[go: up one dir, main page]

CZ372698A3 - Substituované imidazolidinové deriváty, způsob jejich přípravy, jejich použití a farmaceutické prostředky, které je obsahují - Google Patents

Substituované imidazolidinové deriváty, způsob jejich přípravy, jejich použití a farmaceutické prostředky, které je obsahují Download PDF

Info

Publication number
CZ372698A3
CZ372698A3 CZ983726A CZ372698A CZ372698A3 CZ 372698 A3 CZ372698 A3 CZ 372698A3 CZ 983726 A CZ983726 A CZ 983726A CZ 372698 A CZ372698 A CZ 372698A CZ 372698 A3 CZ372698 A3 CZ 372698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
group
formula
aryl
ala
Prior art date
Application number
CZ983726A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297564B6 (cs
Inventor
Volkmar Dr. Wehner
Hans Ulrich Dr. Stilz
Wolfgang Dr. Schmidt
Dirk Dr. Seiffge
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh filed Critical Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh
Publication of CZ372698A3 publication Critical patent/CZ372698A3/cs
Publication of CZ297564B6 publication Critical patent/CZ297564B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/66—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/72—Two oxygen atoms, e.g. hydantoin
    • C07D233/74—Two oxygen atoms, e.g. hydantoin with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to other ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D317/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Description

« · * • * · ř • ♦ · • · • * · «* *« • · • · · * « φ · · * · · É · · ·· · Φ * • « # · · »·»·*·· · * * · 1 7652 T/JT 1
PŘÍPRAVY A FARMACEUTICKÝ
DERIVÁTY PEPTIDŮ, ZPŮSOB JEJICH )
PROSTŘEDEK, KTERÝ JE OBSAHUJE
Oblast techniky Předkládaný' vynález se týká určitých nových derivátů peptidů, které mají farmakologicky využitelné vlastnosti pro použití při léčbě autoimunních onemocnění nebo' onemocnění, jako je revmatoidní arthritida, a jiných onemocnění zprostředkovaných T-buňkami závislými na MHC třídy II. Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahující nové peptidové deriváty, způsobu jejich přípravy a jejich použití při léčbě jednoho nebo více výše uvedených onemocnění nebo stavů a při výrobě nových léčiv pro použití při léčbě těchto onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Stimulace imunitní odpovědi člověka závisí na rozpoznání proteinových antigenů T buňkami. Avšak T buňky nemohou na antigen odpovědět samy o sobě, ale jsou aktivovány antigenem, pouz'é když šě tento” komplexuje s molekulami* 'hlavního* histo-* kompatibilitního komplexu (MHC) na povrchu buněk obsahujících antigen, jako jsou B-buňky, makrofágy nebo dendritické buňky.
Molekuly MHC třídy I vyvolávají odpověď zabiječských T-buněk (T-killer cells), čímž dojde ke zničení buněk nesoucích antigen. Molekuly MHC třídy II vyvolávají odpověď pomocných T buněk (T-helper cells), která kontroluje expanzi a maturaci vybraných buněk B (t.j. vznik protilátek specifických k antigenů) a aktivaci makrofágů.
Kritickým požadavkem imunitního systému je schopnost rozlišovat mezi „vlastními" a „cizorodými" antigeny. Toto rozlišování je nutné proto, aby- mohl imunitní systém odpovědět na vniknutí cizích pathogenů za zachování tolerance k vlastním proteinům a tím působit preventivně proti poškození normální tkáně. €> 2 ·· €> 2 ·· ěě · • · · · · · • · · # ·* • » · ··* · · • · · · · t·· »«·· ·· ·*
Autoimunní onemocnění vznikají, pokud se poruší vlastní tolerance a tak se umožní, aby imunitní systém reagoval proti vlastním tkáním, čímž vznikají spoje při revmatoidní arthritidě. Má se za to, že udržení tolerance, a tedy zabránění autoimunním onemocněním, je kriticky závislé na funkci MHC molekul.
Zjištění, že mnoho autoimunních onemocnění je spojeno s dědičností určitých MHC alel svědčí o klíčové roli molekul MHC při pathogenezi autoimunních onemocnění. Například mnohočetná skleróza je spojena s dědičností HLA-DR2, diabetes mellitus závislý na insulinu je spojen s dědičností HLA-DR3 a Hashimotova thiroiditida je spojena s dědičností HLA-DR5. Zvláště silná vazba existuje mezi dispozicí a vývojem chronické zánětlivé revmatoidní arthritidy a dědičností HLA-DR4Dw4 a/nebo HLA-DR4Dwl4 a/nebo HLA-DR1. Předpokládá se tedy, že autoimunní onemocnění zahrnující MHC molekuly se váží k určitým vlastním antigenum a přenášejí je do T buněk, čímž se stimuluje autoimunní odpověď. Jiné peptidy, které se mohou vázat k autoimunním molekulám spojeným s MHC a/nebo buď předcházejí "vazbě '‘nebo"* "vytlačuj 1--*j'iž "vázané* "viasťní antigěny a/nebo' peptidy, které inhibují aktivaci T buněk (zejména aktivitu pathogenních T buněk (například Th 1 buněk)) a/nebo peptidy, které zvyšují aktivitu ochranných T buněk (například Th 2 buněk) nebo peptidy, které interagují s molekulami MHC pomocí alternativního mechanismu působení tak, že předcházejí nebo modifikují stimulaci autoimunní odpovědi přes tak zvané molekuly MHC, mohou specificky potlačit autoimunní odpověď. Činidlo tohoto druhu by mohlo poskytnout léčbu autoimunních onemocnění a zároveň zamezit obecnému potlačení imunitního systému, čímž se omezí nežádoucí vedlejší účinky. .Toto by mělo významné výhody před dosud používanou léčbou onemocnění, jako je revmatoidní arthritida. v současné době se revmatoidní arthritida léčí nejprve pomocí činidel zmírňujících symptomy. 3 • · t # a * · a ♦ * · • · ·· • · • i > · * I ·· i · I *·* · · a · a · · ··«·*·· · · ·· ta · · • * jako je NSAID, která nemají jakýkoli užitečný vliv na zlepšení onemocnění a jsou často spojena s nežádoucími vedlejšími účinky. Léčba závažnějších onemocnění spoléhá na použití takzvaných činidel „druhé linie". Tato činidla jsou často cytotoxické sloučeniny, které mají omezenou účinnost a mohou způsobovat některé komplikace vzhledem k jejich toxicitě. Činidla modifikující onemocnění bez přidružené nespecifické cytotoxicity by tedy byla velmi prospěšná při léčbě revmatoidní arthritidy. V mezinárodních patentových přihláškách číslo WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707 jsou uvedeny peptidy, které se váží k molekulám MHC a inhibují aktivaci T buněk. Ačkoli bylo objeveno mnoho peptidů, které inhibují aktivaci T buněk omezených HLA-DR pomocí vazby k molekulám HLA-DR, stále existuje potřeba alternativních sloučenin, které se váží k takovým molekulám a/nebo buď působí preventivně proti vazbě nebo vytlačují již vázané vlastní antigeny a/nebo inhibují aktivaci T buněk a/nebo zvyšují aktivitu ochranných T buněk .nebo ..sloučenin,., které .interagují. · s*molekulami —MHC .pomocí-»- -alternativního mechanismu působení tak, že předcházejí nebo modifikují stimulaci autoimunní odpovědi, která způsobuje onemocnění nebo stavy uvedené výše.
Podstata vynálezu
Zjistili jsme, že deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu (uvedené níže) mají překvapivě tyto farmakologicky využitelné vlastnosti a toto zjištění je základem předkládaného vynálezu.
Podle jednoho aspektu předkládaný vynález poskytuje derivát peptidů obecného vzorce I (uvedený níže) nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, kde P je hydrofobní zbytek; AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7 a AA3 jsou L-aminokyselinové zbytky, kde 1, 2 nebo 3 ze zbytků AA1, AA4 a AA7 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II (uvedeného níže) kde n je celé číslo 1, 2, 3 nebo 4,- X je skupina -NH-CO-, skupina -CO- (karbonylová skupina) nebo skupina -0.C0- (oxykarbonylová skupina); R1 a R2 jsou vybrány z (A) , (B) a (C) , kde (A) je skupina obecného vzorce - (CHJa-CO-N(R3) (R4) . kde a je celé číslo 1 nebo 2 a R3 a R4 jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupin - [ (CH2) b0] m-Ra, kde Ra je methylová skupina nebo ethylová skupina a m je celé číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud m je 1, b je 2 nebo 3 a pokud m je 2, 3, 4 nebo 5, hodnota b v každé skupině -(CH2)bO- je je nezávisle vybrána z hodnot 2 a 3,- (Bj je skupina obecného vzorce - (CH2)cO(CH2)d-CO-N<Rs) (R6) , kde c je celé číslo 2 nebo 3, d je celé číslo 1, 2 nebo 3, a Rs a Rs jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupin - [ (CH2)e0]p-Rb', kde Rb je methylová skupina nebo ethylová skupina a p j.e celé číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud pjel, e je 2 nebo 3 a pokud p je 2, 3·, 4 nebo 5, hodnota e pro každou skupinu -{CH2)eO- je nezávisle vybraná z hodnot 2 a 3; a (C) je skupina obecného vzorce - [ (CH2) £0] g-R7, kde R7 je methylová skupina nebo ethylová skupina a g je celé číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud gjel, f je 2 nebo 3 a pokud g j e 2, 3, 4 nebo 5, hodnota f v každé skupině -(CH2)£0- je nezávisle vybraná z hodnot 2 a 3; nebo AA1, AA2, AA3, AA6, AA7, a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, kde jedna nebo obě skupiny AA1 a AA7 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II, jak je definováno výše a AA4 společně s AA5 tvoří skupinu obecného vzorce III, lila, IV, IVa, V nebo Va (uvedeno níže) kde Ra, Rb a Rz.>sou nezávisle na 5 é • *4 • · • t ·« · · · · · · • · * * · · I p » ··* * ♦ • · · * ·····*« t* ** sobě vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a A je atom kyslíku nebo methylenová skupina; nebo AA1, AA1, AA2, AA"1, AA3 a AA2 jsou zbytky L-aminokyselin, kde jedna nebo obě skupiny AA1 a AA4 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II, jak je definováno výše, a AA3 společně s AA7 tvoří skupinu obecného vzorce III, lila, IV, IVa, v nebo Va (uvedeno níže), kde Ra, Rb a Rz jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a A je atom kyslíku nebo methylenová skupina; a Q je hydroxylová skupina, aminoskupina, skupina NRcRd, kde Rc je je vybrána ze skupiny, kterou tvoří alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, 2-karbamoylcyklopentylová skupina, 2-pyridylmethylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylmethylová skupina, 3-karbamoyl-fenylová skupina, 4-karbamoylfenylová skupina, 4 -(karbamoyl-methyl)fenylová skupina, 4-(karboxymethyl)fenylová skupina, .2-morfolinethylová „ skupina -a, skupina--obecného vzorce ‘-Al-G2,-kde A1 je alkylenová skupina obsahující 3 až 7 atomů uhlíku nebo A1 je vybrána ze (1) skupiny obecného vzorce -A1-B1-, kde A1 je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a B1 je alkylenová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo A1 je methylenová skupina a B1 je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová skupina; a 1 skupiny obecného vzorce -A2-B2-C2-, kde A2 je methylenová 2 skupina, B2' je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová 3 uhlíku; a 4 skupina- a C2 je alkylenová skupina obsahující 1 až 3 atomy 6 6 ·· · • * · • · · *·« · *
• · » « f · ί t · « t 4 + G1 je skupina je skupina obecného vzorce -N=C[N(Rp)2] 2, kde každá skupina Rp je je nezávisle vybraná ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, methylová skupina, ethylová skupina a propylová skupina; a Rd je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1' až 4 atomy uhlíku; nebo Q je 1-piperazinylová skupina, 4-methyl-1-piperazinylová skupina, 4-(2-{2-hydroxy-ethoxy)ethyl)-1-piperazinylová skupina, 4-amidino-l-piperaziny-lová skupina, 1-piperidylová skupina nebo v poloze 4 substituovaná 1-piperidylová skupina, kde substituentem v poloze 4 je karboxylová skupina, karbamoylová skupina, N-(2-aminoethyl)karbamoylová skupina a N-(4-aminobutyl)karbamoylová skupina; nebo Q je sekvence 1 až 6 aminokyselinových zbytků nebo jejich amid.
