CZ39898A3 - Biokonjugáty manganových komplexů makrocyklických ligandů obsahujících dusík účinné jako katalyzátory dismutace superoxidu - Google Patents

Description

Biokonjugáty manganových komplexů makrocyklických ligandů obsahujících dusík účinné jako katalyzátory dismutace superoxidu

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin účinných jako katalyzátory dismutace superoxidu. Vynález se týká manganatým (II) a manganitým (III) komplexům patnáctičlenných makrocyklických ligandů, které katalyticky dismutují superoxid. Z jiného hlediska se vynález týká komplexů manganu s patnáctičlennými makrocyklickými ligandy obsahujícími dusík, které jsou konjugovány s biomolekulami s cílenou distribucí.

Dosavadní stav techniky

Enzym superoxid dismutáza katalyzuje konverzi superoxidu na kyslík a peroxid vodíku podle rovnice (1) °2 ⁺ °2 - ^{+ 2H+} - °2 + H₂o_: (v následujícím označováno jako dismutace). O reaktivních kyslíkových metabolitech vznikajících ze superoxidu se předpokládá, že přispívají k tkáňové patologii při mnoha zánétlivých nemocech a poruchách, jako například při reperfusním poškození ischemického srdečního svalu, zánětlivé chorobě vnitřních orgánů, reumatoidní arthritidě, osteoarthritidě, atheroskleroze, hypertenzi, metastázi, lupénce, odvrhnutích orgánových transplantátů, poškozeních způsobených zářením, astmatu, chřipce, mrtvici, popáleninách a traumatu. Viz například, Bulkley, G.B., Reaktivní kyslíkové metabolity a reperfusní poškození, odchylné spuštění retikuloendoteliální funkce, The Lancet, sv. 344, str. 934-36, 1. říjen, 1994; Grisham, M.B., Oxidanty a volné radikály při zánětlivé nemoci vnitřních orgánů, The Lancet, sv. 344, str. 859-861, 24. září, 1994; Cross, C.E. a kol., Reaktivní kyslíkaté částice a plíce, The Lancet, sv. 344, str. 930-33, 1. říjen, 1994; Jenner, P., Oxidační poškození při neurodegenerativní chorobě, The Lancet, sv. 344, str. 796-798,17. září, 1994; Cerutti, P.A., Oxy- radikály a rakovina,The Lancet, sv. 344, str. 862-863, 24. září, 1994; Simic, M.G., a kol., Kyslíkaté radikály v biologii a medicíně, Basic Life Sciences, sv. 49, Plenům Press, New York a London, 1988; Weiss J. Cell. Biochem., 1991 Dopl. 15C, 216 Abstrakt C110 (1991); Petkau, A., Cancer Treat. Rev. 13, 17 (1986); McCord, J., Free Radicals Biol. Med., 2, 307, (1986); a Bannister, J.V., a kol., Crit. Rev. Biochem., 22,111, (1987), Výše uvedené odkazy z The Lancet postulují • 4 ·· • 4 4 I

4 4 • 4 « · «

4444 44 · 4 ··

4 4 4

4 4 4. 4

444*4 * 44

4 4

4 4 4 4 spojitost mezi volnými radikály vznikajícími ze superoxidu a řadou chorob. Zejména odkazy Bulkleyho a Grishama zdůrazňují, že existuje spojitost mezi dismutací superoxidu a konečnou léčbou nemoci.

Je také známo, že superoxid je zapojen při poruše endoteliálního cévního uvolňujícího faktoru (EDRF), který byl identifikován jako oxid dusnatý (NO), a že EDRF je chráněn před defektem superoxid dismutázou. Toto naznačuje ústřední roli aktivovaných kyslíkatých částic vznikajících ze superoxidu při patogenesi cévní křeči, trombosy a atherosklerosy. Viz, například, Gryglewski, R.J., a kol., „Superoxidový anion je zapojen do defektu endoteliálního cévního uvolňujícího faktoru“, Nátuře, sv. 320, str. 454-56 (1986) a Palmer, R.M.J., a kol., „Uvolňování oxidu dusnatého zodpovídá za biologickou aktivitu endoteliálního uvolňujícího faktoru“, Nátuře, sv. 327, str. 523-26 (1987).

Byly vykonány nebo pokračují klinické pokusy a studie na zvířatech s vrozenými, rekombinantnímiamodifikovanýmisuperoxiddismutázovýmienzymy.kterémají demonstrovat terapeutickou účinnost snižování hladiny superoxidu při výše zmíněných chorobných stavech. NicTrTěrTě vyvstala řada probTéTnú s užitím enzýmujako potenciálních terapeutických prostředků, včetně ztráty orální aktivity, krátkého poločasu života in vivo, imunogennosti enzymů získaných mimo lidský organismus a špatné tkáňové distribuce.

Manganové komplexy patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které jsou napodobeninami superoxiddismutázy (SOD) o nízké molekulové hmotnosti, jsou užitečné jako terapeutické prostředky a umožňují se vyvarovat mnoha problémům, které jsou spojeny s SOD enzymy. Nicméně by bylo vhodné nasměrovat napodobeniny SOD k požadovanému cíli v těle, kde může být sloučenina koncentrována pro optimální účinek. Bez nějakého způsobu, jak učinit sloučeniny „cílenými“, jsou někdy k dosažení účinné koncentrace v místě zájmu zvýšené, dávky nezbytné. Tyto zvýšené dávky mohou mít někdy za následek nežádoucí vedlejší účinky na pacienta.

Nyní bylo zjištěno, že makrocykly nebo manganové komplexy podle vynálezu mohou být připojeny, tj. konjugovány, k jedné nebo více molekulám s cílenou distribucí přes spojovací skupinu za vzniku konjugátu biomolekula s cílenou distribucí - makrocyklus nebo konjugátu biomolekula s cílenou distribucí - manganový komplex.

• · 4

4 4 · 4 4 4 »···

4«4 4 444 4 444

444 4 4444 4 444 · 4

444444 444

444444 44 4 4« ··

Podstata vynálezu

Předmětem podle vynálezu je poskytnout biokonjugáty manganatých (II) nebo manganitých (III) komplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, jež jsou nízkomolekulárními napodobeninami superoxíddismutázy (SOD), které jsou užitečné jako terapeutické činidla pro zánětlivé chorobné stavy nebo poruchy zprostředkováné, aspoň z části, superoxídem. Dalším předmětem podle vynálezu je poskytnout biokonjugáty manganatých (II) komplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které jsou užitečné jako magnetické rezonanční zobrazovací (MRI) kontrastní činidla se zlepšenou kinetickou stabilitou, zvýšenou oxidační stabilitou a se zlepšenou schopností tvorby vodíkových vazeb. Dalším předmětem podle vynálezu je poskytnout biokonjugáty manganových komplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které mohou být cíleně distribuovány na specifické místo v těle. . ____ . ___,

Podle vynálezu jsou poskytnuty biokonjugáty manganatých (II) a manganitých (III) komplexú^atnáctičlénTíýčhlnaklOcykličkýčřriigartdů^obsahijjícícOtjšíÍOde7l)ledrtF až pět „R“ skupin je připojeno k biomolekulám přes spojovací skupinu, (2) jedna z X, Y a Z je připojena k biomolekule přes spojovací skupinu, nebo (3) jedna až pět „R“ skupin a jedna z X, Y a Z jsou připojeny k biomolekulám přes spojovací skupinu; a biomolekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající ze steroidú, sacharidů, mastných kyselin, aminokyselin, peptidů, bílkovin, protilátek, vitamínů, lipidů, fosfolipidů, fosforečnanů, fosforitanů, nukleových kyselin, substrátů enzymů, enzymových inhibitorů a substrátů enzymových receptorů a spojovací skupina je odvozena od substituentu připojeného k „R^u skupině nebo k X,Y a Z, která reaguje s biomolekulou a je vybrána ze skupiny skládající se z -NH₂, -NHR₁₀, -SH, -OH, -COOH, -COORio, -CONH₂, -NCO, -NCS, COOX“, alkenylu, alkinylu, halogenidu, p-toluensulfonátu (tosylátu), methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R_w je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a X“ je halogenid.

Vynález je zaměřen na biokonjugáty manganatých (II) nebo manganitých (III) komplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které katalyzují konverzi superoxidu na kyslík a peroxid vodíku. Tyto komplexy mohou být znázorněny vzorcem (I);

• · 9 •99« «9

kde R, R , Ri, R i, R2, R 2, R3, R 3, R4, R 4, Rs, R 5, R$, R g, R₇, R ₇, Rg, R'_8| R_g a R'g nezávisle představují zbytky vodík, alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylalkyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl, alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklus, aryl a aralkyl a zbytky připojené k a-uhTíku a-aminokyselin; nebo Ri nebo R'1 a R₂ nebo R'₂₎ R3 nebo R'₃ a R4 nebo R'₄, R5-nebo-RÍ5.a-R6-nebo-R-₆,-R₇-nebo-Rf₇-a-R8-nebo-R-8-R9-nebo-R-ga-R-nebo-R-společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny nezávisle za vzniku nasycených, částečně nasycených nebo nenasycených cyklů majících 3 až 20 uhlíkové atomy; nebo R nebo R'a Rj nebo R'_b R₂ nebo R'₂ a R3 nebo R'₃, R4 nebo R'₄ a Rs nebo R'₅, Re nebo R'_s a R₇ nebo R'₇, a Re nebo R'₈ a Rg nebo R'_g společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny nezávisle za vzniku heterocyklu obsahujícího dusík se 2 až 20 uhlíkovými atomy za předpokladu, že když heterocyklus obsahující dusík je aromatický heterocyklus, který neobsahuje vodík navázaný k dusíku, vodík navázaný k dusíku v uvedeném vzorci (I), jehož dusík je také v makrocyklu, á R skupiny připojené ke stejným uhlíkovým atomům makrocyklu chybí; a jejich kombinace; a kde (1) jedna až pět „R“ skupin je navázáno k biomolekulám přes spojovací skupinu, (2) jedna z X, Y a Z je navázána k biomolekule přes spojovací skupinu, nebo (3) jedna až pět „R“ skupin a jedna z X, Y a Z jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu; a biomolekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené steroidy, sacharidy, mastnými kyselinami, aminokyselinami, peptidy, bílkovinami, protilátkami, vitamíny, lipidy, fosfolipidy, fosforečnany, fosforitany, nukleovými kyselinami, substráty enzymů, enzymovými inhibitory a substráty enzymových receptorú a spojovací skupina je odvozena od substituentu připojeného k „R“ skupině nebo k X, Y a Z, která reaguje s biomolekulou a je vybrána ze skupiny sestávající z -NH₂, -NHR10, -SH, -OH, -COOH, -COORw, -CONH₂, -NCO, 5 * * · » «··· · t 9 9 ·· • 9 • · ···· ··

Η ·· • · · · • « ·· • * « · * • * · · · · »· « ·· ··

COOX“, alkenylu, alkinylu, halogenidu, p-toluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R_i0 je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a X“ je halogenid.

X, Y a Z zastupují vhodné ligandy nebo anionty neutralizující náboj, které jsou odvozeny od monodentátního nebo polydentátního koordinujícího ligandu nebo ligandového systému nebojím odpovídajícího aniontu (například kyseliny benzoové nebo benzoatového aniontu, fenolu nebo fenoxidového aniontu, alkoholu nebo alkoxidového aniontu). X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z ligandů halogenid, oxo, aqua, hydroxo, alkohol, fenol, molekulový kyslík, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amin, alkylamin, arylamin, heterocykloalkylamin, heterocykloarylamin, aminoxidy, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxid dusnatý, kyano, kyanato, thiokyanato, isokyanato, isothiokyanato, alkylnitril, arylnitril, nitrato, nitrito, azido, alkylsulfonová kyselina, arylsulfonová kyselina, alkylsulfoxid, arylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenovákyseiina.arylsulfenovákyselina.alkylsulfinovákyselina,arylsulfinová kyselina, alkylthiolkarboxylová kyselina, arylthiolkarboxylová kyselina, alkylthiolthiokarbdxýtová^kyselinaů aryítfiiolthiokarboxylová kyselina, aíkylkarboxylová kyselina, (například kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina šťavelová), arylkarboxylová kyselina (například kyselina benzoová, kyselina ftalová), močovina, alkyl močoví na, arylmočovina, alkylarylmočovina, thiomočovina, alkylthiomočovina, arylthiomočovina, alkylarylthiomočovina, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitaň, thíosíran, thiosiřičitan, hydrosiřičitan, alkylfosfin, arylfosfin, alkylfosfinoxid, arylfosfinoxid, alkylarylfosfinoxid, alkylfosfinsulfid, arylfosfinsulfid, alkylarylfosfinsulfid, alkylfosfonová kyselina, arylfosfonová kyselina, alkylfosfinová kyselina, arylfosfinová kyselina, difenylfosfinitá kyselina, arylfosfinitá kyselina, fosforečnan, thiofosforečnan, fosforitan, difosforitan, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfósforečnan, alkylguanidino, arylguanidino, alkylarylguanidino, alkylkarbamat, arylkarbamat, alkylarylkarbamat, alkylthiokarbamat, arylthiokarbamat, alkylarylthiokarbamat, alkyldithiokarbamat, aryldithiokarbamat, álkylaryldithiokarbamat, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromičnan, bromitan, bromnan, tetrahalomanganan, tetrafluoroboritan, hexafluorofosforečnan, hexafluoroantimoničnan, fosfornan, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylborat, tetraalkylborat, vinnan, salicylát, sukcinát, citrát, askorbát, sacharinát, aminokyselina, hydroxamová kyselina, thiotosylát, a aniontu iontoměničových pryskyřic, nebo systémů, kde jeden nebo více ligandů z X, Y a Z je nezávisle navázáno na jednu nebo více „R^u skupin, kde n je O nebo 1. Výhodnější ligandy, ·« «« ·« · ·· ·* ·«·· · » ···· * ·· « · · · · · ·· • a · · · · ···· · ··· t * ·«««·· · · · ·»·· ·· ♦· · ·· ·· z nichž jsou vybírány X, Y a Z, zahrnují anionty halogenídů, organických kyselin, dusičnan a hydrogenuhličitan,

