaný protein izolován a charakterizován, je možno jej měnit různými způsoby, včetně substitucí, delecí, zkracování a inzercí aminokyselin. Způsoby takových manipulací jsou obecně známé v oboru. Například lze připravit obměny pesticidních proteinů v aminokyselinově sekvenci pomocí mutací DNA. Takové obměny (varianty) vykazují požadovanou pesticidní účinnost. Mutace prováděné v DNA kódující variantu samozřejmě nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a výhodně nevytvářejí komplementární oblasti, které by mohly produkovat sekundární strukturu mRNA, viz evropská patentová přihláška zveřejněná pod číslem 75 444.

Vynález tedy zahrnuje pesticidní proteiny, jakož i jejich složky a fragmenty. Mohou být tedy vytvořeny složkové protomery, polypeptidy nebo fragmenty proteinů, které si zachovávají pesticidní účinnost. Mezi tyto fragmenty patří zkrácené sekvence, jakož i N-koncové, C-koncové, vnitřní a vnitřně deletované aminokyselinové sekvence proteinů.

Očekává se, že většina delecí, inzercí a substitucí sekvence proteinů nezpůsobuje zásadní změny v charakteristice pesticidního proteinu. Pokud je však složité předvídat přesný vliv substituce, delece nebo inzerce před jejím provedením, je odborníkovi známé, že se vliv vyhodnotí pomocí běžných vyhledávacích testů.

Proteiny nebo jiné složkové polypeptidy, jak jsou zde popsány, lze použít samotné nebo v kombinaci. To znamená, že je možné použít několik proteinů pro kontrolu různých hmyzích škůdců.

Některé proteiny jsou tvořeny jediným polypeptidovým řetězcem, zatímco mnohé proteiny jsou tvořeny více než jedním polypeptidovým řetězcem, jsou tedy oligomerní. Kromě toho jsou některé vegetativní insekticidní proteiny (VIP) pesticidně účinné jako oligomery. V těchto případech se používají další protomery pro zvýšení pesticidní účinnosti nebo aktivaci pesticidních proteinů. Ty protomery, které se používají pro zvýšení nebo aktivaci, jsou označovány jako pomocné proteiny. Pomocné proteiny aktivují nebo zvyšují účinnost pesticidního proteinu pomocí interakce s pesticidním proteinem za vzniku oligomerního proteinu se zvýšenou pesticidní účinností ve srovnání s účinností pozorovanou za nepřítomnosti pomocného proteinu.

Pomocné proteiny aktivují nebo zvyšují účinnost pesticidních proteinů jako je protein VIP 1 z AB78. Jako příklad takových pomocných proteinů lze uvést, aniž by se však na něj vynález jakkoli omezoval, protein VIP2 z AB78. Jak je demonstrováno v příkladech provedení vynálezu, mohou pomocné proteiny aktivovat řadu pesticidních proteinů. Podle jednoho provedení vynálezu lze tedy rodičovskou rostlinu 1 transformovat pomocným proteinem. Tuto rodičovskou rostlinu 1 lze křížit s řadou rodičovských rostlin 2 transformovaných jedním nebo několika pesticidními proteiny, jejichž pesticidní účinnosti jsou aktivovány uvedeným pomocným proteinem.

V rámci rozsahu vynálezu lze mezi pesticidními proteiny podle vynálezu překvapivě identifikovat novou skupinu proteinů specifických pro hmyz. Tyto proteiny, které jsou označovány v tomto textu jako VIP3, lze získat z kmenů Bacillus spp, avšak výhodně z kmenů Bacillus thuringiensis a nejvýhodněji z kmenů Bacillus thuringiensis AB88 a AB424. Tyto uvedené vegetativní insekticidní proteiny jsou přítomné hlavně v supernatantech kultur rodu Bacillus, přičemž tvoří alespoň 75 % z celkového množství v případě kmene AB88. Proteiny VIP3 se dále vyznačují svým ojedinělým spektrem insekticidní účinnosti, která zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, avšak zejména proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.

Agrotis ipsilon je agronomicky významným druhem hmyzu, který je značně rezistentní vůči δ-endotoxinům. Macintosh a kol. (1990), J. Invertebr. Pahtol. 56, 258 - 266, uvádějí, že δ-endotoxiny CrylA(b) a CrylA(c) vykazují insekticidní vlastnosti vůči Agrotis ipsilon s hodnotami LC_S0 více než 80 μ$ respektive 18 μ$ / ml potravy. Pomocí insekticidních proteinů vip3A podle vynálezu se dosáhne více než 50% mortality při přidání proteinu v množství, které je alespoň desetkrát až pětsetkrát, výhodně padesátkrát až třistapadesátkrát a nejvýhodněji dvěstěkrát až třistakrát nižší než množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality. Zejména výhodné v rámci vynálezu jsou insekticidní proteiny vip3A, kterými se dosáhne 100% mortality při přidání proteinu v množství alespoň dvěstěšedesátkrát nižším než je množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality.

Insekticidní proteiny vip3 podle vynálezu jsou přítomné hlavně v supernatantech kultur a je tudíž potřeba klasifikovat je jako sekretované proteiny. Výhodně obsahují v

N-koncové sekvenci řadu kladně nabitých zbytků následovaných hydrofobní základní oblastí a nejsou v průběhu exportu upravovány na N-konci.

Stejně jako jiné pesticidní proteiny spadající do rozsahu vynálezu lze proteiny VIP3 detekovat v růstových stádiích před sporulací, což představuje další jasnou odlišnost od jiných proteinů, které patří do skupiny δ-endotoxinů. Výhodně začíná exprese proteinu specifického pro hmyz v průběhu střední logaritmické fáze (mid-log fáze) a pokračuje během sporulace. V důsledku specifického typu exprese v kombinaci s vysokou stabilitou proteinů VIP3 lze v supernatantech sporulujících kultur nalézt velká množství proteinů VIP3. Zejména výhodné jsou proteiny VIP3 uvedené v sekvencích SEQ ID č. 23 a SEQ ID č. 32 a odpovídající molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny, avšak zejména ty molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence uvedené v sekvencích SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30 a SEQ ID č. 31.

Pesticidní proteiny podle vynálezu lze použít v kombinaci s endotoxiny Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními proteiny pro zvýšení rozsahu cílového hmyzu. Dále má použití vegetativních insekticidních proteinů podle vynálezu v kombinaci s δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními látkami odlišné povahy výrazný význam pro prevenci nebo/a řízení rezistence hmyzu. Mezi jiné insekticidní látky patří inhibitory proteas (jak serinového tak cysteinového typu, lektiny, cc-amylasy a peroxidasy. Podle jednoho výhodného provedení je exprese vegetativních insekticidních proteinů v transgenické rostlině doprovázena expresí jednoho nebo několika δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Této společné exprese (koexprese) více než jedné insekticidní látky v jediné transgenické rostlině lze dosáhnout modifikací rostliny pomocí genetického inženýrství tak, že obsahuje a exprimuje všechny nutné geny. Alternativně lze rodičovskou rostlinu 1 geneticky modifikovat tak, že exprimuje vegetativní insekticidní proteiny a druhou rostlinu, rodičovskou rostlinu 2 geneticky modifikova tak, že exprimuje δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis. Křížením rodičovské rostliny 1 s rodičovskou rostlinou 2 se získají dceřinné rostliny (potomstvo), které exprimují všechny geny introdukované do rodičovských rostlin 1 a 2. Zejména výhodnými δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis jsou látky popsané v EP-A 0618976.

Podstatná část cytotoxických proteinů, ačkoli ne všechny, působí binárně. Binární toxiny jsou typicky tvořeny dvěma proteinovými doménami, z nichž se jedna označuje jako doména A a druhá jako doména B (viz Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, J. E. Alouf a J. H. Freer, editoři, (1991) Academie Press). Doména A vykazuje silnou cytotoxickou účinnost. Doména B se váže na receptor na vnějším povrchu buňky před přenesením dovnitř buňky (internalizaci). Typicky musí být cytotoxická doména A převáděna do cytoplazmy pomocí translokační domény. Často jsou doména A a doména B oddělenými polypeptidy nebo protomery, které jsou spojeny interakcí protein-protein nebo disulfidickou vazbou. Toxinem však může být i jediný polypeptid, který je v buňce proteolyticky upraven na dvě domény, jako je tomu v případě exotoxinu A z Pseudomonas. Lze shrnout, že binární toxiny mají typicky tři významné domény, cytotoxickou doménu A, doménu B vázající se na receptor a translokační doménu. Doména A a doména B jsou často spojeny doménami tvořícími interakce protein-protein.

Domény vázající se na receptor podle vynálezu jsou vhodné pro transport libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru do cílového hmyzu, který má receptor rozpoznávaný doménou vázající se na receptor z binárních toxinů zde popsaných. Jelikož mají binární toxiny translokační domény, které penetruji fosfolipidové dvouvrstevné membrány a převádějí cytotoxiny přes tyto membrány, mohou být tyto translokační domény podobně vhodné při převádění libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru přes fosfolipidovou dvouvrstvu jako je plazmatická membrána nebo vesikulární membrána. Samotná translokační doména může perforovat membrány a tím vykazovat toxické nebo insekticidní vlasnosti. Všechny binární toxiny mají dále cytotoxické domény. Taková cytotoxická doména může být použitelná jako letální protein, buďto samotná nebo při dodáni do libovolné cílové buňky nebo cílových buněk libovolným způsobem.

Konečně jeilkož binární toxiny složené ze dvou polypeptidů často tvoří komplex, je pravděpodobné, že jsou ve složkách binárních toxinů podle vynálezu oblasti tvořící interakce protein-protein. Tyto domény tvořící interakce protein-protein mohou být vhodné pro vytváření spojení mezi libovolnými kombinacemi toxinů, enzymů, transkripčních fatkorů, nukleových kyselin, protilátek, zbytků vázajících se na buňky nebo libovolných jiných chemikálii, faktorů, proteinů nebo proteinových domén.

Toxiny, enzymy, transkripční faktory, protilátky, zbytky vázající se na buňku nebo jiné proteinové domény lze fúzovat k pesticidním nebo pomocným proteinům za vzniku genetických fúzí ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein který kombinuje vlastnosti vegetativního insekticidního proteinu a dalších složek použitých při fúzi. Dále pokud vykazuje proteinová doména fúzovaná k vegetativnímu insekticidnímu proteinu afinitu k dalšímu proteinu, nukleové kyselině, glycidu, lipidu nebo jiné chemikálii nebo faktoru, lze vytvořit třísložkový komlex. Tento komplex bude mít vlastnosti všech jeho složek. Podobnou úvahu lze použít pro přípravu čtyřnebo vícesložkových komplexů. Tyto komplexy jsou vhodné jako insekticidní toxiny, léčiva, laboratorní činidla a diagnostická činidla atd. Takovéto komplexy se v současné době používají například jako fúzní toxiny pro potenciální terapie rakoviny, jako činidla v ELISA-testech a immunoblotačních analýzách.

Jednou ze strategii obměňování pesticidních nebo pomocných proteinů je fúzování S-zbytku (S-tag) o délce 15 aminokyselin k proteinu bez zničení domény nebo domén vázajících se na buňku hmyzu, translokačních domén nebo domén vytvářejících interakce protein-protein přítomných v tomto proteinu. S-zbytek vykazuje vysokou afinitu (K_d = 10'⁹ M) k ribonukleasovému S-proteinu, ze kterého se, je-li navázán na S-zbytek, vytváří aktivní ribonukleasa. (viz F. B. Richards a H. W. Wyckoff (1971) v The Enzymes, svazek IV (Boyer, P. D., editor) , str. 647 - 806, Academie Press, New York) . Fúzi lze provést takovým způsobem, že se zničí nebo odstraní cytotoxická účinnost pesticidního nebo pomocného proteinu, čímž se nahradí cytotoxická účinnost vegetativního insekticidního proteinu novou cytotoxickou ribonukleasovou účinností. Výsledný toxin bude tvořen S-proteinem, pesticidním proteinem a pomocným proteinem, kde je buď pesticidní protein nebo pomocný protein produkován jako translačni fúze s S-zbytkem. Podobných strategií lze použít pro fúzování jiných potenciálních cytotoxinů k pesticidním nebo pomocným proteinům, včetně, aniž by se však jednalo o omezující výčet, proteinů inaktivujících ribozomy, hormonů hmyzu, receptorů hormonů, transkripčnich faktorů, proteas, fosfatas, exotoxinu A z Pseudomonas, nebo libovolných jiných proteinů nebo chemických faktorů, které jsou letální při dodání do buněk. Podobně lze do buněk dodávat proteiny, které nejsou letální, mohou však měnit buněčnou biochemii nebo fyziologii.

Spektrum toxicity pro různé druhy lze měnit tak, že se k pesticidním nebo pomocným proteinům fúzují domény, které rozpoznávají receptory na povrchu buněk jiných druhů. Mezi takovéto domény mohou patřit, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet, protilátky, transferrin, hormony nebo peptidové sekvence izolované z fágem vytvářených afinitně selektovatelných knihoven (phage displayed affinity selectable libraries). Pro změnu spektra toxicity lze použít rovněž peptidové sekvence, které jsou navázány na živiny, vitaminy, hormony nebo jiné chemikálie, které jsou transportovány do buněk. Podobně lze pro změnu spektra účinnosti VIP1 a VIP2 použít libovolný jiný protein nebo chemikálii, který (která) se váže na receptor na povrchu buňky nebo membránu a může být přenesen (a) dovnitř buňky (internalizován(a)).

Pesticidními proteiny podle vynálezu jsou proteiny, které poskytují specifickou pesticidní vlastnost. Takovéto polypeptidy se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž jejich složkové polypeptidy mají molekulovou hmotnost nejméně 30 kDa nebo větší, výhodné přibližně 50 kDa nebo větší.

Pomocné proteiny podle vynálezu se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně přibližně 15 kDa nebo větší, výhodně přibližně 20 kDa nebo větší, a ještě výhodněji přibližně 30 kDa nebo větší. Pomocné proteiny jako takové se mohou skládat ze složkových polypeptidů.

Je možné, že pesticidní protein a pomocný protein jsou složkami multimerního pesticidního proteinu. Takovéto pesticidní proteiny, které obsahují pomocné proteiny jako jeden nebo několik ze svých složkových polypeptidů, se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně 50 kDa až do nejméně 200 kDa, výhodně přibližně 100 kDa až 150 kDa.

- 37 Pomocný protein lze použít v kombinaci s pesticidními proteiny podle vynálezu pro zvýšení účinnosti nebo aktivaci pesticidního proteinu. Pro stanovení, zda pomocný protein ovlivní účinnost, je možné pesticidní protein exprimovat samotný nebo v kombinaci s pomocným proteinem a jednotlivé účinnosti srovnat v požerových testech pesticidní účinnosti.

Při vyhledávání potenciální pesticidní účinnosti u kmenů může být výhodné testovat účinnost kmene samotného a v kombinaci s pomocným proteinem. V některých případech se kombinací pomocného proteinu s přirozenými proteiny kmenů dosáhne pesticidní účinnosti i tehdy, kdy za nepřítomnosti pomocného proteinu žádná účinnost není pozorována.

Pomocný protein je možné modifikovat, jak je popsáno výše, pomocí různých způsobů známých v oboru. Pro účely vynálezu tudíž termín vegetativní insekticidní protein (VIP) zahrnuje proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu, které lze použít buďto samotné nebo v kombinaci k dosažení pesticidní účinnosti. Zahrnuje tedy pesticidní proteiny, pomocné proteiny a proteiny, které vykazují účinnost pouze za přítomnosti pomocného proteinu nebo polypeptidové složky těchto proteinů.

Je třeba vzít v úvahu, že pro získání nukleotidových a aminokyselinových sekvencí proteinů podle vynálezu jsou k dispozici i alternativní způsoby. Pro získání nukleotidové sekvence kódující pesticidní protein lze například izolovat z genomové knihovny kosmidové klony, které exprimuji pesticidní protein. Z větších účinných kosmidových klonů lze připravit menší subklony a testovat jejich účinnost. Tímto způsobem lze sekvenovat pro stanovení nukleotidové sekvence genu klony, které exprimuji účinný pesticidní protein. Poté lze odvodit aminokyselinovou sekvenci proteinu. Obecné metody molekulární biologie jsou uvedené například v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, svazky 1 - 3, Sambrook a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, New York (1989) a v publikacích citovaných v této práci.

Vynález rovněž zahrnuje nukleotidové sekvence z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, kteréžto nukleotidové sekvence jsou izolovatelné hybridizaci s nukleotidovými sekvencemi z kmenů Bacillus podle vynálezu. U proteinů kódovaných takovými nukleotidovými sekvencemi lze testovat jejich pesticidní účinnost. Vynález rovněž zahrnuje proteiny kódované těmito nukleotidovými sekvencemi. Vynález dále zahrnuje proteiny získané z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, kteréžto proteiny cross-reaguj £ s protilátkami vytvořenými proti proteinům podle vynálezu. U izolovaných proteinů lze opět testovat jejich pesticidní účinnost pomocí zde popsaných způsobů nebo jiných způsobů známých v oboru.

Jakmile se izolují nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, lze s nimi manipulovat a použít je pro expresi proteinu v řadě hostitelů, včetně jiných organismů, včetně mikroorganismů a rostlin.

Pesticidní geny podle vynálezu lze optimalizovat pro zvýšenou expresi v rostlinách, viz například EP-A 0618976, EP-A 0359472, EP-A 0385962, WO 91/16432, Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324 - 3328, a Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Tímto způsobem lze syntetizovat geny používající kodónů preferovaných rostlinami. Preferovaným kodónem pro konkrétního hostitele je jediný kodón, který nej častěji kóduje v tomto hostiteli danou aminokyselinu. Například kodón preferovaný kukuřicí pro konkrétní aminokyselinu lze odvodit ze známých genových sekvenci kukuřice. Použití kodónů kukuřicí pro 28 genů z rostlin kukuřice se nachází v práci Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Lze rovněž vytvořit syntetické geny na základě distribuce kodónů, kterou konkrétní hostitel používá pro konkrétní aminokyselinu.

Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolné rostlině. Je třeba vzít v úvahu, že je možně, aby byla optimalizovaná nebo syntetická celá genová sekvence nebo libovolná její část. To znamená, že je možné použít rovněž syntetické nebo částečně optimalizované sekvence.

Podobným způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolném mikroorganismu. Preferované použití kodónů pro rod Bacillus je uvedeno například v patentu Spojených Států Amerických č. 5 024 837 a v práci Johansen a kol. (1988) Gene 65: 293 - 304.

Metody konstrukce expresívních kazet pro rostliny, jakož i zavedení cizí DNA do rostlin jsou popsány v oboru. Takovéto expresívní kazety mohou obsahovat promotory, terminátory, zesilovače, vedoucí sekvence, introny a jiné regulační sekvence operabilně spojené s kódující sekvencí pesticidního proteinu. Dále je třeba vzít v úvahu, že je možné použít v expresívních kazetách promotory nebo terminátory genů VIP.

Obecně se pro introdukci cizí DNA do rostlin používají vektory na bázi Ti-plazmidu, jakož i přímý příjem DNA, lipozómy, elektroporace, mikroinjekce a vstřelování mikročástic. Takové způsoby jsou popsány v oboru, viz například Guerche a kol., (1987) Plant Science 52: 111 - 116; Neuhause a kol., (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30 - 36; Klein a kol. (1987) Nátuře 327: 70 - 73; Howell a kol., (1980) Science 208: 1265; Horsch a kol., (1985) Science 227: 1229 - 1231; DeBlock a kol., (1989) Plant Physiology 91: 694 - 701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach a Weissbach, editoři) Academie Press, Inc. (1988); a Methods in Plant Molecular Biology (Schuler a Zielinsku, editoři) Academie Press, Inc. (1989), viz rovněž patentová přihláška Spojených

Států Amerických č. 08/008 374, a rovněž EP-A 0193259 a

EP-A 0451878. Je samozřejmé, že způsob transformace závisí na rostlinné buňce, která má být transformována.

Dále je možné složky expresivní kazety modifikovat pro zvýšení exprese. Lze například použít zkrácené sekvence, provést substituce nukleotidů nebo jiné modifikace, viz například Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324 - 3328; Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498; a WO 91/16432.

Konstrukt může rovněž obsahovat libovolné jiné nutné regulátory, jako jsou terminátory (Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671 - 674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev. , 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1272 ; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891 - 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627 - 9639); rostlinné konvenční sekvence pro translaci (Joshi, C.P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6643 - 6653), introny (Luehrsen a Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet. , 225: 81 - 93) a podobně, operabilně spojené s nukleotidovou sekvencí. Může být výhodné zařadit do konstruktu expresivní kazety 5'-vedoucí sekvenci. Takové vedoucí sekvence mohou působit tak, že zvyšují translaci. Translační vedoucí sekvence jsou v oboru známé a patří mezi ně:

vedoucí sekvence picornavirů, sekvence EMCV (5'-nekódující oblast (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T.R., a Moss 86 : 6126 - 6130) ;

například vedoucí encefalomyocarditis)

B. (1989) PNAS USA vedoucí sekvence potyvirů, například vedoucí sekvence TEV (viru skvrnitosti tabáku Tobacco Etch Virus) (Allison a kol., (1986); vedoucí sekvence MDMV (viru zakrslé mozaiky kukuřice), Virology, 154: 9 - 20); a protein vázající těžký řetězec lidského imunoglobulinu (BiP) (Macejak, D. G._z a Sarnow, P., (1991), Nátuře 353:

- 94;

nepřekládaná vedoucí sekvence z mRNA obalového proteinu viru mozaiky vojtěšky (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., a Gehrke, L., (1987), Nátuře, 325: 622 - 625;

vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV), (Gallie, D. R. a kol., (1989), Molecular Biology of RNA, str. 237 - 256; a vedoucí sekvence viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel , S. A. a kol., (1991), Virology, 81: 382 - 385, viz rovněž Della-Cioppa a kol., (1987), Plant Physioloq-y, 84: 965 - 968.

V expresívní kazetě lze použít rostlinný terminátor, viz například Rosenberg a kol., (1987), Gene, 56: 125; Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet. , 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671 - 674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1272; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891 - 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627 - 9639.

Pro tkáňově specifickou expresi lze nukleotidové sekvence podle vynálezu operabilně spojit s tkáňově specifickými promotory, viz například EP-A 0618976.

Do rozsahu vynálezu dále spadají transgenické rostliny, zejména transgenické fertilní rostliny transformované pomocí výše popsaných postupů a jejich asexuální nebo/a sexuální potomstvo, které obsahují a výhodně rovněž exprimují pesticidní protein podle vynálezu. Zejména výhodné jsou hybridní rostliny.

Transgenickými rostlinami podle vynálezu mohou být dvouděložné nebo jednoděložné rostliny. Výhodné jsou jednodšložné rostliny z čeledi Graminaceae, včetně rostlin rodů Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum,

Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.

Zejména výhodná je transgenická kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves, drnové trávy a rýže.

Z dvouděložných rostlin je zejména výhodná sója, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka a slunečnice.

Rozumí se, že termín potomstvo zahrnuje jak asexuálně tak sexuálně vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Rozumí se, že tato definice rovněž zahrnuje všechny mutanty a varianty získatelné pomocí známých způsobů, jako je například buněčná fúze nebo selekce mutantů, které stále vykazují charakteristické vlastnosti původně transformované rodičovské rostliny, spolu se všemi produkty křížení a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.

Další předmět vynálezu se týká proliferačního materiálu transgenických rostlin.

Proliferační materiál transgenických rostlin je podle vynálezu definován jako jakýkoli rostlinný materiál, který lze množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zejména výhodné jsou v rámci rozsahu vynálezu protoplasty, buňky, kalus, tkáně, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, spolu s libovolným jiným propagačním materiálem získaným z transgenických rostlin.

Předmětem vynálezu jsou rovněž části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných pomocí způsobů podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň z části tvořeny transgenickými buňkami.

Předtím než se rostlinný propagační materiál (plody, hlízy, zrna, semena), ale zejména semena, prodává jako komerční produkt, opatřuje se obvykle ochranným obalem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika těchto přípravků, pokud je to žádoucí spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými v oboru, pro poskytnutí ochrany proti poškození způsobenému bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci.

Pro ochranu semen je možné ochranný obal aplikovat na semena buďto impregnací hlíz nebo zrn kapalnou formulací nebo jejich obalením smíchanou vlhkou nebo suchou formulací. Kromě toho jsou ve speciálních případech možné jiné způsoby aplikace na rostliny, například se může provádět ošetření směrované na květy nebo plody.

Semeno rostliny podle vynálezu, které obsahuje molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pesticidní protein podle vynálezu, lze ošetřit obalem chránícím semena obsahujícím sloučeninu na ošetření rostlin, jako je například captan, carboxin, thiram (TMTD), methalaxyl (Apron) a pirimifos-methyl (Actellic) a jině sloučeniny, které se běžně používají na ošetření semen. V rámci rozsahu vynálezu jsou výhodné obaly chránící semena obsahující insekticidní prostředek podle vynálezu, a to buď samotný nebo v kombinaci s jedním z obalů chránících semena běžně používaných k ošetření semen.

Dalším předmětem vynálezu je tedy rostlinný propagační materiál kultivovaných rostlin, avšak zejména semeno rostlin, ošetřené obalem chránícím semena, jak je definován výše.

Geny kódující pesticidní proteiny lze použit pro transformaci organismů patogenních pro hmyz. Mezi takové organismy patří Baculoviry, houby, prvoci, bakterie a háďatka.

Kmeny Bacillus podle vynálezu lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Alternativně lze gen kódující pesticid introdukovat pomocí vhodného vektoru do mikrobiálního hostitele, a tohoto hostitele aplikovat na prostředí, rostliny nebo zvířata. Je možné vybrat jako hostitele mikroorganismy, o kterých je známo, že obsazují fytosféru (fyloplán, fylosféru, rhizosféru nebo/a rhizoplán) jedné nebo několika plodin, které jsou předmětem zájmu. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopné úspěšně soutěžit v konkrétním prostředí s mikroorganismy divokého typu, aby v nich byl stabilně udržován a exprimován gen exprimující polypeptidový pesticid, a s výhodou aby zajišťovaly zlepšenou ochranu pesticidu před degradací a inaktivaci způsobenou prostředím.

Mezi takového mikroorganismy patři bakterie, řasy a houby. Zejména zajímavými mikroorganismy jsou bakterie, například Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, zejména kvasinky, například Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvláště zajímavé jsou takové fytosférní druhy bakterii, jako je Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii, a fytosférní druhy kvasinek, jako je Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, a Aureobasidium pollulans. Obzvláště zajímavé jsou pigmentované mikroorganismy.

Je dostupná řada způsobů introdukce genu exprimujícího pesticidní protein do mikroorganismu jako hostitele za podmínek, které umožňují stabilní udržení a expresi genu. Je například možné zkonstruovat expresívní kazety, které obsahují DNA-konstrukty, které jsou předmětem zájmu, operabilně spojené s transkripčními a translačními regulačními signály pro expresi DNA-konstruktů, a DNA-sekvenci homologickou se sekvencí v hostitelském organismu, jejímž prostřednictvím dojde k integraci, nebo/a replikační systém, který je funkční v hostiteli, jehož prostřednictvím dojde k integraci nebo stabilnímu udržení.

Mezi transkripčni a translační regulační signály patří, aniž by se tím však jejich rozsah jakkoli omezoval, promotor, místo iniciace transkripce, operátory, aktivátory, enhancery, další regulační elementy, místa vázající se na ribozomy, iniciační kodon, terminační signály a podobně, viz například patent Spojených Států Amerických ě. 5 039 523, patent Spojených Států Amerických č. 4 853 331, EPO 0480762A2, Sambrook a kol., viz výše; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) ; Advanced Bacterial Genetics, Davis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980), a v nich citovaně odkazy.

Mezi vhodné hostitelské buňky, v případě že se buňky obsahující pesticid budou ošetřovat pro prodloužení účinnosti toxinu v buňce když se poté ošetřené buňky aplikují na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni, mohou patřit buďto prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky, normálně s omezením na ty buňky, které neprodukují látky toxické pro vyšší organismy, jako jsou savci. Je však možné použít organismy produkující látky toxické pro vyšší organismy v případě, že toxin je nestabilní nebo aplikační množství dostačně nízké, aby bylo možné vyhnout se možnosti toxicity pro savčího hostitele. Jako hostitelé jsou zejména zajímaví prokaryotní hostitelé a nižší eukaryotni hostitelé, jako jsou houby. Mezi ilustrativní příklady prokaryotních hostitelů patří jak Gram-negativní tak

Gram-pozitivní hostitelé, a patří mezi ně Enterobacteriaceae, jako je Escherichia, Próteus; Bacillaceae; Spirillaceae, jako je

Erwinina, Shigella, Salmonella, a Rhizobiaceae, jako je Rhizobium; fotobakterium, Zymomonas, Serratia,

Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, jako je Pseudomonas a Acetobacter; Azotobacteraceae a Nitrobacteraceae. Mezi eukaryotni hostitele patři houby, jako jsou Phycomycetes a Ascomycetes, mezi které patří kvasinky, jako jsou Saccharomyces a Schizosaccharromyces, a kvasinky z třídy Basidiomycetes, jako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces a podobně.

Mezi zejména zajímavé charakteristiky při výběru hostitelské buňky pro účely produkce patří snadnost introdukce genu pro protein do hostitele, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese, stabilita proteinu v hostiteli, a přítomnost pomocných genetických schopnosti. Mezi charakteristiky zajímavé při použití jako pesticidních mikrokapslí patří ochranné vlastnosti pro pesticid, jako jsou silné buněčné stěny, pigmentace a intracelulární packaging nebo vytváření inkluzních tělísek; afinita k listům; nepřítomnost toxicity pro savce; atraktivita pro požer škůdci; snadnost usmrcení a fixace bez poškození toxinu; a podobně. Dále je třeba brát v úvahu snadnost formulace a manipulace, ekonomická hlediska, stabilitu při skladováni a podobně.

Mezi zejména zajímavé hostitelské organismy patří kvasinky, jako jsou Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. a Sporobolomyces sp., fyloplánové organismy jako jsou Pseudomonas sp., Erwinia sp. a Flavobacterium sp., nebo jiné organismy jako jsou Escherichia, Lactobacillus sp. , Bacillus sp. , a podobně. Mezi konkrétní organismy patří Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli,

Bacillus subtilis a podobně.

Geny VIP lze introdukovat do mikroorganismů, které se množí na rostlinách (epifytů) pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například Gram-pozitivní nebo Gram-negativní bakterie.

Z rostliny, která je předmětem zájmu, lze například izolovat pomocí způsobů známých v oboru bakterie kolonizující kořeny. Konkrétně lze z kořenů rostliny izolovat kmen Bacillus cereus kolonizující kořeny (například viz J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L. Wunderlich a C. Grau, Appl. Environ. Microbiol. 56: 713 - 718, (1990)). VIP1 nebo/a VIP2 nebo/a VIP3 lze introdukovat do Bacillus cereus kolonizujícího kořeny pomocí standardních způsobů známých v oboru.

Konkrétně lze VIP1 nebo/a VIP2 získaný z kmene Bacillus cereus AB78 introdukovat do Bacillus cereus kolonizujícího kořeny pomocí konjugace za použití standardních metod (J. Gonzales, B. Brown a B. Carlton, Proč. Nati. Acad. Sci. 79: 6951 - 6955 (1982)) .

VIP1 nebo/a VIP2 nebo/a VIP3 nebo jiné VIP podle vynálezu lze rovněž introdukovat do mikroorganismu rodu Bacillus kolonizujícího kořeny pomoci elektrotransformace. Konkrétně lze VIP klonovat do kyvadlového vektoru (shuttle vector), například pHT3101 (D. Lereclus a kol., FEMS Microbiol. Letts., 60: 211 - 218 (1989)), jak je popsáno v příkladu 10. Kyvadlový vektor pHT3101 obsahující kódující sekvenci konkrétního VIP lze poté transformovat do mikroorganismu rodu Bacillus kolonizujícího kořeny pomocí elektroporace (D. Lereclus a kol. 1989, FEMS Microbiol. Letts. , 60: 211 - 218).

Expresívní systémy lze vytvořit tak, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány vně cytoplazmy například Gram-negativní bakterie Escherichia coli. Výhody toho, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány, jsou následující:

(1) zamezí se tím potenciálním toxickým účinkům exprimovaných vegetativních insekticidních proteinů v cytoplazmě, (2) může se zvýšit množství exprimovaného vegetativního insekticidního proteinu, a (3) může se usnadnit účinná purifikace vegetativního insekticidního proteinu.

Vegetativní insekticidní proteiny lze upravit tak, aby byly sekretovány Escherichia coli, například fúzí vhodného signálního peptidu Escherichia coli na N-konec signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu nebo nahrazením signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu signálním peptidem Escherichia coli. Signální peptidy rozpoznávané Escherichia coli lze nalézt v proteinech, o kterých je již známo, že jsou sekretovány Escherichia coli, jako je například protein OmpA (J. Ghrayeb, H. Kimura, M, Takahara, Y. Masui a M. Inouye, EMBO J. , 3: 2437 - 2442 (1984)). OmpA je hlavním proteinem vnější membrány Escherichia coli a má se tedy za to, že je jeho signální peptid účinný v translokačním procesu. Signální peptid proteinu OmpA rovněž nemusí být modifikován před úpravou (processingem), jak tomu může být v případě jiných signálních peptidů, například lipoproteinového signálního peptidu (G. Duffaud, P. March a M. Inouye, Methods in EnzymolodV, 153: 492 (1987)).

Specificky lze na N-konce a C-konce kódujících sekvencí VIP za použití standardních způsobů známých v oboru zavést jedinečná restrikční místa BamHI. Tyto BamHI-fragmenty lze klonovat, ve čtecím rámci, do vektoru pIN-III-ompAl, A2 nebo A3 (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui a

M. Inouye, ΕΜΒΟ J. , 3: 2437 - 2442 (1984)), čímž se vytvoří fúzní gen ompA:VIP, který je sekretován do periplazmického prostoru. Další restrikční místa v polylinkeru pIN-III-ompA lze eliminovat pomocí standardních způsobů známých v oboru, takže sekvence kódující N-koncovou aminokyselinu vegetativního insekticidního proteinu následuje přímo po místu štěpení signálního peptidu ompA. Sekretovaná sekvence vegetativního insekticidního proteinu v Escherichia coli je tedy poté identická s nativní sekvencí vegetativního insekticidního proteinu.

Pokud není nativní signální peptid vegetativního insekticidního proteinu nutný pro vytvoření správné struktury (folding) maturovaného proteinu, lze takové signální sekvence odstranit a nahradit signální sekvencí ompA. Jedinečná restrikční místa BamHI lze zavést na N-konci kódující sekvence proproteinu bezprostředně za sekvenci kódující signální peptid VIP a na C-konci sekvence kódující VIP. Tyto BamHI-fragmenty lze poté klonovat do vektorů pIN-III-ompA jak je popsáno výše.

Obecné způsoby pro použití kmenů podle vynálezu k pesticidní kontrole nebo vytváření jiných organismů jako pesticidních činidel jsou známy v oboru, viz například patent Spojených Států Amerických č. 5 039 523 a EP 0480762A2.

Vegetativní insekticidní proteiny lze fermentovat v bakteriálním hostiteli a výslednou bakterii zpracovat a použít jako mikrobiální postřik stejným způsobem jakým se používají jako insekticidní postřiky kmeny Bacillus thuringiensis. V případě vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů, sekretovaných z mikroorganismů rodu Bacillus, se sekreční signál odstraní nebo mutuje za použití postupů známých v oboru. Takovéto mutace nebo/a delece zabraňují sekreci vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů do růstového média během procesu fermentace.

Vegetativní insekticidní proteiny jsou uchovávány v buňce a buňky se poté zpracují za vzniku enkapsulovaných vegetativních insekticidních proteinů. Pro tento účel lze použít libovolných vhodných mikroorganismů. Pro expresi endotoxinů Bacillus thuringiensis jako enkapsulovaných proteinů se v současné době používají mikroorganismy rodu Pseudomonas, přičemž se výsledné buňky zpracuji a použijí k postřiku jako insekticidy (H. Gaertner a kol. 1993, v Idvanced Engineered Pesticides, editor L. Kim).

Tímto způsobem se používají různé kmeny Bacillus thuringiensis. Takovéto kmeny Bacillus thuringiensis produkují endotoxinový proteiny (nebo proteiny), jakož i vegetativní insekticidní proteiny. Alternativně mohou takové kmeny produkovat pouze vegetativní insekticidní proteiny. U nesporulujícího kmenu Bacillus subtilis bylo zjištěno, že produkuje vysoká množství endotoxinů CrylIIA z Bacillus thuringiensis (Agaisse, H. a Lereclus, D., Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis CrylIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant, J. Bacteriol., 176: 4734 - 4741 (1994)) . Podobný spoOA mutant lze připravit v případě Bacillus thuringiensis a použit jej pro produkci enkapsulovaných vegetativních insekticidních proteinů, které nejsou sekretovány do média ale jsou uchovávány v buňce.

Pro uchování vegetativních insekticidních proteinů v buňce mikroorganismu Bacillus lze signální peptid změnit tak, že již nepůsobí jako sekreční signál. Konkrétně předpokládaný signální peptid pro VIP1 zahrnuje prvních 31 aminokyselin proteinu s předpokládaným konvenčním místem štěpení, Ala-X-Ala, na C-konci této sekvence (G. von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99 - 105 (1989)) a předpokládaný signální peptid pro VIP2 zahrnuje prvních 40 aminokyselin proteinu s předpokládaným místem štěpení za Ala40. Místa štěpení bud' ve VIP1 nebo VIP2 lze mutovat pomocí způsobů známých v oboru pro nahrazení konvenční sekvence místa štěpení alternativními aminokyselinami, které nejsou rozpoznávány signálními peptidasami.

Alternativně lze signální peptidy VIP1, VIP2 nebo/a jiných VIP podle vynálezu eliminovat ze sekvence, čímž se způsobí, že nejsou rozpoznatelné jako sekreční proteiny v mikroorganismech rodu Bacillus. Konkrétně lze za použití způsobů známých v oboru před proproteinovou sekvenci ve VIP1, začínající Asp32, nebo proproteinovou sekvenci ve VIP2, začínající Glu41, zařadit methioninové iniciační místo.

Geny pro vegetativní insekticidní proteiny lze introdukovat do mikroorganismů, které se rozmnožují na rostlinách (epifytů), pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například Gram-pozitivní nebo Gram-negativní bakterie.

Kmeny rodu Bacillus podle vynálezu, nebo mikroorganismy, které byly geneticky změněny tak, aby obsahovaly pesticidní gen a protein, lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Podle jednoho provedení vynálezu se celé, t.j. nelyžované, buňky organismu produkujícího toxin (pesticid) ošetří činidly, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni.

Alternativně se pesticidy produkují pomocí introdukce heterologního genu do buněčného hostitele. Exprese heterologního genu způsobuje přímo nebo nepřímo intracelulární produkci a uchovávání pesticidu. Tyto buňky se poté ošetří za podmínek, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni. Výsledný produkt si uchovává toxicitu toxinu. Takové přirozeně enkapsulované pesticidy lze poté formulovat podle běžných technik pro aplikaci na prostředí obsahující škůdce, který má být kontrolován, například půdu, vodu, a listy rostlin, viz například EPA 0192319, a odkazy tam citované.

Účinné látky podle vynálezu se normálně aplikují ve formě prostředků, a lze je aplikovat na stanoviště plodiny nebo na rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s jinými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňuji růst rostlin. Může jit rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.

Výhodnými způsoby aplikace účinné látky podle vynálezu nebo agrochemického prostředku podle vynálezu, který obsahuje alespoň jeden z pro hmyz specifických proteinů produkovaných bakteriálními kmeny podle vynálezu, jsou aplikace na listy, obalování semen a půdní aplikace. Počet dávek a aplikační dávka závisí na intenzitě zamoření odpovídajícím škůdcem.

Vynález se tedy dále týká insekticidního prostředku, který obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo/a rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu

DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, spolu se zemědělskou nosnou nebo pomocnou látkou, jako je nosič, ředidlo, povrchově aktivní látka nebo pomocná látka zlepšující aplikaci. Tento prostředek může rovněž obsahovat další biologicky účinnou sloučeninu. Uvedenými sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.

Prostředek může obsahovat od 0,1 do 99 % hmot. účinné látky, od 1 do 99,9 % hmot. pevné nebo kapalné nosné nebo pomocné látky a od 0 do 25 % hmot. povrchově aktivní látky. Účinnou látku, která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, lze na rostliny nebo plodiny, které mají být chráněny, aplikovat spolu s určitými jinými insekticidy nebo chemikáliemi (1993 Crop Protection Chemicals

Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada) bez ztráty účinnosti. Tyto látky a prostředky jsou kompatibilní s většinou jiných materiálů běžně používaných pro postřiky v zemědělství, neměly by však být používány v extrémně alkalických postřikových roztocích. Lze je aplikovat ve formě poprašů, suspenzí, smáčitelných prášků nebo v libovolné jiné formě vhodné pro použití v zemědělství.

Vynález dále popisuje způsoby kontroly nebo inhibice hmyzích škůdců, při kterých se aplikuje účinná látka, která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, na (a) prostředí, ve kterém se může hmyzí škůdce vyskytovat, (b) rostlinu nebo část rostliny za účelem ochrany uvedené rostliny nebo části rostliny před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem, nebo (c) semeno za účelem ochrany rostliny, které se z uvedeného semena vyvine, před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem.

Výhodným způsobem aplikace v oboru ochrany rostlin je aplikace na listy rostlin (listová aplikace), přičemž počet dávek a aplikační dávka závisí na rostlině, která má být chráněna, a riziku napadení daným škůdcem. Účinná látka se však může dostat do rostliny rovněž kořeny (systémové působení), pokud se na stanoviště rostliny aplikuje kapalná formulace nebo pokud se účinná látka zapracuje v pevné formě na stanoviště rostliny, například do půdy, například ve formě granuli (půdní aplikace). Při záplavovém pěstování rýže lze takovéto granule aplikovat v odměřených množstvích na zaplavené rýžové pole.

Prostředky podle vynálezu jsou rovněž vhodné na ochranu rostlinného rozmnožovacího materiálu, například semen, jako jsou plody, hlízy nebo zrna, nebo rostlinných řízků, proti živočišným škůdcům. Rozmnožovací materiál lze tímto prostředkem ošetřit před vysetím či vysázením, například semena lze obalovat před setím. Účinnou látku podle vynálezu lze rovněž aplikovat na zrní (obalování, moření), a to tak, že se na zrní buď aplikuje kapalný prostředek nebo se obalí pevným prostředkem. Prostředek lze rovněž aplikovat na místo setí nebo sázení ve chvíli setí nebo sázení rozmnožovacího materiálu, například do secí brázdy během setí. Vynález rovněž zahrnuje tyto způsoby ošetření rostlinného rozmnožovacího materiálu a rostlinný rozmnožovací materiál, který byl takto ošetřen.

Prostředky podle vynálezu, které obsahují jako účinnou látku rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jeden z nových toxinových genů v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, lze aplikovat libovolným známým způsobem pro ošetření semen nebo půdy bakteriálními kmeny, viz například patent Spojených Států Amerických ě. 4 863 866. Tyto kmeny poskytují účinnou biologickou ochranu dokonce i v případě, že mikroorganismus není živý. Výhodná je však aplikace živých mikroorganismů.

Mezi cílové plodiny, které mají být chráněny, patří v rámci vynálezu například následující druhy rostlin:

obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepa (cukrová řepa a krmná řepa), trávy používané jako pícniny (srha říznačka, kostřavy a podobně), ovocné plodiny rodící jádrové, peckové a měkké ovoce (jabloně, hrušně, švestky, broskvoně, mandloně, třešně, jahodník, maliník a ostružinik), luskoviny (fazol, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka olejka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosovník, skočec, kakaovník, podzemnice olejná), tykvovité rostliny (okurky, dýně, melouny), přadné rostliny (bavlník, len, konopí, jutovník), rostliny produkující citrusové plody (pomeranče, citrony, grepy, mandarinky), zeleniny (špenát, hlávkový salát, chřest, zelí a jiné zeleniny z čeledi Brassicaceae, cibule, rajčata, brambory, paprika), vavřínovíté rostliny (avokado, mrkev, skořicovník, kafrovník), opadavé stromy a konifery (například lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), a rostliny jako je kukuřice, tabák, ořešák, kávovník, cukrová třtina, čajovník, vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník, jakož i okrasné rostliny, včetně hvězdnicovitých (složnokvětých).

Rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, se obvykle aplikuje ve formě insekticidních prostředků, přičemž aplikaci lze provádět na pěstební plochu nebo rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s dalšími biologicky účinnými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků.

Účinnou látku podle vynálezu lze použít v nemodifikované formě nebo spolu s libovolným vhodným zemědělsky přijatelným nosičem. Takovýmito nosiči jsou nosné a pomocné látky obvykle používané při vytváření zemědělských prostředků, a účinné látky podle vynálezu se tedy formulují známým způsobem do formy emulgovatelných koncentrátů, roztíratelných past, roztoků pro přímý postřik nebo ředitelných roztoků, zředěných emulzí, smáčitelných prášků, rozpustných prášků, poprašů a granulí, a rovněž se mohou enkapsulovat, například do polymerních látek. Způsoby aplikace, jako postřik, zmlžování, poprašování, rozmetání nebo zalévání se, stejně jako typ prostředku, volí podle požadovaných výsledků a převládajících podmínek. Výhodné aplikační dávky se normálně pohybují od přibližně 50 g do přibližně 5 kg účinné látky na hektar, výhodně od přibližně 100 g do přibližně 2 kg účinné látky na hektar. Významné jsou aplikační dávky v rozmezí od přibližně 200 g do přibližně 1 kg účinné látky na hektar a od 200 g do 500 g účinné látky na hektar.

V případě obalování (moření) semen činí výhodné aplikační dávky 0,5 g až 1000 g účinné látky na 100 kg semen, výhodně 3 g až 100 g účinné látky na 100 kg semen nebo 10 g až 50 g účinné látky na 100 kg semen.

Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá. Formulace, t.j. insekticidní prostředky, přípravky nebo směsi obsahující rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, jako účinnou látku, nebo jeho kombinaci s jinými účinnými látkami, a popřípadě pevnou nebo kapalnou nosnou nebo pomocnou látku, se připraví známým způsobem, npaříklad homogenním mícháním nebo/a mletím účinných látek s aditivy, například rozpouš58 tědly, pevnými nosnými látkami a v některých případech povrchově aktivními sloučeninami (povrchově aktivními činidly, surfaktanty).

Jako rozpouštědla jsou vhodné následující látky: aromatické uhlovodíky, výhodně frakce obsahující 8 až 12 atomů uhlíku, například směsi xylenů nebo substituované naftaleny, ftaláty, jako je dibutylftalát nebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky, jako je cyklohexan nebo parafiny, alkoholy a glykoly a jejich ethery a estery, jako je ethanol, monomethyl- nebo monoethylether ethylenglykolu, ketony, jako je cyklohexanon, silně polární rozpouštědla, jako je N-methyl-2-pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid, jakož i rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje, jako je epoxidovaný kokosový olej nebo sojový olej, nebo voda.

Pevnými nosiči používanými například pro popraše a dispergovatelné prášky, jsou přírodní minerální plnidla, jako je kalcit, mastek, kaolin, montmorilonit nebo atapulgit. Pro zlepšení fyzikálních vlastností lze rovněž přidávat vysokodisperzní kyselinu křemičitou nebo vysokodisperzní absorbující polymery. Vhodnými granulovanými adsorpčními nosiči jsou porézní typy materiálů, například pemza, cihlová drť, sepiolit nebo bentonit, a vhodnými nesorpčními nosiči jsou materiály jako je kalcit nebo písek. Kromě toho lze použít rovněž rozsáhlou řadu předem granulovaných materiálů anorganické nebo organické povahy, například zejména dolomit nebo rozmělněné rostlinné zbytky.

která je aktivními anionická emulgační, že termín povrchově

V závislosti na povaze účinné látky, začleňována do prostředku, jsou vhodnými povrchově sloučeninami neionogenní, kationická nebo/a povrchově aktivní činidla, která vykazují dobré dispergační a smáčivé vlastnosti. Rozumí se, povrchově aktivní činidlo zahrnuje též směsi aktivních činidel.

Vhodnými anionickými povrchově aktivními činidly mohou být jak ve vodě rozpustná mýdla tak ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní sloučeniny. Vhodnými mýdly jsou soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo nesubstituované nebo substituované amoniové soli vyšších mastných kyselin (obsahujících 10 až 22 atomů uhlíku), například sodné nebo draselné soli olejové nebo stearové kyseliny, nebo přírodních směsí mastných kyselin, které lze získat například z kokosového oleje nebo lojového oleje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními činidly jsou rovněž soli mastných kyselin a methyltaurinu, jakož i modifikované a nemodifikované fosfolipidy.

například sem lignosulfonové,

Častěji se však používají tak zvané syntetické povrchově aktivní látky, zejména mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfonované benzimidazolderiváty nebo alkylarylsulfonáty. Mastné sulfonáty nebo sulfáty jsou zpravidla ve formě solí s alkalickými kovy, solí s kovy alkalických zemin nebo nesubstituovaných nebo substituovaných amoniových solí, a obecně obsahují alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, který zahrnuje rovněž alkylovou část acylových zbytků, patří sodná nebo vápenatá sůl kyseliny dodecylsulfátů nebo směsí mastných alkoholsulfátů získaných z přírodních mastných kyselin. Mezi tyto sloučeniny patří rovněž soli esterů kyseliny sírové a suífonové kyseliny adičních produktů mastných alkoholů s ethylenoxidem. Sulfonované benzimidazolderiváty výhodné obsahují dvě sulfonylové skupiny a jeden zbytek mastné kyseliny obsahující přibližně 8 až 22 atomů uhlíku. Mezi příklady alkylarylsulfonátů patří například sůl sodíku, vápníku nebo triethanolaminu a dodecylbenzensulfonové kyseliny, dibutylnaftalensulfonové kyseliny nebo kondenzačního produktu kyseliny naftalensulfonové a formaldehydu. Vhodné jsou rovněž odpovídající fosfáty, například soli esterů kyseliny fosforečné a aduktů p-nonylfenolu se až 14 mol ethylenoxidu.

Neionogenními povrchově aktivními látkami jsou výhodně polyglykoletherderiváty alifatických nebo cykloalifatických alkoholů, nasycených nebo nenasycených mastných kyselin a alkylfenolů, kteréžto deriváty obsahují 3 až 30 glykoletherových skupin a 8 až 20 atomů uhlíku v (alifatickém) uhlovodíkovém zbytku a 6 až 18 atomů uhlíku v alkylovém zbytku alkylfenolů.

Dalšími vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami jsou ve vodě rozpustné adiční produkty polyethylenoxidu s polypropylenglykolem, ethylendiaminopolypropylenglykolem a alkylpolypropylenglykolem s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém řetězci, obsahující 20 až 250 ethylenglykoletherových skupin a 10 až 100 propylenglykoletherových skupin. Tyto sloučeniny obsahují obvykle na jednotku propylenglykolu 1 až 5 jednotek ethylenglykolu. Jako reprezentativní příklady neionogenních povrchově aktivních látek je možno uvést nonylfenolpolyethoxyethanoly, polyglykolethery ricinového oleje, adiční produkty polypropylenu a polyethylenoxidu, tributylfenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglykol a oktylfenoxypolyethoxyethanol. Vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami sjou kyselin a polyoxyethylensorbitanu, sorbitan-trioleát.

rovněž estery mastných jako je polyoxyethylenKationickými povrchově aktivními látkami jsou výhodně kvarterní amoniové soli, které jako substituent dusíkového atomu obsahují alespoň jeden alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, a jako další substituenty nižší, nesubstituované nebo halogenované, alkylové skupiny, benzylové skupiny, nebo nižší hydroxyalkylové skupiny. Tyto soli jsou výhodně ve formě halogenidů, methylsulfátů nebo ethylsulfátů, jako je například stearyltrimethylamoniumchlorid nebo benzyldi(261

-chlorethyl)ethylamoniumbromid.

Povrchově aktivní látky běžně používané při vytváření prostředků, jsou popsány například v publikacích McCutcheonď Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, 1979, a Dr. Helmut Stache Tensid Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, Mnichov/Vídeň.

Další zejména výhodnou vlastností insekticidního prostředku podle vynálezu je stálost účinné látky pokud je aplikován na rostliny a půdu. Mezi možné příčiny ztráty účinnosti patří inaktivace ultrafialovým světlem, teplem, listovými exudáty a pH. Například při vysokém pH, zejména za přítomnosti redukčního činidla, krystaly δ-endotoxinů solubilizují a tím se stávají přístupnější proteolytické inaktivaci. Významné může být i vysoké pH listů, zejména pokud může mít povrch listů pH v rozmezí 8 - 10. U formulací insekticidního prostředku podle vynálezu je možné se s těmito problémy vypořádat buďto přidáním aditiv napomáhajících zabránění ztráty účinné látky nebo enkapsulací materiálu takovým způsobem, že je účinná látka chráněna proti inaktivaci. Enkapsulací lze provést chemicky (McGuire a Shasha, J Econ Entomol 85: 1425 - 1433, 1992) nebo biologicky (Barnes a Cummings, 1986; EP-A 0 192 319) . Mezi způsoby chemické enkapsulace patří postupy, při kterých je účinná látka obalena polymerem, zatímco biologická enkapsulace zahrnuje expresi genů δ-endotoxinů v mikrobech. V případě biologické enkapsulace se jako účinná složka formulace použije nepoškozený mikrob, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě. Přidáním činidel chránících proti účinkům UV-záření se může účinně snížit poškození zářením. Inaktivaci teplem lze rovněž kontrolovat přidáním vhodného aditiva.

Výhodné jsou v rámci vynálezu formulace, které obsahují jako účinnou složku živé mikroorganismy, buď ve fromě vegetativní buňky nebo výhodněji ve formě spor, pokud jsou v daném případě dostupné. Vhodné formulace mohou být tvořeny například polymerními gely, které jsou zesítěné polyvalentními kationty a obsahují uvedené mikroorganismy, jak popsali například D. R. Fravel a kol. v Phytopathology, svazek 75, č. 7, 774 - 777, 1985 za použití alginátu jako polymerního materiálu. Z této publikace je rovněž známo, že lze používat společně více nosných materiálů. Uvedené formulace se zpravidla připravují mícháním roztoků v přírodě se vyskytujících nebo syntetických polymerů tvořících gely, například alginátů, a vodných roztoků solí polyvalentních iontů kovů tak, že se vytvoří jednotlivé kapičky, přičemž mikroorganismy mohou být suspendovány v jednom ze dvou uvedených reakčních roztoků nebo v obou těchto roztocích. Tvorba gelu začíná při míchání ve formě kapiček. Tyto částice gelu lze následně vysušit. Tento proces se nazývá ionotropní gelovatění. V závislosti na stupni vysušení se vytvoří kompaktní a tvrdé částice polymerů, které jsou strukturně zesítěny polyvalentními kationty a které obsahují mikroorganismy a nosič v převážně rovnoměrném rozmístění. Velikost částic může být až do 5 mm.

EP-A1-0 097 571 popisuje prostředky na bázi částečně zesítěných polysacharidů které, kromě toho že obsahují mikroorganismy, mohou obsahovat rovněž například jemně zrnitou kyselinu křemičitou jako nosný materiál a zesítění lze provést například ionty Ca⁺⁺. Tyto prostředky vykazují vodní aktivitu nepřesahující hodnotu 0,3. Cornick a kol. popisují v shrnujícím článku (New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases, str. 345 - 372, Alan R. Liss, lne. (1990)) různé formulační systémy, přičemž jsou zmíněny granule s vermikulitem jako nosičem a kompaktní alginátové kuličky připravené způsobem ionotropního gelovatění. Takové prostředky popsal rovněž D. R. Fravel v Pesticide Formulatíons and

Application Systems: 11. svazek, ASTM STP 1112 American

Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, str.

173 - 179 a lze je použít pro formulaci rekombinantních mikroorganismů podle vynálezu.

Insekticidní prostředky podle vynálezu obsahují obvykle od přibližně 0,1 do přibližně 99 %, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 95 % a nejvýhodněji přibližně 3 až přibližně 90 % účinné látky, přibližně 1 až přibližně 99,9 %, výhodně přibližně 1 až přibjližně 99 % a nejvýhodneji přibližně 5 až přibližně 95 % pevného nebo kapalného aditiva, a přibližně 0 až přibližně 25 %, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 25 % a nejvýhodněji přibližně 0,1 až přibližně 20 % povrchově aktivního činidla.

Podle výhodného provedení vynálezu obsahují insekticidní prostředky obvykle 0,1 až 9 9 %, výhodně 0,1 až 95 % rekombinantního kmene Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jeho kombinace s jinými účinnými látkami, 1 až 99,9 % pevného nebo kapalného aditiva, a 0 až 25 %, výhodně 0,1 až 20 % povrchově aktivního činidla.

Zatímco komerční produkty se obvykle vyrábějí jako koncentráty, konečný spotřebitel obvykle používá zředěné formulace s podstatně nižší koncentrací. Insekticidní prostředky mohou obsahovat také další složky, jako stabilizátory, činidla proti pěnění, látky regulující viskozitu, pojidla, činidla způsobující lepivost, jakož i hnojivá nebo jiné účinné látky pro dosažení speciálních efektů.

Podle jednoho provedení vynálezu byl izolován mikroorganismus Bacillus cereus, který je schopen usmrcovat Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotiaca longicornis barberi. Nový kmen Bacillus cereus AB78 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent

Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center,

1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21058.

Z tohoto kmene Bacillus cereus byl v podstatě purifikován frakční protein. Tato purifikace proteinu byla ověřena pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu a biologické účinnosti. Protein má molekulovou hmotnost přibližně 60 až přibližně 100 kDa, zejména přibližně 70 až přibližně 90 kDa, obzvláště přibližně 80 kDa a je označován VIP.

Sekvenováním od konce s volnou aminoskupinou bylo zjištěno, že N-koncovou aminokyselinovou sekvencí je NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID č. 8), kde zbytek Asx představuje buďto Asp nebo Asn. Celá aminokyselinová sekvence je uvedená v SEQ ID č. 7. DNA-sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7 je uvedena v SEQ ID č. 6.

Byla vytvořena oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyseliny 3-9 NH₂-konce. Sonda byla syntetizována na bázi použiti kodónů genu pro δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis (Bt) . Nukleotidová sekvence oligonukleotidové sondy použité pro Southernovu hybridizaci byla následuj ící:

5-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9) kde N představuje libovolnou bázi.

Kromě toho, zde popsaná DNA-sonda pro gen Bc AB78 VIP1 umožňuje screening libovolného kmene Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen gen VIP1 (nebo příbuzný gen) , nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje gen VIP1.

Pro lepší pochopení vynálezu obecně popsaného výše slouží následující podrobné příklady, které jsou uvedeny pouze pro ilustraci a vynález se jimi v žádném směru neomezuje, pokud není uvedeno jinak.

Byla vytvořena standardní nomenklatura založená na sekvenční identitě proteinů spadajících do rozsahu vynálezu. Níže jsou uvedena označení genů a proteinů používaná v následujících příkladech a jejich vztah k označením používaným v související základní přihlášce US 314594/08.

označení genu nebo proteinu podle standardní nomenklatury	označení genu nebo proteinu v základní přihlášce US 314594/08	popis proteinu
VIPlA(a)	VI PÍ	VIPÍ z kmene AB78 uvede v sekvenci SEQ ID č. 5
VIP2A(a)	VIP2	VIP2 z kmene AB78 uvede v sekvenci SEQ ID č. 2
VIPlA(b)	homolog VIP1	VIP1 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis uvedený v sekvenci SEQ ID č. 21
VIP2A(b)	homolog VIP2	VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis uvedený v sekvenci SEQ ID č. 20
VIP3A(a)		VIP z kmene AB88 uvedený sekvenci SEQ ID č. 28 té přihlášky
VIP3A(b)		VIP z kmene AB424 uvede v sekvenci SEQ ID č. 3 této přihlášky

Příklady provedeni vynalezu

Příklady formulací

Účinnými látkami používanými v následujících příkladech formulací jsou kmen Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058, kmeny Bacillus thuringiensis s přírůstkovými čísly NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 a NRRL B-21439, a kmeny Bacillus spp s přírůstkovými čísly NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230. Všechny uvedené kmeny jsou kmeny izolovanými z přírody, které obsahují pro hmyz specifické proteiny podle vynálezu.