Podle dalšího aspektu předkládaný vynález poskytuje derivát peptidu obecného vzorce I (uvedeného níže), nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, kde AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA®, AA7 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, kde AA1, AA4 a AA7 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II (uvedeného níže) kde η, X, R1 a R2 mají stejný význam, jako bylo uvedeno výše; "“nebo AA1, AA2, AA3, AAS, ' AA7 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, kde jedna ze skupin AA1 a AA7 je vybrána ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II jak je definováno výše a AA4 společně s AA5 tvoří skupinu obecného vzorce lila, jak je definováno výše; nebo AA1, AA2, AA3, AA4, AA5 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, kde jedna ze skupin AA1 a AA4 je vybrána ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce ΪΙ, jak je definováno výše a AA6 společně s AA7 tvoří' skupinu obecného vzorce lila, jak je definováno výše; a P a Q mají jakoukoli z hodnot definovaných výše.
Je třeba poznamenat, že aminokyselina Q může mít nezávisle stereochemii D i L. Dále, pokud Q je definováno jako hydroxylová skupina (OH), je třeba uvést, že je hydroxylovou skupinou C-konce aminokyseliny AAB. Podobně, pokud Q je 7 7 • * • Ψ ψ 4 · · * ·· ·« «* · « 4 4 · 9 • « « + · | · «Μ » · • · · * *»·· ·· ·· definováno jako aminoskupina, skupina NRcRd, piperazinylová skupina, piperidylová skupina, a tak dále, znamená to, že hydroxylová skupina C-koncové aminokyseliny AAa je nahrazena touto skupinou. Také je potřeba poznamenat, že pokud se uvede termín aminokyselina, znamená alfaaminokyselinu. Také je třeba poznamenat, že pokud se uvede termín L-aminokyselina, zahrnuje také aminokyseliny jako je Gly, 2,2-diethylGly, azaalanin a azaglycin, které neobsahují chirální atomy uhlíku. Dále je třeba uvést, že obecné termíny, jako je „alkylová skupina" zahrnují jak variantu s přímým řetězcem, tak variantu s rozvětveným řetězcem, pokud to počet atomu uhlíku umožňuje. Stejné pravidlo platí i u ostatních zbytků. Dá-le je třeba si uvědomit, že pokud R1 a R2 jsou obě skupiny obecného vzorce (A) , hodnoty a, R1 a R* ve skupině R1 mohou být stejné nebo různé od těchto skupin v R2. Podobně pokud R1 a R2 jsou obě skupiny obecného vzorce (B), hodnoty c, d, Rs a R6 ve skupině R1 mohou být stejné nebo různé, než „tyto skupiny ve skupině R2, a pokud R1 a R2 jsou obě skupiny obecného vzorce (C) , hodnoty f, g a R7 ve skupině R1 mohou být stejné nebo různé než"tyto' hodnoty've skupině R2".* ~ ~~
Pro odborníky v této oblasti je známé, že sloučeniny, které mají chirální centrum, mohou existovat ve formě racemátu (nebo, pokud je přítomno více než jedno chirální centrum, ve směsi diastereomerů) nebo jako opticky aktivní enantiomer nebo diastereoizomer. V této oblasti je také známo, že případná biologická aktivita spojená s racemickou nebo diastereomerní směsí může vnikat převážně nebo pouze z jednoho opticky aktivního izomeru. Proto je třeba poznamenat, že se vynález týká jakékoli formy derivátu peptidu obecného vzorce I, který má výše uvedené garmaceuticky využitelné vlastnosti. V této oblasti je známo, jakým způsobem získat jeden opticky aktivní izomer, například pomocí rozdělení racemickě nebo diastereomerní směsi obsahující izomer za použití běžných technik, jako je chromatografie, nebo pomocí chirální syntézy za použití vhodných opticky aktivních výchozích látek nebo meziproduktů, přičemž příklady jsou uvedeny níže. V této oblasti je také známé, jak určit farmakologické vlastnosti takových racemických nebo diastereomerních směsí a jednotlivých opticky aktivních izomerů, například za použití testů, které jsou popsány níže. Pro odborníka v této oblasti je proto snadné získat patřičné izomery derivátů peptidů obecného vzorce I, které mají výhodné farmakologické vlastnosti uvedené v předkládaném vynálezu. Je třeba uvést, že předkládaný vynález také zahrnuje všechny polymorfní formy, všechny tautomery nebo všechny solváty nebo jejich směsi,- směsi derivátů peptidů obecného vzorce I, které mají výhodné farmakologické vlastnosti uvedené v souladu s předkládaným vynálezem.
Vhodné nazávislé významy zbytků a-aminokyselin AA1, AA2, AA3, AA4, AAD, AA6, AA7 a AA8, pokud nejsou zbytky aminokyseliny obecného vzorce II nebo netvoří část skupiny obecného vzorce III, lila, IV, IVa, V nebo Va, zahrnují například ty, které se skládají z 20 přírodních aminokyselin kódujících genetický kód, y . _^r · : Ί1..Ι Γ'ΊΤΙ· "" i w- ·* — — - Ml * zejména^alaninú' (Ala) ,'"kyseliny glutamové (Glu) , glycinu (Gly) , histidinu (His), isoleucinu (Ile), lysinu (Lys), asparaginu (Asn), glutaminu (Gin), argininu (Arg), threoninu (Thr), valinu (Val) a prolinu (Pro) . Také jsou vhodné zbytky aminokyselin, jako je sarkosin (Sar), 3,3,3-trifluoralanin, 2,2-díethyl-glycin, kyselina 2,3-diaminopropanová (Dap), kyselina 2,4-diaminobutanová (Dab), kyselina 2-aminobutanová (Abu), homarginin, homfenylalanin, trans-4-hydroxyprolin (Hyp), azaalanin [H2N-N(CHj) -COOH; Azala] , aza-glycin [H2N-NH-C00H; Azgly], kyselina 1,2,3,4tetrahydroisochinolin-3-karboxylová (Tic), kyselina oktahydroindol-2-karboxylová (Oic), kyselina dekahydroisochinolin-3-karboxylovš (Die). (Pokud je uvedena zkratka Die, znamená formy, kde spojení kruhu mají obě konfiguraci R nebo obě konfiguraci S) . Mohou se také použít 9 Μ· · • · «V · /* • ♦ %' tp * m i * Ψ Μ · * 41 »4 ο! zbytky odpovídající N2-methylovaným aminokyselinám, stejně jako zbytky odpovídající aminokyselinám, které mají esterifikovanou karboxylovou funkci ve vedlejším řetězci (například alkylesterová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo benzylesterová skupina) a alkylovanou aminoskupinu ve vedlejším řetězci (například methylovanou), acetylovanou nebo na karbamát převedenou aminoskupinu ve vedlejším řetězci (například, alkylkarbamát (jako je methylkarbamat nebo ethylkarbamát), fenylkarbamát nebo benzylkarbamát). Mezi další vhodné významy patří glycin substituovaný v poloze 2, kde substituentem v poloze 2 je skupina vzorce -(CH2)3NH2, kde s je 1 až 3, nebo skupina vzorce - (CH2) pN (Re) ý.X', kde wherein p je 2 až 4 a X' je a protiion (jako je acetát, trifluoracetát, hydroxid nebo chlorid), nebo skupina vzorce - (CH2) qN (Re) 2, kde q je 0 až 4 nebo skupina vzorce - (CH2) ,JN[=C (N(Re) 2] 2, kde r je 1 až 4 a kde každá skupina Re v posledních třech skupinách je nezávisle vybrána ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku (jako, je methylová skupina nebo ethylová skupina). "* Vhodné"" významy pro hydrofobní zbytek P* Tkterý je připojen k aminoskupině N-koncové aminokyseliny AA1} zahrnují například 'organické hydrofobní skupiny jako jsou hydrofobní alifatické, aromatické, heteroaromatické nebo smísené alifaticko/aromatické nebo alifaticko/heteroaromatické organické skupiny obsahující 5 až 20 atomů uhlíku (a l, 2 nebo 3 heteroatomy vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, atom síry a atom dusíku pro skupiny obsahující heteroatom), například skupina vzorce R-, .skupina R.C0-, skupina R.S02-, skupina R.O.CO-, skupina R.NHCO-, skupina R.O.CS-, skupina R.S.CO-, skupina R.NHCS-, skupina R.S.CS- a skupina R.CS-, kde R je například alkylová skupina obsahující 5 až 10 atomů uhlíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, arylalkylová skupina obsahující v alkylová části 2 až 10 atomů uhlíku, heteroarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 10 atomů uhlíku, 10 «· · diarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 8 atomů uhlíku, arylalkenylová skupina obsahující v alkenylové části 2 až 10 atomů uhlíku, arylcyklopropylová skupina, cykloalkylová skupina obsahující 5 až. 10 atomů uhlíku, cykloalkylalkylová skupina obsahující v cykloalkylové části 5 až 10 atomů uhlíku a v alkylové části 2 až 6 atomů uhlíku, 3-bifenylová skupina, 4-bifenylová skupina, 4-cyklohexylfenylová skupina, 2-naftyloxymethylová skupina, 3-naftyloxymethylová skupina, fenoxyfenylová skupina a tetrahydronaftylová skupina, arylová skupina nebo heteroarylová skupina, kde skupiny R mohou nést jednu nebo více substituentů, kterými jsou alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, atom halogenu, kyanoskupina nebo alkoxylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku. Jedno zvláštní provedení podle předkládaného vynálezu zahrnuje například sloučeniny obecného vzorce I, kde P je skupina R.CO-, jak je definováno výše. Další zvláštní provedení podle předkládaného vynálezu zahrnuje například deriváty peptiďu obecného vzorce I, kde P je hydrofobní alifatická, aromatická nebo alifaticko/aromatická organická skupina obsahující 5 až 20 atomů uhlíku. R může mít například následující konkrétní významy: pokud je to alkylová skupina obsahující 5 až 10 atomů uhlíku: pentylová skupina, isopentylová skupina, terč-pentylová skupina, 2-methylpentylová skupina, hexylová skupina, isohexylová skupina, 5-methylhexylová skupina a oktylová skupina; pokud je to arylová skupina: fenylová skupina, naftylová skupina a indenylová skupina; pokud je to heteroarylová skupina: 2-, 3-, 5- nebo 6-indolylová skupina, 2-, 3-, 5- nebo 6-índolinylová skupina, 2-, 3-, 5- nebo 6- benzo[b]thiofenylová skupina, thienylová skupina, 2-, 4- nebo 5-benzothiazolylová skupina, 2-, 4- nebo 5-benzoxazolylová skupina, 2-, 4- nebo 5- benzimidazolylová skupina, 1,4-benzodioxanylová skupina připojená v poloze 2-, 3-, 6- nebo 7- a 2-, 3-, 5- nebo 6- benzof uranyl ová skupina,· pokud je to arylalkylová skupina 9· · 4 · • * I • * 11 II Μ # · Μ ·ΜΙ *4 ** obsahující v alkylové části 2 až 10 atomů uhlíku: arylalkylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku (kde arylovou část tvoří například jakákoli specifická arylová skupina uvedená výše a alkylovou část obsahující 2 až 6 atomů uhlíku tvoří například .methylenová skupina, ethylenová skupina, trimethylenová skupina, tetramethylenová skupina a pentamethylenová skupina) jako je 2-fenylethylová skupina, 3-fenylpropylová skupina, 4- fenylbutylová skupina a 5-fenylpentylová skupina; pokud je to heteroarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 10 atomů uhlíku: heteroarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 6 atomů uhlíku (kde heteroarylovou část tvoří například jakákoli specifická heteroarylová skupina uvedená výše a alkylovou část obsahující 2 až 6 atomů uhlíku tvoří například methylenová skupina, ethylenová skupina, trimethylenová skupina, tetramethylenová skupina a pentamethylenová skupina) jako 2 -(2-kyanobenzo[b]thiofen- 5- yl)ethylová skupina; pokud je to diarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 8 atomů uhlíku: diarylalkylová skupina obsahující v alkylové části 2 až 6 atomů uhlíku, jako je 2,2-difenylethylová skupina, 3,3-difenylpropylová skupina a 4,4-difenylbutylová skupina; pokud je to arylalkenylová skupina obsahující v alkenylové části 2 až 10 atomů uhlíku: arylalkenylová skupina obsahující v alkenylové části 2 až 6 atomů uhlíku jako je styrylová skupina, 3-fenylpropen-2-ylová skupina a 4-fenylbuten-l-ylová skupina; pokud je to arylcyklopropylová skupina: fenylcyklopropylová skupina, 1-naftylcyklopropylová skupina a 2-naftylcyklopropylová skupina; pokud je to cykloalkylová skupina obsahující 5 až 10 atomu uhlíku: cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina a 1-adamantylová skupina; a pokud je to cykloalkylalkylová skupina obsahující v cykloalkylové části 5 až 10 atomů uhlíku a v alkylové .části 2 až 6 atomů uhlíku: 2-(cyklohexyl)ethylová skupina, 3-(cyklohexyl)propylová skupina a 4-(cyklohexyl)-butylová skupina.· Případnými substituenty na arylové skupině 12 12 * * t i « · * 1 Φ m * · I * skupiny R jsou například methylová skupina, ethylová skupina, atom chloru, atom bromu, atom jodu, methoxyskupina, ethoxy-skupina a kyanoskupina.