Spojovací skupiny, označované zde taktéž jako „spojovník“, jsou odvozeny od specifických funkčních skupin navázaných k „R skupinám nebo k X, Y a Z, a mají funkci spojovat biomolekulu s „R“ skupinami nebo X, Y a Z. Funkční skupiny jsou vybrány ze skupiny sestávající z -NH₂, -NHR_W, -SH, -OH, -COOH, -COORio, -CONH₂, *

NCO, -NCS, -COOX, alkenylu, alkinylu, halogenidu, p-toluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R_w je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a X“ je halogenid. Obvykle výhodnější alkenylová skupina je ethenyl a výhodnější alkinylová skupina je ethinyl. Funkční skupiny na „R“ skupině nebo X, Y a Z jsou schopny reagovat s biomolekulou, t.j. reagují s funkční skupinou na steroidech, sacharidech, mastných kyselinách, aminokyselinách, peptidech, bílkovinách, protilátkách, vitamínech, lipidech, fosfolipidech, fosforečnanech, fosforitanech, nukleovych kyselinách. substrátech enzymů, enzymových inhibitorech, substrátech enzymových receptorů a jiných používaných biomolekulách-s-cílenou^_distribucí7ůJestliže^_firňkčňí^Kupina navázaná l?7R“ skupinám nebo X, Y a Z reaguje s biomolekulou, funkční skupina je tím modifikována a tato odvozená funkční skupina je spojovníkem. Například, jestliže funkční skupina -NH₂ navázaná k „R“ skupině reaguje s nějakým steroidem jako například v příkladě 1, spojovník je -NH-. Přesná struktura specifických spojovacích skupin bude odborníkovi v dané oblasti jasně zřejmá a bude záviset na specifické funkční skupině a btomolekule, která byla vybrána. Specifické reakční podmínky pro reakci funkční skupiny navázané k „R“ skupinám nebo X, Y a Z s biomolekulou budou odborníkovi v dané oblasti snadno zřejmé.

Funkční skupina užitečná pro vytvoření spojovníku, definovaná zde jako „prekursor spojovníku“, může být přítomna na „R“ skupinách v době, kdy je připravován makrocyklus nebo může být přidána nebo modifikována po přípravě makrocyklu nebo jeho komplexu s manganem. Podobně, prekursor spojovníku může být přítomen na axiálním ligandu, t.j. X, Y nebo Z, když je připravován komplex manganu nebo je provedena výměnná reakce axiálních ligandů tak, aby došlo k výměně axiálních ligandů přítomných v komplexu manganu.

Makrocyklus podle vynálezu může být komplexován s manganem jak před, tak po konjugaci s biomolekulou s cílenou distribucí v závislosti na specifitě využité biomolekuly. Konjugát makrocyklického komplexu a biomolekuly s cílenou distribucí je zde definován jako „biokonjugát“.

• 9

9« 99 99 · * · 9 9 · 9 ·· 9 9 9 9

9 999 9999

9»« 99 9

9*99 99 99 9

9 9 9

9 ··

9 9 « « 9

99

Cílená distribuce léčiv je odborníkům v dané oblasti dobře známa. Viz například, J. A. Katzenellenbogen a kol., Journal ofNuclear Mediáne, sv. 33, č. 4, 1992,558, a J. A. Katzenellenbogen a kol., Bioconjugate Chemistry, 1991, 2, 353. Činidla s cílenou distribucí jsou typicky biomolekuly. Biomolekuly podle vynálezu jsou biologicky aktivní molekuly, které jsou místně specifické, t.j. je o nich známo, že se koncentrují v určitém důležitém orgánu nebo tkáni. Biomolekuly jsou vybírány tak, aby řídily tkáňovou distribuci biokonjugátu přes vazbu na receptor, asociaci s membránami, rozpustnost v membránách, a tak podobně. Tyto biomolekuly zahrnují, například steroidy, sacharidy {včetně monosacharidů, disacharidů, i polysacharidú), mastné kyseliny, aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, protilátky (včetně polyklonálních a monoklonálních a jejich fragmentů), vitamíny, lipidy, fosfolipidy, fosforečnany, fosforitany, nukleové kyseliny, substráty enzymů, inhibitory enzymů a substráty enzymových receptorů. Biomolekuly také zahrnují ty biomolekuly, které jsou kombinaci výše uvedených biomolekul, iako například kombinace steroidu se sacharidem, například digitonin.

Konkrétní^_biomoíekulý7ktěřé^_mohoiri3ýt'využitý’}Fčílění'člopožadóvářréhoořgaňu’ nebo tkáně, jsou známy ve stavu techniky nebo budou odborníkovi v dané oblasti snadno zřejmé. Biomolekuly podle vynálezu jsou komerčně dostupné nebo mohou být snadno připraveny kvalifikovaným odborníkem za použití konvenčních metod.

Běžně je výhodnější, když nejvýše jedna „R“ skupina navázaná k uhlíkovým atomům umístěným mezi dusíkovými atomy v makrocyklu má biomolekulu připojenu přes spojovník. Navíc, výhodnější sloučeniny jsou ty, které mají jednu až pět, ještě výhodněji jednu až dvě, „R“ skupiny navázané k biomolekule a žádnou ze skupin X, Y a Z nemají navázánu k biomolekule, nebo ty, které mají jednu ze skupin X, Y a Z navázánu k biomolekule a žádná z „R“ skupin není navázána k biomolekule.

Současně výhodnější sloučeniny jsou ty, v nichž nejméně jedna, výhodněji nejméně dvě, z „R‘^! skupin, navíc k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekule, reprezentuje uhlovodíkové zbytky alkyl, cykloalkylalkyl a aralkyl a zbývající „R“ skupiny nenavázané k biomolekule představují vodík, nasycený, částečně nasycený a nenasycený cyklus nebo heterocyklus obsahující dusík. Jiné výhodné skupiny sloučenin jsou ty, kde nejméně jedna, s výhodou však dvě, z Ri nebo R'i a R₂ nebo R'_2t R3 nebo R'₃ a R4 nebo R'₄, Rs nebo R'_s a Re nebo R'_e, R7 nebo R'₇ a Re nebo R'₈ a R₉ nebo R'₉ a R nebo R' společné s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, představují nasycený, částečně nasycený a nenasycený cyklický zbytek se 3 až 20 uhlíkovými atomy a zbývající

9*99 9 9 9 * * · ♦

99 9 9 9 · * * · ·

9 · 9 9 9999 9 999 · 9

999999 999

99*9 99 ·· 9 9999 „R skupiny, navíc k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekule přes spojovník, jsou vodík, heterocykly obsahující dusík nebo alkylové skupiny, a ty, kde nejméně jedna, s výhodou dvě, z R nebo R' a Ri nebo R'_b R₂ nebo R'₂ a R₃ nebo R'_3| R4 nebo R'₄ a R₅ nebo R'_5l Re nebo R'_e, a R₇ nebo R'₇₎ a Re nebo R'_a a Rg nebo R'₉ společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, jsou vázány za vzniku heterocyklu obsahujícího dusík se 2 až 20 uhlíkovými atomy a zbývající „R“ skupiny navíc k „R“ skupinám, které jsou připojeny k biomolekule přes spojovník, jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík, nasycených, částečně nasycených a nenasycených cyklických nebo alkylových skupin.

Jak je zde užito, „Ř“ skupiny označují všechny R skupiny navázané k uhlíkovým atomům makrocyklu, t.j., R, R\ R_t, R'_1f R₂, R'₂, Ra, R'₃, R4, R'₄, R₅, R ₅, R₆, R'₆₎ r_7i R'_7j Re, Re, R9aR9.

_ . Jiné provedení vynálezu je farmaceutickákompozicev jednotkovédávkovací formě platné pro dismutaci superoxidu zahrnující (a) terapeuticky a profylakticky účinné množství komplexu, jak je popsáno výše a (b) netoxický, farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo vehikulum.

Běžně přijímaný mechanismus účinku manganových SOD enzymů zahrnuje střídání dvou oxidačních stavů (II, III) manganového centra. Viz J. B. Bannister, W. H. Bannister, a G. Rotilio, Crit. Rev. Biochem., 22.111-180 (1987).

1) Μη (II) + HO₂ ......> Μη (III) + H₂O₂

2) Μπ (III) + O₂......> Μη (II) + O₂

Formální redoxní potenciály redoxních párů O₂/O₂ a HO₂/H₂O₂ při pH = 7 jsou - 0,33 V, respektive 0,87 V. Viz A. E. G. Cass, v Metaloproteiny. Část 1, Metaloproteiny s redoxními úlohami, ed. P. Harrison, str. 121. Verlag Chemie (Weinheim, GDR) (1985). Pro výše uvedený mechanismus, vyžadují potenciály, aby předpokládaný SOD katalyzátor byl schopen rychle podstupovat změny oxidačního stavu v rozmezí - 0,33 V až 0,87 V.

Komplexy odvozené od Μη (II) a hlavní třída C-substituovaných [15]anN₅ ligandů zde popsaná byly všechny charakterizovány užitím cyklické voltametrie změřením jejich ·« 99 • · * • ·« • · • · · 999« 99

9« 9 • · 9 • · · 9 • « 9«»· 9 • 9 · • 9 »

Ct 9 9 9 ·

9 «· a· 9 9 · ,9 9 9

9» redoxního potenciálu. C-substituované komplexy zde popsané jeví reversibilní oxidace při asi +0,7 V (SHE). Coulometrie ukázala, že tato oxidace je jednoelektronový proces; jmenovitě je to oxidace Μη (II) komplexu na Μη (III) komplex. Tudíž, aby tyto komplexy působily jako SOD katalyzátory, je oxidační stav Μη (III) zahrnut v katalytickém cyklu. To znamená, že Μη (III) komplexy všech těchto ligandů jsou stejně vhodné jako SOD katalyzátory vzhledem k tomu, že nezáleží na tom, která forma (Μη (II) nebo Μη (III)) je přítomná, když je přítomen superoxid, protože superoxid bude jednoduše redukovat Mn (lil) na Μη (II) za uvolňování kyslíku.

Jak je zde užito, termín „alkyl“, samotný nebo v kombinaci, označuje alkylové uhlovodíkové zbytky s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až asi 22 uhlíkových atomů, s výhodou asi od 1 až do 18 uhlíkových atomů, a nejlépe asi od 1 do asi 12 uhlíkových atomů, které případně nesou jeden nebo více substituentů vybraných z (1) -NFUnFLi, kde R™ a R_?1 jsou nezávisle vybrané ze skupin vodík, alkyl, aryl nebo aralkyi; nebo R₃₀ je vodík, alkyl, aryl nebo aralkyl a R₃₁ je vybraná ze skupiny sestávajíčíž^NR^R^OH^OR^r ~ ~ “

O S O O X'

II II II II II — C- Z;-C-Z“,-S-R35, -S-Rse,- S- R37,a-p-( ORmXOR»);

kde R₃₂ a R33 jsou nezávisle vodík, alkyl, aryl nebo acyl, R34 je alkyl, aryl nebo aralkyl, Z'je vodík, alkyl, aryl, alkaryl, -OR34, -SR34 nebo -NR40R41, kde R40 a R41 jsou nezávisle vybrány ze zbytků vodík, alkyl, aryl nebo alkaryl, Z“ je alkyl, aryl, alkaryl, -OR34, -SR34 nebo -NR40R41, R35 je alkyl, aryl, -OR34 nebo -NR40R41, R» je alkyl, aryl nebo -NR40R41, R3₇ je alkyl, aryl nebo alkaryl, X' je kyslík nebo síra, a R^ a R₃₉ jsou nezávisle vybrané ze zbytků vodík, alkyl nebo aryl; (2) -SR42, kde R42je vodík, alkyl, aryl, alkaryl, -SR34, NR32R33,

X' O o

II II II — c — Z¹-, —S — R43, nebo — P~( A)(B);

II

O kde R43 je -OH, -OR34 nebo - NR32R33, a A a B jsou nezávisle -OR34, -SR34 nebo -NR32R33;

• 99 9 ·*

I (3) — S (=Ο)χ, kde x je 1 nebo 2, a R44 je halogenid, alkyl, aryl, alkaryl, -OH, -OR34, -SR34 nebo -NR32R33;

(4) -OR45, kde R45 je vodík, alkyl, aryl, alkaryl, -NR3₂R33,

X' R44 O O ll· I II II ^{— c_} Z',— s (= O)x, —P ~tD)(E), nebo — P~( R^XOR^);

kde D a E jsou nezávisle -OR34 nebo -NR32R33;