Alternativně se používají jako účinné látky izolované pro hmyz specifické proteiny samotné nebo v kombinaci s výše uvedenými kmeny rodu Bacillus.

Al. Smáčitelné prášky spory Bacillus thuringiensis lignosulfonát sodný laurylsulfát sodný diisobutylnaftalensulfonát sodný oktylfenolpolyethylenglykolether (7-8 mol ethylenoxidu) vysokodisperzní kyselina křemičitá kaolin

Spory se důkladné promíchají rozemele ve vhodném mlýnu, čímž se které lze ředit vodou na suspenz koncentrací.

a) b) c) % 50 % 75 % % 5 % % - 5 % % 10 % %

% 10 % 10 % % 27 % s aditivy a směs se dobře získají smáčitelné prášky, e libovolných požadovaných

- 67 spory Bacillus thuringiensis 10 % oktylfenolpolyethyienglykolether (4-5 mol ethylenoxidu) 3 % dodecylbenzensulfonát vápenatý 3 % polyglykolether ricinového oleje (35 mol ethylenoxidu) 4 % cyklohexanon 30 % směs xylenů 50 %

A2 .

Emulgovatelný koncentrát

Z tohoto koncentrátu lze naředěním vodou libovolné požadované koncentrace.

získat emulze

A3 . Popraše spory Bacillus thuringiensis mastek kaolin

a) b) % 8 % %

%

Popraše vhodné k okamžitému použití se získají smícháním účinné látky s nosiči a rozemletím směsi ve vhodném mlýnu.

A4 . Vytlačované granule spory Bacillus thuringiensis 10 % lignosulfonát sodný 2 % karboxymethylcelulosa 1 % kaolin 87 %

Účinná látka nebo kombinace se smíchá a rozemele s aditivy, a směs se poté navlhčí vodou. Tato směs se vytlačuje, granuluje a poté se vysuší v proudu vzduchu.

A5 . Obalované granule spory Bacillus thuringiensis 3 % polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 200 3 % kaolin 94 %

Účinná látka nebo kombinace se v míchačce rovnoměrně nanese na kaolin navlhčený polyethylenglykolem. Tímto způsobem se získá neprášící obalovaný granulát.

A6 . Suspenzní koncentrát spory Bacillus thuringiensis 40 % ethylenglykol 10 % nonylfenolpolyethylenglykolether (15 mol ethylenoxidu) 6 % lignosulfonát sodný 10 % karboxymethylcelulosa 1 %

37% vodný roztok formaldehydu 0,2 % silikonový olej ve formě 75% vodného roztoku 0,8 % voda 32 %

Účinná látka nebo kombinace se důkladně promíchá s aditivy, čímž se získá suspenzní koncentrát, ze kterého lze naředěním vodou připravit suspenze libovolné požadované koncentrace.

Příklad 1

Izolace a charakterizace AB78

Kmen Bacillus cereus AB78 byl izolován jako mikroorganismus kontaminující destičky v laboratoři na mediu T3 (na litr: 3 g tryptonu, 2 g tryptosy, 1,5 g kvasničného extraktu, 0,05 M fosforečnanu sodného (pH 6,8) a 0,005 g chloridu man69 ganatého; Travers, R. S., 1983) . Během logaritmické fáze růstu vykazuje AB78 podstatnou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Byla rovněž zjištěna antibiotická aktivita proti Gram-pozitivnímu Bacillus spp. (tabulka 12).

Tabulka 12

Antibiotická aktivita supernatantu kultury AB78

	zóna	inhibice (v cm)
Testovaná bakterie	AB78	Streptomycin
Escherichia coli	0,0	3,0
Bacillus megaterium	1,1	2,2
Bacillus mycoides	1,3	2,1
Bacillus cereus CB	1,0	2,0
Bacillus cereus 11950	1,3	2,1
Bacillus cereus 14579	1,0	2,4
Bacillus cereus AB78	0,0	2,2
Bacillus thuringiensis var. israelensis	1,1	2,2
Bacillus thuringiensis var. tenebrionis	0,9	2,3

Morfologické charakteristiky AB78 jsou následující:

Vegetativní vlákna jsou rovná, dlouhá 3,1 - 5,0 mm a široká 0,5 - 2,0 mm. Buňky mají zakulaceně konce, jsou jednotlivé v krátkých řetězcích. Na buňku se vytváří jediná subterminální válcovitě-oválná endospora. Nevytváří se parasporální krystal. Kolonie jsou neprůhledné, nepravidelně zoubkované, lalokovíté a ploché. Nevytváří pigmenty. Buňky jsou pohyblivé. Jsou přítomné bičíky.

Růstové charakteristiky AB78 jsou následující:

Mikroorganismus je fakultativně anaerobní s optimální teplotou pro růst 21 - 30 °C. Roste při teplotě 15, 20, 25, a 37 °C. Neroste při teplotě přes 40 °C. Rostě v 5 - 7% chloridu sodném.

Tabulka 13 obsahuje biochemické údaje o AB78.

Tabulka 13

Biochemické charakteristiky kmene Bacillus cereus AB78

kyselina z L-arabinosy	-	zpětná oxidace methylenové
plyn z L-arabinosy	-	modři	+
kyselina z D-xylosy	-	redukce nitrátu	+
plyn z D-xyloxy	-	redukce N03 na NO2	+
kyselina z D-glukosy	+	VP	+
plyn z D-glukosy	-	rozklad H202	+
kyselina z laktosy	-	indol	-
plyn z laktosy	-	rozklad tyrosinu	+
kyselina ze sacharosy	-	dihydroxyaceton	-
plyn ze sacharosy	-	lakmusové mléko kyselé	-
kyselina z D-manitolu	-	lakmusové mléko koagulované	-
plyn z D-manitolu	-	lakmusové mléko alkalické	-
využití propionátu	+	lakmusové mléko peptonizované	-
využití citrátu	+	lakmusové mléko redukované	-
hydrolýza hippurátu	s	hydrolýza kaseinu	+
redukce methylenové modři	+	hydrolýza škrobu	+
produkce lecithinasy	s	zkapalnění želatiny	+

Legenda k tabulce 13:

s = slabá reakce

Příklad 2

Kultivace bakterií

Subkultura kmene Bacillus cereus AB78 byla použita k inokulaci následujícího media, známého jako TB-vývar ('TB broth):

trypton 12 g / 1 kvasničný extrakt 24 g / 1 glyceroí 4 ml / 1

KH₂PO₄ 2,1 g / 1

K₂HPO₄ 14,7 g / 1 pH 7,4

K autoklávovanému vývaru se po ochlazení přidá fosforečnan draselný. Baňky se inkubuji při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin až 36 hodin, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu.

Výše uvedený postup lze za použití procedur známých v oboru snadno upravit do rozsahu potřebného pro velké fermentory.

V průběhu vegetativního růstu, obvykle 24 - 36 hodin po započetí kultivace, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu, byly bakterie AB78 centrifugovány ze supernatantu kultury. Supernatant kultury obsahující aktivní protein byl použit v biologických testech.

- 72 Příklad 3

Biologické testy na hmyzu

Kmen Bacillus cereus AB78 byl testován proti různým druhům hmyzu jak je popsáno níže.

Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi respektive Diabrotica undecempunctata howardi: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supernatant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Marrone a kol. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290 - 293) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do misek. Čerstvě vylihlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6 dnů.

Biologické testy s klony Escherichia coli: buňky Escherichia coli se nechají růst přes noc ve vývaru obsahujícím 100 /xg/ml ampicillinu při teplotě 37 °C. 10 ml kultury se sonikuje třikrát po dobu vždy 2 0 sekund. 500 μΐ sonikované kultury se přidá k roztavené potravě pro Diabrotica virgifera virgifera.

Leptinotarsa decemlineata: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 - 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. Kousky listů bramboru o ploše 5 cm² se ponoří do těchto roztoků, usuší se proudem vzduchu a umístí se na navlhčený filtrační papír v umělohmotových miskách. Čerstvě vylihlé larvy se umístí na kousky listů a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-5 dnů.

Tenebrio molitor: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supernatant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Bioserv

č. F9240) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do umělohmotových misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6-8 dnů.

Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Maduca sexta respektive Spodoptera exigua: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 - 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. 100 μΐ se pipetuje na povrch 18 cm² ztuhlé umělé potravy (Bioserv č. F9240) a nechá se uschnout na vzduchu. Čerstvě vylíhlé larvy se poté umístí na povrch potravy a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-6 dnů.

Culex pipiens: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci. 100 μΐ se pipetuje do 10 ml vody v umělohmotové nádobě o objemu 30 ml. Do vody se přidají larvy ve stádiu třetího instaru a teplota se udržuje na teplotě místnosti. Mortalita se stanoví po uplynutí 24 - 48 dnů.

Spektrum insekticidní aktivity AB78 je uvedeno v tabulce 14

Tabulka 14

Účinnost supernatantu kultury AB78 proti různým hmyzím škůdcům

testovaný druh hmyzu	řád	účinnost
Diabrotica virgifera virgifera	Coleoptera	+ + +
Diabrotica longicornis barberi	Coleoptera	+++
Diabrotica undecimpunctata howardi	Coleoptera	-
Leptinotarsa decemlineata	Coleoptera	-
Tenebrio molitor	Coleoptera	-
Ostrinia nubilalis	Lepidoptera	-
Heliothis virescens	Lepidoptera	-
Manduca sexta	Lepidoptera	-
Spodoptera exigua	Lepidoptera	-
Agrotis ipsilon	Lepidoptera	-
Culex pipiens	Diptera	-

Nově nalezený kmen Bacillus cereus AB78 vykazuje podstatně odlišné spektrum insekticidní účinnosti ve srovnání se známými δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis účinnými proti broukům. AB78 zejména vykazuje selektivnější účinnost proti broukům než známé kmeny Bacillus thuringiensis účinné proti broukům, jelikož je specificky účinný proti Diabrotica spp. Přesněji, je nejúčinnější proti Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotica longicornis barberi, ale nikoli proti Diabrotica undecimpunctata howardi.

U řady kmenů Bacillus byla biologicky testována jejich účinnost v průběhu vegetativního růstu proti Diabrotica virgifera virgifera - viz tabulka 15. Výsledky svědčí o tom,

- 75 že AB78 je jedinečný svou účinností proti Diabrotica virgifera virgifera, která není obecným jevem.

Tabulka 15

Účinnost supernatantů kultur různých kmenů Bacillus spp. proti Diabrotica virgifera virgifera kmen Bacillus procento mortality Diabrotica virgifera virgifera

Bacillus cereus AB78 (Bat.l)	100
Bacillus cereus AB78 (Bat.2)	100
Bacillus cereus (Carolina Bio.)	12
Bacillus cereus ATCC 11950	12
Bacillus cereus ATCC 14579	8
Bacillus mycoides (Carolina Bio.)	30
Bacillus popilliae	28
Bacillus thuringiensis HD135	41
Bacillus thuringiensis HD191	9
Bacillus thuringiensis GC91	4
Bacillus thuringiensis isrealensis	24
voda (kontrola)	4

Specifická účinnost AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera je uvedena v tabulce 16.

Tabulka 16

Účinnost supernatantu kultury AB78 proti čerstvě narozeným larvám Diabrotica virgifera virgifera

koncentrace supernatantu kultury (μΐ / ml)	procento mortality Diabrotica virgifera virgifera
100	100
25	87
10	80
5	40
2,5	20
1	6
0	0

Bylo vypočítáno, že hodnota LC₅₀ činí 6,2 μΐ supernatantu kultury na ml potravy Diabrotica virgifera virgifera.

Byly prováděny rovněž biologické testy buněčné pelety a nebyla zjištěna žádná účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Přítomnost účinnosti pouze v supernatantu tedy svědčí o tom, že tento vegetativní insekticidní protein je exotoxinem.

Příklad 4

Izolace a purifikace proteinů aktivních proti druhům rodu Diabrotica z AB78

Nasyceni kultivačního media prostého buněk a zbytků buněk se upraví na 70 % přidáním 472 g / 1 pevného síranu amonného. Rozpuštěni se provede při teplotě místnosti, následuje ochlazení v ledové lázni a centrifugace při 10000 g po dobu 30 minut, čímž se získá peleta vysrážených proteinů. Supernatant se odstraní a peleta se rozpustí v jedné desetině původního objemu 20mM TRIS-HCl při pH 7,5. Rozpuštěná peleta se odsolí buďto dialýzou v 20mM TRIS-HC1 při pH 7,5 nebo tak, že se nechá projít odsolovací kolonou.

Odsolený materiál se titruje na pH 3,5 za použití 20mM natirum-citrátu o pH 2,5. Po třicetiminutové inkubaci při teplotě místnosti se roztok centrifuguje při 3000 g po dobu 10 minut. Supernatant v této době obsahuje největší množství účinného proteinu.

Po neutralizaci pH na hodnotu 7,0 se supernatant nanese na anexovou kolonu Mono-Q ekvilibrovanou s 20mM TRIS o pH 7,5, s rychlostí průtoku 300 ml / min. Kolona se promývá postupným a lineárním gradientem za použití 400mM chloridu sodného v 2 0mM TRIS o pH 7,5.

Pro stanovení účinných frakcí se použijí biologické testy jednotlivých frakcí z kolony a elektroforéza v SDS-polyakrylamidovém gelu. Analýzou pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se zjistí, že biologicky účinný protein má složky o molekulové hmotnosti v rozmezí přibližně 80 kDa a 50 kDa.

Příklad 5

Analýza sekvence proteinu účinného proti druhům rodu Diabrotica

Protein o molekulové hmotnosti 80 kDa izolovaný pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se přenese na póly(vinylidenfluoridovou) membránu a podrobí se N-koncovému sekvenování prováděnému pomocí opakovaných Edmanových cyklů na sekvenátoru ABI 470 pulsed-liquid sequencer. Přenos se provádí v lOmM CAPS-pufru s 10 % methanolu o pH 11,0 následujícím způsobem:

Po dobu 5 minut se provádí inkubace gelu po elektroforéze v přenosovém pufru. Póly(vinylidenfluoridová) membrána ProBlott se krátce namočí 100% methanolem a poté se ekvilibruje v přenosovém pufru. Materiál se vrstevnatě uspořádá mezi pěnovými houbami a čtverečky filtračního papíru s uspořádáním katoda-gel-membrána-anoda.

Po dobu 1 hodiny se provádí přenos s konstantním napětím 70 V.

Po přenosu se membrána promyje vodou a barví se po dobu 2 minut 0,25% modří Coomassie Blue R-250 v 50% methanolu.

Odbarvení se provede několikerým promytím směsí obsahující 50 % methanolu, 40 % vody a 10 % kyseliny octové.

Po odbarvení se membrána usuší proudem vzduchu a poté se vyříznou pásy pro sekvenační analýzu. Pro dosažení maximální účinnosti a výtěžku se použije BlottCartridge a příslušné cykly. Provede se analýza údajů za použití softwaru model 610 Sequence Analysis pro identifikaci a kvantifikaci aminokyselin derivovaných fenylthiohydantoinem, v každém sekvenačním cyklu.

Bylo zjištěno, že N-koncová sekvence je následující:

NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID č. 8), kde Asx znamená Asp nebo Asn. Úplná aminokyselinová sekvence složky o molekulové hmotnosti 80 kDa je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 7. DNA-sekvence, která kóduje sekvenci SEQ ID č. 7 je uvedena v SEQ ID č. 6.

Příklad 6

Konstrukce DNA-sondy

Připraví se oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyseliny 3 - 9 N-koncové sekvence (příklad 5).

Sonda se syntetizuje na základě znalosti použití kodónů genu δ-endotoxinu z Bacillus thuringiensis (Bt) . Jako sonda v

Southernových hybridizacích se použije nukleotidová sekvence

5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9)

Oligonukleotid se syntetizuje za použití standardních postupů a zařízení.

Příklad 7

Stanovení izoelektríckého bodu proteinu účinného proti druhům rodu Diabrotica

Purifikovaný protein ze stupně 5 purifikačního postupu se analyzuje na 3 - 9 pí izoelektrickém fokusačním gelu za použití elektroforézního systému Phastgel (Pharmacia). Standardní postupy ovládání jednotky se použijí jak při

separaci přibližně	tak při vyvíjení obarvení stříbrem. 4,9.	Hodnota pí činí
Příklad 8
Údaje o (PCR)	analýze AB78 pomocí polymerasové	řetězové reakce
Pro	ověření, že kmen Bacillus cereus	AB78 neobsahuje

žádné geny insekticidních krystalických proteinů Bacillus thuringiensis nebo Bacillus sphaericus byla použita analýza pomocí polymerasové řetězové reakce (viz například patentová přihláška Spojených Států Amerických č. 08/008 006, a Carozzí a kol. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 (11) : 3057 až 3061). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17

Primery genů insekticidních krystalických proteinů Bacillus testované pomocí polymerasové řetězové reakce proti

DNA z AB78

testované primery	produkován produkt
2 sady specifické pro CrylIIA	negativní
CrylIIB	negativní
2 sady specifické pro CrylA	negativní
CrylA(a)	negativní
specifický pro CrylA(b)	negativní
CrylB	negativní
specifický pro CrylC	negativní
specifický pro CrylE	negativní
2 sady specifické pro Bacillus sphaericus	negativní
2 sady specifické pro CrylV	negativní
kontrola Bacillus (PI-PLC)	pozitivní

Příklad 9

Klonování celkové DNA z kmene Bacillus cereus AB78 pomocí kosmidů

Gen VIPlA(a) byl klonován z celkové DNA připravené z kmene AB78 následujícím způsobem:

Izolace DNA z A.B78 se provede následovně:

1. Bakterie se nechají růst přes noc v 10 ml media L-broth (za použití sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml).

2. Přidá se 25 ml čerstvého media L-broth a 30 gg / ml ampicillinu.

3. Buňky se nechají růst po dobu 2-6 hodin na třepačce při teplotě 30 °C.

4. Buňky se odstředí v polypropylenové kyvetě s oranžovým uzávěrem o objemu 50 ml ve stolní klinické centrifuze IEC při 3/4 rychlosti.

5. Peleta buněk se resuspenduje v 10 ml TES (TES = 50mM TRIS o pH 8,0, lOOmM kyselina ethylendiamintetraoctová, 15mM chlorid sodný).

6. Přidá se 30 mg lysozymu a provede se inkubace po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.

7. Přidá se 200 μΐ 20% SDS (dodecylsulf átu sodného) a 400 μΐ zásobního roztoku Proteinasy K (20 mg / ml) a provádí se inkubace při teplotě 37 °C.

8. Přidá se 200 μΐ čerstvé Proteinasy K a provádí se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 55 °C. Přidá se 5 ml TES pro dosažení konečného objemu 15 ml.

9. Provede se dvakrát fenolová extrakce (10 ml fenolu, centrifugace se provádí při teplotě místnosti při 3/4 rychlosti ve stolní klinické centrifuze IEC). Supernatant (vrchní část) se přenese do čisté zkumavky pomocí pipety s velkým průměrem.

10. Provede se jednou extrakce směsí, kterou tvoří v objemovém poměru 1 : 1 fenol a chloroform s isoamyl82 alkoholem (v poměru 24 : 1).

11. DNA se vysráží stejným objemem studeného isopropanolu.

Provede se centrifugace, kterou se vytvoří peleta DNA.

12. Peleta se resuspenduje v 5 ml TE.

13. DNA se vysráží 0,5 ml 3M octanu sodného o pH 5,2 a ml 95% ethanolu. Směs se umístí na 2 hodiny do -20 °C.

. DNA se vyjme ze zkumavky umělohmotovým očkem, přenese se do kyvety pro mikrocentrifugaci, odstředí se, odpipetuje se nadbytek ethanolu, a vysuší se ve vakuu.

15. DNA se resuspenduje v 0,5 ml TE. Provede se inkubace po dobu 90 minut při teplotě 65 °C, pro usnadnění převedení DNA zpět do roztoku.

16. Za použití standardních postupů se stanoví koncentrace.

Klonování AB78 pomocí kosmidů:

Všechny postupy, pokud není uvedeno jinak, se provádějí podle instrukčního manuálu firmy Stratagene (Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, kat. č. 251301).

Obecně se provedou následující kroky:

A. DNA AB78 se částečně rozštěpí Sau 3A.

B. Připraví se vektorová DNA.

C. Provede se ligace a packaging (sbalení) DNA.

D. Vytvoří se kosmidová knihovna:

1. Vytvoří se kultura buněk HB101 tak, že se umístí ml kultury pěstované přes noc do 5 ml TB s

0,2 % maltosy. Kultura se inkubuje po dobu 3,5 hodiny při teplotě 37 °C.

2. Buňky se odstředí a resuspenduj í v 0,5 ml lOmM síranu hořečnatého.

. Smíchá se :

100 ml buněk,

100 ml naředšné směsi se sbalenou DNA,

100 ml lOmM síranu hořečnatého, ml TB.

4. Provede se adsorbce při teplotě místnosti po dobu 30 minut, přičemž se směs nemíchá.

5. Přidá se 1 ml TB a směs se mírně míchá. Provádí se inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C.

6. 200 ml se nanese na destičky L-amp. Provádí se inkubace při teplotě 37 °C přes noc.

Alespoň 400 kosmidových klonů bylo náhodně vybráno a byla u nich zkoumána účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera jak je popsáno v příkladu 3. DNA z 5 účinných klonů a 5 neúčinných klonů byla použita pro Southernovy hybridizace. Výsledky svědčí o tom, že hybridizace za použití výše popsané oligonukleotidové sondy je v korelaci s účinností proti Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 18) .

Kosmidové klony P3-12 a P5-4 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21061 respektive NRRL B-21059.

Tabulka 18

Účinnost kosmidových klonů AB7 8 proti Diabrotica virgifera virgifera

klon průměrné procento mortality (N=4)
klony které hybridizují se sondou
Pl-73	47
Pl-83	64
P2-2	69
P3-12	85
P5-4	97
klony které nehybridizují se sondou
Pl-2	5
P3-8	4
P3-9	12
P3-18	0
P4-6	9

Příklad 10

Identifikace oblasti o velikosti 6 kb účinné proti Diabrotica virgifera virgifera

DNA z P3-12 byla částečně rozštěpena pomocí restrikčního enzymu Sau 3A a ligována do vektoru pUC19 pro Escherichia coli, jímž byla transformována Escherichia coli. DNA-sonda specifická pro protein VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 80 kDa byla syntetizována amplifikaci části DNA P3-12 pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR). Za použití částečné aminokyselinové sekvence proteinu o molekulové hmotnosti 80 kDa byly syntetizovány oligonukleotidy MK113 a MK117, které hybridizují s částmi VIPlA(a). Kolonovou hybridizací se sondou vytvořenou pomocí polymerasové řetězové reakce byly identifikovány plazmidové subklony a testována jejich účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Jeden z těchto klonů, PL2, hybridizuje s fragmentem vytvořeným pomocí polymerasové řetězové reakce, a je v dříve popsaném testu účinný proti Diabrotica virgifera virgifera.

Restrikční fragment Cla I o velikosti 6 kb z pL2 byl klonován do místa Srna I kyvadlového vektoru (shuttle vector) pHT 3101 pro Escherichia coli - Bacillus (Lereclus, D. a kol., FEMS Microbiology Letters 60: 211 - 218 (1989)), čímž byl získán pCIB6201. Tento konstrukt propůjčuje účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera jak kmenům Bacillus tak Escherichia coli, v libovolné orientaci. pCIB6022 obsahuje stejný fragment Cla I o veliksoti 6 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene), produkuje ekvivalentní protein VIPlA(a) (stanoveno pomocí western blottingu) a je rovněž účinný proti Diabrotica virgifera virgifera.

Nukleotidová sekvence pCIB6022 byla určena pomocí postupu využívájícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467 (1977), za použití sekvenačních souprav PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru ABI 373. Sekvence je uvedena jako SEQ ID č. 1. Fragment o velikosti 6 kb kóduje jak VIPlA(a) tak VIP2A(a) , jak je zřejmé z otevřených čtecích rámců popsaných v sekvenci SEQ ID č. 1. Sekvence kódující VIP2A(a) je dále uvedena v SEQ ID č. 4. Vzájemný vztah VIPlA(a) a VIP2A(a) v rámci fragmentu o velikosti 6 kb nacházejícího se v pCIB6022 je uveden v tabulce 19. pCIB6022 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21222.

Příklad 11

Funkční štěpení oblasti DNA VIPlA(a)

Pro ověření, že je otevřený čtecí rámec (ORF) VIPlA(a) nutný pro insekticidní účinnost, byla v genu vytvořena mutace měnící translační rámec. Restrikční enzym Bgl II poznává jedinečné místo umístěné 857 bp v kódující oblasti VIPlA(a). pCIB6201 byl rozštěpen Bgl II a jednovlákné konce doplněny DNA-polymerasou (Klenow fragmentem) a dNTP. Plazmid byl zpětně ligován a transformován do Escherichia coli. Výsledný plazmid, pCIB6203, obsahuje čtyři nukleotidové inzerce v kódující oblasti VIPlA(a). pCIB6203 nedodává insekticidní účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, což potvrzuje, že VIPlA(a) je nezbytnou složkou účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera.

Pro další definování oblasti nutné pro kódování VIPlA(a) byly zkonstruovány subklony VIPlA(a) a VIP2A(a) (pomocný protein) a byla testována jejich schopnost doplnit mutaci v pCIB6203. pCIB6023 obsahuje fragment Xba I - EcoRV o velikosti 3,7 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene). Analýza pomocí western blottingu svědčí o tom, že pCIB6023 produkuje protein VIPlA(a) o stejné velikosti a ve stejném množství jako klony PL2 a pCIB6022. pCIB6023 obsahuje celý gen kódující protein o molekulové hmotnosti 80 kDa. pCIB6023 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria,

Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21223N. pCIB6206 obsahuje fragment Xba I - Cla I o velikosti 4,3 kb z pCIB6022 ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene). pCIB6206 byl rovněž uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21321.

pCIB6023, pCIB6206 a pCIB6203 nevykazují při odděleném testování detekovatelnou účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Avšak směs buněk obsahujících pCIB6203 (mutovaný VIPlA(a) plus VIP2A(a)) a buněk obsahujících pCIB6023 (pouze VIPlA(a)) vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Podobně vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera směs buněk obsahujících pCIB6206 a buněk obsahujících pCIB6203.

Pro další definování možností VIP2A(a) byl zkonstruován pCIB6024, který obsahuje celou oblast kódující VIP2A(a), ale postrádá většinu oblasti kódující VIPlA(a). pCIB6024 byl zkonstruován gelovou purifikací restrikčního fragmentu Cla I - Sca I o velikosti 2,2 kb z pCIB6022, doplněním jednovlákných konců DNA-polymerasou (Klenow fragmentem) a dNTP a ligací tohoto fragmentu do vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene) rozštěpeného enzymem Eco RV. Buňky obsahující pCIB6024 nevykazují žádnou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Směs buněk obsahujících pCIB6024 a buněk obsahujících pCIB6023 však vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 19).

pCIB6023 a pCIB6206 tedy musí produkovat funkční produkt genu VIPlA(a), zatímco pCIB6203 a pCIB6204 musí produkovat funkční produkt genu VIP2A(a). Tyto výsledky svědčí o tom, že je pro dodání maximální účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera nutný genový produkt (nebo produkty) z oblasti VIP2A(a), v kombinaci s VIPlA(a) (viz tabulka 19).

Tabulka 19

Charakterizace pCIB6022 účinnost proti Dw

X S Rl 8 RV C

VlP2A(a.V........ _J1 j....._H||^ I YLglA(u)-..........-J_[

pCIB6022 pCIB6203 pCIB6023 pCIB6206 pCIB6024 +++

Funkční komplementace vegetativních insekticidních proteinů (VIP) účinnost proti Dw pCIB6203 _J pCIB6023 +++

J pCIB6203 J pCIB6206 +++ pCIB6023 pCIB6024 +++

Legenda k tabulce 19 :

Dvv = Diabrotica virgifera virgifera

Oblasti v rámečcích představují rozsah VIPlA(a) a VIP2A(a). Bílý rámeček označuje oblast VIP1 kódující peptid o molekulové hmotnosti 80 kDa pozorovaný u Bacillus. Tmavý rámeček představuje N-koncový propeptid VIPlA(a) předpovezený analýzou DNA-sekvence. Vytečkovaný rámeček představuje oblast kódující VIP2A(a). Velké X znázorňuje umístění mutace měnící čtecí rámec (posunové mutace) zavedené do VIPlA(a). Šipky představují konstrukty transkribované beta-galaktosidásovým promotorem. Restrikční místa: C - Cla I; X - Xba I; S - Sca I; RI - Eco RI; B - Bgl II; RV - Eco RV.

Příklad 12

Tvorba protilátek proti AB78

Ve 2 Lewisových krysách byla vyvolána tvorba protilátek jednak za účelem umožnit budoucí tvorbu hybridomových buněčných linií, jednak rovněž vytvořit dostatečné množství séra pro omezený screening genomové DNA-knihovny. Dalším faktorem bylo velmi omezené dostupné množství antigenu a skutečnost, že jej bylo možné produkovat v čisté formě pouze pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a následného elektrotransferu na nitrocelulosu.

Vzhledem k omezené dostupnosti antigenu na nitrocelulose byla nitrocelulosa emulgována v dimethylsulfoxidu a injikována do zadních tlapek zvířat pro vyvolání produkce B-buněk v podkolenních mízních uzlinách bezprostředně proti proudu krve. Pomocí western-anylýzy při prvním produkčním odběru krve bylo zjištěno, že je produkováno silně reagující sérum. Pomocí několika následných injekcí a odběrů krve bylo vytvořeno dostatečné množství séra pro provedení všech požadovaných screeningů.

Poté byla u jedné z krys vyvolána tvorba hybridomu. Podkolenní mízní uzlina byla vyříznuta, macerována, a výsledné buňky fúzovány s myším myelomem P3x63Ag8.653. Následující vyhledávací test buněk byl proveden jak je popsáno níže. Čtyři původní jamky, které vykazovaly nejvyšší reakci na emulgovaný antigen, byly vybrány pro přenesení ke klonování v omezeném zředění. Dalších 10 jamek bylo vybráno pro expanzi a kryoprezervaci.

Postup emulgace AB78 na nitrocelulose v dimethylsulfoxidu pro screening pomocí ELISA-testu:

Po elektrotransferu vzorků AB78 rozdělených elektroforézou v polyakrylamidovém gelu na nitrocelulosu se použije pro vizualizaci veškerého přeneseného proteinu reverzibilní Ponceau S. Pás odpovídající toxinu AB78, dříve identifikovanému a sekvenovanému od N-konce, se identifikuje a vyřízne z nitrocelulosy. Každý pás má rozměry přibližně 1 mm x 5 mm za účelem minimalizace množství emulgované nitrocelulosy. Jediný pás se umístí do mikrocentrifugační kyvety s 250 μΐ dimethylsulfoxidu a maceruje se za použití umělohmotového tloučku (Kontes, Vineland, New Jersey, USA) . Pro usnadnění emulgace se směs s dimethylsulfoxidem zahřívá po dobu 2 až 3 minut na teplotu 37 °C až 45 °C. Po zahřátí může být nutná určitá další macerace, všechnu nitrocelulosu je však třeba emulgovat. Jakmile je vzorek AB78 emulgován, umístí se na led. Při přípravě k nanesení na mikrotitrační desky s emulgovaným antigenem se vzorek musí naředit v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku v následujících poměrech: 1 : 5, 1 : 10, 1 : 15, 1 : 20, 1 : 30, 1 : 50, 1 : 100, a 0. Antigen pro nanesení na desky musí být připraven čerstvý bezprostředně před použitím.

Protokol ELISA-testu:

1. Nanese se AB78 v dimethylsulfoxidu naředěný v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku. Provede se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.

2. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

3. Provádí se blokování (1 % BSA a 0,05 % povrchově aktivního činidla Tween 20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem) po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

4. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

5. Přidá se krysí sérum a provede se inkubace po dobu 1,5 hodiny při teplotě 37 °C.

6. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

7. Přidá se kozí protikrysí v koncentraci 2 gg / ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.

8. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

9. Přidá se králičí protikozí alkalická fosfatasa v koncentraci 2 μg / ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.

10. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

11. Přidá se substrát a provede se inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

12. Test se zastaví po 30 minutách 3N hydroxidem sodným.

Příprava antiséra proti VIP2A(a)

Částečně purifikovaný supernatant kultury AB78 se rozdělí nekontinuální elektroforesou v SDS-polyakrylamidovém gelu (Novex) podle pokynů výrobce. Rozdělené proteiny se elektroforeticky přenesou na nitrocelulosu (S&S č. 21640), jak popsali Towbin a kol. (1979) . Nitrocelulosa se obarví pomocí Ponceau S a identifikuje se pás VIP2A(a). Pás VIP2A(a) se vyřízne a emulguje v dimethylsulfoxidu bezprostředně před injekcí. Králík se nejprve imunizuje emulgovaným VIP2A(a) smíchaným v poměru přibližně 1 : 1 s Freundovými kompletním adjuvantem intramuskulámí injekcí na čtyřech různých místech. Následné imunizace se provádějí v čtyřtýdenních intervalech a jsou identické jako první imunizace, s tím rozdílem, že se použije Freundovo nekompletní adjuvans. První sérum získané pro imunizaci reagovalo s proteinem VIP2A(a). Analýzou supernatantu kultury AB78 pomocí western blottingu za použití tohoto antiséra se identifikuje převážně protein VIP2A(a) o plné délce.

Příklad 13

Aktivace insekticidní účinnosti neúčinných kmenů Bacillus thuringiensis pomocí klonů VIP AB78

Přidání pCIB6203 spolu se supernatantem kultury rostoucí po dobu 24 hodin (počáteční až střední logaritmická fáze) z kmene Bacillus thuringiensis GC91 způsobuje 100% mortalitu u Diabrotica virgifera virgifera. Tkni pCIB6203 ani GC91 není samotný účinný proti Diabrotica virgifera virgifera. Údaje jsou uvedeny níže:

testovaný materiál	procento mortality Diabrotica
pCIB6203	0
GC91	16
pCIB6203 + GC91	100
kontrola	0

Příklad 14

Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus cereus AB81

Druhý kmen Bacillus cereus, označený AB81, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomoci standardních postupů. Subkultura AB81 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:

testované druhy hmyzu	procento mortality
Ostrinia nubilalis	0
Agrotis ipsilon	0
Diabrotica virgifera virgifera	55

Přiklad 15

Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus thuringiensis AB6

Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB6, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB6 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu.

Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v přikladu 3. Výsledky jsou následující:

testované druhy hmyzu	procento mortality
Ostrinia nubilalis	0
Agrotis ipsilon	100
Agrotis ipsilon (autoklávovaný	0
vzorek)
Diabrotica virgifera virgifera	0

Sníženi insekticidní účinnosti supernatantu kultury na nepodstatné hodnoty pomocí autoklávování svědčí o tom, že účinnou látkou není β-exotoxin.

Kmen AB6 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21060.

Příklad 16

Izolace a biologická charakterizace kmene Bacillus thuringiensis AB88

Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB88, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomocí standardních postupů. Subkultura AB88 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu. Biologická účinnost proti řadě druhů hmyzu byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:

testované druhy hmyzu	řád	procento mortality v případě supernatantu kultury
neautoklávova- ného	autoklávová- ného
Agrotis ipsilon	Lepidoptera	100	5
Ostrinia nubilalis	Lepidoptera	100	0
Spodoptera frugiperda	Lepidoptera	100	4
Helicoverpa zea	Lepidoptera	100	12
Heliothís virescens	Lepidoptera	100	12
Leptinotarsa decemlineata	Coleoptera	0	0
Diabrotica virgifera virgifera	Coleoptera	0	5

Snížení insekticidní účinnosti supernatantu kultury na nepodstatné hodnoty pomocí autoklávování svědčí o tom, že účinnou látkou není β-exotoxin.

Krystaly δ-endotoxinu byly purifikovány z kmene AB88 za použití standardních postupů. Při biologických testech proti Agrotis ipsilon nebyla u čistých krystalů pozorována žádná účinnost.

Příklad 17

Purifikace vegetativních insekticidních proteinů z kmene AB88

Kapalná kultura bakterií byla nechána růst přes noc při teplotě 30 °C v TB-mediu. Buňky byly odcentrifugovány při

5000 g za 20 minut a byl odebrán supernatant. Proteiny přítomné v supernatantu byly vysráženy síranem amonným (70% nasycení) , centrifugovány při 5000 g po dobu 15 minut a byla odebrána peleta. Tato peleta byla resuspendována v původním dialyzovánan přes noc proti 4 °C. Dialyzát AB88 byl materiál z AB78

Dialyzát objemu 2 0mM Tris o pH 7,5 a stejnému pufru při teplotě zakalenější než srovnatelný byl titrován na pH 4,5 za použití 20mM natrium-citrátu o pH 2,5 a po 30-minutové inkubaci při teplotě místnosti byl roztok centrifugován při 3000 g po dobu 10 minut. Proteinová rozpuštěna ve 20mM Bis-Tris-propanu o peleta pH 9,0 byla znovu

Po vyčeření byly separovány proteiny AB88 pomocí několika různých metod, včetně izoelektrické fokusace (Rotofor, BioRad, Hercules, Kalifornie, UDSA), precipitace při pH 4,5, chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací chromatografie a ultrafiltrace.

Proteiny byly separovány na anexové koloně Poros HQ/N (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA) za použití lineárního gradientu od 0 do 500mM chloridu sodného ve 20mM Bis-Tris-propanu o pH 9,0 s rychlostí průtoku 4 ml za minutu. Insekticidní protein se vymýval při 250mM koncentraci chloridu sodného.

Protein účinný proti Ostrinia nubilalis zůstal v peletě získané pomocí precipitace dialyzátu při pH 4,5. Po provedení preparativní izoelektrické fokusace dialyzátu za použiti amfolytů pH 3-10 byla nalezena insekticidní účinnost proti Ostrinia nubilalis ve všech frakcích s pH 7 nebo vyšším. Pomocí. elektroforézy těchto frakcí v SDS-polyakrylamidovém gelu byly nalezeny pásy proteinů o molekulové hmotnosti přibližně 60 kDa a přibližně 80 kDa. Pásy 60 kDa a 80 kDa byly odděleny pomoci anexové vysoceúčinné kapalinové chromatografie na koloně Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA) . N-koncová sekvence byla získána ze dvou

- 97 frakcí obsahujících proteiny které se mírně lišily molekulovou hmotností, oba však měly velikost přibližně 60 kDa.

Získané sekvence si byly navzájem podobné a rovněž byly podobné některým δ-endotoxinům.

anexová frakce 23 (menší anexová frakce 28 (větší xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID č. 10) xEYENVEPFVSAx (SEQ ID č. 11)

Pokud byla peleta účinná proti získaná precipitací dialyzátu při pH 4,5 anexové kolony Poros-Q, byla účinnost frakcích s hlavním pásem o molekulové 60 kDa.

Ostrinia nubilalis dále dělena pomoci nalezena pouze ve hmotnosti přibližně

Protein účinný proti Agrotis ipsilon rovněž zůstával v peletě při okyselení dialyzátu AB88 na pH 4,5. Při preparativní isoelektrické fokusaci za použití amfolytů pH 3-10 nebyla účinnost zjištěna ve frakcích účinných proti Ostrinia nubilalis, místo toho byla nejvyšší ve frakci o pH 4,5 - 5,0. Její hlavní složky měly molekulovou hmotnost přibližně 35 kDa a přibližně 80 kDa.

Peleta s pH 4,5 byla rozdělena pomoci anexové vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), čímž byly získány frakce obsahující pouze materiál o molekulové hmotnosti 35 kDa a frakce obsahující jak pásy o molekulové hmotnosti 35 kDa tak 80 kDa.

Přiklad 18

Charakterizace vegetativních insekticiních proteinů AB88

Frakce obsahující vegetativní proteiny účinné proti různým druhům motýlů byly vytvořeny jak je popsáno v příkladu

17. Frakce vykazující insekticidní účinnost byly rozděleny v až 16% SDS-polyakrylamidových gelech a přeneseny na póly(vinylidenfluoridové) membrány (LeGendre a kol. (1989) v »

A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for

Microsequencing, ed. Matsudaria PT (Academie Press lne., New

York, USA) . Biologická analýza frakci svědčí o tom, že za účinnost proti různým druhům z řádu motýlů jsou zodpovědné různé vegetativní insekticidní proteiny (VIP).

Účinnost proti Agrotis ipsilon je způsobena proteinem o molekulové hmotnosti 80 kDa nebo/a proteinem o molekulové hmotnosti 35 kDa, podanými buď jednotlivě nebo v kombinaci. Tyto proteiny nejsou příbuzné žádným δ-endotoxinům z Bacillus thuringiensis, což dokazuje neexistence sekvenční homologie se známými sekvencemi δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 je přítomen hlavně (alespoň 75 % z celkového množství) v supernatanech kultur AB8 8 .

Tyto proteiny se rovněž nenacházejí v δ-endotoxinovém krystalu AB88. N-koncové sekvence hlavních δ-endotoxinových proteinů byly srovnány s N-koncovými sekvencemi vegetativních insekticidních proteinů o molekulové hmotnosti 80 kDa a 35 kDa a nevykazují žádnou sekvenční homologii. N-koncová sekvence insekticidního proteinu vip3A(a) obsahuje řadu kladně nabitých zbytků (od Asn2 do Asn7) následovaných hydrofobní základní oblastí (od Thr8 do Ile34). Na rozdíl od většiny známých sekrečních proteinů není insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 v průběhu exportu upravován na N-konci.

Výsledky jsou shrnuty níže:

N-koncové sekvence vegetativních N-koncová sekvence hlavních insekticidních proteinů z Agrotis δ-endotoxinových proteinů

130 kDa

MDNNPNINE (SEQ ID č. 14) kDa 80 kDa

MNKNNTKLPTRALP (SEQ ID č. 12) MDNNPNINE (SEQ ID č. 15)

60kDa

MNVLNSGRTTI (SEQ ID č. 16) kDa

ALSENTGKDGGYIVP (SEQ ID č. 13)

Účinnost proti Ostrinia nubilalis je způsobena vegetativním insekticidním proteinem o molekulové hmotnosti 60 kDa a účinnost proti Spodoptera frugiperda je způsobena vegetativním insekticidním proteinem neznámé velikosti.

Kmen Bacillus thuringiensis AB88 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21225.

Příklad 18A

Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus thuringiensis AB424

Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB424, byl izolován z mechem porostlé borové šišky pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB424 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2.

Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:

- 100

100

	——- ~
	< -σ
0	i— X,
	£· C3>
	M S O
	Zj 73- 2 W κ
	— i— 3^
	o O □
	in
	o

testované druhy hmyzu	procento mortality
Ostrinia nubilalis	100
Agrotis ipsilon	100
Diabrotica virgifera virgifera	0

Kmen AB424 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21439.

Příklad 18B

Klonování genů VIP3A(a) a VIP3A(b), které kódují proteinů účinné proti Agrotis ipsilon

Celková DNA z izolátů AB88 a AB424 byla izolována (Ausubel a kol. (1988), v: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, USA)), rozštěpena restrikčními enzymy Xbal (knihovna Xbal-fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,0 až 5,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB88) respektive EcoRI (knihovna EcoRI- fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,5 až 6,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB424), ligována do vektoru pBluescript předem linearizovaného stejnými enzymy a defosforylovaného, a transformována do kmene Escherichia coli DH5cc. Rekombinantní klony byly blotovány na nitrocelulosové filtry, které byly následně analyzovány za použití sondy, kterou byl ³²P-značený oligonukleotid o délce 33 bází odpovídající 11 N-koncovým aminokyselinám proteinu o molekulové hmotnosti 80 kDa účinného proti Agrotis ipsilon. Hybridizace byla prováděna při teplotě 42 °C v 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného

101 (lx SSC = 0,15M chlorid sodný a 0,015M natrium-citrát, pH 7,4) po dobu 5 minut a dvakrát při teplotě 50 °C v lx SSC s 0,1 % dodecylsulfátu sodného po dobu 10 minut. Čtyři ze 400 rekombinantních klonů byly pozitivní. V biologických testech na hmyzu vykazovaly pozitivní rekombinanty srovnatelnou toxicitu pro larvy Agrotis ipsilon jako supernatanty AB88 nebo AB424.

Plazmid pCIB7104 obsahuje Xbal-fragment z DNA AB88 o velikosti 4,5 kb. Byly zkonstruovány subklony pro stanovení oblasti kódující insekticidní protein.

Escherichia coli pCIB7105 byl zkonstruován klonováním fragmentu Xbal-AccI o velikosti 3,5 kb z pCIB7104 do vektoru pBluescript.

Plazmid pCIB7106 obsahoval EcorI-fragment o velikosti 5,0 kb z DNA AB424. Tento fragment byl dále rozštěpen HincII za vzniku inzertu EcoRI-HincII o velikosti 2,8 kb (pCIB7107), který stále kódoval funkční insekticidní protein.

Nukleotidová sekvence pCIB7104, pozitivního rekombinantního klonu z AB88, a pCIB7107, pozitivního rekombinantního klonu z AB424, byla stanovena pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467 (1977), za použití sekvenaóních souprav PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru ABI 373.

Klon pCIB7104 oblast je uvedena jehož kódující 28. Sekvence

29. Syntetická obsahuje gen VIP3A(a) , v sekvenci SEQ ID č. kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č.

verze kódující oblasti vytvořená tak, aby byla vysoce exprimována v kukuřici, je uvedena v SEQ ID č. 30. Na základě aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID č. 29 lze vytvořit

102 libovolný počet syntetických genů.

Klon pCIB7107 obsahuje gen VIP3A(b), jehož kódující oblast je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 31. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č. 32.

Jak pCIB7104 tak pCIB7107 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21422 respektive B-21423.

Gen VIP3A(a) obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF), který sahá od nukleotidu 732 do nukletidu 3105. Tento otevřený čtecí rámec kóduje peptid o délce 791 aminokyselin, s molekulovou hmotností odpovídající 88500 daltonům. Shine-Dalgarnova sekvence (SD) je umístěna 6 bází před prvním methioninem a její sekvence svědčí o tom, že se jedná o silnou Shine-Dalgarnovu sekvenci pro Bacillus.

Gen VIP3A(b) je z 98 % identický s VIP3A(a).

Při zkoumání blotů celkové DNA izolované z buněk Bacillus thuringiensis AB88 pomocí sondy, kterou je fragment o velikosti 33 bází odpovídající N-koncové oblasti insekticidního proteinu VIP3A, lze ve vzorcích štěpených různými restrikčními enzymy pozorovat jediné pásy. Tento výsledek byl potvrzen za použití větších sond odpovídajících kódující oblasti genu. Rešerší v databázi GenBank nebyla zjištěna žádná homologie se známými proteiny.

Příklad 18C

Exprese insekticidních proteinů VIP3A

Časový průběh exprese insekticidního proteinu VIP3A(a) byl analyzován pomocí western blottingu. Vzorky kultur Bacillus thuringiensis AB88 byly odebírány během celé růstové křivky a sporulace. Insekticidní protein VIP3A(a) lze

103 detekovat v supernatantech kultur AB88 během logaritmické fáze, již 15 hodin po založení kultury. Jeho obsah dosahuje maximální hodnoty během počátečních stádií stacionární fáze a zůstává vysoký během sporulace a po ní. Podobných výsledků bylo dosaženo při použití supernatantů kultur Bacillus cereus AB424. Hladiny insekticidního proteinu VIP3A(a) odrážejí expresi genu VIP3A(a), jak se stanoví northern blottingem. Počátek sporulace byl stanoven přímým mikroskopickým pozorováním a analýzou přítomnosti δ-endotoxinů v buněčných peletách. Proteiny typu Cry-I lze detekovat v pozdních stádiích stacionární fáze, během sporulace a po ní.

Příklad 18D

Identifikace nových genů podobných VIP3 pomocí hybridizace

Pro identifikaci kmenů Bacillus obsahujících geny příbuzné VIP3A(a) z izolátu AB88 byla pomocí hybridizace zkoumána sada izolátů Bacillus. Kultury 463 kmenů rodu Bacillus byly pěstovány v mikrotitračních jamkách až do sporulace. Pro přenesení kultur na 150 mm desky obsahující L-agar bylo použito zařízení s 96 hroty. Inokulované desky byly uchovávány při teplotě 30 °C po dobu 10 hodin a poté při teplotě 4 °C přes noc. Kolonie byly přeneseny na nylonové filtry a analyzovány sondou, kterou byl HindiII-fragment o velikosti 1,2 kb získaný z VIP3A(a). Hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 62 hybridizačních podmínek, které uvádějí

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) . Filtry byly promyty 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného (SDS) při teplotě 62 °C a exponovány na film citlivý na rentgenové záření.

°C za Maniatis použití a kol.

Ze zkoumaných 463 kmenů rodu Bacillus obsahovalo 60 kmenů geny podobné VIP3, které bylo možné detekovat hybridizaci. Další charakterizací některých z nich (AB6 a

104

AB426) se zjistilo, že jejich supernatanty obsahují insekticidní proteiny podobné proteinu VIP3, účinné proti

Agrotis ipsilon.

Příklad 18E

Charakterizace kmene Bacillus thuringiensis M2194 obsahujícího kryptický gen podobný VIP3 kmenu Bacillus thuringiensis, označeném M2194, bylo zjištěno, že obsahuje gen (nebo geny) podobné VIP3, pomocí kolonové hybridizace jak je popsána v příkladu 18C. Má se za to, že gen z M2194 podobný VIP3 je kryptický, jelikož během růstových fází bakterie nelze detekovat žádnou expresi, af už pomocí imunoblotační analýzy za použití polyklonálních protilátek vytvořených proti proteinu VIP3A(a) izolovanému z AB88 nebo pomocí biologického testu, jak je popsán v příkladu 3 .

Antisérum proti purifikovanému insekticidními proteinu VIP3A(a) bylo vytvořeno v králících. 50 yg proteinu navázaného na nitrocelulosu bylo rozpuštěno v dimethylsulfoxidu a emulgováno s Freundovým kompletním adjuvans (Difco). Dvěma králíkům byly dávány subkutánní inejkce každý měsíc po dobu 3 měsíců. Byla jim odebrána krev 10 dnů po druhé a třetí injekci a ze vzorku krve bylo získáno sérum (Harlow a kol. (1988) v: Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, New York, USA)).

Gen z M2194 podobný VIP3 byl klonován do pKS za použití postupu popsaného v příkladu 9, čímž byl získán pCIB7108. Escherichia coli obsahující pCIB7108, který obsahuje gen VIP3 z M2194, byla účinná proti Agrotis ipsilon, což svědčí o tom, že tento gen kóduje funkční protein s insekticidní účinností. Plazmid pCIB7108 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture

105

Collection (NRRL), a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo

NRRL B-21438.

Příklad 18F

Insekticidní účinnost proteinů VIP3A

Spektrum účinnosti insekticidních proteinů VIP3A bylo kvalitativně stanoveno v biologických testech na hmyzu, ve kterých larvy pozřely rekombinantní Escherichia coli nesoucí geny VIP*A. V těchto testech byly buňky nesoucí geny VIP3A(a) a VIP3A(b) insekticidní pro Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea. Za stejných pokusných podmínek nevykazovaly bakteriální extrakty obsahující proteiny VIP3A žádnou účinnost proti Ostrinia nubilalis.

Účinek insekticidních proteinů VIP*A na larvy Agrotis ipsilon materiál použitý pro test mortalita (v %)

TB-medium				5
supernatant	AB88			100
supernatant	AB424		100
pufr				7
Escherichia	coli	pKS		10
Escherichia	coli	pCIB7104	(AB88)	100
Escherichia	coli	pCIB7105	(AB88)	100
Escherichia	coli	pCIB7106	(AB424)	100
Escherichia	coli	pCIB7107	(AB424)	100

106

Účinek insekticidních proteinů VIP3A na larvy hmyzu z řádu motýlů

materiál použitý pro test	hmyz	mortalita (%)
Escherichia coli pKS	AI	10
	SF	5
	SE	10
	HV	8
	HZ	10
	ON	5
Escherichia coli pCIB7105
Escherichia coli pCIB7107	AI	100
	SF	100
	SE	100
	HV	100
	HZ	50
	ON	10

Legenda:

AI = Agrotis ipsilon, SF - Spodoptera frugiperda,

SE = Spodoptera exigua, HV = Heliothis virescens,

HZ = Helicoverpa zea, ON = Ostrinia nubilalis

Přiklad 19

Izolace a biologická účinnost jiných druhů Bacillus sp.

Byly izolovány další druhy rodu Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu proteiny s insekticidní účinností. Tyto kmeny byly izolovány ze vzorků jejich životního prostředí pomocí standardních postupů. Byly

107 připraveny izoláty pro biologické testy a byly testovány jak je popsáno v příkladech 2 respektive 3. Izoláty, které produkovaly v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné v biologickém testu proti Agrotis ipsilon jsou uvedeny v tabulce níže. Nebyla pozorována žádná korelace mezi přítomností krystalu δ-endotoxinu a produkcí vegetativního insekticidního proteinu.

izolát Bacillus	přítomnost krystalu δ-endotoxinu	procento mortality
AB6	+	100
AB53	-	80
AB88	+	100
AB195	-	60
AB211	-	70
AB217	-	83
AB272	-	80
AB279	-	70
AB289	+	100
AB292	+	80
AB294	-	100
AB300	-	80
AB359	-	100

Izoláty AB289, AB294 a AB359 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21227, NRRL B-21229

108 respektive NRRL B-21226.

Izoláty Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné proti Diabrotica virgifera virgifera jsou uvedeny v tabulce níže

izolát Bacillus	přítomnost krystalu δ-endotoxinů	procento mortality
AB52	-	50
AB59	-	71
AB68	+	60
AB78	-	100
AB122	-	57
AB218	-	64
AB256	-	64

Izoláty AB59 a AB256 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21228 respektive B-21230.

Příklad 20

Identifikace nových genů podobných VIP1/VIP2 pomocí hybridizace

Pro identifikaci kmenů obsahujících geny příbuzné genům nacházejícím se v oblasti VIP1A(a)/VIP2A(a) v AB78 byla pomocí hybridizace zkoumána sada izolátů Bacillus. Nezávislé

109 kultury 463 kmenů rodu Bacillus byly pěstovány v jamkách mikrotitračních desek s 96 jamkami (celkem 5 desek) až do sporulace kultur. Z celkového počtu testovaných kmenů bylo 288 zařazeno jako Bacillus thuringiensis a 175 bylo zařazeno mezi jiné druhy rodu Bacillus, na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti krystalů δ-endotoxinů. Pro každou mikrotitrační desku bylo použito zařízení s 96 hroty pro přenos přibližně 10 μΐ kultury spor na dvě 150 mm desky obsahující L-agar. Na inokulovaných deskách byl umožněn růst při teplotě 30 °C po dobu 4-8 hodin a poté byly ochlazeny na teplotu 4 °C. Kolonie byly přeneseny na nylonové filtry a buňky byly lyžovány pomocí standardních způsobů známých v oboru. Filtry byly hybridizovány s DNA-sondou vytvořenou z DNA-fragmentů obsahujících DNA-sekvence jak VIPlA(a) tak VIP2A(a). Hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 65 °C za použití hybridizačních podmínek, které uvádějí Church a Gilbert (Church, G. M. a W. Gilbert, PNAS, 81: 1991 - 1995 (1984)) . Filtry byly promyty 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného (SDS) při teplotě 65 °C a exponovány na film citlivý na rentgenové záření.

Ze zkoumaných 463 kmenů rodu Bacillus bylo u 55 kmenů zjištěno, že hybridizuji s VIP1A(a)/VIP2A(a)-sondou. Z 22 z těchto kmenů byla izolována DNA a byla analyzována pomocí Southernova blottingu za použití DNA VIP1A(a)/VIP2A(a) jako sond. Tyto kmeny byly rozděleny do 8 skupin na základě toho, jak u nich proběhl Southernův blotting. Každá z těchto skupin se tím, jak u ní proběhl Southernův blotting, lišila od AB78. U jedné skupiny byl výsledek Southernova blottingu identický s výsledky získanými pro homology VIP1A(a)/VIP2A(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (viz níže). U každého z těctho 22 kmenů byla testována jeho účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Bylo zjištěno, že tři kmeny, AB433, AB434 a AB435, jsou účinné proti Diabrotica virgifera virgifera. Analýzou pomocí western blottingu za použití antiséra proti VIP2A(a) bylo zjištěno, že kmeny AB6, AB433,

110

AB434, AB435, AB444 a AB445 produkují protein (nebo proteiny) stejné velikosti jako je VIP2A(a).

Za zmínku stojí mezi identifikovanými kmeny kmen Bacillus thuringiensis AB6 (NRRL B-21060), který produkoval vegetativní insekticidní protein účinný proti Agrotis ipsilon, jak je popsáno v příkladu 15. Analýza pomocí western blottingu za použití polyklonálního antiséra proti VIP2A(a) a polyklonálního antiséra proti VIPlA(a) svědčí o tom, že AB6 produkuje proteiny podobné proteinům VIP2A(a) a VIPlA(a). AB6 tedy může obsahovat vegetativní insekticidní proteiny podobné VIPlA(a) a VIP2A(a), avšak s odlišným spektrem insekticidní účinnosti.

Příklad 21

Klonováni homologů VIP1A(a)/VIP2A(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis

U několika dříve charakterizovaných kmenů rodu Bacillus bylo pomocí Southernova blottingu testována přítomnost DNA podobné VIP1A(a)/VIP2A(a). U DNA z kmenů Bacillus AB78, AB88, GC91, HD-1 a ATCC 10876 bylo testováno, zda jsou přítomné sekvence podobné VIP1A (a)/VIP2A (a) . DNA z: kmenů Bacillus thuringiensis GC91 a HD-1 a kmene Bacillus cereus ATCC 10876 nehybridizovala s DNA VIP2A(a)/VIP1A(a), což svědčí o tom, že tyto kmeny neobsahující DNA-sekvence podobné genům VIP1A(a)/VIP2A(a). Podobně DNA z insekticidniho kmene AB88 (příklad 16) nehybridizovala s oblasti DNA VIP1A(a)/VIP2A(a), což naznačuje, že účinnost VIP produkovaná tímto kmenem není důsledkem homologů VIP1A(a)/VIP2A(a). Naproti tomu, Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) obsahoval sekvence, které hybridizovaly s oblastí VIP1A(a)/VIP2A(a). Další analýzy potvrdily, že Bacillus thuringiensis var. tenebrionis obsahuje sekvence podobné VIP1A(a)/VIP2A(a).