Mezi hydrofobní zbytky P také patří například hydrofobní L-amínokyseliny, jako je fenylalanin (Phe) a jeho hydrogenovaná analoga, jako je cyklohexylalanin (Cha), parachlorPhe, 3-(2-thienyl)alanin, tyrosin (Tyr), Tyr(Omethyl), tryptofan (Trp), bifenylalanin, 3-(1-naftyl)alanin, 3-(2-naftyl)alanin a jeho hydrogenovaná analoga, 3-(1-adamantyl)alanin (Ada),
Glu(OBenzyl), 3 -(benzyloxv)Ala, 3-(benzylsulfanyl)Ala a 9-fluorenylGly, každá z těchto skupin může popřípadě nést na N-konci hydrofobní alifatický, aromatický, heteroaromatický nebo smísený alifaticko/aromatický nebo alifaticko/hetero-aromatický organický zbytek, jak je definováno výše. Alternativně může hydrofobní aminokyselina popřípadě nést například další sekvenci 1 až 3 aminokyselin, které jsou vybrány ze všech vhodným hodnot uvedených výše pro AA1 až AA8. Například P zahrnuje sekvence Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe a Ala-Ala-Ala-Phe. .První,.aminokyselina takové další--sekvence- 1'jaž"-3 'aminokyselin" (čteno zleva doprava) může být L- nebo D-aminokyselinou a také může popřípadě nést hydrofobní alifatickou, aromatickou, heteroaromatickou nebo smíšenou alifaticko/aromatickou nebo alifaticko/heteroaromatickou organickou skupinu, jak je de f i nováno výše.
Popřípadě může být P například skupina 3 -(benzyloxykarbonyl)-propionyl-Phe, skupina 3-(benzyloxykarbonyl)propionyl-Cha, skupina 4-(benzyloxykarbonyl)butyryl-Phe, skupina 4-(benzyloxykarbonyl) butyryl-Cha, skupina (5-oxo-pyrrolidin-2 -yl) karbonyl-Phe-Tyr, skupina (5-oxopyrrolidin-2-yl)karbonyl-Glu(O-Benzyl)-Tyr, skupina acetyl-Glu(O-Benzyl)-Tyr, skupina difenyl-methyl.CONH.CH2CH2.CO-Cha, skupina difenylmethyl.CONH.CH2CH2.C0-Tyr, skupina dif enylmethyl. CONH. CH2CH2CH2. CO-Cha, skupina difenylmethyl .CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr, skupina difenylmethyl.NHCO. CH2CH2CH2. CO- Cha, skupina difenylmethyl. NHCO. CH2CH2CH2.CO-Tyr, skupina benzyl.NHCO.CH2CH2 .CO-Cha, skupina benzyl. NHCO. CH2-CH2.CO-Tyr, skupina N-acetyl-4-chlorbetahydroxy-Phe, skupina 4-fenoxyfeny1.NHCO-, . skupina benzyl.NHCO.CH2CH2.CO.(N-methyl-Phe) , skupina benzyl.NHCO.CH2CH2.CONH.CH(CHPh2) .CO, skupina benzyl-NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, 3,3-difenylpropionylová skupina, trans-cinnamoylová skupina, 5-fenylvalerylová skupina a 3-(2-kyanobenzo[b]thiofen-5-yl)propionylová skupina. Výhodnou skupinou P je například skupina Ph. (CH2)4.CO-(5-fenylvaleryl (Phv)), skupina Ph.(CH2) „.CS- a 3-(2-kyano-benzo[b]thiofen-5-yl)propionylová skupina.
Mezi výhodné hydrofobní zbytky P patří, například, 3-(2-kyanobenzo[b] thiofen-5-yl)propionylová skupina a 5-fenylvalerylová skupina (Phv), zejména druhá z těchto skupin.
Pokud Re je skupina obecného vzorce -A^G1, A1 je konkrétně, pokud je to alkylenová skupina, například methylenová skupina, ethylenová skupina, propylenová skupina a butylenová skupina,- a B* je "konkré t ně Γ" pokud"'jé" to "alky lenová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, například methylenová skupina, ethylenová skupina a propylenová skupina; a C3 je, pokud je to alkylenová skupinaobsáhující 1 až 3 atomy uhlíku, například methylenová skupina, ethylenová skupina a propylenová skupina.
Mezi konkrétní skupiny -A1-G1 patří například 3-guanidino-propylová skupina, 4-.(2-guanidinoethyl) fenylová skupina, 4-(2-morfolinoethyl .NH.CO.CHj) fenylová skupina a 4-(4-(2-(2-hydroxyethoxy)ethyl]píperazin-1-yl.CO.CH2) fenylová skupina.
Konkrétní skupiny Q, pokud je to sekvence 1 až 6 aminokyselinových zbytků, patří například sekvence aminokyselinových zbytků nezávisle vybraných z jakýchkoli vhodných nezávislých skupin AA1 až AA8 definovaných výše, (jako je Ala-Thr-Gly-OH), 9f · « * · · · * · % · ·· é « v «·* # · » » · · * f9* ·*Μ ·· 11 « · ♦ « « * * ft · · · i 14 »» ·· nebo jejich D- analog, nebo sekvence obsahující jak D-, tak L-aminokyseliny, nebo jejich amidy, jako je amid odvozený od amoniaku, alkylamin obsahující 1 až 4 atomy uhlíku (jako je methylamin) nebo dialkylamin obsahující v každí alkylové skupině 1 až 4 atomy uhlíku (jako je dimethylamin).
Mezi výhodné skupiny Q patří například 4-karbamoyl-1-piperidylová skupina (zbytek od piperidin-4-karboxamidu (Pip-NH2) ) , 4-karboxy-1-piperidylová skupina (zbytek od piperidin- 4-karboxylové kyseliny (Pip-OH)), 4 -(karbamoylmethyl)anilíno- skupína (zbytek od 4-aminofenylacetamidu (Papa-NH2) } , 4-(karboxymethyl)anilinoskupina (zbytek od 4-aminofenyloctové kyseliny (Papa-OH)), a 4-(2rguanidinoethyl)anilinoskupina (zbytek od 2-(4-aminofenyl) ethylguanidinu (Pape-NH'C (=ΝΉ) NKZ) . Pip-NH3 a Papa-NH2 jsou zvláště výhodnými skupinami Q, a zejména Papa-NH2.
Mezi konkrétní nové deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu patří například peptidové sloučeniny obecného vzorce I, definované výše, kde: --(1)- ve vzorci" II,,"" η'^ϊ a*X ”= ^CO- 111 rt ΤΓΙ'“' " --- * — - (2) ve vzorci II, n = 4 a X = -NHCO-; (3) ve vzorci II, R1 a R3 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce (A), kde a = l; (4) ve vzorci II, R1 a R2 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce (A), kde r3 a R4 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce - [ (CH,) bQ] m-Ra, kde b = 2; (5) ve vzorci II, R1 a R2 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce vzorce (A), kde R3 a R4 jsou skupiny (stejné nebo různé) - [ (CH2)bO]m-Ra, kde m = 1, 2 nebo 3; 15 15 v« f « • · « * « « f » * I · · 9 *9 *9 • t ·· M· · ·
9 - I • * * M ·· ^ (6) ve V20rci II, R1 a R2 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce (B) , kde c = 2,- (7) ve vzorci II, R1 a R2 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce (B), kde d = 2; jsou skupiny (stejné nebo různé) skupiny (stejné nebo různé) vzorce jsou skupiny (stejné nebo různé) skupiny (stejné nebo různé) vzorce jsou skupiny (stejné nebo různé) (8) ve vzorci II, RL a R2 vzorce (B) , kde R5 a Rs jsou - [(CH2).01p Re, kde e = 2; (9) ve vzorci II, R1 a R2 vzorce (B) , kde R5 a RG jsou - [ (CH2)eO]p-R% kde p = 1; (10) ve vzorci II, R1 a R2 vzorce (C), kde f = 2; a (11) ve vzorci II, R1 a R2 jsou skupiny (stejné nebo různé) vzorce (C) , kde g = 3; a kde, pokud není uvedeno jinak, AA1, AA2, AA1, AA4, AAS, AAS, AA', AA8, P a Q mají jakýkoli z významů uvedených výše.
