CZ89898A3

CZ89898A3 - Prostředek na bázi 1,2,4-benzotriazinu

Info

Publication number: CZ89898A3
Application number: CZ98898A
Authority: CZ
Inventors: Stephen Brown; Edward Baker
Original assignee: Sanofi-Synthelabo Inc.
Priority date: 1995-09-25
Filing date: 1996-08-21
Publication date: 1998-11-11
Also published as: HUP9802536A2; PT866709E; CN100366253C; KR19990063735A; HUP9802536A3; EP0866709A4; AU718268B2; CZ292102B6; CA2232989C; MX9802314A; NO981324L; EP0866709B1; CN1202827A; DE69636837T2; CA2232989A1; AU6854896A; KR100514009B1; RU2166946C2; WO1997011699A1; EP0866709A1

Description

Prostředek na bázi 1,2,4 - benzotriazinu

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti léčení rakovinných nádorů. Zejména se tento vynález vztahuje k léčení rakovinných nádorů pomocí oxidů

1,2,4-benzotriazinu vázaných ve vodním tlumícím přenašeči.

Dosavadní stav techniky

Oxidy 1,2,4-benzotriazinu jsou známé sloučeniny. Patent USA č. 3,980,779 popisuje sloučeniny typu 3-amino-l,2,4-benzotriazin-l,4-

dioxid, které mají vzorec	?
		I

		a
ve kterém		δ

jedním z R nebo R¹ je vodík, halogen, nižší alkyl, halo (nižší alkyl), nižší alkoxy, karbomoyl, sulfonamido, karboxy nebo karbo (nižší alkoxy) a druhým z R nebo R¹ je halogeno, nižší alkyl, halo (nižší alkyl), nižší alkoxy, karbomoyl, sulfonamido, karboxy nebo karbo (nižší alkoxy), jako antimikrobiální sloučeniny používané na podporu výnosů při pěstování dobytka.

Patent USA č. 5,175,287, vydaný dne 29. prosince 1992, popisuje používání oxidů 1,2,4-benzotriazinu v kombinaci s ozařováním k léčení nádorů. Oxidy 1,2,4-benzotriazinu zvyšují citlivost nádorových buněk na záření a způsobují, že tyto buňky jsou lépe přístupné pro tuto metodu léčby.

Holden a kol. (1992) v díle „Zvýšení aktivity alkylačního činidla u myšího fíbrosarkomu FSalIC prostřednictvím SR-4233“ JNCI 84: 187-193 popisuje používání SR-4233, zejména 3-amino- l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu, který je také známý a dále v tomto textu někdy uváděný jako tirapazamin, v kombinaci s protinádorovým alkylačním činidlem. Každé ze čtyř následujících protinádorových alkylačních činidel, cisplatin, cyklofosfamid, karmustin a melfalan, bylo testováno tak, aby se prozkoumala schopnost tirapazaminu překonat odpor hypoxických nádorových buněk vůči protinádorovým alkylačním činidlům. Tirapazamin byl testován sám a v kombinaci s různým množstvím každého z uvedených protinádorovým alkylačních činidel. Když byl SR-4233 podáván právě před léčbou jednorázovou dávkou cyklofosfamidu, karmustinu nebo melfalanu, bylo zjištěno nápadné zvýšení dávky vedoucí k vzájemně působícím cytotoxickým účinkům na nádorové buňky.

Mezinárodní přihláška č. PCT/US89/01037 popisuje oxidy

1.2.4- benzotriazinu jako radiosenzibilizátory a selektivní cytotoxická činidla. Další související patenty jsou tyto: patenty USA č. 3,868,372 a 4,001, 410, které popisují přípravu oxidů 1,2,4-benzotriazinu; a patenty USA č.: 3,991,189 a 3,957,799, které popisuji deriváty oxidů

1.2.4- benzotriazinu.

Bylo zjištěno že členové řady oxidů 1,2,4-benzotriazinu jsou účinné při léčbě rakovinných nádorů, pokud jsou používány v kombinaci s ozařováním a chemoterapií.

Ozařování a chemoterapie, spolu s chirurgií, zůstávají třemi základními způsoby léčby rakoviny. Léčba ozařováním a chemoterapie fungují jako alternativy pro chirurgické zásahy při primárním zdolávání množství novotvarů, kde chirurgie je omezena anatomickými činiteli. Současné znalosti dokazují, že pokud se zlepší účinnost ozařování a chemoterapie, zvýší se také počet vyléčených pacientů a pacientům s rakovinou bude umožněna vyšší kvalita života.

Jedním ze způsobů jak zvýšit účinnost ozařování a chemoterapie je využití hypoxie, která existuje v nádorech - jeden z mála využitelných rozdílů mezi normální a nádorovou tkání. Abnormální vývoj krevních cév je charakteristickým znakem velkého množství pevných nádorů. Tento abnormální vlásečnicový systém má často za následek vznik oblastí s nedostatečným přívodem kyslíku, ať • *»♦ r?

♦ * ft 9 · · · · 9r.

• · · ···· ···« • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9« » · ·· · · · » i* í“ * 99 9 9 9 9 9 9 9 99 9 již dočasně nebo trvale. Obecně hypoxie zvyšuje odolnost buňky, normální nebo rakovinné, vůči léčbě. Metoda, která zvyšuje ničení hypoxických nádorových buněk (nebo omezuje poškození normálních tkání při ozařování) by zlepšila léčebný ukazatel ozařování a chemoterapie.

Sloučeniny benzotriazinu byly vyvíjeny proto, aby se využilo této relativní hypoxie u nádoru. Tirapazamin, v současnosti nejslibnější člen benzotriazinové řady, je za podmínek hypoxie bioredukován na aktivní meziprodukt. Tento aktivní meziprodukt může vyvolat poškození DNA, což zvýší účinky léčby ozařováním nebo chemoterapie a sám o sobě je cytotoxický. Protože sousední normální tkáně nejsou hypoxické, umožní tato bioredukce selektivní cytotoxické působení na hypoxické nádorové buňky.