X'

II ......_:_

- C“ R46, (5) kde R46 je halogenid, -OH, -SH, -OR34, -SR34 nebo -NR^R»; nebo (6) aminoxidy vzorce

I

0’ s podmínkou, že R30 a R31 nejsou vodík; nebo

O

II

- P“( F)(G);

(7) kde F a G jsou nezávisle -OH, -SH, -OR34, -SR34 nebo -NR32R33; nebo (8) -0-(-(CH₂) a -O)b -Rw, kde R10 je vodík nebo alkyl, a a, b jsou celá čísla nezávisle vybraná z 1-6; nebo (9) halogen, kyano, nitro, nebo azido. Alkytové, arylové a alkarylové skupiny na substituentech výše definovaných alkylových skupin mohou obsahovat jeden substituent na11 • 4 · · * 4 ♦♦ víc, ale nejlépe je, jsou-li nesubstituované. Příklady takových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sekbutyl, terc.butyl, pentyl, isoamyl, hexyl, oktyl, nonyl, decyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, oktadecyl a eikosyl. Termín „alkenyl“, samotný nebo v kombinaci, značí alkylový uhlovodíkový zbytek s jednou nebo více dvojnými vazbami. Příklady takových alkenylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na ethenyl, propenyl, 1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, isobutylenyl, cis-2-pentenyl, trans-2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl, 2,3-dimethyl-2-butenyl, 1-pentenyl, 1-hexenyl, 1-oktenyl, decenyl, dodecenyl, tetradecenyl, hexadecenyl, cis- a trans- 9-oktadecenyl, 1,3-pentadienyl, 2,4-pentadienyl, 2,3-pentadienyl, 1,3-hexadienyl, 2,4-hexadienyl, 5,8,11,14eikosatetraenyl, a 9,12,15-oktadekatrienyl. Termín „alkinyl“, samotný nebo v kombinaci, označuje alkylový uhlovodíkový zbytek s jednou nebo více trojnými vazbami. Příklady takových alkinových skupin zahmují, ale—nejsou—omezeny— na—ethinylpropinyl (propargyl), 1-butinyl, 1-oktinyl, 9-oktadecinyl, 1,3-pentadiinyl, 2,4-pentadiinyl, 1,3hexadiinyl, a 2,4-hexadiinyl. Termín „cykloalkyl, samotný nebo v kombinaci, označuje cykloalkylový uhlovodíkový zbytek obsahující od 3 do asi 10, s výhodou od 3 do asi 8, a nejlépe od 3 do asi 6 uhlíkových atomů. Příklady takových cykloalkylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, cyklooktyl a perhydronaftyl. Termín „cykloalkylalkyl“ označuje alkylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, který je substituovaný výše definovaným cykloalkylovým uhlovodíkovým zbytkem. Příklady cykloalkylalkylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cylohexylmethyí, cyklopentylmethyl, (4isopropylcyklohexyl)methyl, (4-t-butyl-cyklohexyl)methyl, 3-cyklohexylpropyl, 2cyklohexylmethylpentyl, 3-cyklopentylmethylhexyl, 1-{4-neopentylcyklohexyl) methylhexyl, a 1-(4-isopropylcyklohexyl)methylheptyl. Termín „cykloalkylcykloalkyl“ označuje cykloalkylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, který je substituovaný jiným výše definovaným cykloalkylovým uhlovodíkovým zbytkem. Příklady cykloalkylcykloalkyíových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklohexylcyklopentyl a cykiohexylcyklohexyl. Termín „cykloalkenyl“, samotný nebo v kombinaci, označuje cykloalkylový uhlovodíkový zbytek s jednou nebo více dvojnými vazbami. Příklady cykloaIkenylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklopentenyl, cyklohexenyl, cyklooktenyl, cyklopentadienyl, cyklohexadienyl a cyklooktadienyl. Termín „cykloalkenylalkyl” označuje alkylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, který

9 ·9·« • 9 9 9 9

9999 9 je substituovaný výše definovaným cykloalkenylovým uhlovodíkovým zbytkem. Příklady cykloalkenylalkylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na 2cyklohexen-1-ylmethyl, 1-cyklopenten-1-ylmethyl, 2-(1-cyklohexen-1-yl)ethyl, 3-(1cyklopenten-1 -yl)propyl, 1 -(1 -cyklohexen-1 -ylmethyl)pentyl, 1 -(1-cyklopenten-1 -yl)hexyl, 6-(1-cyklohexen-yl) hexyl, 1-(1-cyklopenten-1-yl)nonyl, a 1-(1-cyklohexen-1yl)nonyl. Termíny „alkylcykloalkyl“ a „alkenylcykloalkyl“ označují cykloalkylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, který je substituovaný výše definovanými alkylovým nebo alkenylovým uhlovodíkovým zbytkem. Příklady alkylcykloalkýlových a alkenylcykloalkylových uhlovodíkových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na 2ethylcyklobutyl, 1-methylcyklopentyl, 1-hexylcyklopentyl, 1-methylcyklohexyl, 1-(9oktadecenyljcyklopentyl a 1-(9-oktadecenyl)cyklohexyl. Termíny „alkylcykloalkenyl“ a „alkenylcykloalkenyl“ označují cykloalkenylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, který je substituovaný alkylovým nebo alkenylovým uhlovodíkovým zbytkem. definovanými výše. Příklady alkylcykloalkenylových a alkenylcykloalkenylových uhlovodíkových zbytku zahrnuj í~ale nejsou omezeny na 1-methyl-2-cyklopentenyl, 1-hexyl-2cyklopentenyl, 1-ethyl-2-cyklohexenyl, 1-butyl-2-cyklohexenyl, 1-(9-oktadecenyl)-2cyklohexenyl a 1-(2-pentenyl)-2-cyklohexenyl. Termín „aryl“, samotný nebo v kombinaci, označuje fenylový nebo naftylový uhlovodíkový zbytek, který volitelně nese jeden nebo více substituentů vybraných ze skupin alkyl, cylkoalkyl, cykloalkenyl, aryl, heterocyklus, alkoxyaryl, alkaryl, alkoxy, halogen, hydroxy, amin, kyano, nitro, alkylthio, fenoxy, ether, trifluormethyl a podobné, jako například, fenyl, p-tolyl, 4-methoxyfenyl, 4(terc.butoxy)fenyl, 4-fluorfenyl, 4-chlorfenyl, 4-hydroxyfenyl, 1 -naftyl, 2-naftyl, a podobné. Termín „aralkyl“, samotný nebo v kombinaci, označuje alkylový nebo cykloalkylový uhlovodíkový zbytek, definovaný výše, ve kterém je jeden vodíkový atom nahrazen výše definovaným arylovým uhlovodíkovým zbytkem, například benzylem, 2-fenylethylem, a podobnými. Termín „heterocyklický označuje kruhové struktury obsahující v cyklu kromě uhlíku nejméně jeden atom jiného druhu. Nejobvyklejší heteroatomy zahrnují dusík, kyslík a síru. Příklady heterocyklických skupin zahrnují, ale nejsou omezeny na pyrrolidinyl, píperidyl, imidazolidínyl, tetrahydrofuryl, tetrahydrothienyl, furyl, thienyl, pyridyl, chinolyl, isochinolyl, pyridazinyl, pyrazinyl, indolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyrazolyl, pyridiny!, benžoxadiazolyl, benzothiadiazolyl, triazolyl a tetrazolyl. Výraz „nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklický“ označuje kondenzované cyklické struktury, ve kterých 2 uhlíky cyklu jsou také částí patnáctičlenného makrocy13 * · klického ligandů. Cyklické struktury mohou obsahovat 3 až 20 uhlíkových atomů, s výhodou 5 až 10 uhlíkových atomů, a také mohou vedle uhlíku obsahovat jeden nebo více atomů jiného druhu. Nejobvyklejší heteroatomy zahrnují dusík, kyslík a síru. Cyklické struktury mohou také obsahovat více než jeden cyklus. Výraz „nasycená, částečně nasycená nebo nenasycená cyklická struktura“ označuje cyklickou strukturu, ve které jeden uhlík cyklu je také součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandů. Kruh struktury může obsahovat 3 až 20, s výhodou 5 až 10, uhlíkových atomů a může také obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo síry. Výraz „heterocyklus obsahující dusík“ označuje cyklické struktury, ve kterých 2 uhlíky a dusík cyklu jsou také součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandů. Cyklická struktura může obsahovat 2 až 20, lépe však 4 až 10, uhlíkových atomů, může být částečně nebo plně nenasycená nebo nasycená a může také obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo síry v části kruhu, která není též částí patnáctičlenného makrocyklického, ligandu._Termín- „anion-organické kyseliny“ se vztahuje k aniontům karboxylové kyseliny s asi 1 až asi 18 atomy uhlíku. Termín^helogeniď-žnačí cňlořiďňěBóbřomídT^

Makrocykltcké ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu mohou být připraveny podle obecného postupu ukázaného ve schématu A vyloženém níže. Tudíž, amid aminokyseliny, který je odpovídající amido derivát přirozeně se vyskytující nebo přirozeně se nevyskytující α-aminokyseliny, je omezen na formu odpovídajícího substituovaného ethylendiaminu. Takový amid aminokyseliny může být amido derivát kterékoli z mnoha dobře známých aminokyselin. Výhodné amidy aminokyselin jsou zastoupeny vzorcem:

H kde R je odvozená z D nebo L forem aminokyselin alaninu, kyseliny asparagové, argininu, asparaginu, cysteinu, glycinu, kyseliny glutamové, glutaminu, histidinu, isoleucinu, leucinu, lysinu, methioninu, prolinu, fenylalaninu, šeřinu, tryptofanu, threoninu, tyrosinu, valinu a/nebo R skupin α-aminokyselin, které se nevyskytují v přírodě, jako například alkyl, ethyl, butyl, terc.butyl, cykloalkyl, fenyl, alkenyl, allyl, alkinyl, aryl, heteroaryl, polycykloalkyl, polycykloaryl, polycykloheteroaryl, iminy, aminoalkyl, hydroxyalkyl, ·· ·· ·· · ·· ·· #··· ··· » · · · ··· · · · · · · ·· · · · « · ·«·* · ··· · · »«···· · · · «··« ·· ·· V ·· ·♦ hydroxyl, fenol, aminoxidy, thioalkyl, karboalkoxyalkyl, karboxylové kyseliny a jejich deriváty, keto, ether, aldehyd, amin, nitril, halo, thiol, sulfoxid, sulfon, sulfonová kyselina, sulfid, disulfid, fosfonová kyselina, fosfínová kyselina, fosfinoxidy, sulfonamidy, amidy, aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, sacharidy, nukleové kyseliny, mastné kyseliny, lipidy, nitro, hydroxylaminy, hydroxamové kyseliny, thiokarbonyly, boritany, borany, boraza, silyl, siloxy, silaza, a jejich kombinace. Nejvýhodnější jsou ty, kde R zastupuje zbytky vodík, alkyl, cykloalkylalkyl, a aralkyl. Diamin je pak tosylován za vzniku di-Ntosylderivátu, který reaguje s di-O-tosylovaným tris-N-tosylovaným triazaalkandiolem za vzniku odpovídajícího substituovaného N-pentatosylpentaazacykloalkanu. Tosylové skupiny jsou poté odstraněny a výsledná sloučenina reaguje s manganatou (II) sloučeninou za nezbytně bezvodých a anaerobních podmínek za tvorby odpovídajícího substituovaného manganatého (II) pentaazacykloalkanového komplexu. Pokud ligandy neboanionty neutralizující náboj, napríkladX, YaZ.jsou aniontynebo ligandy,které nemohou být zavedeny přímo ze sloučeniny manganu, komplex s těmito anionty nebo tigaňdýTňůžFbyFťvóřen provedením výměnné reakce s komplexem, který byl připraven reakcí makrocyklu se sloučeninou manganu.

Komplexy podle vynálezu, kde R_9| a R₂ je alkyl, a R3, R'_3| R4, R'₄, R5, R's, Re, R'e, R7, R'7, Re a R'e mohou být alkyl, arylalkyl nebo cykloalkylalkyl a R nebo R'a R1 nebo R'1 společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, jsou navázány tak, že tvoří heterocyklus obsahující dusík, mohou být také připraveny podle obecného postupu ukázaného ve schématu B uvedeného níže za využití odborníkům známých metod pro přípravu prekursoru pentaazabicyklo[12,3,1]oktadekapentaen manganatého (II) komplexu. Viz například, Alexander a kol., Inorg. Nucl. Chem. Lett., 6, 445 (1970). Takto je 2,6-diketopyridin kondenzován s triethylentetraaminem za přítomnosti manganaté (II) sloučeniny za vzniku pentaazabicyklo[12,3,1 joktadekapentaen manganatého (II) komplexu, Pentaazabícyklo[12,3,1]oktadekapentaen manganatý (II) komplex je hydrogenován oxidem platnatým za tlaku 69-690 kPa (10-1000 psi), čímž vzniká odpovídající pentaazabicyklo(12,3,1]oktadekatrien manganatý (II) komplex.

Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu mohou být připraveny cestou dichloridu dvojsytné kyseliny ukázané ve schématu C uvedeném níže. Takto je triazaalkan tosylován ve vhodné soustavě rozpouštědel za tvorby odpovídajícího tris(N-tosyl) derivátu. Na takový derivát je působeno vhodnou baží za vzniku odpovídajícího disulfonamidového aniontu. Anion disulfonamidu je dialkylován vhodným

4* * • 4 ·

4 4 ♦444 4>

44 • · · · 4 4 · * 4 4

444* « *44* · • 4*4 • * 4 * * etektrofilem za vzniku derivátu dikarboxylové kyseliny. Na tento derivát dikarboxylové kyseliny je převeden na dikarboxylovou kyselinu, na kterou se pak působí vhodným reagentem za tvorby dichloridu dvojsytné kyseliny. Požadovaný vicinální diamin je získán kteroukoli z několika cest. Jedna cesta, která je použitelná, je příprava z aldehydu reakcí s kyanidem za přítomnosti chloridu amonného následovanou působením kyselinou za vzniku α-amonium nitrilu. Poslední zmíněná sloučenina je redukována za přítomnosti kyseliny a poté je na ni působeno vhodnou baží za vzniku vicinálního diaminu. Kondenzace dichloridu dvojsytné kyseliny s vicinálním diaminem v přítomnosti vhodné zásady dává vznikout tris(to$yí)diamidu makrocyklu. Tosylové skupiny jsou odstraněny a amidy jsou redukovány a výsledná sloučenina se nechá reagovat s manganatou (II) sloučeninou za v podstatě bezvodých a anaerobních podmínek za vzniku odpovídajícího substituovaného pentaazacykloalkan manganatého (II) komplexu.

- Vicinální diaminy byly připraveny ukázanou cestou (známou jako Streckerova syntéza) a vicinální diaminy byly zakoupeny, pokud jsou komerčně dostupné. Mohla být použita jakákoli metoda přípravy vicinálního diaminu.

Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu mohou být také připraveny pyridin diamidovou cestou ukázanou ve schématu D uvedeném níže. Takto je polyamin, jako například tetraaza sloučenina, obsahující dva primární aminy kondenzován s dimethyl 2,6-pyridindikarboxylátem zahříváním ve vhodném rozpouštědle, například methanolu, za vzniku makrocyklu se začleněným pyridinovým cyklem, například 2,6-dikarboxamid. Pyridinový cyklus v makrocyklu je redukován na odpovídající piperidinový cyklus v makrocyklu, a poté jsou tyto diamidy redukovány a výsledná sloučenina reaguje s manganatou (II) sloučeninou za v podstatě bezvodých a anaerobních podmínek za tvorby odpovídajícího pentaazacykloalkan manganatého (II) komplexu.

Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu mohou být také připraveny bis(haloacetamid)ovou cestou ukázanou ve schématu E uvedeném níže. Takto je triazaalkan tosylován ve vhodné soustavě rozpouštědel za tvorby odpovídajícího tris(N-tosyl) derivátu. Takovýto derivát je podroben působení vhodné zásady za tvorby odpovídajícího aniontu disuSfonamidu. Bis(haloacetamid), například bís(chloracetamid), vicinálního diaminu je připraven reakcí diaminu s nadbytkem haloacetyl halogenidu, například chloracetyl chloridu, v přítomnosti zásady. Anion disulfonamidu tris(N-tosyl)triazaalkanu poté reaguje s bis(chloracetamidem)diaminu za vzniku substituovaného tris(N-tosyl)diamidového makrocyklu. Tosylové skupiny jsou odstrav w »9 • « « 9 9 «9 9

9 9 9 9

9 · · ·

9999 99 99

9

9 9

9999 ·

9 9

99 nény a amidy jsou zredukovány a výsledná sloučenina reaguje s manganatou (II) sloučeninou za v podstatě bezvodých a anaerobních podmínek za tvorby odpovídajícího pentaazacykloalkan manganatého (II) komplexu.

Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu, kde R_1f R'₁₍ R_2l RX jsou odvozeny z výchozí diaminosloučeniny a R₅, R'_5l R₇, R'₇₎ a R₉, R'₉ mohou být H nebo funkční skupiny popsané dříve, mohou být připraveny podle pseudopeptidové metody ukázané ve schématu F uvedeném níže. Substituovaný 1,2-diaminoethan představovaný vzorcem,

H₂N nh₂ kde R₁₍ R\ R₂ a R'₂ jsou substituenty na sousedních uhlíkových atomech ve výsledMiŤrmákrocykličkéřřriiganduJjáirje uvedeno výše, může být použit v této metodě v kombinaci s jakýmikoli aminokyselinami. Diamin může být vyroben jakoukoli běžnou metodou známou odborníkům v dané oblasti. R-skupíny v makrocyklu odvozené od substituentů na a-uhlíku α-aminokyselin, například R_5l R'₅, R₇, R'₇, R₉ a R'₉ mohou být odvozeny od D nebo L forem aminokyselin alaninu, kyseliny asparagové, argininu, asparaginu, cysteinu, glycinu, kyseliny glutamové, glutaminu, histidinu, isoleucinu, leucinu, lysinu, methioninu, prolinu, fenylalaninu, šeřinu, tryptofanu, threoninu, tyrosinu, valinu a/nebo R skupin nepřírodních α-aminokyselin, například alkylu, ethylu, butylu, terc.butylu, cykloalkylu, fenylu, alkenylu, allylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, polycykloalkylu, polycykloarylu, polycykloheteroarylu, iminú, aminoalkylu, hydroxyalkylu, hydroxylu, fenolu, aminoxidů, thioalkylu, karboalkoxyalkylu, karboxylových kyselin a jejich derivátů, keto, etheru, aldehydu, aminu, nitrilu, halo, thiolu, sulfoxidu, sulfonu, sulfonových kyselin, sulfidu, disulfidu, fosfonových kyselin, fosfinových kyselin, fosfinoxidů, sulfonamidů, amidů, aminokyselin, peptidů, bílkovin, sacharidů, nukleových kyselin, mastných kyselin, lipidů, nitro, hydroxylaminů, hydroxamových kyselin, thiokarbonylů, boritanů, boranů, boraza, silylu, siloxy, silaza, a jejich kombinací. Pro příklad 1,8-dihydroxy4,5-diaminooktan je monotosylován a reaguje s Boc anhydridem za dosažení diferencovaného N-Boc, N-tosyl derivátu. Sulfonamid byl alkylován methylbromacetátem za užití hydridu sodného jako zásady a zmýdelněn na volnou kyselinu. Diamin obsahující *9

99 999 • 9 9 9 9 9 *

9 9 · 9 9 9 9 999 • 9 «V* 99999* 9999 9 • 99999 999 ••«*99 99 9 ·· ·*

N-tosylglycin slouží jako náhrada dipeptidu při standardní peptidové syntéze ve vodné fázi. Takto je spojením s esterem aminokyseliny s různými funkčními skupinami dosaženo odpovídajícího pseudo-tripeptidu. Dvě následující TFA štěpení a navázání dosáhnou pseudo-pentapeptidu, který může být zbaven chránění N- a C- konce v jednom kroku za užití HCI/AcOH. Cyklizací zprostředkovanou DPPA následovanou redukcí L1AIH4 nebo boranem se dosáhne odpovídajícího makrocyklického ligandu. Tento ligandový systém reaguje s manganatou (II) sloučeninou, například s chloridem manganatým, za nezbytně anaerobních podmínek za tvorby odpovídajícího funkcionalizovaného pentaazacykloalkan manganatého (II) komplexu. Pokud jsou ligandy nebo náboj neutralizující anionty, například X, Y a Z, anionty nebo ligandy, které nemohou být zavedeny přímo ze sloučeniny manganu, komplex s těmito anionty nebo ligandy může být vytvořen provedením výměnné reakce s komplexem, který byl připraven reakcí makrocyklu se_sLQučeninou.manganu. ——— -— --— . Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu, kde Ri, R\ R3, R^RšTRITRtTR tT^šTR’9 mohou být H nebo jakákoli funkční skupina výše popsaná, mohou být připraveny podle obecné peptidové metody ukázané ve schématu G uvedeném níže. R skupiny v makrocyklu odvozené od substituentů na α-uhlíku aaminokyselin, například R₁₍ R'_b R3, R'₃₎ R₅, R's, R7, R\ Rg a R'₉, jsou definovány výše ve schématu F. Postupy přípravy prekursorů cyklických peptidů z odpovídajících lineárních peptidů jsou stejné nebo významné modifikace metod známých ve stavu techniky. Viz například, Veber, D.F. a kol., J. Org. Chem., 44, 3101 (1979). Obecná metoda naznačená ve schématu G níže je příkladem využívajícím sekvenční přípravy funkcionalizovaného lineárního pentapeptidu z N-konce nebo C-konce v kapalné fázi. Případně může být reakční sekvence přípravy lineárního pentapeptidu prováděna za využití metod přípravy v pevné fázi známých ve stavu techniky. Reakční sekvence může být prováděna z C-konce k N-konci a odlišnými přístupy jako například připojováním di- a tri-peptidů podle potřeby. Takto je Boc-chráněná aminokyselina spojena s esterem aminokyseliny užitím standardních reagentů pro spojování peptidů. Nový Bocdipeptidový ester je poté zmýdelněn na volnou kyselinu, která je opět připojena k dalšímu esteru aminokyseliny. Výsledný Boc-tripeptidový ester je opět zmýdelněn a metoda pokračuje do té doby, než je připravena Boc-chráněná pentapeptidová volná kyselina. Boc chránící skupina je odstraněna za standardních podmínek a výsledný pentapeptid nebo jeho sůl jsou převedeny na cyklický pentapeptid. Cyklický pentapeptid je ·····« * · * ·«·« ·· ·· · ·· ·· poté zredukován na pentaazacyklopentadekan tetrahydridohlinitanem lithným nebo boranem. Konečný ligand pak reaguje s manganatou (II) sloučeninou za nezbytně anaerobních podmínek za tvorby odpovídajícího pentaazacyklopentadekan manganatého (II) komplexu. Pokud jsou ligandy nebo náboj-neutralizující anionty, např. X, Y a Z, anionty nebo ligandy, které nemohou být zavedeny přímo ze sloučeniny manganu, může být komplex s těmito anionty nebo ligandy vytvořen provedením výměnné reakce s komplexem, který byl připraven reakcí makrocyklu se sloučeninou manganu.

Schéma B

AAA· ·

A AA A » A AAA

A A ·

AAAA AA AA • * * AAA·

A A A A A AAA

AAAA ·

A A A

A A AA

9«

9 9 ·

9 99

99« 9 9

9 9 «9 9«

Schéma A

9« *« · 9 9 »9

9 «

9 9

9999 ♦ >

9* 9 • 9 9

9 9 9 • 9 9··· »

9 «

9

LiAW/THF

T«HN

TsQ/EijN

CHjClj

* · A A A A A

A · · * AAA

A A AAA AAAA ••AA AA AA A

A A 4

A A A

AAAA 4

A A 4

A A A A

Schéma C

A*O

ι.τ»α, ' Na· . pyrttfn _T«-N *

N<

1. KCN. NHLO ^QKlhf

2.NaOC₂H c₂h₉oh ⁵ R.

Na* •Ts

BrCR₂COOCH₃ (trf —Cl

Schéma D • 9 99 9» 9

9 9 9 9 * * • ·· · 9 9 9

9«9 9999

9 9 9 «<

0999 99 99 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9

99

H₂7PtO₂— CHgOH HQ

9 9 9 í 9 9 4

I 9 9 9

9 * 4

9 4

99

9 9 9 zo

9« • 9 I I » ( • 99999

Schéma F • · ·

9

9

9 9 9

9999 99 99 • 9 • A · • · ·« *

• 9

9

I « *9 ♦ 999 9·

99 • 9 9 9 • 9 ·· • * · 9 9

9 9

99

Schéma F (pokračování)

9

Schéma G fy n'.

4« 99

9 9 9

9 ·

9«

9*

9999 9· ·

999 9 • · 9 «4 · • 9 ··

9 9

9 9

99 9 9

9 ·

99

NaOH, HjO CHjOH

EDC-HCI. HOBT, OMF.TEA.RT ethyl-chlorformiát OMF, TEA,0*C

BocM

EDC-HCI. HOBT DMF, TEA. RT ' nebo ethyl-chlorformíat dmf.tea,o°c

—edc-hci, hobt. DMF.TEA.RT nebo ethyl-chlorformiát DMF, TEA, o*c

NaOH, HjO CHjOH

EDC-HCI, HOBT DMF. TEA. RT nebo ethyl-chlorformj^t dmf,tea.o«c • 9

9 9 • 9*99 9

9*9 9

9 9 9 9

9 · 9 9«

9999 9* ·9 9

9 4

9 9 * 9 I » a

9 9 9

Schéma G (pokračování)

/ uah.