Konkrétní* významy "pro *R3, 'R4,“ R5"“a” R6^ '"a" Řl a R2, pokud jsou tyto skupiny vybrány ze skupin obecného vzorce - [ (CH2) fO]g-R7, zahrnují například skupinu -CH2CH2OCH3, skupinu-CH2CH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2OCH3 a skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2-0CH3.
Mezi další konkrétní nové peptidové deriváty podle předkládaného vynálezu patří například následující peptidové deriváty obecného vzorce I: (i) P - AA1 - AA2 - AA3 -11 ~AAS -AAS - AA7 - AAa - Q; (ii) P-II-AA2-AA3-AA4-AA5-AAS-AA7-AA8-Q; 16 » I ·- • · • t · · • ·' ·'· * * # * *·« ·*«»
• * · « * * ·♦ ··· · · • · >» • f «I (i i i) P-AA1-AA2-AA3-IIIa-AA€-II - AAa-Q; (iv) P-ňAl-AA3-AA1-AA*-AA5-AAs-II-AAe-Q; (v) P-AA1-AA2-AA3- II - AAS- IIIa-AAs-Q; a (vi) P -11 - AA2 - AA3 - AA4 - AA5 -111 a - AA8 - Q; kde II je zbytek L-aminokyseliny obecného vzorce II, jak je definováno výše, a lila je skupina vzorce lila, jak je definováno níže, a kde, pokud není uvedeno jinak, AA1, AA2, AA1, AA4, AA5, AA6, AA7, AA3, P a Q mají jakýkoli význam, včetně, konkrétních a výhodných významů, jak je definováno výše. (je třeba uvést, že ve skupinách (i) až (vi) , kde se vyskytuje skupina AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7 nebo AAa, jsou to L-aminokyselinové zbytky a přítomnost a poloha skupiny vzorce II nebo lila je specificky označena). Skupiny (i) až (vi) jsou dalším nezávislým aspektem předkládaného vynálezu.
Mezi peptidové deriváty zvláštního významu obsahující (i) až (vi) patří například deriváty, kde ve vzorci li, η = 1 nebo 2, X= karbonylová skupina a R1 a Rz jsou skupiny obecného vzorce _ _ „ „ ............ v* — -*—**“ —*» -*-r~-r ·τ· - —*ΓΤΓ- {C)*“(zejméha, kde f = 2, g = 3 a/nebo R7 = methylová skupina*, jako je skupina -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3) nebo jsou obě skupiny vzorce (A) (zejména, kde a=l, b = 2, m=l nebo 3 a/nebo Ra = methylová skupina, jako je skupina -CH2CON (CH2CH2OCH3),) nebo skupina -CH2CON [ (CH2CH20) 3CH3] 2. Ze skupin (i) až (vi) , jsou peptidové deriváty skupin (i) a (v) zvláště důležité. Mezi _j^ýhodné--pep-fe-idové—deriváty"patří"-nap~fíkladl. ~sloučeniny skupiny (v), ve kterých, ve vzorci II, n = 1, X = karbonylová skupina a R1 a Rz jsou obě skupiny obecného vzorce (A). Výhodnými významy pro AA1 až AAe (pokud AA1, AA4 nebo AA7 není zbytek aminokyseliny vzorce II a pokud AA4 společně s AA5 nebo AA6 společně s AA7 nejsou skupiny vzorce III, lila, IV, IVa, V nebo. Va). jsou například 17 17 4 * · 4 * * • 4*4 4 4 44- 4 4 4 4* 4 * 44t « · • 4 · ·· ·♦ «*' AAl vybraná ze skupiny, kterou tvoří Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluóralanin, zejména Ala, Ile, Arg, Gap, GapMe4, zvláště Ala, Arg a Ile, a výhodněji Ala a Arg; AA3 vybraná ze skupiny, kterou tvoří Ala, Lys, Glu, Sar, Val,
Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoralanin a NĚ-diethylLys, zejména Ala, Arg, Ile, Lys a Tic, zvláště Ala, Arg, Ile a Tic a výhodněji Ala a Arg.; AA3 vybraná ze skupiny, kterou tvoří Ala, His, Gin, Val, Thr,
Glu, Gly, Asp, Asn a N3-di ethyl Dap, zvláště Ala, His, Asp a Asn, zejména Ala a Asn a výhodněji Ala; AA’ vybraná ze skupiny, kterou tvoří Ala, Lys, Asn, Arg, Thr,
Glu, Sar, Gly, Pro, His a N6-diethylLys, zvláště Ala, Arg, Lys a His, zejména Ala, Arg a His a výhodněji Ala; AA5 vybraná ze skupiny, kterou tvoří Thr, Val, Ala, Gly, Dap,
Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser a N3-diethylDap, zvláště Thr, Val a Dap, a zejména Thr a Val; "^'AAs“výbřariár'ze skupiny, kterou tvoří Gly, Leu, Lys, Ala, Pro,
Glu, Sar, His a Dap (zejména Ala a Pro); AA7 vybraná ze skupiny, kterou tvoří Pro, Ala, Lys, Arg, Glu,
Sar, Gly, Oic a Die (zejména Ala a Arg); a AAS vybraná ze skupiny, kterou tvoří Ala, Gly, Dap, azaalanin a -------a-zaglycŤn-, zéjlňéna"'Ala, Gly a azaglycin a zvláště Ala a Gly. (kde Gap má význam uvedený pro zbytek vzorce -NH.CH[CH2-NH. C (=NH) .NH2] .CO-, a kde GapMe4 má význam uvedený pro zbytek vzorce -NH. CH (CH2N=C [N (CH3) 2] 2) , CO- .) .
Dalšími individuálními nezávislými skupinami derivátů peptidů podle předkládaného vynálezu jsou například peptidové deriváty obecného vzorce I, kde 1 nebo 2 skupiny AA1, AA4 a AA7 jsou
1S ♦ *« . ♦ · ·· · · · · » · * ♦ *:ι · ·« • ♦ ♦ · * # t · · * ····«*· ·· ·· vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II, jak je definováno výše a ostatní skupiny AAL, AA2, AA3, AA\ AAS, AA5, ΑΑί a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin (včetně vhodných, specifických a výhodných významů, které jsou uvedeny výše).
Pokud peptidový derivát obecného vzorce I obsahuje skupiny vzorce III, IV, IVa nebo V, specifické významy pro Ra ve vzorci III a .Rb ye vzorci.., .1'V, .a .IVa,....a^-R-& rve··: .v-zo-rci-^V= -j^sou;---=-pokud to jsou alkylové skupiny, methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina a isopropylová skupina. Z derivátů peptidů obsahujících skupinu vzorce III, lila, IV, IVa, v nebo Va, jsou výhodné deriváty obsahující skupinu lila.
Další výhodný aspekt podle předkládaného vynálezu zahrnuje peptidové deriváty obecného vzorce I, které obsahují zbytek argininu, zejména sloučeniny, kde AA1 nebo AA2 jsou arginin (jako jsou sloučeniny, ve kterých částí sekvence AA1-AA2-AA3 je Ala-Arg-Ala nebo Arg-Ala-Ala).
Deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu, které jsou zvláště důležité, zahrnují například specifická provedeni 'uvedená” níže" v příkladech. Z těchto derivátů jsou zvláště důležité peptidové deriváty z příkladů 3 a 6 a tyto sloučeniny, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli tvoří další rysy předkládaného vynálezu. 19 19 • t •.. · · ·λ · * * • · · * t · ě·· · * I * · t i ♦ 1 k ·· ·♦♦ »*·· ** *· (Sekvence identifikační číslo: 3! .ch2ch2och3 ch3och2ch2n^ "Ch2ch2och3 ** Phv-Ala-Arg-Aía~
Příklad 3 (Sekvence identifikační číslo: 6)
ch2ch2och2cb2och2ch2och3\ ^ CH2CH2OCH CH?OCH,CH,OCH
N
H / οπ2^π2υοπ2^η2ο~, ,2^, ,2^„, ,3^CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3 I x''"'"* -N n Y Nsch2ch2och2.ch,och2ch7och 0 '
0
CH. J
Ala_'^ \Jhch2Conhj Příklad 6
Další aspekt podle předkládaného vynálezu tvoří chráněné (například skupinou Fmoc)__nebo nechráněné aminokyseliny obecného vzorce II, kde η, X, R1 a R2 mají jakýkoli význam, včetně konkrétních a výhodných významů, uvedený výše.
Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují například soli peptidových derivátů, které jsou dostatečně bazické, například těch, které obsahují volnou aminoskupinu, s kyselinami tvořícími fyziologicky přijatelné anionty, jako jsou soli s minerálními kyselinami, -například halogenovodíky (jako je 20 • « ·*· Φ 4 «*« ··+* « 9 '4 «« ·« chlorovodík-a bromovodík), sulfonovými kyselinami a fosfonovými kyselinami a s organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina šéavelová, kyselina vinná, kyselina mandlová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina methansulfonová, kyselina trifluor-octová a podobně, a soli peptídových derivátů, které jsou dostatečně kyselé, například derivátů, které mají volnou karboxylovou skupinu, s bázemi tvořícími fyziologicky prijTa te lne"5" íeatf ion tyr~~j akó ”j 'šoů^SS lT^sT^SlKaT íc kým i* kovy=(j á'kó “ jeř sodík nebo draslík), soli s kovy alkalických zemin (jako je hořčík nebo vápník), soli s hliníkem a amonné soli, stejně jako soli s vhodnými organickými bázemi, jako je ethanolamin, methylamin, diethylamin, isopropylamin, trímethylamin a podobně.
Jak je uvedeno výše, deriváty peptidů obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, budou mít užitečný farmakologický vliv u teplokrevných živočichů (včetně člověka) při léčbě autoimunních onemocnění a .nebo stavů, na léčbu symptomů nebo jako modifikační činidlo nebo profylaktické činidlo. Mezi taková onemocnění patří například revmatoidní arthritida*;' mnohoČethá ” * sklerózaT^^Goodpasturův^^syndrom;" idiopatická trombocytopenická purpura, mladická revmatoidní arthritida, celiakie, systémový iupus erythematosus, ankyloidní spondylitída, Sjorgenúv syndrom, myastenia gravis, diabetes typu 1 (závislý na insulinu), Hashimotovo onemocnění, Graveovo onemocnění, Addisonovo onemocnění, skleroderma, polymyositida, dermatomyas.i.ti.da.,__p.emf_igus__vul.gar.is_,_ ._pemf.igo.idní_bul.č>.za.,__a.u,to_i_- munní hemolytická anemie, zhoubná anemie, glomerulonefritida, odmítnutí transplantátu a podobně, zejména revmatoidní arthritida a mnohočetná skleróza.
Využitelnost peptídových derivátů obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, může být stanovena za použití mnoha standardních testů, a klinických studií, včetně těch, které jsou popsané v mezinárodní patentové přihlášce číslo WO92/02543, W093/05011 a W095/07707 (nebo jejich modifikací) a pomocí testů popsaných níže. Deriváty peptidu obecného vzorce I vykazují významnou aktivitu při jednom nebo více takových testech nebo studiích.