Výzkum prokázal značnou převahu benzotriazinů nad nitroímidazolovými radiačními senzibilizátory a dalšími bioreduktivními činidly in vitro, jak uvádí Tabulka I.

TABULKA I

Ukazatele hypoxické cytotoxicity pro různé bioreduktivní léky in vitro

Ukazatel hypoxické cytotoxicity³

Bioreduktivní činidlo (a typ)	Hlodavci	Lidé
Tirapazamin (Benzotriazin di-N-oxide)	75-200	15-100
RSU-1069 (Nitroirnidazol/Aziridin)	75-100	10-20
Misonidazol (Nitroimidazol)	10-15	15
Porfiromycin (Chinon)	5-10	~ 10
Nitrakrin (Nitroakridin)	7
Mitomycin C (Chinon)	1-5	1-2

³ Ukazatel hypoxické cytotoxicity = pro ekvivalentní úrovně ničení buněk představuje poměr mezi koncentraci léku vyžadovanou za aerobních podmínek versus za podmínek hypoxie

Nicméně tirapazamin má své nevýhody v nedostatečné rozpustnosti ve farmaceutických přenašečích vhodných pro parenterální podávání, a stejně tak je v těchto přenašečích nestálý. Bylo zjištěno, že rozpustnost tirapazaminu ve vodě je asi 0,81mg/ml, což by vyžadovalo značný objem roztoku, přibližně 1 litr, podaný pacientovi pro zajištění správné dávky. Pokusy, jak zvýšit rozpustnost pomocí povrchově aktivních látek jako je Tween 80 a polymerů jako jsou Pluronic F68, Povidon a Albumin byly neúspěšné při minimálním zvýšením rozpustnosti. Zvýšení rozpustnosti pomocí spolurozpouštědel bylo úspěšnější, nicméně poměr spolurozpouštědel nezbytný pro rozpuštění předpokládané minimálně snášené dávky tirapazaminu by znamenalo přidání značného množství spolurozpouštědel, například až 120 ml propylenglykolu v 50% vodním roztoku propylenglykolu. Tento značný objem spolurozpouštědla je pro formu injekcí nepřijatelný a rizikem jsou zde nežádoucí klinické účinky na pacienta.

Tirapazamin také postrádá stálost pokud jde o skladovatelnost: úplný rozklad se objeví po refluxi v 0,1 N hydroxidu sodného za méně než čtyři hodiny.

Vynález si klade za svůj hlavní cíl zajistit takové vodní infúzní / injektovatelné složení, které bude obsahovat dostatečné množství protirakovinného nádorového činidla a bude stálé pokud jde o skladovatelnost. Během našich rozsáhlých klinických zkoušek tirapazaminu bylo zjištěno, že bez dostatečné rozpustnosti a stálosti by tento velmi slibný lék nemohl pomoci mnohým pacientům, kteří trpí rakovinným nádorem.

• e

Podstata vynálezu

Vynález představuje vodní parenterální prostředek pro léčení rakovinných nádorů, který obsahuje:

účinné množství sloučeniny pro léčbu rakovinných nádorů se vzorcem (I)

kde X je H; hydrokarbyl (1-4C); hydrokarbyl (1-4C) substituovaný OH, NH₂, NHR nebo NRR; halogen; OH; alkoxy (1-4C); NH₂; NHR nebo NRR; kde každý R je nezávisle vybrán z nižšího alkylu (1-4C) a nižšího acylu (1-4C) a nižší alkyl (1-4C) a nižší acyl (1-4C) jsou substituovány OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními a dialkyl (1-4C) terciárními amino skupinami, alkoxy (1-4C) nebo halogenem; a když X je NRR, jsou oba R spojeny dohromady přímo nebo prostřednictvím kyslíkové vazby a vytváří morfblinový, pyrrolidinový nebo piperidinový uzavřený řetězec;

nje 0 nebo 1; a

Y¹ a Y² jsou nezávisle bud’ H; nitro; halogen; hydrokarbyl (1-14C) včetně cyklického a nenasyceného hydrokarbylu, volitelně substituován 1 nebo 2 substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, hydroxy, epoxy, alkoxy (1-4C), alkylthio (1-4C), primární amino (NH2), alkyl (1-4C) sekundární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, kde dva alkyly jsou spojeny dohromady a vytváří morfolino, pyrrolidino nebo piperidino, acyloxy (1-4C), acylamido (1-4C) a jejich thio analogy, acetylaminoalkyl (1-4C), karboxy, alkoxykarbonyl (1-4C), karbamyl, alkylkarbamyl (1-4C), alkylsulfonyl (1-4C) nebo alkylfosfonyl (1-4C), kde hydrokarbyl může být volitelně přerušen jedinou etherovou vazbou (-O-); nebo kde Y¹ a Y² jsou nezávisle buď morfolino, pyrrolidino, piperidino, NH2, NHR’, NR’R’O(CO)R’, NH(CO)R’, O(SO)R’ nebo O(POR’)R’, kde R’ je hydrokarbyl (1-4C). který může být substituován OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními aminovými, dialkyl • * ···· ·· · · • · · · · · «··· · · · · ♦ ·· · ♦ · · · • · · · · « ♦ · · · · ·· ·· • · (1-4C) terciárními aminovými, morfolino, pyrrolidino, piperidino, alkoxy (1-4C) nebo halogenovými substituenty, nebo farmakologicky přijatelnou solí uvedené sloučeniny v parenterálně přijatelném tlumícím roztoku s přibližnou koncentrací 0,001M až O,1M.