111

Pro charakterizaci homologů VIP2A(a) a VIPlA(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis byly klonovány geny kódující tyto proteiny. Pomocí Southernova blottingu byl identifikován restrikční fragment o velikosti 9,5 kb získaný pomocí Eco RI, o kterém bylo pravděpodobné, že obsahuje kódující oblasti homologů. Genomová DNA byla rozštěpena Eco RI a fragmenty DNA o délce přibližně 9,5 kb byly purifikovány v gelu. Tato DNA byla ligována do vektoru pBluescript SK( + ) rozštěpeného Eco RI a byla transformována do Escherichia coli pro vytvoření plazmidové knihovny. U přibližně 10000 kolonií bylo pomocí kolonové hybridizace zjišťováno, zda obsahují sekvence homologické s VIP2A(a). Bylo identifikováno 28 pozitivních kolonií. Všech 28 klonů je identických a obsahují homology VIP1A(a)/VIP2A(a). Klon pCIB7100 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo B-21322. Z pCIB7100 bylo zkonstruováno několik subklonů. Xba I-fragment o velikosti 3,8 kb z pCIB7100 byl klonován do vektoru pBluescript SK(+) pro získání pCIB7101. Hind III-fragment o velikosti 1,8 kb a Hind III-fragment o velikosti 1,4 kb z pCIB7100 byly klonovány do vektoru pBluescript SK(+) pro získání pCIB7102 respektive pCIB7103. Subklony pCIB7101, pCIB7102 a pCIB7103 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla B-21323, B-21324 respektive B-21325.

DNA-sekvence oblasti pCIB7100 obsahující homology VIP2A(a)/VIPlA(a) byla určena pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 až 5467. Reakce byly provedeny za použití sekvenačních souprav

112

PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenačních souprav PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analýza byla provedena na automatickém sekvenátoru ABI 373. Jako primery pro stanovení DNA-sekvence v určitých oblastech byly použity na zakázku vyrobené oligonukleotidy. DNA-sekvence této oblasti je uvedena v SEQ ID č. 19.

Oblast o velikosti 4 kb uvedená v SEQ ID č. 19 obsahuje dva otevřené čtecí rámce, které kódují proteiny vykazující vysoký stupeň podobnosti s proteiny VIPlA(a) a VIP2A(a) z kmene AB78. Aminokyselinová sekvence homologu VIP2A(a), označeného za použití standardizované nomenklatury jako VIP2A(b) , je uvedena v SEQ ID č. 20 a aminokyselinová sekvence homologu VIPlA(a), označeného za použití standardizované nomenklatury jako VIPlA(b), je uvedena v SEQ ID č. 21. Protein VIP2A(b) vykazuje 91% aminokyselinovou identitu (totožnost) s VIP2A(a) z AB78. Srovnání aminokyselinových sekvencí těchto dvou proteinů VIP2 je uvedeno v tabulce 20. Protein VIPlA(b) vykazuje 77% aminokyselinovou identitu s VIPlA(a) z AB78. Srovnání těchto dvou proteinů VIP2 je uvedeno v tabulce 21. Srovnání uvedené v tabulce 21 svědčí o podobnosti mezi VIPlA(b) a VIPlA(a) z AB78. Toto srovnání svědčí o tom, že tyto dva proteiny VIP1 vykazují vyšší aminokyselinovou identitu v N-koncové oblasti než v C-koncové oblasti. Ve skutečnosti vykazují N-koncové dvě třetiny (do aminokyseliny 618 sekvence VIPlA(b) uvedené v tabulce 21) těchto proteinů 91% identitu, zatímco C-koncová třetina (od aminokyseliny 619 do 833 VIPlA(b)) vykazuje pouze 35% identitu.

Analýza pomocí western blottingu svědčí o tom, že Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) produkuje jak proteiny podobné VIPlA(a) tak proteiny podobné VI2A(a). Zdá se však, že tyto proteiny nevykazují účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Biologický test účinnosti

113 proti Diabrotica virgifera virgifera byl prováděn bud' za použití supernatantu 24 hodin staré kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) nebo klonu Escherichia coli pCIB7100 (který obsahuje celou oblast homologů VIP1A(a)/VIP2A(a)). V žádném z těchto případů nebyla zjištěna žádná účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera.

Vzhledem k podobnosti mezi proteiny VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a AB78 byla testována schopnost VIP2A(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis nahradit VIP2A(a) z AB78. Buňky obsahující pCIB6206 (který produkuje protein VIPlA(a) z AB78, ale neprodukuje protein VIP2A(a)) byly smíchány se supernatantem kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a byla testována jejich účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Zatímco ani supernatant kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, ani buňky obsahující pCIB6206 nevykazovaly účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, vykazovala směs Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a pCIB6206 vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Kromě toho bylo v dalším biologické testu zjištěno, že klon Btt pCIB7100, který obsahuje geny VIP1A(b)/VIP2A(b) v Escherichia coli, rovněž poskytuje účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, pokud je smíchán s pCIB6206. Protein VIP2A(b) produkovaný Bacillus thuringiensis var. tenebrionis je tedy funkčně ekvivalentní s proteinem VIP2A(a) produkovaným AB78 .

Tímto byla demonstrována možnost identifikovat nové kmeny s insekticidní účinnosti za použití DNA vegetativních insekticidních proteinů jako hybridizačních sond. Dále, kmeny rodu Bacillus, které obsahují sekvence podobné VIPlA(a)/ /VIP2A(a) a produkují protein podobný VIP1A(a)/VIP2A(a), vykazují toxicitu vůči různým hmyzím škůdcům. Za použití podobných způsobů lze identifikovat mnoho dalších příslušníků rodiny VIP1/VIP2. Dále lze za použití podobných způsobů

114 identifikovat homology jiných variant vegetativních insekticidních proteinů (například vegetativních insekticidních proteinů z AB88).

Tabulka 20

Srovnání aminokyselinových sekvencí VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis - Btt (VIP2A(b)) a z AB78 (VIP2A(a))

Btt 1 MQRMEGKLFWSKTIQWTRIVLESIVYSITLLNNWIKADQLNINSQSK 50 SEQ ID Č . 20 I . I I I I I I I : I I I · I I I I I : I I I I I I i : I I . I I ! I I I I I : ί I I I I I I I I

AB78 1 MKRMEGKLFMVSKKDQWTKTVLLSTVFSISLLNNEVIK-EQLNINSQSK 50 SEQ ID Č . 2

YTNLQNLKIPDNAEDFKEDKGKAKEWGKEKGEEWRPPATEKGEt'4NNELDN 100 IIIIIIIII - I..II i II I I : I I I I I I I I I I I : . I I I I I · I I I I I I I

YTMLQNIKITDKVEDEKEDKEKAKEWGKEKEKEWKLTATEKGKMNIIELDN 100

101 KNDIKTNYKEITFSMAGSCEDEIKDLEEIDKIFDKANLSSS1ITYKNVEP 150 lili I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I I I : I í I · I I I · I I I I I I I i I I

101 KNDIXIWKEITFSMAGSEEDEIKDLKEIDKMFDKTNLSNSIITYKNVEP 150

151 ATIGFNKSLTEGNTINSDAI^QFKEQFLGKDMKFDSYLDTHLTAQQVSSK 200 . I I I I I ί I I I I I I I I I I I ί I I I I I ί I I I :·' I : I I I I I I I I I I I I I I I i ί I

151 TTIGFNKSLTEGNTINSDAMAQFKEQFLDRDIKFDSYLDTHLTAQQVSSK 200

201 KRVILKVTVPSGKGSTTPTKAGVILNNNEYFMLIDNGYVLHVDKVSKWK 250 . I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I - I I I I I I I I I I : : I I I I I I I I I I

201 ERVIIXVTWSGKGSTTPTKAGVIIJsINSEYRMLIDNGYMVHVDKVSKWK 250

251 KGMECLQVEGTLKKSLDFKNDINAEAHSWGMKIYEDWAW^LTASQREALD 300 I I : I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I : I I - I I I I i ! I

251 KGVECLQIEGTLKKSLDFKNDINAEAHSWGMKNYEEWAKDLTDSQREAin 300

115

301 GY.ARQDYKEINNYLRNQGGSGNEKl.DAQLKNISD.ALGKKPIPENITVYRW 350 i I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I i I I I I I i I I I I I I I I I I I I I

301 GYARQDYKEINNhOLRNQGGSGNEKLDAQIKNISDALGKKPIPENITVYRW 350

351 CQ4PEFGYQISDPLPSLKDFEEQFLNTIKEDKGYMSTSLSSERLAAFGSR 400

I I i II I I I I I I I I I I I I 1 I II II II I I I I I I I I II I I I I I i I I I I 1 I I I I

351 CGMPEFGYQISDPLPSLKDFEEQFLNTIKEDKGYMSTSLSSERLAAFGSR 400

401 KIILRLQVPKGSTGAYLSAIGGFASEKEILLDKDSKYKIDKATEVIIKGV 450 I I : I ! I II I I I I I I I I I I I II I I i I í I II II I II I I I I I 1 I - I I I I I I I I 401 KIILRLQVPKGSTGAYLSAIGGFAEEKEILLDKDSKYHIDKVTEVIIKGV 450

451 KRYWDATLLTN 462 I ! I II Η I I I I I

451 KRYWDATLLTN 462

Tabulka 21

Srovnání aminokyselinových sekvencí VIP1 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis - Btt (VIPlA(b)) a z AB78 (VIPlA(a))

Btt 1 MKNMKKKLASWTCMLLAPMFLNGNVNAVNADSKINQISTTQENQQKEMD 50 SEQ ID Č . 21 IIII I I I I II I I ! I I II I I I II I II I I I I I I I · I I I I I I I . I i IIIII

Ab78 1 MKNMKKKLASWGCTLLAPMFLNGNWAWADSKTNQISTTQKNQQKEMD 50 SEQ ID č.5

RKGLLGYYFKGKDFNNLTMFAPTRDNTLMYDQQTANALLDKKQQEYQSIR 100

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

RKGLLGYYFKGKDFSNLTMFAPTRDSTLIYDQQTANKLLDKKQQEYQSIR 100

101 WIGLIQRKETGDFTFNLSKDEQAIIEIDGKIISNKGKEKQWHLEKEKLV 150

II I I II . II I I I I I I I I I - I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I

101 WIGLIQSKETGDFTFNLSEDEQAIIEINGKIISNKGKEKQWHLEKGKLV 150

151 PIKIEYQSDTKFNIDSKTFKELKLFKIDSQNQSQQVQ...LRNPEFNKKE 197

116

151 PIKIEYQSDTKFNIDSKTFKELKLFKIDSQNQPQQV<2QDELRNPEF14KKE 200

198 SQEFLAKASKTNLFKQKMKRDIDEDTDTDGDSIPDLWEENGYTIQI4KVAV 247 I I I I I I I : I I · I I I · I I I I I : I I I I I I I I IIIIIIIIIIIIIIIII::II

201 SQEFLAKPSKINLFTQKMKREIDEDTDTDGDSIPDLWEENGYTIQNRIAV 250

248 KWDDSLASKGYTKFVSNPLDSHTVGDPYTDYEKAARDLDLSNAKETFNPL 297

IIIIIIIIIIIIIII I I I I : I I I I I i I ! I I I I I I I II I I I I I II I I I I i I

251 KWDDSLASKGYTKFVSNPLESHTVGDPYTDYEKAARDLDLSNAKETFNPL 300

298 VAAFPSVNVSMEKVILSPNENLSNSVESHSSTNWSYTNTEGASIEAGGG? 347

I IIII II II I ! 1 I I II I II I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I II

301 VAAFPSVNVSMEKVILSPNENLSNSVESHSSTNWSYTNTEGASVEAGIG? 350

348 LGLSFGVSVTYQHSETVAQEWGTSTGNTSQFNTASAGYLNANVRYNNVGT 397 I : I I I I I I - I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I II I I l.l I I I I I I I I

351 KGISFGVSVNYQHSETVAQEWGTSTGNTSQFNTASAGYLNANVRYNNVGT 400

398 GAIYDVKPTTSFVLNNNTIATITAKSNSTALRISPGDSYPEIGENMAIT 447

II I I I I I I I IIIIIII:IIIIIIII I I I I I I · I I I I : I I I . I : I : I I I I

401 GAIYDVKPTTSFVLNNDTIATITAKSNSTALNISPGESYPKKGQNGIAIT 450

448 SMDDFNSHPITLNKQQVNQLINNKPIMLETDQTDGVYKIRDTHGNIVTGG 497 I I I I I I I I IIIIII·II:·I:II I I:II I I : I I I I I I I I : I I I I I I I I I I 451 SMDDFNSHPITLNKKQVDNLLNNKPMMLETNQTDGVYKIKDTHGNIVTGG 500

98 EWNGVTQQIKAKTASIIVDDGKQVAEKRVAAKDYGHPEDKTPPLTLKDTL 547 IIIIIIIIIII I I I I II I I I .. I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I I I I . I 501 EWNGVIQQIKAKTASIIVDDGERVAEKRVAAKDYENPEDKTPSLTLKD.AL 550

548 KLSYPDEIKETNGLLYYDDKPIYESSVMTYLDENTAKEVKKQINDTTGKF 597

III I II II I I : I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I : I I I I I I I

551 KLSYPDEIKEIEGLLYYKNKPIYESSVMTYLDENlAKEVrKQLNDTTGKF 600

117

598 KDVNHLYDVKLTPKMNFTIKMASLYDGAENNHNSLGTWYLTYNVAGGNTG 647 I I I · I I I I I II I I I I I · I II : - I I I · I I . I . I I : I . I I I . I I I . I

.... 601 KDVSHLYDVKLTPKMNVTIKLSILYDNAESNDNSIGKWTNTNIVSGGNNG 650

648 KRQYRSAHSCAHVALSSEAKKKLNQNANYYLSt4YMKADSTTEPTIEVAGE 697 1:11.1·:. I::.I . . : I . . I I I ·I :I I : I : I I I . : . . I : . . I . : . I |

651 KKQYSSNNPDANLTLNTDAQEKLNKNRDYYISLYMKSEKNTQCEITIDGE 700

698 KSAITSKKVKLNNQNYQRVDILVKNSERNPMDKIYIRGNGTTNVYGDDVT 747 : I I . I . I . : I . : I I . I : I I : . . I . . I I : . . : . I : . I : . . . : : | | : .

701 IYPITTKTVNVNKDNYKRLDIIAHNIKSNPISSLHIKIWEITLFWDDIS 750

748 IPEVSAINPASLSDEEIQEIFKDSTIEYGNPSFVADAVTFK......... 788 ί . : I . . I . I . . I . I . I I . : I : . . | . . : : . : : . . . . : .

751 ITDVASIKPENLTDSEIKQIYSRYGIKLEDGILIDKKGGIHYGEFINEAS 800

789 .N1KPLQNYVKEYEIYHK.......SHRYEKKTVFDIMGVHYEYSIAREQ 830

I I . I I I I I I . . i . : . . I . . | . . . : : . ...

801 FNIEPLQNYVTKYKVTYSSELGQNVSDTLESDKIYKDGTIKFDFTKYSKN 850

831 KKA 833

851 EQG 853

Příklad 22

Fúze proteinů VIP pro vytvoření jediného polypeptidu

Proteiny VIP se mohou v přírodě vyskytovat jako jednotlivé polypeptidy nebo jako dva nebo více interagujících polypeptidu. Pokud je účinný vegetativní insekticidní protein složen ze dvou nebo více interagujících proteinových řetězců, lze tyto proteinové řetězce produkovat jako jediný polypeptidový řetězec z genu vzniklého fúzí dvou (nebo více) oblastí kódujících VIP. Geny kódující tyto dva řetězce se fúzují spojením kódujících oblastí těchto genů za vytvoření

118 jediného otevřeného čtecího rámce kódujícího oba polypeptidy VIP. Složené polypeptidy lze fúzovat tak, že N-konec fúzního proteinu tvoří menší polypeptid nebo je lze fúzovat tak, že N-konec fúzního proteinu tvoří větší z polypeptidů. Mezi tyto dvě polypeptidové domény lze popřípadě zařadit linker. Takové linkery jsou v oboru známé. Linker může být popřípadě vytvořen tak, aby obsahoval taková místa štěpená proteasami, že jakmile je jediný fúzní polypeptid pozřen cílovým hmyzem, je rozštěpen v oblasti linkeru, čímž se uvolní dvě polypeptidové složky účinné molekuly VIP.

VIPlA(a) a VIP2A(a) z kmene Bacillus cereus AB78 se fúzují pro vytvoření jediného polypeptidů fúzováním jejich kódujících oblastí. Výsledná DNA obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SIQ ID č. 23. Podobným způsobem lze produkovat jiné fúzní proteiny.

Fúze genů kódujících VIPlA(a) a VIP2A(a) se provede za použití standardních postupů molekulární biologie. Nukleotidy deletované mezi kódujícími oblastmi VIPlA(a) a VIP2A(a) se delterují za použití známých postupů mutageneze nebo se alternativně kódující oblasti fúzují za použití polymerasově řetězové reakce (PCR).

Fúzované polypeptidy VIP mohou být exprimovány v jiných organismech za použití syntetického genu, nebo částečně syntetického genu, optimalizovaného pro expresi v alternativním hostiteli. Například pro expresi výše popsaného fúzovaného polypeptidů VIP v kukuřici se připraví syntetický gen za použití kodónů preferovaných kukuřicí pro každou aminokyselinu, viz například EP-A 0618976. Syntetické DNA-sekvence vytvořené podle těchto způsobů jsou uvedeny v SEQ ID č. 17 (pro kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 100 kDa), SEQ ID č. 18 (pro kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 80 kDa) a SEQ ID č. 24 (pro

119 kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIP2A(a)).

Syntetické geny VIP1 a VIP2 optimalizované pro expresi v kukuřici lze fúzovat za použití polymerasové řetězové reakce, nebo lze syntetické geny vytvořit tak, že budou fúzovány na běžném restrikčnim místě. Alternativně lze syntetický fúzní gen vytvořit tak, aby kódoval jediný polypeptid obsahující domény jak VIP1 tak VIP2 .

Přidání peptidového linkeru mezi domény VIP1 a VIP2 fúzního proteinu lze provést mutagenezí pomoci polymerasové řetězové reakce (PCR-mutagenezí), použitím syntetického DNA-linkeru kódujícího linkerový peptid, nebo za použití jiných způsobů známých v oboru.

Fúzované polypeptidy VIP mohou obsahovat jednu nebo několik vazebných domén (domén vázajících se na receptor). Pokud se při fúzi použije více než jedna vazebná doména, je za použití takového fúzního produktu kontrolováno více cílových druhů hmyzu. Další vazebné domény lze získat za použití jiných vegetativních insekticidních proteinů, a to buď celých nebo jejich částí, endotoxinů z Bacillus thuringiensis nebo jejich částí, nebo jiných proteinů schopných vazby na cílového škůdce nebo příslušných vazebných domén získaných z takto se vázajících proteinů.

Jedním z příkladů fúzního konstruktu obsahujícího DNA-sekvenci optimalizovanou pro kukuřici, která kóduje fúzní produkt kterým je jediný polypeptidový řetězec obsahující na N-konci VIP2A(a) a na C-konci VIPlA(a), je pCIB5531. Mezi dvě kódující oblasti byla vložena DNA-sekvence kódující linker s peptidovou sekvencí PSTPPTPSPSTPPTPS (SEQ ID č. 47). Sekvence kódující linker a odpovídající klonovací místa je 5'- CCC GGG CCT TCT ACT CCC CCA ACT CCC TCT CCT AGC ACG CCT CCG ACA CCT AGC GAT ATC GGA TCC -3' (SEQ ID č. 48). Byly syntetizovány oligonukleotidy představující jak horní tak dolní řetězec a po hybridizaci a fosforylaci za použití standardních postupů

120 byly klonovány do vektoru pUC. Terminační kodón (stop kodón) ve VIP2A(a) byl odstraněn za použití polymerasové řetězové reakce a nahrazen restrikčním místem BglII s místem Smál. Translační fúzní produkt byl vytvořen ligaci fragmentu Bam Hl/Pst I z genu VIP2A(a) z pCIB5522 (viz příklad 24), fragmentu získaného polymerasovou řetězovou reakcí obsahujícího Pstl-koncový fragment genu VIP2A(a) (identického jako byl použit pro konstrukci pCIB5522), syntetického linkeru s konci, které ligují s tupým místem na 5'-konci a s BamHI na 3'-konci, a modifikovaného santetického genu VIPlA(a) z pCIB5526 popsaného níže (viz SEQ ID č. 35). Fúzní produkt byl vytvořen ligaci čtyř částí, čímž vznikl plazmid obsahující gen VIP2A(a) bez kodónu ukončujícícho translaci (terminačního kodónu), spolu s linkerem a kódující oblasti VIPlA(a) bez sekrečního signálu pro Bacillus. DNA-sekvence tohoto konstruktu je uvedena v SEQ ID č. 49 a kóduje fúzní protein uvedený v SEQ ID č. 50. Fúzní produkt tvořený jediným polypeptidem, kde je VIPlA(a) na N-konci a VIP2A(a) na C-konci lze vytvořit podobným způsobem. Dále lze kterýkoli z těchto genů nebo oba tyto geny napojit za vzniku translační fúze, za použití nebo bez použití linkeru, buď na 5'-konec nebo na 3'-konec jiných molekul, jako jsou geny kódující toxiny nebo reportérové geny.

Příklad 23

Cílení VIP2 do rostlinných organel

Je známo, že v rostlinách existují různé mechanismy cílení genových produktů a do určité míry byly charakterizovány sekvence řídící fungování těchto mechanismů. Například cílení genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí, která se nachází na N-konci různých proteinů. Tento signál se odštěpuje během importu do chloroplastu za vzniku maturovaného proteinu (například Comai

121 a kol., J. Biol. Chem. 263: 15104 - 15109 (1988)). Tyto signální sekvence lze fúzovat k heterologním genovým produktům, jako je VIP2, pro vyvolání importu těchto produktů do chloroplastu (van den Broeck a kol., Nátuře 313: 358 - 363 (1985)). DNA kódující příslušné signální sekvence lze izolovat z 5'-konce cDNA kódujících protein RUBISCO, protein CAB, enzym EPSP-synthasu, protein GS2 a mnoho dalších proteinů, o kterých je známo, že jsou lokalizovány do chloroplastů.

Jiné genové produkty jsou lokalizovány do jiných organel, jako jsou mitochondrie a peroxisomy (například Unger a kol., Plant Molec. Biol. 13: 411 - 418 (1989)). S cDNA kódujícími tyto produkty lze rovněž manipulovat pro dosažení cílení heterologních genových produktů, jako je VIP2, do těchto organel. Mezi příklady takových sekvencí patří nukleárně kódované ATPasy a specifické isoformy aspartát-b -aminotransferasy pro mitochondrie. Podobně cílení do celulárních proteinových tělísek popsali Rogers a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512 - 6516 (1985)).

Fúzí příslušných sekvencí způsobujících cílení, jak jsou popsány výše, s kódujícími sekvencemi jež jsou předmětem zájmu, jako je VIP2, je možné řídit transgenický produkt do libovolné organely nebo kompartmentu buňky. Pro cílení do chloroplastu se například chloroplastová signální sekvence z genu RUBISCO, genu CAB, genu EPSP-synthasy nebo genu GS2 fúzuje ve stejném čtecím rámci s N-koncovým kodónem ATG transgenu. Vybraná signální sekvence by měla obsahovat známé místo štěpení a při konstruování fúzního produktu je třeba počítat s jakýmikoli aminokyselinami za místem štěpení, které jsou pro štěpení nutné. V některých případech lze tento požadavek splnit přidáním malého počtu aminokyselin mezi místo štěpení a startovací kodón ATG, nebo alternativně nahrazením některých aminokyselin v kódující sekvenci. U fúzních produktů zkonstruovaných pro import do chloroplastu

122 lze testovat účinnost příjmu chloroplastem pomocí in vitro translace in vitro transkribovaných konstruktů s následujícím příjmem do chloroplastů in vitro za použití postupů, které popsali Bartlett a kol. v: Edelmann a kol. (editoři) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str. 1081 - 1091 (1982), a Wasmann a kol., Mol. Gen. Genet. 205: 446 - 453 (1986). Tyto postupy konstruování jsou v oboru dobře známé a lze je rovněž použít pro mitochondrie a peroxisomy.

Výše popsané mechanismy cílení v buňce lze použít nejen ve spojení s jejich příbuznými promotory, ale rovněž ve spojení s heterologními promotory, pro dosažení specifického cílení v buňce za regulace transkripce promotorem který vykazuje model exprese odlišující se od modelu vykazovaného promotorem od kterého je získán signál způsobující cílení.

V nativním genu VIP2 z mikroorganismů Bacillus je přítomná DNA-sekvence kódující sekreční signál. Tento signál není přítomen v maturovaném proteinu, který má N-koncovou sekvenci LKITDKVEDF (aminokyselinové zbytky 57 až 66 v SEQ ID č. 2) . Je možné pomocí genového inženýrství modifikovat VIP2 tak, aby byl vylučován z rostlinné buňky nebo aby byl cílen do subcelulárních organel, jako je endoplazmatické retikulum, vakuola, mitochondrie a plastidy včetně chloroplastů. Hybridní proteiny připravené fúzí sekrečního signálu s markerovým genem byly úspěšně cíleny do sekreční dráhy (Itirriaga G. a kol., The Plant Cell, 1: 381 - 390 (1989), Denecke a kol. The Plant Cell. 2: 51 - 59 (1990)). Byly identifikovány N-koncové sekvence, které jsou které jsou zodpovědné za cílení do endoplazmatického retikula, do apoplastu a za extracelulární sekreci z aleuronových buněk (Koehler a Ho, Plant Cell 2: 769 - 783 (1990)).

Pro zadržení proteinu v endoplazmatickém retikulu nebo vakuole je nutná přítomnost dalších signálů. Pro zadržení proteinu v endoplazmatickém retikulu je nutná peptidová sekvence KDEL/HDEL na C-konci tohoto proteinu (jak shrnul

123

Pelham, Annual Review Cell Biol., 5: 1-23 (1989)). Signály pro zadržení proteinů ve vakuole byly rovněž charakterizovány. Signály způsobující cílení do vakuoly mohou být přítomné bud' na N-koncové části (Holwerda a kol., The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992), Nakamura a kol., Plant Physiol., 101: 1-5 (1993)), C-koncové části nebo ve vnitřní sekvenci cíleného proteinu (Tague a kol., The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992), Saalbach a kol., The Plant Cell, 3: 695 - 708 (1991)). Kromě toho jsou za cíleni genových produktů do vakuoly zodpovědné N-koncové sekvence ve spojení s C-koncovými sekvencemi (Shinshi a kol., Plant Molec. Biol., 14: 357 - 368 (1990)). Podobně mohou být proteiny cíleny do mitochondrií nebo plastidů za použití fúzí se specifickými C-koncovými signálním peptidy (Heijne a kol., Eur. J. Biochem., 180: 535 - 545 (1989), Archer a Keegstra, Plant Molecular Biology, 23 : 1105 - 1115 (1993) ) .

Pro cílení VIP2, buďto pro sekreci nebo do různých subcelulárních organel, může být na 5'-konec nebo 3'-konec genu, jak je potřeba, zařazena DNA-sekvence kódující známý signální peptid (nebo peptidy) optimalizovaná pro kukuřici. Pro sekreci VIP2 z buňky lze na 5'-konec buďto úplné sekvence genu VIP2 nebo zkrácené sekvence kódující maturovaný protein nebo genu zkráceného až k nukleotidu 286 nebo kódujícího protein počínaje aminokyselinovým zbytkem 94 (methioninem) přidat DNA-sekvenci kódující eukaryotický sekreční signál MGWSWIFLFLLSGAAGVHCL (SEQ ID č. 25) z PCT-přihlášky č. IB95/00497 nebo libovolný jiný sekreční signál popsaný v literatuře (Itirriaga a kol., The Plant Cell, 1: 381 - 390 (1989), Denecke a kol., The Plant Cell, 2: 51 - 59 (1990)). Pro cíleni VIP2 tak, aby byl zadržen v endoplazmat ickém retikulu, lze na 3'-konec genu, kromě sekrečního signálu, přidat DNA-sekvenci kódující signální peptid pro endoplazmatické retikulum KDEL/HDEL. Pro cílení do vakuoly lze umístit vedle sekrečního signálu DNA-sekvenci kódující signální peptid SSSSFADSNPIRVTDRAAST (SEQ ID č. 3, Holwerda a kol.,

124

The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992)) nebo vložit na 3'-konec genu sekvenci kódující karboxylový signální peptid, jak ji popsali Dombrowski a kol., The Plant Cell, 5: 587 - 596 (1993) nebo její funkční variantu. Podobně lze VIP2 modifikovat tak, aby byl cílen buď do mitochondrií nebo plastidů, včetně chloroplastů, tím, že se do popsané sekvence VIP2 vloží sekvence kódující požadované signály způsobující cílení. Bakteriální sekreční signál přítomný ve VIP2 může být ve výsledném konstruktu zachován nebo z něj může být odstraněn.

Jedním z příkladů konstruktu, který obsahuje eukaryotický sekreční signál fúzovaný s kódující sekvencí VIP, je pCIB5528. Byly syntetizovány oligonukleotidy odpovídající jak hornímu tak dolnímu řetězci sekvencí kódujících sekreční signál uvedený v SEQ ID č. 25, mající sekvenci 5'-GGATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC CTG TTC CTG CTG AGC GGC GCC GCG GGC GTG CAC TGC CTGCAG-3' (SEQ ID č. 41). Po hybridizací se 5'-konec sekrečního signálu podobá lepivým koncům odpovídajícím restrikčním místům BamHI a Pstl. Oligonukleotid byl hybridizován a fosforylován a ligován do pCIB5527 (konstruování je popsáno v příkladu 23A), který byl rozštěpen BamHI a Pstl za použití standardních postupů. Výsledná kódující sekvence optimalizovaná pro kukuřici je uvedena v SEQ ID č. 42 a kóduje protein uvedený v SEQ ID č. 43. Kódovaný protein obsahuje eukaryotický sekreční signál místo sekrečního signálu mikroorganismu Bacillus.

Jedním z příkladů konstruktu, který obsahuje signál způsobující cílení do vakuoly fúzovaný s kódující sekvencí VIP, je pCIB5533. Byly syntetizovány oligonukleotidy odpovídající jak hornímu tak dolnímu řetězci sekvencí kódujících peptid způsobující cílení do vakuoly uvedený v SEQ ID č. 3, mající sekvenci 5'-CCG CGG GCG TGC ACT GCC TCA GCA GCA GCA GCT TCG CCG ACA GCA ACC CCA TCC GCG TGA CCG ACC GCG CCG CCA GCA CCC TCG AG-3' (SEQ ID č. 44) . Po hybridizací se 5'-konec

125 signálu způsobujícího cílení do vakuoly podobá lepivým koncům odpovídajícím restrikčnim místům SacII a Pstl. Oligonukleotid byl hybridizován a fosforylován a ligován do pCIB5528 (konstruování je popsáno výše), který byl rozštěpen SacII a Pstl za použití standardních postupů. Výsledná kódující sekvence optimalizovaná pro kukuřici je uvedena v SEQ ID č. 4 5 a kóduje protein uvedený v SEQ ID č. 46. Kódovaný protein obsahuje kromě eukaryotickěho sekrečního signálu peptid způsobující cílení do vakuoly.

Gen VIP1 lze pomocí podobných postupů rovněž upravit tak, aby byl sekretován nebo cílen do subcelulárních organel.

Příklad 23A

Odstranění sekrečního signálu mikroorganismu Bacillus z VIPlA(a) a VIP2A(a)

VIPlA(a) a VIP2A(a) jsou sekretovány během růstu kmene AB78. Povaha peptidových sekvencí, které působí jako sekreční signály, byla popsána v literatuře (Simonen a Palva, Microbiological reviews, str. 109 - 137 (1993)). Na základě informací z výše uvedené publikace byl v obou genech identifikován předpokládaný sekreční signál. Ve VIPlA(a) je tento signál tvořen aminokyselinami 1-33 (viz SEQ ID č. 5). K odštěpení sekrečního signálu pravděpodobně dochází za serinem, který je aminokyselinou 33. Jako sekreční signál ve VIP2A(a) byly identifikovány aminokyseliny 1-49 (viz SEQ ID č. 2). Analýzou N-koncového peptidů sekretovaného maturovaného proteinu VIP2A(a) bylo zjištěno, že N-koncová sekvence je LKITDKVEDFKEDK. Tato sekvence začíná aminokyselinou 57 v SEQ ID č. 2. Geny kódující tyto proteiny byly modifikovány tak, že byly odstraněny sekreční signály mikroorganismu Bacillus.

Byla zkonstruována kódující oblast VIPlA(a) optimalizo126 váná pro kukuřici, z jejíhož 5'-konce byly odstraněny sekvence kódující prvních 33 aminokyselin, t.j. sekreční signál. Tato modifikace byla provedena pomocí polymerasově řetězové reakce za použití dopředného primeru který obsahoval sekvenci 5'-GGA TCC ACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC-3' (SEQ ID č. 33), který hybridizuje s genem optimalizovaným pro kukuřici (SEQ ID č. 26) v nukleotidové poloze 100, a přidával restrikční místo BamHI a konvenční eukaryotické místo počátku translace včetně startovacího kodónu. Zpětný primer, který obsahoval sekvenci 5'-AAG CTT CAG CTC CTT G-3' (SEQ ID č. 34), hybridizuje s komplementárním vláknem v nukleotidové poloze 507. Byl získán amplifikační produkt o velikosti 527 bp, který obsahuje restrikční místa BamHI na 5'-konci a místo HindlII na 3'-konci. Amplifikační produkt byl klonován do T-vektoru (popsaného níže v příkladu 24) a sekvenován pro zajištění správné DNA-sekvence. Poté byl restrikčním štěpením získán fragment BamHI/HindlII, který byl použit pro nahrazení fragmentu BamHI/HindlII genu VIPlA(a) optimalizovaného pro kukuřici, klonovaného do kořeny preferované promotorové kazety. Získaný konstrukt byl označen pCIB5526. Kódující oblast VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici, ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, je uvedena jako SEQ ID č. 35. Kódovaný protein je uveden jako SEQ ID č. 36 .

Gen který kóduje upravenou formu VIP2A(a), tedy kódující oblast ze které byl odstraněn sekreční signál, byla zkonstruována podobným způsobem jako je popsán výše pro zkonstruování upravené formy VIPlA(a). Modifikace byla provedena pomocí polymerasové řetězové reakce za použití dopředného primeru 5'-GGA TCC ACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC AC-3' (SEQ ID č. 37) . Tento primer hybridizuje s genem VIP2A(a) optimalizovaným pro kukuřici (SEQ ID č. 27) v nukleotidové poloze 150. V nukleotidové poloze 15 tohoto primeru byla provedena tichá mutace pro získání restrikčního místa Pstl. Zpětný primer má sekvenci 5'-AAG CTT CCA CTC CTT

127

CTC-3' (SEQ ID č. 38). Byl získán produkt o velikosti 259 bp s restrikčním místem HindlII na 3'-konci. Amplifikační produkt byl klonován do T-vektoru, sekvenován a ligován do kořeny preferované promotorové kazety obsahující VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici, kterážto kazeta byla rozštěpena BamHI/HindlII. Získaný konstrukt byl označen pCIB5527. Kódující oblast VIP2A(a) optimalizovaná pro kukuřici, ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, je uvedena jako SEQ ID č. 39. Kódovaný protein je uveden jako SEQ ID č. 40.

Příklad 24

Konstrukce a klonování genů VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizovaných pro kukuřici

Konstruování: Geny optimalizované pro kukuřici byly sestaveny pomocí reverzní translace nativních proteinových sekvencí VIPlA(a) a VIP2A(a) za použití kodónů, které jsou v kukuřici nej častěji používány (Murray a kol., Nucleic Acid Research, 17: 477 - 498 (1989)) . Pro usnadnění klonování byla DNA-sekvence dále modifikována začleněním jedinečných restrikčních míst ve vzdálenostech každých 200 - 360 nukleotidů. VIPlA(a) byl zkonstruován tak, aby byl klonován v 11 takových fragmentech a VIP2A(a) byl klonován v 5 fragmentech. Po klonování sousedící fragmenty spojeny jednotlivých fragmentů byly za použití restrikčních míst společných oběma fragmentům, za vzniku kompletního genu. Pro klonování každého fragmentu byly zkonstruovány oligonukleotidy o délce 50 - 85 nukleotidů představující jak horní tak dolní řetězec DNA. Horní oligonukleotid prvního páru oligonukleotidů byl zkonstruován tak, že měl na 3'-konci jednořetězcovou oblast o délce 15 bp, která byla homologická s podobnou jednořetězcovou oblastí dolního řetězce následujícího páru oligonukleotidů, pro řízení orientace a pořadí

128 různých párů oligonukleotidů v daném fragmentu. Oligonukleotidy byly rovněž zkonstruovány tak, že v případě, že jsou všechny oligonukleotidy představující fragment hybridizovány, jsou na koncích jednořetězcové oblasti odpovídající konkrétním restrikčním místům, která mají být vytvořena. Struktura každého oligomeru byla zkoumána pokud jde o stabilní sekundární struktury, jako jsou vlásenkové smyčky, za použití programu OLIGO firmy NBI lne. Kdekoli to bylo nutně, byly nukleotidy změněny pro snížení stability sekundární struktury aniž by došlo ke změně aminokyselinové sekvence proteinu. Na místo kodónu startujícího translaci v genu byla vložena rostlinná konvenční sekvence místa vázajícího se na ribozomy, TAAACAATG (Joshi a kol., Nucleic Acid Res., 15: 6643 - 6653 (1987)) nebo eukaryotická konvenční sekvence místa vázajícího se na ribozomy, CCACCATG (Kozák, Nucleic Acid Research, 12: 857 - 872 (1984)).

Klonování: Oligonukleotidy byly syntetizovány firmou IDT lne. , a byly dodány ve formě lyofilizovaných prášků. Byly resuspendovány ve 200 μΜ koncentraci. Ke 30 μΐ každého oligonukleotidu byl přidán formamid na konečnou koncentraci 25 - 50 % a vzorek byl vařen po dobu 2 minut před separací na předem připraveném 10% polyakrylamid/močovinovém gelu získaném od firmy Novex. Po elektroforéze byl oligomer detekován za použití ultrafialového světla pomocí umístění gelu na desku pro chromatografií na tenké vrstvě obsahující fluorescenční indikátor a osvícení ultrafialovým světlem. Oblast obsahující DNA o správné velikosti byla vyříznuta a extrahována z polyakrylamidu inkubací rozkouskovaného fragmentu gelu přes noc v pufru obsahujícím 0,4M chlorid lithný a 0,lmM kyselinu ethylendiamintetraoctovou. DNA byla separována ze zbytků gelu centrifugací přes filtr Millipore UFMC. Extrahovaná DNA byla vysrážena ethanolem pomocí přidání dvou objemu absolutního alkoholu. Po centrifugaci byl precipitát resuspendován v dH₂O v koncentraci 2,5 μιηοΐ. Fragmenty byly klonovány buďto hybridizaci oligonukleotidů a

129 ligací s vhodným vektorem nebo amplifikací hybridizovaného fragmentu za použití ekvimolární směsi všech oligonukleotidu pro konkrétní fragment jako matrice a koncově specifických primerů pro polymerasovou řetězovou reakci.

Klonování pomocí hybridizace a licrace: Homologické dvouřetězcové páry oligonukleotidu byly získány smícháním 5 μΐ horního a dolního oligomeru pro každý pár oligonukleotidů s pufrem obsahujícím lx polynukleotid-kinasový pufr (PNK-pufr) (70mM Tris-HCl o pH 7,6, lOmM chlorid hořečnatý, 5mM dithiothreitol (DTT)), 50mM chlorid draselný a 5 % formamidu, na konečný objem 50 μΐ. Oligonukleotidy byly vařeny po dobu 10 minut a pomalu ochlazeny na teplotu 37 °C nebo na teplotu místnosti. 10 μΐ bylo odebráno pro analýzu na 4% agarose v pufračním systému TAE (Metaphore, FMC) . Každý z hybridizovaných párů oligonukleotidů byl kinasován přidáním ATP na konečnou koncentraci 1 mmol, BSA na konečnou koncentraci 100 μg na ml, 200 jednotek polynukleotid-kinasy a 1 μΐ lOx PNK-pufru, v objemu 10 μΐ. Po hybridizací a fosforylaci byla reakční směs inkubována při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin přes noc. 10 μΐ každého párů oligonukleotidů pro konkrétní fragment bylo smícháno na konečný objem 50 μΐ. Páry oligonukleotidů byly hybridizovány zahřátím na teplotu 80 °C na dobu 10 minut a poté pomalým ochlazením na 37 °C. 2 μΐ oligonukleotidů byly smíchány s přibližně 100 ng příslušného vektoru a ligovány za oužití pufru obsahujícího 50mM Tris-HCl o pH 7,8, lOmM chlorid hořečnatý, lOmM dithiothreitol a 1 mM ATP. Reakční směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin až přes noc a transformována do kmene Escherichia coli DH5a, nanesen na L-desky obsahující ampicillin v 100 μρ/ιηΐ za použití standardních postupů.

Pozitivní klony byly dále charakterizovány a jejich struktura potvrzena za použití miniscreeningu pomocí polymerasové řetězové reakce, podrobně popsaného v EP-A 0618976, přičemž byly jako primery použity univerzální primery Reverse a M13-20. Pozitivní klony byly identifikovány pomocí který byl koncentraci

130 rozštěpení DNA příslušnými enzymy a následným sekvenováním.

Rekombinantní klony, které obsahovaly očekávanou DNA-sekvenci, byly poté vybrány pro další práci.

Amplifikace pomocí polymerasové řetězové reakce a klonování do T-vektoru: Amplifikace pomocí polymerasové řetězové reakce byla prováděna za použití směsi všech oligomerů, které představovaly horní a dolní řetězec konkrétního fragmentu (konečná koncentrace 5 mmol každého z nich) jako matrice, specifických koncových primerů pro konkrétní fragment (konečná koncentrace 2 /imol) , 200μΜ každého z dATP, dTTP, dCTP a dGTP, lOmM Tris-HCl o pH 8,3, 50mM chloridu draselného, l,5mM chloridu hořečnatého, 0,01% želatiny a 5 jednotek Taq-polymerasy v konečném objemu 50 μΐ. Amplifikační reakce byla prováděna v přístroji Perkin Elmer thermocycler 9600 inkubací při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty (1 cyklus) , s následujícími 20 cykly 95 °C po dobu 45 sekund, 50 °C po dobu 45 sekund a 72 °C po dobu 3 0 sekund. Nakonec byla před analýzou produktu reakční směs inkubována po dobu 5 minut při teplotě 72 °C. 10 μΐ reakčni směsi bylo analyzováno na 2,5% agarosovém gelu Nusieve (FMC) v pufračním systému TAE. Fragment o správné velikosti byl purifikován v gelu a použit pro klonování do klonovaciho vektoru pro polymerasovou řetězovou reakci nebo T-vektoru. Zkonstruování T-vektoru bylo provedeno jak popsali Marchuk a kol., Nucleic Acid Research, 19: 1154 (1991) . Jako rodičovský vektor byl použit pBluescriptsk+ (Stratagene, Kalifornie, USA). Transformace a identifikace správného klonu byla prováděna jak je popsáno výše.

Fragmenty VIPlA(a) č. 1, 3, 4, 5, 6, 8a9a fragmetny VIP2A(a) č. 2 a 4 byly získány klonováním amplifikačních produktů polymerasové řetězové reakce, zatímco fragmenty VIPlA(a) č. 2, 7, 10 a 11 a fragmenty VIP2A(a) č. 1, 3 a 5 byly získány pomocí hybridizace a ligace.

Jakmile byly získány fragmenty s požadovanou sekvencí,

131 byl sestaven kompletní gen klonováním sousedících fragmentů dohromady. Kompletní gen byl znovu sekvenován a byla testována jeho účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera před přenosem do expresívních vektorů pro rostliny obsahujících kořeny preferovaný promotor (popsaný v patentové přihlášce Spojených Států Amerických č. 08/017 209) a actin-promotor z rýže.

Jedním z takových expresívních vektorů pro rostliny je pCIB5521. Kódující oblast VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici (SEQ ID č. 26) byla klonována do expresívního vektoru pro rostliny, obsahujícího kořeny preferovaný promotor na 5-konci genu, s PEP-karboxylasovým intronem č. 9 následovaným 35S-terminátorem na 3'-konci. Tento plazmid rovněž obsahuje sekvence rezistence vůči ampicillinu z plazmidu pUC 19. Dalším expresívním vektorem pro rostliny je pCIB5522, který obsahuje kódující oblast VIP2A(a) optimalizovanou pro kukuřici (SEQ ID č. 27), fúzovanou s kořeny preferovaným promotorem na 5'-konci genu, s PEP-karboxylasovým intronem č. 9 následovaným 35S-terminátorem na 3'-konci.

Příklad 25

NAD-afinitní chromatografie

Byla použita purifikační strategie založená na afinitě VIP2 k substrátu NAD (nikotinamidadenindinukleotidu). Supernatant ze směsi, jejíž pH bylo upraveno natrium-citrátovým pufrem na hodnotu 3,5, popsaný v příkladu 4, byl dialyzován ve 20mM TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethanu) o pH 7,5 přes noc. Neutralizovaný supernatant byl přidán ke stejnému objemu promyté NAD-agarosy a inkubován za mírného třepání při teplotě 4 °C přes noc. Pryskyřice a proteinový roztok byly vneseny do polypropylenové kolony o objemu 10 ml a bylo umožněno, aby proteinový roztok vytekl. Kolona byla promyta

132

20mM TRIS o pH 7,5 v objemu rovnajícím se pětinásobku objemu kolony, 20mM TRIS o pH 7,5 se lOOmM chloridem sodným v objemu rovnajícím se dvou- až pětinásobku objemu kolony a poté 20mM TRIS o pH 7,5 v objemu rovnajícím se dvou- až pětinásobku objemu kolony. Proteiny VIP byly vymyty 2 0mM TRIS o pH 7,5 doplněným 5mM NAD. Byly odebrány promývací kapaliny o objemu rovnajícím se přibližně trojnásobku objemu kolony a byly zahuštěny na přístroji Centricon -10. Výtěžek typicky činí přibližně 7 - 15 gg proteinu na ml pryskyřice.

Při analýze purifikovaných proteinů pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu s následujícím obarvením stříbrem byly viditelné dva polypeptidy, jeden o molekulové hmotnosti přibližně 80000 a druhý o molekulové hmotnosti přibližně 45000. N-koncovým sekvenováním bylo zjištěno, že protein o molekulové hmotnosti 80000 odpovídá proteolyticky upravené formě VIPlA(a) a protein o molekulové hmotnosti 45000 odpovídá proteolyticky upravené formě VIP2A(a). Společná purifikace VIPlA(a) s VIP2A(a) svědčí o tom, že tyto dva proteiny pravděpodobně tvoří komplex a obsahují oblasti tvořící interakce protein-protein. Proteiny VIPlA(a) a VIP2A(a) purifikované tímto způsobem byly biologicky účinné proti Diabrotica virgifera virgifera.

Příklad 26

Exprese VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizovaných pro kukuřici

U kmenů Escherichia coli obsahujících různé plazmidy, které obsahují geny VIP, byla zkoumána exprese vegetativních insekticidních proteinů. Kmeny Escherichia coli obsahující jednotlivé plazmidy byly pěstovány přes noc v L-vývaru a exprimovaný protein byl extrahován z kultury jak je popsáno výše v příkladu 3. Exprimovaně proteiny byly zkoumány pomocí western blottingu za použití protilátek vytvořených pomocí standardních způsobů známých v oboru, podobných jako jsou

133 popsány výše v příkladu 12. Byla rovněž testována insekticidní účinnost exprimovaných proteinů proti Diabrotica virgifera virgifera, podle způsobu popsaného výše v příkladu

3. Výsledky testů exprese v Escherichia coli jsou uvedeny níže.

Exprese vegetativních insekticidních proteinů v Escherichia coli

extrakt kmene Escherichia coli obsahujícího uvedený plazmid	test č. 1 test č. 2 % mortality	detekován protein
kontrola	0	0	ne
pCIB5521 (VIPlA(a) optimalizovaný pro kukuřici)	47	27	ano
pCIB5522 (VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici)	7	7	ano
pCIB6024 (nativní VIP2A(a))	13	13	ano
pCIB6206 (nativní VIPlA(a) )	27	40	ano
kombinované extrakty pCIB5521 + pCIB5522	87	47
kombinované extrakty pCIB5521 + pCIB6024	93	100
kombinované extrakty pCIB5522 + pCIB6206	100	100
kombinované extrakty pCIB6024 + pCIB6206	100	100

DNA z těchto plazmidů byla použita pro dočasnou expresi vegetativních insekticidních proteinů pomocí expresívního systému pro protoplasty kukuřice. Protoplasty byly izolovány ze suspenzních kultur kukuřičné linie 2717 Line 6 pomocí rozštěpení buněčných stěn za použití enzymů Cellulase RS a

134

Macerase R10 v příslušném pufru. Protoplasty byly izolovány na sítech a centrifugací. Protoplasty byly transformovány pomocí standardního způsobu přímého přenosu genů za použití přibližně 75 μg plazmidové DNA a polyethylenglykolu PEG-40. Ošetřené protoplasty byly inkubovány přes noc ve tmě při teplotě místnosti. Pomocí western blottingu byla na protoplastových explantátech provedena analýza exprese vegetativních insekticidních proteinů a insekticidní účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera byla analyzována jak je popsáno výše v případě exprese v Escherichia coli. Výsledky testů exprese v kukuřičných protoplastech jsou uvedeny níže.

Exprese vegetativních insekticidních proteinů v rostlinných protoplastech

testovaný extrakt	test č. 1 test č. 2 % mortality	detekován protein
kontrola bez DNA	27	10	ne
pCIB5521 (p) (VIPlA(a) optimalizovaný pro kukuřici)	20 (0)	30	ano
pCIB5522 (p) (VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici)	20 (0)	20	ano
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB5522 (p)	87 (82)	90
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB5522 (e)	100	-
kombinované extrakty pCIB5522 (p) + pCIB5521 (p)	53 (36)
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB6024 (e)	100	-

135

testovaný extrakt	test č. 1	test č. 2	detekován
	% mortality	protein
kombinované extrakty pCIB5522 (p) + pCIB6206 (e)	100
pCIB6024 (e) (nativní VIP2A(a))	0	ano
pCIB6206 (e) (nativní VIPlA(a))	20	ano
pCIB5521 + pCIB5522 (plazmidy dodané kotransformací)	100	100	ano

Legenda :

(ρ) = extrakt protoplastové kultury transformované uvedeným plazmidem (e) = extrakt kmene Escherichia coli obsahujícího uvedený plazmid

Údaje o expresi získané jak s Escherichia coli tak s kukuřičnými protoplasty svědčí o tom, že geny VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizované pro kukuřici tvoří stejný protein jako nativní geny VIPlA(a) respektive VIP2A(a), a že proteiny kódované geny optimalizovanými pro kukuřici jsou funkčně ekvivalentní s proteiny, které jsou kódované nativními geny.

Všechny publikace a patentové přihlášky uvedené v tomto popisu určují úroveň odborníka v oboru, kterého se tento vynález týká. Obsah všech citovaných publikací a patentových přihlášek se považuje za odkazem začleněný do této přihlášky.

V patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA byly uloženy následující kultury:

136

označení kmene	číslo uložení	datum uložení
1. Escherichia coli PL2	NRRL B-21221	9. března 199
2. Escherichia coli PL2	NRRL B-21221N	2. září 1994
3. Escherichia coli pCIB6022	NRRL B-21222	9. března 199
4. Escherichia coli pCIB6023	NRRL B-21223	9. března 199
5. Escherichia coli pCIB6022	NRRL B-21223N	2. září 1994
6. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP	NRRL B-21224	9. března 199
7. Bacillus thuringiensis AB88	NRRL B-21225	9. března 199
8. Bacillus thuringiensis AB359	NRRL B-21226	9. března 199
9. Bacillus thuringiensis AB289	NRRL B-21227	9. března 199
10. Bacillus sp. AB59	NRRL B-21228	9. března 199
11. Bacillus sp. AB294	NRRL B-21229	9. března 199
12. Bacillus sp. AB256	NRRL B-21230	9. března 199
13. Escherichia coli P5-4	NRRL B-21059	18. března 199
14. Escherichia coli P3-12	NRRL B-21061	18. března 199
15. Bacillus cereus AB78	NRRL B-21058	18. března 199
16. Bacillus thuringiensis AB6	NRRL B-21060	18. března 199
17. Escherichia coli pCIB6202	NRRL B-21321	2. září 1994
18. Escherichia coli pCIB7100	NRRL B-21322	2. září 1994
19. Escherichia coli pCIB7101	NRRL B-21323	2. září 1994
20. Escherichia coli pCIB7102	NRRL B-21324	2. září 1994
21. Escherichia coli pCIB7103	NRRL B-21325	2. září 1994
22. Escherichia coli pCIB7104	NRRL B-21422	24. března 199
23. Escherichia coli pCIB7107	NRRL B-21423	24. března 199
24. Escherichia coli pCIB7108	NRRL B-21438	5. května 199
25. Bacillus thuringiensis AB424	NRRL B-21439	5. května 199

Ačkoli byl vynález v příkladech výše popsán detailně z důvodů ilustrace a jasnosti, je zřejmé, že je možné provést určité změny a modifikace v rámci připojených nároků.

137

Zobrazení sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 6049 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1082..2467 (D) další informace: produkt = VIP-2A(a) (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: různá vlastnost (B) lokace: 2475..5126 (D) další informace: poznámka = kódující sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 100 kDa. Tato kódující sekvence se opakuje v SEQ ID č. 4a translatuje se odděleně.

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

ATCGATACAA TGTTGTTTTA CTTAGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT 60

CTTTACTTTG ATACATTTTA ATAGCCATTT CAACCTTATC AGTATGTTTT TGTGGTCTTC 120

CTCCTTTTTT TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TT.AATCCTGT TTTGGTACGT TCGCTAATAA 180

TATCTCTTTC TAATTCTGCA ATACTTGCCA TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT 240

TAGAGGTATC AATGTTGTCA TGAATAGAAA TAAAATCTAC A.CCTAGCTCT TTGAATTTTT 300

CACTTAACTC AATTAGGTGT TTTGTAGAGC GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA 360

138

TCTTATCGCC	TTTACGTAAT	ACTTTTAGCA	ACTCTTCGAG	TTGAGGGCGC	TCTTTTTTTA	420
TTCCTGTTAT	TTTCTCCTGA	TATAGCCTTT	CTAGACCATA	TTGTTGCAAA	GCATCTATTT	480
GCATATCGAG	ATTTTGTTCT	TCTGTGCTGA	CACGAGCATA	ACCAAAAATC	AAATTGGTTT	540
CACTTCCTAT	CTAAA.TATAT	CTATTAAAAT	AGCACGAAAA	ACCTTATTAA	ATTAAAATAA	600
GGAACTTTGT	TTTTY^OSTaT	GGA.TTTTGGT	ACTCAATATG	GATGAGTTTT	TAACGCTTTT	660
GTTAAAAAAC	AAACAAGTGC	CA.TAAACGGT	CGTTTTTGGG	ATGACATAAT	AAATAATCTG	720
TTTGATTAAC	CTAACCTTGT	ATCCTTACAG	CCCAGTTTTA	TTTGTACTTC	AACTGACTGA	780
ATATGAAAAC	AACATGAAGG	TTTCATAAAA	TTTATATA-TT	TTCCATAACG	GATGCTCTAT	840
CTTTAGGTTA	TAGTTAAATT	ATAAGAAAAA	AACAAACGGA	GGGAGTGAAA	AAAAGGATCT	900
TCTCTATAAT	TTTACAGGCT	CTTTAATAAG	AAGGGGGGAG	ATTAGATAA.T	AAATATGAAT	960
ATCTATCTAT	AATTGTTTGC	TTCTACAATA	ACTTATCTAA	CTTTCATATA	CAAGAACAAA	1020
ACAGACTAAA	TCCAGATTGT	ATATTCATTT	TCAGTTGTTC	CTTTATAAAA	TAATTTCATA	1080

A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA 1126

Met Lys Arg Met Glu Gly Lvs Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu

5 ~ 10 15

CAA. GTA Gin Val

GTT Val

ACT AAA ACT GTA TTG

CTT AGT ACA GTT TTC TCT ATA TCT

1174

Thr

Lys 20

Thr

Val

Leu

Leu

Ser 25

Thr

Val

Phe

Ser

Ile 30

Ser

TTA

TTA

AAT

AAT

GAA

GTG

ATA

AAA

GCT

GAA.

CAA.

TTA

AAT

ATA

AAT

TCT

1222

Leu

Leu

Asn

Asn

Glu

Val

Ile

Lvs

Ala

Glu

Gin

Leu

A.sn

Ile

Asn

Ser

35

40

45

CAA

AGT

AAA

TAT

ACT

AAC

TTG

CAA

AAT

CTA

AAA

ATC

ACT

GAC

AAG

GTA

1270

Gin

Ser

Lys

Tyn

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

A.sp

Lys

Val

50

55

60

GAG

G4T

TTT

AAA

GAA

GA.T

AAG

GAA

AAA.

GCG

AAA

GAA

mr r~* i

GGG

AAA

GAA

1318

Glu

Asp

Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

65

70

75

AAA

GAA

AAA

GAG

TGG

AAA

CTA

ACT

GCT

ACT

GAA

AAA

GGA

AAA

ATG

AAT

1366

Lvs

Glu

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

80

85

90

95

AAT

TTT

TTA

GAT

AAT

AAA

AAT

GAT

ATA

AAG

ACA

AAT

TAT

AAA

GAA

ATT

1414

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

100

105

110

139

ACT TTT Thr Phe

TCT ATG GCA GGC TCA TTT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA AAA

1462

Ser

Mec 115

Ala

Gly Ser

Phe

Glu 120

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp 125

Leu

Lys

GAA

ATT

GAT

AAG

ATG

TTT

GAT

AAA

ACC

AAT

CTA

TCA

AAT

TCT

ATT

ATC

1510

Glu

Ile

Asp

Lys

Met

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

130

135

140

ACC

TAT

AAA.

AAT

GTG

GAA

CCG

ACA

ACA

ATT

GGA

TTT

AAT

AAA

TCT

TTA

1558

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

145

150

155

ACA

GAA

GGT

AAT

ACG

ATT

AAT

TCT

GAT

GCA

ATG

GCA

CAG

TTT

AAA

GAA .