/ THF. δ f nebo

BHj. THF

4 4

4 4*

4 · ·4444 4 ♦ 444

4

• 4 ·« 44

Pentaazamakrocykly podle vynálezu mohou mít jeden nebo více uhlíkových atomů a jsou tedy schopny existence ve formě optických izomerů stejně jako ve formě jejich racemických nebo neracemických směsí. Optické izomery mohou být získány rozdělením racemických směsí podle běžných postupů, například vytvářením diastereoisomerních solí působením opticky aktivní kyseliny. Příklady vhodných kyselin jsou vinná, diacetylvinná, dibenzoylvinná, ditoluoylvinná a kafrsulfonová kyselina a pak rozdělení směsi diastereoisomerů krystalizací následovanou uvolněním opticky aktivních zásad z těchto solí. Odlišný postup oddělení optických isomerů zahrnuje užití chirální chromatografické kolony optimálně vybrané pro maximalizaci oddělení enantiomerů. Ještě další použitelná metoda zahrnuje syntézu kovalentních diastereoisomerních molekul reakcí jedné nebo více sekundárních amino skupin sloučenin podle vynálezu s opticky čistou kyselinou v aktivované formě nebo opticky čistým isokyanatanem. Nasyntetízované diastereoisomery mohou být odděleny běžnými prostředky jako chromatografie, destilace, krystalizace nebo sublimace, a pak k získání hydrolyzovány enantiomerně^-čišfého ligandů. Opticky aktivní sloučeniny podle vynálezu mohou být rovněž získány využitím opticky aktivních výchozích látek, jako například aminokyselin.

Sloučeniny a komplexy podle vynálezu jsou nové a mohou být využity k léčbě četných zánětlivých chorobných stavů a poruch. Například, reperfusního poškození ischemického orgánu, například, reperfusního poškození ischemického myokardu, chirurgicky vyvolané ischemie, zánětlivého onemocnění vnitřních orgánů, reumatoidní arthritidy, osteoarthritidy, lupénky, odvrhnutí orgánových transplantátů, poškození vyvolané ozářením, oxidačně vyvolaných poškození a zničení tkání, thrombózy, agregace krevních destiček, mrtvice, akutní pankreatitidy, diabetů melittus závislého na inzulínu, rozšířeného intravaskulárního srážení, tukové embolie, dospělého a infantilního respiračního stresu, metastáze a karcinogeneze.

Aktivita sloučenin nebo komplexů podle vynálezu pro katalýzu dismutace superoxidu může být demonstrována za užití kinetické analýzy metodou zastaveného toku jak je popsáno v Riley, D.P., Rivers, W.J. a Weiss, R.H., „Kinetická analýza metodou zastaveného toku pro sledování rozkladu superoxidu ve vodných soustavách“, Anal. Biochem., 196, 344-349 (1991), který je připojen odkazem na tomto místě. Kinetická analýza metodou zastaveného toku je přesná a přímá metoda pro kvantitativní sledování rychlostí rozkladu superoxidu ve vodě. Kinetická analýza metodou zastaveného toku je vhodná pro screeningové sloučeniny na SOD aktivitu a katalytická aktivita slou4 9 • 4 4 • *

4*4 44*44 4 čenin nebo komplexů podle vynálezu pro dismutací superoxidu, jak je ukázáno analýzou zastaveného toku, má vztah k léčbě výše uvedených chorobných stavů a poruch.

Celková denní dávka podaná hostiteli v jednotlivé nebo v rozdělených dávkách může být v množstvích, například, asi od 1 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně a obvykleji asi 3 až 30 mg/kg. Skladby jednotkové dávky smějí obsahovat taková množství jejich podílů, že tvoří denní dávku.

Množství aktivní složky, která může být kombinována s nosičovými materiály za tvorby jednotlivé dávkové formy, se bude měnit v závislosti na léčeném hostiteli a konkrétním režimu podávání.

Dávkovači dieta pro léčbu chorobných stavů sloučeninami a/nebo kompozicemi podle vynálezu je vybrána ve shodě s řadou faktorů, zahrnující typ, věk, hmotnost, pohlaví, zdravotní stav pacienta, závažnost choroby, cestu podávání, farmakologickó zřetelejakonapríkladaktivitu.účinnost,farmakokinetickéatoxikologicképrofilykonkrétní upotřebené sloučeniny; zdali je využit systém dodávání léků a zdali je sloučenina podáváhajáko součášťkombinace léků?Takto se může aktuálně upotřebená dávkovači dieta široce měnit a tudíž se může odchylovat od výhodné dávkovači diety uvedené výše.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány orálně, parenterálně, inhalačním sprejem, rektálně, nebo místně v jednotkových dávkovačích formách obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans, a vehikula jak je požadováno. Místní podávání může zahrnovat užití transdermálního podávání, jako například transdermálních náplastí nebo iontoforézových zařízení. Termín parenterální, jak je užit na tomto místě, zahrnuje subkutánní injekce, intravenosní, intramuskulární, intrasternální injekce nebo infusní techniky.

Injikovatelné preparáty, například, sterilní injikovatelné vodné nebo olejovitě suspenze mohou být formulovány podle známé techniky za užití vhodných dispergujícich nebo vlhčících činidel. Sterilní injikovatelný preparát může také být sterilní injekční roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, například, jako roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelnými vehikuly a rozpouštědly, která mohou být využita, jsou voda, Ringerův roztok, a ísotonický roztok chloridu sodného. Navíc, sterilní, vázané oleje jsou běžně využívané jako rozpouštědla nebo suspendující média. Pro tento účel může být využit jakýkoli nedráždivý vázaný olej včetně

9

A AA • A · • · · · A A A A • « A A »··· < ♦·♦ ·

AAAAAA · ·

A A A A A A AA · · · · · syntetických mono- nebo diglyceridů. Navíc, mastné kyseliny jako například kyselina olejová nalezly využití v přípravě injektovatelných směsí.

Čípky pro rektální podávání léku mohou být připraveny smíšením léku s vhodným nedráždivým excipientem jako například s kakaovým máslem a polyethylenglykoly, které jsou pevné za běžných teplot, ale kapalné za rektální teploty a tudíž budou v konečníku tát a uvolňovat lék.

Pevné dávkovači formy pro orální podávání mohou zahrnovat kapsle, tablety, pilulky, prášky, granule a gely. V takových pevných dávkovačích formách může být aktivní sloučenina smísena s nejméně jedním inertním ředidlem, jako například se sacharosou, laktosou nebo škrobem. Taková dávkovači forma může také zahrnovat, jako v běžné praxi, doplňkové látky jiné než inertní ředidla, například, lubrikační činidla jako například magnesium-stearát. V případě kapslí, tablet a pilulek, mohou dávkovači formy také obsahovat pufrační činidla. Tabletv_a_pilulkv-mohou-navíc-bvt-připraveny-se střevními povlaky.

—-‘Kapalné”dávkovací^_formy pro orální podávání mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, syrupy a elixíry obsahující inertní diluenty běžně užívané v technice jako například vodu. Takové kompozice mohou také obsahovat adjuvans, jako například vlhčící činidla, emulgující a suspendující činidla, a sladící, aromatická a vonící činidla.

Zatímco sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány jako samostatné aktivní farmaceutické činidlo, mohou být také použity v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami, které jsou známé svým účinkem proti určitému chorobnému stavu, na něhož léčba směřuje.

Sloučeniny nebo komplexy podle vynálezu mohou být také využity jako MRI kontrastní činidla. Diskusi užití kontrastních činidel v MRI je možno nalézt v přihlášce vynálezu č. 08/397,469, která je sem tímto odkazem začleněna.

Uvažované ekvivalenty obecných vzorců uvedených výše pro sloučeniny a deriváty stejně jako pro meziprodukty jsou sloučeniny k tomu jinak odpovídající a se stejnými obecnými vlastnostmi, jako například tautomery sloučenin a kde například jedna nebo více různých R skupin je prostými obměnami substituentů jak je definováno na tomto místě, například kde R je vyšší alkylová skupina než ona uvedená, nebo kde tosylové skupiny jsou odlišné dusík nebo kyslík chránící skupiny nebo kde O-tosyl je halogenid. Anionty s nábojem jiným než 1, například uhličitan, fosforečnan a hydrogenfosforečnan, mohou být užity místo aniontú s nábojem 1, pokud neovlivňují nepříznivě celkovou aktivitu komplexu. Nicméně, užití aniontů s nábojem jiným než 1 bude mít za následek mírnou modifikaci obecného vzorce (I) pro komplex uvedený výše. Navíc, kde je substituent označen jako, nebo může být, vodík, přesná chemická podstata substítuentu, který je jiný než vodík v této pozici, například uhlovodíkový zbytek nebo halogen, hydroxy, amino a podobné funkční skupiny, není rozhodující, pokud neovlivňuje nepříznivě celkovou aktivitu a/nebo postup syntézy. Dále je uvažováno to, že manganité (III) komplexy budou ekvivalentní předmětným manganatým (II) komplexům.

Chemické reakce popsané výše jsou obecně uvedeny ve známost v pojmech jejich nejširší aplikace pro přípravu sloučenin podle vynálezu. Příležitostně, reakce nemohou být použitelné jak je popsáno ke každé sloučenině obsažené v šíři zveřejnění. Sloučeniny, pro které toto platí, budou odborníky z dané oblasti snadno rozpoznány. Ve všech těchto případech. mohou být reakce také úspěšně provedeny běžnými modifikacemi, které jsou odborníku v dané oblasti známé, například, vhodnou ochranou -interferujících-skupinrzméňouYŤa^iltémativňrběžná činidla, rutinní modifikací reakčních podmínek, a tak podobně, nebo jinými reakcemi uvedenými ve známost na tomto místě nebo jinak běžnými metodami, budou použitelné pro přípravu odpovídajících sloučenin podle vynálezu. U všech preparačních postupů jsou všechny výchozí látky známy nebo je možno tyto látky snadno připravit ze známých výchozích látek.

Bez dalšího rozpracování věříme, že odborník v dané oblasti může, za použití předchozích popisů, využít vynález v jeho plném rozsahu. Následující výhodná specifická provedení by, tudíž, měla být chápána jako pouze ilustrativní a jakkoliv neomezující zbytek popisu.

Příklady provedení vynálezu

Všechny reagenty byly užity tak, jak byly získány, bez purifikace pokud není uvedeno jinak. Všechna NMR spektra byla získána na spektrometru nukleární magnetické resonance Varian VXR-300 nebo VXR-4Ó0. Kvalitativní a kvantitativní hmotnostní spektroskopie probíhala na Finiganu MAT90, Finiganu 4500 a VG40-250T s použitím m-nitrobenzylalkoholu (NBA), m-nitrobenzylalkoholu / LiCI (NBA - Li). Teploty tání jsou nekorigované.

• · «9 « * · 0 ·’ • 9

9 9 • ·

4

Následující zkratky vztahující se k aminokyselinám a jejich chránícím skupinám jsou ve shodě s doporučením IUPAC-IUB Komise pro biochemickou nomenklaturu (Biochemistry 1972, 11,1726) a s běžným užíváním.

Ala	L-alanin
DAla	D-alanin
Gly	glycin
Ser	serin
DSer	D-serín
Bzl	benzyl
Boc	terc.butoxykarbonyl
Et	ethyl
TFA	trifluoroctová kvselina
DMF	dimethylformamid
HOBTíH2O	1-hydroxy-(íH)-benzotriazol mohohydrát
EDOHCI	1-{3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochlorid
TEA	triethylamin
DMSO	dimethylsulfoxid
THF	tetrahydrofuran
DPPA	difenylfosforylazid

♦Zkratka Cyc zastupuje 1,2-cyklohexandiamin (stereochemie, například R,R nebo S,S, je indikována jako taková). Toto umožňuje třípísmennému kódu peptidové nomenklatury užití u pseudopeptidů obsahujících 1,2-cyklohexandiaminový „zbytek“.

Příklad 1

A. Syntéza N-(p-toluensulfonyl)-(R,R)-1,2-diaminocyklohexanu

K míchanému roztoku (R,R)-1,2-diaminocyklohexanu (300 g, 2,63 mol) v CH₂CI₂ (5,00 I) při -10 °C byl přidán roztok p-toluensulfonylchloridu (209 g, 1,10 mol) v CH₂CI₂ (5,00 I) po kapkách za 7 h periodu, při udržování teploty -5°C až -10 °C. Směs byla ponechána, aby se ohřála na pokojovou teplotu, zatímco se přes noc míchala. Směs byla vakuově zakoncentrována na objem 3 I a bílá pevná látka byla odstraněna filtrací. Roztok byl poté promyt H₂O (10x1 I) a sušen nad MgSO₄. Odstranění rozpouštědla ve • 9 99* 999··« 9 9 9 9

999999 · • 999 99 99 * 9« «9 vakuu dalo 286 g (97,5 % výtěžek) produktu ve formě žluté krystalické pevné látky: ¹H NMR (CDCb) δ 0,98 - 1,27 (m, 4 H), 1,54 -1,66 (m, 2 H), 1,81 - 1,93 (m, 2 H), 2,34 (dt, J = 4,0, 10,7 Hz, 1 H), 2,42 (s, 3 H), 2,62 (dt, J = 4,2, 9,9 Hz, 1 H), 7,29 (d, J = 8,1 Hz, 2 H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); MS (LRFAB - DTT- DTE) m/z 269 [M + H]⁺

B. Syntéza N-(p-toluensulfonyl)-N'-(Boc)-(R,R)-1,2-díaminocyklohexanu

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl)-(R,R)-1,2-diaminocyklohexanu připraveného jako v příkladu 1A (265 g, 0,955 mol) v THF (1,15 I) byl přidán 1 M vodný roztok NaOH (1,15 I, 1,15 mol). Di-t-butyldikarbonát (229 g, 1,05 mol) byl poté přidán a výsledná směs byla míchána přes noc. Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla adjustována na pH 2 pomocí 1 M HCI a nasycena NaCI. Vodný roztok byl poté extrahován CH₂CI₂ (2 x 500 ml) a extrakty a THF vrstva byly spojeny a sušeny nad MgSO₄. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, což dalo žíutou pevnou látku. Surový produkt byl purifikován krystalizací ze směsi THF-ether-hexany, což dalo 310 g (88,1% výtěžek) produktujakcTbílěkrystálicke pevné látky: teplota tání: 137°C -139 °C; ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,04 -1,28 (m, 4 H), 1,44 (s, 9 H), 1,61 -1,69 (m, 2 H), 1,94 - 2,01 (m, 2 H), 2,43 (s, 3 H), 2,86 (brs, 1 H), 3,30 (br d, J = 9,6 Hz, 1 H), 4,37 (br d, J = 6,7 Hz, 1 H) 5,48 (br d, J = 4,6 Hz, 1 H), 7,27 (d, J = 9,7 Hz, 2 H), 7,73 (d, J = 8,1 Hz, 2 H); MS (LRFAB, NBA Li) m/z 375 [M + Lif.