Pokud jde o podrobné složení tohoto parenterálního přípravku pro léčení rakovinných nádorů podle tohoto vynálezu, tento obsahuje:

přibližně 0,500 až 0,810 g sloučeniny podle vzorce (I); přibližně 0,100 až 9,000 g chloridu sodného; .

přibližně 0,1 až 10,00 g kyseliny citrónové; přibližně 0,02 až 3,00 g hydroxidu sodného; a qs do pH 3,0 - 5,0 ve vodě do 1000 ml.

Preferovanou sloučeninou působící proti rakovinným nádorům u tohoto vynálezu je tirapazamin. l,2,4-benzotriazin-3-amin 1,4dioxid, který má strukturální vzorec

O

Os molekulovou váhou 178,16 a bodem tání při rozkladu 220°C.

U většiny preferovaných nitrožilních přípravků každý milimetr roztoku obsahuje přibližně 0,7 až 0,81 mg/ml tirapazaminu v isotonickém citrátovém tlumícím roztoku s pH přibližně od 3,7 do 4,3.

Vynález je také zaměřen na metodu léčby rakovinného nádoru u pacienta, který potřebuje tuto léčbu spočívající v podávání účinného množství přípravku léčícího rakovinný nádor danému pacientovi.

Průmyslová využitelnost

Protinádorová činidla

Vynález představuje přípravek a metodu pro léčbu rakovinných nádorů u savců, včetně lidských rakovinných nádorů, a to zejména pro léčbu pevných nádorů. Z tohoto pohledu na vynález je účinné množství sloučeniny vzorce I, jak je definována v tomto dokumentu, obsažené v citrátovém tlumícím roztoku, podáváno savci, který má rakovinný nádor a potřebuje toto léčení, a to přibližně půlhodiny až 24 hodin před podáním účinného množství chemoterapeutického činidla, na které je nádor vnímavý. Vzorec I a testování sloučeniny je popsáno v Přihlášce USA sériové číslo 125,609 podané dne 22 září 1993, jejíž popis je zde ve své celistvosti zahrnutý prostřednictvím referencí.

Jak bude jasné z popisu, který následuje, byly při přípravě složení tohoto vynálezu prováděny rozsáhlé studie, aby byla zajištěna dostatečná rozpustnost protinádorové sloučeniny a získán takový přípravek, který je stálý při skladování.

Vynález bude popsán v konkrétním, vztahu ke složení tirapazaminu, nicméně rozumí se, že ostatní uváděné sloučeniny vzorce (I) budou zahrnuty v patentových nárocích.

Schopnost rozpustnosti u tirapazaminu

Rozpustnost tirapazaminu ve vodě a různých přenašečích je uvedena v Tabulce II.

TABULKA II

Rozpustnost tirapazaminu ve vodném prostředí

Rozpouštědlo

Teplota v °C mg/ml

Voda pro injekce

1,43

0,85

Běžný fyziologický roztok

0,85

Citrátový tlumící roztok 0,05M pH 4 (izotonický)	15	0,81
Laktátový tlumící roztok 0,lM pH 4 (izotonický)	15	0,90
Tween 80 0,2% w/v	15	0,9
Tween 80 20% w/v	15	1,02
Pluronic F68 20% w/v	15	1,08

e λ · · t * ♦ » ♦ · · ·

Povidon

(Kollidon 12PF) 10% w/v	15	0,95
Albumin 4,5% w/v	20	1,33
Albumin 20% w/v	20	1,71
Glycerol 50% v/v ve vodě	15	2,93
Glycerol	15	4,59
Propylenglykol 50% v/v ve vodě	15	2,58
Propylenglykol	15	3,27
PEG 400 50% v/v ve vodě	15	1,60
PEG 400	15	5,12
Dimethylformamid 25% v/v ve vodě	15	1,83
1% benzylalkohol: 10% etanol: 89% voda, v/v	15	1,23
Ethanol 10% v/v ve vodě	15	0,93
Ethanol 50% v/v ve vodě	15	2,32
Ethanol 65% v/v ve vodě	15	2,84
Ethanol 85% v/v ve vodě	15	1,71
Ethanol	15	0,47

Omezená rozpustnost 0,81 mg/ml by si vyžádala přidání až jednoho litru tekutiny, proto je tedy nutno zvýšit rozpustnost tak, aby bylo možno minimalizovat objem tekutiny. Pokusy zvýšit rozpustnost pomocí povrchově aktivních látek (Tween 80) a polymerů (Pluronic F68, Povidon, Albumin) byly neúspěšné při minimálním zvýšení rozpustnosti.

Zvýšení rozpustnosti bylo dosaženo pomocí spolurozpouštědel, nicméně podíl spolurozpouštědel nutný pro rozpuštění předpokládané maximálně tolerované dávky tirapazaminu (~ 700 mg) by znamenal přidání značného množství těchto spolurozpouštědel (například až do 120 ml propylenglykolu (PG) u 50% v/v PG/vodní roztok).

Fyzikálně chemické vlastnosti tirapazaminu ukazují, že molekula není charakterem ani vysoce polární, ani vysoce lipofílní. To ukazuje (i) koeficient rozdělení (oktanol/voda) 0,15 (logP -0,82) a (ii) zjištěný rozklad při tání při 200°C, což naznačuje, že krystalová struktura tirapazaminu je silně vázána mezimolekulámími silami. Rovinná povaha molekuly by usnadnila uspořádané seskupení u krystalu s mezimolekulovou přitažlivostí (interakce přenosu náboje) mezi každou rovinou přes dusík a kyslík N-oxidových funkcí. Hydratovaná forma tirapazaminu může existovat tam, kde mají molekuly vody vodíkovou vazbu na kyslíkové sloučeniny.