1606

Thr

Glu

Gly

Asn

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

160

165

170

175

CAA

TTT

TTA

GAT

AGG

GAT

ATT

AAG

TTT

GAT

AGT

TAT

CTA

GAT

ACG

CAT

1654

C-ln

Phe

Leu

A.sp

Arg

Asp

Ile

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

180

185

190

TTA

ACT

GCT

CAA

CAA

GTT

TCC

AGT

AAA

GAA

AGA

GTT

ATT

TTG

AAG

GTT

1702

Leu

Thr

Ale

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

195

200

205

ACG

GTT

CCG

AGT

GGG

AAA

GGT

TCT

ACT

ACT

CCA

ACA

AAA

GCA

GGT

GTC

1750

Thr

Val

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

210

215

220

ATT

TTA

AAT

AAT

AGT

GAA

TAC

AAA

ATG

CTC

ATT

GAT

AAT

GGG

TAT

ATG

1798

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

225

230

235

GTC

CAT

GTA

GAT

AAG

GTA

TCA

AAA

GTG

GTG

AAA

AAA

GGG

GTG

GAG

TGC

1846

Vel

His

Val

Asp

Lys

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Val

Glu

Cys

240

245

250

255

TTA

CAA

ATT

GAA

GGG

ACT

TTA

AAA

AAG

AGT

CTT

GAC

TTT

AAA

AAT

GAT

1894

Leu

Gin

Ile

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

260

265

270

ATA

AAT

GCT

GAA

GCG

CAT

AGC

TGG

GGT

ATG

AAG

AAT

TAT

GAA

GAG

TGG

1942

Ile

Asn

Ala

Glu

Ala

His

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asn

Tyr

Glu

Glu

Trp

275

280

285

GCT

AAA

GAT

TTA

ACC

GAT

TCG

CAA

AGG

GAA

GCT

TTA

GAT

GGG

TAT

GCT

1990

Ala

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

290

295

300

AGG

CAA

GAT

TAT

AAA

GAA

ATC

AAT

AAT

TAT

TTA

AGA

AAT

CAA

GGC

GGA

2038

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

305

310

315

AGT

GGA

AAT

GAA

AAA

CTA

GAT

GCT

CAA

ATA

AAA

AAT

ATT

TCT

GAT

GCT

2086

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Gin

Ile

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

320

325

330

335

140

TTA Leu

GGG Gly

.AAG Lys

.AAA Lys

CCA ATA CCG GAA AAT ATT ACT GTG TAT AGA

TGG Trp 350

TGT Cys

2134

Pro 340

Ile

Pro Glu Asn

Ile 345

Thr

Val

Tyr

Arg

GGC

ATG

CCG

GAA

TTT

GGT

TAT

CAA

ATT

AGT

GAT

CCG

TTA

CCT

TCT

TTA

2182

Gly

Met

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

355

360

365

AAA

GAT

TTT

GAA

GAA

CAA

TTT

TTA

AAT

ACA

ATC

AAA

GAA

GAC

AAA

GGA

2230

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

370

375

380

TAT

ATG

AGT

ACA

AGC

TTA

TCG

AGT

GAA

CGT

CTT

GCA

GCT

TTT

GGA

TCT

2278

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

řla

Phe

Gly

Ser

385

390

395

AGA

AAA

ATT

ATA

TTA

CGA

TTA

CAA

GTT

CCG

AAA

GGA

AGT

ACG

GGT

GCG

2326

Arg

Lys

Ile

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

400

405

410

415

TAT

TTA

AGT

GCC

ATT

GGT

GGA

TTT

GCA

AGT

GAA

AAA

GAG

ATC

CTA

CTT

2374

Tyr

Leu

Ser

Ala

Ile

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

420

425

430

GAT

AAA

GAT

AGT

AAA

TAT

CAT

ATT

GAT

AAA

GTA

ACA

GAG

GTA

ATT

JTT

2422

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

Asp

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Ile

Ile

435

440

445

AAA

GGT

GTT

AAG

CGA

TAT

GTA

GTG

GAT

GCA

ACA

TTA

TTA

ACA

AAT

2467

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

450

455

460

TAAGGAGATG	AAAAATATGA	AGAAAAAGTT	AGCAAGTGTT	GTAACGTGTA	CGTTATTAGC	2527
TCCTATGTTT	TTGAATGGAA	ATGTGAATGC	TGTTTACGCA	GACAGCAAAA	CAAATCAAAT	2587
TTCTACAA.CA	CAGAAAAATC	AACAGAAAGA	GATGGACCGA	AAAGGATTAC	TTGGGTATTA	2647
TTTCAAAGGA	AAAGATTTTA	GTAATCTTAC	TATGTTTGCA	CCGACACGTG	ATAGTACTCT	2707
TATTTATGAT	CAACAAACAG	CAAATAAACT	ATTAGATAAA	AAACAAC.AAG	AATATCAGTC	2767
TATTCGTTGG	ATTGGTTTGA	TTCAGAGTAA	AGAAACGGGA	GATTTCACAT	TTAACTTATC	2827
TGAGGATGAA	CAGGCAATTA	TAGAAATCAA	TGGGAAAATT	ATTTCTAATA	AAGGGAAAGA	2887
flPAGCAAGTT	GTCCATTTAG	AAAAAGGAAA	ATTAGTTCCA	ATCAAAATAG	AGTATCAATC	2947
AGATACAAAA	TTTAATATTG	ACAGTAAAAC	ATTTAAAGAA	CTTAAATTAT	TTAAAATAGA	3007
TAGTCAAAAC	CAACCCCAGC	AAGTCCAGCA	AGATGAACTG	AGAAATCCTG	AATTTAACAA	3067
GAAAGAATCA	CAGGAATTCT	TAGCGAAACC	ATCGAAAATA	AATCTTTTCA	CTCAAAAAAT	3127
GAAALGGGAA	ATTGATGAAG	ACACGGATAC	GGATGGGGAC	TCTATTCCTG	ACCTTTGGGA	3187

141

AGAAAATGGG	TATACGATTC	ACAATAGAAT	CGCTGTAAAG	TGGGACGATT	CTCTAGCAAG	3247
TAAAGS3TAT	ACGAAATTTG	TTTCAAATCC	ACTAGAAAGT	CACACAGTTG	GTGATCCTTA	3307
TACAGATTAT	GAAAAGGCAG	CAAGAGATCT	AGATTTGTCA	AATGCAAAGG	AAACGTTTAA	3367
CCCATTGGTA	GCTGCTTTTC	CAAGTGTGAA	TGTTAGTATG	GAAAAGGTGA	TATTATCACC	3427
AAATGAAAAT	TTATCCAATA	GTGTAGAGTC	TCATTCATCC	ACGAATTGGT	CTTATACAAA	3487
TACAGAAGGT	GCTTCTGTTG	AAGCGGGGAT	TGGACCAAAA	GGTATTTCGT	TCGGAGTTAG	3547
CGTAAACTAT	CAACACTCTG	AAACAGTTGC	ACAAGAATGG	GGAACATCTA	CAGGAAATAC	3607
TTCGCAATTC	.AATACGGCTT	CAGCGGGATA	TTTAAATGCA	AATGTTCGAT	ATAACAATGT	3667
AGGAACTGGT	GCCATCTACG	ATGTAAAACC	TACAACAAGT	TTTGTATTAA	ATAACGATAC	3727
TATCGCAACT	ATTACGGCGA	aatctaattc	TACAGCCTTA	AATATATCTC	CTGGAGAAAG	3787
TTACCCGAAA	AAAGGACAAA	ATGGAATCGC	AATAACATCA	ATGGATGATT	TTAATTCCCA	3847
TCCGATTACA	TTAAATAAAA	AACAAGTAGA	TAATCTGCTA	AATAATAAAC	CTATGATGTT	3907
GSAAACAAAu	CAAACAGATG	gtgtttataa	GATAAAAGAT	ACACATGGAA	ATATAGTAAC	3967
TGGCGGAGAA	TGGAATGGTG	TCATACAACA	AATCAAGGCT	AAAACAGCGT	CTATTATTGT	4027
GGATGATGGG	GAACGTGTAG	CAGAAAAACG	TGTAGCGGCA	AAAGATTATG	AAAA.TCCAGA	4087
AGATAAAACA	CCGTCTTTAA	CTTTAAAAGA	TGCCCTGAAG	CTTTCATATC	CAGATGAAAT	4147
.AAAAGAAATA	GAGGGATTAT	TATATTATAA	AAACAAACCG	ATATACGAAT	CGAGCGTTAT	4207
GACTTACTTA	GATGAAAATA	CAGCAAAAGA	AGTGACCAAA	CAATTAAATG	ATACCACTGG	4267
GAAATTTAAA	GATGTAAGTC	ATTTATATGA	TGTAAAACTG	ACTCCAAAAA	TGAATGTTAC	4327
AATCAAATTG	TCTATACTTT	ATGATAATGC	TGAGTCTAAT	GATAACTCAA	TTGGTAAATG	4387
GACAAACACA	AATATTGTTT	CAGGTGGAAA	TAACGGAAAA	AAACAA.TATT	CTTCTAATAA	4447
TCCGGATGCT	AATTTGACAT	TAAATACAGA	TGCTCAAGAA	AAATTAAATA.	AAAATCGTGA	4507
CTATTATATA	AGTTTATATA	TGAAGTCAGA	.AAAAAACACA	CAATGTGAGA	TTACTATAGA	4567
TGGGGAGATT	TATCCGATCA	CTACAAAAAC	AGTGAATGTG	A4TAAAGACA	ATTACAAAAG	4627
ATTAGATATT	ATAGCTCATA	ATATAAAAAG	TAATCCAATT	TCTTCACTTC	ATATTAAAAC	4687
GAATGATGAA	ATAACTTTAT	TTTGGGATGA	TATTTCTATA	ACAGATGTAG	CATCAATAAA	4747
ACCGGAAAAT	TTAACAGATT	CAGAAATTAA	ACAGATTTAT	AGTAGGTATG	GTATTAAGTT	4807

142

AGAAGATGGA ATCCTTATTG ATAAAAAAGG TGGGATTCAT TATGGTGAAT TTATTAATGA 4867

AGCTAGTTTT AATATTGAAC CATTGCAAAA TTATGTGACC AAATATGAAG TTACTTATAG 4927

TAGTGAGTTA GGACCAAACG TGAGTGACAC ACTTGAAAGT GATAAAATTT ACAAGGATGG 4987

GACAATTAAA TTTGATTTTA CCAAATATAG TAAAAATGAA CAAGGATTAT TTTATGACAG 5047

TGGATTAAAT TGGGACTTTA AAATTAATGC TATTACTTAT GATGGTAAAG AGATGAATGT 5107

TTTTCATAGA TATAATAAAT AGTTATTATA TCTATGAAGC TGGTGCTAAA GATAGTGTAA 5167

AAGTTAATAT ACTGTAGGAT TGT.AATAAAA GTAATGGAAT TGATATCGTA CTTTGGAGTG 5227

GGGGATACTT TGTAAATAGT TCTATCAGAA ACATTAGACT AAGAAAAGTT ACTACCCCCA 5287

CTTGAAAATG AAGATTCAAC TGATTACAAA CAACCTGTTA AATATTATAA GGTTTTAACA 5347

AAATATTAAA CTCTTTATGT TAATACTGTA ATATAAAGAG TTTAATTGTA TTCAAATGAA 5407

GCTTTCCCAC AAAATTAGAC TGATTATCTA ATGAAATAAT CAGTCTAATT TTGTAGAACA 5467

GGTCTGGTAT TATTGTACGT GGTCACTAAA AGATATCTAA TATTATTGGG CAAGGCGTTC 5527

CATGATTGAA TCCTCGAATG TCTTGCCCTT TTCATTTATT TAAGAAGGAT TGTGGAGAAA 5587

TTATGGTTTA GATAATGAAG AAAGACTTCA CTTCTAATTT TTGATGTTAA ATAAATCAAA 5647

ATTTGGCGAT TCACATTGTT TAATCCACTG ATAAAACATA CTGGAGTGTT CTTAAAAAAT 5707

CAGCTTTTTT CTTTATAAAA TTTTGGTTAG CGTACGAAAT TCGTGTTTTG TTGGTGGGAC 5767

CCCATGCCCA TCAACTTAAG AGTAAATTAG TAATGAACTT TCGTTCATCT GGATT.AAAAT 5827

AACCTCAAAT TAGGACATGT TTTTAAAAAT AAGCAGACCA AATAAGCCTA GAATAGGT.AT 5887

CATTTTTAAA AATTATGCTG CTTTCTTTTG TTTTCCAAAT CCATTATACT CATAAGCAAC 5947

ACCCATAATG TCAAAGACTG TTTTTGTCTC ATATCGATAA GCTTGATATC GAATTCCTGC 6007

AGCCCGGGGG ATCCACTAGT TCTAGAGCGG CCGCCACCGC GG 6049

Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) (B) (D) délka: 462 aminokyselin typ: aminokyselinová topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

143

(xi)

znázornění

sekvence SEQ

ID

č.

2 :

Met Lys

Arg

Met

Glu

Gly

Lys

Leu

Phe

Met

Val

Ser

Lys

Lys

Leu

Gin

1

5

10

15

Val Val

Thr

Lys

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

lle

Ser

Leu

20

25

30

Leu Asn

Asn

Glu

Val

lle

Lys

Ala

Glu

Gin

Leu

Asn

lle

Asn

Ser

Gin

35

40

45

Ser Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

lle

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

50

55

60

Asp Phe

Lys

Glu

A.sp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

65

70

75

80

Glu Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

85

90

95

Phe Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

lle

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

lle

Thr

100

105

110

Phe Ser

Met

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

lle

Lys

Asd

Leu

Lys

Glu

115

120

125

lle Asp

Lys

Met

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

lle

lle

Thr

130

135

140

Tyr Lys

Asn

Val

Glu

Pro

Thr

Thr

lle

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

14 5

150

155

160

Glu Gly

Asn

Thr

lle

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

165

170

175

Phe Leu

Asp

Arg

Asp

lle

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

180

185

190

Thr Ala

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

lle

Leu

Lys

Val

Thr

195

200

205

Val Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

lle

210

215

220

Leu Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

lle

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

Val

225

2 30

235

240

His Val

Asp

Lys

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Val

Glu

Cys

Leu

245

250

255

Gin lle

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

lle

260

265

270

Asn Ala

Glu

Ala

His

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asn

Tyr

Glu

Glu

Trp

Ala

275

280

285

144

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

290

295

300

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

305

310

315

320

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Gin

Ile

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

325

330

335

Gly

Lys

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

340

345

350

Met

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

355

360

365

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

370

375

380

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Gly

Set

Arg

385

390

395

400

Lys

Ile

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Ser

Ala

Ile

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

420

425

430

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

Aso

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Ile

Ile

Lys

435

440

445

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

450 455 460

Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..20 (D) další informace: poznámka = signální

145 peptid pro cílení do vakuoly (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro lle Arg Val Thr Asp Arg 15 10 15

Ala Ala Ser Thr 20

Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

(ii)	typ molekuly: DNA (genomová)
(iii)	hypotetická: není
(iv)	anti-sense: není
(vi)	původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1..2652 (D) další informace: produkt - protein VIPlA(a) o velikosti 100 kDa, poznámka = = Tato sekvence je identická s části SEQ ID č. 1 mezi nukleotidy 2475 a 5126 včetně.

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:

ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu 465 470 475

146

TTA GCT CCT

ATG Met

TTT TTG

AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC

96

Leu

Ala 480

Pro

Phe

Leu

Asn Gly Asn 485

Val Asn

Ala 490

Val

Tyr

Ala

Asp

AGC

AAA

ACA

AAT

CAA

ATT

TCT

ACA

ACA

CAG

AAA

AAT

CAA

CAG

AAA

GAG

144

Ser

Lys

Thr

Asn

Gin

Ile

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys

Asn

Gin

Gin

Lys

Glu

495

500

505

510

ATG

GAC

CGA

AAA

GGA

TTA

CTT

GGG

TAT

TAT

TTC

AAA

GGA

AAA

GAT

TTT

192

Met

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp

Phe

515

520

525

AGT

AAT

CTT

ACT

ATG

TTT

GCA

CCG

ACA

CGT

GAT

AGT

ACT

CTT

ATT

TAT

240

Ser

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr

530

535

540

GAT

CAA

CAA

ACA

GCA

AAT

AAA

CTA

TTA

GAT

AAA

AAA

CAA

CAA

CAA

TAT

288

Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr

545

550

555

CAG

TCT

ATT

CGT

TGG

ATT

GGT

TTG

ATT

CA.G

AGT

AAA

CAA

ACG

GGA

CAT

336

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

560

565

570

TTC

ACA

TTT

AAC

TTA

TCT

GAG

GAT

GAA

CAG

GCA

ATT

ATA

GAA

ATC

AAT

384

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Asp

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile

.Asn

575

580

585

590

GGG

AAA

ATT

ATT

TCT

AAT

AAA

GGG

AAA

GAA

AAG

CAA

GTT

GTC

CAT

TTA

432

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

595

600

605

GAA

AAA

GGA

AAA

TTA

GTT

CCA

ATC

AAA

ATA

GAG

TAT

CAA

TCA

GAT

ACA

480

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

Val

Pro

Ile

Lys

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr

610

615

620

AAA

TTT

AAT

ATT

GAC

AGT

AAA

ACA

TTT

AAA

GAA

CTT

AAA

TTA

TTT

AAA

528

Lys

Phe

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys

625

630

635

ATA

GAT

AGT

CAA

AAC

CAA

CCC

CAG

CAA

GTC

CAG

CAA

CAT

GAA

CTG

ACA

576

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin

Val

Gin

Gin

Asp

Glu

Leu

Arg

640

645

650

AAT

CCT

GAA

TTT

AAC

AAG

AAA

GAA

TCA

CAG

GAA

TTC

TTA

GCG

.AAA

CCA

624

Asn

Pro

Glu

Phe

.Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys

Pro

655

660

665

670

TCG

AAA

ATA

AAT

CTT

TTC

ACT

CAA

AAA

ATG

AAA

AGG

CAA

ATT

CAT

CAA

672

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin

Lys

Met

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

675

680

685

GAC

ACG

GAT

ACG

GAT

GGG

GAC

TCT

ATT

CCT

GAC

CTT

TGG

GAA

GAA

AAT

720

Asp

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

690

695

700

147

GGG TAT ACG ATT CAA

AAT AGA

ATC GCT GTA .AAG TGG GAC GAT TCT CTA

768

Gly Tyr Thr 705

Ile

Gin

Asn

Arg

Ile 710

Ala

Val

Lys

Trp

Asp Asp 715

Ser

Leu

GCA AGT AAA

GGG

TAT

ACG

.AAA

TTT

GTT

TCA

AAT

CCA

CTA

G.AA

AGT

CAC

816

Ala Ser Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

720

725

730

ACA GTT GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT

TAT

GAA

. AAG

GCA

GCA

AGA

GAT

CTA

864

T.nr Val Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

' Leu

735

740

745

750

GAT TTG TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG

TTT

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

GCT

TTT

912

Asp Leu Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

755

760

765

CCA AGT GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

960

Pro Ser Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

770

775

780

AAT TTA TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

1008

Asn Leu Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

785

790

795

ACA AAT ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT

GAA

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

1056

Thr Asn Thr

Glu

Gly

AJLa

Ser

Val

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

800

805

810

ATT TCG TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC

TAT

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA

GTT

GCA

1104

Ile Ser Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

815

820

825

830

CAA GAA TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

1152

Gin Glu Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

835

840

845

TCA GCG GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

1200

Ser Ala Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

850

855

860

GGT GCC ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

1248

Gly A2_a Ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

865

870

875

GA.T ACT ATC

GCA

ACT

ATT

ACG

GCG

AAA

TCT

AAT

TCT

ACA

GCC

TTA

AAT

1296

Aso Thr Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

880

885

890

ATA TCT CCT

GGA

GAA

AGT

TAC

CCG

AAA

AAA

GGA

CAA

AAT

GGA

ATC

GCA

1344

Ile Ser Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile

Ala

895

900

905

910

ATA ACA TCA

ATG

GAT

GAT

TTT

AAT

TCC

CAT

CCG

ATT

ACA

TTA

AAT

AAA

1392

Ile Thr Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

915 920 925

148

AAA CAA GTA

GAT AAT CTG CTA AAT AAT AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA

1440

lys Gin

Val

Asp 930

Asn Leu

Leu

Asn

Asn 935

Lys

Pro

Met

Met

Leu 940

Glu

Thr

AAG CAA

ACA

GAT

GGT GTT

TAT

AAG

ATA

AAA

GAT

ACA

CAT

GGA

AAT

ATA

1488

Asn Gin

Thr 945

Asp

Gly Val

Tyr

Lys 950

lle

Lys

Asp

Thr

His 955

Gly

Asn

lle

GTA ACT

GGC

GGA

GAA TGG

AAT

GGT

GTC

ATA

CAA

CAA

ATC

AAG

GCT

AAA

1536

Val Thr 960

Gly

Gly

Glu Trp

Asn 965

Gly

Val

lle

Gin

Gin 970

lle

Lys

Ala

Lys

ACA GCG

TCT

ATT

ATT GTG

GAT

GAT

GGG

GAA

CGT

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

1584

Thr Ala 975

Ser

lle

lle Val 980

Asp

Asp

Gly

Glu

Arg 985

Val

Ala

Glu

Lys

Arg 990

GTA GCG

GCA

.AAA

GAT TAT

GAA

AAT

CCA

GAA

GAT

AAA

ACA

CCG

TCT

TTA

1632

Val Ala

Ala

Lys

Asp Tyr 995

Glu

Asn

Pro

Glu Asp 1000

Lys

Thr

Pro

Ser Leu 1005

ACT TTA

.AAA

GAT

GCC CTG

AAG

CTT

TCA

TAT

CGA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

1680

Thr Leu

Lys

Asp Ala Leu 1010

Lys

Leu

Ser Tyr 1015

Pro

Asp

Glu

lle Lys 1020

Glu

ATA GAG

GGA

TTA

TTA TAT

TAT

AAA

AAC

AAA

CCG

ATA

TAC

GAA

TCG

AGC

1728

lle Glu

Gly Leu 1025

Leu Tyr

Tyr

Lys Asn 1030

Lys

Pro

lle

Tyr Glu 1035

Ser

Ser

GTT ATG

ACT

TAC

TTA GAT

GAA

AAT

ACA

GCA

AAA

GAA

GTG

ACC

AAA

GAA

1776

Val Met Thr 1040

Tyr

Leu Asp

Glu Asn 1045

Thr

Ala

Lys

Glu Val 1050

Thr

Lys

Gin

TTA AAT

GAT

ACC

ACT GGG

AAA

TTT

AAA

GAT

GTA

AGT

CAT

TTA

TAT

GAT

1824

Leu Asn 1055

Asp

Thr

Thr Gly Lys 1060

Pne

Lys

Asp

Val Ser 1065

His

Leu

Tyr

Asd 1070

GTA AAA

CTG

ACT

CCA AAA

ATG

AAT

GTT

AGA

ATC

AAA

TTG

TCT

ATA.

CTT

1872

Val Lys

Leu

Thr

Pro Lys 1075

Met

Asn

Val

Thr lle 1080

Lys

Leu

Ser

lle Leu 1085

TAT GAT

AAT

GCT

GAG TCT

AAT

GAT

AAC

TCA

ATT

GGT

AAA

TGG

ACA

AAC

1920

Tyr Asp

Asn

Ala 109C

Glu Ser )

Asn

Asp

Asn 1095

Ser

lle

Gly

Lys

Trp noc

Thr )

Asn

ACA AAT

ATT

GTT

TCA GGT

GGA

AAT

AAC

GGA

AAA

AAA

CAA

TAT

TCT

TCT

1968

Thr Asn

lle 1105

Val I

Ser Gly

Gly

Asn nic

Asn 1

Gly

Lys

Lys

Gin 1115

Tyr I

Ser

Ser

AAT AAT

CCG

GAT

GCT .AAT

TTG

ACA

TTA

AAT

AGA

GAT

GCT

CAA

GAA,

AAA

2016

Asn Asn

Pro

Asp

Ala Asn

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

1120 1125 1130

149

TTA AAT ΑΛΑ AAT CGT GAC TAT Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr	TAT ATA AGT TTA TAT	ATG AAG TCA G~A	2064
Tyr	lle	Ser	Leu Tyr 1145	Met	Lys	Ser	Glu 1150
1135	1140
AAA AAC ACA CAA TGT	GAG ATT	ACT	ATA	GAT	GGG GAG	ATT	TAT	CCG	ATC	2112
Lys Asn Thr Gin Cys	Glu lle	Thr	lle	Asp	Gly Glu	lle	Tyr	Pro	lle
1155			1160			1165
ACT ACA ΑΛΑ ACA GTG	AAT GTG	AAT	A*\A	GAC	AAT TAC	AAA	AGA	TTA	GAT	2160
Thr Thr Lys Thr Val	Asn Val	Asn	Lys	Asp	Asn Tyr	Lys	Arg	Leu	Asp
1170			1175			1180
ATT ATA GCT CAT AAT	ATA AAA	AGT	AAT	CCA	ATT TCT	TCA	CTT	CAT	ATT	2208
lle lle Ala His Asn	lle Lys	Ser	Asn	Pro	lle Ser	Ser	Leu	His	lle
1185		1190			1195
AAA ACG A4T GAT GAA	ATA ACT	TTA	TTT	TGG	GAT GAT	ATT	TCT	ATA	ACA	2256
Lys Thr Asn Asp Glu	lle Thr	Leu	Phe	Trp	Asp Asp	lle	Ser	lle	Thr

1200 1205 1210

GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT TTA ACA GAT TCA	GAA ATT AAA	2304
Asp Val 1215	Ala Ser	lle Lys Pro 1220	Glu	Asn	Leu	Thr Asp 1225	Ser	Glu lle	Lys 1230
CAG ATT	TAT AGT	AGG TAT GGT	ATT	AAG	TTA	GAA GAT	GGA	ATC CTT	ATT	2352
Gin lle	Tyr Ser	Arg Tyr Gly 1235	lle	Lys	Leu Glu Asp 1240	Gly	lle Leu lle 1245
GAT AAA	AAA GGT	GGG ATT CAT	TAT	GGT	GAA	TTT ATT	AAT	GAA GCT	AGT	2400
.Asp Lys	Lys Gly Gly lle His 1250	Tyr	Gly Glu 1255	Phe lle	Asn	Glu Ala 1260	Ser
TTT .AAT	ATT GAA	CCA TTG CAA	AAT	TAT	GTG	ACC AAA	TAT	GAA GTT	ACT	2448
Phe Asn	lle Glu 1265	Pro Leu Gin	Asn Tyr 1270	Val	Thr Lys	Tyr Glu Val 1275	Thr
TAT AGT	AGT GAG	TTA GGA CCA	AAC	GTG	AGT	GAC ACA	CTT	GAA AGT	GAT	2496
Tyr Ser Ser Glu 1280	Leu Gly Pro Asn 1285	Val	Ser	Asp Thr Leu 1290	Glu Set	Asp
AAA ATT	TAC AAG	GAT GGG ACA	ATT	AAA	TTT	GAT TTT	ACC	AAA TAT	AGT	2544
Lys lle 1295	Tyr Lys	Asp Gly Thr 1300	lle	Lys	Phe	Asp Phe 1305	Thr	Lys Tyr	Ser 1310
AAA AAT	GAA CAA	GGA TTA TTT	TAT	GAC	AGT	GGA TTA	AAT	TGG GAC	TTT	2592
Lys Asn	Glu Gin	Gly Leu Phe 1315	Tyr	Asp	Ser 1320	Gly Leu 1	Asn	Trp Asp 1325	Phe 1
A.AA ATT	AAT GCT	ATT ACT TAT	GAT	GGT	AAA	GAG ATG	AAT	GTT TTT	CAT	2640
Lys lle	Asn Ala 1330	lle Thr Tyr	Asp	Gly 1335	Lys	Glu Met	Asn	Val Phe 1340	His

AGA TAT AAT AAA TAG Arg Tyr Asn Lys

1345

2655

150

Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 884 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:

Met 1

Lys tón

Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser

Val

Val Thr Cys

Thr 15

Leu

5

10

Leu

Ada

Pro

Met

Phe

Leu

Asn

Gly

tón

Val

Asn

Ala

Val

Tyr

Ala

Asp

20

25

30

Ser

Lys

Thr

A.sn

Gin

Ile

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys

Arsn

Gin

Gin

Lys

Glu

35

40

45

Met

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp

Phe

50

55

60

Ser

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr

65

70

75

80

Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr

85

90

95

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

100

105

110

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Asp

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile

Asn

115

120

125

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

tón

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

130

135

140

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

Val

Pro

Ile

Lys

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr

145

150

155

160

Lys

Phe

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys

165

170

175

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin

Val

Gin

Gin

Asp

Glu

Leu

Arg

180

185

190

Asn

Pro

Glu

Phe

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

.Ala

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin

Lys

Met

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

210

215

220

151

Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp

Ser

Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn

225

230

235

240

Gly

Tyr

Thr

Ile

Gin

Asn

Arg

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

245

250

255

Ala

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

260

265

270

Thr

Val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

275

280

285

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

290

295

300

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

305

310

315

320

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

325

330

335

Thr

.Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

340

345

350

Ile

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

355

360

365

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

370

375

380

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

385

390

395

400

Gly

Ala

Ile

Tyr

A.sp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

405

410

415

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

420

425

430

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile

Ala

435

440

445

Ile

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

450

455

460

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

465

470

475

480

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys

Ile

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

485

4 90

495

Val

Thr

Gly

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

Val

Ile

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys

500 505 510

Thr Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg 515 520 525

152

Val

Ala

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser

Leu

530

535

540

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

lle

Lys

Glu

54 5

550

555

560

lle

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

Lys

Pro

lle

Tyr

Glu

Ser

Ser

565

570

575

Val

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

Ala

Lys

Glu

val

Thr

Lys

Gin

580

585

590

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

595

600

605

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

Thr

lle

Lys

Leu

Ser

lle

Leu

610

615

620

Tyr

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

lle

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn

625

630

635

640

Thr

Asn

lle

Val

Ser

Gly

Gly

Asn

A.sn

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

645

650

655

Asn

Asn

Pro

Asp

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

660

665

670

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

lle

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

675

680

685

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

Glu

lle

Thr

lle

A.sp

Gly

Glu

lle

Tyr

Pro

lle

690

695

700

Thr

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

Asp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

705

710

715

720

lle

lle

Ala

His

Asn

lle

Lys

Ser

Asn

Pro

lle

Ser

Ser

Leu

His

lle

725

730

735

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

lle

Thr

Leu

Phe

Trp

Asp

Asp

lle

Ser

lle

Thr

740

745

750

Asp

Val

Ala

Ser

lle

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

lle

Lys

755

760

765

Gin

lle

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

lle

Lys

Leu

Glu

Asp

Gly

lle

Leu

lle

770

775

780

Asp

Lys

Lys

Gly

Gly

lle

His

Tyr

Gly

Glu

Phe

lle

Asn

Glu

Ala

Ser

785

790

795

800

Phe

Asn

lle

Glu

Pro

Leu

Gin

Asn

Tyr

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

805 810 815

Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp 820 825 830

153

Lys Lys

Ile Tyr 835 Asn Glu 850

Lys Asp Gly Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr

Lys Trp

Tyr Asp

Ser Phe

Gin

Gly Leu

Phe 855

840

Gly

Leu 860

84 5 Asn

Tyr

Asp

Ser

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

865

870

875

880

Arg Tyr Asn Lys

Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2004 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární

(ii)	typ molekuly: DNA	(genomová)
(lil)	hypotetická: není
(iv)	anti-sense: není
(vi)	původní zdroj: (A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21
(ix)	vlastnosti:

(A)	jméno /	klíč: CDS
(B)	lokace:	1 . .2001
(D)	další informace: produkt = protein
	VIPlA(a)	o velikosti 80 kDa, poznámka

= Tato sekvence je identická se sekvenc

SEQ ID č. 1 mezi nukleotidy 3126 a 5126 včetně.

154 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:

ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT

48

Met 885

Lys

Arg Glu

lle Asp 890

Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle

895

900

CCT

GAC

CTT

TGG

GAA

GAA

AAT

GGG

TAT

ACG

ATT

CAA

AAT

AGA

ATC GCT

96

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr

lle

Gin

Asn

Arg

lle Ala

905

910

915

GTA

AAG

TGG

GAC

GAT

TCT

CTA

GCA

AGT

AAA

GGG

TAT

ACG

AAA

TTT GTT

144

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe Val

920

925

930

TCA

AAT

CCA

CTA

GAA

AGT

CAC

ACA

GTT

GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT TAT

192

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp Tyr

935

940

945

GAA

AAG

GCA

GCA

AGA

GAT

CTA

GAT

TTG

TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG TTT

240

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr Phe

950

955

960

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

GCT

TTT

CCA

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA. AAG

288

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu Lys

965

970

975

980

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

AAT

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT GAT

336

Val

lle

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser His

985

990

995

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

ACA

AAT

ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT GAA

384

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val Glu

1000

1005

1010

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

ATT

TCG

TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC TAT

432

Ala

Gly

lle

Gly

Pro

Lys

Gly

lle

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn Tyr

1015

1020

1025

CAA

CAC

TCT

GAA

AGA

GTT

GCA

CAA

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA AAT

480

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly .Asn

1030

1035

1040

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

TCA

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT GTT

528

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

A.sn Val

1045

1050

1055

1060

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

GGT

GCC

ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT ACA

576

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val 1065

Gly

Thr

Gly

Ala

lle 107C

Tyr 1

A^p

Val

Lys

Pro Thr 1075

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

GAT

ACT

ATC

GGA

ACT

ATT

ACG

GCG .AAA

Thr

Ser

Phe

Val 1080

Leu

Asn

Asn

Asp

Thr 1085

lle

AGa

Thr

lle

Thr 1090

Ala Lys 1

155

TCT AAT Ser Asn	TCT ACA GCC TTA AAT ATA TCT CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA Ser Thr Ala Leu Asn Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys	672
1095	1100	1105
AAA GGA	CAA AAT	GGA ATC GCA ATA ACA TCA	ATG GAT GAT TTT AAT TCC	720
Lys Gly Gin Asn 1110	Gly Ile Ala Ile Thr Ser 1115	Met Asp Asp Phe Asn Ser 1120
CAT CCG	ATT ACA	TTA AAT AAA AAA CAA GTA	GAT AAT CTG CTA AAT AAT	768
His Pro 1125	Ile Thr	Leu Asn Lys Lys Gin Val 1130	Asp Asn Leu Leu Asn Asn 1135 1140
AAA CCT	ATG ATG	TTG GAA ACA AAC CAA ACA	GAT GGT GTT TAT AAG ATA	816
Lys Pro	Met Met	Leu Glu Thr Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile 1145 1150 * 1155
AAA GAT	ACA CAT	GGA AAT ATA GTA ACT GGC	GGA G.AA TGG AAT GGT GTC	864
Lys Asp	Thr His Gly Asn Ile Val Thr Gly 1160 1165	Gly Glu Trp Asn Gly Val 1170
ATA CAA	CAA ATC	AAG GCT AAA ACA GCG TCT	ATT ATT GTG GAT GAT GGG	912
Ile Gin	Gin Ile 1175	Lys Ala Lys Thr Ala Ser 1180	Ile Ile Val Asp Aso Gly 1185
GAA CGT	GTA GCA	GAA AAA CGT GTA GCG GCA	AAA GAT TAT GAA AAT CCA	960
Glu Arg Val Ala 1190	Glu Lys Arg Val Ala Ala 1195	Lys Asp Tyr Glu Asn Pro 1200
GAA GAT	AAA ACA	CCG TCT TTA ACT TTA AAA	GAT GCC CTG AAG CTT TCA	1008
Glu Asp 1205	Lys Thr	Pro Ser Leu Thr Leu Lys 1210	Asp Ala Leu Lys Leu Ser 1215 1220
TAT CCA	GAT GAA	ATA AAA GAA ATA GAG GGA	TTA TTA TAT TAT AAA AAC	1056
Tyr Pro	Asp Glu	Ile Lys Glu Ile Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn 1225 1230 1235
AAA CCG	ATA TAC	GAA TCG AGC GTT ATG ACT	TAC TTA GAT GAA AAT ACA	1104
Lys Pro	Ile Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr 1240 1245	Tyr Leu Asp Glu Asn Thr 1250
GCA AAA	GAA GTG	ACC AAA CAA TTA AAT GAT	ACC ACT GGG AAA TTT AAA	1152
Ala Lys	Glu Val 1255	Thr Lys Gin Leu Asn Asp 1260	Thr Thr Gly Lys Phe Lys 1265
GAT GTA	AGT CAT	TTA TAT GAT GTA AAA CTG	ACT CCA AAA ATG AAT GTT	1200
Asp Val 127C	Ser His )	Leu Tyr Asp Val Lys Leu 1275	Thr Pro Lys Met Asn Val 1280
ACA ATC	AAA TTG	TCT ATA CTT TAT GAT AAT	GCT GAG TCT AAT GAT AAC	1248
Thr Ile 1285	Lys Leu	Ser Ile Leu Tyr Asp Asn 1290	Ala Glu Ser Asn Asp Asn 1295 * 1300
TCA ATT	GGT AAA	TGG ACA AAC ACA AAT ATT	GTT TCA GGT GGA AAT AAC	1296
Ser Ile	Gly Lys	Trp Thr Asn Thr Asn Ile 1305 1310	Val Ser Gly Gly Asn Asn 1315

156

GGA AAA AAA Gly Lys Lys	CAA TAT Gin Tyr 1320	TCT TCT AAT AAT CCG GAT GCT AAT TTG ACA TTA Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu	1344
1325	1330
AAT ACA GAT	GCT CAA	GAA AAA TTA AAT AAA AAT	CGT GAC TAT TAT ATA	1392
Asn Thr Asp Ala Gin 1335	Glu Lys Leu Asn Lys Asn 1340	Arg Asp Tyr Tyr Ile 1345
AGT TTA TAT	ATG AAG	TCA GAA AAA AAC ACA CAA	TGT GAG ATT ACT ATA	1440
Ser Leu Tyr 1350	Met Lys	Ser Glu Lys Asn Thr Gin 1355	Cys Glu Ile Thr Ile 1360
GAT GGG GAG	ATT TAT	CCG ATC ACT ACA AAA ACA	GTG AAT GTG AAT AAA	1488
Asp Gly Glu 1365	Ile Tyr	Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys 1370 1375 1380
GAC AAT TAC	AAA AGA	TTA GAT ATT ATA GCT CAT	AAT ATA AAA AGT AAT	1536
Asp Asn Tyr	Lys Arg Leu Asp Ile Ile Ala His 1385 1390	Asn Ile Lys Ser Asn 1395
CCA ATT TCT	TCA CTT	CAT ATT AAA ACG AAT GAT	GA« ΛΤΑ ACT TTA TTT	1584
Pro Ile Ser	Ser Leu 1400	His Ile Lys Thr Asn Asp 1405	Glu Ile Thr Leu Phe 1410
TGG GAT GAT	ATT TCT	ATA ACA GAT GTA GCA TCA	ATA AAA CCG GAA AAT	1632
Trp Asp Asp Ile Ser 1415	Ile Thr Asp Val Ala Ser 1420	Ile Lys Pro Glu Asn 1425
TTA ACA GAT	TCA GAA	ATT AAA CAG ATT TAT AGT	AGG' TAT GGT ATT AAG	1680
Leu Thr Asp 1430	Ser Glu	Ile Lys Gin Ile Tyr Ser 1435	Arg Tyr Gly Ile Lys 1440
TTA GAA GAT	GGA ATC	CTT ATT GAT AAA AAA GGT	GGG ATT CAT TAT GGT	1728
Leu Glu Asp 1445	Gly Ile	Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly 1450 1455 1460
GAA TTT ATT	AAT GAA	GCT AGT TTT AAT ATT GAA	CCA TTG CCA AAT TAT	1776
Glu Phe Ile	Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu 1465 1470	Pro Leu Pro Asn Tyr 1475
GTG ACC AAA	TAT GAA	GTT ACT TAT AGT AGT GAG	TTA GGA CCA AAC GTG	1824
Val Thr Lys	Tyr Glu 1480	Val Thr Tyr Ser Ser Glu 1485	Leu Gly Pro Asn Val 1490
AGT GAC ACA	CTT GAA	AGT GAT AAA ATT TAC AAG	GAT GGG ACA ATT AAA	1872
Ser Asp Thr 1495	Leu Glu i	Ser Asp Lys Ile Tyr Lys 1500	Asp Gly Thr Ile Lys 1505
TTT GAT TTT	ACC AAA	TAT AGT AAA AAT GAA CAA	GGA TTA TTT TAT GAC	1920
Phe .Asp Phe 1510	Thr Lys	Tyr Ser Lys Asn Glu Gin 1515	Gly Leu Phe Tyr Asp 1520
AGT GGA TTA	AAT TGG	GAC TTT AAA ATT AAT GCT	ATT ACT TAT GAT GGT	1968
Ser Gly Leu 1525	Asn Trp	Asp Phe Lys Ile Asn Ala 1530 1535	Ile Thr Tyr Asp Gly 1540

157

AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT AGA TAT AAT AAA TAG Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys

1545 1550

2004

Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 667 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:

Mec 1

Lys

Arg

Glu

Ile 5

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp 10

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser 15

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp 20

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr 25

Thr

Ile

Gin

Asn

Arg 30

Ile

Ala

Val

Lys

Trp 35

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala 40

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr 45

Lys

Phe

Val

Ser

Asn 50

Pro

Leu

Glu

Ser

His 55

Thr

Val

Gly

Asp

Pro 60

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu 65

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp 70

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn 75

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe 80

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

90 95

Val

Ile

Leu

Ser 100

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu 105

Ser

Asn

Ser

Val

Glu 110

Ser

His

Ser

Ser

Thr 115

A.sn

Trp

Ser

Tyr

Thr 120

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala 125

Ser

Val

Glu

Ala

Gly 130

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly 135

Ile

Ser

Phe

Gly

Val 140

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin 145

His

Ser

Glu

Thr

Val 150

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly 155

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn 160

Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val 165 170 175

158

Are

Tyr

Asn .Asn Val 180

Gly

Thr Gly Ala 185

lle Tyr Asp

Val

Lys 190

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

A.sn

Asn

Asp

Thr

lle

Ala

Thr

lle

Thr

Ala

Lys

195

200

205

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

lle

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

210

215

220

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

lle

A2La

lle

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

225

230

235

240

His

Pro

lle

Thr

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

245

250

255

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys

lle

260

265

270

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

lle

Val

Thr

Gly

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

Val

275

280

285

lle

Gin

Gin

lle

Lys

Ala

Lys

Thr

Ala

Ser

lle

lle

Val

Asp

Asp

Gly

290

295

300

Glu

~rg

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro

305

310

315

320

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

325

330

335

Tyr

Pro

Asp

Glu

lle

Lys

Glu

lle

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

340

345

350

Lys

Pro

lle

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

355

360

365

Ala

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

370

375

380

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

385

390

395

400

Thr

lle

Lys

Leu

Ser

lle

Leu

Tyr

Asp

Asn

AGa

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

405

410

415

Ser

lle

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn

Thr

Asn

lle

Val

Ser

Gly

Gly

Asn

Asn

420

425

430

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

Asn

Asn

Pro

A.sp

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

435

440

445

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

lle

450

455

460

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

Glu

lle

Thr.

lle

465

470

475

480

159

ASp

Gly Glu Ile

Tyr Pro 485

Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys

4 90

4 95

Asp

A.sn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

Ile

Ile

Ala

His

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

500

505

510

Pro

Ile

Ser

Ser

Leu

His

Ile

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe

515

520

525

Trp

Asp

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

A.sn

530

535

540

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Lys

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

Leu

Glu

Asp

Gly

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Lys

Gly Gly

Ile

His

Tyr

Gly

565

570

575

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Ala

Ser

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

580

585

590

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

595

600

605

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

610

615

620

Phe

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr

Ser

Lys

A.sn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

625

630

635

640

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

64 5

650

655

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

Arg

Tyr

Asn

Lys

660

665

Informace o

sekvenci

SEQ

1 ID

č .

8 :

(i)

charakteristiky

sekvence:

(A)

délka:

16

aminokyselin

(B)

typ

>: aminokyselinová

(C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ií) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není

160 (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..16 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence proteinu purifikovaného z kmene AB78 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:

Lys Arg Glu lle Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly A.sp Ser lle Pro 1 5 10 * 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

(ii)	typ molekuly: DNA	(genomová)
(iii)	hypotetická: není
(iv)	anti-sense: není
(ix)	vlastnosti: (A) jméno / klíč	: různá vl

(B) lokace: 1..21 (D) další informace: poznámka = oligonukleoti dová sonda na bázi aminokyselin 3 až 9 v SEQ ID č. 8, s využitím znalosti použití kodónů Bacillus thuringiensis

161 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:

GAAATTGATC AAGATACNGA T 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..14 (D) další informace: poznámka = N-koncová aminokyselinová sekvence proteinu známého jako anexová frakce 23 (menší) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:

Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 13 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová

162 (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:

Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa 1 5 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro 15 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis

163 (B) kmen: ΑΒ88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..15 (D) další informace: poznámka = N-koncová ami nokyselinová sekvence VIP o velikosti 35 kDa účinného proti Agrotis ipsilon (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:

Ada Leu Ser Glu A.sn Thr Gly Lys A.sp Gly Gly Tyr Ile Val Pro 15 10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu 1 5

Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není

164 (v) typ fragmentu: N-koncový (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..9 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence δ-endotoxinu o velikosti 80 kDa (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu

5

Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 11 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..11 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence δ-endotoxinu o velikosti 60 kDa (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:

Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile 15 10

165

Informace o sekvenci

SEQ ID č.

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..2652 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 100 kDa z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:

ATGAAGAACA	TGAAGAAGAA	GCTGGCCAGC	GTGGTGACCT	GCACCCTGCT	GGCCCCCATG	60
TTCCTGAACG	GCAACGTGAA	CGCCGTGTAC	GCCGACAGCA	AGACCAACCA	GATCAGCACC	120
ACCCAGAAGA	ACCAGCAGAA	GGAGATGGAC	CGCAAGGGCC	TGCTGGGCTA	CTACTTCAAG	180
GGCAAGGACT	TCAGCAACCT	GACCATGTTC	GCCCCCACGC	GTGACAGCAC	CCTGATCTAC	240
GACCAGCAGA	CCGCCAACAA	GCTGCTGGAC	AAGAAGCAGC	AGGAGTACCA	GAGCATCCGC	300
TGGATCGGCC	TGATCCAGAG	CAAGGAGACC	GGCGACTTCA	CCTTCAACCT	GAGCGAGGAC	360
GAGCAGGCCA	TCATCGAGAT	CAACGGCAAG	ATCATCAGCA	ACAAGGGCAA	GGAGAAGCAG	420
GTGGTGCACC	TGGAGAAGGG	CAAGCTGGTG	CCCATCAAGA	TCGAGTACCA	GAGCGACACC	480
AAGTTCAACA	TCGACAGCAA	GACCTTCAAG	GAGCTGAAGC	TTTTCAAGAT	CGACAGCCAG	540
AACCAGCCCC	AGCAGGTGCA	GCAGGACGAG	CTGCGCAACC	CCGAGTTCAA	CAAGAAGGAG	600
AGCCAGGAGT	TCCTGGCCAA	GCCCAGCAAG	ATCAACCTGT	TCACCCAGCA	GATGAAGCGC	660
GAGATCGACG	AGGACACCGA	CACCGACGGC	GACAGCATCC	CCGACCTGTG	GGAGGAGAAC	720

166

GGCTACACCA	TCCAGAACCG	CATCGCCGTG	AAGTGGGACG	ACAGCCTGGC	TAGCAAGGGC	780
TACACCAAGT	TCGTGAGCAA	CCCCCTGGAG	AGCCACACCG	TGGGCGACCC	CTACACCGAC	840
TACGAGAAGG	CCGCCCGCGA	CCTGGACCTG	AGCAACGCCA	AGGAGACCTT	CAACCCCCTG	900
GTGGCCGCCT	TCCCCAGCGT	GAACGTGAGC	ATGGAGAAGG	TGATCCTGAG	CCCCAACGAG	960
AACCTGAGCA	ACAGCGTGGA	GAGCGACTCG	AGCACCAACT	GGAGCTACAC	CAACACCGAG	1020
G<<.GCCAu^,G	TGGAGGCCGG	CATCGGTCCC	AAGGGCATCA	GCTTCGGCGT	GAGCGTGAAC	1080
TACCAGCACA	GCGAGACCGT	GGCCCAGGAG	TGGGGCACCA	GCACCGGCAA	CACCAGCCAG	1140
TTCAACACCG	CCAGCGCCGG	CTACCTGAAC	GCCAACGTGC	GCTACAACAA	CGTGGGCACC	1200
GGCGCCATCT	ACGACGTGAA	GCCCACCACC	AGCTTCGTGC	TGAACAACGA	CACCATCGCC	1260
ACCATCACCG	CCAAGTCGAA	TTCCACCGCC	CTGAACATCA	GCCCCGGCGA	GAGCTACCCC	1320
AAGAAGGGCC	AGAACGGCAT	CGCCATCACC	AGCATGGACG	ACTTCAACAG	CCACCCCATC	1380
ACCCTGAACA	AGAAGCAGGT	GGACAACCTG	CTGAACAACA	AGCCCATGAT	GCTGGAGACC	1440
AACCAGACCG	ACGGCGTCTA	CAAGATCAAG	GACACCCACG	GCAACATCGT	GACCGGCGGC	1500
GAGTGGAACG	GCGTGATCCA	GCAGATCAAG	GCCAAGACCG	CCAGCATCAT	CGTCGACGAC	1560
GGCGAGCGCG	TGGCCGAGAA	GCGCGTGGCC	GCCAAGGACT	ACGAGAACCC	CGAGGACAAG	1620
ACCCCCAGCC	TGACCCTGAA	GGACGCCCTG	AAGCTGAGCT	ACCCCGACGA	GATCAAGGAG	1680
ATCGAGGGCC	TGCTGTACTA	CAAGAACAAG	CCCATCTACG	AGAGCAGCGT	GATGACCTAT	1740
CTAGACGAGA	ACACCGCCAA	GGAGGTGACC	AAGCAGCTGA	ACGACACCAC	CGGCAAGTTC	1800
λ τ.Γ'ί— λ η i 'jr.	GCCACCTGTA	CGACGTGAAG	CTGACCCCCA	AGATGAACGT	GACCATCAAG	1860
CTGAGCATCC	TGTACGACAA	CGCCGAGAGC	AACGACAACA	GCATCGGCAA	GTGGACCAAC	1920
ACCAACATCG	TGAGCGGCGG	CAACAACGGC	AAGAAGCAGT	ACAGCAGCAA	CAACCCCGAC	1980
GCCAACCTGA	CCCTGAACAC	CGACGCCCAG	GAGAAGCTGA	ACAAGAACCG	CGACTACTAC	2040
ATCAGCCTGT	ACATGAAGAG	CGAGAAGAAC	ACCCAGTGCG	AGATCACCAT	CGACGGCGAG	2100
ATATACCCCA	TCACCACCAA	GACCGTGAAC	GTGAACAAGG	ACAACTACAA	GCGCCTGGAC	2160
ATCATCGCCC	ACAACATCAA	GAGCAACCCC	ATCAGCAGCC	TGCACATCAA	GACCAACGAC	2220
GAGATCACCC	TGTTCTGGGA	CGACATATCG	ATTACCGACG	TCGCCAGCAT	CAAGCCCGAG	2280
AACCTGACCG	ACAGCGAGAT	CAAGCAGATA	TACAGTCGCT	ACGGCATCAA	GCTGGAGGAC	2340
GGCATCCTGA	TCGACAAGAA	GGGCGGCATC	CACTACGGCG	AGTTCATCAA	CGAGGCCAGC	2400

167

TTCAACATCG	AGCCCCTGCA	GAACTACGTG	ACCAAGTACG	AGGTGACCTA	CAGCAGCGAG	2460
CTGGGCCCCA	ACGTGAGCGA	CACCCTGGAG	AGCGACAAGA	TTTACAAGGA	CGGCACCATC	2520
AAGTTCGACT	TCACCAAGTA	CAGCAAGAAC	GAGCAGGGCC	TGTTCTACGA	CAGCGGCCTG	2580
AACTGGGACT	TCAAGATCAA	CGCCATCACC	TACGACGGCA	AGGAGATGAA	CGTGTTCCAC	2640
CGCTACAACA	AGTAG					2655

Informace o sekvenci SEQ ID č . 18:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2004 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..2004 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 80 kDa z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:

ATGAAGCGCG	AGATCGACGA	GGACACCGAC	ACCG.AoGGCG	ACAGCATCCC	CGACCTGTGG	60
GAGGAGAACG	GCTACACCAT	CCAGAACCGC	ATCGCCGTGA	AGTGGGACGA	CAGCCTGGCT	120
AGCAAGGGCT	ACACC.AAGTT	CGTGAGCAAC	CCCCTGGAGA	GCCACACCGT	GGGCGACCCC	180
TACACCGACT	ACGAGAAGGC	CGCCCGCGAC	CTGGACCTGA	GCAACGCCAA	GGAGACCTTC	240
AACCCCCTGG	TGGCCGCCTT	CCCCAGCGTG	AACGTGAGCA	TGGAGAAGGT	GATCCTGAGC	300
CCCAACGAGA	ACCTGAGCAA	CAGCGTGGAG	AGCCACTCGA	GCACCAACTG	GAGCTACACC	360
AACACCGAGG	GCGCCAGCGT	GGAGGCCGGC	ATCGGTCCCA	AGGGCATCAG	CTTCGGCGTG	420
AGCGTGAACT	ACCAGCACAG	CGAGACCGTG	GCCCAGGAGT	GGGGCACCAG	CACCGGCAAC	480
ACCAGCCAGT	TCAACACCGC	CAGCGCCGGC	TACCTGAACG	CCAACGTGCG	CTACAACAAC	540

168

GTGGGCACCG	GCGCCATCTA	CGACGTGAAG	CCCACCACCA	GCTTCGTGCT	GAACAACGAC	600
ACCATCGCCA	CCATCACCGC	CAAGTCGAAT	TCCACCGCCC	TGAACATCAG	CCCCGGCGAG	660
AGCTACCCCA	AGAAGGGCCA	GAACGGCATC	GCCATCACCA	GCATGGACGA	CTTCAACAGC	720
CACCCCATCA	CCCTGAACAA	GAAGCAGGTG	GACAACCTGC	TGAACAACAA	GCCCATGATG	780
CTGGAGACCA	ACCAGACCGA	CGGCGTCTAC	AAGATCAAGG	ACACCCACGG	CAACATCGTG	840
ACCGGCGGCG	AGTGGAACGG	CGTGATCCAG	CAGATCAAGG	CCAAGACCGC	CAGCATCATC	900
GTCGACGACG	GCGAGCGCGT	GGCCGAGAAG	CGCGTGGCCG	CCAAGGACTA	CGAGAACCCC	960
GAGGACAAGA	CCCCCAGCCT	GACCCTGAAG	GACGCCCTGA	AGCTGAGCTA	CCCCGACGAG	1020
ATCAAGGAGA	TCGAGGGCCT	GCTGTACTAC	AAGAACAAGC	CCATCTACGA	GAGCAGCGTG	1080
ATGACCTATC	TAGACGAGAA	CACCGCCAAG	GAGGTGACCA	AGCAGCTGAA	CGACACCACC	1140
GGCAAGTTCA	AGGACGTGAG	CCACCTGTAC	GACGTGAAGC	TGACCCCCAA	GATGAACGTG	1200
ACCATCA4GC	TGAGCATCCT	GTACGACAAC	GCCGAGAGCA	ACGACAACAG	CATCGGCAAG	1260
TGGACCA^CA	CCAACATCGT	GAGCGGCGGC	AACAACGGCA	AGAAGCAGTA	CAGCAGCAAC	1320
AACCCCGACG	CCAACCTGAC	CCTGAACACC	GACGCCCAGG	AGAAGCTGAA	CAAGAACCGC	1380
GACTACTACA	TCAGCCTGTA	CATGAAGAGC	GAGAAGAACA	CCCAGTGCGA	GATCACCATC	1440
GACGGCGAGA	TATACCCCAT	CACCACCAAG	ACCGTGAACG	TGAACAAGGA	CAACTACAAG	1500
CGCCTGGACA	TCATCGCCCA	CAACATCAAG	AGCAACCCCA	TCAGCAGCCT	GCACATCAAG	1560
ACCAACGACG	AGATCACCCT	GTTCTGGGAC	GACATATCGA	TTACCGACGT	CGCCAGCATC	1620
AAGCCCGAGA	ACCTGACCGA	CAGCGAGATC	AAGCAGATAT	ACAGTCGCTA	CGGCATCAAG	1680
CTGGAGGACG	GCATCCTGAT	CGACAAGAAG	GGCGGCATCC	ACTACGGCGA	GTTCATCAAC	1740
GAGGCCAGCT	TCAACATCGA	GCCCCTGCAG	AACTACGTGA	CCAAGTACGA	GGTGACCTAC	1800
AGCAGCGAGC	TGGGCCCCAA	CGTGAGCGAC	ACCCTGGAGA	GCGACAAGAT	TTACAAGGAC	1860
GGCACCATCA	AGTTCGACTT	CACCAAGTAC	AGCAAGAACG	AGCAGGGCCT	GTTCTACGAC	1920
AGCGGCCTGA	ACTGGGACTT	CAAGATCAAC	GCCATCACCT	ACGACGGCAA	GGAGATGAAC	1980
GTGTTCCACC	GCTACAACAA	GTAG				2004

Informace o sekvenci SEQ ID č. 19:

(i) charakteristiky sekvence:

169 (A) délka: 4074 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace :1..1386 (D) další informace: produkt = VIP2A(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1394..3895 (D) další informace: produkt = VIPlA(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..4074 (D) další informace: poznámka = klonovaná

DNA-sekvence z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, která obsahuje gen jak pro VIPlA(b) takVIP2A(b) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19:

ATG Met

CAA AGA ATG GAG GGA

AAG TTG TTT GTG GTG TCA AAA ACA TTA

CAA Gin

Gin Arg Met 670

Glu

Gly

Lys

Leu 675

Phe

Val

Val

Ser

Lys 680

Thr

Leu

GTA

GTT

ACT

AGA

ACT

GTA

TTG

CTT

AGT

ACA

GTT

TAC

TCT

ATA

ACT

TTA

Val

Val

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Tyr

Ser

Ile

Thr

Leu

685

690

695

TTA

AAT

AAT

GTA

GTG

ATA

AAA

GCT

GAC

CAA

TTA

AAT

ATA

AAT

TCT

C.AA

Leu

Asn

Asn

Val

Val

Ile

Lys

Ala

Asp

Gin

Leu

Asn

Ile

Asn

Ser

Gin

700

705

710

715

AGT

AAA

TAT

ACT

AAC

TTG

CAA

AAT

CTA

AAA

ATC

CCT

GAT

AAT

GCA

GAG

Ser

Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Pro

Asp

Asn

Ala

Glu

170

720 725 730

-GAT TTT AAA GAA GAT AAG GGG AAA GCG AAA GAA TGG GGG AAA GAG AAA

240

Asp

Phe Lys Glu Asp Lys Gly Lys 735

Ala 740

Lys

Glu Trp Gly

Lys 745

Glu Lys

LtGG

GAA GAG

TGG

AGG

CCT

CCT

GCT

ACT

GAG

AAA

GGA

GAA

ATG

AAT

AAT

288

Gly

Glu Glu

Trp

Arg

Pro

Pro

Ada

Thr

Glu

Lys

Gly

Glu

Met

Asn

Asn

750

755

760

TTT

TTA GAT

AAT

AAA

AAT

GAT

ATA

AAG

ACC

AAT

TAT

AAA

GAA

ATT

ACT

336

Phe

Leu Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

765

770

775

rpi-pcp

TCT ATG

GCA

GGT

TCA

TGT

GAA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAT

TTA

GAA

GAA

384

Phe

Ser Met

Ala

Gly

Ser

Cys

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Glu

Glu

780

785

790

795

ATT

GAT AAG

ATC

TTT

GAT

AAA

GCC

AAT

CTC

TCG

AGT

TCT

ATT

ATC

ACC

432

Ile

.Asp Lys

Ile

Phe

Asp

Lys

Ala

Asn

Leu

Ser

Ser

Ser

Ile

Ile

Thr

800

805

810

TAT

AAA. AAT

GTG

GAA.

CGA

GGA

ACA

ATT

GGA

TTT

AAT

AAA

TCT

TTA

ACA

480

Tyr

Lys A.sn

Val

Glu

Pro

Ala

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

815

820

825

GAA

GGT AAT

ACG

ATT

AAT

TCT

GAT

GCA

ATG

GCA

CAG

TTT

AAA

GAA

CAA

528

Glu

Gly Asn

Thr

Ile

Asn

Ser

.Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

830

835

840

TTT

TTA GGT

AAG

GAT

ATG

AAG

TTT

GAT

AGT

TAT

CTA

GAT

ACT

CAT

TTA

576

Phe

Leu Gly

Lys

Asp

Met

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

845

850

855

ACT

GCT CAA

GAA

GTT

TCC

AGT

AAA

AAA

AGA

GTT

ATT

TTG

AAG

GTT

ACG

624

Thr

Ala Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Lys

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

8 60

865

870

875

GTT

CCG AGT

GGG

AAA

GGT

TCT

ACT

ACT

CCA

ACA

AAA

GCA

GGT

GTC

ATT

672

Val

Pro Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

Ile

880

885

890

TTA

AAC AAT

AAT

GAA

TAC

AAA

ATG

CTC

ATT

GAT

AAT

GGG

TAT

GTG

CTC

720

Leu

Asn A.sn

Asn

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Val

Leu

895

900

905

CAT

GTA GAT

AAG

GTA

TCA

AAA

GTA

GTA

AAA

AAA

GGG

ATG

GAG

TGC

TTA

768

Hrs

Val Asp

Lys

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Met

Glu

Cys

Leu

910

915

920

CAA.