C. Synthéza Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-gly-OMe

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl)-N'-(Boc)-(R,R)-1,2-diamino cyklohexanu připravenému jako v příkladu 1B (310 g, 0,841 mol) v bezvodém DMF (3,11 I) při 0 °C byl po dávkách přidáván NaH (37,4 g - 60 % v oleji, 0,934 mol) a výsledná směs byla míchána po dobu 30 minut. Methyl-bromacetát (142 g, 0,925 mol) byl poté 45 minut přidáván po kapkách a směs byla ponechána ohřátí na pokojovou teplotu během míchání přes noc. Po míchání po dobu 17 h bylo vakuem odstraněno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (3 I) a H₂O (1 I). Ethylacetatový roztok byl promyt nasyceným NaHCO₃ (1 I), nasyceným NaCI (500 mt) a byl sušen nad MgSO₄. Rozpouštědlo bylo odstraněno vakuem a výsledný olej byl rozpuštěn v etheru. Krystalizace přídavkem hexanů dala 364 g (98 % výtěžek) produktu (TLC (98:2) CHCI₃MeOH/silikagel/UV detekce) ukázala, že produkt obsahoval asi 5% výchozího materiálu) ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání čistého vzorku 151 je -2 °C; ¹H NMR

9 4 · *44 4*44

444 4 4 4 · « 444

4 4 4« 4 4 949 4 4**4 * *4**·· 449 • 444 44 44 4 44 44 (CDCh) δ 1,11 -1,22 (m,4H), 1,45 (s,9H), 1,64-1,70 (m, 3 H), 2,16 - 2,19 (m, 1 H), 2,43 (s, 3 H), 3,34 - 3,40 (m, 2 H), 3,68 (s, 3 H), 4,06 (ABq, J = 18,5 Hz, Δυ =155 Hz, 2 H), 4,77 (br s, 1 H), 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,82 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); MS (LRFAB, DTT - DTE) m/z 441 [M + Hf

D. Syntéza Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-OH

K míchanému roztoku znečištěného Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-OMe připraveného jako v příkladu 1C (217 g, 0,492 mol) v MeOH (1,05 I) byl pomalu přidán 2,5 M vodný roztok NaOH (295 ml, 0,737 mol) a výsledný roztok byl míchán po dobu 2 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno vakuem a zbytek byl rozpuštěn ve vodě (1,5 I). Roztok byl zfiltrován, aby došlo k odstranění malého množství pevné látky, a promyt etherem (7 X 1 I) pro odstranění nečistoty (sloučenina 1B), která po sušení spojených promytí nad MgSO₄ a odstranění rozpouštědla vakuem dospěla ke zpětnému výtěžku 8,37 g. Vodný roztok byl poté adjustován na pH 2 pomocí 1 M HCI a produkt byl extrahován ethylacetatem (3 x 1 I). Extrakty byly spojeny, promyty nasyceným NaCI (500 ml) a sušeny nad MgSO₄. Rozpouštědlo bylo odstraněno vakuem a zbylý ethylacetát byl odstraněn spoluodpařením s etherem (500 ml) a pak CH₂CI₂ (500 ml), což dalo 205 g (97,6 % výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,15 -1,22 (m, 4 H), 1,48 (s, 9 H), 1,55 -1,68 (m, 3 H), 2,12 - 2,15 (m, 1 H), 2,43 (s, 3 H), 3,41 - 3,49 (m, 2 H), 3,97 (ABq,

J = 17,9 Hz, Δυ = 69,6 Hz, 2 H), 4,79 (br s, 1 H), 7,31 (d, J = 8,1 Hz, 2 H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 8,81 (br s, 1 H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z 433 [M + Li]⁺.

E. Syntéza Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-Gly-OEt

K Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-OH (18,1 g, 43,1 mmof) v DMF (480 ml) byly přidány HOBt<H₂O (7,92 g, 51,7 mmol) a EDOHCI (9,91 g, 51,7 mmol) a výsledná směs byla míchána po dobu 20 min při teplotě místnosti. K tomuto roztoku byly přidány GlyOEt»HCI (6,0 g, 43,1 mmol) a TEA (7,2 ml, 51,7 mmol) a výsledná směs byla poté mí, chána po dobu 16 hodin. DMF byl odpařen a zbytek byl rozdělen mezi vodu (250 ml) a EtOAc (400ml). EtOAc vrstva byla oddělena a promyta 1 M KHSO₄ (250 ml), vodou (250 ml), nasyceným NaHCO₃ (250 ml) a slanou vodou (250 ml) a sušena (Na₂SO₄). Filtrace a zakoncentrování poskytly 21,9 g (99 % výtěžek) čistého produktu ve formě bílé pěny:¹H NMR (DMSO-d_e) δ 1,00 -1,10 (m, 1 H), 1,19 (t, J = 7,6 Hz, 3 H), 1,38 (s, 9 H), 1,50 -1,56 (m, 3 H), 1,75 -1,84 (m, 1 H), 2,38 (s, 3 H), 3,30 - 3,40 (bs, 2 H), 3,75 35 • * • ♦♦

4 4 4

4·· « 4444 4

4 4

44 44

4,01 (komplexní m, 4 H), 4,08 (q, J = 7,6 Hz, 2 H), 6,05 (bs, 1 H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,77 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 8,32 (t, J = 7,2 Hz, 1 H); MS (HRFAB) m/z 518,2551 (M + Lif; 518,2512 vypočteno pro C24H37N3O7SLÍ.

F. Syntéza Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt TFA soli

K roztoku Boc-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt (21,2 g, 41,4 mmol) v CH₂CI₂ (180 mi) byla přidána TFA (44 ml) a výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Roztok byl zakoncentrován a zbytek byl rozpuštěn v etheru (50 ml) a srážen hexanem (500 ml). Rozpouštědla byla dekantována a zbytek byl promyt hexanem/etherem 10:1 (500 ml). Konečný zbytek byl důkladně sušen při vysokém vakuu za poskytnutí 20,7 g (95 % výtěžek) produktu ve formě žlutohnědé pěny: ¹H NMR (DMSOde) δ 0,85 - 0,96 (m, 1 H), 1,03 -1,31 (komplexní m, 7 H), 1,09 (t, J = 7,6 Hz, 3 H), 2,00 .(m,_1 H),_2,39_(s,_3_H)_l_3,02_(bs,J_H)_l_3,62^(m,JH),-3,82---4₇05-(m_r4-H)_r4_r10-(qH-= 7,6 Hz, 2 H), 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,67 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 8,25 (bs, 3 H), 9,09 (t, J = 5;637rH)rMS (HRFABpn/z 418,1990 (Μ -Ύ^+Τϊ)Τ418,1988 vypočteno pro CigH^NaOsS.

G. Syntéza Boc-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt

K Boc-Orn(Z)-OH (8,37 g, 22,8 mmol) v DMF (200 ml) byly přidány HOBt«H₂O (4,29 g, 27,4 mmol) a EDOHCI (5,25 g, 27,4 mmol) a výsledný roztok byl míchán po dobu 20 minut při teplotě místnosti. K tomuto roztoku byla přidána Cyc(Ts)-Gly-GlyOEt TFA sůl (12,0 g, 22,8 mmol) a TEA (3,82 ml, 27,4 mmol) a v míchání bylo odtud pokračováno po dobu 16 hodin. DMF byl odpařen a zbytek byl rozdělen mezi vodu (200 ml) a EtOAc (250 ml). Vrstva EtOAc byla oddělena a promyta 1 M KHSO₄ (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným NaHCO₃ (150 ml) a solankou (150 mi) a sušena (MgSO₄). Filtrace a zakoncentrování poskytly 15,1 g (87 % výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO-d_e) δ 1,00 - 1,94 (komplexní m, 12 H), 1,15 (t, J = 7,4 Hz, 3 H), 2,38 (s, 3 H), 2,98 (bs, 2 H), 3,30 - 3,46 (m, 2 H), 3,70 - 3,82 (m, 4 H), 3,90 - 4,02 (m, 1 H), 4,05 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 6,43 (m, 1 H), 7,17 (m, 1 H), 7,20 - 7,37 (m, 8 H), 7,78 (m, 2 H), 8,30 (bs, 1 H); MS (LRFAB, NBA + HCI) m/z 760 (M + Hf.

A A AA • A A • A A A • A A

AAAA AA

AA · ♦ *

A A AA

A A A A A A A A • A A • A AA

H. Syntéza Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt TFA soli

K roztoku Boc-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt (14,5 g, 19,1 mmol) v CH₂CI₂ (120 ml) byla přidána TFA (30 ml) a výsledný roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Roztok byl odpařen a zbytek byl rozetřen s etherem (100 ml). Ether byl dekantován a zbytek byl důkladně sušen při vysokém vakuu za poskytnutí 15,5 g (>100 % výtěžek, obsahuje TFA) produktu ve formě oranžové pěny: ¹K NMR (DMSO-d₆) δ 0,97 I, 93 (komplexní M, 12 H), 1,16 (t, J = 7,4 Hz, 3 H), 2,38 (s, 3 H), 2,98 (bs, 2 H), 3,31 3,50 (m, 2 H), 3,71 - 3,91 (m, 4 H), 3,97 - 4,04 (m, 1 H), 4,08 (q, J = 7,4 Hz, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 7,23 - 7,39 (m, 8 H), 7,77 - 7,81 (m, 2 H), 8,18 (bs, 3 H), 8,41 (bs, 1 H); MS (LRFAB, NBA + HCI) m/z 660 (M - TFA)⁺.

I. syntéza Boc-Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt „—K roztoku Boc-Gly-OH (3,36 g, 19,2 mmol) v DMF (2320 ml) bylypřidány HOBt»H₂O (3,52 g, 23,0 mmol) a EDOHCI (4,41 g, 23_s0 mmol) a výsledný roztok byl míchán po dobu 20 minut při teplotě místnosti. K tomuto roztoku byla přidána Orn(Z)Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt TFA sul (14,8 g, 19,2 mmol) a TEA (3,20 ml, 23,0 mmol) a míchání poté pokračovalo po dobu 12 hodin. DMF byl odpařen a zbytek byl rozdělen mezi vodu (200 ml) a EtOAc (350 ml). Vrstvy byly odděleny a vrstva EtOAc byla promyta 1 M KHSO4 (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným NaHCO₃ (150 ml) a slanou vodou (150 ml) a sušena (MgSCM. Filtrace a zakoncentrování poskytly 13,7 g (87 % výtěžek) produktu ve formě bílé pěny; ’H NMR (DMSO-d_e) δ 0,96 -1,10 (m, 2 H), 1,17 (t, J = 7,4 Hz, 3 H), 1,38 (s, 9 H), 1,35 - 2,00 (komplexní m, 10 H), 2,97 (m, 2 H), 3,60 (bs, 2 H), 3,67 3,84 (m, 4 H), 3,93 - 4,03 (m, 3 H), 4,06 (q, J = 7,4 Hz, 2 H), 6,92 (bs, 1 H), 7,19 (m, 1 H), 7,24 - 7,37 (m, 7 H), 7,60 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,76 (m, 2 H), 7,38 (bs, 1 H). MS (LRFAB, NBA + Li)⁺ m/z 823 (M+Li)⁺.

J. Syntéza Boc-Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OH

K roztoku Boc-Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt (13,3 g, 16,3 mmol) v methanolu (100 ml) byl přidán 1 M NaOH (25 ml). Výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti a sledována pomocí TLC. Po 2 hodinách byla reakce dokončena. Methanol byl odpařen a ke zbytku byla přidána voda (50 ml). Tato vodná fáze byla promyta EtOAc (2 x 100 ml) a EtOAc vrstvy byly odstraněny. pH bylo sníženo na 3,5 1 M KHSO4 a vodná fáze byla extrahována EtOAc (3 x 100 mi). Spojené EtOAc vrstvy byly sušeny (MgSO₄), »

*«

4 4 · · • 4 · 4 4

4 4 » 4 44444«

4 4 4 *4

4444 44 44 « filtrovány a zakoncentrovány za poskytnutí 11,7 g (91 % výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ’H NMR (CDCb) δ 0,98 -1,25 (m, 2H), 1,38 (s, 9 H), 1,40 - 1,92 (m, 10 H), 2,38 (s, 3 H), 2,97 (m, 2 H), 3,62 (bs, 2 H), 3,75 - 3,85 (m, 3 H), 3,95 - 4,05 (m, 2 H), 5,01 (s, 2 H), 6,96 (bs, 1 H), 7,28 (m, 1 H), 7,25 - 7,38 (m, 7 H), 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,78 (m, 2 H), 8,25 (bs, 1 H).