Aby bylo možno předpovídat rozpustnost sloučenin ve směsích vody s rozpouštědlem, byly prováděny nej různější pokusy pro klasifikaci organických rozpouštědel za pomocí takových parametrů, jako je dielektrická konstanta, parametr rozpustnosti, povrchové napětí kapaliny, povrchové napětí mezi kapalinami, hustoty donora a akceptora vodíkové vazby, a rozdělovači koeficient oktanol/voda. Hodnoty u vybraných rozpouštědel použitých při studiích rozpustnosti tirapazaminu jsou uvedeny v Tabulce III. Tyto parametry byly použity matematicky pro předpovědi rozpustnosti nepolárních rozpuštěných látek tak, že tyto parametry byly dány do korelace s sklonem diagramů rozpustnosti sestrojených na základě pokusných dat. Ty parametry, které odrážejí soudržné vlastnosti rozpouštědel, jako jsou parametry rozpustnosti a povrchové napětí mezi kapalinami, vysoce korelují se sklonem, stejně jako schopnost čistého spolurozpouštědla vytvářet vodíkové vazby vyjádřená jako hustota skupin dávajících nebo přijímajících proton.

TABULKA III

Ukazatele polarity rozpouštědel (Rubino, J.T. a Yalkowski, S.H., Spolurozpustnost a polarita spolurozpouštědel, Pharmaceutical Research, 4 (1987) 220-230) voda DMSO DMF DMA GLYC PG

PEG400

dielektrická konstanta	78,5	46,7	36,7	37,8	42,5	32,0	13,6
parametry rozpustnosti	23,4	12,0	12,1	10,8	17,7	12,6	11,3
povrchové napětí mezi kapalinami dyn/cm	45,6	0,9	6,9	4,6	32,7	12,4	11,7
povrchové napětí kapaliny dyn/cm	72,7	44,0	36,8	35,7	60,6	37,1	46,0
logP	-4,0	-1,4	-0,85	-0,66	-2,0	-1,0	—
hustota donora vodíkové vazby	111,0	0,0	0,0	0,0	41,1	27,4	5,6
hustota akceptora vodíkové vazby	11,0	28,2	38,7	32,3	82,2	54,4	50,8

kde:

DMSO = dimethylsulfoxid DMF = dimethylformamid

DMA= dimethylacetamid

GLYC= glycerol

PG = propylenglykol

PEG400 = polyethylenglykol 400

Při vysokoobjemových frakcích rozrušují aprotická rozpouštědla, např. dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylformamid (DMF) a dimethylacetamid (DMA) vodní strukturu prostřednictvím dipolámího a hydrofóbního působení. Amfiprotická rozpouštědla, např. glycerol, PEG 400 a propylenglykol (PG) se mohou jak sami spojovat, tak vytvářet vodíkový můstek s vodou, a proto nejsou tato rozpouštědla ideální pro rozpuštěné látky, které se nemohou účastnit vodíkových vazeb. Koeficient rozdělení rozpuštěné látky je ukazatelem toho, zda budou spolurozpouštědla účinná. Pro úspěšné stanovení rozpustnosti v různých systémech rozpouštědel byla použita následující rovnice:

logC_s = logCo = f(logR + 0,891ogP + 0,03) kde C_s a Co jsou rozpustnosti ve směsi rozpouštědel, resp. ve vodě, f je frakce spolurozpouštědla, R je relativní síla rozpouštědla (běžné hodnoty jsou pro DMF = 4, glycerol = 0,5) a P je koeficient rozdělení. Protože P směřuje ke sjednocení (logP => 0), pak není možné žádné zvýšení rozpustnosti vzhledem k tomu, že logC_s = logC_o

Protože logP pro tirapazamin je -0,8, určovala by tato rovnice, že spolurozpouštědla pravděpodobně nebudou mít významný vliv na rozpustnost ve vodě. Pokusy prováděné s těmito spolurozpouštědly vedly ke zjištění, že rozpustnost tirapazaminu se po použití těchto spolurozpouštědel významně nezvýšila.

Stálost

Byly prováděny studie namáhání prostřednictvím vícenásobných cyklů v autoklávu, a to po 21 minutách při 121°C. Tyto studie prokázaly, že tirapazamin byl stálejší v kyselých roztocích běžného fyziologického roztoku nebo v roztocích ztlumených na pH 4 s použitím 0,05M citrátového nebo 0,lM laktátového tlumícího roztoku. Tirapazamin byl nestálý v přítomnosti fosfátového tlumícího roztoku při pH 5,9 a v citrátovém tlumícím roztoku při pH 6. Posun v pH složení běžného fyziologického roztoku se objevil po osmi cyklech v autoklávu v rozsahu od 4,5 do 4,9, proto přípravky vyžadovaly určitý stupeň ztlumení.

Přípravky byly také namáhány skladováním při zvýšené teplotě 50°C a 70°C po jediném cyklu v autoklávu v trvání 21 minut při 121 °C. Bylo zjištěno, že tirapazamin je nestálý v přítomnosti laktátového tlumícího roztoku po skladování při 70°C. Tato nestálost nebyla zřejmá z vícenásobného namáhání vautoklávu. Nej stálejší složení bylo zjištěno jako 0,05M citrát s pH 4.

Ve složení tirapazaminu se tedy postupovalo dále s použitím citrátového tlumícího roztoku. Rozpustnost tirapazaminu při 15°C vyžadovala snížení koncentrace z 1 na 0,5 mg/ml. Další namáhání v citrátovém tlumícím roztoku při pH 3,5, 4,0 a 4,5 bylo provedeno proto, aby se zjistily pravděpodobné limity pH. Na základě údajů zjištěných v této studii byly limity stanoveny při pH 4,0 ± 0,3.

Na základě generovaných údajů o stálosti bylo zjištěno jako nejstálejší složení tirapazaminu v citrátovém tlumícím roztoku při pH 4. Rozpustnost tirapazaminu v citrátovém tlumícím roztoku byla 0,81 mg/ml při 15°C. Proto tedy byla pro další vývoj přípravku, kvůli omezení objemu přidávané tekutiny, použita maximální koncentrace 0,7 mg/ml.