GTT G.AA.

GGG

ACT

TTA

AAA

AAG

AGT

CTC

GAC

TTT

AAA

AAT

GAT

ATA

816

Gin

Val Glu

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

Ile

925

930

935

AAT

GCT G.AA

GCG

CAT

AGC

TGG

GGG

ATG

AAA

ATT

TAT

GAA

GAC

TGG

GCT

864

171

Asn 940

Ala

Glu

Ala

His

Ser 945

Trp

Gly

Met

Lys

lle 950

Tyr

Glu

Asp

Trp

Ala 955

AAA

AAT

TTA

ACC

GCT

TCG

CAA

AGG

GAA

GCT

TTA

GAT

GGG

TAT

GCT

AGG

Lys

Asn

Leu

Thr

Ala 960

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala 965

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala 970

Arg

CAA

GAT

TAT

AAA

GAA.

ATC

AAT

AAT

TAT

TTG

CGC

AAT

CAA

GGC

GGG

AGT

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

lle

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

975 980 985

GGA AAT GAA AAG CTG GAT GCC GAA TTA AAA AAT ATT TCT GAT GCT TTA	1008
Gly A.sn Glu Lys 990	Leu	Asp	Ala Gin 995	Leu	Lys	Asn	lle	Ser Asp Ala 1000	Leu
GGG AAG AAA CCC	ATA	CCA	GAA AAT	ATT	ACC	GTG	TAT	AGA TGG TGT	GGC	1056
Gly Lys Lys Pro	lle	Pro	Glu A.sn	lle	Thr	Val	Tyr Arg Trp Cys	Gly
1005			1010				1015
ATG CCG GAA TTT	GGT	TAT	CAA ATT	AGT	GAT	CCG	TTA	CCT TCT TTA	AAA	. 1104
Met Pro Glu Phe	Gly	Tyr	Gin lle	Ser	Asp	Pro	Leu	Pro Ser Leu	Lys
1020		1025			1030		1035
GAT TTT GAA GAA	CAA	TTT	TTA AAT	ACA	ATT	AAA	GAA	GAC AAA GGG	TAT	1152
Asp Phe Glu Glu	Gin	Phe	Leu Asn	Thr	lle	Lys	Glu	Asp Lys Gly	Tyr
	1040			1045		1050
ATG AGT ACA. AGC	TTA	TCG	AGT GAA	CGT	CTT	GCA	GCT	TTT GGA TCT	AGA	1200
Met Ser Thr Ser	Leu	Ser	Ser Glu	Arg	Leu	Ala	Ala	Phe Gly Ser	Arg
1055			1060			1065
AAA ATT ATA TTA	CGC	TTA	CAA. GTT	CCG	AAA	GGA	AGT	ACG GGG GCG	TAT	1248
Lys lle lle Leu	Arg	Leu	Gin Val	Pro	Lys	Gly	Ser	Thr Gly Ala	Tyr
1070			1075				1080
TTA AGT GCC ATT	GGT	GGA	TTT GCA	AGT	GAA	AAA	GAG	ATC CTA CTT	GAT	1296
Leu Ser Ala lle	Gly	Gly	Phe Ala	Ser	Glu	Lys	Glu	lle Leu Leu	Asp
1085			1090				1095
AAA GAT AGT AAA	TAT	CAT	ATT GAT	AAA	GCA	ACA	GAG	GTA ATC ATT	AAA	1344
Lys Asp Ser Lys	Tyr	His	lle Asp	Lys	Ala	Thr	Glu	Val lle lle	Lys
1100		1105			1110		1115
GGT GTT AAG CGA	TAT	GTA	GTG GAT	GCA	ACA	TTA	TTA	ACA AAT		1386
Gly Val Lys Arg	Tyr	Val	Val Asp	Ala	Thr	Leu	Leu	Thr A.sn
	1120			1125
TAAGGAG ATG AAA	AAT	ATG	AAG AAA	AAG	TTA	GCA	AGT	GTT GTA ACC	TGT	1435
Met Lys	Asn	Met	Lys Lys	Lys	Leu	Ala	Ser	Val Val Thr	Cys
1			5				10
ATG TTA TTA GCT	CCT	ATG	TTT TTG	AAT	GGA	AAT	GTG	AAT GCT GTT	AAC	1483
Met Leu Leu Ala	Pro	Met	Phe Leu	Asn	Gly	Asn	Val	Asn Ala Val	Asn
15		20				25			30

172

GCG GAT AGT AAA ΑΤΑ ΑΛΤ CAG ATT TCT ACA ACG CAG GAA AAC CAA CAG

1531

Ala Asp Ser Lys

lle Asn Gin 35

lle Ser Thr Thr Gin Glu Asn Gin Gin

40

45

AAA GAG ATG

GAC

CGA

AAG

GGA

TTA

TTG

GGA

TAT

TAT

TTC

AAA

GGA

AAA

1579

Lys Glu Met

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

50

55

60

GAT TTT AAT

AAT

CTT

ACT

ATG

TTT

GCA

CCG

ACA

CGT

GAT

AAT

ACC

CTT

1627

Asp Phe Asn

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Asn

Thr

Leu

65

70

75

ATG TAT GAC

CAA

CAA

ACA

GCG

AAT

GCA

TTA

TTA

GAT

AAA

AAA

CAA

CAA

1675

Met Tyr Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

80

85

90

GAA. TAT CAG

TCC

ATT

CGT

TGG

ATT

GGT

TTG

ATT

CAG

CGT

AAA

GAA

ACG

1723

Glu Tyr Gin

Ser

lle

Arg

Trp

lle

Gly

Leu

lle

Gin

Arg

Lys

Glu

Thr

95

100

105

110

GGC GAT TTC

ACA

TTT

AAC

TTA

TCA

AAG

GAT

GAA

CAG

GCA

ATT

ATA

GAA

1771

Gly Asp Phe

Thr

Phe

A.sn

Leu

Ser

Lys

Asp

Glu

Gin

Ala

lle

lle

Glu

115

120

125

ATC GAT GGG

AAA

ATC

ATT

TCT

AAT

AAA

GGG

AAA

GAA

AAG

CAA

GTT

GTC

1819

lle Asp Gly

Lys

lle

lle

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

130

135

140

CAT TTA GAA

AAA

GAA.

AAA

TTA

GTT

CCA

ATC

AAA

ATA

GAG

TAT

CAA

TCA

1867

His Leu Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Val

Pro

lle

Lys

lle

Glu

Tyr

Gin

Ser

145

150

155

GAT ACG AAA

TTT

AAT

ATT

GAT

AGT

AAA

ACA

TTT

AAA

GAA

CTT

AAA

TTA

1915

Asp Thr Lys

Phe

A.sn

lle

A.sp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

160

165

170

TTT AAA ATA

GAT

AGT

CAA

AAC

CAA

TCT

CAA

CAA

GTT

CAA

CTG

AGA

AAC

1963

Phe Lys lle

A.sp

Ser

Gin

Asn

Gin

Ser

Gin

Gin

Val

Gin

Leu

Arg

Asn

175

180

185

190

CCT GAA TTT

AAC

AAA

AAA

GAA

TCA

CAG

GAA

TTT

TTA

GCA

AAA

GCA

TCA

2011

Pro Glu Phe

A.sn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

195

200

205

AAA ACA AAC

CTT

TTT

AAG

CAA

AAA

ATG

AAA

AGA

GAT

ATT

GAT

GAA

GAT

2059

Lys Thr Asn

Leu

Phe

Lys

Gin

Lys

Met

Lys

Arg

Asp

lle

Asp

Glu

Asp

210

215

220

ACG GAT ACA

GA.T

GGA

GAC

TCC

ATT

CCT

GAT

CTT

TGG

GAA

GAA

AAT

GGG

2107

Thr Asp Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

lle

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

225

230

235

TAC ACG ATT

CAA

AA.T

AAA

GTT

GCT

GTC

AAA

TGG

GAT

GAT

TCG

CTA

GCA

2155

Tyr Thr lle

Gin

Asn

Lys

Val

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala

240 245 250

173

AGT

AAG

GGA

. TAT

ACA

. AAA

. TTT

GTT

1 TCG

í AAT

CCA

TTA

. GAC AGC CAC ACA.

2203

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

Ser

Asn

Pro

Leu

Asp Ser His Thr

255

260

265

270

GTT

GGC

GAT

CCC

TAT

ACT

GAT

TAT

GAA

AAG

GCC

GCA

AGG GAT TTA GAT

2251

Val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg Asp Leu Asp

275

280

285

TTA

TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG

TTC

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT GCT TTT CCA

2299

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ma Ma Phe Pro

290

295

300

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA AAT GAA AAT

2347

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro Asn Glu Asn

305

310

315

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG TCT TAT ACG

2395

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp Ser Tyr Thr

320

325

330

AAT

ACA

GAA

GGA.

GCT

TCC

ATT

GAA

GCT

GGT

GGC

GGT

CCA TTA. GGC CTT

2443

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Ile

Glu

Ala

Gly

Gly

Gly

Pro Leu Gly Leu

335

340

345

350

TCT

«piperi

GGC

GTG

AGT

GTT

ACT

TAT

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA GTT GCA CAA

2491

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Thr

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr Val Ma Gin

355

360

365

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

ACT

TCA

CAA

TTC

AAT ACG GCT TCA

2539

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn Thr Aia Ser

370

375

380

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

CGG

TAT

AAC

AAT

GTA GGG ACT GGT

2587

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val Gly Thr Gly

385

390

395

GCC

ATC

TAT

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA AAT AAC AAT

2635

Ala

Ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu .Asn .Mn Asn

400

405

410

ACC

ATC

GCA

ACG

ATT

ACA

GCA

AAA

TCA

AAT

TCA

ACA

GCT TTA CGT ATA

2683

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ma Leu .Arg Ile

415

420

425

430

TCT

CCG

GGG

GAT

AGT

TAT

CCA

GAA

ATA

GGA

GAA

AAC

GCT ATT GCG ATT

2731

Ser

Pro

Gly

Asp

Ser

Tyr

Pro

Glu

Ile

Gly

Glu

Asn

Ma Ile Aia Ile

435

440

445

ACA

TCT

ATG

GAT

GAT

TTT

AAT

TCT

CAT

CCA

ATT

ACA

TTA .AAT AAA CAA.

2779

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu Asn Lys Gin

450

455

4 60

CAG

GTA

AAT

CAA

TTG

ATA

AAT

AAT

AAG

CCA

ATT

ATG

CTA GAG ACA GAC

2827

Gin

Val

Asn

Gin

Leu

Ile

Asn

Asn

Lys

Pro

Ile

Met

Leu Glu Thr Asp

174

465 470 475

CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAA ATA AGA GAT ACA CAT GGA AAT ATT GTA 2875

Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile Arg Asp Thr His Gly Asn Ile Val

480 485 490

ACT GGT GGA GAA TGG AAT GGT GTA ACA CAA CAA ATT AAA GCA AAA ACA 2923

Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val Thr Gin Gin Ile Lys Ala Lys Thr

495

500

505

510

GCG

TCT ATT

ATT

GTG

GAT

GAC

GGG

AAA

CAG

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

GTG

2971

Ala

Ser Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

Lys

Gin

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

Val

515

520

525

GCG

AA4

GAT

TAT

GGT

CAT

CCA

GAA

GAT

AAA

AGA

CCA

CCT

TTA

ACT

3019

Ala

Ala Lys

Asp

Tyr

Gly

His

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Pro

Leu

Thr

530

535

540

TTA

AAA GAT

ACC

CTG

AAG

CTT

TCA

TAC

CCA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

ACT

3067

Leu

Lys Asp

Thr

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

.Asp

Glu

Ile

Lys

Glu

Thr

545

550

555

AAT

GGA TTG

TTG

TAC

TAT

GAT

GAC

AAA

CCA

ATC

TAT

GAA

TCG

AGT

GTC

3115

Asn

Gly Leu

Leu

Tyr

Tyr

Asp

A.sp

Lys

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

560

565

570

ATG

ACT TAT

CTG

GAT

GAA

AAT

ACG

GGA

AAA

GAA

GTC

AAA

AAA

GAA

ATA

3163

Met

Thr Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Lys

Lys

Gin

Ile

575

580

585

590

.AAT

GAT ACA

ACC

GGA

AAA

TTT

AAG

GAT

GTA

AAT

CAC

TTA

TAT

GAT

GTA

3211

Asn

Asp Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

A.sn

His

Leu

Tyr

Asp

Val

595

600

605

AAA

CTG ACT

CGA

.AAA

ATG

AAT

TTT

ACG

ATT

AAA

ATG

GCT

TCC

TTG

TAT

3259

Lys

Leu Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Phe

Thr

Ile

Lys

Met

Ala

Ser

Leu

Tyr

610

615

620

GAT

GGG GCT

GAA

AAT

AAT

CAT

AAC

TCT

TTA

GGA

ACC

TGG

TAT

TTA

ACA

3307

Asp

Glv Ala

Glu

Asn

A.sn

His

Asn

Ser

Leu

Gly

Thr

Trp

Tyr

Leu

Thr

625

630

635

TAT

AAT GTT

GCT

GGT

GGA

AAT

ACT

GGG

AAG

AGA

CAA

TAT

CGT

TCA

GCT

3355

Tvr

Asn Val

.Ala

Gly

Gly

Asn

Thr

Gly

Lys

Arg

Gin

Tyr

Arg

Ser

Ala

640

645

650

CAT

TCT TGT

GCA

CAT

GTA

GCT

CTA

TCT

TCA

GAA

GCG

AAA

AAG

AAA

CTA

3403

His

Ser Cys

Ala

His

Val

Ala

Leu

Ser

Ser

Glu

Ala

Lys

Lys

Lys

Leu

655

660

665

670

AAT

CAA AAT

GCG

AAT

TAC

TAT

CTT

AGC

ATG

TAT

ATG

AAG

GCT

GAT

TCT

3451

Asn

Gin Asn

.Ala

Asn

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Tyr

Met

Lys

Ala

Asp

Ser

675

680

685

ACT

ACG GAA

CCT

ACA

ATA

GAA

GTA

GCT

GGG

GAA

AAA

TCT

GCA

.ATA

ACA

3499

175

Thr

Thr

Glu

Pro 690

Thr

Ile

Glu

Val

Ala 695

Gly

Glu

Lys

Ser

Ala 700

Ile

Thr

AGT

AAA

AAA

GTA

AAA

TTA

AAT

AAT

CAA

AAT

TAT

CAA

AGA

GTT

GAT

ATT

3547

Ser

Lys

Lys 705

Val

Lys

Leu

Asn

Asn 710

Gin

Asn

Tyr

Gin

Arg 715

Val

Asp

Ile

TTA

GTG

AAA

AAT

TCT

GAA

AGA

AAT

CCA

ATG

GAT

AAA

ATA

TAT

ATA

AGA

3595

Leu

Val 720

Lys

Asn

Ser

Glu

Arg 725

Asn

Pro

Met

Asp

Lys 730

Ile

Tyr

Ile

Arg

GGA

AAT

GGC

ACG

ACA

AAT

GTT

TAT

GGG

GAT

GAT

GTT

ACT

ATC

CCA

GAG

3643

Gly 735

Asn

Gly

Thr

Thr

Asn 740

Val

Tyr

Gly

Asp

Asp 745

Val

Thr

Ile

Pro

Glu 750

GTA

TCA

GCT

ATA

AAT

CCG

GCT

AGT

CTA

TCA

GAT

GAA

GAA

ATT

CAA

GAA

3691

Val

Ser

Ala

Ile

Asn 755

Pro

Ada

Ser

Leu

Ser 760

Asp

Glu

Glu

Ile

Gin 765

Glu

ATA

TTT

AAA

GAC

TCA

ACT

ATT

GAA

TAT

GGA

AAT

CCT

AGT

TTC

GTT

GCT

3739

Ile

Phe

Lys

Asp 770

Ser

Thr

Ile

Glu

Tyr 775

Gly

Asn

Pro

Ser

Phe 780

Val

íla

GAT

GCC

GTA

ACA

TTT

AAA.

AAT

ATA

AAA

CCT

TTA

CAA

AAT

TAT

GTA

AAG

3787

Asp

Ala

Val 785

Thr

Phe

Lys

Asn

Ile 790

Lys

Pro

Leu

Gin

Asn 795

Tyr

Val

Lys

GAA

TAT

GAA

ATA

TAT

CAT

AAA

TCT

CAT

CGA

TAT

GAA

AAG

AAA

ACG

GTC

3835

Glu

Tyr 800

Glu

Ile

Tyr

His

Lys 805

Ser

His

Arg

Tyr

Glu 810

Lys

Lys

Thr

Val

TTT

GAT

ATC

ATG

GGT

GTT

CAT

TAT

GAG

TAT

AGT

ATA

GCT

AGG

GAA

CAA

3883

Phe 815

Asp

Ile

Met

Gly

Val 820

His

Tyr

Glu

Tyr

Ser 825

Ile

Ala

Arg

Glu

Gin 830

AAG AAA GCC GCA TAATTTTAAA AATAAAACTC GTTAGAGTTT ATTTAGCATG 3935

Lys Lys Ala Ala

GTATTTTTAA GAATAATCAA TATGTTGAAC CGTTTGTAGC TGTTTTGGAA GGGAATTTCA 3995

TTTTATTTGG TCTCTTAAGT TGATGGGCAT GGGATATGTT CAGCATCCAA GCGTTTNGGG 4055

GGTTANAAAA TCCAATTTT 4074

Informace o sekvenci SEQ ID č. 20:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 462 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

176

(xi)

zná

zornění

) se

kve:

nce

SEC

! ID

Č .

20 :

Met Gin

Arg

Met

Glu

Gly

' Lys

Leu

i Phe

Val

. Val

. Ser

' Lys

Thr

Leu

1 Gin

Ί 1

3

10

15

Vel Vsi

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Tyr

Ser

Ile

Thr

Leu

20

25

30

Leu Asn

Asn

Val

Val

Ile

Lys

Ala

Asp

Gin

Leu

Asn

Ile

Asn

Ser

Gin

35

40

45

Ser Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

A.sn

Leu

Lys

Ile

Pro

Asp

Asn

Ala

Glu

50

55

60

Asp Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

65

70

75

80

Gly Glu

Glu

Trp

Arg

Pro

Pro

AJ_a

Thr

Glu

Lys

Gly

Glu

Met

Asn

Asn

85

90

95

Phe Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

100

105

110

Phe Ser

Μθέ

A_la

Gly

Ser

Cys

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

'Asp

Leu

Glu

Glu

115

120

125

Ile Asp

Lys

Ile

Phe

Asp

Lys

Ala

A.sn

Leu

Ser

Ser

Ser

Ile

Ile

Thr

130

135

140

Tyr Lys

Asn

Val

Glu

Pro

Ala

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

145

150

155

160

Glu Gly

A.sn

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

165

170

175

Phe Leu

Gly

Lys

Asp

Met

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

180

185

190

Thr Ala

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Lys

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

195

200

205

Val Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

Ile

210

215

220

Leu Asn

Asn

Asn

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Val

Leu

225

230

235

240

His Val

Asp

Lys

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Met

Glu

Cys

Leu

245

250

255

Gin Val

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

Ile

260

265

270

Asn Ala

Glu

Ala

His

Ser

Trp '

Gly 1

Met

Lys

Ile

Tyr

Glu

Asp

Trp .

Ala

275 280 285

177

Lys Asn Leu Thr Ala 290

Ser

Gin Axg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala

Arg

295

300

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

305

310

315

320

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu

Asp

Ada

Gin

Leu

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

325

330

335

Gly

Lys

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

340

345

350

Mec

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

355

360

365

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

370

375

380

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg

385

390

395

400

Lys

Ile

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Ser

Ala

Ile

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

420

425

430

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

Asp

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Ile

ile

Lys

435

440

445

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ada

Thr

Leu

Leu

Thr

AxSn

450

455

460

Informace o

sekvenci

SEQ

ID

č .

21 :

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 834 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

	(xi(	) znázornění	sekvence	SEQ	ID	Č .	21:
Met d	Lys	Asn Met Lys Lys 5	Lys Leu Ada	Ser 10	Val	Val	Thr	Cys	Met 15	Leu
Leu	Ala	Pro Met Phe Leu 20	Asn Gly Asn 25	Val	Asn	Ala	Val	Asn 30	Ada	Asp
Ser	Lys	Ile Asn Gin Ile 35	Ser Thr Thr 40	Gin	Glu	Asn	Gin 45	Gin	Lys	Glu

178

MSC

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp

Phe

50

55

60

Asn

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Asn

Thr

Leu

Met

Tyr

65

70

75

80

Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr

85

90

95

Gin

Ser

lle

Arg

Trp

lle

Gly

Leu

lle

Gin

Arg

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

100

105

110

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Lys

Asp

Glu

Gin

Ala

lle

lle

Glu

lle

Asp

115

120

125

Gly

Lys

lle

lle

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

130

135

140

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Val

Pro

lle

Lys

lle

Glu

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr

145

150

155

160

Lys

Phe

Asn

lle

Asd

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys

165

170

175

lle

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Ser

Gin

Gin

Val

Gin

Leu

Arg

Asn

Pro

Glu

180

185

190

Phe

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Thr

195

200

205

Asn

Leu

Phe

Lys

Gin

Lys

Met

Lys

Arg

Asp

lle

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp

210

215

220

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

lle

Pro

.Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr

225

230

235

240

lle

Gin

Asn

Lys

Val

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala

Ser

Lys

24 5

250

255

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

Ser

A.sn

Pro

Leu

Asp

Ser

His

Thr

Val

Gly

260

265

270

A.sp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

Asp

Leu

Ser

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

Ser

Val

290

295

300

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

lle

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser

305

310

315

320

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Thr

325 330 335

Glu Gly Ala Ser lle Glu Ala Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ser Phe

179

340

345

350

Gly

Val

Ser

Val

Thr

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

Trp

355

360

365

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

370

375

380

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

Gly

Ala

Ile

385

390

395

400

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

Asn

Thr

Ile

405

410

415

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Arg

Ile

Ser

Pro

420

425

430

Gly

Asp

Ser

Tyr

Pro

Glu

Ile

Gly

Glu

Asn

Ala

Ile

Ala

Ile

Thr

Ser

435

440

445

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

Gin

Gin

Val

450

455

4 60

Asn

Gin

Leu

Ile

Asn

Asn

Lys

Pro

Ile

Met

Leu

Glu

Thr

A^p

Gin

Thr

4 65

470

475

480

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys

Ile

Arg

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

Val

Thr

Gly

485

490

495

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

Val

Thr

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys

Thr

Ala

Ser

500

505

510

Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

Lys

Gin

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Ala

515

520

525

Lys

Asp

Tyr

Gly

His

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Pro

Leu

Thr

Leu

Lys

530

535

540

Asp

Thr

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

Ile

Lys

Glu

Thr

Asn

Gly

545

550

555

560

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Asp

Asp

Lys

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

Met

Thr

565

570

575

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Lys

Lys

Gin

Ile

Asn

Asp

580

585

590

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

Asn

His

Leu

Tyr

Asp

Val

Lys

Leu

595

600

605

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Phe

Thr

Ile

Lys

Met

Ala

Ser

Leu

Tyr

Asp

Gly

610

615

620

Ala

Glu

Asn

Asn

His

Asn

Ser

Leu

Gly

Thr

Trp

Tyr

Leu

Thr

Tyr

Asn

625

630

635

640

180

Val Ala Gly Gly Asn Thr Gly Lys Arg Gin Tyr Arg Ser Ala His Ser

645 650 655

Cys Ada

His Val 660

Ala Leu

Ser Ser Glu 665

Ala Lys Lys Lys

Leu 670

Asn Gin

Asn

Ala

Asn

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Tyr

Met

Lys

Ala

Asp

Ser

Thr

Thr

675

680

685

Glu

Pro

Thr

Ile

Glu

Val

Ala

Gly

Glu

Lys

Ser

Ala

Ile

Thr

Ser

Lys

690

695

700

Lys

Val

Lys

Leu

Asn

Asn

Gin

Asn

Tyr

Gin

Arg

Val

Asp

Ile

Leu

Val

705

710

715

720

Lys

Asn

Ser

Glu

Aurg

A.sn

Pro

Met

Asp

Lys

Ile

Tyr

Ile

Arg

Gly

Asn

725

730

735

Gly

Thr

Thr

Asn

Val

Tyr

Gly

Asp

Asp

Val

Thr

Ile

Pro

Glu

Val

Ser

740

745

750

Ala

Ile

A.sn

Pro

Ada

Ser

Leu

Ser

Alsp

Glu

Glu

Ile

Gin

Glu

Ile

Phe

755

760

765

Lys

A.so

Ser

Thr

Ile

Glu

Tyr

Gly

A.sn

Pro

Ser

Phe

Val

Ala

Asp

Ala

770

775

780

Val

mh—

Phe

Lys

Asn

Ile

Lys

Pro

Leu

Gin

A.sn

Tyr

Val

Lys

Glu

Tyr

785

790

795

800

Glu

Ile

Tyr

His

Lys

Ser

His

Arg

Tyr

Glu

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Asp

805

810

815

Ile

Met

Gly

Val

His

Tyr

Glu

Tyr

Ser

Ile

Ala

Arg

Glu

Gin

Lys

Lys

820

825

830

Ada

Ala

Informace o

sekvenci

SEQ

ID

Č .

22 :

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 4041 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1..4038

181 (D) další informace: produkt = fúzní produkt

VIPlA(a)/VIP2A(a) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 22:

ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG

TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA CAA

48

Met 835

Lys

Arg

Met Glu Gly 840

Lys

Leu

Phe

Met

Val 845

Ser

Lys

Lys

Leu

Gin 850

GTA

GTT

ACT

AAA ACT GTA

TTG

CTT

AGT

ACA

GTT

TTC

TCT

ATA

TCT

TTA

96

Val

Val

Thr

Lys Thr Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

lle

Ser

Leu

855

860

865

TTA

AAT

AAT

GAA GTG ATA

AAA

GCT

GAA

CAA

TTA

AAT

ATA

AAT

TCT

CAA

144

Leu

Asn

Asn

Glu Val lle

Lys

Ala

Glu

Gin

Leu

Asn

lle

Asn

Ser

Gin

870

875

880

AGT

AAA

TAT

ACT AAC TTG

CAA

AAT

CTA

AAA

ATC

ACT

GAC

AAG

GTA

GAG

192

Ser

Lys

Tyr

Thr Asn Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

lle

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

885

890

895

GAT

TTT

AAA

GAA GAT AAG

GAA

AAA

GCG

AAA

GAA

TGG

GGG

AAA

GAA

AAA

240

Asp

Phe

Lys

Glu Asp Lys

Glu

Lys

Ma

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

900

905

910

GAA

AAA

GAG

TGG AAA CTA

ACT

GCT

ACT

GAA

AAA

GGA

AAA

ATG

AAT

AAT

288

Glu

Lys

Glu

Trp Lys Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Mst

Asn

Asn

915

920

925

930

TTT

TTA

GAT

AAT AAA AAT

GAT

ATA

.AAG

ACA

AAT

TAT

AAA

GAA

ATT

ACT

336

Phe

Leu

Asp

Asn Lys Asn

Asp

lle

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

lle

Thr

935

940

94 5

TTT

TCT

ATG

GCA GGC TCA

TTT

GAA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAT

TTA

AAA

GAA

384

Phe

Ser

Met

Ala Gly Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

lle

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

950

955

960

ATT

GAT

AAG

ATG TTT GAT

AAA

ACC

AAT

CTA

TCA

AAT

TCT

ATT

ATC

ACC

432

lle

Asp

Lys

Met Phe Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

lle

lle

Thr

965

970

975

TAT

AAA

AAT

GTG GAA CCG

ACA

ACA

ATT

GGA

TTT

AAT

AAA

TCT

TTA

ACA

'480

Tyr

Lys

Asn

Val Glu Pro

Thr

Thr

lle

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

980

985

990

GAA

GGT

AAT

ACG ATT AAT

TCT

GAT

GCA

ATG

GCA

CAG

TTT

AAA

GAA

CAA

528

Glu

Gly

Asn

Thr lle Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

995

1000

1005

1010

TTT

TTA

GAT

AGG GAT ATT

AAG

TTT

GAT

AGT

TAT

CTA

GAT

ACG

CAT

TTA

576

Phe

Leu

Asp

Arg Asp lle

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

1015

1020

1025

ACT

GCT

CAA

CAA GTT TCC

AGT

AAA

GAA

AGA

GTT

ATT

TTG

AAG

GTT

ACG

624

Thr

Ala

Gin

Gin Val Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

lle

Leu

Lys

Val

Thr

182

1030 1035 1040

GTT CCG AGT GGG AAA	GGT Gly	TCT Ser	ACT ACT CCA ACA AAA	GCA GGT GTC Ala Gly Val 1055	ATT Ile	672
Val	Pro	Ser Gly Lys 1045	Thr Thr 1050	Pro	Thr	Lys
TTA	AAT	AAT AGT GAA	TAC	AAA	ATG CTC	ATT	GAT	AAT	GGG TAT ATG	GTC	720
Leu	Asn Asn Ser Glu 1060	Tyr	Lys Met Leu 1065	Ile	Asp	Asn Gly Tyr Met 1070	Val
CAT	GTA	GAT AAG GTA	TCA	AAA	GTG GTG	AAA	AAA		GTG GAG TGC	TTA	768
His Val 1075	A.sp Lys Val	Ser Lys 1080	Val Val	Lys	Lys Gly 1085	Val Glu Cys	Leu 1090
CAA	ATT	GAA GGG ACT	TTA	AAA	AAG AGT	CTT	GAC	TTT	AAA AAT GAT	ATA	816
Gin	Ile	Glu Gly Thr Leu 1095	Lys	Lys Ser	Leu A.sp 1100	Phe	Lys Asn Asp Ile 1105
AAT	GCT	GAA GCG CAT	AGC	TGG	GGT ATG	AAG	AAT	TAT	GAA GAG TGG	GCT	864
.Asn	Ala	Glu .Ala His 1110	Ser	Trp	Gly Met Lys 1115	Asn	Tyr	Glu Glu Trp 1120	Ala
AAA	GAT	TTA ACC GAT	TCG	CAA	AGG GAA	GCT	TTA	GAT	GGG TAT GCT	AGG	912
Lys	Asp	Leu Thr Asp 1125	Ser	Gin	Arg Glu 1130	Ala	Leu	Asp	Gly Tyr Ala 1135	Arg
CAA	GAT	TAT AAA GAA	ATC	AAT	AAT TAT	TTA	AGA	AAT	CAA GGC GGA	AGT	960
Gin	Asp Tyr Lys Glu 1140	Ile	.Asn Asn Tyr 1145	Leu	Arg	Asn Gin Gly Gly 1150	Ser
GGA	AAT	GAA AM CTA	GAT	GCT	CAA ATA	AAA	AAT	ATT	TCT GAT GCT	TTA	1008
Gly Asn 1155	Glu Lys Leu	Asp Ala 1160	Gin Ile	Lys	Asn Ile 1165	Ser Asp Ala	Leu 1170
GGG	AAG	AAA CCA ATA	CCG	GAA	AAT ATT	ACT	GTG	TAT	AGA TGG TGT	GGC	1056
Gly	Lys	Lys Pro Ile Pro 1175	Glu	Asn Ile	Thr Val 1180	Tyr	Arg Trp Cys Gly 1185
ATG	CCG	GAA TTT GGT	TAT	CAA	ATT AGT	GAT	CCG	TTA	CCT TCT TTA	AAA	1104
Met	Pro	Glu Phe Gly 1190	Tyr	Gin	Ile Ser Asp 1195	Pro	Leu	Pro Ser Leu 1200	Lys
GAT	TTT	GAA GAA CAA	TTT	TTA	AAT ACA	ATC	AAA	GAA	GAC AAA GGA	TAT	1152
Asp	Phe	Glu Glu Gin 1205	Phe	Leu	Asn Thr 1210	Ile	Lys	Glu	Asp Lys Gly 1215	Tyr
ATG	AGT	ACA AGC TTA	TCG	AGT	GAA CGT	CTT	GCA	GCT	TTT GGA TCT	AGA	1200
Met	Ser 122C	Thr Ser Leu 1	Ser	Ser 1225	Glu Arg >	Leu	Ala	Ala 123C	Phe Gly Ser 1	Arg
AAA	ATT	ATA TTA CGA	TTA	CAA	GTT CCG	AAA	GGA	AGT	ACG GGT GCG	TAT	1248
Lys 1235	Ile )	Ile Leu Arg	Leu 124C	Gin 1	Val Pro	Lys	Gly 1245	Ser )	Thr Gly Ala	Tyr 1250
TTA	AGT	GCC ATT GGT	GGA	TTT	GCA AGT	GAA	AAA	GAG	ATC CTA CTT	GAT	1296

183

Leu

Ser

Ala

Ile

Gly Gly 1255

Phe

Ala

Ser

Glu Lys 1260

Glu

Ile

Leu

Leu Asp 1265

AAA

GAT

AGT

AAA

TAT

CAT

ATT

GAT

AAA

GTA

ACA

GAG

GTA

ATT

ATT

AAA

1344

Lys

Asp

Ser

Lys Tyr 1270

His

Ile

Asp

Lys Val 1275

Thr

Glu

Val

Ile Ile 1280

Lys

GGT

GTT

AAG

CGA

TAT

GTA

GTG

GAT

GCA

ACA

TTA

TTA

ACA

AAT

ATG

AAA

1392

Gly

Val

Lys Arg 1285

Tyr

Val

Val

Asp Ala 1290

Thr

Leu

Leu

Thr Asn 1295

Met

Lys

AAT

ATG

AAG

AAA

AAG

TTA

GCA

AGT

GTT

GTA

ACG

TGT

ACG

TTA

TTA

GCT

1440

Asn

Met Lys 1300

Lys

Lys

Leu

Ala Ser 1305

Val

Val

Thr

Cys Thr 1310

Leu

Leu

Ma

CCT

ATG

TTT

TTG

AAT

GGA

AAT

GTG

AAT

GCT

GTT

TAC

GCA

GAC

AGC

AAA

1488

Pro Met 1315

Phe

Leu

Asn

Gly Asn 1320

Val

Asn

Ala

Val Tyr 1325

Ala

Asp

Ser

Lys 1330

ACA

AAT

CAA

ATT

TCT

ACA

ACA

CAG

AAA

AAT

CAA

CAG

ΆΆΑ

GAG

ATG

GAC

1536

Thr

Asn

Gin

Ile

Ser Thr 1335

Thr

Gin

Lys

Asn Gin 1340

Gin

Lys

Glu

Met Asp 1345

CGA

AAA

GGA

TTA

CTT

GGG

TAT

TAT

TTC

AAA

GGA

AAA

GAT

TTT

AGT

AAT

1584

Arg

Lys

Gly

Leu Leu 1350

Gly

Tyr

Tyr

Phe Lys 1355

Gly

Lys

Asp

Phe Ser 1360

Asn

CTT

ACT

ATG

TTT

GCA

CCG

ACA

CGT

GAT

AGT

ACT

CTT

ATT

TAT

GAT

GA\

1632

Leu

Thr

Met Phe 1365

Ala

Pro

Thr

Arg 137C

Asp )

Ser

Thr

Leu

Ile Tyr 1375

Asp

Gin

CAA

ACA

GCA

AAT

AAA

CTA

TTA

GAT

AAA

AAA

CAA

CAA

GAA

TAT

CAG

TCT

1680

Gin

Thr 138C

Ala )

Asn

Lys

Leu

Leu Asp 1385

Lys

Lys

Gin

Gin 139C

Glu )

Tyr

Gin

Ser

ATT

CGT

TGG

ATT

GGT

TTG

ATT

CAG

AGT

AAA

GAA

ACG

GGA

GAT

TTC

ACA

1728

Ile 1395

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu 140C

Ile )

Gin

Ser

Lys

Glu 1405

Thr

Gly

Asp

Phe

Thr 1410

TTT

AAC

TTA

TCT

GAG

GAT

GAA

CAG

GCA

ATT

ATA

GAA

ATC

AAT

GGG

AAA

1776

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu 1415

Asp

Glu

Gin

Ala

Ile 142C

Ile 1

Glu

Ile

Asn

Gly 1425

Lys

ATT

ATT

TCT

AAT

AAA

GGG

AAA

GAA

AAG

CAA

GTT

GTC

CAT

TTA

GAA

AAA

1824

Ile

Ile

Ser

Asn 143C

Lys 1

Gly

Lys

Glu

Lys 1435

Gin

Val

Val

His

Leu 144C

Glu 1

Lys

GGA

AAA

TTA

GTT

CCA

ATC

AAA

ATA

GAG

TAT

CAA

TCA

GAT

ACA

AAA

TTT

1872

Gly

Lys

Leu 1445

Val 1

Pro

Ile

Lys

Ile 1450

Glu 1

Tyr

Gin

Ser

Asp 1455

Thr >

Lys

Phe

AAT

ATT

GAC

AGT

AAA

ACA

TTT

AAA

GAA

CTT

AAA

TTA

TTT

AAA

ATA

GAT

1920

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys

Ile

Asp

1460 1465 1470

184

AGT CAA AAC Ser Gin Asn 1475	CAA CCC CAG CAA GTC Gin Pro Gin Gin Val 1480	CAG CAA GAT GAA CTG AGA AAT CCT	1968
Gin	Gin	Asp Glu 1485	Leu	Arg	Asn	Pro 1490
GAA TTT AAC	AAG AAA GAA TCA CAG	GAA	TTC	TTA GCG	AAA	CCA	TCG	AAA	2016
Glu Phe Asn	Lys Lys Glu Ser Gin 1495	Glu	Phe Leu Ala 1500	Lys	Pro	Ser Lys 1505
ATA AAT CTT	TTC ACT CAA AAA ATG	AAA	AGG	GAA ATT	GAT	GAA	GAC	ACG	2064
Ile Asn Leu	Phe Thr Gin Lys Met 1510	Lys Arg 1515	Glu Ile	Asp	Glu Asp 1520	Thr
GAT ACG GAT	GGG GAC TCT ATT CCT	GAC	CTT	TGG GAA	' GAA	AAT	GGG	TAT	2112
Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp 1525 * 1530	Leu	Trp Glu	Glu Asn 1535	Gly	Tyr
ACG ATT CAA	AAT AGA ATC GCT GTA	AAG	TGG	GAC GAT	TCT	CTA	GGA	AGT	2160
Thr Ile Gin 1540	Asn Arg Ile Ala Val 1545	Lys	Trp	Asp Asp Ser 1550	Leu	Ala	Ser
AAA GGG TAT	ACG AAA TTT GTT TCA	AAT	CCA	CTA GAA	AGT	CAC	ACA	GTT	2208
Lys Gly Tyr 1555	Thr Lys Phe Val Ser 1560	Asn	Pro	Leu Glu 1565	Ser	His	Thr	Val 1570
GGT GAT CCT	TAT ACA GAT TAT GAA	AAG	GCA	GCA. AGA	GAT	CTA	GAT	TTG	2256
Gly Asp Pro	Tyr Thr Asp Tyr Glu 1575	Lys	Ala Ala Arg 1580	Asp	Leu	Asp Leu 1585
TCA AAT GCA	AAG GAA ACG TTT AAC	CCA	TTG	GTA GCT	GCT	TTT	CCA	AGT	2304
Ser Asn Ala	Lys Glu Thr Phe Asn 1590	Pro Leu 1595	Val Ala	Ala	Phe Pro 1600	Ser
GTG AAT GTT	AGT ATG GAA AAG GTG	ATA	TTA	TCA CCA	AAT	GAA	AAT	TTA	2352
Val Asn Val 1605	Ser Met Glu Lys Val Ile i 1610	Leu	Ser Pro	Asn 1611	Glu	Asn	Leu
TCC AAT AGT	GTA GAG TCT CAT TCA	TCC	ACG	AAT TGG	TCT	TAT	ACA	AAT	2400
Ser Asn Ser 1620	Val Glu Ser His Ser 1625	Ser	Thr	Asn Trp 163C	Ser 1	Tyr	Thr	Asn
ACA GAA GGT	GCT TCT GTT GAA GCG	GGG	ATT	GGA CCA	AAA	GGT	ATT	TCG	2448
Thr Glu Gly 1635	Ala Ser Val Glu Ala 1640	Gly	Ile	Gly Pro 1645	Lys	Gly	Ile	Ser 1650
TTC GGA GTT	AGC GTA AAC TAT CAA	CAC	TCT	GAA ACA	GTT	GCA	GAA	GAA	2496
Phe Gly Val	Ser Val Asn Tyr Gin 1655	His	Ser 1660	Glu Thr 1	Val	Ala	Gin 1665	Glu
TGG GGA ACA	TCT ACA GGA AAT ACT	TCG	C.AA	TTC AAT	ACG	GCT	TCA	GCG	2544
Trp Gly Thr	Ser Thr Gly Asn Thr 1670	Ser 1675	Gin	Phe Asn	Thr	Ala 1680	Ser	Ala
GGA TAT TTA	AAT GCA AAT GTT CGA	TAT	AAC	AAT GTA	GGA	ACT	GGT	GCC	2592
Gly Tyr Leu 1685	Asn Ala Asn Val Arg 1690	Tyr	Asn	Asn Val	Gly 1695	Thr Gly	Ala

185

ATC TAC GAT	GTA AAA	CCT ACA ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC GAT ACT	2640
Ile	Tyr Asp 1700	Val	Lys	Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn	Asn	Asp	Thr
1705	1710
ATC	GCA ACT	ATT	ACG	GCG AAA TCT AAT	TCT ACA GCC TTA	AAT	ATA	TCT	2688
Ile Ala Thr 1715	Ile	Thr	Ala Lys Ser Asn 1720	Ser Thr Ala Leu 1725	Asn	Ile	Ser 1730
CCT	GGA GAA	AGT	TAC	CCG AAA AAA GGA	CAA AAT GGA ATC	GCA	ATA	ACA	2736
Pro	Gly Glu	Ser	Tyr Pro Lys Lys Gly 1735	Gin Asn Gly Ile 1740	Ala	Ile Thr 1745
TCA	ATG GAT	GAT	TTT	AAT TCC CAT CCG	A.TT ACA TTA AAT	AAA	AAA	CAA	2784
Ser	Mer A.sp	A.sp Phe 1750	Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn 1755	Lys Lys 1760	Gin
GTA	GAT AAT	CTG	CTA	AAT AAT AAA CCT	ATG ATG TTG GAA	ACA	AAC	CAA	2832
Val	Asp Asn Leu 1765	Leu	Asn Asn Lys Pro 1770	Met Met Leu Glu Thr 1775	Asn	Gin
ACA	GAT GGT	GTT	TAT	AAG ATA AAA GAT	ACA CAT GGA AAT	ATA	GTA	ACT	2880
Thr	Asp Gly 1780	Val	Tyr	Lys Ile Lys Asp 1785	Thr His Gly Asn 1790	Ile	Val	Thr
GGC	GGA GAA	TGG	AAT	GGT GTC ATA CAA	CAA ATC AAG GCT	AAA	ACA	GCG	2928
Gly Gly Glu 1795	Trp	Asn	Gly Val Ile Gin 1800	Gin Ile Lys Ala 1805 '	Lys	Thr	Ala 1810
TCT	A.TT ATT	GTG	GAT	GAT GGG GAA CGT	GTA GCA GAA AAA	CGT	GTA	GCG	2976
Ser	Ile Ile	Val	Asp A.sp Gly Glu Arg 1815	Val Ala Glu Lys 1820	Arg	Val Ala 1825
GCA	AAA GAT	TAT	GAA	AAT CCA GAA GAT	AAA ACA CCG TCT	TTA	ACT	TTA	3024
.Ala	Lys Asp	Tyr Glu 1830	Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser 1835	Leu Thr 1840	Leu
AAA	GAT GCC	CTG	AAG	CTT TCA TAT CCA	GAT GAA ATA AAA	GAA	ATA	GAG	3072
Lys	Asp Ala Leu 1845	Lys	Leu Ser Tyr Pro 1850	Asp Glu Ile Lys Glu 1855	Ile	Glu
GGA	TTA TTA	TAT	TAT	AAA AAC AAA CCG	ATA TAC GAA TCG	AGC	GTT	ATG	3120
Gly	Leu Leu 1860	Tyr	Tyr	Lys Asn Lys Pro 1865	Ile Tyr Glu Ser 1870	Ser	Val	Met
ACT	TAC TTA	GAT	GAA	AAT ACA GCA AAA	GAA GTG ACC AAA	CAA	TTA	AAT	3168
Thr 1875	Tyr Leu	Asp	Glu	Asn Thr Ala Lys 1880	Glu Val Thr Lys 1885	Gin	Leu	Asn 1890
GAT	ACC ACT	GGG	AAA	TTT AAA GAT GTA	AGT CAT TTA TAT	GAT	GTA	AAA	3216
Asp	Thr Thr	Gly	Lys 1895	Phe Lys Asp Val >	Ser His Leu Tyr 1900	Asp	Val 1905	Lys >
CTG	ACT CCA	MA	ATG	AAT GTT ACA ATC	AAA TTG TCT ATA	CTT	TAT	GAT	3264
Leu	Thr Pro	Lys	Met	Asn Val Thr Ile	Lys Leu Ser Ile	Leu	Tyr Asp

186

1910 1915 1920

AAT Asn	GCT Ada	GAG TCT Glu Ser 1925	AAT GAT A.sn .Asp	AAC Asn	TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC ACA AAT	3312
Ser Ile 1930	Gly	Lys Trp Thr Asn Thr 1935	Asn
ATT	GTT	TCA GGT	GGA AAT	AAC	GGA AAA	AAA	CAA TAT TCT TCT AAT	AAT	3360
Ile	Val Ser Gly 1940	Gly Asn	Asn Gly Lys 1945	Lys	Gin Tyr Ser Ser Asn 1950	Asn
CCG	GA.T	GCT AAT	TTG ACA	TTA	AAT ACA	GAT	GCT CAA GAA AAA TTA	AAT	3408
Pro Asp 1955	.Ala A.sn	Leu Thr Leu 1960	Asn Thr	Asp	Ala Gin Glu Lys Leu 1965	Asn 1970
.AAA	AAT	CGT GAC	TAT TAT	ATA.	AGT TTA	TAT	ATG AAG TCA GAA AAA	AAC	3456
Lys	.Asn	Arg .Asp	Tvr Tyr 1975	Ile	Ser Leu	Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn 1980 1985
AGA	CAA.	TGT GAG	ATT ACT	ATA.	GAT GGG	GAG	ATT TAT CCG ATC ACT	ACA	3504
Thr	Gin	Cys Glu Ile Thr 1990	Ile	Asp Gly Glu 1995	Ile Tyr Pro Ile Thr 2000	Thr
AAA	ACA	GTG AA.T	GTG .AAT	AAA	GAC AAT	TAC	AAA AGA TTA GAT ATT	ATA	3552
Lys	Thr	Val Asn 2005	Val A.sn	Lys	Asp Asn 2010	Tyr	Lys Arg Leu .Asp Ile 2015	Ile
GCT	CAT	AA.T .ATA.	AAA AGT	AAT	CCA ATT	TCT	TGA CTT CAT ATT AAA	ACG	3600
Ala	His .Asn Ile 2020	Lys Ser	Asn Pro Ile 2025	Ser	Ser Leu His Ile Lys 2030	Thr
AA.T	GAT	GAA ATA	ACT TTA	TTT	TGG GAT	GAT	ATT TCT ATA ACA GAT	GTA	3648
Asn Asp 2035	Glu Ile	Thr Leu Phe 2040	Trp Asp	Asp	Ile Ser Ile Thr Asp 2045	Val 2050
GCA	TCA	ATA AAA	CCG GAA	AAT	TTA ACA	GAT	TCA GAA ATT AAA CAG	ATT	3696
Ala	Ser	Ile Lys	Pro Glu 2055	Asn	Leu Thr	ASP 206C	Ser Glu Ile Lys Gin ) 2065	Ile
TAT	AGT	AGG TAT	GGT ATT	AAG	TTA GAA	GAT	GGA ATC CTT ATT GAT	AAA	3744
Tyr	Ser	Arg Tyr 20VC	Gly Ile )	Lys	Leu Glu Asp 2075	Gly Ile Leu Ile Asp 2080	Lys
AAA	GGT	GGG ATT	CAT TAT	GGT	GAA TTT	ATT	AAT GAA GCT AGT TTT	AAT	3792
Lys	Gly	Gly Ile 2085	His Tyr	Gly	Glu Phe 2090	Ile	Asn Glu Ala Ser Phe 2095	Asn
ATT	GAA	CGA TTG	CAA AAT	TAT	GTG ACC	AAA	TAT GAA GTT ACT TAT	AGT	3840
Ile	Glu 2100	Pro Leu 1	Gin Asn	Tyr 2105	Val Thr >	Lys	Tyr Glu Val Thr Tyr 2110	Ser
AGT	GAG	TTA GGA	CCA AAC	GTG	AGT GAC	ACA	CTT GAA AGT GAT AAA	ATT	3888
Ser 2115	Glu	Leu Gly	Pro A.sn 2120	Val	Ser A.sp	Thr	Leu Glu Ser Asp Lys 2125	Ile 2130
TAC	AAG	GAT GGG	ACA ATT	AAA	TTT GAT	TTT	ACC AAA TAT AGT AAA	AAT	3936

187

Tyr

Lys

Asp

Gly Thr Ile 2135

Lys

Phe

Asp

Phe Thr 2140

Lys

Tyr

Ser Lys Asn 2145

G.AA

CAA

GGA

TTA TTT

TAT

GAC

AGT

GGA

TTA

AAT

TGG

GAC

TTT AAA

ATT

3984

Glu

Gin

Gly

Leu Phe 2150

Tyr

Asp

Ser

Gly Leu 2155

Asn

Trp

Asp

Phe Lys 2160

Ile

AAT

GCT

ATT

ACT TAT

GAT

GGT

AAA

GAG

ATG

AAT

GTT

TTT

CAT AGA

TAT

4032

Asn

Ala

Ile 2165

Thr Tyr

Asp

Gly

Lys 217C

Glu 1

Met

Asn

Val

Phe 2175

His Arg

Tyr

AAT AAA TAG 4041

Asn Lys

2180

Informace o sekvenci SEQ ID č. 23:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1346 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

1	(xi)	znázc	arnění	sekvence SEQ	ID	č. :	23 :
Met 1	Lys	Arg Met	Glu Gly 5	Lys Leu Phe Met 10	Val	Ser	Lys Lys Leu Gin 15
Val	Val	Thr Lys 20	Thr Val	Leu Leu Ser Thr 25	Val	Phe	Ser Ile Ser Leu 30
Leu	Asn	Asn Glu 35	Val Ile	Lys Ala Glu Gin 40	Leu	Asn	Ile Asn Ser Gin 45
Ser	Lys 50	Tyr Thr	Asn Leu	Gin Asn Leu Lys 55	Ile	Thr 60	Asp Lys Val Glu
Asp 65	Phe	Lys Glu	Asp Lys 70	Glu Lys Ala Lys	Glu 75	Trp	Gly Lys Glu Lys 80
Glu	Lys	Glu Trp	Lys Leu 85	Thr Ala Thr Glu 90	Lys	Gly	Lys Met Asn Asn 95
Phe	Leu	Asp Asn 100	Lys Asn	Asp Ile Lys Thr 105	Asn	Tyr	Lys Glu Ile Thr 110
Phe	Ser	Met Ala 115	Gly Ser	Phe Glu Asp Glu 120	Ile	Lys	Asp Leu Lys Glu 125
Ile	Asp	Lys Met	Phe Asp	Lys Thr Asn Leu	Ser	Asn	Ser Ile Ile Thr

130 135 140

Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr

188

145 150 155 160

Glu Gly Asn Thr lle Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin 165 170 175

Phe

Leu

Asp

Arg 180

Asp

lle

Lys

Phe

Asp 185

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr 190

His

Leu

Thr

Ala

Gin 195

Gin

Val

Ser

Ser

Lys 200

Glu

Arg

Val

lle

Leu 205

Lys

Val

Thr

Val

Pro 210

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser 215

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys 220

Ala

Gly

Val

lle

Leu 225

Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr 230

Lys

Met

Leu

lle

Asd 235

Asn

Gly

Tyr

Met

Val 240

His

Val

Asp

Lys

Val 245

Ser

Lys

Val

Val

Lys 250

Lys

Gly

Val

Glu

Cys 255

Leu

Gin

lle

Glu

Gly 260

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser 265

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn 270

Asp

lle

Asn

Ala

Glu 275

AiLa

His

Ser

Trp

Gly 280

Met

Lys

Asn

Tyr

Glu 285

Glu

Trp

Ala

Lys

Asp 290

Leu

Thr

.Asp

Ser

Gin 295

Arg

Glu

Ala

Leu

A.sp 300

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gin 305

Asp

Tyr

Lys

Glu

lle 310

Asn

.Asn

Tyr

Leu

Arg 315

Asn

Gin

Gly Gly

Ser 320

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu 325

Asp

Ala

Gin

lle

Lys 330

Asn

lle

Ser

Asp

Ala 335

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro 340

lle

Pro

Glu

Asn

lle 345

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp 350

Cys

Gly

Met

Pro

Glu 355

Phe

Gly

Tyr

Gin

lle 360

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro 365

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe 370

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu 375

A.sn

Thr

lle

Lys

Glu 380

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met 385

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser 390

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala 395

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg 400

Lys

lle

lle

Leu

Arg 405

Leu

Gin

Val

Pro

Lys 410

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala 415

Tyr

Leu

Ser

Ala

lle 420

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser 425

Glu

Lys

Glu

lle

Leu 430

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser 435

Lys

Tyr

His

lle

Asp 440

Lys

Val

Thr

Glu

Val 445

ne

lle

Lys

189

Gly

Val 4 50

Lys

Arg

Tyr

Val

Val 455

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu 460

Thr

Asn

Met

Lys

Asn 465

Met

Lys

Lys

Lys

Leu 470

Ala

Ser

Val

Val

Thr 475

Cys

Thr

Leu

Leu

Ala 480

Pro

Met

Phe

Leu

Asn 485

Gly

Asn

Val

Asn

Ala 4 90

Val

Tyr

Ala

Asp

Ser 495

Lys

Thr

Asn

Gin

Ile 500

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys 505

Asn

Gin

Gin

Lys

Glu 510

Met

Asp

Arg

Lys

Gly 515

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr 520

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp 525

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr 530

Met

Phe

Ala

Pro

Thr 535

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu 540

Ile

Tyr

Asp

Gin

Gin 545

Thr

Ala

Asn

Lys

Leu 550

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin 555

Gin

Glu

Tyr

Gin

Ser 560

Ile

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

Phe

Thr

565 570 575

Phe

Asn

Leu

Ser 580

Glu

Asp

Glu

Gin

Ala 585

Ile

Ile

Glu

Ile

A.sn 590

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser 595

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu 600

Lys

Gin

Val

Val

His 605

Leu

Glu

Lys

Gly

Lys 610

Leu

Val

Pro

Ile

Lys 615

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser 620

Asp

Thr

Lys

Phe

Asn 625

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr 630

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys 635

Leu

Phe

Lys

Ile

Asp 640

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro 645

Gin

Gin

Val

Gin

Gin 650

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn 655

Pro

Glu

Phe

Asn

Lys 660

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu 665

Phe

Leu

Ala

Lys

Pro 670

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu 675

Phe

Thr

Gin

Lys

Met 680

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp 685

Glu

Asp

Thr

Asp

Thr 690

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile 695

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu 700

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr 705

Ile

Gin

Asn

Arg

Ile 710

Ala

Val

Lys

Trp

Asp 715

Asp

Ser

Leu

Ala

Ser 720

Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val 725 730 735

190

Gly

Asp

Pro

Tyr 740

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys 745

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu 750

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala 755

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn 760

Pro

Leu

Val

Ala

Ala 765

Phe

Pro

Ser

Val

Asn 770

Val

Ser

Met

Glu

Lys 775

Val

lle

Leu

Ser

Pro 780

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser 785

Asn

Ser

Val

Glu

Ser 790

His

Ser

Ser

Thr

Asn 795

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn 800

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser 805

Val

Glu

Ala

Gly

lle 810

Gly

Pro

Lys

Gly

lle 815

Ser

Phe

Gly

Val

Ser 820

Val

Asn

Tyr

Gin

His 825

Ser

Glu

Thr

Val

Ala 830

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr 835

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr 840

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr 845

Ala

Ser

Ala

Gly

Tyr 850

Leu

Asn

Ala

Asn

Val 855

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val 860

Gly

Thr

Gly

Ala

lle 865

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro 870

Thr

Thr

Ser

Phe

Val 875

Leu

Asn

.Asn

Asp

Thr 880

lle

AJa

Thr

lle

Thr 885

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser 890

Thr

Ala

Leu

A.sn

lle 895

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser 900

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly 905

Gin

Asn

Gly

lle

Ala 910

lle

Thr

Ser

Met

Asp 915

Asp

Phe

Asn

Ser

His 920

Pro

lle

Thr

Leu

Asn 925

Lys

Lys

Gin

Val

Asp 930

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn 935

Lys

Pro

Met

Met

Leu 940

Glu

Thr

Asn

Gin

Thr 945

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys 950

lle

Lys

Asp

Thr

His 955

Gly

Asn

lle

Val

Thr 960

Gly Gly

Glu

Trp

Asn 965

Gly

Val

lle

Gin

Gin 970

lle

Lys

A2La

Lys

Thr 975

Ala

Ser

lle

lle

Val 980

Asp

Asp

Gly

Glu

A_rg 985

Val

Ala

Glu

Lys

Arg 990

Val

Ala

Ala

Lys

Asp 995

Tyr

Glu

Asn

Pro

Glu 1000

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser 1005

Leu

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

lle

Lys

Glu

lle

Glu

1010 1015 1020

Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser Val Met

191

1025 1030 1035 1040

Thr	Tyr	Leu Asp	Glu A.sn Thr Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn
1045	1050	1055
Asp	Thr	Thr Gly Lys Phe 1060	Lys Asp Val Ser His Leu Tyr 1065	Asp Val Lys 1070
Leu	Thr	Pro Lys 1075	Met Asn	Val Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp 1080 1085
Asn	Ada Glu Ser 1090	A.sn Asp	Asn Ser Ile Gly Lys Trp Thr 1095 1100	Asn Thr Asn
Ile Vel 1105	Ser Gly	Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser 1110 1115	Ser Asn Asn 1120
Pro	Asp	Ada A.sn	Leu Thr 1125	Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu 1130	Lys Leu Asn 1135
Lys	Asn	Arg Asp Tyr Tyr 1140	Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser 1145	Glu Lys Asn 1150
Thr	Gin	Cys Glu 1155	Ile Thr	Ile Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr 1160 ” 1165
Lys	Thr Val Asn 1170	Val Asn	Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu 1175 * 1180	Asp Ile Ile
Ala His 1185	Asn Ile	Lys Ser Asn Pro Ile Ser Ser Leu His 1190 1195	Ile Lys Thr 1200
.Asn	.Asp	Glu Ile	Thr Leu 1205	Phe Trp Asp Asp Ile Ser Ile 1210	Thr Asp Val 1215
Ada	Ser	Ile Lys 122C	Pro Glu )	Asn Leu Thr Asp Ser Glu Ile 1225	Lys Gin Ile 1230
Tyr	Ser	Arg Tyr 1235	Gly Ile	Lys Leu Glu Asp Gly Ile Leu 1240 1245	Ile Asp Lys
Lys	Gly 125C	Gly Ile 1	His Tyr	Gly Glu Phe Ile Asn Glu Ala 1255 1260	Ser Phe Asn
Ile 1265	Glu 1	Pro Leu	Gin Asn 1270	Tyr Val Thr Lys Tyr Glu Val 1275	Thr Tyr Ser 1280
Ser	Glu	Leu Gly	Pro A.sn 1285	Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser 1290	Asp Lys Ile 1295
Tyr	Lys	Asp Gly 1300	Thr Ile	Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr 1305	Ser Lys Asn 1310
clu	Gin	Gly Leu 1315	Phe Tyr	Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp 1320 1325	Phe Lys Ile