Test A
Test vazby čištěného HLA-DR peptidu in vitro. (Tento test je možné použít pro demonstraci vazby derivátů .peptidu obecného vzorce I k·molekulám MKC třídy II souvisejícím s onemocněním). 30 μΐ biotin-FHA307.320 (FHA (307-320) peptid, derivát i zovaný na N-konci biotinem s dlouhým řetězcem, Biotin-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) při 800 nM ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS)) se inkubuje s 30 μΐ čištěného HLA-DR4Dw4 při koncentraci mezi 0,5 a 5 pg/ml v mikrotitrační desce s jamkami ve tvaru V (V-jamky) (Nunc) 48 hodin s nebo bez inhibitoru peptidu. Na konci inkubační periody se 100 μΐ inkubátu převede na desky..pro test s enzymem navázaným na imunosorbent (ELISA test) (Nunc), které se předtím povlékly anti-MHC protilátkou (L243 kolekce kultur amerického -typu- (ATCCJ—HBSS, -popsáno - v Lampson-a^-Levy*{ 1980)--J. 'Immunolrr 125, 293-299) při koncentraci 10 pg/ml na 1 hodinu při teplotě místnosti a . potom se 1 hodinu blokuje 1% telecím sérovým albuminem (BSA) v PBS a 0,05% Tween 20. Po další 1 hodině se nevázaný peptid vymyje a ' na 2 hodiny při teplotě místnosti se přidá 1/4000 zředěná streptavidinperoxidáza (Sigma) v PBS s 0,01 % vhodného detergentu,. jako je NP-40 (Sigma)., Po dalším promytí se do každé desky přidá tetramethylbenzidenový (TMB) substrátový roztok (1 TMB tableta (Sigma) v 10 ml 0,1M citrát/acetát pufru, pH 6,0 s 36 μΐ hydroperoxidu močoviny (UHPO) (Fluka)). Reakce se ukončí přidáním 2M kyseliny sírové (10 μΐ na jamku) a pomocí měření absorbance při 450 nm se určí množství vázaného peptidu. Inhibiční aktivita peptidu se získá pomocí vynesení absorbance proti koncentraci. 22 ·· • · . · t • # • · ··* ··#» * **' • t* · · • « « »* ♦·' «Λ Čištěný HLA-DR4Dw4 se získá následujícím způsobem: (i) Exprese HLA-DR v bakulovirovém systému
Exprese rekombinovaných proteinů v buňkách z bakulovirových vektorů je postupem používaným pro· získání vysokého výtěžku rekombinovaného proteinu [Luckow, VA & Summers, MD (1983) Biotechnology, 6, 47-551]. Aby se umožnila exprese ΊϊΙΐeTrodimerηϊή'ο”“"HLADŘ "napři klTd HLA-DR4Dw4 ~ ~~"z j ednoho rekombinovaného bakulovirového vektoru (což odporuje získání oddělených rekombinovaných virů pro a a β řetězce a potom koinfekci) , připraví se dvojnásobný rekombinovaný bakulovirus, který obsahuje a a β řetězce. cDNA kódující sekvence a polypeptidu se klonuje do transferového vektoru pacYMl [Matsuura, Y; Possee, RD; Overton, HA & Bishop, DHL (1987) J. Gen. Virol., 68, 1233-1250], aby se uvedla exprese proteinu pod kontrolu polyhedrinového promotéru. Jednotka se zavede do genomu bakuloviru pomocí homologní rekombinace v buňkách Sf21 a vytvoří se jednoduchý rekombinant bakuloviru pro řetězec a. Techniky pro kultivaci a infekci buněk, pro homologní rekombinaci a detekci/izolaci rekombinovaného viru jsou podrobně popsány Summersem, MDD & Smith GE (1987) [A Manual of Methods for Baculovirus Vectors a Insect Cell Cul ture Procedures,· Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555]. Molekulární genetické techniky používané pro přípravu rekombinovaných vektorů jsou také dostupné v literatuře a jsou podrobně popsány v Sambrook, J; Fritsch, EF & Maniatis T, (1989) [Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press].
Aby se připravil dvojnásobně rekombinovaný bakulovirus, cDNA kódující β řetězec se klonuje do transferového vektoru pAclJWl [Weyer, U; Knight, S &- Possee, RD (1990) J. Gen. Virol., 71, v 23 v 23 • · t • ♦ • · · M ·« • · * ♦ · · »> « · « ··· · · * · #♦ * Vt* Vftt ·· ·♦ •v 1525-1534], a tak se uvede exprese proteinu pod kontrolu P10 promotéru. Jednotka se potom vloží do genomu jednoho rekombinovaného bakuloviru nesoucího řetězec a. Dvojnásobné rekombinované viry se detekují pomocí natečkování buněk infikovaných náhodně sebranými viry z transfekce, na membrány a jejich reakcí s monoklonální protilátkou, například L243, která specificky rozpozná HLA-DR heterodimer. Vázání protilátky k Sf21 buňkám se detekuje za použití standardních průtokových cytometrických technok, které jsou snadno dostupné z literatury. Stabilní, dvojnásobně rekombinované bakuloviry vylučující HLA-DR se čistí z plaku. (ii) Čištění HLA-DR od buněk
Použitá metoda je modifikací metody popsané Gorgou a kol., 1987. (Gorga a kol., 1987. J. Biol. Chem. 262, 16087-16094).
HLA-DR vylučující buňky bakuloviru/Sf21 (10 1, což je přibližně 2 x 101Q buněk) se rozpustí v 100 ml 5 mM EDTA (sodná sůl) , 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 2% NP40, 150nM chloridu sodného, lmM jodoacetamidu, lmM PMSF pomocí homogenizace 10 tahy teflonového ^ skleněného-homogenizéru.*-Homogenát«-.se-odstředbval-’při—100»000* g· 1 hodinu a oddělil se supernatant. Anti-HLA-DR monoklonální protilátka LE3,1 (Gorga a kol., 1936,' Cell. Immunol. 103, 160-172) kovalentně vázaná v poměru 50 mg L243 na 10 ml protein A-v. sefarózy (Pharmacia) a preinkubovaná s 10 mM Tris-HCl, pH 8,0,. 0,1% NP-40 se inkubuje se supernatantem přes noc. Pryskyřice se v potom umístí na kolonu a promyje se 10 mM Tris-HCl·, pH 8,0, 0,1 % NP-40 (20 objemů kolony) potom 0,15 M chloridu sodného, 50 nM Na2HP04, pH 7,0 1 % oktylglukosidem (2 0 objemů kolony) . HLA-DR se eluuje 50 mM diethylaminu pH 11,0, 0,15 M chloridem sodným, 1 % oktylglukosidem. Frakce z kolony se okamžitě neutralizují 1 M Tris-HCl pH 8,0 a zahustí se ultraodstředěním přes membránu centricon 10. Obsah proteinu se určí pomocí BCA proteinového testu (Pierce) a čistota pomocí SDA-PAGE elektroforézy. 24 • V * w " ' - · • » » É * * * ·** * · • · * * · · · · · ·· ·· »»t ·»·* ·* ··
Obecně, deriváty peptidů obecného vzorce I, které jsou definovány výše, které se testovaly v testu A vykázaly významnou inhibici při 'koncentraci asi ΙΟμΜ nebo daleko nižší.
Další výhodný aspekt předkládaného vynálezu zahrnujé derivát peptidu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelnou súl, která se neváže k HLADR3, ale váže se k HLA-DR l a/nebo HLA;.DR4Dw4ria,/nebo,HLAspR4p_y 14 HLA-DR3 _ j.e _ o b e c ná _HLA-DR^a.l_e 1a, která nesouvisí s revmatoidní arthritidou. Tedy, u pacientů s revmatoidní arthritidou·, kteří mají HLA-DR3 jako jednu z jeho alel (což je přibližně jedna třetina z celkového počtu pacientů s revmatoidní arthritidou), nebudou takové deriváty peptidů obecného vzorce I zasahovat do normální role HLA-DR3 v obranné funkcí hostitele. Použití takových derivátů .peptidů je proto zvláště výhodné pro léčbu pacientů s revmatoidní arthritidou, protože dochází k menší imunosupresi, než při použití neselektivních látek vážících DR.
Pomocí varianty testu A se odhadla schopnost peptidu podle vynálezu vázat jednu nebo více molekul HLA-DR následujícím způsobem: (i) Čištění typů HLA-DR z buněčných kmenů
Použitá metoda je modifikací metody popsané v Gorga a kol., 1987, J.Biol.Chem. 262, 16087-16094. Lidské HLA-DR antigeny se čistily z různých buněčných kmenů pomocí imunoafinitní chromátografie. Krátce tedy, lxlO9 - SxlO9 peletovaných buněk příslušného buněčného kmene z Hom 2 (zdroj DR1), BBF (zdroj DR2), AVL-B (zdroj DR3), JAH (zdroj DR4Dw4), JHAF (zdroj DR4Dwl3) nebo Pell7 (zdroj DR4Dwl4) se rozpustí přibližně při 4 °C v 50 ml 5 mM EDTA (sodná sůl), 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 2% NP40, 150 mM chloridu sodného, 1 mM jodacetamidu, 1 mM PMSF, pomocí homogenizace 10 tahy teflonového skleněného homogenizéru. Homogenát se potom odstředbval při 100 000 g 1 hodinu a odebral se supernatant. Anti-HLA-DR monoklonální 25 φ φ φ »· t * • · · ΦΛ m W Ψ - · * w • • · 4 ΦΦ * • * ·*· • Φ • • · Φ Φ ΦΦ Μ protilátka LB3.1 (Gorga a kol., 1986, Cell. Immunol., 103, 160-173) kovalentně kondenzovaná k CNBr-Sefarose 4B (Pharmacia) se ekvilibruje se 150 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 % NP-40 a inkubuje se přes noc se supernatantem. Pryskyřice se potom umístí na kolonu a promyje se 0,15 M chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % oktylglukosidem (20 objemu kolony). HLA-DR se eluuje 50 mM diethylaminu pH 11,0, 0,15 ^M _chloridem sodným, 1 % oktylglukosidem. Frakce z kolony se okamžitě neutralizují 0,5 M HEPES NaOH pH 7,4. Obsah proteinu se určí pomocí Biorad proteinového testu a čistota pomocí SDS-PAGE elektroforézy. (ii) Test selektivity vázání peptidu. 200nM biotin-FHA307.320 v pufrovaném solném roztoku (PBS) se inkubuje s Čištěným HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dwl3 nebo DR4Dwl4 (2-20μ9/πι1) v mikrotitračních deskách s jamkami ve tvaru v (Nunc) s nebo bez inhibitoru peptidů v testovacím pufru (PBS, 0,01% NP40 (Sigma.)) Pro inhibici DR3 se 400nM Biotin-Ahx-(D) Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH' inkubuje" "s 'čištěným DŘ3_ (20 μ9/Ιτύ.) , a inkubuje se tak, jak je popsáno výše. Po 48 hodinách se inkubáty zpracovaly a určila se absorbance tak, jak je popsáno výše. Inhibiční aktivita peptidů, vyjádřená jako hodnota ICS0, se vypočte za použití software Microcal Origin na počítači.
Tes t B
Inhibice aktivace T buněk in vitro (Tento test je možné použít pro demonstraci schopnosti derivátů peptidů obecného vzorce I inhibovat imunitní odpověď T buněk zprostředkovanou molekulami MHC třídy II).