Účinek koncentrace tlumícího roztoku (0,05 nebo 0,005M) na stálost byl vyhodnocen při namáhání 2 x 10 L stabilizačních dávek tirapazaminu (0,7 mg/ml) v citrátovém tlumícím roztoku při pH 4,0.

Tirapazamin byl stálý po 2 měsících jak v citrátovém tlumícím roztoku 0,005M, tak i 0,05M při 50°C. Při 70°C zde byly známky nestálosti při složení citrátového roztoku 0,05M, a proto tedy byla pro vývoj klinického složení zvolena nižší koncentrace citrátu (0,005M). Klinické složení používané při chemických studiích, o kterých se pojednává dále, bylo následující:

Tirapazamin 0,700g

Chlorid sodný 8,700g

Kyselina citrónová 0,9605g

Hydroxid sodný 0,2500g qs do pH 4,0 ve vodě do 1000 ml.

Tirapazamin je ukládán do 20 ml ampulek z čirého skla, které obsahují 0,7 mg/ml (14 mg) tirapazaminu v izotonickém citrátovém • · · · · · • * tlumícím roztoku. Ampulky jsou uskladněny při 15°C až 30°C v balení odolném proti světlu.

Dávkování

Složení tohoto vynálezu bylo podrobeno studii akutní snášenlivosti u myší, studii jednorázových a násobných dávek u krys a psů a studii myelosuprese in vitro.

Pokud jde o studii akutní snášenlivosti u myší, byly LDio a LD50 pro tirapazamin zjištěny jako 98, resp. 101 mg/kg.

Studie jednorázových a čtrnáctidenních a dvouměsíčních násobných dávek byly prováděny u krys a psů. Klinické známky a symptomy pozorované u obou druhů a pro každý režim zahrnovaly slinění, pokles v měření bílých krvinek (včetně počtu lymfocytů u psů) a pokles v měření červených krvinek.

Farmakologie

Účinek tirapazaminu na množství aerobních a hypoxických buněk byl studován na kultuře, aby mohla být změřena selektivita tirapazaminové cytotoxicity. Tirapazamin (20 μΜ) byl silně účinný a selektivní ničitel hypoxických buněk in vitro, s ukazatelem hypoxické cytotoxicity 150, 119 a 52 u křečka, resp. myši a u lidských buněčných řad (o 1-2 řády velikosti vyšší než u radiačních senzibilizátorů jakými jsou nitroimidazoly, mitomycin C a porfíromycin). Tato cytotoxicita byla také zjištěna v rozsahu kyslíkových potenciálů (1 % - 20 % O?; primárně při 1 % - 4 % O2).

Tirapazamin in vivo byl stejně účinný u modelů myšího tumoru jako jednorázová dávka 0,30 mmol/kg (160mg/m²) nebo jako vícenásobné dávky 0,08 mmol/kg (43 mg/m²), pokud byl používán s přerušovaným ozařováním (2,5 Gy x 8). Tirapazamin byl také účinný jako jednorázová dávka 0,30 mmol/kg (160mg/m²) s jednorázovou velkou dávkou ozáření (20 Gy). Tirapazamin se ukázal jako nejúčinnější ve vícenásobných dávkách 0,08 mmol/kg (43 mg/m²) • · · ♦ podaných před každou frakcí záření (2,5 Gy x 8), což mělo za následek několik vyléčených tumorů SCCVII u myší; a tirapazamin se ukázal jako nejméně účinný, s výsledkem ničení buněk běžně menším než je 1 log, pokud byl podáván bez ozařování. Pokud byl použitý s přerušovaným ozařováním, rovnal se účinek tirapazaminu účinku předpověděnému, jestliže tirapazamin působil na jinou populaci buněk (hypoxické buňky) než na kterou bylo použito ozařování (aerobní buňky).

Mechanismus působení tirapazaminu byl podrobně studován a je těsně spjatý s metabolismem léku. Ilustrace níže zobrazuje navrhovaný mechanismus fungování tirapazaminové tvorby volného radikálu během redukce na mono-N-oxid, což způsobuje jedno a dvouřetězcové zlomy v DNA. Za podmínek hypoxie je tirapazamin metabolizován na 2-elektronový redukční produkt WIN 64102 (monoN-oxid; SR 4317) a potom na 4-elektronový redukční produkt WIN 60109 (nula-N-oxid; SR 4330). Několik studií zkoumající opravu poškození DNA po léčení tirapazaminem ukázalo, že útlum opravy DNA je v poměru k dávce a je podobný tomu, jenž produkují rentgenové paprsky.

in vitro, tak in vivo, aby bylo možno určit a kvantifikovat jeho účinnost a objasnit mechanismus fungování.

In vitro

Účinky tirapazaminu na množství aerobních a hypoxických buněk byly studovány na kultuře, aby mohla být změřena selektivita tirapazaminové cytotoxicity. Byly použity řady vaječníkových buněk čínského křečka (CHO-HA-1), řady myších (C3H 10T1/2, RIF-1 a SCCVII) a lidských buněk (HCT-8, AG 1522, A549 a HT 1080). Tirapazamin (20 μΜ) byl silně účinným a selektivním ničitelem hypoxických buněk in vitro, jak je vidět v Tabulce 4.