192

Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr

1330 1335 1340

Asn Lys 1345

Informace o sekvenci SEQ ID č. 24:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1399 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..1386 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIP2A(a) z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 24:

ATGAAGCGCA	TGGAGGGCAA	GCTGTTCATG	GTGAGCAAGA	AGCTCCAGGT	GGTGACCAAG	60
ACCGTGCTGC	TGAGCACCGT	GTTCAGCATC	AGCCTGCTGA	ACAACGAGGT	GATCAAGGCC	120
GAGCAGCTGA	ACATCAACAG	CCAGAGCAAG	TACACCAACC	TCCAGAACCT	GAAGATCACC	180
GACAAGGTGG	AGGACTTCAA	GGAGGACAAG	GAGAAGGCCA	AGGAGTGGGG	CAAGGAGAAG	240
GAGAAGGAGT	GGAAGCTTAC	CGCCACCGAG	AAGGGCAAGA	TGAACAACTT	CCTGGACAAC	300
aagaacgaca	TCAAGACCAA	CTACAAGGAG	ATCACCTTCA	GCATGGCCGG	CAGCTTCGAG	360
GACGAGATCA	AGGACCTGAA	GGAGATCGAC	AAGATGTTCG	ACAAGACCAA	CCTGAGCAAC	420
AGCATCATCA	CCTACAAGAA	CGTGGAGCCC	ACCACCATCG	GCTTCAACAA	GAGCCTGACC	480
GAGGGCAACA	CCATCAACAG	CGACGCCATG	GCCCAGTTCA	AGGAGCAGTT	CCTGGACCGC	540
GACATCAAGT	TCGACAGCTA	CCTGGACACC	CACCTGACCG	CCCAGCAGGT	GAGCAGCAAG	600
GAGCGCGTGA	TCCTGAAGGT	GACCGTCCCC	AGCGGCAAGG	GCAGCACCAC	CCCCACCAAG	660
GCCGGCGTGA	TCCTGAACAA	CAGCGAGTAC	AAGATGCTGA	TCGACAACGG	CTACATGGTG	720
CACGTGGACA	AGGTGAGCAA	GGTGGTGAAG	AAGGGCGTGG	AGTGCCTCCA	GATCGAGGGC	780
ACCCTGAAGA	AGAGTCTAGA	CTTCAAGAAC	GACATCAACG	CCGAGGCCCA	CAGCTGGGGC	840

193

ATGAAGAACT ACGAGGAGTG GGCCAAGGAC CTGACCGACA GCCAGCGCGA GGCCCTGGAC 900

GGCTACGCCC GCCAGGACTA CAAGGAGATC AACAACTACC TGCGCAACCA GGGCGGCAGC 960

GGCAACGAGA AGCTGGACGC CCAGATCAAG AACATCAGCG ACGCCCTGGG CAAGAAGCCC 1020

ATCCCCGAGA ACATCACCGT GTACCGCTGG TGCGGCATGC CCGAGTTCGG CTACCAGATC 1080

AGCGACCCCC TGCCCAGCCT GAAGGACTTC GAGGAGCAGT TCCTGAACAC CATCAAGGAG 1140

GACAAGGGCT ACATGAGCAC CAGCCTGAGC AGCGAGCGCC TGGCCGCCTT CGGCAGCCGC 1200

AAGATCATCC TGCGCCTGCA GGTGCCCAAG GGCAGCACCG GCGCCTACCT GAGCGCCATC 1260

GGCGGCTTCG CCAGCGAGAA GGAGATCCTG CTGGACAAGG ACAGCAAGTA CCACATCGAC 1320

AAGGTGACCG AGGTGATCAT CAAGGGCGTG AAGCGCTACG TGGTGGACGC CACCCTGCTG 1380

ACCAACTAGA TCTGAGCTC 1399

Informace o sekvenci SEQ ID č. 25:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 19 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: peptid (B) lokace: 1..19 (D) další informace: poznámka = sekreční signální peptid pro sekreci VIP2 z buňky (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 25:

Gly Trp Ser Trp lle Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ada Ala Gly Val 1 5 10 15

His Cys Leu

Informace o sekvenci SEQ ID č. 26:

(i) charakteristiky sekvence:

194 (A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina

(A)	popis: syntetická DNA
hypotetická: není
vlastnosti:
(A)	jméno/klíč: různá vlastnost
(B)	lokace : 1..2655
(D)	další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIPlA(a) optimalizovaná pro kuku- rici

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 26:

ATGAAGAACA	TGAAGAAGAA	GCTGGCCAGC	GTGGTGACCT	GCACCCTGCT	GGCCCCCATG	60
TTCCTGAACG	GCAACGTGAA	CGCCGTGTAC	GCCGACAGCA	AGACCAACCA	GATCAGCACC	120
ACCCAGAAGA	ACCAGCAGAA	GGAGATGGAC	CGCAAGGGCC	TGCTGGGCTA	CTACTTCAAG	180
GGCAAGGACT	TCAGCAACCT	GACCATGTTC	GCCCCCACGC	gtgacagcac	CCTGATCTAC	240
GACCAGCAGA	CCGCCAACAA	GCTGCTGGAC	AAGAAGCAGC	AGGAGTACCA	GAGCATCCGC	300
TGGATCGGCC	TGATCCAGAG	CAAGGAGACC	GGCGACTTCA	CCTTCAACCT	GAGCGAGGAC	360
GAGGAGGCCA	TCATCGAGAT	CAACGGCAAG	ATCATCAGCA	ACAAGGGCAA	GGAGAAGCAG	420
GTGGTGCACC	TGGAGAAGGG	CAAGCTGGTG	CCCATCAAGA	TCGAGTACCA	GAGCGACACC	480
AAGTTCAACA	TCGACAGCAA	GACCTTCAAG	GAGCTGAAGC	TTTTCAAGAT	CGACAGCCAG	540
AACCAGCCCC	AGCAGGTGCA	GCAGGACGAG	CTGCGCAACC	CCGAGTTCAA	CAAGAAGGAG	600
AGCCAGGAGT	TCCTGGCCAA	GCCCAGCAAG	ATCAACCTGT	TCACCCAGCA	GATGAAGCGC	660
GAGATCGACG	AGGACACCGA	CACCGACGGC	GACAGCATCC	CCGACCTGTG	GGAGGAGAAC.	720
GGCTACACCA	TCCAGAACCG	CATCGCCGTG	AAGTGGGACG	ACAGCCTGGC	TAGCAAGGGC	780
TACACCAAGT	TCGTGAGCAA	CCCCCTGGAG	AGCCACACCG	TGGGCGACCC	CTACACCGAC	840
TACGAGAAGG	CCGCCCGCGA	CCTGGACCTG	AGCAACGCCA	AGGAGACCTT	CAACCCCCTG	900

195

GTGGCCGCCT	TCCCCAGCGT	GAACGTGAGC	ATGGAGAAGG	TGATCCTGAG	CCCCAACGAG	960
AACCTGAGCA	ACAGCGTGGA	GAGCCACTCG	AGCACCAACT	GGAGCTACAC	CAACACCGAG	1020
GGCGCCAGCG	TGGAGGCCGG	CATCGGTCCC	AAGGGCATCA	GCTTCGGCGT	GAGCGTGAAC	1080
TACCAGCACA	GCGAGACCGT	GGCCCAGGAG	TGGGGCACCA	GCACCGGCAA	CACCAGCCAG	1140
TTC.AACACCG	CCAGCGCCGG	CTACCTGAAC	GCCAACGTGC	GCTACAACAA	CGTGGGCACC	1200
GGCGCCATCT	ACGACGTGAA	GCCCACCACC	AGCTTCGTGC	TGAACAACGA	CACCATCGCC	1260
ACCATCACCG	CCAAGTCGAA	TTCCACCGCC	CTGAACATCA	GCCCCGGCGA	GAGCTACCCC	1320
AAGAAGGGCC	AGAACGGCAT	CGCCATCACC	AGCATGGACG	ACTTCAACAG	CCACCCCATC	1380
ACCCTGAACA	AGAAGCAGGT	GGACAACCTG	CTGAACAACA	AGCCCATGAT	GCTGGAGACC	1440
AACCAGACCG	ACGGCGTCTA	CAAGATCAAG	GACACCCACG	GCAACATCGT	GACGGGCGGC	1500
GAGTGGAACG	GCGTGATCCA	GCAGATCAAG	GCCAAGACCG	CCAGCATCAT	CGTCGACGAC	1560
GGCGAGCGCG	TGGCCGAGAA	GCGCGTGGCC	GCCAAGGACT	ACGAGAACCC	CGAGGACAAG	1620
ACCCCCAGCC	TGACCCTGAA	GGACGCCCTG	AAGCTGAGCT	ACCCCGACGA	GATCAAGGAG	1680
ATCGAGGGCT	TGCTGTACTA	CAAGAACAAG	CCCATCTACG	AGAGCAGCGT	GATGACCTAT	1740
CTAGACGAGA	ACACCGCCAA	GGAGGTGACC	AAGCAGCTGA	ACGACACCAC	CGGCAAGTTC	1800
AAGGACGTGA	GCCACCTGTA	CGACGTGAAG	CTGACCCCCA	AGATGAACGT	GACGATCAAG	1860
CTGAGCATCC	TGTACGACAA	CGCCGAGAGC	AACGACAACA	GCATCGGCAA	GTGGACGAAC	1920
ACCAACATCG	TGAGCGGCGG	CAACAACGGC	AAGAAGCAGT	ACAGGAGCAA	GAACCCCGAC	1980
GCCAACCTGA	CCCTGAACAC	CGACGCCCAG	GAGAAGCTGA	ACAAGAACCG	CGACTACTAC	2040
ATCAGCCTGT	ACATGAAGAG	CGAGAAGAAC	ACCCAGTGCG	AGATCACCAT	CGACGGCGAG	2100
ATATACCCCA	TCACCACCAA	GACCGTGAAC	GTGAACAAGG	ACAACTACAA	GCGCCTGGAC	2150
ATCATCGCCC	ACAACATCAA	GAGCAACCCC	ATCAGCAGCC	TGCACATCAA	GACCAACGAC	2220
GAGATCACCC	TGTTCTGGGA	CGACATATCG	ATTACCGACG	TCGCCAGCAT	GAAGCCCGAG	2280
AACCTGACCG	ACAGCGAGAT	CAAGCAGATA	TACAGTCGCT	ACGGCATCAA	GCTGGAGGAC	2340
GGCATCCTGA	TCGACAAGAA	AGGCGGCATC	CACTACGGCG	AGTTCATCAA	CGAGGCGAGC	2400
TTCAACATCG	AGCCCCTGCA	GAACTACGTG	ACCAAGTACG	AGGTGACCTA	CAGCAGCGAG	2460
CTGGGCCCCA	ACGTGAGCGA	CACCCTGGAG	AGCGACAAGA	TTTACAAGGA	CGGCACCATC	2520
AAGTTCGACT	TCACCAAGTA	CAGCAAGAAC	GAGCAGGGCC	TGTTCTACGA	GAGCGGCCTG	2580

196

AACTGGGACT TCAAGATCAA CGCCATCACC TACGACGGCA AGGAGATGAA CGTGTTCCAC 2640

CGCTACAACA AGTAG 2655

Informace o sekvenci SEQ ID č. 27:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1389 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina

(A)	popis: syntetická	DNA
hypotetická: není
vlastnosti:
(A)	jměno/klíč: různá	vlastnost
(B)	lokace : 1..1389
(D)	další informace: poznámka = DNA-sekvence
	kódující VIP2A(a) říci	optimalizovaná pro kuku-

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 27:

ATGAAGCGCA	TGGAGGGCAA	GCTGTTCATG	GTGAGCAAGA	AGCTCCAGGT	GGTGACCAAG	60
ACCGTGCTGC	TGAGCACCGT	GTTCAGCATC	AGCCTGCTGA	ACAACGAGGT	GATCAAGGCC	120
GAGCAGCTGA	ACATCAACAG	CCAGAGCAAG	TACACCAACC	TCCAGAACCT	GAAGATCACC	180
GACAAGGTGG	AGGACTTCAA	GGAGGACAAG	GAGAAGGCCA	AGGAGTGGGG	CAAGGAGAAG	240
GAGAAGGAGT	GGAAGCTTAC	CGCCACCGAG	AAGGGCAAGA	TGAACAACTT	CCTGGACAAC	300
AAGAACGACA	TCAAGACCAA	CTACAAGGAG	ATCACCTTCA	GCATAGCCGG	CAGCTTCGAG	360
GACGAGATCA	AGGACCTGAA	GGAGATCGAC	AAGATGTTCG	ACAAGACCAA	CCTGAGCAAC	420
AGCATCATCA	CCTACAAGAA	CGTGGAGCCC	ACCACCATCG	GCTTCAACAA	GAGCCTGACC	480
GAGGGCAACA	CCATCAACAG	CGACGCCATG	GCCCAGTTCA	AGGAGCAGTT	CCTGGACCGC	540
GACA.TCAAGT	TCGACAGCTA	CCTGGACACC	CACCTGACCG	CCCAGCAGGT	GAGCAGCAAG	600
GAGCGCGTGA	TCCTGAAGGT	GACCGTCCCC	AGCGGCAAGG	GCAGCACCAC	CCCCACCAAG	660

197

GCCGGCGTGA	TCCTGAACAA	cagcgagtac	AAGATGCTGA	TCGACAACGG	CTACATGGTG	720
CACGTGGACA	AGGTGAGCAA	ggtggtgaag	AAGGGCGTGG	AGTGCCTCCA	GATCGAGGGC	780
ACCCTGAAGA	AGAGTCTAGA	cttcaagaac	GACATCAACG	CCGAGGCCCA	CAGCTGGGGC	840
ATGAAGAACT	ACGAGGAGTG	ggccaaggac	CTGACCGACA	GCCAGCGCGA	GGCCCTGGAC	900
GGCTACGCCC	GCCAGGACTA	caaggagatc	AACAACTACC	TGCGCAACCA	GGGCGGCAGC	960
GGCAACGAGA	AGCTGGACGC	ccagatcaag	AACATCAGCG	ACGCCCTGGG	CAAGAAGCCC	1020
ATCCCCGAGA	ACATCACCGT	gtaccgctgg	TGCGGCATGC	CCGAGTTCGG	CTACCAGATC	1080
AGCGACCCCC	TGCCCAGCCT	gaaggacttc	GAGGAGCAGT	TCCTGAACAC	CATCAAGGAG	1140
GACAAGGGCT	ACATGAGCAC	CAGCCTGAGC	AGCGAGCGCC	TGGCCGCCTT	CGGCAGCCGC	1200
AAGATCATCC	TGCGCCTGCA	GGTGCCCAAG	GGCAGCACTG	GTGCCTACCT	GAGCGCCATC	1260
GGCGGCTTCG	CCAGCGAGAA	GGAGATCCTG	CTGGATAAGG	ACAGCAAGTA	CCACATCGAC	1320
AAGGTGACCG	aggtgatcat	CAAGGGCGTG	.AAGCGCTACG	TGGTGGACGC	CACCCTGCTG	1380

ACCAACTAG 1389

Informace o sekvenci SEQ ID č. 28:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2378 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..2375 (D) další informace: poznámka = nativní DNAsekvence kódující protein VIP3A(a) z AB88 jak je obsažena v pCIB7104

198 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 28:

AGATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA 50

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro

10

AGT TTT ATT GAT TAT TTT

AAT Asn

GGC ATT Gly Ile

TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC

98

Ser Phe 15

Ile

Asp

Tyr

Phe 20

Tyr

Gly 25

Phe

Ala

Thr

Gly Ile 30

AAA

GAC

ATT

ATG

AAC

ATG

ATT

TTT

AAA

ACG

GAT

ACA

GGT

GGT

GAT

CTA

146

Lys

Asp

Ile

Met

Asn

Met

Ile

Phe

Lys

Thr

Asp

Thr

Gly

Gly Asp

Leu

35

40

45

ACC

CTA

GAC

GAA

ATT

TTA

AAG

AAT

CAG

CAG

TTA

CTA

AAT

GAT

ATT

TCT

194

Thr

Leu

Asp

Glu

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Gin

Leu

Leu

Asn

Asp

Ile

Ser

50

55

60

GGT

AAA

TTG

GAT

GGG

GTG

AAT

GGA

AGC

TTA

AAT

GAT

CTT

ATC

GCA

CAG

242

Gly

Lys

Leu

Asp

Gly

Val

Asn

Gly

Ser

Leu

Asn

Asp

Leu

Ile

Ala

Gin

65

70

75

GGA

AAC

TTA

AAT

ACA

GAA

TTA

TCT

AAG

GAA

ATA

TTA

AAA

ATT

GCA

AAT

290

Gly

Asn

Leu

Asn

Thr

Glu

Leu

Ser

Lys

Glu

Ile

Leu

Lys

Ile

Ala

Asn

80

85

90

GAA

CAA

AAT

CAA

GTT

TTA

AAT

GAT

GTT

AAT

AAC

AAA

CTC

GAT

GCG

ATA

338

Glu

Gin

Asn

Gin

Val

Leu

Asn

Asp

Val

Asn

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

Ile

95

100

105

110

AAT

ACG

ATG

CTT

CGG

GTA

TAT

CTA

CCT

AAA

ATT

ACC

TCT

ATG

TTG

AGT

386

Mn

Thr

Met

Leu

Arg

Val

Tyr

Leu

Pro

Lys

Ile

Thr

Ser

Met

Leu

Ser

115

120

125

GAT

GTA

ATG

AAA

CAA

AAT

TAT

GCG

CTA

AGT

CTG

CAA

ATA

GAA

TAC

TTA

434

Asp

Val

Met

Lys

Gin

Asn

Tyr

Ala

Leu

Ser

Leu

Gin

Ile

Glu

Tyr

Leu

130

135

140

AGT

AAA

CAA

TTG

CAA

eAG

ATT

TCT

GAT

AAG

TTG

GAT

ATT

ATT

AAT

GTA

482

Ser

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser

Asp

Lys

Leu

Asp

Ile

Ile

Asn

Val

145

150

155

AAT

GTA

CTT

ATT

AAC

TCT

ACA

CTT

ACT

GAA

ATT

ACA

CCT

GCG

TAT

CAA

530

Asn

Val

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr

Leu

Thr

Glu

Ile

Thr

Pro

Ala

Tyr

Gin

160

165

170

AGG

ATT

AAA

TAT

GTG

AAC

GAA

AAA

TTT

GAG

GAA

TTA

ACT

TTT

GCT

ACA

578

Arg

Ile

Lys

Tyr

Val

Asn

Glu

Lys

Phe

Glu

Glu

Leu

Thr

Phe

Ala

Thr

175

180

185

190

GAA

ACT

AGT

TCA

AAA

GTA

AAA

AAG

GAT

GGC

TCT

CCT

GCA

GAT

ATT

CTT

626

Glu

Thr

Ser

Ser

Lys

Val

Lys

Lys

Asp

Gly

Ser

Pro

Ala

Asp

Ile

Leu

195 200 205

199

GAT Asp

GAG TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT

674

Glu

Leu

Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn

210

215

220

GAT

GTG

GAT

GGT

TTT

GAA

TTT

TAC

CTT

AAT

ACA

TTC

CAC

GAT

GTA

ATG

722

Asp

Val

Asp

Gly

Phe

Glu

Phe

Tyr

Leu

Asn

Thr

Phe

His

Asp

Val

Met

225

230

235

GTA

GGA

AAT

AAT

TTA

TTC

GGG

CGT

TCA

GCT

TTA

AAA

ACT

GCA

TCG

GAA

770

Val

Gly

Asn

Asn

Leu

Phe

Gly Arg

Ser

Ala

Leu

Lys

Thr

Ala

Ser

Glu

240

245

250

TTA

ATT

ACT

AAA

GAA

AAT

GTG

AAA

ACA

AGT

GGC

AGT

GAG

GTC

GGA

AAT

818

Leu

Ile

Thr

Lys

Glu

Asn

Val

Lys

Thr

Ser

Gly

Ser

Glu

Val

Gly

Asn

255

260

265

270

GTT

TAT

AAC

TTC

TTA

ATT

GTA

TTA

ACA

GCT

CTG

CAA

GCC

CAA

GCT

TTT

866

Val

Tyr

Asn

Phe

Leu

Ile

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Gin

Ala

Phe

275

280

285

CTT

ACT

TTA

ACA

ACA

TGC

CGA

AAA

TTA

TTA

GGC

TTA

GCA

GAT

ATT

GAT

914

Leu

Thr

Leu

Thr

Thr

Cys

Arg

Lys

Leu

Leu

Gly

Leu

Ala

Asp

Ile

Asp

290

295

300

TAT

ACT

TCT

ATT

ATG

AAT

GAA

CAT

TTA

AAT

AAG

GAA

AAA

GAG

GAA

TTT

962

Tyr

Thr

Ser

Ile

Met

Asn

Glu

His

Leu

Asn

Lys

Glu

Lys

Glu

Glu

Phe

305

310

315

AGA

GTA

AAC

ATC

CTC

CCT

ACA

CTT

TCT

AAT

ACT

TTT

TCT

AAT

CCT

AAT

1010

Arg

Val

Asn

Ile

Leu

Pro

Thr

Leu

Ser

Asn

Thr

Phe

Ser

Asn

Pro

Asn

320

325

330

TAT

GCA

AAA

GTT

AAA

GGA

AGT

GAT

GAA

GAT

GCA

AAG

ATG

ATT

GTG

GAA

1058

Tyr

Ala

Lys

Val

Lys

Gly

Ser

Asp

Glu

Asp

Ala

Lys

Met

Ile

Val

Glu

335

340

345

350

GCT

AAA

CCA

GGA

CAT

GCA

TTG

ATT

GGG

TTT

GAA

ATT

AGT

AAT

GAT

TCA

1106

Ala

Lys

Pro

Gly

His

Ala

Leu

Ile

Gly

Phe

Glu

Ile

Ser

Asn

Asp

Ser

355 360 365

ATT Ile

ACA Thr

GTA TTA AAA GTA TAT GAG

GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA

1154

Val

Leu Lys Val. 370

Tyr Glu

Ala 375

Lys

Leu

Lys

Gin

Asn Tyr Gin 380

GTC

GAT

AAG

GAT

TCC

TTA

TCG

GAA

GTT

ATT

TAT

GGT

GAT

ATG

GAT

AAA

1202

Val

Asp

Lys

Asp

Ser

Leu

Ser

Glu

Val

Ile

Tyr

Gly Asp

Met

Asp

Lys

385

390

395

TTA

TTG

TGC

CCA

GAT

CAA

TCT

GAA

CAA

ATC

TAT

TAT

ACA

AAT

AAC

ATA

1250

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Gin

Ser

Glu

Gin

Ile

Tyr

Tyr

Thr

Asn

A.sn

Ile

400

405

410

GTA

TTT

CCA

AAT

GAA

TAT

GTA

ATT

ACT

AAA

ATT

GAT

TTC

ACT

AAA

AAA

1298

Val

Phe

Pro

Asn

Glu

Tyr

Val

Ile

Thr

Lys

Ile

Asp

Phe

Thr

Lys

Lys

415

420

425

430

- 200 -

ATG

AAA

ACT

TTA

AGA

TAT

GAG

GTA

ACA

GCG

AAT

TTT

TAT

GAT

TCT

TCT

1346

Met

Lys

Thr

Leu

Arg

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Asn

Phe

Tyr

Asp

Ser

Ser

435

440

445

ACA

GGA

GAA

ATT

GAC

TTA

AAT

AAG

AAA

AAA

GTA

GAA

TCA

AGT

GAA

GCG

1394

Thr

Gly

Glu

Ile

Asp

Leu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

Glu

Ser

Ser

Glu

Ala

450

455

460

GAG

TAT

AGA

ACG

TTA

AGT

GCT

AAT

GAT

GAT

GGG

GTG

TAT

ATG

CCG

TTA

1442

Glu

Tyr

Arg

Thr

Leu

Ser

Ala

Asn

Asp

Asp

Gly

Val

Tyr

Met

Pro

Leu

465

470

475

GGT

GTC

ATC

AGT

GAA

ACA

TTT

TTG

ACT

CCG

ATT

AAT

GGG

TTT

CTC

1490

Gly

Val

Ile

Ser

Glu

Thr

Phe

Leu

Thr

Pro

Ile

Asn

Gly

Phe

Gly

Leu

480

485

490

CAA

GCT

GAT

GAA

AAT

TCA

AGA

TTA

ATT

ACT

TTA

ACA

TGT

AAA

TCA

TAT

1538

Gin

Ala

Asp

Glu

Asn

Ser

Arg

Leu

Ile

Thr

Leu

Thr

Cys

Lys

Ser

Tyr

495

500

505

510

TTA

AGA

GAA

CTA

CTG

CTA

GCA

ACA

GAC

TTA

AGC

AAT

AAA

GAA

ACT

AAA

1586

Leu

Arg

Glu

Leu

Leu

Leu

Ala

Thr

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Glu

Thr

Lys

515

520

525

TTG

ATC

GTC

CCG

CCA

AGT

GGT

TTT

ATT

AGC

AAT

ATT

GTA

GAG

A4C

GoG

1634

Leu

Ile

Val

Pro

Pro

Ser

Gly

Phe

Ile

Ser

Asn

Ile

Val

Glu

Asn

Gly

530

535

540

TCC

ATA

GAA

GAG

GAC

AAT

TTA

GAG

CCG

TGG

AAA

GCA

AAT

AAT

AAG

AAT

1682

Ser

Ile

Glu

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

Ala

Asn

Asn

Lys

Asn

545

550

555

GCG

TAT

GTA

GAT

CAT

ACA

GGC

GGA

GTG

AAT

GGA

ACT

AAA

GCT

TTA

TAT

1730

Ala

Tyr

Val

Asp

His

Thr

Gly

Gly

Val

Asn

Gly

Thr

Lys

Ala

Leu

Tyr

560

565

570

GTT

CAT

AAG

GAC

GGA

GGA

ATT

TCA

CAA

TTT

ATT

GGA

GAT

AAG

TTA

AAA

1778

Val

His

Lys

Asp

Gly Gly

Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Gly Asp

Lys

Leu

Lys

575

580

585

590

CCG

AAA

ACT

GAG

TAT

GTA

ATC

CAA

TAT

ACT

GTT

AAA

GGA

AAA

CCT

TCT

1826

Pro

Lys

Thr

Glu

Tyr

Val

Ile

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Gly

Lys

Pro

Ser

595

600

605

ATT

CAT

TTA

AAA

GAT

GAA

AAT

ACT

GGA

TAT

ATT

CAT

TAT

GAA

GAT

ACA

1874

Ile

His

Leu

Lys

Asp

Glu

Asn

Thr

Gly Tyr

Ile

His

Tyr

Glu

Asp

Thr

610

615

620

AAT

AAT

AAT

TTA

GAA

GAT

TAT

CAA

ACT

ATT

AAT

AAA

CGT

TTT

ACT

ACA

1922

Asn

Asn

Asn

Leu

Glu

Asp

Tyr

Gin

Thr

Ile

Asn

Lys

Arg

Phe

Thr

Thr

625 630 635

201

GGA ACT Gly Thr

GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA

1970

Mp Leu

Lys Gly

Val Tyr Leu 645

Ile Leu

Lys 650

Ser Gin

Asn Gly

640

GAT

GAA

GCT

TGG

GGA

GAT

AAC

TTT

ATT

ATT

TTG

GAA

ATT

AGT

CCT

TCT

2018

Asp

Glu

Ala

Trp

Gly

Asp

Asn

Phe

Ile

Ile

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Ser

655

660

665

670

GAA

AAG

TTA

TTA

AGT

CCA

GAA

TTA

ATT

AAT

ACA

AAT

AAT

TGG

ACG

AGT

2066

Glu

Lys

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Leu

Ile

Asn

Thr

Asn

Asn

Trp

Thr

Ser

675

680

685

ACG

GGA

TCA

ACT

AAT

ATT

AGC

GGT

AAT

ACA

CTC

ACT

CTT

TAT

CAG

GGA

2114

Thr

Gly

Ser

Thr

Asn

Ile

Ser

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Gly

690

695

700

GGA

CGA

GGG

ATT

CTA

AAA

CAA

AAC

CTT

CAA

TTA

GAT

AGT

TTT

TCA

ACT

2162

Gly

Arg

Gly

Ile

Leu

Lys

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe

Ser

Thr

705

710

715

TAT

AGA

GTG

TAT

TTT

TCT

GTG

TCC

GGA

GAT

GCT

AAT

GTA

AGG

ATT

AGA

2210

Tyr

Arg

Val

Tyr

Phe

Ser

Val

Ser

Gly

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Ile

Arg

720

725

730

AAT

TCT

AGG

GAA

GTG

TTA

TTT

GAA

AAA

AGA

TAT

ATG

AGC

GGT

GCT

AAA

2258

Asn

Ser

Arg

Glu

Val

Leu

Phe

Glu

Lys

Arg

Tyr

Met

Ser

Gly

Ala

Lys

735

740

745

750

GAT

GTT

TCT

GAA

ATG

TTC

ACT

ACA

AAA

TTT

GAG

AAA

GAT

AAC

TTT

TAT

2306

Asp

Val

Ser

Glu

Met

Phe

Thr

Thr

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Asn

Phe

Tyr

755

760

765

ATA

GAG

CTT

TCT

CAA

GGG

AAT

AAT

TTA

TAT

GGT

GGT

CCT

ATT

GTA

CAT

2354

Ile

Glu

Leu

Ser

Gin

Gly

Asn

Asn

Leu

Tyr

Gly

Gly

Pro

Ile

Val

His

770

775

780

TTT

TAC

GAT

GTC

TCT

ATT

AAG

TAA

2378

Phe

Tyr

Asp

Val

Ser

Ile

Lys

785

Informace o sekvenci SEQ ID č. 29:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

202 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 29:

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe .5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

25 30 .

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys 50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly ?sn 65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin 85 90 95

Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr 100 105 110

Met

Leu

Arg 115

Val

Tyr

Leu

Pro

Lys 120

Ile

Thr

Ser

Met

Leu 125

Ser

Asp

Val

Met

Lys 130

Gin

Asn

Tyr

Ala

Leu 135

Ser

Leu

Gin

Ile

Glu 140

Tyr

Leu

Ser

Lys

Gin 145

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser 150

Asp

Lys

Leu

Asp

Ile 155

Ile

Asn

Val

Asn

Val 160

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr 165

Leu

Thr

Glu

Ile

Thr 170

Pro

Ala

Tyr

Gin

Arg 175

Ile

Lys

Tyr

Val

Asn 180

Glu

Lys

Phe

Glu

Glu 185

Leu

Thr

Phe

Ala

Thr 190

Glu

Thr

Ser

Ser

Lys 195

Val

Lys

Lys

Asp

Gly 200

Ser

Pro

Ala

Asp

Ile 205

Leu

Asp

Glu

Leu

Thr 210

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu 215

Ala

Lys

Ser

Val

Thr 220

Lys

Asn

Asp

Val

Asp 225

Gly

Phe

Glu

Phe

Tyr 230

Leu

Asn

Thr

Phe

His 235

Asp

Val

Met

Val

Gly 240

Asn

Asn

Leu

Phe

Gly Arg 245

Ser

Ala

Leu

Lys 250

Thr

Ala

Ser

Glu

Leu 255

Ile

Thr

Lys

Glu

Asn 260

Val

Lys

Thr

Ser

Gly 265

Ser

Glu

Val

Gly

Asn 270

Val

Tyr

203

Asn

Phe

Leu 275

lle

Val

Leu

Thr

Ala 280

Leu

Gin

Ala

Gin

Ala 285

Phe

Leu

Thr

Leu

Thr 290

Thr

Cys

Arg Lys

Leu 295

Leu

Gly

Leu

Ala

Asp 300

lle

Asp

Tyr

Thr

Ser 305

lle

Met

Asn

Glu

His 310

Leu

Asn

Lys

Glu

Lys 315

Glu

Glu

Phe

Arg

Val 320

Asn

lle

Leu

Pro

Thr 325

Leu

Ser

Asn

Thr

Phe 330

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr 335

Ala

Lys

Val

Lys

Gly 340

Ser

Asp

Glu

Asp

Ala 345

Lys

Met

lle

Val

Glu 350

Ala

Lys

Pro

Gly

His 355

Ala

Leu

lle

Gly

Phe 360

Glu

lle

Ser

Asn

Asp 365

Ser

lle

Thr

Val

Leu 370

Lys

Val

Tyr

Glu

Ala 375

Lys

Leu

Lys

Gin

Asn 380

Tyr

Gin

Val

Asp

Lvs 385

Asp

Ser

Leu

Ser

Glu 390

Val

lle

Tyr

Gly Asp 395

Met

Asp

Lys

Leu

Leu 400

Cys

Pro

Asp

Gin

Ser 405

Glu

Gin

lle

Tyr

Tyr 410

Thr

Asn

Asn

lle

Val 415

Phe

Pro

Asn

Glu

Tyr 420

Val

lle

Thr

Lys

lle 425

Asp

Phe

Thr

Lys

Lys 430

Met

Lys

Thr

Leu

Arg 435

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala 440

Asn

Phe

Tyr

Asp

Ser 445

Ser

Thr

Gly

Glu

lle 450

Asp

Leu

Asn

Lys

Lys 455

Lys

Val

Glu

Ser

Ser 460

Glu

Ala

Glu

Tyr

Arg 4 65

Thr

Leu

Ser

Ala

Asn 470

Asp

Asp

Gly

Val

Tyr 475

Met

Pro

Leu

Gly

Val 480

lle

Ser

Glu

Thr

Phe 485

Leu

Thr

Pro

lle

Asn 490

Gly

Phe

Gly

Leu

Gin 495

Ala

Asp

Glu

Asn

Ser 500

Arg

Leu

lle

Thr

Leu 505

Thr

Cys

Lys

Ser

Tyr 510

Leu

Arg

Glu

Leu

Leu 515

Leu

Ala

Thr

Asp

Leu 520

Ser

Asn

Lys

Glu

Thr 525

Lys

Leu

lle

Val

Pro 530

Pro

Ser

Gly

Phe

lle 535

Ser

Asn

lle

Val

Glu 540

Asn

Gly

Ser

lle

Glu

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

Ala

Asn

řsn

Lys

Asn

Ala

Tyr

545

550

555

560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ma Leu Tyr Val His 565 570 575

204

Lys Asp	Gly Gly lle Ser Gin Phe lle	Gly	Asp Lys	Leu	Lys Pro 590	Lys
580	585
Thr Glu	Tyr Val lle Gin 595	Tyr Thr Val 600	Lys	Gly Lys	Pro 605	Ser lle	His
Leu Lys 610	Asp Glu Asn Thr	Gly Tyr lle 615	His	Tyr Glu 620	Asp	Thr Asn	Asn
Asn Leu 625	Glu Asp Tyr Gin 630	Thr lle Asn	Lys	Arg Phe 635	Thr	Thr Gly	Thr 640
Asp Leu	Lys Gly Val Tyr 645	Leu lle Leu	Lys 650	Ser Gin	Asn	Gly Asp 655	Glu
Ala Trp	Gly Asp Asn Phe 660	lle lle Leu 665	Glu	lle Ser	Pro	Ser Glu 670	Lys
Leu Leu	Ser Pro Glu Leu 675	lle Asn Thr 680	Asn	Asn Trp	Thr 685	Ser Thr	Gly
Ser Thr 690	Asn lle Ser Gly	Asn Thr Leu 695	Thr	Leu Tyr 700	Gin	Gly Gly Arg
Gly lle 705	Leu Lys Gin Asn 710	Leu Gin Leu	Asp	Ser Phe 715	Ser	Thr Tyr	Arg 720
Val Tyr	Phe Ser Val Ser 725	Gly Asp Ada	Asn 730	Val Arg	lle	Arg Asn 735	Ser
Arg Glu	Val Leu Phe Glu 740	Lys Arg Tyr 745	Met	Ser Gly	Ala	Lys Asp 750	Val
Ser Glu	Met Phe Thr Thr 755	Lys Phe Glu 760	Lys	Asp Asn	Phe 765	Tyr lle	Glu
Leu Ser 770	Gin Gly Asn Asn	Leu Tyr Gly Gly 775	Pro lle 780	Val	His Phe	Tyr

Asp Val Ser lle Lys 785

Informace o sekvenci SEQ ID č. 30:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2403 párů hází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

205 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/kl£č: různá vlastnost (B) lokace: 11..2389 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP3A(a) optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 30:

GGATCCACCA	ATGAACATGA	ACAAGAACAA	CACCAAGCTG	AGCACCCGCG	CCCTGCCGAG	60
CTTCATCGAC	TACTTCAACG	GCATCTACGG	CTTCGCCACC	GGCATCAAGG	ACATCATGAA	120
CATGATCTTC	AAGACCGACA	CCGGCGGCGA	CCTGACCCTG	GACGAGATCC	TGAAGAACCA	180
GCAGCTGCTG	AACGACATCA	GCGGCAAGCT	GGACGGCGTG	AACGGCAGCC	TGAACGACCT	240
GATCGCCCAG	GGCAACCTGA	ACACCGAGCT	GAGCAAGGAG	ATCCTTAAGA	TCGCCAACGA	300
GCAGAACCAG	GTGCTGAACG	ACGTGAACAA	CAAGCTGGAC	GCCATCAACA	CCATGCTGCG	360
CGTGTACCTG	CCGAAGATCA	CCAGCATGCT	GAGCGACGTG	ATGAAGCAGA	ACTACGCCCT	420
GAGCCTGCAG	ATCGAGTACC	TGAGCAAGCA	GCTGCAGGAG	ATCAGCGACA	AGCTGGACAT	480
CATCAACGTG	AACGTCCTGA	TCAACAGCAC	CCTGACCGAG	ATCACCCCGG	CCTACCAGCG	540
CATCAAGTAC	GTGAACGAGA	AGTTCGAAGA	GCTGACCTTC	GCCACCGAGA	CCAGCAGCAA	600
GGTGAAGAAG	GACGGCAGCC	CGGCCGACAT	CCTGGACGAG	CTGACCGAGC	TGACCGAGCT	660
GGCCAAGAGC	GTGACCAAGA	ACGACGTGGA	CGGCTTCGAG	TTCTACCTGA	ACACCTTCCA	720
CGACGTGATG	GTGGGCAAČA	ACCTGTTCGG	CCGCAGCGCC	CTGAAGACCG	CCAGCGAGCT	780
GATCACCAAG	GAGAACGTGA	AGACCAGCGG	CAGCGAGGTG	GGCAACGTGT	ACAACTTCCT	840
GATCGTGCTG	ACCGCCCTGC	AGGCCCAGGC	CTTCCTGACC	CTGACCACCT	GTCGCAAGCT	900
GCTGGGCCTG	GCCGACATCG	ACTACACCAG	CATCATGAAC	GAGCACTTGA	ACAAGGAGAA	960

206

GGAGGAGTTC	CGCGTGAACA	TCCTGCCGAC	CCTGAGCAAC	ACCTTCAGCA	ACCCGAACTA	1020
CGCCAAGGTG	AAGGGCAGCG	ACGAGGACGC	CAAGATGATC	GTGGAGGCTA	AGCCGGGCCA	1080
CGCGTTGATC	GGCTTCGAGA	TCAGCAACGA	CAGCATCACC	GTGCTGAAGG	TGTACGAGGC	1140
CAAGCTGAAG	CAGAACTACC	AGGTGGACAA	GGACAGCTTG	AGCGAGGTGA	TCTACGGCGA	1200
CATGGACAAG	CTGCTGTGTC	CGGACCAGAG	CGAGCAAATC	TACTACACCA	ACAACATCGT	1260
GTTCCCGAAC	GAGTACGTGA	TCACCAAGAT	CGACTTCACC	AAGAAGATGA	AGACCCTGCG	1320
CTACGAGGTG	ACCGCCAACT	TCTACGACAG	CAGCACCGGC	GAGATCGACC	TGAACAAGAA	1380
GAAGGTGGAG	AGCAGCGAGG	CCGAGTACCG	CACCCTGAGC	GCGAACGACG	ACGGCGTCTA	1440
CATGCCACTG	GGCGTGATCA	GCGAGACCTT	CCTGACCCCG	ATCAACGGCT	TTGGCCTGCA	1500
GGCCGACGAG	AACAGCCGCC	TGATCACCCT	GACCTGTAAG	AGCTACCTGC	GCGAGCTGCT	1560
GCTAGCCACC	GACCTGAGCA	ACAAGGAGAC	CAAGCTGATC	GTGCCACCGA	GCGGCTTCAT	1620
CAGCAACATC	GTGGAGAACG	GCAGCATCGA	GGAGGACAAC	CTGGAGCCGT	GGAAGGCCAA	1680
CAACAAGAAC	GCCTACGTGG	ACCACACCGG	CGGCGTGAAC	GGCACCAAGG	CCCTGTACGT	1740
GCACAAGGAC	GGCGGCATCA	GCCAGTTCAT	CGGCGACAAG	CTGAAGCCGA	AGACCGAGTA	1800
CGTGATCCAG	TACACCGTGA	AGGGCAAGCC	ATCGATTCAC	CTGAAGGACG	AGAACACCGG	1860
CTACATCCAC	TACGAGGACA	CCAACAACAA	CCTGGAGGAC	TACCAGACCA	TCAACAAGCG	1920
CTTCACCACC	GGCACCGACC	TGAAGGGCGT	GTACCTGATC	CTGAAGAGCC	AGAACGGCGA	1980
CGAGGCCTGG	GGCGACAACT	TCATCATCCT	GGAGATCAGC	CCGAGCGAGA	AGCTGCTGAG	2040
CCCGGAGCTG	ATCAACACCA	ACAACTGGAC	CAGCACCGGC	AGCACCAACA	TCAGCGGCAA	2100
CACCCTGACC	CTGTACCAGG	GCGGCCGCGG	CATCCTGAAG	CAGAACCTGC	AGCTGGACAG	2160
CTTCAGCACC	TACCGCGTGT	ACTTCAGCGT	GAGCGGCGAC	GCCAACGTGC	GCATCCGCAA	2220
CAGCCGCGAG	GTGCTGTTCG	AGAAGAGGTA	CATGAGCGGC	GCCAAGGACG	TGAGCGAGAT	2280
GTTCACCACC	AAGTTCGAGA	AGGACAACTT	CTACATCGAG	CTGAGCCAGG	GCAACAACCT	2340
GTACGGCGGC	CCGATCGTGC	ACTTCTACGA	CGTGAGCATC	AAGTTAACGT	AGAGCTCAGA	2400

TCT

2403

207

Informace o sekvenci SEQ ID č. 31:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2612 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jměno/klič: CDS (B) lokace: 118..2484 (D) další informace: poznámka = nativní DNAsekvence kódující VIP3A(b) z AB424 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 31:

ATTGAAATTG ATAAAAAGTT ATGAGTGTTT AATAATCAGT AATTACCAAT AAAGAATTAA 60

GAATACAAGT TTACAAGAAA TAAGTGTTAC AAAAAATAGC TGAAAAGGAA GATGAAC 117

ATG AAC AAG Met Asn Lys 790

AAT AAT

ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA AGT TTT Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

165

Asn

Asn

795

800

805

ATT

GAT

TAT

TTC

AAT

GGC

ATT

TAT

GGA

TTT

GCC

ACT

GGT

ATC

AAA

GAC

213

lle

Asp

Tyr

Phe

Asn

Gly

lle

Tyr

Gly

Phe

Ala

Thr

Gly

lle

Lys

Asp

810

815

820

ATT

ATG

AAC

ATG

ATT

TTT

AAA

ACG

GAT

ACA

GGT

GGT

GAT

CTA

ACC

CTA

261

lle

Met

Asn

Met

lle

Phe

Lys

Thr

Asp

Thr

Gly

Gly

Asp

Leu

Thr

Leu

825

830

835

GAC

GAA

ATT

TTA

AAG

AAT

CAG

CAG

CTA

CTA

AAT

GAT

ATT

TCT

GGT

AAA

309

Asp

Glu

lle

Leu

Lys

Asn

Gin

Gin

Leu

Leu

Asn

Asp

lle

Ser

Gly

Lys

840

845

850

TTG

GAT

GGG

GTG

AAT

GGA

AGC

TTA

AAT

GAT

CTT

ATC

GCA

CAG

GGA

AAC

357

Leu

Asp

Gly

Val

Asn

Gly

Ser

Leu

Asn

Asp

Leu

lle

Ala

Gin

Gly

Asn

855

860

865

TTA

AAT

ACA

GAA

TTA

TCT

AAG

GAA

ATA

TTA

AAA

ATT

GCA

AAT

GAA

CAA

405

Leu

Asn

Thr

Glu

Leu

Ser

Lys

Glu

lle

Leu

Lys

lle

Ala

Asn

Glu

Gin

870

875

880

885

AAT

CAA

GTT

TTA

AAT

GAT

GTT

AAT

AAC

AAA

CTC

GAT

GCG

ATA

AAT

ACG

453

208

Asn

Gin

Val

Leu

Asn 890

Asp

Val

Asn

Asn

Lys 895

Leu

Asp

Ala

Ile

Asn 900

Thr

ATG

CTT

CGG

GTA

TAT

CTA

CCT

AAA

ATT

ACC

TCT

ATG

TTG

AGT

GAT

GTA

501

Met

Leu

Arg

Val 905

Tyr

Leu

Pro

Lys

Ile 910

Thr

Ser

Met

Leu

Ser 915

Asp

Val

ATG

AAA

CAA

AAT

TAT

GCG

CTA

AGT

CTG

CM

ATA

GAA

TAC

TTA

AGT

AM

549

Met

Lys

Gin 920

Asn

Tyr

Ala

Leu

Ser 925

Leu

Gin

Ile

Glu

Tyr 930

Leu

Ser

Lys

CAA

TTG

CAA

GAG

ATT

TCT

GAT

MG

TTG

GAT

ATT

ATT

MT

GTA

MT

GTA

597

Gin

Leu 935

Gin

Glu

Ile

Ser

Asp 940

Lys

Leu

Asp

Ile

Ile 945

A.sn

Val

Asn

Val

CTT

ATT

AAC

TCT

ACA

CTT

ACT

GAA

ATT

ACA

CCT

GCG

TAT

CM

AGG

ATT

645

Leu 950

Ile

Asn

Ser

Thr

Leu 955

Thr

Glu

Ile

Thr

Pro 960

Ala

Tyr

Gin

Arg

Ile 965

AAA

TAT

GTG

AAC

GAA

AAA

TTT

GAG

GM

TTA

ACT

TTT

GCT

ACA

GM

ACT

693

Lys

Tyr

Val

Asn

Glu 970

Lys

Phe

Glu

Glu

Leu 975

Thr

Phe

Ala

Thr

Glu 980

Thr

AGT

TCA

AAA

GTA

AAA

AAG

GAT

GGC

TCT

CCT

GCA

GAT

ATT

CGT

GAT

GAG

741

Ser

Ser

Lys

Val 985

Lys

Lys

Asp

Gly

Ser 990

Pro

Ala

Asp

Ile

Arg 995

Asp

Glu

TTA

ACT

GAG

TTA

ACT

GAA

CTA

GCG

AAA

AGT

GTA

ACA

AAA

MT

GAT

GTG

789

Leu

Thr

Glu 100C

Leu 1

Thr

Glu

Leu

Ala 1005

Lys

Ser

Val

Thr

Lys 101C

Asn 1

Asp

Val

GAT

GGT

TTT

GAA

TTT

TAC

CTT

AAT

ACA

TTC

CAC

GAT

GTA

ATG

GTA

GGA

837

Asp

Gly 1015

Phe

Glu

Phe

Tyr

Leu 1020

Asn

Thr

Phe

His

Asp 1025

Val

Met

Val

Gly

AAT

AAT

TTA

TTC

GGG

CGT

TCA

GCT

TTA

AAA

ACT

GCA

TCG

GAA

TTA

ATT

885

Asn 1030

Asn 1

Leu

Phe

Gly

Arg 1035

Ser

Ala

Leu

Lys

Thr 1040

Ala

Ser

Glu

Leu

Ile 1045

ACT

AAA

GAA

AAT

GTG

AAA

ACA

AGT

GGC

AGT

GAG

GTC

GGA

AAT

GTT

TAT

933

Thr

Lys

Glu

Asn

Val

Lys

Thr

Ser

Gly

Ser

Glu

Val

Gly

Asn

Val

Tyr

1050 1055 1060

AAC TTC Asn Phe	CTA ATT GTA TTA	ACA Thr	GCT Ala	CTG CAA GCA AAA GCT TTT CTT ACT	981
Leu	Ile Val 1065	Leu	Leu Gin 1070	Ala	Lys	Ma Phe Leu 1075	Thr
TTA ACA	CCA	TGC CGA	AAA	TTA	TTA	GGC TTA	GCA	GAT	ATT GAT TAT	ACT	1029
Leu Thr	Pro	Cys Arg	Lys	Leu	Leu	Gly Leu	Ala	Asp	Ile Asp Tyr	Thr
	1080			1085			1090
TCT ATT	ATG	MT GAA	CAT	TTA	MT	MG GM	AM	GAG	GM TTT AGA	GTA	1077
Ser Ile	Met	Asn Glu	His	Leu	Asn	Lys Glu	Lys	Glu	Glu Phe Arg	Val
1095			1100				1105

209

AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA	1125
Asn Ile Leu Pro 1110	Thr	Leu Ser 1115	Asn Thr Phe	Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
1120	1125
AAA GTT AAA GGA	AGT	GAT GAA	GAT GCA AAG	ATG ATT	GTG GAA GCT AAA	1173
Lys Val Lys Gly	Ser Asp Glu 1130	Asp Ala Lys Met Ile 1135	Val Glu Ala Lys 1140
CCA GGA CAT GCA	TTG	ATT GGG	TTT GAA ATT	AGT AAT	GAT TCA ATT ACA	1221
Pro Gly His Ala Leu 1145	Ile Gly	Phe Glu Ile 1150	Ser Asn	Asp Ser Ile Thr 1155
GTA TTA AAA GTA	TAT	GAG GCT	AAG CTA AAA	CAA AAT	TAT CAA GTC GAT	1269
Val Leu Lys Val 1160	Tyr	Glu Ala	Lys Leu Lys 1165	Gin Asn	Tyr Gin Val Asp 1170
AAG GAT TCC TTA	TCG	GAA GTT	ATT TAT GGC	GAT ATG	GAT AAA TTA TTG	1317
Lys Asp Ser Leu 1175	Ser	Glu Val Ile Tyr Gly 1180	Asp Met Asp Lys Leu Leu 1185
TGC CCA GAT CAA	TCT	GGA CAA	ATC TAT TAT	ACA AAT	AAC ATA GTA TTT	1365
Cys Pro Asp Gin 1190	Ser	Gly Gin 1195	Ile Tyr Tyr	Thr Asn 1200	Asn Ile Val Phe 1205
CCA AAT GAA TAT	GTA	ATT ACT	AAA ATT GAT	TTC ACT	AAA AAA ATG AAA	1413
Pro Asn Glu Tyr	Val Ile Thr 1210	Lys Ile Asp Phe Thr 1215	Lys Lys Met Lys 1220
ACT TTA AGA TAT	GAG	GTA ACA	GCG AAT TTT	TAT GAT	TCT TCT ACA GGA	1461
Thr Leu Arg Tyr Glu 1225	Val Thr	Ala Asn Phe 1230	Tyr Asp	Ser Ser Thr Gly 1235
GAA ATT GAC TTA	AAT	AAG AAA	AAA GTA GAA	TCA AGT	GAA GCG GAG TAT	1509
Glu Ile Asp Leu 1240	Asn	Lys Lys	Lys Val Glu 1245	Ser Ser	Glu Ala Glu Tyr 1250
AGA ACG TTA AGT	GCT	AAT GAT	GAT GGG GTG	TAT ATG	CCG TTA GGT GTC	1557
Arg Thr Leu Ser 1255	Ala	Asn Asp 126C	Asp Gly Val 1	Tyr Met 1265	Pro Leu Gly Val
ATC AGT GAA ACA	TTT	TTG ACT	CCG ATT AAT	GGG TTT	GGC CTC CAA GCT	1605
Ile Ser Glu Thr 1270	Phe	Leu Thr 1275	Pro Ile Asn	Gly Phe 1280	Gly Leu Gin Ala 1285
GAT GAA AAT TCA	AGA	TTA ATT	ACT TTA ACA	TGT AAA	TCA TAT TTA AGA	1653
Asp Glu Asn Ser	Arg 1290	Leu Ile	Thr Leu Thr 1295	Cys Lys	Ser Tyr Leu Arg 1300
GAA CTA CTG CTA	GCA	ACA GAC	TTA AGC AAT	AAA GAA	ACT AAA TTG ATC	1701
Glu Leu Leu Leu 1305	Ala	Thr Asp	Leu Ser Asn 1310	Lys Glu	Thr Lys Leu Ile 1315
GTC CCG CCA AGT	GGT	TTT ATT	AGC AAT ATT	GTA GAG	AAC GGG TCC ATA	1749
Val Pro Pro Ser Gly	Phe Ile	Ser Asn Ile	Val Glu	Asn Gly Ser Ile

1320 1325 1330

210

GAA Glu	GAG Glu 133	GAC Asp 5	AAT Asn	TTA GAG Leu Glu	CCG TGG Pro Trp 1340	AAA GCA AAT Lys Ala Asn	AAT AAG Asn Lys 1345	AAT Asn	GCG TAT Ala Tyr	1797
GTA	GAT	CAT	ACA	GGC GGA	GTG AAT	GGA ACT AAA	GCT TTA	TAT	GTT CAT	1845
Val Asp 1350	His	Thr	Gly Gly Val Asn 1355	Gly Thr Lys Ala Leu 1360	Tyr	Val His 1365
AAG	GAC	GGA	GGA	ATT TCA	CAA TTT	ATT GGA GAT	AAG TTA	AAA	CCG AAA	1893
Lys	Asp	Gly	Gly	Ile Ser 1370	Gin Phe	Ile Gly Asp 1375	Lys Leu	Lys	Pro Lys 1380
ACT	GAG	TAT	GTA	ATC CAA	TAT ACT	GTT AAA GGA	AAA CCT	TCT	ATT CAT	1941
Thr	Glu	Tyr	Val Ile Gin 1385	Tyr Thr	Val Lys Gly 1390	Lys Pro	Ser Ile His 1395
TTA	AAA	GAT	GAA	AAT ACT	GGA TAT	ATT CAT TAT	GAA GAT	ACA	AAT AAT	1989
Leu	Lys	Asp Glu 1400	Asn Thr	Gly Tyr Ile His Tyr 1405	Glu Asp Thr 1410	Asn Asn
AAT	TTA	GAA	GAT	TAT CAA	ACT ATT	AAT AAA CGT	TTT ACT	ACA	GGA ACT	2037
.Asn	Leu Glu 1415	Asp	Tyr Gin	Thr Ile 1420	Asn Lys Arg	Phe Thr 1425	Thr	Gly Thr
GAT	TTA	AAG	GGA	GTG TAT	TTA ATT	TTA AAA AGT	CAA AAT	GGA	GAT GAA	2085
.Asp Leu 1430	Lys	Gly	Val Tyr Leu Ile 1435	Leu Lys Ser Gin Asn 1440	Gly	Asp Glu 1445
GCT	TGG	GGA	GAT	AAC TTT	ATT ATT	TTG GAA ATT	AGT CCT	TCT	GAA AAG	2133
.Ala	Trp	Gly	Asp	Asn Phe 1450	Ile Ile	Leu Glu Ile 1455	Ser Pro	Ser	Glu Lys 1460
TTA	TTA	AGT	CCA	GAA TTA	ATT AAT	ACA AAT AAT	TGG ACG	AGT	ACG GGA	2181
Leu	Leu	Ser	Pro Glu Leu 1465	Ile Asn	Thr Asn Asn 1470	Trp Thr	Ser Thr Gly 1475
TCA	ACT	AAT	ATT	AGC GGT	AAT ACA	CTC ACT CTT	TAT CAG	GGA	GGA CGA	2229
Ser	Thr	Asn 148C	Ile 1	Ser Gly	Asn Thr 1485	Leu Thr Leu	Tyr Gin 149C	Gly 1	Gly Arg
GGG	ATT	CTA	AAA	CAA AAC	CTT CAA	TTA GAT AGT	TTT TCA	ACT	TAT AGA	2277
Gly	Ile 1495	Leu 1	Lys	Gin Asn	Leu Gin 1500	Leu Asp Ser	Phe Ser 1505	Thr	Tyr Arg
GTG	TAT	TTC	TCT	GTG TCC	GGA GAT	GCT AAT GTA	AGG ATT	AGA	AAT TCT	2325
Val 1510	Tyr 1	Phe	Ser	Val Ser 1515	Gly Asp	Ala Asn Val 1520	Arg Ile	Arg	Asn Ser 1525
AGG	GAA	GTG	TTA	TTT GAA	AAA AGA	TAT ATG AGC	GGT GCT	AAA	GAT GTT	2373
Arg	Glu	Val	Leu	Phe Glu 1530	Lys Arg	Tyr Met Ser 1535	Gly Ala	Lys	Asp Val 1540
TCT	GAA	ATG	TTC	ACT ACA	AAA TTT	GAG AAA GAT	AAC TTC	TAT	ATA GAG	2421
Ser	Glu	Mec	Phe	Thr Thr	Lys Phe	Glu Lys Asp	Asn Phe	Tyr	Ile Glu

211

1545 1550 1555

CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT TTT TAC Leu Ser Gin Gly .Asn A.sn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

1560 1565 1570

GAT GTC TCT ATT AAG TAAGATCGGG ATCTAATATT AACAGTTTTT AGAAGCTAAT Asp Val Ser Ile Lys

1575

TCTTGTATAA TGTCCTTGAT TATGGAAAAA CACAATTTTG TTTGCTAAGA TGTATATATA

GCTCACTCAT TAAAAGGCAA TCAAGCTT

Informace o sekvenci SEQ ID č. 32:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 32:

2469

2524

2584

2612

Met 1

.Asn Lys Asn

Asn 5

Thr Lys

Leu Ser Thr Arg Ala 10

Leu

Pro

Ser 15

Phe

Ile

Asp

Tyr

Phe

Asn

Gly

Ile

Tyr

Gly

Phe

Ala

Thr

Gly

Ile

Lys

Asp

20

25

30

Ile

Met

Asn

Met

Ile

Phe

Lys

Thr

A.sp

Thr

Gly

Gly

Asp

Leu

Thr

Leu

35

40

45

Asp

Glu

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Gin

Leu

Leu

Asn

Asp

Ile

Ser

Gly

Lys

50

55

60

Leu

Asp

Gly

Val

Asn

Gly

Ser

Leu

Asn

Asp

Leu

Ile

Ala

Gin

Gly

Asn

65

70

75

80

Leu

Asn

Thr

Glu

Leu

Ser

Lys

Glu

Ile

Leu

Lys

Ile

Ala

Asn

Glu

Gin

85

90

95

Asn

Gin

Val

Leu

Asn

Asp

Val

Asn

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

Ile

Asn

Thr

100

105

110

Met

Leu

Arg

Val

Tyr

Leu

Pro

Lys

Ile

Thr

Ser

Met

Leu

Ser

Asp

Val

115

120

125

Met

Lys

Gin

Asn

Tyr

Ala

Leu

Ser

Leu

Gin

Ile

Glu

Tyr

Leu

Ser

Lys

130

135

140

Gin

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser

Asp

Lys

Leu

Asp

Ile

Ile

Asn

Val

Asn

Val

145

150

155

160

212

Leu

lle

Asn

Ser

Thr 165

Leu

Thr

Glu

lle

Thr 170

Pro

Ala

Tyr

Gin

Arg 175

lle

Lys

Tyr

Val

Asn 180

Glu

Lys

Phe

Glu

Glu 185

Leu

Thr

Phe

Ada

Thr 190

Glu

Thr

Ser

Ser

Lys 195

Val

Lys

Lys

Asp

Gly 200

Ser

Pro

Ala

Asp

lle 205

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr 210

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu 215

Ada

Lys

Ser

Val

Thr 220

Lys

Asn

Asp

Val

Asp 225

Gly

Phe

Glu

Phe

Tyr 230

Leu

Asn

Thr

Phe

His 235

Asp

Val

Met

Val

Gly 240

Asn

Asn

Leu

Phe

Gly 245

Arg

Ser

Ada

Leu

Lys 250

Thr

Ada

Ser

Glu

Leu 255

lle

Thr

Lys

Glu

Asn 260

Val

Lys

Thr

Ser

Gly 265

Ser

Glu

Val

Gly

Asn 270

Val

Tyr

Asn

Phe

Leu 275

lle

Val

Leu

Thr

Ada 280

Leu

Gin

Ala

Lys

Ada 285

Phe

Leu

Thr

Leu

Thr 290

Pro

Cys

Arg

Lys

Leu 295

Leu

Gly

Leu

Ala

Asp 300

lle

Asp

Tyr

Thr

Ser 305

lle

Met

Asn

Glu

His 310

Leu

Asn

Lys

Glu

Lys 315

Glu

Glu

Phe

Arg

Val 320

Asn

lle

Leu

Pro

Thr 325

Leu

Ser

Asn

Thr

Phe 330

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr 335

Ala

Lys

Val

Lys

Gly 340

Ser

Asp

Glu

Asp

Ala 345

Lys

Met

lle

Val

Glu 350

Ada

Lys

Pro

Gly

His 355

Ada

Leu

lle

Gly

Phe 360

Glu

lle

Ser

Asn

Asp 365

Ser

lle

Thr

Val

Leu 370

Lys

Val

Tyr

Glu

Ada 375

Lys

Leu

Lys

Gin

Asn 380

Tyr

Gin

Val

Asp

Lys 385

Asp

Ser

Leu

Ser

Glu 390

Val

lle

Tyr

Gly Asp 395

Met

Asp

Lys

Leu

Leu 400

Cys

Pro

Asp

Gin

Ser 405

Gly

Gin

lle

Tyr

Tyr 410

Thr

Asn

Asn

lle

Val 415

Phe

Pro

Asn

Glu

Tyr 420

Val

lle

Thr

Lys

lle 425

Asp

Phe

Thr

Lys

Lys 430

Met

Lys

Thr

Leu

Arg

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Asn

Phe

Tyr

Asp

Ser

Ser

Thr

Gly

435 440 445

213

Glu

Ile

Asp

Leu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

Glu

Ser

Ser

Glu

Ala Glu Tyr

450

455

460

Arg

Thr

Leu

Ser

Ala

Asn

Asp

Asp

Gly

Val

Tyr

Met

Pro

Leu Gly Val

465

470

475

480

Ile

Ser

Glu

Thr

Phe

Leu

Thr

Pro

Ile

Asn

Gly

Phe

Gly

Leu Gin Ala

485

490

495

Asp

Glu

Asn

Ser

Arg

Leu

Ile

Thr

Leu

Thr

Cys

Lys

Ser

Tyr Leu Arg

500

505

510

Glu

Leu

Leu

Leu

Ala

Thr

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Glu

Thr

Lys Leu Ile

515

520

525

Val

Pro

Pro

Ser

Gly

Phe

Ile

Ser

Asn

Ile

Val

Glu

Asn

Gly Ser Ile

530

535

540

Glu

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

Ala

Asn

Asn

Lys

Asn Ala Tyr

545

550

555

560

Val

Asp

His

Thr

Gly

Gly

Val

Asn

Gly

Thr

Lys

Ala

Leu

Tyr Val His

565

570

575

Lys

Asp

Gly Gly

Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys Pro Lvs

580

585

590

Thr

Glu

Tyr

Val

Ile

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Gly

Lys

Pro

Ser Ile His

595

600

605

Leu

Lys

Asp

Glu

Asn

Thr

Gly

Tyr

Ile

His

Tyr

Glu

Asp

Thr Asn Asn

610

615

620

Asn

Leu

Glu

Asp

Tyr

Gin

Thr

Ile

Asn

Lys

Arg

Phe

Thr

Thr Gly Thr

625

630

635

640

Asp

Leu

Lys

Gly

Val

Tyr

Leu

Ile

Leu

Lys

Ser

Gin

Asn

Gly Aso Glu

645

650

655

Ala

Trp

Gly

Asp

Asn

Phe

Ile

Ile

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Ser Glu Lvs

660

665

670

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Leu

Ile

Asn

Thr

Asn

Asn

Trp

Thr

Ser Thr Gly

675

680

685

Ser

Thr

Asn

Ile

Ser

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Gly Gly Arg

690

695

700

Gly

Ile

Leu

Lys

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe

Ser

Thr Tyr Arg

705

710

715

720

Val

Tyr

Phe

Ser

Val

Ser

Gly

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Ile

Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

214

740

745

750

Ser

Glu

Met

Phe

Thr

Thr

Lys

Phe

Glu Lys

Asp Asn

Phe

Tyr

Ile

Glu

755

760

765

Leu

Ser

Gin

Gly

Asn

Asn

Leu

Tyr

Gly Gly

Pro Ile

Val

His

Phe

Tyr

770

775

780

Asp

Val

Ser

Ile

Lys

785

nformac

e o

se

kvenci

SEQ

ID

Č . 33 :

(i

)

ch,

arakter

ist:

iky

sekven

ce:

(A)

dél

ka:

30

párů b

ází

(B)

typ

: nukleová ky

selina

(C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: dopředný primer použitý pro vytvoření pCIB5526 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 33:

GGATCCACCA TGAAGACCAA CCAGATCAGC 30

Informace o sekvenci SEQ ID č. 34:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: zpětný primer použitý pro vytvoření pCIB5526 (iii) hypotetická: není

215 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 34:

AAGCTTCAGC TCCTT

Informace o sekvenci SEQ ID č. 35:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2576 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..2564 (D) další informace: poznámka = sekvence kódující VIPlA(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5526 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 35:

GATCCACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC ACC ACC CAG AAG AAC CAG CAG 50

Met Lys Thr Asn Gin Ile Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin

825 830 835

AAG

GAG

ATG

GAC

CGC

AAG

GGC

CTG

CTG

GGC

TAC

TAC

TTC

AAG

GGC

AAG

Lys

Glu

Met

Asp

Arg 840

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly 845

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly 850

Lys

GAC

TTC

AGC

AAC

CTG

ACC

ATG

TTC

GCC

CCC

ACG

CGT

GAC

AGC

ACC

CTG

Asp

Phe

Ser

Asn 855

Leu

Thr

Met

Phe

Ala 860

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser 865

Thr

Leu

ATC

TAC

GAC

CAG

CAG

ACC

GCC

AAC

AAG

CTG

CTG

GAC

AAG

AAG

CAG

GAG

Ile

Tyr Asp 870

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn 875

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys 880

Lys

Gin

Gin

GAG

TAC

CAG

AGC

ATC

CGC

TGG

ATC

GGC

CTG

ATC

CAG

AGC

AAG

GAG

ACC

Glu

Tyr 885

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp 890

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin 895

Ser

Lys

Glu

Thr

216

GGC Gly 900	GAC Asp	TTC Phe	ACC Thr	TTC Phe	AAC Asn 905	CTG Leu	AGC GAG Ser Glu	GAC GAG CAG GCC ATC ATC GAG Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu 910 915	290
ATC	AAC	GGC	AAG	ATC	ATC	AGC	AAC AAG	GGC AAG GAG AAG CAG GTG GTG	338
Ile	Asn	Gly	Lys	Ile 920	Ile	Ser	Asn Lys	Gly Lys Glu Lys Gin Val Val 925 930
CAC	CTG	GAG	AAG	GGC	AAG	CTG	GTG CCC	ATC AAG ATC GAG TAC CAG AGC	386
His	Leu	Glu	Lys 935	Gly	Lys	Leu	Val Pro 940	Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser 94 5
GAC	ACC	AAG	TTC	AAC	ATC	GAC	AGC AAG	ACC TTC AAG GAG CTG AAG CTT	4 34
Asp	Thr	Lys 950	Phe	Asn	Ile	Asp	Ser Lys 955	Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu 960
TTC	AAG	ATC	GAC	AGC	CAG	AAC	CAG CCC	CAG CAG GTG CAG CAG GAC GAG	482
Phe	Lys 965	Ile	Asp	Ser	Gin	Asn 970	Gin Pro	Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu 975
CTG	CGC	AAC	CCC	GAG	TTC	AAC	AAG AAG	GAG AGC CAG GAG TTC CTG GCC	530
Leu 980	Arg	Asn	Pro	Glu	Phe 985	Asn	Lys Lys	Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala 990 995
AAG	ccc	AGC	AAG	ATC	AAC	CTG	TTC ACC	CAG CAG ATG AAG CGC GAG ATC	578
Lys	Pro	Ser	Lys	Ile Asn 1000	Leu	Phe Thr	Gin Gin Met Lys Arg Glu Ile 1005 1010
GAC	GAG	GAC	ACC	GAC	ACC	GAC	GGC GAC	AGC ATC CCC GAC CTG TGG GAG	626
Asp	Glu	Asp	Thr Asp 1015	Thr	Asp	Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu 1020 * 1025
GAG	AAC	GGC	TAC	ACC	ATC	CAG	AAC CGC	ATC GCC GTG AAG TGG GAC GAC	674
Glu	Asn	Gly 103C	Tyr )	Thr	Ile	Gin	Asn Arg 1035	Ile Ala Val Lys Trp Asp Asp 1040
AGC	CTG	GCT	AGC	AAG	GGC	TAC	ACC AAG	TTC GTG AGC AAC CCC CTG GAG	722
Ser	Leu 1045	Ala	Ser	Lys	Gly	Tyr 105C	Thr Lys 1	Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu 1055
AGu	CAC	ACC	GTG	GGC	GAC	CCC	TAC ACC	GAC TAC GAG AAG GCC GCC CGC	770
Ser 1060	His	Thr	Val	Gly	Asp 1065	Pro	Tyr Thr	Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg 1070 1075
GAC	CTG	GAC	CTG	AGC	AAC	GCC	AAG GAG	ACC TTC AAC CCC CTG GTG GCC	818
Asp	Leu	Asp	Leu	Ser 1080	Asn	Ala	Lys Glu	Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala 1085 1090
GCC	TTC	CCC	AGC	GTG	AAC	GTG	AGC ATG	GAG AAG GTG ATC CTG AGC CCC	866
Ala	Phe	Pro	Ser 1095	Val	Asn	Val	Ser Met 1100	Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro 1105
AAC	GAG	AAC	CTG	AGC	AAC	AGC	GTG GAG	AGC CAC TCG AGC ACC AAC TGG	914
Asn	Glu	Asn	Leu	Ser	Asn	Ser	Val Glu	Ser His Ser Ser Thr Asn Trp

1110 1115 1120

217

AGC TAC ACC AAC ACC GAG GGC GCC AGC GTG GAG GCC GGC ATC GGT	CCC Pro	962
Ser	Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly lle	Gly
1125	1130	1135
AAG	GGC ATC AGC TTC	GGC GTG AGC GTG	.AAC TAC CAG CAC AGC	GAG	ACC	1010
Lys Gly lle Ser Phe 1140	Gly Val Ser Val 1145	Asn Tyr Gin His Ser 1150	Glu	Thr 1155
GTG	GCC CAG GAG TGG	GGC ACo AGC ACC	GGC AAC ACC AGC CAG	TTC	AAC	1058
Val	Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr 1160	Gly Asn Thr Ser Gin 1165	Phe Asn 1170
ACC	GCC AGC GCC GGC	TAC CTG AAC GCC	AAC GTG CGC TAC AAC	AAC	GTG	1106
Thr	AGa Ser Ala Gly 1175	Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr A.sn Asn 1180 1185	Val
GGC	ACC GGC GCC ATC	TAC GAC GTG AAG	CCC ACC ACC AGC TTC	GTG	CTG	1154
Gly	Thr Gly ALLa lle 1190	Tyr Asp Val Lys 1195	Pro Thr Thr Ser Phe 1200	Val	Leu
AAC	AAC GAC ACC ATC	GCC ACC ATC ACC	GCC AAG TCG AAT TCC	ACC	GCC	1202
Asn	Asn Asp Thr lle 1205	Ala Thr lle Thr 1210	Ala Lys Ser Asn Ser 1215	Thr	Ala
CTG	AAC ATC AGC CCC	GGC GAG AGC TAC	CCC AAG AAG GGC CAG	AAC	GGC	1250
Leu Asn lle Ser Pro 1220	Gly Glu Ser Tyr 1225	Pro Lys Lys Gly Gin 1230	Asn	Gly 1235
ATC	GCC ATC ACC AGC	ATG GAC GAC TTC	AAC AGC CAC CCC ATC	ACC	CTG	1298
lle	Ala lle Thr Ser Met Asp Asp Phe 1240	Asn Ser His Pro lle 1245	Thr Leu 1250
AAC	AAG AAG GAG GTG	GAC AAC CTG CTG	AAC AAC AAG CCC ATG	ATG	CTG	134 6
Asn	Lys Lys Gin Val 1255	Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met 1260 1265	Leu
GAG	ACC AAC CAG ACC	GAC GGC GTC TAC	AAG ATC AAG GAC ACC	CAC	GGC	1394
Glu	Thr Asn Gin Thr 1270	Asp Gly Val Tyr 1275	Lys lle Lys Asp Thr 1280	His	Gly
AAC	ATC GTG ACG GGC	GGC GAG TGG AAC	GGC GTG ATC CAG CAG	ATC	AAG	1442
Asn	lle Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn 1285 1290	Gly Val lle Gin Gin 1295	lle	Lys
GGC	AAG ACC GCC AGC	ATC ATC GTC GAC	GAC GGC GAG CGC GTG	GCC	GAG	1490
Ala 1300	Lys Thr Ala Ser 1	lle lle Val Asp 1305	Asp Gly Glu Arg Val 1310	Ala	Glu 1315
AAG	CGC GTG GCC GCC	AAG GAC TAC GAG	AAC CCC GAG GAC AAG	ACC	CCC	1538
Lys	Arg Val Ala Ala 1320	Lys Asp Tyr Glu	Asn Pro Glu Asp Lys 1325	Thr 1330	Pro
AGC	CTG ACC CTG AAG	GAC GCC CTG AAG	CTG AGC TAC CCC GAC	GAG	ATC	1586
Ser	Leu Thr Leu Lys	Asp Ala Leu Lys	Leu Ser Tyr Pro Asp	Glu	lle

1335 1340 1345

218

AAG Lys	GAG Glu	ATC GAG GGC Ile Glu Gly 1350	TTG Leu	CTG Leu	TAC TAC AAG AAC AAG CCC ATC TAC GAG	1634
Tyr Tyr Lys 1355	Asn Lys	Pro Ile 1360	Tyr	Glu
AGC	AGC	GTG ATG ACC	TAT	CTA	GAC GAG AAC	ACC GCC	AAG GAG	GTG	ACC	1682
Ser	Ser Val Met Thr 1365	Tyr	Leu Asp Glu Asn 1370	Thr Ala Lys Glu 1375	Val	Thr
AAG	CAG	CTG AAC GAC	ACC	ACC	GGC AAG TTC	AAG GAC	GTG AGC	CAC	CTG	1730
Lys Gin 1380	Leu Asn Asp	Thr Thr 1385	Gly Lys Phe	Lys Asp 1390	Val Ser	His	Leu 1395
TAC	GAC	GTG AAG CTG	ACC	CCC	AAG ATG AAC	GTG ACC	ATC AAG	CTG	AGC	1778
Tyr	Asp	Val Lys Leu Thr 1400	Pro	Lys Met Asn Val Thr 1405	Ile Lys	Leu Ser 1410
ATC	CTG	TAC GAC AAC	GCC	GAG	AGC AAC GAC	AAC AGC	ATC GGC	MG	TGG	1826
Ile	Leu	Tyr Asp Asn 1415	Ala	Glu	Ser Asn Asp 1420	Asn Ser	Ile Gly Lys 1425	Trp
ACC	AAC	ACC AAC ATC	GTG	AGC	GGC GGC AAC	AAC GGC	MG AAG	CAG	TAC	1874
Thr	Asn	Thr Asn Ile 1430	Val	Ser	Gly Gly Asn 1435	Asn Gly	Lys Lys 1440	Gin	Tyr
AGC	AGC	AAC AAC CCC	GAC	GCC	AAC CTG ACC	CTG AAC	ACC GAC	GCC	CAG	1922
Ser	Ser Asn Asn Pro 1445	Asp	Ala Asn Leu Thr 1450	Leu Asn Thr Asp 1455	Ala	Gin
GAG	AAG	CTG AAC AAG	AAC	CGC	GAC TAC TAC	ATC AGC	CTG TAC	ATG	AAG	1970
Glu Lys 1460	Leu Asn Lys	Asn Arg 1465	Asp Tyr Tyr	Ile Ser 1470	Leu Tyr	Met	Lys 1475
AGC	GAG	AAG AAC ACC	CAG	TGC	GAG ATC ACC	ATC GAC	GGC GAG	ATA	TAC	2018
Ser	Glu	Lys Asn Thr Gin 1480	Cys	Glu Ile Thr Ile Asp 1485	Gly Glu	Ile Tyr 1490
CCC	ATC	ACC ACC AAG	ACC	GTG	AAC GTG AAC	AAG GAC	AAC TAC	AAG	CGC	2066
Pro	Ile	Thr Thr Lys 1495	Thr	Val	Asn Val Asn 1500	Lys Asp	Asn Tyr Lys 1505	Arg
CTG	GAC	ATC ATC GCC	CAC	AAC	ATC AAG AGC	AAC CCC	ATC AGC	AGC	CTG	2114
Leu	Asp	Ile Ile Ala 1510	His	Asn	Ile Lys Ser 1515	Asn Pro	Ile Ser 1520	Ser	Leu
CAC	ATC	AAG ACC AAC	GAC	GAG	ATC ACC CTG	TTC TGG	GAC GAC	ATA	TCG	2162
His	Ile 1525	Lys Thr Asn	Asp	Glu 153C	Ile Thr Leu 1	Phe Trp Asp Asp 1535	Ile	Ser
ATT	ACC	GAC GTC GCC	AGC	ATC	AAG CCC GAG	AAC CTG	ACC GAC	AGC	G4G	2210
Ile 154C	Thr 1	Asp Val Ala	Ser 1545	Ile 1	Lys Pro Glu	Asn Leu 1550	Thr Asp	Ser	Glu 1555
ATC	AAG	CAG ATA TAC	AGT	CGC	TAC GGC ATC	AAG CTG	GAG GAC	GGC	ATC	2258
Ile	Lys	Gin Ile Tyr	Ser Arg	Tyr Gly Ile	Lys Leu	Glu Asp	Gly	Ile

1560 1565 1570

219

CTG ATC GAC AAG AAA GGC GGC	ATC lle	CAC TAC GGC GAG TTC ATC AAC GAG His Tyr Gly Glu Phe lle Asn Glu	2306
Leu	lle	Asp	Lys Lys Gly Gly 1575
1580	1585
GCC	AGC	TTC	AAC ATC GAG CCC	CTG	CAG AAC	TAC GTG ACC AAG TAC GAG	2354
Ala	Ser	Phe Asn lle Glu Pro 1590	Leu Gin Asn 1595	Tyr Val Thr Lys Tvr Glu 1600
GTG	ACC	TAC	AGC AGC GAG CTG	GGC	CCC AAC	GTG AGC GAC ACC CTG GAG	2402
Val	Thr 160;	Tyr	Ser Ser Glu Leu Gly 1610	Pro Asn	Val Ser Asp Thr Leu Glu 1615
AGC	GAC	.AAG	ATT TAC AAG GAC	GGC	ACC ATC	AAG TTC GAC TTC ACC AAG	2450
Ser 162C	ř.sp )	Lys	lle Tyr Lys Asp 1625	Gly	Thr lle	Lys Phe Asp Phe Thr Lys 1630 1635
TAC	AGC	.AAG	AAC GAG CAG GGC	CTG	TTC TAC	GAC AGC GGC CTG AAC TGG	2498
Tyr	Ser	Lys	Asn Glu Gin Gly 1640	Leu	Phe Tyr 1643	Asp Ser Gly Leu Asn Trp » 1650
GAC	TTC	AAG	ATC AAC GCC ATC	ACC	TAC GAC	GGC AAG GAG ATG AAC GTG	2546
Asp	Phe	Lys	lle Asn Ada lle	Thr	Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val

1655 1660 1665

TTC CAC CGC TAC AAC AAG TAGATCTGAG CT 2576

Phe His Arg Tyr Asn Lys

1670

Informace o sekvenci SEQ ID č. 36:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 852 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 36:

Met

Lvs

Thr

Asn

Gin

lle

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys

Asn

Gin

Gin

Lys

Glu

1

5

10

15

Met

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp

Phe

20

25

30

Ssr

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu

lle

Tyr

35

40

45

220

Asp

Gin 50

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys 55

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys 60

Gin

Gin

Glu

Tyr

Gin 65

Ser

Ile

Arg

Trp

Ile 70

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser 75

Lys

Glu

Thr

Gly Asp 80

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu 85

Ser

Glu

Asp

Glu

Gin 90

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile 95

Asn

Gly

Lys

Ile

Ile 100

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys 105

Glu

Lys

Gin

Val

Val 110

His

Leu

Glu

Lys

Gly 115

Lys

Leu

Val

Pro

Ile 120

Lys

Ile

Glu

Tyr

Gin 125

Ser

Asp

Thr

Lys

Phe 130

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys 135

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu 140

Lys

Leu

Phe

Lys

Ile 14 5

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin 150

Pro

Gin

Gin

Val

Gin 155

Gin

Asp

Glu

Leu

Arg 160

Asn

Pro

Glu

Phe

Asn 165

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin 170

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys 175

Pro

Ser

Lys

Ile

Asn 180

Leu

Phe

Thr

Gin

Gin 185

Met

Lys

Arg

Glu

Ile 190

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp 195

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser 200

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp 205

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr 210

Thr

Ile

Gin

Asn

Arg 215

Ile

Ala

Val

Lys

Trp 220

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala 225

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr 230

Lys

Phe

Val

Ser

Asn 235

Pro

Leu

Glu

Ser

His 240

Thr

Val

Gly

Asp

Pro 245

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu 250

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp 255

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn 260

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe 265

Asn

Pro

Leu

Val

Ala 270

Ala

Phe

Pro

Ser

Val 275

Asn

Val

Ser

Met

Glu 280

Lys

Val

Ile

Leu

Ser 285

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu 290

Ser

Asn

Ser

Val

Glu 295

Ser

His

Ser

Ser

Thr 300

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr 305

A.sn

Thr

Glu

Gly

Ala 310

Ser

Val

Glu

Ala

Gly 315

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly 320

Ile

Ser

Phe

Gly

Val 325

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin 330

His

Ser

Glu

Thr

Val 335

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

340 345 350

Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr 355 360 365

221

Gly

Ala 370

Ile

Tyr

Asp

Val

Lys 375

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe 380

Val

Leu

Asn

Asn

Asp 385

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile 390

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn 395

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn 400

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu 405

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys 410

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile 415

Ala

Ile

Thr

Ser

Met 420

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser 425

His

Pro

Ile

Thr

Leu 430

Asn

Lys

Lys

Gin

Val 435

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn 440

Asn

Lys

Pro

Met

Met 445

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin 450

Thr

Asp

Gly

Val

Tyr 455

Lys

Ile

Lys

Asp

Thr 460

His

Gly

Asn

Ile

Val 4 65

Thr

Gly

Gly

Glu

Trp 470

Asn

Gly

Val

Ile

Gin 475

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys 480

Thr

Ala

Ser

Ile

Ile 485

Val

Asp

Asp

Gly

Glu 490

Arg

Val

Ala

Glu

Lvs 495

Arg

Val

Ala

Ala

Lys 500

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro 505

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro 510

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys 515

Asp

ALLa

Leu

Lys

Leu 520

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu 525

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu 530

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr 535

Lys

Asn

Lys

Pro

Ile 540

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val 545

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp 550

Glu

Asn

Thr

AILa

Lys 555

Glu

Val

Thr

Lys

Gin 560

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr 565

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp 570

Val

Ser

His

Leu

Tyr 575

Asp

Val

Lys

Leu

Thr 580

Pro

Lys

Met

Asn

Val 585

Thr

Ile

Lys

Leu

Ser 590

Ilé

Leu

Tyr

Asp

Asn 595

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp 600

Asn

Ser

Ile

Gly

Lys 605

Trp

Thr

Asn

Thr

Asn 610

Ile

Val

Ser

Gly

Gly 615

Asn

Asn

Gly

Lys

Lys 620

Gin

Tyr

Ser

Ser

Asn 625

Asn

Pro

Asp

Ala

Asn 630

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr 635

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys 640

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg 645

Asp

Tyr

Tyr

Ile

Ser 650

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser 655

Glu

Lys

Asn

Thr

Gin 660

Cys

Glu

Ile

Thr

Ile 665

Asp

Gly

Glu

Ile

Tyr 670

Pro

Ile

Thr

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

Asp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

675 680 685

222

Ile

Ile 690

Ala

His

Asn

Ile

Lys 695

Ser

Asn

Pro

Ile

Ser 700

Ser

Leu

His

Ile

Lys 705

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile 710

Thr

Leu

Phe

Trp

Asp 715

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr 720

Asp

Val

Ala

Ser

Ile 725

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu 730

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile 735

Lys

Gin

Ile

Tyr

Ser 740

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys 745

Leu

Glu

Asp

Gly

Ile 750

Leu

Ile

Asp

Lys

Lys 755

Gly

Gly

Ile

His

Tyr 760

Gly

Glu

Phe

Ile

Asn 765

Glu

Ala

Ser

Phe

Asn 770

Ile

Glu

Pro

Leu

Gin 775

Asn

Tyr

Val

Thr

Lys 780

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr 785

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly 790

Pro

Asn

Val

Ser

Asp 795

Thr

Leu

Glu

Ser

Aso 80*0

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp 80*5

Gly

Thr

Ile

Lys

Phe 810

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr 815

Ser

Lys

Asn

Glu

Gin 820

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp 825

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp 830

Asp

Phe

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

835 840 845

Arg Tyr Asn Lys 850

Informace	o sekvenci SEQ ID č. 37:
(i)	charakteristiky sekvence: (A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

(ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: dopředný primer použitý pro vytvoření pCIB5527 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 37:

GGATCCACCA TGCTGCAGAA CCTGAAGATC AC

223

Informace <

(i) (ii) (iii) (xi)

AAGCTTCCAC

Informace c (i) (ii) (iii) (ix) ) sekvenci SEQ ID č. 38:

charakteristiky sekvence ·.

(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: zpětný primer použitý pro vytvoření pCIB5527 hypotetická: není znázornění sekvence SEQ ID č. 38:

TCCTTCTC 18 sekvenci SEQ ID č. 39:

charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1241 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA hypotetická: není vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..1238 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5527

224 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 39:

GATCCACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC ACC GAC AAG GTG GAG GAC TTC 50

Met Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe

855 860 865

AAG GAG GAC AAG GAG AAG GCC AAG GAG TGG GGC AAG GAG AAG GAG AAG

98

Lys

Glu

Asp Lys Glu 870

Lys

Ala Lys

Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys

875

880

GAG

TGG

AAG

CTT

ACC

GCC

ACC

GAG

AAG

GGC

AAG

ATG

AAC

AAC

TTC

CTG

146

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Leu

885

890

895

GAC

AAC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAG

ACC

AAC

TAC

AAG

GAG

ATC

ACC

mm/“' ul

AGC

194

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe

Ser

900

905

910

ATA

GCC

GGC

AGC

TTC

GAG

GAC

GAG

ATC

AAG

GAC

CTG

AAG

GAG

ATC

GAC

242

Ile

.Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

Ile

Asp

915

920

925

930

AAG

ATG

TTC

GAC

A4G

ACC

AAC

CTG

AGC

AAC

AGC

ATC

ATC

ACC

TAC

AAG

290

Lys

Met

Phe

Asp

Lys

Thr

A.sn

Leu

Ser

A.sn

Ser

Ile

Ile

Thr

Tyr

Lys

935

940

945

AAC

GTG

GAG

CCC

ACC

ACC

ATC

GGC

TTC

AAC

AAG

AGC

CTG

ACC

GAG

GGC

338

Asn

Val

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

950

955

960

AAC

ACC

ATC

AAC

AGC

GAC

GCC

ATG

GCC

CAG

TTC

AAG

GAG

CAG

TTC

CTG

386

A.sn

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

Phe

Leu

965

970

975

GAC

CGC

GAC

ATC

A4G

TTC

GAC

AGC

TAC

CTG

GAC

ACC

CAC

CTG

ACC

GCC

434

A.sp

Arg

Asp

Ile

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

Thr

Ala

980

985

990

CAG

CAG

GTG

AGC

AGC

AAG

GAG

CGC

GTG

ATC

CTG

AAG

GTG

ACC

GTC

CCC

482

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Val

Pro

995

1000

1005

1010

AGC

GGC

AAG

GGC

AGC

ACC

ACC

CCC

ACC

AAG

GCC

GGC

GTG

ATC

CTG

AAC

530

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

Ile

Leu

Asn

1015

1020

1025

AAC

AGC

GAG

TAC

AAG

ATG

CTG

ATC

GAC

AAC

GGC

TAC

ATG

GTG

CAC

GTG

578

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys .

Met

Leu

Ile

Asp

Asr. Gly

Tyr i

Met

Val

His

Val

1030 1035 1040

225

GAC Asp

AAG GTG AGC

AAG Lys

GTG Val

GTG AAG AAG GGC GTG GAG TGC CTC CAG ATC

626

Lys

Val Ser 1045

Val

Lys Lys 1050

Gly

Val

Glu Cys Leu 1055

Gin

Ile

GAG

GGC

ACC CTG

AAG

AAG

AGT

CTA GAC

TTC

AAG

AAC GAC ATC

AAC

GCC

674

Glu

Gly

Thr Leu

Lys

Lys

Ser

Leu Asp

Phe

Lys

Asn Asp Ile

Asn

Ma

1060

1065

1070

GAG

GCC

CAC AGC

TGG

GGC

ATG

AAG AAC

TAC

GAG

GAG TGG GCC

AAG

GAC

722

Glu

Ala

His Ser

Trp

Gly

Mec

Lys Asn

Tyr

Glu

Glu Trp Ala

Lys

Asp

1075

1080

1085

1090

CTG

ACC

GAC AGC

GAG

CGC

GAG

GCC CTG

GAC

GGC

TAC GCC CGC

CAG

GAC

770

Leu

Thr

Asp Ser

Gin

Arg

Glu

Ala Leu

Asp

Gly

Tyr Ala Arg

Gin

Asp

1091

1100

1105

TAC

AAG

GAG ATC

AAC

AAC

TAC

CTG CGC

AAC

CAG

GGC GGC AGC

GGC

AAC

818

Tyr

Lys

Glu Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu Arg

Asn

Gin

Gly Gly Ser

Gly

Asn

1110

1115

1120

GAG

AAG

CTG GAC

GCC

CAG

ATC

AAG AAC

ATC

AGC

GAC GCC CTG

GGC

AAG

866

Glu

Lys

Leu Asp

Ala

Gin

Ile

Lys Asn

Ile

Ser

Asp Ala Leu

Gly

Lys

1125

1130

1135

AAG

CCC

ATC CCC

GAG

AAC

ATC

ACC GTG

TAC

CGC

TGG TGC GGC

ATG

CCC

914

Lys

Pro

Ile Pro

Glu

A.sn

Ile

Thr Val

Tyr

Arg

Trp Cys Gly

Met

Pro

1140

1145

1150

GAG

TTC

GGC TAC

CAG

ATC

AGC

GAC CCC

CTG

CCC

AGC CTG AAG

GAC

TTC

962

Glu

Phe

Gly Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp Pro

Leu

Pro

Ser Leu Lys

Asp

Phe

1155

1160

1165

1170

GAG

GAG

GAG TTC

CTG

AAC

ACC

ATC AAG

GAG

GAC

AAG GGC TAC

ATG

AGC

1010

Glu

Glu

Gin Phe

Leu

Asn

Thr

Ile Lys

Glu

Asp

Lys Gly Tyr

Met

Ser

1175

1180

1185

ACC

AGC

CTG AGC

AGC

GAG

CGC

CTG GCC

GCC

TTC

GGC AGC CGC

AAG

ATC

1058

Thr

Ser

Leu Ser

Ser

Glu

Arg

Leu Ala

Ala

Phe

Gly Ser Arg

Lys

Ile

1190

1195

1200

ATC

CTG

CGC CTG

CAG

GTG

CCC

AAG GGC

AGC

ACT

GGT GCC TAC

CTG

AGC

1106

Ile

Leu

Arg Leu

Gin

Val

Pro

Lys Gly

Ser

Thr

Gly Ala Tyr

Leu

Ser

1205

1210

1215

GCC

ATC

GGC GGC

TTC

GCC

AGC

GAG AAG

GAG

ATC

CTG CTG GAT

AAG

GAC

1154

Ala

Ile

Gly Gly

Phe

Ala

Ser

Glu Lys

Glu

Ile

Leu Leu Asp

Lys Asp

1220

1225

1230

AGC

AAG

TAC CAC

ATC

GAC

AAG

GTG ACC

GAG

GTG

ATC ATC AAG

GGC

GTG

1202

Ser

Lys

Tyr His

Ile

Asp

Lys

Val Thr

Glu

Val

Ile Ile Lys

Gly Val

1235

1240

1245

1250

AAG

CGC

TAC GTG

GTG

GAC

GCC

ACC CTG

CTG

ACC

AAC TAG

1241

Lys

Arg

Tyr Val

Val

Asp

Ala

Thr Leu

Leu

Thr

Asn

1255

1260

226

Informace o sekvenci SEQ ID č. 40:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 410 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

(xi:

) znázornění

sekvence

SEQ

ID

č.

40 :

Met

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

Asp

Phe

Lys

Glu

1

5

10

15

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu

Trp

20

25

30

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe

Ser

Ile

Ala

50

55

60

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

Ile

Asp

Lys

Met

65

70

75

80

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val

85

90

95

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Asn

Thr

100

105

110

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

Phe

Leu

Asp

Arg

115

120

125

Asp

Ile

Lys

Phe

A.sp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

Thr

Ala

Gin

Gin

130

135

140

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Gly

145

150

155

160

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser

165

170

175

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

Val

His

Val

Asp

Lys

180

185

190

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Val

Glu

Cys

Leu

Gin

Ile

Glu

Gly

195

200

205

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

A.sn

Asp

Ile

Asn

Ala

Glu

Ala

210

215

220

227

His 225

Ser Trp Gly Met

Lys Asn 230

Tyr Glu Glu

Trp 235

Ala Lys Asp Leu Thr 240

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

245

250

255

Glu

lle

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

260

265

270

Leu

Asp

Ala

Gin

lle

Lys

Asn

lle

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro

275

280

285

lle

Pro

Glu

Asn

lle

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

Met

Pro

Glu

Phe

290

295

300

Gly

Tyr

Gin

lle

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

305

310

315

320

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

lle

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

325

330

335

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg

Lys

lle

lle

Leu

340

345

350

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

Ala

lle

355

360

365

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

lle

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

370

375

380

Tyr

His

lle

Asp

Lys

Val

Thr

Glu

Val

lle

lle

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

385

390

395

400

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

405 410

Informace o sekvenci SEQ ID č. 41:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 72 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotid kódující eukaryotický sekreční signál použitý pro zkonstruování

228 pCIB5527 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 41:

GGATCCACCA TGGGCTGGAG CTGGATCTTC CTGTTCCTGC TGAGCGGCGC CGCGGGCGTG 60

CACTGCCTGC AG 72

Informace o sekvenci SEQ ID č. 42:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1241 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9 . .1238 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus a do které byl zařazen eukaryotický sekreční signál, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5528 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 42:

GATCCACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC ACC GAC AAG GTG GAG GAC TTC 50

Met Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe

415 420

AAG Lys 425

GAG Glu

GAC Asp

AAG Lys

GAG AAG GCC AAG GAG TGG GGC AAG GAG AAG GAG AAG

98

Glu

Lys Ala Lys 430

Glu

Trp Gly 435

Lys

Glu

Lys Glu

Lys 440

GAG

TGG

AAG

CTT

ACC

GCC

ACC

GAG

AAG

GGC

AAG

ATG

AAC

AAC

TTC

CTG

146

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Leu

445

450

455

229

194

GAC

AAC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAG

ACC

AAC

TAC

AAG

GAG

ATC

ACC

TTC

AGC

Asp

Asn

Lys

Asn 4 60

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn 4 65

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr 470

Phe

Ser

ATA

GCC

GGC

AGC

TTC

GAG

GAC

GAG

ATC

AAG

GAC

CTG

AAG

GAG

ATC

GAC

Ile

Ala

Gly 475

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu 480

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys 485

Glu

Ile

Asp

AAG

ATG

TTC

GAC

AAG

ACC

AAC

CTG

AGC

AAC

AGC

ATC

ATC

ACC

TAC

AAG

Lys

Met 490

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn 4 95

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile 500

Ile

Thr

Tyr

Lys

AAC

GTG

GAG

CCC

ACC

ACC

ATC

GGC

TTC

AAC

AAG

AGC

CTG

ACC

GAG

GGC

Asn 505

Val

Glu

Pro

Thr

Thr 510

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys 515

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly 520

AAC

ACC

ATC

AAC

AGC

GAC

GCC

ATG

GCC

CAG

TTC

AAG

GAG

CAG

TTC

CTG

Asn

Thr

Ile

Asn

Ser 525

Asp

Ala

Met

Ala

Gin 530

Phe

Lys

Glu

Gin

Phe 535

Leu

GAC

CGC

GAC

ATC

AAG

TTC

GAC

AGC

TAC

CTG

GAC

ACC

CAC

CTG

ACC

GCC

Asp

Arg

Asp

Ile 540

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr 545

Leu

Asp

Thr

His

Leu 550

Thr

Ala

242

290

338

386

434

CAG

CAG

GTG

AGC

AGC

AAG

GAG

CGC

GTG

ATC

CTG

AAG

GTG

ACC

GTC

CCC

Gin

Gin

Val 555

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg 560

Val

Ile

Leu

Lys

Val 565

Thr

Val

Pro

AGC

GGC

AAG

GGC

AGC

ACC

ACC

CCC

ACC

AAG

GCC

GGC

GTG

ATC

CTG

AAC

Ser

Gly 570

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr 575

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly 580

Val

Ile

Leu

Asn

AAC

AGC

GAG

TAC

AAG

ATG

CTG

ATC

GAC

AAC

GGC

TAC

ATG

GTG

CAC

GTG

Asn 585

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met 590

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly 595

Tyr

Met

Val

His

Val 600

GAC

AAG

GTG

AGC

AAG

GTG

GTG

AAG

AAG

GGC

GTG

GAG

TGC

CTC

CAG

ATC

Asp

Lys

Val

Ser

Lys 605

Val

Val

Lys

Lys

Gly 610

Val

Glu

Cys

Leu

Gin 615

Ile

GAG

GGC

ACC

CTG

AAG

AAG

AGT

CTA

GAC

TTC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAC

GCC

Glu

Gly

Thr

Leu 620

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp 625

Phe

Lys

Asn

Asp

Ile 630

Asn

Ala

GAG

GCC

CAC

AGC

TGG

GGC

ATG

AAG

AAC

TAC

GAG

GAG

TGG

GCC

AAG

GAC

Glu

Ala

His 635

Ser

Trp

Gly

Met

Lys 640

Asn

Tyr

Glu

Glu

Trp 645

Ala

Lys

Asp

CTG

ACC

GAC

AGC

CAG

CGC

GAG

GCC

CTG

GAC

GGC

TAC

GCC

CGC

CAG

GAC

Leu

Thr 650

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu 655

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr 660

Ala

Arg

Gin

Asp

TAC

AAG

GAG

ATC

AAC

AAC

TAC

CTG

CGC

AAC

CAG

GGC

GGC

AGC

GGC

AAC

Tyr 665

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn 670

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin 675

Gly

Gly

Ser

Gly

Asn 680

482

530

578

626

674

722

770

818

230

866

GAG AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC ATC AGC GAC GCC CTG GGC

AAG Lys

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala 685

Gin

Ile

Lys

Asn

Ile 690

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly 695

AAG

CCC

ATC

CCC

GAG

AAC

ATC

ACC

GTG

TAC

CGC

TGG

TGC

GGC

ATG

CCC

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

Met

Pro

700

705

710

GAG

TTC

GGC

TAC

CAG

ATC

AGC

GAC

CCC

CTG

CCC

AGC

CTG

AAG

GAC

TTC

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

715

720

725

GAG

GAG

CAG

TTC

CTG

AAC

ACC

ATC

AAG

GAG

GAC

AAG

GGC

TAC

ATG

AGC

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

730

735

740

ACC

AGC

CTG

AGC

AGC

GAG

CGC

CTG

GCC

GCC

TTC

GGC

AGC

CGC

AAG

ATC

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg

Lys

Ile

745

750

755

760

ATC

CTG

CGC

CTG

CAG

GTG

CCC

AAG

GGC

AGC

ACT

GGT

GCC

TAC

CTG

AGC

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

7 65

770

775

GCC

ATC

GGC

GGC

TTC

GCC

AGC

GAG

AAG

GAG

ATC

CTG

CTG

GAT

AAG

GAC

Ala

Ile

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

780

785

790

AGC

AAG

TAC

CAC

ATC

GAC

AAG

GTG

ACC

GAG

GTG

ATC

ATC

AAG

GGC

GTG

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

Asp

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Ile

Ile

Lys

Gly

Val

795

800

805

AAG

CGC

TAC

GTG

GTG

GAC

GCC

ACC

CTG

CTG

ACC

AAC

TAG

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

810

815

820

914

962

1010

1058

1106

1154

1202

1241

Informace o sekvenci SEQ ID č. 43:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 410 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 43:

Met Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu 15 10 15

231

Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp

20

25

30

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe

Ser

Ile

Ala

50

55

60

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

Ile

Asp

Lys

Met

65

70

75

80

PhS

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val

85

90

95

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Asn

Thr

100

105

110

Ile

A.sn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

Phe

Leu

Asp

Arg

115

120

125

Asp

Ile

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

Thr

Ala

Gin

Gin

130

135

140

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Gly

14 5

150

155

160

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

AJ.a

Gly

Val

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser

165

170

175

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

Val

His

Val

Asp

Lys

180

185

190

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Val

Glu

Cys

Leu

Gin

Ile

Glu

Gly

195

200

205

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

Ile

Asn

Ala

Glu

Ala

210

215

220

His

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asn

Tyr

Glu

Glu

Trp

Ala

Lys

Asp

Leu

Thr

225

230

235

240

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

245

250

255

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly Gly

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

260

265

270

Leu

Asp

Ala

Gin

Ile

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro

275 280 285

Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe 290 295 300

232

Gly 305

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp 310

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu 315

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu 320

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr 325

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys 330

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr 335

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu 340

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe 345

Gly

Ser

Arg

Lys

Ile 350

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin 355

Val

Pro

Lys

Gly

Ser 360

Thr

Gly

Ala

Tyr

Leu 365

Ser

Ala

Ile

Gly

Gly 370

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys 375

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp 380

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr 385

His

Ile

Asp

Lys

Val 390

Thr

Glu

Val

Ile

Ile 395

Lys

Gly

Val

Lys Arg 400

Tyr

Val

Val

Asp

Ala 405

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn 410

Informace o sekvenci SEQ ID č. 44:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 86 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotid kódující peptid způsobující cílení do vakuoly, použitý pro zkonstruování pCIB5533 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 44:

CCGCGGGCGT GCACTGCCTC AGCAGCAGCA GCTTCGCCGA CAGCAACCCC ATCCGCGTGA 60

CCGACCGCGC CGCCAGCACC CTGCAG 86

Informace o sekvenci SEQ ID č. 45:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1358 párů bází (B) typ: nukleová kyselina

233 (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9 . .1355 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus a do které byl zařazen signál způsobující cílení do vakuoly, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5533 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 45:

GATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC CTG TTC CTG CTG AGC GGC GCC 50

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala 415 420

GCG GGC

GTG Val

CAC TGC CTC AGC

AGC AGC AGC TTC GCC GAC AGC AAC CCC

98

Ala 425

Gly

His Cys Leu 430

Ser

Ser Ser

Ser

Phe 435

Ada

Asp

Ser

Asn

Pro 440

ATC

CGC

GTG

ACC

GAC

CGS

GCC

GCC

AGC

ACC

CTG

CAG

AAC

CTG

AAG

ATC

146

Ile

Arg

Val

Thr

Asp

Arg

Ala

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

445

450

455

ACC

GAC

AAG

GTG

GAG

GAC

TTC

AAG

CAG

CAC

AAG

GAG

AAG

GCC

AAG

GAG

194

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

Asp

Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

4 60

4 65

470

TGG

GGC

AAG

GAG

AAG

GAG

AAG

GAG

TGG

AAG

CTT

ACC

GCC

ACC

GAG

AAG

242

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

475

480

485

GGC

AAG

ATG

AAC

AAC

TTC

CTG

GAC

AAC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAG

ACC

AAC

290

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

4 90

495

500

TAC

AAG

GAG

ATC

ACC

TTC

AGC

ATA

GCC

GGC

AGC

TTC

GAG

GAC

GAG

ATC

338

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe

Ser

Ile

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

505

510

515

520

AAG

GAC

CTG

AAG

GAG

ATC

CAC

AAG

ATG

TTC

GAC

AAG

ACC

AAC

CTG

AGC

386

234

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu 525

Ile

Asp

Lys

Met

Phe 530

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu 535

Ser

ΆΑΟ

AGC

ATC

ATC

ACC

TAC

AAG

AAC

GTG

GAG

CCC

ACC

ACC

ATC

GGC

TTC

434

Asn

Ser

Ile

Ile 540

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val 545

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile 550

Gly

Phe

AAO

AAG

AGC

CTG

ACC

GAG

GGC

AAC

ACC

ATC

AAC

AGC

GAC

GCC

ATG

GCC

482

Asn

Lys

Ser 555

Leu

Thr

Glu

Gly

Asn 560

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp 565

Ala

Met

Ala

CAG

TTC

AAG

GAG

CAG

TTC

CTG

GAC

CGC

GAC

ATC

AAG

TTC

GAC

AGC

TAC

530

Gin

Phe 570

Lys

Glu

Gin

Phe

Leu 575

Asp

Arg

Asp

Ile

Lys 580

Phe

Asp

Ser

Tyr

CTG

GAC

ACC

CAC

CTG

ACC

GCC

CAG

CAG

GTG

AGC

AGC

AAG

GAG

CGC

GTG

578

Leu 585

Asp

Thr

His

Leu

Thr 590

Ala

Gin

Gin

Val

Ser 595

Ser

Lys

Glu

Arg

Val 600

ATC

CTG

AAG

GTG

ACC

GTC

CCC

AGC

GGC

AAG

GGC

AGC

ACC

ACC

CCC

ACC

626

Ile

Leu

Lys

Val

Thr 605

Val

Pro

Ser

Gly

Lys 610

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro 615

Thr

AAS

GCC

GGC

GTG

ATC

CTG

AAC

AAC

AGC

GAG

TAC

AAG

ATG

CTG

ATC

GAC

674

Lys

Ala

Gly

Val 620

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser 625

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu 630

Ile

Asp

AAO

GGC

TAC

ATG

GTG

CAC

GTG

GAC

AAG

GTG

AGC

AAG

GTG

GTG

AAG

AAG

722

Asn

Gly

Tyr 635

Met

Val

His

Val

Asp 640

Lys

Val

Ser

Lys

Val 645

Val

Lys

Lys

GGC

GTG

GAG

TGC

CTC

CAG

ATC

GAG

GGC

ACC

CTG

AAG

AAG

AGT

CTA

GAC

770

Gly

Val 650

Glu

Cys

Leu

Gin

Ile 655

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys 660

Lys

Ser

Leu

Asp

TTC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAC

GCC

GAG

GCC

CAC

AGC

TGG

GGC

ATG

AAG

AAC

818

Phe

Lys

Asn

Asp

Ile

Asn

Ala

Glu

Ala

His

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asn

665 670 675 680

TAC GAG Tyr Glu

GAG TGG GCC Glu Trp Ala 685

AAG Lys

GAC CTG ACC Asp Leu Thr

GAC AGC CAG CGC GAG GCC CTG

866

Asp 690

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala 695

Leu

GAC

GGC

TAC

GCC

CGC

CAG

GAC

TAC

AAG

GAG

ATC

AAC

AAC

TAC

CTG

CGC

914

Asp Gly

Tyr

Ais

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

700 705 710

AAC CAG Asn Gin

GGC Gly 715

GGC Gly

AGC GGC AAC GAG

AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC

962

Ser

Gly Asn Glu 720

Lys

Leu

Asp

Ala Gin 725

Ile

Lys

Asn

ATC

AGC

GAC

GCC

CTG

GGC

AAG

AAG

CCC

ATC

CCC

GAG

AAC

ATC

ACC

GTG

1010

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

730 735 740

235

TAC Tyr 745

CGC hzg

TGG Trp

TGC Cys

GGC ATG CCC GAG TTC GGC TAC CAG ATC AGC GAC CCC

1058

Gly

Met 750

Pro

Glu

Phe

Gly Tyr 755

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro 760

CTG

CCC

AGC

CTG

AAG

GAC

TTC

GAG

GAG

CAG

TTC

CTG

AAC

ACC

ATC

AAG

1106

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

Lys

765

770

775

GAG

GAC

AAG

GGC

TAC

ATG

AGC

ACC

AGC

CTG

AGC

AGC

GAG

CGC

CTG

GCC

1154

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

780

785

790

GCC

TTC

GGC

AGC

CGC

AAG

ATC

ATC

CTG

CGC

CTG

CAG

GTG

CCC

AAG

GGC

1202

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg

Lys

Ile

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

795

800

805

AGC

ACT

GGT

GCC

TAC

CTG

AGC

GCC

ATC

GGC

GGC

TTC

GCC

AGC

GAG

AAG

1250

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

Ala

Ile

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

810

815

820

GAG

ATC

CTG

CTG

GAT

AAG

GAC

AGC

AAG

TAC

CAC

ATC

GAC

.AAG

GTG

ACC

1298

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

.Asp

Lys

Val

Thr

825

830

835

840

GAe

GTG

ATC

ATC

AAG

oíoC

GTG

AAG

CGC

TAC

GTG

GTG

GAC

GCC

ACC

CTG

1346

Glu

Val

Ile

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ada

Thr

Leu

845

850

855

CTG ACC AAC TAG

Leu Thr Asn

Informace o sekvenci SEQ ID č. 46:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 449 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 46:

Met

Gly

Trp

Ser

Trp

Ile

Phe

Leu

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly

Ala

Ala

Gly

1

5

10

15

Val

His

Cys

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Phe

Ala

Asp

Ser

Asn

Pro

Ile

Arg

20

25

30

Val

Thr

Asp

Arg

Ala

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp

40 45

Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly 50 55 60

236

Lys 65

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu 70

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala 75

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys 80

Met

Asn

Asn

Phe

Leu 85

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp 90

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr 95

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe 100

Ser

Ile

Ala

Gly

Ser 105

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile 110

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu 115

Ile

Asp

Lys

Met

Phe 120

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu 125

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile 130

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val 135

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile 140

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser 145

Leu

Thr

Glu

Gly

Asn 150

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp 155

Ala

Met

Ala

Gin

Phe 160

Lys

Glu

Gin

Phe

Leu 165

Asp

Arg

A.sp

Ile

Lys 170

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu 175

Asp

Thr

His

Leu

Thr 180

Ala

Gin

Gin

Val

Ser 185

Ser

Lys

Glu

Arg

Val 190

Ile

Leu

Lys

Val

Thr 195

Val

Pro

Ser

Gly

Lys 200

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro 205

Thr

Lys

Ada

Gly

Val 210

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser 215

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu 220

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr 225

Met

Val

His

Val

Asp 230

Lys

Val

Ser

Lys

Val 235

Val

Lys

Lys

Gly

Val 240

Glu

Cys

Leu

Gin

Ile 245

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys 250

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe 255

Lys

Asn

Asp

Ile

Asn 260

Ala

Glu

Ala

His

Ser 265

Trp

Gly

Met

Lys

Asn 270

Tyr

Glu

Glu

Trp

Ala

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Tkla

Leu

Asp

Gly

275 280 285

Tyr Ala 290

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys 295

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr 300

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly Gly 305

Ser

Gly

Asn

Glu 310

Lys

Leu

Asp

Ala

Gin 315

Ile

Lys

Asn

Ile

Ser 320

Asp Ala

Leu

Gly

Lys 325

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu 330

Asn

Ile

Thr

Val

Tyr 335

Arg

Trp Cys

Gly

Met

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

340 345 350

237

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

lle

Lys

Glu

Asp

355

360

365

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

370

375

380

Gly

Ser

Arg

Lys

lle

lle

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

385

390

395

400

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

Ala

lle

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

lle

405

410

415

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

lle

Asp

Lys

Val

Thr

Glu

Val

420

425

430

lle

lle

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

435 440 445

Asn

Informace o sekvenci SEQ ID č. 47:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klič: peptid (B) lokace 1. . 16 (D) další informace: poznámka = linkerovy peptid pro fúzi VIPlA(a) a VIP2A(a) použitý pro zkonstruováni pCIB5533 (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 47:

Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser 15 10 15

238

Informace o sekvenci SEQ ID č. 48:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 66 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: DNA kódující linkerový peptid použi tá pro zkonstruování pCIB5533 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 48:

CCCGGGCCTT CTACTCCCCC AACTCCCTCT CCTAGCACGC CTCCGACACC TAGCGATATC 60

GGATCC 66

Informace o sekvenci SEQ ID č. 49:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 4031 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 6..4019 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující fúzní protein VIP2A(a) - VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5531

239 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 49:

GATCC ATG AAG CGC ATG GAG GGC AAG CTG TTC ATG GTG AGC AAG AAG 47

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys

4 50

455

4 60

CTC

CAG

GTG

GTG

ACC

AAG

ACC

GTG

CTG

: CTG

; AGC

ACC

GTG

TTC

AGC

ATC

95

Leu

Gin 465

Val

Val

Thr

Lys

Thr 470

Val

Leu

Leu

Ser

Thr 475

Val

Phe

Ser

lle

AGC

CTG

CTG

AAC

AAC

GAG

GTG

ATC

AAG

GCC

GAG

CAG

CTG

AAC

ATC

AAC

143

Ser 480

Leu

Leu

Asn

Asn

Glu 485

Val

lle

Lys

Ala

Glu 4 90

Gin

Leu

Asn

lle

.Asn 495

AGC

CAG

AGC

AAG

TAC

ACC

AAC

CTC

CAG

AAC

CTG

AAG

ATC

ACC

GAC

AAG

191

Ser

Gin

Ser

Lys

Tyr 500

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn 505

Leu

Lys

lle

Thr

Asp 510

Lys

GTG

GAG

GAC

TTC

AAG

GAG

GAC

AAG

GAG

AAG

GCC

AAG

GAG

TGG

GGC

AAG

239

Val

Glu

Asp

Phe 515

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu 520

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp 525

Gly

Lys

GAG

AAG

GAG

AAG

GAG

TGG

AAG

CTT

ACC

GCC

ACC

GAG

AAG

GGC

AAG

ATG

287

Glu

Lys

Glu 530

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu 535

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys 540

Gly

Lys

Met

AAC

AAC

TTC

CTG

GAC

AAC

AAG

AAC

GAC

ATC

AAG

ACC

AAC

TAC

AAG

GAG

335

Asn

Asn 545

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys 550

Asn

Asp

lle

Lys

Thr 555

Asn

Tyr

Lys

Glu

ATC

ACC

TTC

AGC

ATA

GCC

OKtC

AGC

TTC

GAG

GAC

GAG

ATC

AAG

GAC

CTG

383

lle 560

Thr

Phe

Ser

lle

Ala 565

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp 570

Glu

lle

Lys

Asp

Leu 575

AAG

GAG

ATC

GAC

AAG

ATG

TTC

GAC

AAG

ACC

AAC

CTG

AGC

AAC

AGC

ATC

431

Lys

Glu

lle

Asp

Lys 580

Met

Phe

Aap

Lys

Thr 585

Asn

Leu

Ser

A^n

Ser 590

lle

ATC

ACC

TAC

AAG

AAC

GTG

GAG

CCC

ACC

ACC

ATC

GGC

TTC

AAC

AAG

AGC

479

lle

Thr

Tyr

Lys 595

Asn

Val

Glu

Pro

Thr 600

Thr

lle

Gly

Phe

Asn 605

Lys

Ser

CTG

ACC

GAG

GGC

AAC

ACC

ATC

AAC

AGC

GAC

GCC

ATG

GCC

CAG

TTC

AAG

527

Leu

Thr

Glu 610

Gly

Asn

Thr

lle

A.sn 615

Ser

Asp

Ala

Met

Ala 620

Gin

Phe

Lys

GAG

CAG

TTC

CTG

GAC

CGC

GAC

ATC

AAG

TTC

GAC

AGC

TAC

CTG

GAC

ACC

575

Glu

Gin 625

Phe

Leu

Asp

.Arg

Asp 630

lle

Lys

Phe

Asp

Ser 635

Tyr

Leu

Asp

Thr

CAC

CTG

ACC

GCC

CAG

CAG

GTG

AGC

AGC

AAG

GAG

CGC

GTG

ATC

CTG

AAG

623

His 640

Leu

Thr

Ala

Gin

Gin 645

Val

Ser

Ser

Lys

Glu 650

Arg

Val

lle

Leu

Lys 655

GTG

ACC

GTC

CCC

AGC

GGC

AAG

GGC

AGC

ACC

ACC

CCC .