Peptidové inhibitory se testovaly na schopnost blokovat stimulaci B52.24 hybridomové linie T-buněk myší, které reagují na FHA307.330. peptid " (H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys- 26 • · • · φφφ φφφφ * · ·* Φ ··* « • Φ •·Φ Μ
Leu-AI... . -Qly-OH) přítomný v HLA-DR4Dw4 molekulách. Látka B52,24 se připraví fůzí T buněk lymfatických uzlin izolovaných z FHA307..30 imunizovaných HLA-DR4Dw4 transgenních myší (mezinárodní patentová přihláška číslo WO95/03331) s kmenem BW5147 myších lymfatických T buněk (White a· další (1989) J. Immunol. 143; 1822) jak je uvedeno v práci Woods a další (1994) J. Exp. Med. 180, 173-181 a obecnými metodami pro přípravu hybridomů T buněk popsanými v Current Protocóls in~Ϊmmuno1egy* oddíl 2.7.21.
Peptidové inhibitory se smíchaly při ,koncentraci od 100 do 0,1 μΜ (nebo nižší) s antigenním peptidem FHA307.320 o buď různých koncentracích meni 100 a 0,1 μΜ nebo o pevné koncentraci 10 μΜ zředěním v kultivačním médiu RPM1-1640 (Gibco) na 96 jamkové mikrotitrační desce (Nunc) na konečný objem 100: μΐ. Pomocí gluteraldehydu se na 30 sekund ustálily B buňky s expresí HLA-DR4Dw4 (například JAH EBV.transformované kmeny lymfoblástoidních buněk - Evropská kolekce kultur ECACC 85102909) nebo B buňky izolované z HLA-DR4Dw4 homozygotních „j.edinců._ a „transformované.^ pomocí ... Epstein^Barr viru metodou , popsanou v Current Protocols ín Immunology 7.22.1 (suspendováním na 30 sekund v 1% gluteraldehydu (Sigma) při koncentraci 4xl06 buněk/ml). Potom se na 3 minuty přidal ekvivalentní objem 200 mM lysinu (Sigma). Buňky se zpracovaly odstředěním při 300 g, promyly v roztoku RPMI-1640 a nanesly na mikrotitrační desky obsahující antigenní a inhibitorní sloučeniny o .koncentraci 2xl05 buněk na jamku, Mikrotitrační desky se inkubovaly 2 hodiny při 37°C a v atmosféře s 5 % C02.
Mikrotitrační desky se pak promyly v roztoku RPMI-1640 odstředěním při 300 g, dvakrát odplyněny, a pak byly přidány hybridní T buňky kmene B52,24 při koncentraci 105 buněk na jamku v kultivačním médiu (RPMI-1640, 10% fetální hovězí sérum (Gibco) a 2 mM glutaminu (Gibco)). Mikrotitrační desky pak byly inkubovány další 2 dny při 3 7 °C a 5 % C02; Desky se pak 10 minut odstředily při 3 00 g a z každé jamky se před bilogickým testem na obsah IL-2 odebralo 150 μΐ roztoku ke zmrazení při -20 °C.
Kultivační desky obsahující roztoky k testování se ponechaly při teplotě místnosti roztát a 100 ml roztoku se převedlo do č é’fs t Vé^^des fcy s 9 6 amkam i~ “ eT kul a tym" ~ dnefriŤ" “Za~"pou z íti kultivačního media (RPMI-1640 (Gibco), 10% hovězího fetálního séra (Advanced Protein Products), 100 pg/ml streptomycinu a 100 U/ml penicilinu (Gibco) , 2 mM L-glutaminu (Gibco) a 50 μΜ 2-merkaptoethanolu (Sigma)) se provedlo 1:1 sériové zředění IL-2 za získání standardní křivky 250 jednotek/ml až 0,04 jednotky/ml IL-2. Na IL-2 závislý kmen buněk jako CTLL-2 buňky (Nátuře (1977) 268 154-156) nebo HT-2 buňky (J. Immunol. Methods (1987) 94104) se zpracovaly a dvakrát promyly kultivačním médiem, a pak se opět suspendovaly při koncentraci 5x1ο4 buněk/ml. Potom bylo do každé jamky standardní křivky a testovaných vzorků přidáno 100 μΐ suspenze na IL-2 závislých buněk. -Kultivační -desky -se- inkubovaly-72«hodin-při— 37-°C-a--5"%-C03. Potom se do každé jamky přidalo 20 μΐ (lmCi) 3H-thymidinu (Amersham International) a desky se vrátily do inkubátoru na dalších 16 hodin. Obsah každé desky se převedl na filtrační podložku ze skelného vlákna a změřila se radioaktivita, a to pomocí beta scintilačního počítadla.
Obecně platí, že peptidové deriváty vzorce I uvedeného výše, které se testovaly testem B, vykazují silnou inhibici při koncentraci kolem 10 μΜ nebo značně nižší.
Test C
Peptidem stimulovaná DTK (zpožděný typ hypersensitivity) u myší BALB/C. (Test lze použít pro důkaz in vivo aktivity peptidových derivátů vzorce I na zvířecím modelu) Γ Balb/c samice myší ·♦ · Λ! 28 * * · • · · • * · · ·« ♦· • · • · « (18-20 g) ve skupinách po 5 byly podkožně očkovány do slabin 0,1 ml emulse ovalbuminu (Sigma) (2 mg/ml v šalinu) smíchané v poměru 1:1 (objemově) s kompletním Freundovým činidlem (Sigma) . Po sedmi dnech byla stanovena tlouštíka chodidla za použití duálního odpichovacího mikrometru, a pak byla 'do chodidla zadní končetiny vstříknuta 30 μΐ podkožní injekce 1% teplem sraženého ovalbuminového proteinu v šalinu. Dvacetčtyři hodin po vstříknutí antigenu byla chodidla, opět změřena a byla vypočtena DTH odezva jako procento zvýšení tlouštíky chodidla po injekci v porovnání s kontralaterální (druhou) stranou. Inhibitory byly podávány třídenními osmotickými minipumpičkami (Alzet) implantovanými 24 hodin před podáním antigenu v dávce od 10 mg/kg/den až do 0,1 pg/kg/den. Stupeň inhibice byl vypočten z hodnoty otoku inhibitorem ošetřeného chodidla a hodnoty otoku chodidla ošetřeného kontrolní dávkou nosiče, a to vydělením hodnotou kontrolního vzorku a vynásobením 100 %.
Peptidové deriváty vzorce I uvedené výše, které byly testovány v testu C obecně vykázaly silnou inhibici při dávkách 1 mg/kg/den nebo značně menších bez vyvolání jakéhokoliv ·.·, ·· ·ψ M W rr+* · *1-» ' *—**»» * ***· >IM tm*· mu I* . -. .-w- . » JI * * zjevného toxikologického nebo jiného než farmakologickáho účinku.
Test D (Test lze použít pro důkaz in vivo aktivity peptidových derivátů vzorce I na zvířecím modelu arthritidy).
Samice myší balb/c (19-21 g, skupiny po 5-10) se očkují v den 0 a toto se stupňuje až do dne 7, a to podkožní injekcí 0,1 ml emulze obsahující stejné objemy 2 mg/ml methylovaného albuminu hovězího séra (met-BSA, Sigma) v šalinu a kompletního Freundova činidla (Sigma) doplněným 2,5 mg/ml Mycobacterium tudercolosis (MTB, kmen C, DT a PN, MAFF, Weybridge, Surrey) za získání konečné MTB koncentrace 3,5 mg/ml. Současně se navíc podá 0,1 ml injekce 109 organismů Bordetella pertussis (Wellcome 29 tf * « * * a
Pertussis vakclna) v šalinu. Po Čtrnácti dnech se zvířatům do jednoho kolenního kloubu podá 10 μΐ nitrokloubní injekce obsahující 100 ug met-BSA v šalinu a to za použití 30 G jehly a a hamilton· stříkačky. Do druhého kolena se injektuje stejný objem šalinu, což poslouží jako kontrolní vzorek. Po 13 dnech se stanoví velikost zánětu/otoku obou kolen měřením duálním odpichovacím mikrometrem. To s^proyede_řpzem,nůžkami^.s.^.t.upými_~. konci a lékařskými kleštěmi do kůže asi 5 mm nad a pod kolenem a pokračuje se po straně kolena za vytvoření kypsy, která se pak opatrně odstřihne, čímž se obnaží ^zespod ležící kloub. Měření se provede přes nejširší část kolena v horizontální rovině na ohnuté končetině držené v zafixované poloze. Procento zvětšení následkem zánětu v koleně se vstříknutým antigenem v porovnání s kontrolním vzorkem se vypočítá podle vzorce: [tloušfka kolena inj ektovaného antigenem - tlouštíka kolena inj ektovaného salinem / tlouštíka kolena inj ektovaného salinem] x 100. Inhibitory byly podávány třídenními osmotickými minípumpičkami {AI zet) implantovanými 24 hodin před podáním antigen v dávce od 10 mg/kg/den až do 0,1 μg/kg/den. Procento inhibice'· zánětu/otoku·"bylo' 'vypočtehb'^z^ěřění-'tlouštíký resp. hodnoty otoku ve skupině ošetřené inhibitorem a hodnoty v kontrolní skupině ošetřené pouze dávkou nosiče, a to vydělením kontrolní hodnotou a vynásobením 100. Další vyhodnocení choroby zahrnuje l) histologické vyšetření zánětu, synovitidy a eroze chrupavky/kosti provedené na zafixované části kolena obarvené hemotoxylinem a eosinem a 2) stanovení hladiny akutního reaktantu v séru, sérového amyloidu P a/nebo haptoglobinu.
Peptidový derivát vzorce I uvedený výše může v testu D vykázat silnou inhibici při dávce 10 mg/kg/den nebo značně nižší.
Jako ilustraci farmakologické aktivity kontkrétních peptidových derivátů vzorce I vykázaly sloučeniny z příkladů 3 a 6 silnou vazbu k HLA-DR4Dw4 v testu A (nebo variantě testu A popsané zde 30 • · • · I · « 4 i· ·« ·« * *·· ·«·« I · * · I · ·· ·« ♦ » * • # ♦ »« ·· výše) při koncentraci 0,1 mikromolu nebo nižší a v testu C byly aktivní při koncentraci menší než 0,1 mg/kg/den. Sloučenina z příkladu 3 také vykázala silnou vazbu k HLA-DR4Dwl4, ale sloučeniny z příkladu 3 a příkladu 6 nevykázaly silnou vazbu (ICS0 >100 mikromolů) k HLA-DR1, HLA-DR2 nebo HLA-DR3. Obě sloučeniny vykázaly dobrou stabilitu ve vodě při pH 3 a pfí 7,6 a ve formě polymerního extrahovaného depotního prostředku "výkaza1ý^Tninima1ni úbytek v důsledku rozkladu při protlačování a minimální rozklad při uvolnění z tohoto depotního prostředku.
Deriváty peptidú obecného vzorce I je možné připravit pomocí jakýchkoli známých postupů používaných v chemii peptidů, které je možné aplikovat na syntézu analogických peptidů.