TABULKA 4

Cytotoxicita tirapazaminu in vitro na osm buněčných řad inkubovaných za aerobních nebo hypoxických podmínek

Buněčná řada	Index citlivosti¹⁵	IC,o^c(μΜ)	Ukazatel hypoxické cytotoxicity³
Druh	Název			Buněčná řada	Průměr u druhu
Křeček	CHO-HA-l (normální¹)	48	5	100-200	150
Myš	RIF-1 (nádorová)	30	3	80-100
	SCCVII (nádorová)	39	4	160-200	119
	C3H 10T1/2 (normální)	118	12	75-100
Lidský	HCT-8 (nádorová)	94	10	15-40
	A549 (nádorová)	280	15	25-50
	AG 1522 (normální)	190	13	50	52
	HT 1080 (nádorová)		22	100

a Ukazatel hypoxické cytotoxicity = koncentrace tirapazaminu ve vzduchu/koncentrace tirapazaminu v dusíku pro získání přibližně stejného stupně přežití b Index citlivosti = doba (v minutách) pro dosaženi 10' (1%) přežívající frakce při 20 μΜ za podmínek hypoxie c IC₅₀ = koncentrace požadovaná pro potlačení růstu buněk o 50 % při 1-hodinové inkubaci za podmínek hypoxie d Normální = netvořící, nepůsobící nádor ln vivo

Pokud je tirapazamin podáván myším sám in vivo v jednorázových dávkách, očekávalo by se bude vyprodukováno relativně malé ničení buněk odpovídající procentu nádorových buněk, které jsou hypoxické. Množství pokusů ukázalo, že je tomu tak a ničení buněk bylo běžně menší než jeden log (přežívající frakce > 1 · 10’’). Například maximální ničení buněk zjištěné po jednorázové dávce bylo u nádoru SCCVII (přežívající frakce = 5 · 10'¹) a u fibrosarkomu FSalIC bylo vyprodukováno pouze malé pozdržení růstu nádoru v délce 3 dnů.

• ·

U vícenásobných dávek tirapazaminu podávaných bez ozařování bychom mohli očekávat lehce vyšší ničení buněk než u jednorázových dávek, dokonce při nižších dávkách tirapazaminu. Nicméně nejnižší přežívající frakce pozorovaná u čtyř rozdílných myších nádorů byla 5-10’ a pokles na 5 · 10' u pátého myšího nádoru (nádor RIF-1).

Tirapazamin a ozařování

U množství modelových systémů popsaných níže tirapazamin zvyšuje protinádorovou aktivitu ozařování, která je hodnocena na základě ničení buněk nebo zpoždění růstu nádoru. Testované nádory zahrnovaly FSalIC, SCCVII, RIF-1, EMT6 a KHT. Tirapazamin zvyšuje ničení buněk, pokud je podáván v programu jednorázových nebo vícenásobných dávek a pokud je kombinován buď s jednorázovým nebo přerušovaným ozařováním.

V jedné studii protinádorové působení tirapazaminu spolu s ozařováním převyšuje součtový účinek těchto dvou léčení. Nárůst aktivity pomocí tirapazaminu se objeví, když je lék podáván 2,5 až 0,5 hodiny před ozařováním nebo až do 6 hodin poté. Kromě aktivity proti hypoxickým buňkám tirapazamin radiosenzibiluje aerobní buňky in vitro, pokud jsou buňky vystaveny léku za podmínek hypoxie buď před nebo po ozařování.

V jedné studii léčení tirapazaminem zvýšilo protinádorovou aktivitu ozařování na větší míru než se stalo pomocí senzibilizátoru hypoxických buněk etanidazolu.

Koncentrace kyslíku/křivka cytotoxicity tirapazaminu se jeví obzvláště dobře vhodná pro kombinaci s radioterapií. Pod přibližně 30 torr (mm Hg) se buňky stávají ve zvýšené míře odolné proti škodlivým účinkům ozařování. Nitroaromatické a chinonové antibiotické radiosenzibilizátory jsou nicméně nejúčinnější pouze při mnohem nižších hladinách kyslíku. Takto nejsou toxické pro středně • · · · hypoxické buňky odolné proti záření, které jsou přítomné v nádorech. Naopak cytotoxicita tirapazaminu zůstává relativně konstantní přes celý rozsah kyslíkových koncentrací prokazujících odolnost proti záření.

Na rozdíl od jiných studií radiosenzibilizátorů, které byly doposud provedeny, klesá toxicita tirapazaminu při vysokých koncentracích kyslíku (tj. těch, které jsou v normální tkáni). V systému in vitro byla toxicita tirapazaminu alespoň 50 až > 2000krát vyšší za hypoxie než při 100% kyslíkových výparech. Protože je aktivní proti širokému spektru nádorových buněk odolných proti záření, ale není toxický pro normální buňky s vysokými koncentracemi kyslíku, je tirapazamin selektivně cytotoxický pro hypoxické nádorové buňky.

Tirapazamin a chemoterapie

Když byl tirapazamin (25 až 75 mg/kg IP=83,3 až 250 mg/m²) podáván myším s fibrosarkomem FSalIC, bylo pozorováno některé přímé ničení nádorových buněk. Přidání tirapazaminu (50 mg/kg IP = 167 mg/m²) k cyklofosfamidu (150 mg/kg IP = 500 mg/m²), melfalanu (10 mg/kg IP = 33 mg/m²) nebo cisplatinu (10 mg/kg IP = 33 mg/m²) v tomto modelu produkovalo 1,6 až 5,3 krát vyšší zdržení růstu nádoru.

Účinek na běžnou tkáň

Myší samice C3H/Km byly použity ve dvou testech k prověření možnosti, zda tirapazamin může mít vliv na citlivost normální tkáně na ionizující záření. Jak běžná reakce kůže, tak testy kontrakce nohy (stehna) byly provedeny s přerušovaným zářením. Tirapazamin neměl na tkáně účinek ani v jednom testu.

Ke stanovení toho, zda tirapazamin může mít vliv na normální tkáň, byly pravé zadní končetiny myších samic C3H/Km byly ozářeny osmi frakcemi (3,4,5 nebo 6 Gy) v rozmezí 4 dnů (každých 12 hodin).