ACC

AAG

GCC

GGC

671

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

660 665 670

240

GTG	: ATC	: CTG	; AAC AAC AGC GAG TAC AAG	; ATG	1 CTG ATC	GAC	AAC	GGC	: TAC	719
Val	Ile	Leu	Asn Asn Ser Glu Tyr Lys 675 680	Met	Leu Ile	Asp	Asn 685	Gly	Tyr
ATG	GTG	CAC	GTG GAC AAG GTG AGC AAG	GTG	GTG AAG	AAG	GGC	GTG	GAG	767
Met	Val	His 690	Val Asp Lys Val Ser Lys 695	Val	Val Lys	Lys 700	Gly	Val	Glu
TGC	CTC	CAG	ATC GAG GGC ACC CTG AAG	AAG	AGT CTA	GAC	TTC	AAG	MC	815
Cys	Leu 705	Gin	Ile Glu Gly Thr Leu Lys 710	Lys	Ser Leu 715	Asp	Phe	Lys	Asn
GAC	ATC	AAC	GCC GAG GCC CAC AGC TGG	GGC	ATG AAG	AAC	TAC	GAG	GAG	863
Asp 720	Ile	Asn	Ala Glu Ala His Ser Trp 725	Gly	Met Lys 730	Asn	Tyr	Glu	Glu 735
TGG	GCC	AAG	GAC CTG ACC GAC AGC CAG	CGC	GAG GCC	CTG	GAC	GGC	TAC	911
Trp	Ala	Lys	Asp Leu Thr Asp Ser Gin 740	Arg 745	Glu Ala	Leu	Asp	Gly 750	Tyr
GCC	CGC	CAG	GAC TAC AAG GAG ATC AAC	AAC	TAC CTG	CGC	AAC	CAG	GGC	959
Ala	Arg	Gin	Asp Tyr Lys Glu Ile Asn 755 760	Asn	Tyr Leu	Arg	Asn 765	Gin	Gly
GGC	AGC	GGC	AAC GAG AAG CTG GAC GCC	CAG	ATC AAG	AAC	ATC	AGC	GAC	1007
Gly	Ser	Gly 770	Asn Glu Lys Leu Asp Ala 775	Gin	Ile Lys	Asn 780	Ile	Ser	Asp
GCC	CTG	GGC	AAG AAG CCC ATC CCC GAG	AAC	ATC ACC	GTG	TAC	CGC	TGG	1055
Ala	Leu 785	Gly	Lys Lys Pro Ile Pro Glu 790	Asn	Ile Thr 795	Val	Tyr Arg	Trp
TGC	GGC	ATG	CCC GAG TTC GGC TAC CAG	ATC	AGC GAC	CCC	CTG	CCC	AGC	1103
Cys 800	Gly	Met	Pro Glu Phe Gly Tyr Gin 805	Ile	Ser Asp 810	Pro	Leu	Pro	Ser 815
CTG	AAG	GAC	TTC GAG GAG CAG TTC CTG	AAC	ACC ATC	AAG	GAG	GAC	AAG	1151
Leu	Lys	Asp	Phe Glu Glu Gin Phe Leu 820	Asn 825	Thr Ile	Lys	Glu	Asp 830	Lys
GGC	TAC	ATG	AGC ACC AGC CTG AGC AGC	GAG	CGC CTG	GCC	GCC	TTC	GGC	1199
Gly	Tyr	Met	Ser Thr Ser Leu Ser Ser 835 840	Glu	Arg Leu	Ala	Ala 845	Phe	Gly
AGC	CGC	AAG	ATC ATC CTG CGC CTG CAG	GTG	CCC AAG	GGC	AGC	ACŤ	GGT	1247
Ser	Arg	Lys 850	Ile Ile Leu Arg Leu Gin 855	Val	Pro Lys	Gly 860	Ser	Thr	Gly
GCC	TAC	CTG	AGC GCC ATC GGC GGC TTC	GCC	AGC GAG	AAG	GAG	ATC	CTG	1295
Ala	Tyr 865	Leu	Ser Ala Ile Gly Gly Phe 870	Ala	Ser Glu 875	Lys	Glu	Ile	Leu
CTG	GAT	AAG	GAC AGC AAG TAC CAC ATC <	GAC .	AAG GTG	ACC	GAG ’	GTG ,	ATC	1343
Leu	Asp	Lys .	Asp Ser Lys Tyr His Ile .	Asp	Lys Val	Thr	Glu	Val	Ile

880 885 890 895

241

1391

ATC AAG Ile Lys

GGC GTG Gly Val

AAG CGC TAC GTG GTG GAC GCC ACC CTG CTG

ACC Thr 910

AAC Asn

Lys 900

Arg

Tyr

Val

Val

Asp 905

Ala

Thr

Leu

Leu

TCC CGG

GGG CCT

TCT

ACT

CCC

CCA

ACT

CCC

TCT

CCT

AGC

ACG

CCT

CCG

Ser Arg

Gly Pro 915

Ser

Thr

Pro

Pro

Thr 920

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr 925

Pro

Pro

ACA CCT

AGC GAT

ATC

GGA

TCC

ACC

ATG

AAG

ACC

AAC

CAG

ATC

AGC

ACC

Thr Pro

Ser Asp 930

Ile

Gly

Ser

Thr 935

Met

Lys

Thr

Asn

Gin 940

Ile

Ser

Thr

ACC CAG

AAG AAC

CAG

CAG

AAG

GAG

ATG

GAC

CGC

AAG

GGC

CTG

CTG

GGC

Thr Gin 945

Lys Asn

Gin

Gin

Lys 950

Glu

Met

Asp

Arg

Lys 955

Gly

Leu

Leu

Gly

TAC TAC

TTC AAG

GGC

AAG

GAC

TTC

AGC

A4C

CTG

ACC

ATG

TTC

GCC

CCC

Tyr Tyr 960

Phe Lys

Gly

Lys 965

Asp

Phe

Ser

Asn

Leu 970

Thr

Met

Phe

Ala

Pro 975

ACG CGT

GAC AGC

ACC

CTG

ATC

TAC

GAC

CAG

CAG

ACC

GCC

AAC

AAG

CTG

Thr Arg

Asp Ser

Thr 980

Leu

Ile

Tyr

Asp

Gin 985

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys 990

Leu

CTG GAC

AAG AAG

CAG

CAG

GAG

TAC

CAG

AGC

ATC

CGC

TGG

ATC

GGC

CTG

Leu Asp

Lys Lys 995

Gin

Gin

Glu

Tyr

Gin Ser 1000

Ile

Arg

Trp

Ile Gly 1005

Leu

ATC CAG

AGC AAG

GAG

ACC

GGC

GAC

TTC

ACC

TTC

AAC

CTG

AGC

GAG

GAC

Ile Gin

Ser Lys 1010

Glu

Thr

Gly

Asp Phe 1015

Thr

Phe

Asn

Leu Ser 1020

Glu

Asp

GAG CAG

GCC ATC

ATC

GAG

ATC

AAC

GGC

AAG

ATC

ATC

AGC

AAC

A3G

GGC

Glu Gin Ala Ile 1025

Ile

Glu

Ile Asn 1030

Gly

Lys

Ile

Ile Ser 1035

Asn

Lys

Gly

AAG GAG

AAG CAG

GTG

GTG

CAC

CTG

GAG

AAG

GGC

AAG

CTG

GTG

CCC

ATC

Lys Glu 1040

Lys Gin

Val

Val His 1045

Leu

Glu

Lys

Gly Lys 1050

Leu

Val

Pro

Ile 1055

ΑΑΞ ATC

GAG TAC

CAG

AGC

GAC

ACC

AAG

TTC

AAC

ATC

GAC

AGC

AAG

ACC

Lys Ile

Glu Tyr

Gin Ser 1060

Asp

Thr

Lys

Phe Asn 1065

Ile

Asp

Ser

Lys 107C

Thr 1

TTC AAG

GAG CTG

AAG

CTT

TTC

AAG

ATC

GAC

AGC

CAG

AAC

CAG

CCC

CAG

Phe Lys

Glu Leu Lys 1075

Leu

Phe

Lys

Ile 108C

Asp )

Ser

Gin

Asn

Gin 1085

Pro

Gin

CAG GTG

CAG CAG

GAC

GAG

CTG

CGC

AAC

CCC

GAG

TTC

AAC

AAG

AAG

GAG

Gin Val

Gin Gin 1090

Asp

Glu

Leu

Arg 1095

Asn

Pro

Glu

Phe

Asn 110C

Lys 1

Lys

Glu

AGC CAG

GAG TTC

CTG

GCC

AAG

CCC

AGC

AAG

ATC

AAC

CTG

TTC

ACC

CAG

Ser Gin 1105

Glu Phe )

Leu

Ala

Lys nic

Pro 1

Ser

Lys

Ile

Asn 1115

Leu 1

Phe

Thr

Gin

1439

1487

1535

1583

1631

1679

1727

1775

1823

1871

1919

1967

2015

242

2063

CAG ATG Gin Met 1120	AAG CGC GAG Lys Arg Glu	ATC GAC GAG GAC ACC GAC ACC GAC GGC GAC AGC Ile Asp Glu Asp Thr A*sp Thr Asp Gly Asp Ser
1125	1130	1135
ATC CCC	GAC CTG TGG	GAG GAG AAC GGC	TAC ACC ATC	CAG AAC CGC ATC
Ile Pro	Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly 1140	Tyr Thr Ile 1145	Gin Asn Arg Ile 1150
GCC GTG	AAG TGG GAC	GAC AGC CTG GCT	AGC AAG GGC	TAC ACC AAG TTC
Ala Val	Lys Trp Asp 1155	Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly 1160	Tyr Thr Lys Phe 1165
GTG AGC	AAC CCC CTG	GAG AGC CAC ACC	GTG GGC GAC	CCC TAC ACC GAC
Val Ser	Asn Pro Leu 1170	Glu Ser His Thr 1175	Val Gly Asp	Pro Tyr Thr Asp 1180
TAC GAG	AAG GCC GCC	CGC GAC CTG GAC	CTG AGC AAC	GCC AAG GAG ACC
Tyr Glu Lys Ala Ala 1185	Arg Asp Leu Asp 1190	Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr 1195
TTC AAC	CCC CTG GTG	GCC GCC TTC CCC	AGC GTG AAC	GTG AGC ATG GAG
Phe A.sn 1200	Pro Leu Val	Ala Ala Phe Pro 1205	Ser Val Asn 1210	Val Ser Met Glu 1215
AAG GTG	ATC CTG AGC	CCC AAC GAG AAC	CTG AGC AAC	AGC GTG GAG AGC
Lys Val	Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn 1220	Leu Ser Asn 1225	Ser Val Glu Ser 1230
CAC TCG	AGC ACC AA.C	TGG AGC TAC ACC	AAC ACC GAG	GGC GCC AGC GTG
His Ser	Ser Thr Asn 1235	Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu 1240	Gly Ala Ser Val 1245
GAG GCC	GGC ATC GGT	CCC AAG GGC ATC	AGC TTC GGC	GTG AGC GTG AAC
Glu Ala	Gly Ile Gly 1250	Pro Lys Gly Ile 1255	Ser Phe Gly	Val Ser Val Asn 1260
TAC CAG	CAC AGC GAG	ACC GTG GCC CAG	GAG TGG GGC	ACC AGC ACC GGC
Tyr Gin 1265	His Ser Glu 1	Thr Val Ala Gin 1270	Glu Trp Gly 1275	Thr Ser Thr Gly
AAC ACC	AGC CAG TTC	AAC ACC GCC AGC	GCC GGC TAC	CTG AAC GCC AAC
Asn Thr 1280	Ser Gin Phe	Asn Thr Ala Ser 1285	Ala Gly Tyr 1290	Leu Asn Ala Asn ' 1295
GTG CGC	TAC AAC AAC	GTG GGC ACC GGC	GCC ATC TAC	GAC GTG AAG CCC
Val Arg	Tyr Asn Asn 1300	Val Gly Thr Gly	Ala Ile Tyr Asp Val Lys Pro 1305 1310
ACC ACC	AGC TTC GTG	CTG AAC AAC GAC	ACC ATC GCC	ACC ATC ACC GCC
Thr Thr	Ser Phe Val	Leu Asn Asn Asp	Thr Ile Ala	Thr Ile Thr Ala

1315 1320 1325

2111

2159

2207

2255

2303

2351

2399

2447

2495

2543

2591

2639

AAG TCG AAT TCC ACC GCC CTG AAC ATC AGC CCC GGC GAG AGC TAC CCC Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro

1330 1335 1340

2687

243

AAG AAG GGC CAG Lys Lys Gly Gin 1345	AAC GGC ATC GCC ATC ACC AGC ATG GAC GAC TTC AAC	2735
Asn	Gly Ile Ala 1350	Ile	Thr Ser	Met Asp Asp 1355	Phe	Asn
AGC CAC CCC ATC	ACC	CTG AAC AAG	AAG	CAG GTG	GAC AAC CTG	CTG	AAC	2783
Ser His Pro Ile 1360	Thr	Leu Asn Lys 1365	Lys	Gin Val Asp Asn Leu 1370	Leu	Asn 1375
AAC AAG CCC ATG	ATG	CTG GAG ACC	AAC	CAG ACC	GAC GGC GTC	TAC	AAG	2831
Asn Lys Pro Met	Met Leu Glu Thr 1380	Asn	Gin Thr 1385	Asp Gly Val	Tyr Lys 1390
ATC AAG GAC ACC	CAC	GGC AAC ATC	GTG	ACG GGC	GGC GAG TGG	AAC	GGC	287S
Ile Lys Asp Thr His 1395	Gly Asn Ile	Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn 1400 1405	Gly
GTG ATC CAG CAG	ATC	AAG GCC AAG	ACC	GCC AGC	ATC ATC GTC	GAC	GAC	2927
Vel Ile Gin Gin 1410	Ile	Lys Ala Lys Thr 1415	Ma Ser	Ile Ile Val 1420	Asp	Mp
GGC GAG CGC GTG	GCC	GAG AAG CGC	GTG	GCC GCC	AAG GAC TAC	GAG	AAC	2975
Gly Glu Arg Val 1425	Ala	Glu Lys Arg 1430	Val	Ala Ala	Lys Mp Tyr 1435	Glu	Mn
CCC GAG GAC AAG	ACC	CCC AGC CTG	ACC	CTG AAG	GAC GCC CTG	AAG	CTG	3023
Pro Glu Asp Lys 1440	Thr	Pro Ser Leu 1445	Thr	Leu Lys Asp Ala Leu 1450	Lys	Leu 1455
AGC TAC CCC GAC	GAG	ATC AAG GAG	ATC	GAG GGC	TTG CTG TAC	TAC	AAG	3071
Ser Tyr Pro Asp	Glu 14 6C	Ile Lys Glu )	Ile	Glu Gly 1465	Leu Leu Tyr	Tyr 147C	Lys )
AAC AAG CCC ATC	TAC	GAG AGC AGC	GTG	ATG ACC	TAT CTA GAC	GAG	AAC	3119
Asn Lys Pro Ile Tyr 1475	Glu Ser Ser	Val 148C	Met Thr )	Tyr Leu Mp 1485	Glu	Mn
ACC GCC AAG GAG	GTG	ACC AAG CAG	CTG	AAC GAC	ACC ACC GGC	AAG	TTC	3167
Thr Ala Lys Glu 1490	Val	Thr Lys Gin 1495	Leu	Asn Asp	Thr Thr Gly 1500	Lys	Phe
AAG GAC GTG AGC	CAC	CTG TAC GAC	GTG	AAG CTG	ACC CCC AAG	ATG	AAC	3215
Lys Asp Val Ser 1505	His	Leu Tyr Asp 1510	Val	Lys Leu	Thr Pro Lys 1515	Met	Mn
GTG ACC ATC AAG	CTG	AGC ATC CTG	TAC	GAC AAC	GCC GAG AGC	AAC	GAC	3263
Val Thr Ile Lys 1520	Leu	Ser Ile Leu 1525	Tyr	Mp Mn 1530	Ala Glu Ser	Asn	Asp 1535
AAC AGC ATC GGC	AAG	TGG ACC AAC	ACC	AAC ATC	GTG AGC GGC	GGC	AAC	3311
Asn Ser Ile Gly	Lys 1540	Trp Thr Asn	Thr	Asn Ile 1545	Val Ser Gly	Gly 1550	Mn

244

AAC GGC AAG	AAG CAG TAC Lys Gin Tyr 1555	AGC AGC AAC AAC CCC GAC GCC AAC CTG ACC	3359
Asn	Gly	Lys	Ser	Ser	Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu	Thr
1560	1565
CTG	AAC	ACC	GAC GCC CAG	GAG	AAG	CTG AAC AAG	AAC CGC GAC TAC	TAC	3407
Leu	Asn	Thr Asp Ala Gin 1570	Glu	Lys Leu Asn Lys 1575	Asn Arg Asp Tyr 1580	Tyr
ATC	AGC	CTG	TAC ATG AAG	AGC	GAG	AAG AAC ACC	CAG TGC GAG ATC	ACC	3455
Ile	Ser Leu 1585	Tyr Met Lys	Ser Glu 1590	Lys Asn Thr	Gin Cys Glu Ile 1595	Thr
ATC	GAC	GGC	GAG ATA TAC	CCC	ATC	ACC ACC AAG	ACC GTG AAC GTG	AAC	3503
Ile Asp 1600	Gly	Glu Ile Tyr Pro 1605	Ile	Thr Thr Lys Thr Val Asn Val 1610	Asn 1615
AAG	GAC	AAC	TAC AAG CGC	CTG	GAC	ATC ATC GCC	CAC AAC ATC AAG	AGC	3551
Lys	Asp	Asn	Tyr Lys Arg 1620	Leu	Asp	Ile Ile Ala 1625	His Asn Ile Lys Ser 1630
AAC	CCC	ATC	AGC AGC CTG	CAC	ATC	AAG ACC AAC	GAC GAG ATC ACC	CTG	3599
Asn	Pro	Ile	Ser Ser Leu 1635	His	Ile	Lys Thr Asn 1640	Asp Glu Ile Thr 1645	Leu
TTC	TGG	GAC	GAC ATA TCG	ATT	ACC	GAC GTC GCC	AGC ATC AAG CCC	GAG	3647
Phe	Trp	Asp Asp Ile Ser 1650	Ile	Thr Asp Val Ala 1655	Ser Ile Lys Pro 1660	Glu
AAC	CTG	ACC	GAC AGC GAG	ATC	AAG	CAG ATA TAC	AGT CGC TAC GGC	ATC	3695
Asn	Leu Thr 1665	Asp Ser Glu	Ile Lys 1670	Gin Ile Tyr	Ser Arg Tyr Gly 1675	Ile
AAG	CTG	GAG	GAC GGC ATC	CTG	ATC	GAC AAG AAA	GGC GGC ATC CAC	TAC	3743
Lys Leu 1680	Glu	Asp Gly Ile Leu 1685	Ile	Asp Lys Lys Gly Gly Ile His 1690	Tyr 1695
GGC	GAG	TTC	ATC AAC GAG	GCC	AGC	TTC AAC ATC	GAG CCC CTG CAG	AAC	3791
Gly	Glu	Phe	Ile Asn Glu 1700	Ala	Ser	Phe Asn Ile 1705	Glu Pro Leu Gin Asn 1710
TAC	GTG	ACC	AAG TAC GAG	GTG	ACC	TAC AGC AGC	GAG CTG GGC CCC	AAC	3839
Tyr	Val	Thr	Lys Tyr Glu 1715	Val	Thr	Tyr Ser Ser 1720	Glu Leu Gly Pro 1725	Asn
GTG	AGC	GAC	ACC CTG GAG	AGC	GAC	AAG ATT TAC	AAG GAC GGC ACC	ATC	3887
Val	Ser	Asp 173C	Thr Leu Glu 1	Ser	Asp 1735	Lys Ile Tyr	Lys Asp Gly Thr 1740	Ile
AAG	TTC	GAC	TTC ACC AAG	TAC	AGC	AAG AAC GAG	CAG GGC CTG TTC	TAC	3935
Lys	Phe 1745	Asp	Phe Thr Lys	Tyr 1750	Ser	Lys Asn Glu	Gin Gly Leu Phe 1755	Tyr
GAC	AGC	GGC	CTG AAC TGG	GAC	TTC	AAG ATC AAC	GCC ATC ACC TAC	GAC	3983
Asp 1760	Ser Gly	Leu Asn Trp 1765	Asp Phe	Lys Ile Asn 1770	Ala Ile Thr Tyr	Asp 1775

245

GGC AAG GAG ATG AAC GTG TTC CAC CGC TAC AAC AAG TAGATCTGAG Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys	4029
	1780 1785
CT		4031
Informace	o sekvenci SEQ ID č. 50:
(i)	charakteristiky sekvence: (A) délka: 1338 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární
(ii)	typ molekuly: protein
(xi)	znázornění sekvence SEQ ID č. 50:

Met

Lys

Arg

Met

Glu

Gly

Lys

Leu

Phe

Met

Val

Ser

Lys

Lys

Leu

Gin

1

5

10

15

Val

Val

Thr

Lys

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

Ile

Ser

Leu

20

25

30

Leu

Asn

Asn

Glu

Val

Ile

Lys

Ala

Glu

Gin

Leu

Asn

Ile

Asn

Ser

Gin

35

40

45

Ser

Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

50

55

60

Asp

Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

85

90

95

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Lys

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

100

105

110

Phe

Ser

Ile

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

115

120

125

Ile

Asd

Lys

Met

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

Thr

130

135

140

Tyr

Lys

Asn

Val

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

145

150

155

160

Glu

Gly

Asn

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

165

170

175

246

Phe Leu Asp Arg

Asp lle Lys Phe

Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu

180

185

190

Thr

Ala

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

lle

Leu

Lys

Val

Thr

195

200

205

Val

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

lle

210

215

220

Leu

Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

lle

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

Val

225

230

235

240

His

Val

Asp

Lys

Val

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Val

Glu

Cys

Leu

245

250

255

Gin

lle

Glu

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp

lle

260

265

270

Asn

Ala

Glu

Ala

His

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asn

Tyr

Glu

Glu

Trp

Ala

275

280

285

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

290

295

300

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

lle

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

305

310

315

320

Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gin lle Lys Asn lle Ser Asp Ala Leu 325 330 335

Gly Lys Lys Pro lle Pro Glu Asn lle Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly 340 345 350

Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin lle Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys 355 360 365

Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr lle Lys Glu Asp Lys Gly Tyr 370 375 380

Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg 385 390 395 400

Lys

lle

lle

Leu

Arg 405

Leu

Gin

Val

Pro

Lys 410

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala 415

Tyr

Leu

Ser

Ala

lle 420

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser 425

Glu

Lys

Glu

lle

Leu 430

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

lle

Asp

Lys

Val

Thr

Glu

Val

lle

lle

Lys

435 440 445

Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn Ser Arg 450 455 460

247

Gly 465

Pro

Ser

Thr

Pro

Pro 470

Thr

Pro

Ser

Pro

Ser 475

Thr

Pro

Pro

Thr

Pro 480

Ser

Asp

Ile

Gly

Ser 485

Thr

Met

Lys

Thr

Asn 490

Gin

Ile

Ser

Thr

Thr 4 95

Gin

Lys

Asn

Gin

Gin 500

Lys

Glu

Met

Asp

Arg 505

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly 510

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly 515

Lys

Asp

Phe

Ser

Asn 520

Leu

Thr

Met

Phe

Ala 525

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser 530

Thr

Leu

Ile

Tyr

Asp 535

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn 540

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys 545

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr 550

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp 555

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin 560

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly 565

Asp

Phe

Thr

Phe

Asn 570

Leu

Ser

Glu

Asp

Glu 575

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu 580

Ile

Asn

Gly

Lys

Ile 585

Ile

Ser

Asn

Lys

Gly 590

Lys

Glu

Lys

Gin

Val 595

Val

His

Leu

Glu

Lys 600

Gly

Lys

Leu

Val

Pro 605

Ile

Lys

Ile

Glu

Tyr 610

Gin

Ser

Asp

Thr

Lys 615

Phe

Asn

Ile

Asp

Ser 620

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu 625

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys 630

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn 635

Gin

Pro

Gin

Gin

Val 640

Gin

Gin

Asp

Glu

Leu 645

Arg

Asn

Pro

Glu

Phe 650

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser 655

Gin

Glu

Phe

Leu

Ada 660

Lys

Pro

Ser

Lys

Ile 665

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin 670

Gin

Met

Lys

Arg

Glu 675

Ile

Asp

Glu

Asp

Thr 680

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp 685

Ser

Ile

Pro

A.sp

Leu 690

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly 695

Tyr

Thr

Ile

Gin

Asn 700

Arg

Ile

Ala

Val

Lys 705

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu 710

Ala

Ser

Lys

Gly

Tyr 715

Thr

Lys

Phe

Val

Ser 720

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

725 730 735

Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn 740 745 750

248

Pro

Leu

Val 755

Ala

Ala

Phe

Pro

Ser 760

Val

Asn

Val

Ser

Met 765

Glu

Lys

Val

Ile

Leu 770

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn 775

Leu

Ser

Asn

Ser

Val 780

Glu

Ser

His

Ser

Ser 785

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr 790

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly 795

Ala

Ser

Val

Glu

Ala 800

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys 805

Gly

Ile

Ser

Phe

Gly 810

Val

Ser

Val

Asn

Tyr 815

Gin

His

Ser

Glu

Thr 820

Val

Ala

Gin

Glu

Trp 825

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly 830

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe 835

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala 840

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala 845

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn 850

Asn

Val

Gly

Thr

Gly 855

Ala

Ile

Tyr

Asp

Val 860

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser 865

Phe

Val

Leu

Asn

Asn 870

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr 875

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser 880

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu 885

Asn

Ile

Ser

Pro

Gly 890

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys 895

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly 900

Ile

Ala

Ile

Thr

Ser 905

Met

Asp

Asp

Phe

Asn 910

Ser

His

Pro

Ile

Thr 915

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin 920

Val

Asp

Asn

Leu

Leu 925

Asn

Asn

Lys

Pro

Met 930

Met

Leu

Glu

Thr

Asn 935

Gin

Thr

Asp

Gly

Val 940

Tyr

Lys

Ile

Lys

Asp 945

Thr

His

Gly

Asn

Ile 950

Val

Thr

Gly

Gly

Glu 955

Trp

Asn

Gly

Val

Ile 960

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala 965

Lys

Thr

Ala

Ser

Ile 970

Ile

Val

Asp

Asp

Gly 975

Glu

Arg

Val

Ala

Glu 980

Lys

Arg

Val

Ala

Ala 985

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn 990

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr 995

Pro

Ser

Leu

Thr

Leu 1000

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys 1005

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp 1010

Glu

Ile

Lys

Glu

Ile 1015

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr 1020

Tyr

Lys

Asn

Lys

Pro

Ile Tyr

Glu

Ser

Ser

Val .

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp Glu

Asn

Thr

Ala

1025

1030

1035

Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp 1045 1050 1055

1040

249

Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys	Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr
	1060	1065	1070
Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp Asn Ala Glu Ser 1075 1080	Asn Asp Asn Ser 1085
Ile Gly Lys 1090	Trp Thr Asn Thr Asn 1095	Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn Gly 1100
Lys Lys Gin 1105	Tyr Ser Ser Asn Asn 1110	Pro Asp Ala Asn 1115	Leu Thr Leu Asn 1120
Thr Asp Ala	Gin Glu Lys Leu Asn 1125	Lys Asn Arg Asp 1130	Tyr Tyr Ile Ser 1135
Leu Tyr Met	Lys Ser Glu Lys Asn 1140	Thr Gin Cys Glu 1145	Ile Thr Ile Asp 1150
Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn 1155 1160	Val Asn Lys Asp 1165
Asn Tyr Lys 1170	Arg Leu Asp Ile Ile 1175	Ala His Asn Ile Lys Ser Asn Pro 1180
Ile Ser Ser 1185	Leu His Ile Lys Thr 1190	Asn Asp Glu Ile 1195	Thr Leu Phe Trp 1200
Asp Asp Ile	Ser Ile Thr Asp Val 1205	Ala Ser Ile Lys 1210	Pro Glu Asn Leu 1215
Thr Asp Ser	Glu Ile Lys Gin Ile 1220	Tyr Ser Arg Tyr 1225	Gly Ile Lys Leu 1230
Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile 1235 1240	His Tyr Gly Glu 1245
Phe Ile Asn 1250	Glu Ala Ser Phe Asn 1255	Ile Glu Pro Leu 1260	Gin Asn Tyr Val 1
Thr Lys Tyr 1265	Glu Val Thr Tyr Ser 1270	Ser Glu Leu Gly 1275	Pro Asn Val Ser 1280
Asp Thr Leu	Glu Ser Asp Lys Ile 1285	Tyr Lys Asp Gly 1290	Thr Ile Lys Phe 1295
Asp Phe Thr	Lys Tyr Ser Lys Asn 1300	Glu Gin Gly Leu 1305	Phe Tyr Asp Ser 1310
Gly Leu Asn	Trp Asp Phe Lys Ile	Asn Ala Ile Thr	Tyr Asp Gly Lys

1315 1320 1325

Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys 1330 1335

250

Informace o sekvenci SEQ ID č. 51:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2444 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

(ii)	typ molekuly: DNA	(genomová)
(iii)	hypotetická: není
(ix)	vlastnosti:
	(A) jméno/klíč:	CDS
	(B) lokace: 17..	2444
	(D) další informace: produkt =

syntetický:nativní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 51:

GGATCCACCA ATGAAC ATG AAC AAG AAC AAC ACC AAG CTG AGC ACC CGC 49

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg

10

GCC CTG CCG AGC TTC ATC GAC TAC TTC AAC GGC ATC TAC GGC TTC GCC

97

Ala Leu Pro Ser 15

Phe

Ile

Asp

Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala

20

25

ACC

GGC

ATC

AAG

GAC

ATC

ATG

AAC

ATG

ATC

TTC

AAG

ACC

GAC

ACC

GGC

145

Thr

Gly

Ile

Lys

Asp

Ile

Met

Asn

Met

Ile

Phe

Lys

Thr

Asp

Thr

Gly

30

35

40

GGC

GAC

CTG

ACC

CTG

GAC

GAG

ATC

CTG

AAG

AAC

CAG

CAG

CTG

CTG

AAC

193

Gly Asp

Leu

Thr

Leu

Asp

Glu

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Gin

Leu

Leu

Asn

45

50

55

GAC

ATC

AGC

GGC

AAG

CTG

GAC

GGC

GTG

AAC

GGC

AGC

CTG

AAC

GAC

CTG

241

Asp

Ile

Ser

Gly

Lys

Leu

Asp

Gly

Val

Asn

Gly

Ser

Leu

Asn

Asp

Leu

6*0

65

70

75

ATC

GCC

CAG

GGC

AAC

CTG

AAC

ACC

GAG

CTG

AGC

AAG

GAG

ATC

CTT

AAG

289

Ile

Ala

Gin

Gly

Asn

Leu

Asn

Thr

Glu

Leu

Ser

Lys

Glu

Ile

Leu

Lys

80

85

90

ATC

GCC

AAC

GAG

CAG

AAC

CAG

GTG

CTG

AAC

GAC

GTG

AAC

AAC

AAG

CTG

337

Ile

Ala

Asn

Glu

Gin

Asn

Gin

Val

Leu

Asn

Asp

Val

Asn

Asn

Lys

Leu

95

100

105

GAC

GCC

ATC

AAC

ACC

ATG

CTG

CGC

GTG

TAC

CTG

CCG

AAG

ATC

ACC

AGC

385

Asp

Ala

Ile

Asn

Thr

Met

Leu

Arg

Val

Tyr

Leu

Pro

Lys

Ile

Thr

Ser

110

115

120

251

ATG Met

CTG AGC GAC GTG ATG AAG CAG AAC TAC GCC CTG AGC CTG CAG ATC

433

Leu Ser 125

Asp Val Met

Lys 130

Gin Asn

Tyr Ala Leu 135

Ser Leu Gin lle

GAG

TAC

CTG

AGC

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

ATC

AGC

GAC

AAG

CTG

GAC

ATC

481

Glu

Tyr

Leu

Ser

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

lle

Ser

Asp

Lys

Leu

Asp

lle

140

145

150

155

ATC

AAC

GTG

AAC

GTC

CTG

ATC

AAC

AGC

ACC

CTG

ACC

GAG

ATC

ACC

CCG

529

lle

Asn

Val

Asn

Val

Leu

lle

Asn

Ser

Thr

Leu

Thr

Glu

lle

Thr

Pro

160

165

170

GCC

TAC

CAG

CGC

ATC

AAG

TAC

GTG

AAC

GAG

AAG

TTC

GAA

GAG

CTG

ACC

577

Ala

Tyr

Gin

Arg

lle

Lys

Tyr

Val

Asn

Glu

Lys

Phe

Glu

Glu

Leu

Thr

175

180

185

TTC

GCC

ACC

GAG

ACC

AGC

AGC

AAG

GTG

AAG

AAG

GAC

GGC

AGC

CCG

GCC

625

Phe

Ala

Thr

Glu

Thr

Ser

Ser

Lys

Val

Lys

Lys

Asp

Gly

Ser

Pro

Ala

190

195

200

GAC

ATC

CTG

GAC

GAG

CTG

ACC

GAG

CTG

ACC

GAG

CTG

GCC

AAG

AGC

GTG

673

Asp

lle

Leu

Asp

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu

Ala

Lys

Ser

Val

205

210

215

ACC

AAG

AAC

GAC

GTG

GAC

GGC

TTC

GAG

TTC

TAC

CTG

AAC

ACC

TTC

CAC

721

Thr

Lys

Asn

Asp

Val

Asp

Gly

Phe

Glu

Phe

Tyr

Leu

Asn

Thr

Phe

His

220

225

230

235

GAC

GTG

ATG

GTG

GGC

AAC

AAC

CTG

TTC

GGC

CGC

AGC

GCC

CTG

AAG

ACC

769

Asp

Val

Met

Val

Gly

Asn

Asn

Leu

Phe

Gly Arg

Ser

Ala

Leu

Lys

Thr

240

245

250

GCC

AGC

GAG

CTG

ATC

ACC

AAG

GAG

AAC

GTG

AAG

ACC

AGC

GGC

AGC

GAG

817

Ala

Ser

Glu

Leu

lle

Thr

Lys

Glu

Asn

Val

Lys

Thr

Ser

Gly

Ser

Glu

255

260

265

GTG

GGC

AAC

GTG

TAC

AAC

TTC

CTG

ATC

GTG

CTG

ACC

GCC

CTG

CAG

GCC

865

Val

Gly

Asn

Val

Tyr

Asn

Phe

Leu

lle

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

270

275

280

CAG

GCC

TTC

CTG

ACC

CTG

ACC

ACC

TGT

CGC

AAG

CTG

CTG

GGC

CTG

GCC

913

Gin

Ala

Phe

Leu

Thr

Leu

Thr

Thr

Cys

Arg

Lys

Leu

Leu

Gly

Leu

Ala

285

290

295

GAC

A.TC

GAC

TAC

ACC

AGC

ATC

ATG

AAC

GAG

CAC

TTG

AAC

AAG

GAG

AAG

961

Asp

lle

Asp

Tyr

Thr

Ser

lle

Met

Asn

Glu

His

Leu

Asn

Lys

Glu

Lys

300

305

310

315

GAG

GAG

TTC

CGC

GTG

AAC

ATC

CTG

CCG

ACC

CTG

AGC

AAC

ACC

TTC

AGC

1009

Glu

Glu

Phe

Arg

Val

Asn

lle

Leu

Pro

Thr

Leu

Ser

Asn

Thr

Phe

Ser

320

325

330

AAC

CCG

AAC

TAC

GCC

AAG

GTG

AAG

GGC

AGC

GAC

GAG

GAC

GCC

AAG .

ATG

1057

Asn

Pro

Asn

Tyr

Ala

Lys

Val

Lys

Gly

Ser

Asp

Glu .

Asp .

Ala

Lys

Met

335 340 345

252

ATC GTG GAG GCT AAG CCG GGC CAC GCG TTG ATC GGC TTC GAG ATC AGC lle Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu lle Gly Phe Glu lle Ser

1105

350

355

360

AAC

GAC

AGC

ATC

: ACC

: GTG

i CTG

. AAG

GTG

TAC

GAG

GCC

AAG

CTG

AAG

CAG

1153

Asn

Asp

Ser

lle

Thr

Val

Leu

Lys

Val

Tyr

Glu

Ala

Lys

Leu

Lys

Gin

365

370

375

AAC

TAC

CAG

GTG

GAC

AAG

GAC

AGC

TTG

AGC

GAG

GTG

ATC

TAC

GGC

GAC

1201

Asn

Tyr

Gin

Val

Asp

Lys

Asp

Ser

Leu

Ser

Glu

Val

lle

Tyr

Gly Asp

380

385

390

395

ATG

GAC

AAG

CTG

CTG

TGT

CCG

GAC

CAG

AGC

GAG

CAA

ATC

TAC

TAC

ACC

1249

Met

Asp

Lys

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Gin

Ser

Glu

Gin

lle

Tyr

Tyr

Thr

400

405

410

AAC

AAC

ATC

GTG

TTC

CCG

AAC

GAG

TAC

GTG

ATC

ACC

AAG

ATC

GAC

TTC

1297

Asn

Asn

lle

Val

Phe

Pro

Asn

Glu

Tyr

Val

lle

Thr

Lys

lle

Asp

Phe

415

420

425

ACC

AAG

AAG

ATG

AAG

ACC

CTG

CGC

TAC

GAG

GTG

ACC

GCC

AAC

TTC

TAC

1345

Thr

Lys

Lys

Met

Lys

Thr

Leu

Arg

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Asn

Phe

Tyr

430

435

440

GAC

AGC

AGC

ACC

GGC

GAG

ATC

GAC

CTG

AAC

AAG

AAG

AAG

GTG

GAG

AGC

1393

Asp

Ser

Ser

Thr

Gly

Glu

lle

Asp

Leu

Asn

Lys

Lys

Lys

Val

Glu

Ser

445

450

455

AGC

GAG

GCC

GAG

TAC

CGC

ACC

CTG

AGC

GCG

AAC

GAC

GAC

GGC

GTC

TAC

1441

Ser

Glu

Ala

Glu

Tyr

Arg

Thr

Leu

Ser

Ala

Asn

Asp

Asp

Gly

Val

Tyr

460

465

470

475

ATG

CCA

CTG

GGC

GTG

ATC

AGC

GAG

ACC

TTC

CTG

ACC

CCG

ATC

AAC

GGC

1489

Met

Pro

Leu

Gly

Val

lle

Ser

Glu

Thr

Phe

Leu

Thr

Pro

lle

Asn

Gly

480

485

490

TTT

GGC

CTG

CAG

GCC

GAC

GAG

AAC

AGC

CGC

CTG

ATC

ACC

CTG

ACC

TGT

1537

Phe

Gly

Leu

Gin

Ala

Asp

Glu

Asn

Ser

Arg

Leu

lle

Thr

Leu

Thr

Cys

495

500

505

AAG

AGC

TAC

CTG

CGC

GAG

CTG

CTG

CTA

GCC

ACC

GAC

CTG

AGC

AAC

AAG

1585

Lys

Ser

Tyr

Leu

Arg

Glu

Leu

Leu

Leu

Ala

Thr

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

510

515

520

GAG

ACC

AAG

CTG

ATC

GTG

CCA

CCG

AGC

GGC

TTC

ATC

AGC

AAC

ATC

GTG

1633

Glu

Thr

Lys

Leu

lle

Val

Pro

Pro

Ser

Gly

Phe

lle

Ser

Asn

lle

Val

525

530

535

GAG

AAC

GGC

AGC

ATC

GAG

GAG

GAC

AAC

CTG

GAG

CCG

TGG

AAG

GCC

AAC

1681

Glu

Asn

Gly

Ser

lle

Glu

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

Ala

Asn

540

545

550

555

AAC

AAG

AAC

GCC

TAC

GTG

GAC

CAC

ACC

GGC

GGC

GTG

AAC

GGC

ACC

AAG

1729

Asn

Lys

Asn

Ala

Tyr

Val

Asp

His

Thr

Gly Gly

Val

Asn

Gly

Thr

Lys

560

565

570

GCC

CTG

TAC

GTG

CAC

AAG

GAC

GGC

GGC

ATC

AGC

CAG

TTC

ATC

GGC

GAC

1777

Ala

Leu

Tyr '

Val

His

Lys .

Asp

Gly Gly

lle

Ser

Gin

Phe

lle

Gly Asp

575 580 585

253

AAG Lys

CTG AAG CCG Leu Lys Pro 590

AAG ACC GAG Lys Thr Glu

TAC Tyr 595

GTG ATC CAG TAC

ACC GTG AAG GGC

1825

Val Ile

Gin

Tyr

Thr Val 600

Lys

Gly

AAG

CCA

TCG

ATT

CAC

CTG

AAG

GAC

GAG

AAC

ACC

GGC

TAC

ATC

CAC

TAC

1873

Lys

Pro

Ser

Ile

His

Leu

Lys

Asp

Glu

Asn

Thr

Gly

Tyr

Ile

His

Tyr

605

610

615

GAG

GAC

ACC

AAC

AAC

AAC

CTG

GAG

GAC

TAC

CAG

ACC

ATC

AAC

AAG

CGC

1921

Glu

Asp

Thr

Asn

Asn

Asn

Leu

Glu

Asp

Tyr

Gin

Thr

Ile

Asn

Lys

Arg

620 625 630 635

TTC Phe

ACC ACC Thr Thr

GGC ACC Gly Thr 640

GAC CTG

AAG GGC GTG

TAC CTG ATC CTG

AAG AGC Lys Ser 650

1969

Asp

Leu

Lys

Gly

Val 645

Tyr

Leu

Ile

Leu

CAG

AAC

GGC

GAC

GAG

GCC

TGG

GGC

GAC

AAC

TTC

ATC

ATC

CTG

GAG

ATC

2017

Gin

Asn

Gly

Asp

Glu

Ala

Trp

Gly Asp

Asn

Phe

Ile

Ile

Leu

Glu

Ile

655

660

665

AGC

CCG

AGC

GAG

AAG

CTG

CTG

AGC

CCG

GAG

CTG

ATC

AAC

ACC

AAC

.AAC

2065

Ser

Pro

Ser

Glu

Lys

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Leu

Ile

Asn

Thr

Asn

Asn

670 675 680

TGG ACC AGC ACC Trp Thr Ser Thr 685

GGC Gly

AGC ACC AAC ATC AGC GGC AAC ACC CTG ACC CTG

2113

Ser

Thr 690

Asn

Ile

Ser Gly Asn 695

Thr

Leu

Thr

Leu

TAC

CAG

GGC

GGC

CGG

GGG

ATT

CTA

AAA

CAA

AAC

CTT

CAA

TTA

GAT

AGT

2161

Tyr

Gin

Gly

Gly Arg Gly

Ile

Leu

Lys

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Asp

Ser

700

705

710

715

TTT

TCA

ACT

TAT

AGA

GTG

TAT

TTT

TCT

GTG

TCC

GGA

GAT

GCT

AAT

GTA

2209

Phe

Ser

Thr

Tyr Arg

Val

Tyr

Phe

Ser

Val

Ser

Gly Asp

Ala

Asn

Val

720

725

730

AGG

ATT

AGA

AAT

TCT

AGG

GAA

GTG

TTA

TTT

GAA

AAA

AGA

TAT

ATG

AGC

2257

Arg

Ile

Arg

Asn

Ser

Arg

Glu

Val.

Leu

Phe

Glu

Lys

Arg

Tyr

Met

Ser

735

740

745

GGT

GCT

AAA

GAT

GTT

TCT

GAA

ATG

TTC

ACT

ACA

AAA

TTT

GAG

AAA

GAT

2305

Gly

Ala

Lys

Asp

Val

Ser

Glu

Met

Phe

Thr

Thr

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

750

755

760

AAC

TTT

TAT

ATA

GAG

CTT

TCT

CAA

GGG

AAT

AAT

TTA

TAT

GGT

GGT

CCT

2353

Asn

Phe

Tyr

Ile

Glu

Leu

Ser

Gin

Gly

Asn

Asn

Leu

Tyr

Gly Gly

Pro

765

770

775

ATT

GTA

CAT

TTT

TAC

GAT

GTC

TCT

ATT

AAG

NAA

GAT

CGG

GAT

CTA

ATA

2401

Ile

Val

His

Phe

Tyr

Asp

Val

Ser

Ile

Lys

Xaa

Asp

Arg

Asp

Leu

Ile

780

785

790

795

1 TTA

ACA

GTT

TTT

AAA

AGC

NAA

TTC

TTG

TAT

AAT

GTC

CTT

GAT

T

2444

Leu

Thr

Val

Phe

Lys

Ser

Xaa

Phe

Leu

Tyr

Asn

Val

Leu

A*sp

800 805

254

Informace o sekvenci SEQ ID č. 52:

(i) charakteristiky sekvence:

			(A) délka: 809	aminokyselin
			(B) typ: aminokyselinová
			(D) topologie:	lineární
	(ii)	typ molekuly: protein
	(xi)	znázornění sekvence SEQ ID č.	52 :
Met	Asn	Lys	Asn Asn Thr Lys Leu	Ser Thr Arg Ala	Leu	Pro	Ser	Phe
1			5	10			15
Ile	Asp	Tyr	Phe Asn Gly Ile Tyr	Gly Phe Ala Thr	Gly	Ile	Lys	Asp
			20	25		30
Ile	Met	Asn	Met Ile Phe Lys Thr	Asp Thr Gly Gly Asp	Leu	Thr	Leu
		35	40		45
Asp	Glu	Ile	Leu Lys Asn Gin Gin	Leu Leu Asn Asp	Ile	Ser	Gly	Lys
	50		55	60
Leu	Asp	Gly	Val Asn Gly Ser Leu	Asn A<p Leu Ile	Ala	Gin	Gly	Asn
65			70	75				80
Leu	Asn	Thr	Glu Leu Ser Lys Glu	Ile Leu Lys Ile	Ala	Asn	Glu	Gin
			85	90			95
Asn	Gin	Val	Leu Asn Asp Val Asn	Asn Lys Leu Asp	Ala	Ile	Asn	Thr
			100	105		110
Met	Leu	Arg	Val Tyr Leu Pro Lys	Ile Thr Ser Met	Leu	Ser	Asp	Val
		115	120		125
Met	Lys	Gin	Asn Tyr Ala Leu Ser	Leu Gin Ile Glu	Tyr	Leu	Ser	Lys
	130		135	140
Gin	Leu	Gin	Glu Ile Ser Asp Lys	Leu Asp Ile Ile	Asn	Val	Asn	Val
145			150	155				160
Leu	Ile	Asn	Ser Thr Leu Thr Glu	Ile Thr Pro Ala	Tyr	Gin	Arg	Ile
			165	170			175
Lys	Tyr	Val	Asn Glu Lys Phe Glu	Glu Leu Thr Phe	Ala	Thr	Glu	Thr
			180	185		190
Ser	Ser	Lys	Val Lys Lys Asp Gly	Ser Pro Ala Asp	Ile	Leu	Asp	Glu
		195	200		205
Leu	Thr	Glu	Leu Thr Glu Leu Ala	Lys Ser Val Thr	Lys	Asn	Asp '	Val
	210		215	220

255

Asp 225	Gly Phe	Glu Phe	Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val	Gly 240
230	235
Asn	Asn Leu	Phe Gly Arg	Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu	lle
		245		250 255
Thr	Lys Glu	Asn Val	Lys	Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val	Tyr
		260		265 270
Asn	Phe Leu	lle Val	Leu	Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe Leu	Thr
	275			280 285
Leu	Thr Thr	Cys Arg	Lys	Leu Leu Gly Leu Ala Asp lle Asp Tyr	Thr
	290			295 300
Ser	lle Met	Asn Glu	His	Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg	Val
305			310	315	320
Asn	lle Leu	Pro Thr	Leu	Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr	Ala
		325		330 335
Lys	Val Lys	Gly Ser	Asp	Glu Asp Ala Lys Met lle Val Glu Ala	Lys
		340		345 350
Pro	Gly His	Ala Leu	Lle	Gly Phe Glu lle Ser Asn Asp Ser lle	Thr
	355			360 365
Val	Leu Lys	Val Tyr	Glu	Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val	Asp
	370			375 380
Lys	Asp Ser	Leu Ser	Glu	Val lle Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu	Leu
385			390	395	400
Cys	Pro Asp	Gin Ser	Glu	Gin lle Tyr Tyr Thr Asn Asn lle Val	Phe
		405		410 415
Pro	Asn Glu	Tyr Val	lle	Thr Lys lle Asp Phe Thr Lys Lys Met	Lys
		420		425 430
Thr	Leu Arg	Tyr Glu	Val	Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr	Gly
	435			440 445
Glu	lle Asp	Leu Asn	Lys	Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu	Tyr
	450			455 460
Arg	Thr Leu	Ser Ala	Asn	Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly	Val
465			470	475	480
lle	Ser Glu	Thr Phe	Leu	Thr Pro lle Asn Gly Phe Gly Leu Gin	Ala
		485		490 495
Asp	Glu Asn	Ser Arg	Leu	lle Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu	Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lle 515 520 525

256

Val

Pro

Pro

Ser

Gly

Phe

Ile

Ser

Asn

Ile

Val

Glu

Asn

Gly

Ser Ile

530

535

540

Glu

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

Ala

Asn

Asn

Lys

Mn

Ala Tyr

545

550

555

560

Val

Asp

His

Thr

Gly

Gly

Val

Asn

Gly

Thr

Lys

Ala

Leu

Tyr

Val His

565

570

575

Lys

Asp

Gly Gly

Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys

Pro Lys

580

585

590

Thr

Glu

Tyr

Val

Ile

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Gly

Lys

Pro

Ser

Ile His

595

600

605

Leu

Lys

Asp

Glu

Asn

Thr

Gly

Tyr

Ile

His

Tyr

Glu

Asp

Thr

Asn Asn

610

615

620

Asn

Leu

Glu

Asp

Tyr

Gin

Thr

Ile

Asn

Lys

Arg

Phe

Thr

Thr

Gly Thr

625

630

635

640

Asp

Leu

Lys

Gly

Val

Tyr

Leu

Ile

Leu

Lys

Ser

Gin

Asn

Gly

Asd Glu

645

650

655

Ala

Trp

Gly

Asp

Asn

Phe

Ile

Ile

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Ser

Glu Lys

660

665

67C

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Leu

Ile

Asn

Thr

Asn

Asn

Trp

Thr

Ser

Thr Gly

675

680

685

Ser

Thr

Asn

Ile

Ser

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Gly Gly Arg

690

695

700

Gly

Ile

Leu

Lys

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe

Ser

Thr

Tyr Arg

705

710

715

720

Val

Tyr

Phe

Ser

Val

Ser

Gly Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Ile

Arg

Asn Ser

725

730

735

Arg

Glu

Val

Leu

Phe

Glu

Lys

Arg

Tyr

Met

Ser

Gly

Ala

Lys

Asp Val

740

745

750

Ser

Glu

Met

Phe

Thr

Thr

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Asn

Phe

Tyr

Ile Glu

755

760

765

Leu

Ser

Gin

Gly

Asn

Asn

Leu

Tyr

Gly Gly

Pro

Ile

Val

His

Phe Tyr

770

775

780

Asp

Val

Ser

Ile

Lys

Xaa

Asp

Arg

Asp

Leu

Ile

Leu

Thr

Val

Phe Lvs

785

790

795

300

Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu Asp

Claims (62)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Pro hmyz specifický sekretovaný protein, izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1.
2. 2. Pro hmyz specifický sekretovaný protein podle nároku 1 a jeho složky, kterýžto protein

   a) je izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a

   b) vykazuje specifické spektrum insekticidní účinnosti, které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
3. 3. Pro hmyz specifický sekretovaný protein podle nároku

   1 a jeho složky, kterýžto protein obsahuje v N-koncové sekvenci řadu kladně nabitých zbytků následovaných hydrofobní základní oblastí a není v průběhu exportu upravován na N-konci.
4. 4. Pro hmyz specifický protein podle nároku 1, kde uvedený Bacillus je vybrán ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL· B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.
5. 5. Pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 4, který má molekulovou hmotnost přibližně 30 kDa nebo větší, výhodně přibližně 60 až přibližně 100 kDa a ještě výhodněji přibližně 80 kDa.

   • · · · · · · · • · · · · · · · · · • · « · · · · ·· ·· ·» ·* • ·· • · • · • · · · · ·

   - 258
6. 6. Pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 5, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 29, SEQ ID č. 32 a SEQ ID č. 52, včetně jeho homologů.
7. 7. Pro hmyz specifický protein podle nároku 1, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 2, SEQ ID č. 20 a SEQ ID č. 21.
8. 8. Multimerní pesticidní protein, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický sekretovaný protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
9. 9. Multimerní pesticidní protein podle nároku 8, který obsahuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 nebo 6 a pomocný protein, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
10. 10. Fúzní protein, který obsahuje několik proteinových domén včetně alespoň jednoho sekretovaného pro hmyz specifického proteinu izolovatelného z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu nebo/a pomocného proteinu, vytvořený genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu nebo/a pomocného proteinu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.
11. 11. Fúzní protein podle nároku ribonukleasový S-protein, sekretovaný

    10, pro který obsahuje hmyz specifický • ·

    - 259 protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu a pomocný protein.
12. 12. Fúzní protein podle nároku 10, který má na svém N-konci buď uvedený pro hmyz specifický protein nebo uvedený pomocný protein.
13. 13. Fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 12, kde pro hmyz specifickým proteinem je protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 nebo 6.
14. 14. Multimerní protein podle libovolného z nároků 8 nebo 9 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 13, kde uvedený pomocný protein má molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa a lze jej získat z Bacillus cereus.
15. 15. Multimerní protein podle libovolného z nároků 8 nebo 9 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 12, kde jak uvedený pomocný protein tak uvedený pro hmyz specifický protein lze získat z kmene AB78.
16. 16. Insekticidní protein podle libovolného z nároků 1 až 7, multimerní protein podle libovolného z nároků 8 až 9 a 14 až 15 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 15, ve kterém byly sekvence představující sekreční signál

    a) odstraněny nebo inaktivovány,

    b) nahrazeny sekrečním signálem heterologního původu,

    c) nahrazeny sekvencí způsobující cílení, která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky.
17. 17. Fúzní protein podle nároku 15, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 23 a SEQ ID č. 50, včetně jeho homologů.

    • »·

    - 260 -
18. 18. Insekticidní sekretovaný protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, ve kterém byly sekvence představující sekreční signál

    a) odstraněny nebo inaktivovány,

    b) nahrazeny sekrečním signálem heterologního původu,

    c) nahrazeny sekvencí způsobující cílení, která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky.
19. 19. Insekticidní protein podle nároku 18, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 36, SEQ ID č. 40, SEQ ID č. 43 a SEQ ID č. 46.
20. 20. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 1 až 19.
21. 21. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, včetně jejích homologů.
22. 22. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26 nebo SEQ ID č. 27, včetně jejích homologů.
23. 23. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22 nebo SEQ ID č. 49, včetně jejích homologů.
24. 24. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 35, SEQ ID č. 39, SEQ ID č. 42 nebo SEQ ID č. 45, včetně jejích homologů.
25. 25. Molekula DNA podle libovolného z nároků 20 až 24, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která byla zcela nebo • ·· • · ·

    - 261 • · · · · · ···· ·· ·· ·· zčásti optimalizována pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
26. 26. Molekula DNA podle nároku 25, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 27, SEQ ID č. 35, SEQ ID č. 39, SEQ ID č. 42 nebo SEQ ID č. 45, včetně jejích homologů.
27. 27. Molekula DNA podle nároku 25, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 30 nebo SEQ ID č. 51, včetně jejích homologů.
28. 28. Molekula DNA, která hybridizuje s molekulou DNA podle libovolného z nároků 20 až 27 za mírně přísných podmínek, a která vykazuje pro hmyz specifickou účinnost.
29. 29. Pro hmyz specifický protein, který je kódován molekulou DNA podle nároku 28.
30. 30. Expresívní kazeta, která obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, operabilně spojenou s rostlinnými expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
31. 31. Expresívní kazeta, která obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, operabilně spojenou s rostlinnými expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
32. 32. Expresívní kazeta podle nároků 30 a 31, kde je uvedeným hostitelským organismem rostlina.

    • ·· • · · • · ·

    - 262
33. 33. Vektorová molekula obsahující expresivní kazetu podle nároků 30 až 32.
34. 34. Expresivní kazeta podle nároků 30 až 32 nebo vektorová molekula podle nároku 33, která tvoří součást genomu rostliny.
35. 35. Hostitelský organismus, který obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
36. 36. Hostitelský organismus, který obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
37. 37. Hostitelský organismus podle nároku 36, který je vybrán ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy.
38. 38. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje stabilně začleněnou do jejího genomu molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
39. 39. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje stabilně začleněnou do jejího genomu molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní • ·· • · · • · • · ··· ·· · * ··· · · « · · · · · · · · · ···· ·· #· ** ·· *·

    - 263 kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
40. 40. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29.
41. 41. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5, 6, 9 a 13.
42. 42. Transgenická rostlina podle nároku 40 nebo 41, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, výhodně δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis.
43. 43. Rostlinný propagační materiál rostliny podle libovolného z nároků 37 až 42, který je ošetřen obalem chránícím semena.
44. 44. Transgenická rostlina podle libovolného z nároků 37 až 42, kterou je dvouděložná nebo jednoděložná rostlina.
45. 45. Transgenická rostlina podle nároku 44, kterou je rostlina vybraná ze skupiny zahrnující rostliny rodů Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
46. 46. Hostitelský organismus podle nároků 35 až 37, kterým je mikroorganismus, který se množí na rostlinách, jako je bakterie kolonizující kořeny.
47. 47. Kmen rodu Bacillus, který produkuje během vegetativního růstu pesticidní protein, kterým je Bacillus vybraný ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL

    B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.

    - 264
48. 48. Insekticidní prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje kmen rodu Bacillus podle nároku 47 nebo hostitelský organismus podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
49. 49. Insekticidní prostředek, vyznačuj ící se t £ m, že obsahuje izolovanou molekulu proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, samotnou nebo v kombinaci s kmenem rodu Bacillus podle nároku 47 nebo hostitelským organismem podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, v insekticidnš účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
50. 50. Způsob identifikace účinnosti pro hmyz specifického proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29 na hmyz, vyznačující se t ím , že zahrnuje (a) pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, (b) získání supernatantu z uvedené kultury, (c) poskytnutí potravy s uvedeným supernatantem larvám hmyzu, a (d) stanovení mortality.
51. 51. Způsob izolace pro hmyz specifického proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, vyznačuj ící se t í m , že zahrnuje (a) pěstování kmene rodu Bacillus exprimujícího uvedený pro hmyz specifický protein v kultuře, (b) získání supernatantu z uvedené kultury, a (c) izolaci uvedeného pro hmyz specifického proteinu z uvedeného supernatantu.
52. 52. Způsob izolace molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein vykazující insekticidní účinnost proteinů podle libovolného z nároků Iažl9a29, vyznačující se tím,

    - 265 * ·· • ·· že zahrnuje (a) získáni molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s DNA získanou z druhu rodu Bacillus, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
53. 53. Způsob zvýšení rozsahu cílového hmyzu u hostitelského organismu, vyznačující se tím, že se k němu použije první pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29 v kombinaci s alespoň jedním druhým insekticidním proteinem, který se liší od uvedeného prvního pro hmyz specifického proteinu.
54. 54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se t i m , že uvedený druhý insekticidní protein je vybrán ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacilus thuringiensis, inhibitory proteas, lektiny, α-amylasy a peroxidasy.
55. 55. Způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, vyznačující se tím, že se na rostlinu nebo na plochu, na které tato rostlina roste, aplikuje, nebo že se v této rostlině exprimuje, insekticidní protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29.
56. 56. Způsob vytvoření hostitelského organismu podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, vyznačující se tím, že se uvedený hostitelský organismus transformuje molekulou DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresívní kazetou podle libovolného z nároků 30 až 32 a 34 nebo vektorovou molekulou podle libovolného z nároků 33 až 35.
57. 57. Způsob přípravy insekticidního prostředku podle libovolného z nároků 48 nebo 49, vyznačuj ící • ·· t ·9 · · ·· · ♦ · · · · · · · « ··· · · ··» · · · · · · · ·»···« «· ·* ·· ··

    - 266 tím, že se smíchá kmen rodu Bacillus podle nároku 47 nebo/a hostitelský organismus podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46 nebo/a izolovaná molekula proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, v insekticidně účinném množství, s vhodným nosičem.
58. 58. Způsob vytvoření transgenického potomstva transgenické rodičovské rostliny, které obsahuje, stabilně začleněnou do rostlinného genomu, molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, vyznačující se tím, že se uvedená rodičovská rostlina transformuje expresivní kazetou podle libovolného z nároků 30 až 32 a 34 nebo vektorovou molekulou podle libovolného z nároků 33 až 35 a pesticidní znak se přenese na potomstvo uvedené transgenické rodičovské rostliny za použití známých postupů množení rostlin.
59. 59. Oligonukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s nukleotidovou sekvencí kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, vyznačující se tím , že obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů.
60. 60. Použití oligonukleotidové sondy pro screening libovolného kmene rodu Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen pro hmyz specifický protein nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje tento gen.
61. 61. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 1 až 6, kterou * ·· • ··

    267 lze získat způsobem který zahrnuje (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou podle nároku 60, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
62. 62. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 a 6, kterou lze získat způsobem který zahrnuje (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou podle nároku 60, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.