Deriváty peptidů obecného vzorce I je možné připravit například pomocí postupů, které jsou analogické postupům popsaným v "Solid Fase Peptid Synthesis·. A practical approach”; Atherton a Sheppard (vydal IRL press v Oxford University Press, 1989). "Solid Fase Peptid Synthesis" od Stewart a Young (vydal Piercé Chemical Company, Illinois, 1984), "Principles of Peptid
Synth.es i sj'___(vydal, „Springer-Verlag‘Berlin,·—-1984) vv' a-* v "sérii"" knih "Amino Acids, Peptids a Proteins" (díl 1 - 25; vydáno 1994) (vydala Roval Society of Chemistry, Cambridge, UK). S výhodou se deriváty peptidů obecného vzorce I připraví pomocí postupné syntézy na pevné fázi. 2a použití této techniky se aminokyselina, která se má připojit na C-konec aminokyseliny peptidů chrání na alfa-aminoskupině, a, pokud je to nutné, na vedlejším řetězci, a kondenzuje se s pevným nosičem, například s pryskyřicí, jako je 2-chlortritylchloridová pryskyřice nebo Merrifieldova pryskyřice (chlormethylpolystyrendivinyibenzen) pokud se po štěpeni požaduje volná karboxylová kyselina, nebo Rink Amid pryskyřice (4-(2’ , 41-dimethoxyfenyl-Fmoc-amino-methyl)fenoxy pryskyřice) nebo Rink Amid MBHA pryskyřice (N-(4-[2’ ,4’ -dimethoxyfenyl-Fmoc-aminomethyl) -f enoxyacetamido-norljsu- cvl)-4-methylbenzhydrylaminová pryskyřice (všechny dostupné od Calbiochem-Novabiochem), pokud se po štěpení požaduje karboxamíd, potom se odstraní chránící skupina z alfa- aminoskupiny. Aminokyselina, která se má připojit na C-konec aminokyseliny, se chrání na alřa-aminoskupině a, pokud je to nutné, ve vedleším řetězci a připojí se na C-konec aminokyseliny, která ^zůstala _ při po j.ena.,^ kypevnému ^no-sř ěi Postupný způsob odstranění skupiny chránící alfa-aminoskupinu a kondenzace s další aminokyselinou se opakuje za získání chráněného nebo nechráněného polypeptidu připojeného k pevnému nosiči. Chráněná aminokyselina onecného vzorce II se může připravit například tak, jak je popsáno v příkladech nebo jak je ilustrováno ve schématu 1 níže, nebo pomocí analogických postupů za použití symetrického nebo nesymetrického aminu vzorce RlR^NH. Aminy obecného vzorce RlR^NH je možné připravit pocí způsobů, které jsou v této oblasti známé, například tak, jak je popsáno v příkladech nebo ilustrováno ve schématu·' 2 níže, nebo analogickými způsoby. Činidla a podmínky použité pro provedení reakčních kroků ve schématech 1 a 2, jako je alkyláce .^alkoholů,-a.-aminů, ~kondenzace- aminů' akdrbóxýlóvýcH*""kyše 1 in za vzniku amidů, vznik močoviny a karbamátů a chránění a odstranění chránících skupin, jsou v této oblasti'dobře známé a jsou popsány ve standardních učebnicích. Skupina' vzorce III nebo IV se do sekvence zavede pomocí vhodně chráněné (3-amino-2-oxopyrrolidin-l-yl)alkanové kyseliny (pro peptidovou sloučeninu obsahujcící III, kde A = methylenová skupina) nebo odpovídajícího oxa analoga získaného tak, jak je popsáno v J. Med. Chem., .1993, 36, 256-263 nebo pomocí analoga (pro peptidovou sloučeninu obsahující III, kde A je atom kyslíku) nebo (6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)alkanové kyseliny (pro peptidovou sloučeninu obsahující IV) na místo chráněné aminokyseliny. Skupina vzorce V může být do sekvence zařazena použitím vhodně chráněné 3-amino-2^oxoperhydroazepin-l-alkanové kyseliny získané podle J. Med. Chem., 1993, 36, 256-263 (nebo analogickým způsobem) nebo tak, jak je popsáno v příkladech níže (nebo analogickým způsobem). Chráněný nebo nechráněný polypeptid se uvolní z pevného nosiče pomocí standardních postupů, například za použití směsi kyseliny trifluoroctové, triethylsílanu a vody.
Je třeba si uvědomit, že vedlejší řetězec chránící skupiny múze byt___štěpen.«=.za==-podmínek _ -ponžíváných"·pro·’.......uvolněn-í^peptidu"' z pevného nosiče nebo může být Štěpen v odděleném kroku za následného uvolnění peptidu z pevného nosiče. Dále je třeba si uvědomit, že způsob výstavby poiypeptidu může být upraven za použití sekvence dvou nebo více vhodně chráněných aminokyselin ve vhodném kondenzačním kroku. Při syntéze je možné použít ruční techniku nebo může být prováděna automaticky, za využití například „Applied Biosystems 431 A nebo 430A" syntetizéru peptidů, „Advanced Chemtech ACT357" syntetizéru peptidů nebo podobných automatických syntetizérů peptidů nebo může být použita kombinace, obou technik. V průběhu syntézy peptidů se aminokyselinové funkční skupiny neúčastnící, „se . reakce .„chrání .. různými—- funkční mi-—skupinami-.-* Například N-koncové aminoskupiny ve vedlejším řetězci mohou být chráněny za použití 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupiny (Pmoc), t-butoxykarbonylové skupiny (Boc), bifenylisopropoxy-karbonylové skupiny (Bpoc), 2 -[3,5-dimethoxyfenyl]propyl-2- oxykarbonylove skupiny (Ddz), adamantyloxykarbonylové skupiny (Adoc), allyloxykarbonylové skupiny (Aloe), 2,2,2-trichlor-ethoxykarbonylové skupiny (Troc), benzyloxykarbonylové skupiny a různých substituovaných benzyloxykarbonylových skupin. Tyto chránící skupiny je možné štěpit, pokud je to nutné, pomocí standardních technik (například pomocí kyselého nebo bazického zpracování, katalytické hydrogenolýzy a reakce s Pd(0) nebo směsí zinek/kyselina octová). 33 *· * ··· #» • · · · · · · • * * « t ····*· ·**· · * · ·· ·· t»· ··** **
Mezi vhodné chránící skupiny používané pro chránění guanidinové skupiny ve vedlejším řetězci v peptidech obsahujících zbytek argininu patří nitroskupina, adamantyloxykarbonylová skupina, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonylová skupina (Mtr), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylová skupina - (Pmc) a (zejména) 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonylová skupina (Pbf). používanými pro chránění vedlejším řetězci jsou t-na a tritylová skupina (Trt).
Vhodnými chránícími skupinami hydroxylové skupiny obsažené ve butylová skupina, benzylová skupí
Vhodnými chránícími skupinami používanými pro imidazolové skupiny ve vedlejším řetězci v peptidech obsahujících zbytek histidinu jsou tritylová skupina, benzylová skupina, tosylová skupina, dinitrofenylová skupina, skupina Adoc, skupina Boc nebo skupina Fmoc.
Vhodnými chránícími skupinami používanými pro chránění karboxylové skupiny ve vedlejším řetězci jsou různé estery (například methylesterová skupina, ethylesterová skupina, t-butylesterová_ _ skupina ,e,Tiiibenzyl es t.erová^skupina,*w-. nit roben zyl--esterová skupina, allylová skupina a 9-fluorenylmethylesterová skupina).
Reakce štěpení chránících skupin je možné provádět při teplotách v rozmezí 4 až 40 °C (s výhodou při teplotě blízké teplotě místnosti) a v časovém rozmezí 10 minut až 24 hodin.
Vhodné způsoby kondenzace používané pro kondenzaci jednotlivých aminokyselin zahrnují běžně používané azidy, symetrické anhydridy, smíšené anhydridy a různé aktivní estery a karbodiímidy. V případě různých karbodiimidů (například dicyklohexylkarbodiimidu nebo diisopropylkarbodiimidu), je možné také použít mnoho přísad (například 1-hydroxybenzotřiazol (HOBT) a N-hydroxysukcinimd). Dále je možné kondenzace aminokyselin dosáhnout také za použití mnoha jiných činidel, například ΙΗ-benzotriazol-l-yl-oxytrispyrrolidinofosfoniumhexa-fluorofosfátu (PyBOP), (2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborátu (TBTU) a (2 -(lH-benzotria-zol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborátu (HBTU). KondenzačníJreakci je možné provádět při teplotách v rozmezí -20 až 40 °C a v časovém rozsahu 10 minut až 24 hodin. Vhodným médiem pro provádění kondenzační reakce je například N, řídíme thylformamiď (DMF) . Zvláště vhodným způsobem je použití HBTU, HOBT a diisopropylethylaminu v dimethylformamidu. Příklady těchto a jiných způsobů syntézy peptidů jsou uvedeny v mezinárodních patentových přihláškách uvedených zde jako odkazy. Hydrofobní zbytek P, který je skupinou vzorce R-, skupinou R.CO-, skupinou R.S02-, skupinou R.O.CO-, skupinou R.NHCO-, skupinou R.O.CS-, skupinou R.S.CO-, skupinou R.NHCS-, skupinou R.S.CS- a skupinou R.CS- (nebo takovou, skupinou přítomnou jako substituent na koncové aminoskupině P, kde P je hydrofobní aminokyselina nebo hydrofobní aminokyselina nesoucí další aminokyselinu) může být zaveden například v koncovém kroku pomocí alkylace, acylace nebo pomocí jiné standardní ^ ^ ^ -1 „ —***. ·*** un. JI H*l T1 ΓΙf.j y>'i ^ -MÍiHHh *· -< <l'WII Nu*" modifikace funkční skupiny koncové aminokyseliny. Pokud je třeba modifikovat C-konec (aby se získalo příslušné Q) , je možné jej provést po syntéze peptidu s využitím běžných způsobů pro modifikaci funkčních skupin. Alternativně je možné příslušné Q získat pomocí vhodné volby počáteční výchozí pryskyřice a/nebo chráněné jednotky, která se nejprve kondenzuje s pryskyřicí (například za použití vhodně chráněné skupiny obecného vzorce H-Q). Typické příklady přípravy peptidových sloučenin obecného vzorce I jsou uvedeny v příkladech níže.
Typickým způsobem pro měření stability derivátu peptidu podle předkládaného vynálezu je následující způsob, kdy, aby se minimalizovalo mikrobiální znečištění a degradace, všechno vybavení, které se používá pro "přípravu roztoků peptidu se 35 ··· ··· · • ··« « • * ·· · sterilizuje v autoklávu a veškeré manipulace s materiálem se provádí ve skříni s laminárnxm proděním třídy II. Přibližně 20 ml roztoku Mcllvainova pufru obsahujícího kyselinu citrónovou a fosfát při pH 3 nebo 7,6 obsahujícího 0,02% azid sodný se filtruje do 50 ml baňky za použití sterilní 0,22 pm filtrační jednotky a 20 ml stříkačky. V uzavřené viálce se přesně zváží přibližně 1,2 mg peptidu. Za použití sterilní pipětové špičky se k peptidu ve viálce přidá dostatečné množství roztoku pufru, aby se získala koncentrace 0,1 mg/ml. Viálka se uzavře a protřepe se za rozpuštění peptidu. Za použití sterilní pipětové špičky se přibližně 1 ml alikvotní díly roztoku peptidu převedou 10 ml HPLC viálek, které se potom uzavřou. 5 viálek se skladuje při teplotě -18 až 37 °C. Plocha píků peptidu pro roztok se určí pomocí HPLC za použití vhodných standardů před a po skladování při -18 až 37 °C 1, 2, 3 a 4 týdny, za použití nové viálky v každém časovém úseku a dvojnásobném stanovení vzorku. Procentuální obsah peptidu zbylého po skladování při 37 °C v každém časovém úseku se určil z poměru plochy píku peptidu v každém časovém úseku ku počáteční^ploše . „Výhodné,,deriváty-,peptidu-podle-předkládaného, vynálezu obsahují více než 90 % a s výhodou více než 95 %, zbylého peptidu po skladování při 37 °C jak při pH 3, tak při pH 7,6.