« * » · « ·

Myším byl vstříknutý buď fyziologický roztok nebo tirapazamin (0,08 mmol/Kg = 43 mg/m²) 30 minut předem, nebo okamžitě po každé frakci. Reakce kůže na ozářených stehnech byly zaznamenávány třikrát týdně, ode 10. dne do 32.dne po první dávce ozáření. Myši byly zaznamenávány „naslepo“ - bez informací o tom, o jakou léčenou skupinu se jedná - podle stupnice podobné té vytvořené dříve [Brown J.M., Goffinet D.R., Cleaver J.E., Kallman R.F., “Preferenční radiosenzibilizace myšího sarkomu u normální myší kůže pomocí chronické nitrotepenné infuze halogenovaných pyrimidinových analogů“, JNCI (1971) 47, 77-89]. Jak bylo stanoveno na základě vyhodnocení kožní reakce, nevznikla přidáním tirapazaminu k léčbě ozařováním žádná radiosenzibilita, ani dodatečná toxicita.

Poté, co byl popsán vynálezu s odkazem na své preferované formy, se předpokládá, že modifikace v rámci vynálezu budou zřejmé těm, kteří mají kvalifikované technické předpoklady.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vodní parenterální prostředek pro léčbu rakovinných nádorů citlivých na sloučeniny uvedené níže obsahující:

účinné množství sloučeniny léčící rakovinný nádor se vzorcem

O ΐ

kde X je H; hydrokarbyl (1-4C); hydrokarbyl (1-4C) substituovaný OH, NH?, NHR nebo NRR; halogen; OH: alkoxy (1-4C); NH?; NHR nebo NRR; kde každý R je nezávisle vybrán z nižšího alkylu (1-4C) a nižšího acylu (1-4C) a nižší alkyl (1-4C) a nižší acyl (1-4C) jsou substituovány OH, NH₂. alkyl (1-4C) sekundárními a dialkyl (1-4C) terciárními amino skupinami, alkoxy (1-4C) nebo halogenem; a když X je NRR, jsou oba R spojeny dohromady přímo nebo kyslíkovou vazbou a vytvářejí morfolinový, pyrrolidinový nebo piperidinový uzavřený řetězec;

nje 0 nebo 1; a

Y¹ a Y jsou nezávisle buď H; nitro; halogen; hydrokarbyl (1-14C), včetně cyklického a nenasyceného hydrokarbylu, volitelně substituován 1 nebo 2 substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, hydroxy, epoxy, alkoxy (1-4C), alkylthio (1-4C), primární amino (NH2), alkyl (1-4C) sekundární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, kde dva alkyly jsou spojeny dohromady a vytváří morfolino, pyrrolidino nebo piperidino, acyloxy (1-4C), acylamido (1-4C) a jejich thio analogy, acetylaminoalkyl (1-4C), karboxy, alkoxykarbonyl (1-4C), karbamyl, alkylkarbamyl (1-4C), alkylsulfonyl (1-4C) nebo alkylfosfonyl (1-4C), kde hydrokarbyl může být volitelně přerušen jedinou etherovou vazbou (-O-); nebo kde Y¹ a Y' jsou nezávisle buď morfolino, pyrrolidino, piperidino. NH₂, NHR', NR’R’O(CO)R’, NH(CO)R\ O(SO)R’, nebo O(POR’)R, kde R' je hydrokarbyl (1-4C). který může být • f- 9 ♦ ♦ · » * » » f 9 · · •9 e* •· · ♦♦ ·» •· « · substituován OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními amino, dialkyl (1-4C) terciárními amino, morfolino, pyrrolidino, piperidino, alkoxy (1-4C) nebo halogenovými substituenty, nebo farmakologicky přijatelnou solí uvedené sloučeniny v parenterálně přijatelném tlumícím roztoku s koncentrací přibližně 0,001M až O,1M.
2. Metoda léčby rakovinného nádoru u pacienta, který má rakovinný nádor citlivý na sloučeniny uvedené níže a má potřebu této léčby spočívající v podávání účinného množství prostředku léčícího rakovinný nádor uvedenému pacientovi, který má potřebu této léčby, a tento uvedený prostředek obsahuje:

účinné množství sloučeniny léčící rakovinný nádor se vzorcem (I)

O

Ψ kde X je H; hydrokarbyl (1-4C); hydrokarbyl (1-4C) substituovaný OH, NH₂, NHR nebo NRR; halogen: OH: alkoxy (1-4C); NH₂; NHR nebo NRR; kde každý R je nezávisle vybrán z nižšího alkylu (1-4C) a nižšího acylu (1-4C) a nižší alkyl (1-4C) a nižší acyl (1-4C) jsou substituovány OH. NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními a dialkyl (1-4C) terciárními amino skupinami, alkoxy (1-4C) nebo halogenem; a když X je NRR, jsou oba R spojeny dohromady přímo nebo kyslíkovou vazbou a vytváří morfolinový, pyrrolidinový nebo piperidinový uzavřený řetězec;