K. Syntéza Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OH TFA soli

K roztoku Boc-Gly-Orn{Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OH (11,2 g, 14,3 mmol) v CH₂CI₂ (100ml) byla přidána TFA (24 ml) a výsledný roztok byl míchán po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Roztok byl zakoncentrován a rozetřen s ethyletherem (500 ml). Filtrace poskytla 11,3 g (99 % výtěžek) produktu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSOde) δ 0,95 -1,98 (komplexní m, 12 H), 2,39 (s, 3 H), 3,01 (m, 2 H), 3,38 (m, 1 H), 3,65 4,10 (komplexní m, 7 H), 4,18 (q, J =2,4Hz, JLH),. .5, .02_(s^2_H),-7., 24^-7,-40-(m,-9 ~H-)_r 7,77 - 7,85 (m, 2 H), 8,13 (bs, 3 H), 8,31 (bs, 1 H), 8,42 (d, J = 8,3 Hz,1 H); MS (HRFAB)’689;2953(M-TFA)⁺;^_689;2969^_výpoČtěhopřo’C^H^N609S~ “

L. Syntéza cyWo-(Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-)

Na roztok Gly-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OH TFA soli (5,0 g, 6,23 mmol) v suchém odplyněném DMF (1520 ml) bylo působeno TEA (1,74 ml, 12,5 mmol) a roztok byl ochlazen na -40 ’C. V průběhu 10 minut byl po kapkách přidáván DPPA (1,64 ml, 7,60 mmol) a reakce byla poté míchána při -40 °C po dobu 3 h. Po uplynutí této doby byla reakce umístěna do lázně o teplotě -2 °C a od té doby ponechána stát při této teplotě 16 h. Byla přidána voda (1520 ml) a výsledný roztok byl míchán se směsnou ionexovou náplní (750 g) po dobu 6 hodin při teplotě místnosti. Pryskyřice byla poté zfiltrována a roztok byl zakoncentrován na objem asi 100 ml (DMF). Po přidáni ethyletheru (500 ml) se vytvořil pevný zbytek, který byl opětně rozpuštěn v methanolu (100 ml) a znovu vysrážen přidáním ethyletheru (500 ml). Filtrace dala 3,26 g (78 % výtěžek) produktu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (CDCI₃) δ 0,96 - 2,10 (komplexní m, 14 H), 2,37 (bs, 3 H), 2,68-3,05 (m, 3 H), 3,42-3,90 (komplexní m, 8 H), 4,1.4 (m, 1 H), 4,20 (m, 1 H), 4,97 5,08 (m, 3 H), 6,42 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,19 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,20 - 7,39 (m, 7 H), 7,65 - 7,78 (m, 2 H), 9,15 (bs, 1 H), 9,22 (bs, 1 H); MS (HRFAB) m/z 671,2842 (M + H)⁺; 671,2863 vypočteno pro C^H^NeOsS.

φ» «9 99 *· *

ΦΦΦΦ φφφ » · · φφφ 9 9 · * φΦ* • » φφ· ΦΦΦΦΦ Φ ΦΦΦΦ φφφ»·· ♦·

ΦΦΦΦ 99 «9 9 999

Μ. Syntéza cyWo-(Gly-Om-Cyc(Ts)-Gly-Gly-)

Κ roztoku cyWo-(Gly-Om(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-) (3,94 g, 5,90 mmol) v methanolu (40 ml) bylo přidáno Pd (černé) (1,0 g) a mravenčan amonný (2,0 g). Reakce byla zahřívána pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin a poté se nechala ochladit. Směs byla zfiltrována pod argonem přes celitovou vrstvu a filtrát byl zakoncentrován za poskytnutí 2,86 g (89 % výtěžek) produktu ve formě bílé pény^JH NMR (DMSO-d_e) δ 0,94 - 2,22 (komplexní m, 12 H), 2,39 (s, 3 H), 2,55 - 2,95 (m, 7 H), 3,42 - 3,89 (komplexní m , 9 H), 4,11 (m, 1 H), 4,39 (m, 1 H), 6,43 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,27 (d, J = 9,3 Hz, 1 H), 7,25 - 7,45 (m, 2 H), 7,64 - 7,80 (m, 2 H), 9,12 - 9,29 (m, 2 H); MS (HRFAB) m/z 537,2511 (M + H)⁺; 537,2495 vypočteno pro C^H^NeSOg.

N. Syntéza cy/r/o-(Gly-Om(lithocholyl)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-)

K roztoku cyWo-(Gly-Om-Cyc(Ts)-Gly-Gly-) (1,0 g.1,9 mmol) v CHCl3 (25 ml) byl přidán NHS aktivní ester lithocholové kyseliny (881 mg, 1,9 mmol) a výsledná směs poté-byla-míchána-po-dobu-16-hodinrPo-přidání-ethyletheru-(50ml)-se'vytvořila3Sevha látka. Filtrace dala 946 mg (56 % výtěžek) produktu ve formě žlutohnědého prášku: ¹H NMR (CD3OD) δ 0,66 (m, 3 H), 0,93 (bs, 6 h), 0,94 - 2,37 (komplexní m,’48 H), 2,43 (s, 3 H), 2,80 - 4,60 (bm, 14 H), 7,39 (bs, 2 H), 7,80 (bs, 2 H); MS (HRFAB) m/z 895,5432 (M + H)⁺; 895,5367 vypočteno pro C4eH75N6O₈S.

O. Syntéza 2,3-(R,Ř)-cyklohexano-6-(S)-{3-(lithochoiylamino)propyl}-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekanu

K suspenzi cy/r/o-(Gly-Om(lithochoíyl)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-) (2,70 g, 3,00 mmol) v THF (50 ml) byl přidán tetrahydrídohlinitan lithný (51,0 ml 1,0 M roztoku). Výsledná směs byla poté zahřívána pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Reakční směs byla chlazena asi na -20 °C a prudce ochlazena (opatrně) 5 % Na₂SO₄ (30 ml) a následně methanolem (30,ml). Tento roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a zakoncentrován na suchý prášek. Prášek byl rozetřen s ethyletherem (3 x 200 ml) a zfiltrován. Ether byl zakoncentrován a olej byl rekrystalován z acetonitrilu za poskytnutí 800 mg (40 % výtěžek) produktu ve formě bezbarvého oleje: ¹H NMR (C6D6) δ 0,64 (s, 3 H), 0,67 (s, 3 H), 0,88 (d, J = 3,0 Hz, 3 H), 0,84 - 2,61 (komplexní m, 52 H), 2,38 - 2,95 (komplexní m, 14 H), 3,49 (m, 3 H); ¹³C NMR (CDCI3) δ 71,4; 63,1; 62,6; 61,8; 58,2; 56,5; 56,1; 51,5; 50,4; 50,1; 48,3; 47,9; 46,1; 45,7; 42,6; 42,1; 40,4; 40,1;

99 99 9 > 9 9 9 · 9 9

99 · 999

9 9 9 9 9 9 99

9· 99 9 • 999 99 >9 9 • 9 99

9 9 9 • · 99

9 9 9 9

9 9

9» 99

36,4; 35,8; 35,7; 35,6; 35,4; 34,5; 31,9; 31,7; 31,6; 30,8; 30,5; 29,4; 28,3; 27,2; 26,4; 26,2; 24,9; 24,2; 23,4; 20,8; 18,6; 12,0; MS (LRFAB), NBA + Li) m/z 677 (M + Li)*.

P. Syntéza dichloro-2,3-(R,R)-cyklohexano-6-(S)-{3-(lithocholylamino)-propyl}1,4,7,10,13-penta-azacyklopentadekan manganatého komplexu

2,3-(R,R)-cyklohexano-6-(S)-(3-(lithocholylamÍno)propyl}-1,4,7,10,13pentaazacyklopentadekan připravený jako v příkladě 10 {547 mg, 0,817 mmol) byl přidán k horkému bezvodému methanolu (50 ml) obsahujícímu chlorid manganatý (103 mg, 0,818 mmol) pod atmosférou suchého dusíku. Po zahřívání pod zpětným chladičem po dobu 2 h byl roztok přiveden do sucha a zbytek byl rozpuštěn ve směsi rozpouštědel THF (35 ml) a ethyletheru (5 ml) a zfiltrován přes celitovou vrstvu. Zakoncentrování a rozetření s ethyletherem poskytly po filtraci 512 mg (79 % výtěžek) komplexu ve formě bílé pevné látky: FAB hmotové spektrum (NBA) m/z 760 [M-Clf; Anal. vypočteno pro C^H/gNeOMnC^: C, 61,79; H, 9,87; N, 10,55; Cl, 8,90. Zjištěno: C, 62,67^,9,84.-24,,8,04^01,,8,29. _---·--Příklad 2

Kinetická analýza metodou zastaveného toku

Kinetická analýza metodou zastaveného toku byla využita pro zjištění, zda sloučenina může katalyzovat dísmutaci superoxidu (Riley, D.P., Rivers, W.J. a Weiss, R.H., „Kinetická analýza metodou zastaveného toku pro sledování rozkladu superoxidu ve vodných soustavách“, Anal. Biochem., 196, 344-349 [1991]). Pro dosažení správných a přesných měření byly všechny reagenty biologicky čisté a bez obsahu kovů. Aby toho bylo dosaženo, všechny pufry (Calbiochem) byly biologicky čisté, bez obsahu kovů a bylo s nimi manipulováno nástroji, které byly nejprve umyty 0,1 M HCI, následně přečištěnou vodou, poté opláchnuty v 10⁴ M EDTA lázni při pH 8, dále opláchnuty v přečištěné vodě a sušeny při 65 °C po několik hodin. Suché DMSO roztoky superoxidu draselného (Aldrich) byly připraveny pod suchou, inertní atmosférou argonu v suché rukavicové skříni s vakuovou atmosférou s použitím sušeného skleněného nádobí. DMSO roztoky byly připraveny bezprostředně před každým experimentem s využitím metody zastaveného toku. K rozdrcení žlutého pevného superoxidu draselného (asi 100 mg) byl používán moždíř a palička. Prášek byl pak rozmělněn s několika kapkami DMSO a kaše byla převedena do baňky obsahující dalších 25 ml DMSO. Výsledná kaše byla míchána 1/2 hodiny a pak zfiltrována. Tento postup dával reprodukovatelně asi 2 mM koncentrace superoxidu v DMSO. Tyto roztoky byly převedeny do rukavicového pytle pod dusíkem v utěsněných lahvičkách před naplněním injekční stříkačky pod dusíkem. Je nutno poznamenat, že roztoky DMSO/superoxidu jsou velmi citlivé k vodě, teplu, vzduchu, a ke kovům. Čerstvý, čistý roztok má mírný žlutavý nádech.

Voda pro roztoky pufrů byla dodána z vlastního systému pro deionizovanou vodu k vodnímu systému Bamstead Nanopure Ultrapure Senes 550 a pak dvojnásobně destilována, nejprve ze zásaditého manganistanu draselného a poté ze zředěného roztoku EDTA. Například, roztok obsahující 1,0 g manganistanu draselného, 2 litry vody a navíc hydroxid sodný nezbytný pro úpravu pH na 9,0 byl přidán do odpovídající 2-litrové baňky s destilačním nástavcem. Tato destilace zoxiduje jakékoli stopy organických sloučenin ve vodě. Závěrečná destilace byla provedena pod dusíkem ve 2,5-litrové baňce obsahující 1500 ml vody z první destilace a 1,0 x10⁶ MEDTA.Tento krok odstraní zbývající stopykovů z ultračisté vody. Aby se zabránilo zakalení EDTA z těkání přes refluxníj^niénkp_do_de.stilačního-nástavce_r40-cm-vertikálnrramé'nko'Býló naplněno skleněnými kuličkami a obaleno izolací. Tento systém vyrábí vodu zbavenou kyslíku, u které může být naměřena vodivost menší než 2,0 nanosiemens/cm².

Systém spektrometru se zastaveným tokem byl zkonstruován a vyroben firmou Kinetic Instruments lne. (Ann Arbor, Ml) a byl připojen k osobnímu počítači MAC IICX. Programové vybavení pro analýzu metodou zastaveného toku bylo poskytnuto firmou Kinetic Instruments lne. a bylo napsáno v jazyce QuickBasic s ovladači MacAdios. Typické vstřikovací objemy (0,10 ml pufru a 0,006 ml DMSO) byly kalibrovány tak, že byly dohromady smíchány velký přebytek vody s DMSO. Účinný poměr byl přibližné 19/1, takže počáteční koncentrace superoxidu ve vodném roztoku byla v rozmezí 60 až 120 μΜ. Vzhledem k tomu, že publikovaný extinkční koeficient superoxidu v H₂O při 245 nm je asi 2250 M*¹ cm'¹ (1), bylo by možno očekávat počáteční hodnotu absorbance přibližně 0,3 až 0,5 pro celu s délkou dráhy 2 cm, a toto bylo experimentálně pozorováno. Vodné roztoky určené k míšení s DMSO roztoky superoxidu byly připraveny s použitím 80 mM koncentrací Hepes pufru, pH 8,1 (volná kyselina + Na forma). Jedna z nádržkových stříkaček byla naplněna 5 ml roztoku DMSO, zatímco další byla naplněna 5 ml vodného roztoku pufru. Úplný vstřikovací blok, směšovací zařízení, a cela spektrofotometru byly ponořeny do termostatované cirkulující vodní lázně s teplotou 21,0 ± 0,5 °C.