nje 0 nebo 1; a

Y¹ a Y² jsou nezávisle bud’ H; nitro; halogen; hydrokarbyl (1-14C), včetně cyklického a nenasyceného hydrokarbylu, volitelně substituován 1 nebo 2 substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, hydroxy, epoxy, alkoxy (1-4C), alkylthio (1-4C), primární amino (NH₂), alkyl (1-4C) sekundární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, kde dva alkyly jsou spojeny dohromady a vytváří morfolino, pyrrolidino nebo piperidino, acyloxy (1-4C), acylamido (1-4C) a jejich thio analogy, acetylaminoalkyl • * · · » · • · ♦ • * · · * • · · • « · · ♦ (1-4C), karboxy, alkoxykarbonyl (1-4C), karbamyl, alkylkarbamyl (1-4C), alkylsulfonyl (1-4C) nebo alkylfosfonyl (1-4C), kde hydrokarbyl může být volitelně přerušen jedinou etherovou vazbou (-O-); nebo kde Y¹ a Y² jsou nezávisle buď morfolino, pyrrolidino, piperidino, NH?, NHR’, NR’RO(CO)R’, NH(CO)R\ O(SO)R’ nebo O(POR’)R’, kde R’ je hydrokarbyl (1-4C), který může být substituován OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními amino, dialkyl (1-4C) terciárními amino, morfolino, pyrrolidino, piperidino, alkoxy (1-4C) nebo halogenovými substituenty, nebo farmakologicky přijatelnou solí uvedené sloučeniny v citrátovém tlumícím roztoku s koncentrací přibližně od 0,005M do 0,05M. - -
3. Vodní parenterální prostředek pro léčení rakovinných nádorů citlivých na sloučeniny uvedené níže obsahující:

přibližně 0.500 až 0,810 g sloučeniny, která má vzorec (I)

O

X kde X je H; hydrokarbyl (1-4C); hydrokarbyl (1-4C) substituovaný OH, NH₂, NHR nebo NRR; halogen: OH: alkoxy (1-4C); NH₂; NHR nebo NRR; kde každý R je nezávisle vybrán z nižšího alkylu (1-4C) a nižšího acylu (1-4C) a nižší alkyl (1-4C) a nižší acyl (1-4C) jsou substituovány OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními a dialkyl (1-4C) terciárními amino skupinami, alkoxy (1-4C) nebo halogenem; a když X je NRR, jsou oba R spojeny dohromady přímo nebo kyslíkovou vazbou a vytváří morfolinový, pyrrolidinový nebo piperidinový uzavřený řetězec;

n je 0 nebo 1; a

Y¹ a Y² jsou nezávisle buď H; nitro; halogen; hydrokarbyl (1-14C), včetně cyklického a nenasyceného hydrokarbylu, volitelně substituován 1 nebo 2 substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, hydroxy, epoxy, alkoxy (1-4C), alkylthio (1-4C), primární amino (NH?), alkyl (1-4C) sekundární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, dialkyl (1-4C) terciární amino, kde dva alkyly jsou spojeny dohromady a vytváří morfolino, pyrrolidino nebo piperidíno, acyloxy (1-4C), acylamido (1-4C) a jejich thio analogy, acetylaminoalkyl (1-4C), karboxy, alkoxykarbonyl (1-4C), karbamyl, alkylkarbamyl (1-4C), alkylsulfonyl (1-4C) nebo alkylfosfonyl (1-4C), kde hydrokarbyl může být volitelně přerušen jedinou etherovou vazbou (-O-); nebo kde Y¹ a Y² jsou nezávisle buď morfolino, pyrrolidino, piperidino, NH₂, NHR’, NR’R’O(CO)R’, NH(CO)R’, O(SO)R’ nebo O(POR’)R’, kde R’ je hydrokarbyl (1-4C), který může být substituován OH, NH₂, alkyl (1-4C) sekundárními amino, dialkyl (1-4C) terciárními amino, morfolino, pyrrolidino, piperidino, alkoxy (1-4C) nebo halogenovými substituenty, nebo farmakologicky přijatelnou solí uvedené sloučeniny vcitrátovém tlumícím roztoku s koncentrací přibližně od 0,005M do 0,05M;

přibližně 0,100 až 9,000 g chloridu sodného;

přibližně 0,9000 až 10,00 g kyseliny citrónové;

přibližně 0,200 až 3,000 g hydroxidu sodného; a qs do pH 3,0 - 5,0 ve vodě do 1000 ml.
4. Metoda léčby rakovinného nádoru u pacienta, který potřebuje tuto léčbu spočívající v podávání účinného množství přípravku podle nároku 3 léčícího rakovinný nádor.
5. Vodní parenterální přípravek pro léčení rakovinových nádorů citlivých na sloučeninu uvedenou níže obsahující:

účinné množství 1,2,4-benzotriazin 3-amin 1,4-dioxidu, který léčí rakovinný nádor, vcitrátovém tlumícím roztoku skoncentrací přibližně 0,005M až 0,05M.
6. Vodní parenterální přípravek podle nároku 5, kde uvedený citrátový tlumící roztok má pH přibližně 3,7 až 4,3.
7. Metoda léčby rakovinného nádoru u pacienta, který potřebuje tuto léčbu spočívající v podávání účinného množství přípravku podle nároku 5 léčícího rakovinný nádor.

• toto* * ♦ ·
8. Vodní parenterální přípravek pro léčení rakovinných nádorů citlivých na sloučeninu uvedenou níže obsahující:

přibližně 0,500 až 0,810 g l,2,4-benzotriazin-3-amin 1,4dioxidu:

přibližně 5,000 až 9,000 g chloridu sodného;

přibližně 0,9000 až 10,00 g kyseliny citrónové;

přibližně 0,200 až 3,000 g hydroxidu sodného; a qs do pH 3,7 - 4,3 ve vodě do 1000 ml.
9. Metoda léčby rakovinného nádoru u pacienta, který potřebuje tuto léčbu spočívající v podávání účinného množství přípravku podle nároku 8 léčícího rakovinný nádor.
10. Vodní parenterální přípravek pro léčení rakovinných nádorů citlivých na sloučeninu uvedenou níže obsahující:

0,700 g l,2,4-benzotriazin-3-amin 1,4-dioxidu:

8,700 g chloridu sodného;

0,9605 g kyseliny citrónové;

0,2500 g hydroxidu sodného; a qs do pH 3,0 - 5,0 ve vodě do 1000 ml.
11. Metoda léčby rakovinného nádoru u pacienta, který potřebuje tuto léčbu spočívající v podávání účinného množství přípravku podle nároku 10 léčícího rakovinný nádor.