Před započetím shromažďování dat pro rozklad superoxidu byla získána průměrná základní linie nástřikem několika dávek pufru a DMSO roztoků do směšovací komory. Tyto dávka byly zprúměrovány a uloženy jako základní linie. První dávky shromážděné v průběhu série běhů byly s vodnými roztoky, které neobsahovaly katalyzátor. Toto zajišťuje, aby každá serie pokusů byla bez kontaminace schopné vytvářet pro superoxid rozkladové profily prvního řádu. Jestliže rozklady pozorované po několik nástřiků roztoku pufru byly druhého řádu, mohly být užity roztoky manganatých (II) komplexů. Obvykle byl potenciální SOD katalyzátor sledován v širokém rozmezí koncentrací. Vzhledem k tomu, že počáteční koncentrace superoxidu po smíšení DMSO s vodným pufrem byla asi 1,2 x 10⁴ M, chtěli jsme použít koncentraci manganatého (II) komplexu, která je aspoň 20 krát nižší než koncentrace substrátového superoxidu. Dále jsme obvykle sledovali sloučeniny na SOD aktivitu za užití rozsahu koncentrací od 5 χ 10'⁷ do 8 x 10* M. Data získaná z experimentu byla importována do vhodnéhomatematického programu (například, Cricket Graph), aby mohla být provedena standardnLkinetická-analvza-dat--Katalvtická~rychl5štňí~konstanta pro dismutaci superoxidu manganatým (II) komplexem podle příkladu 1 byla stanovena z lineárního výnosu pozorovaných rychlostních konstant (K,bs) proti koncentraci manganatých (II) komplexů. Hodnoty byly získány z lineárních výnosů In absorbance při 245 nm proti době dismutace superoxidu manganatým (II) komplexem, kxat (M'¹sek'¹) manganatého komplexu podle příkladu 1 při pH = 8,1 a 21 °C byla vypočtena 0,77 χ 10⁺⁷ M^sek'¹.

Manganatý (II) komplex makrocyklického ligandu obsahujícího dusík v příkladu 1 je účinný katalyzátor pro dismutaci superoxidu, jak je zřejmé z hodnoty k^ uvedené výše.

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina, která je komplexem představovaný vzorcem (I):

   -—-· ·—“kde-RrR^rR/rRttRz/R í/Rá, R 37R4, R 4, Rs, R 5, Re, R e, R?, R 7, Re, R e,. Rg 3 R'₉ nezávisle představují alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylaikyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl, alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklický, aryl a aralkyl a zbytky připojené k a-uhlíku a-aminokyselin; nebo R1 nebo R\ a R₂ nebo R'₂, R3 nebo R'₃ a R₄ nebo R'₄, R₅ nebo R'_s a R_e nebo R'_6l R₇ nebo R'? a R₈ nebo R's, R₉ nebo R'₉ a R nebo R' společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny nezávisle tvoří nasycené, částečně nasycené nebo nenasycené cykly mající 3 až 20 uhlíkovými atomy; nebo R nebo R'a Ri nebo R\, R₂ nebo R ₂ a R₃ nebo R'₃, R₄ nebo R'₄a R₅ nebo R'_s, R₆ nebo _v R'e a R₇ nebo R'₇, a R_e nebo R'₈ a R₉ nebo R'₉ společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou připojeny, nezávisle tvoří dusík obsahující heterocyklus se 2 až 20 uhlíkovými atomy za předpokladu, že když dusík obsahující heterocyklus je aromatickým heterocyklem, který neobsahuje vodík navázaný k dusíku, vodík navázaný k dusíku v uvedeném vzorci (I), jehož dusík je také v makrocyklu a R skupiny připojené ke stejným uhlíkovým atomům makrocyklu chybí; a jejich kombinace;

   kde (1) jedna až pět „R“ skupin je navázáno k biomolekulám přes spojovací skupinu, (2) jedna z X, Y a Z je navázána k biomolekule přes spojovací skupinu, nebo (3) jedna až pět „R“ skupin a jedna z X, Y a Z jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu; a uvedené biomolekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny <· »· .·· * • · · · · · · * ·· · · · • · · · · · · > · · · · **«· ·· ·· sestávající ze steroidů, sacharidů, mastných kyselin, aminokyselin, peptidů, bílkovin, protilátek, vitamínů, lipidů, fosfolipidů, fosforečnanů, fosforitanů, nukleových kyselin, substrátů enzymů, enzymových inhibitorů a substrátů enzymových receptorů a uvedená spojovací skupina je odvozena od substituentu připojeného k uvedené „R“ skupině nebo k uvedené X, Y a Z, která reaguje s biomolekulou a je vybrána ze skupiny skládající se z -NH₂, -NHR₁₀, -SH, -OH, -COOH, -COOR₁₀, -CONH₂, -NCO, -NCS, COOX“, alkenylu, alkinylu, halogenidu, p-toluensulfonatu, methansulfonatu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R₁₀ je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a X“ je halogenid; a kde X, Y a Z jsou ligandy nezávisle vybrané ze skupiny skládající se z ligandů halogenid, oxo, aqua, hydroxo, alkohol, fenol, molekulový kyslík, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amin, alkylamin, arylamin, heterocykloalkylamin, heterocykloarylamin, aminoxidy, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxid dusnatý, kyano, kyanato, thiokyanato, isokyanato, isothiokyanato, alkylnítril, arylnitril, nitrato, nitríto,._azido,_ alkylsulfonová kyselina. arylsulfonová kyselina, alkylsulfoxid, arylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenová kyselina.—arvlsulfenová—kyselina;—alkylsulfinová' kyselina, arylsulfinová kyselina, alkylthiol karboxylová kyselina, arylthiol karboxylová kyselina, alkylthiolthiokarboxylová kyselina, arylthiolthiokarboxylová kyselina, alkylkarboxylová kyselina, arylkarboxylová kyselina, močovina, alkylmočovina, arylmočovina, alkylarylmočovina, thiomočovina, alkylthiomočovina, arylthiomočovina, alkylarylthiomočovina, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiričitan, hydrosiricitan, alkylfosfin, arylfosfin, alkylfosfinoxid, arylfosfinoxid, alkyiarylfosfinoxid, alkylfosfinsulfid, arylfosfinsulfid, alkylarylfosfinsulfid, alkylfosfonová kyselina, arylfosfonová kyselina, alkylfosfinová kyselina, arylfosfinová kyselina, difenylfosfinitá kyselina, arylfosfinitá kyselina, fosforečnan, thiofosforečnan, fosforitan, difosforitan, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, alkylguanidino, arylguanidino, alkylarylguanidino, alkylkarbamat, arylkarbamat, alkylarylkarbamat, alkylthiokarbamat, arylthiokarbamat, alkylarylthiokarbamat, alkyldithiokarbamat, aryldithiokarbamat, alkylaryldithiokarbamat, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromičnan, bromitan, bromnan, tetrahalomanganan, tetrafluoroboritan, hexafiuorofosforečnan, hexafluoroantimoničnan, fosfoman, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylborat, tetraalkylborat, tartarat, salicylat, sukcinat, citrát, askorbat, sacharinat, aminokyselina, hydroxamová kyselina, thiotosylat, a anionty ionexových pryskyřic, nebo jim • · · · • · ·· ··· « · • · « odpovídající anionty, nebo X, Y a Z jsou nezávisle navázány k jedné nebo více „R“ skupinám a n je 0 nebo 1.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde 1 až 2 „R“ skupin jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu a žádná z X, Y a Z není navázána k biomolekule přes spojovací skupinu.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1, kde jedna z X, Y a Z je navázána k biomolekule přes spojovací skupinu a žádná z „R“ skupin není navázána k biomolekulám přes spojovací skupinu.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, kde nejvýše jedna „R“ skupina navázaná k uhlíkovým atomům makrocyklu nacházejícím se mezi dusíkovými atomy má biomolekulu navázanou přes spojovací skupinu. __________________
5. 5. Sloučenina podle nároku 1 ,_kde_nejméné.jedna-z-_riR-skupinrkteré-jsou'navázáný.1C biomolekulám přes spojovací skupinu, je nezávisle vybrána ze skupiny sestávající ze zbytků alkyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, aralkyl, alkaryl, aryl, heterocyklů a uhlovodíkových zbytků navázaných k α-uhlíku a-aminokyselin, a zbývající „R“ skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík, nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus nebo heterocyklus obsahující dusík.
6. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde nejméně dvě z „R“ skupin, dále k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu, jsou nezávisle vybrány ze skupin alkyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, aralkyl, alkaryl, aryl, heterocykly a uhlovodíkové zbytky navázané k α-uhlíku a-aminokyselin.
7. 7. Sloučenina podle nároku 5, kde nejméně jedna z „R“ skupin, dále k „R^u skupinám, které jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu, jsou alkyl a zbývající „R“ skupiny jsou nezávisle vybrány z vodíku nebo nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde nejméně jedna z Ri nebo R'i a R₂ nebo R'₂, R₃ nebo R'₃ a R₄ nebo R\ R₅ nebo R'₅ a R_e nebo R'_e, R₇ nebo R'₇ a Re nebo R'_e, a R₉ nebo R'_g a R nebo R' společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou navázány, zastupují nasycený, částečné nasycený nebo nenasycený cyklus se 3 až 20 uhlíkovými atomy a zbývající „R skupiny, dále k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík, heterocykly obsahující dusík nebo alkylové skupiny.
9. 9. Sloučenina podle nároku 8, kde kde nejméně dvě z Ri nebo R't a R₂ nebo R'_2t R₃ nebo R'₃ a R₄ nebo R'_4l Rs nebo R'_s a R_e nebo R'_e, R7 nebo R'?a R₈ nebo R^r8, a Ra nebo R’s a R nebo R' společně s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou navázány, představují nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus se 3 až 20 uhlíkovými atomy a zbývající „R“ skupiny, dále k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík, heterocykly obsahující dusík nebo alkylové skupiny.

   -
10. 10~-Sloučenina podle nároku 8, kde uvedený nasycený,, částečně nasycený nebo nenasycený cyklický zbytek jecyklnhexyl. —_ < —-—
11. 11. Sloučenina podle nároku 10, kde uvedené zbývající „R“ skupiny, dále k „R skupinám, které jsou navázány k biomolekulám pres spojovací skupiny, jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík nebo alkylové skupiny.
12. 12. Sloučenina podle nároku 1, kde uvedené R nebo R'a R1 nebo R'_b R₂ nebo R'₂ a R₃ nebo R'_3l R₄ nebo R'₄ a R₅ nebo R's, Re nebo R'_e a R? nebo R'_7l a R₈ nebo R'₈a R₉ nebo R'₉ spleene s uhlíkovými atomy, ke kterým jsou navázány, tvoří heterocyklus obsahující dusík s 2 až 20 uhlíkovými atomy, a zbývající „R“ skupiny, dále k „R“ skupinám, které jsou navázány k biomolekulám přes spojovací skupinu, jsou nezávisle vybrány ze skupin vodík, nasycené, částečně nasycené nebo nenasycené cykly nebo alkylové skupiny.
13. 13. Sloučenina podle nároku 1, kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující halogenid, anion organické kyseliny, dusičnanový a hydrogenuhličitanový anion.
14. 14. Farmaceutická kompozice v jednotkové dávkové formě užitečné pro dismutaci superoxidu zahrnující (a) terapeuticky nebo profylakticky účinné množství komplexu r

    • 9 »0 • 0 0 · «' *·>

    • 0 «

    9 · · • «0« ·· · 9 • 00··

    0« ·* « 0 • · · 9 9 0

    00 · podle nároku 1 a (b) netoxický, farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo vehikulum.
15. 15. Způsob prevence nebo léčby choroby nebo poruchy, která je zprostředkovaná, alespoň částečně superoxidem, zahrnující podání subjektu, který potřebuje takovou prevenci nebo léčbu, terapeuticky, profylakticky, patologicky, nebo resuscitativně účinné množství komplexu podle nároku 1.
16. 16. Způsob podle nároku 15, kde uvedená choroba nebo porucha je vybraná ze skupiny sestávající z ischemického reperfusního poškození, chirurgicky vyvolané ischemie, zánětlivého onemocnění vnitřních orgánů, rtieumatoidní arthritidy, atherosklerosy, thrombosy, agregace krevních destiček, oxidantem vyvolaného zranění a poškození tkání, osteoarthritidý, lupénky, odvržení orgánových transplantátů, zářením vyvolaněho zranění, mrtvice, akutní pankreatitidy, na inzulínu závislém diabetes mellitus, dospělého a infantilního—respíračního—stresu—metastáze~~a~ karcinogeneze.

    A.
17. 17. Způsob podle nároku 16, kde uvedená choroba nebo porucha je vybrána ze skupiny sestávající z ischemického reperfusního poškození, mrtvice, atherosklerosy a zánětlivého onemocnění vnitřních orgánů.