Deriváty peptidů obecného vzorce I se obvykle podávají teplokrevným živočichům (včetně člověka) z terapeutických nebo profylaktických důvodů teplokrevným živočichům (včetně člověka), kteří takovou léčbu potřebují, ve formě farmaceutických prostředků, které jsou ve farmacii známé. V souladu s dalším rysem předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje derivát peptidu obecného vzorce I, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem. p · · > » « 114 I 9 ♦ • * t * ♦ · • · t * ··» *··* • · · · ♦ » ♦ * 36
Prostředek může být ve formě vhodné pro orální použití, například ve formě tablet, tobolek, vodného nebo olejového roztoku, suspenze nebo emulze; pro nasální. použití, například ve formě prášku pro vdechování, nosního spreje nebo nosních kapek; pro -vaginální nebo rektální použití, například čípků; pro inhalační podávání, například dobře rozetřeného prášku nebo kapalného aerosolu; pro podávání pod jazyk nebo pro bukální 'podavi.ni, například ve formě tablet nebo tobolek; nebo pro parenterální použití (včetně nitrožilního, podkožního, mezi-svalového, nitrocévního a infuzního podávání), například ve formě sterilního vodného roztoku nebo olejového roztoku nebo suspenze. Prostředky mohou být ve formě vhodné pro místní podávání, jako jsou krémy, masti a gely. Také mohou být ve formě náplastí na 'pokožku. Prostředky jsou obecně popsány v kapitole 25,2 v „Comprehensive Medicinal Chemistry", díl 5·, vydavatel Hansch a kol., Pergamon Press 1990.
Obecně je možné výše, uvedené prostředky připravit pomocí běžných postupů za využití běžných přísad. Avšak v případě prostředků pro orální podávání může být vhodné, aby prostředky obsahovaly ""povlaky pro ochranu polypeptidové aktivní složky před působením enzymů v žaludku. Výhodným prostředkem podle předkládaného vynálezu je prostředek vhodný pro orální podávání .v jednotlivé · dávkovači formě, například tabletě nebo tobolce, která obsahuje 2,5 až 500 mg, a s výhodou 10 až 100 mg, polypeptidu v jednotlivé dávce, nebo prostředek pro parenterální podávání, který obsahuje 0,5 až 100 mg polypeptidu na ml, as výhodou 1 až 10 mg polypeptidu na ml.
Prostředek pro parenterální podávání je s výhodou roztok v izotonické solance nebo izotonické dextróze pufrovaný, pokud je to nutné, na pH 5 až 9. Alternativně prostředky pro parenterální podávání mohou být upraveny pro pomalé uvolňování aktivní složky, kdy je množství polypeptidu na jednotlivou * * * * φ *
A 37 *» *· Φ 9 999 9999 9 *9 9 9 99 99 9 9 9 · ·· Ι· dávku obvykle vyšší, než množství používané při běžném injekčním podávání prostředku. Výhodný prostředek pro pomalé uvolňování je prostředek s kontinuálním uvolňováním, například prostředek typu, který je posaný v evropské patentové přihlášce číslo 58481. nebo, pro peptidové deriváty obecného vzorce I obsahující nejméně jednu bazickou skupinu, prostředek posaný v mezinárodní patentové přihlášce číslo W093/24150. Určité -deriváty- -‘pepfidu *'podle - předícládaného vynálezu maj í takové charakteristiky rozpustnosti, které umožňují přípravu a zpracování prostředků pro parenterální podávání s pomalým uvolňováním, zvláště prostředků obsahujících biologicky rozložitelné polyestery, jako jsou polylaktidy a přípravu prostředků s pomalým uvolňováním, které mají výhodnou uvolňovací charakteristiku. Dále deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu obsahující jednu nebo více bazických skupin, zvláště arginin, mohou také tvořit peptidové polymerní soli s polyestery zakončenými kyselinou, jako jsou polylaktidy a takové pepcidy a peptidové polymerní soli tvoří další aspekt podle předkládaného , vynálezu. Určité takové soli mají charakteristiku rozpustnosti, ^ která „umožňuj e._ zvláště^, vhodným způsobem přípravu a zpracování protředků pro parenterání podávání s pomalým uvolňováním, například iak je popsáno v W093/24150, a přípravu prostředků s pomalým uvolňováním s- výhodným uvolňovacím profilem a výhodnou stabilitní charakteristikou při skladování. Výhodné prostředky pro parenterální podávání s pomalým uvolňováním obsahují 1 až 100 mg (například 5 až 50 mg) polypeptidu na jednotlivou dávku. Výhodné prostředky pro parenterální podávání s pomalým uvolňováním jsou také upravené pro uvolňování v periodě nejméně 5 dní. Výhodné deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu zahrnují deriváty, které, pokud jsou ve formě vytlačovaného polymerního prostředku pro skladování, vykazují minimální ztrátu způsobenou degradací na výlisku, nebo které vykazují minimální degradaci 38 w ·: « · • · • · · · ·· * · • · • ·«#· • * ·· • ·»· · t • · · ·· ·· při uvolnění z takového prostředku pro skladování. Typické způsoby pro měření úrovně degradace peptidů podle předkládaného vynálezu jsou následující: Příprava vytlačovaného polymerního prostředku peptidu pro skladování
Asi 20 mg peptidu se přesně zváží a přidá se dostatečné množství'' polymeru (50/50 % molárních kopolymeru póly(D,L-kyselina mléčná/kyseliha glykolová) o přibližné střední molární hmotnosti 20kD a'přibližné polydisperzitě 1,7, což se určí pomocí vytěsňovací chromatografie (size exclus.ion chromatography) za získání přibližně 20% (hmotn./hmotn.) směsi. Ta se rozpustí v ledové kyselině octové prosté anhydridu za získání 10% (hmotn. /obj..). roztoku. Roztok se suší za chladu a získaný zmrazený produkt se skladuje před použitím za vakua.
Asi 100 mg zmrazeného materiálu se vloží do bubnu malého laboratorního extrudéru a plunžrový' píst se·-.stlačí a vzorek sé' tak spojí. Extrudér se zahřeje, na teplotu 90 až 95 °C a při této teplotě se udržuje 10 minut, potom se látka sušená z'a mrazu'" protlačuje ""za tlaku za získání válcovitého výlisku o průměru přibližně 1 mm.
Analýza obsahu peptidu v extrudovaném polymerním prostředku peptidu pro skladování
Dvě přibližně 5 mm dlouhé extrudované části polymeru obsahujícího peptid se přesně zváží a rozpustí se v 1 ml ledové kyseliny octové prosté anhydridu v oddělených 25 ml odměrných baňkách. Přibližně po 1,5 hodině se objem každé baňky doplní destilovanou vodou na 25 ml, čímž dojde ke srážení polymeru. Pevný podíl se odfiltruje za použití 0,5 pm Millex PTFE filtru a roztoky A se shromáždí. Série standardních roztoků . se připraví ze zásobního roztoku peptidu v destilované vodě při 0,5 mg/ml a zásobního roztoku * Ψ * Ψ 9 « · · ·· • · ···» i · * »· ·· • ψ * * ί · · • · · · • · · · •· ·· · 39 polymeru v ledové kyselině octové prosté anhydridu při 2,5 mg/ml, přičemž se každý roztok doplní destilovanou vodou na 10. ml:
Koncentrace peptidu (^ig/ml). Objem zásobního roztoku polymeru (μΐ) Objem zásobního roztoku peptidu (μ1) 50 1000 1000 40 1000 800 30 1000 600 20 1000 400 10 1000 200 5 1000 100 0 1000 0
Každý standard se filtruje- přes 5 μπι Millex PTFE 'filtr a alikvotní díly filtrátu, společně s alikvotními díly roztoků A, se analyzují pomocí HPLC za použití dvojího stanovení každého vzorku. Obsah peptidu v prostředku etrudovaného polymeru pro skladování se vypočte z koncentrce peptidu v roztoku A, která se určí pomocí porovnání plochy píku peptidu v roztoku A s plochou píku peptidu ze standarních roztoků· Výhodné deriváty peptidů podle předkládaného vynálezu vykazují minimální ztrátu způsobenou degradací na výlisku a tedy obsah peptidu v prostředku extrudovaného polymeru se blíží teoretické hodnotě okolo 20 % hmotnostních.
Degradace peptidu při in vitro uvolnění z extrudovaného polymernlho prostředku pro skladování
Roztok Mcllvainova pufrovacího roztoku obsahujícího kyselinu citronovou/fosfát při pH 7,5 obsahující 0,02 % azidu sodného se filtruje přes 0,22 μτη filtr a skladuje se při 4 °C. Do dvou i* · i* · »á · • · • · é » ·«« *··· » · · • · * · • · · · ♦* ·· 40 malých viálek se umístí přibližně 10 mg extrudovaného polymeru pro skladování obsahujícího peptid a přidají se 2 ml pufrovacího roztoku. Viálky se potom uzavřou a skladují se ve vodní lázni při 37 °C 1 měsíc. Ve vhodných časových intervalech v průběhu měsíce' se z každé viálky odeberou tři 0,6 ml alikvotní díly uvolněného média a analyzují se pomocí HPLC nebo se před HPLC analýzou zmrazené skladují v HPLC_j/iálkách„,při_ -18^. Do každé viálky obsahující skladovací hmotu se přidá 1,8 ml pufrovacího roztoku, aby se vyměnilo uvolněné médium, které odstraňovalo v každém časovém úseku.
Průměrné množství neporušeného peptidu v uvolňovacím médiu v každém časovém úseku se určí pomocí HPLC za použití dvojnásobného stanovení porovnáním plochy píku peptidu a uvolněném médiu. s plochou píku peptidu ze standardního pufrovacího roztoku peptidu o známé koncentraci. Přibližné průměrné množství degradovaného produktu peptidu v uvolněném médiu v každém časovém úseku se 'Určí· pomocí HPLC porovnáním plochydalších nových píku v uvolněném médiu s plochou píku peptidu ze standardních pufrovacích roztoků peptidu o jznámých koncentracích a za předpokladu, že se nemění extinkční koeficient. Průměrný kumulativní ín vitro uvolňovací profil nepoškozeného peptidu a celkové množství peptidu (nepoškozeného peptidu a degradačního produktu peptidu) se určí z množství nepoškozeného peptidu a degradačního produktu peptidu v uvolněném médiu v každém časovém úseku. Výhodné deriváty peptidu podle předkládaného vynálezu vykazují minimální degradaci při in vitro uvolňování a tedy vykazují celkovou degradaci peptidového produktu nižší než 10 % a s výhodou nižší než 5 % celkového množství peptidu po 1 měsíci ín vitro uvolňování v Mcllvainově pufrovacím roztoku při pH 7,6 a při 37 °C.
Prostředky podle předkládaného vynálezu se obvykle podávají člověku tak, že například se denní dávka pohybuje v rozmezí 41 • · • · é • φ Φ Φ φ # φ * • φ»φ φ # φ #Φ Μ Φ Φ 10 μσ až 5000 mg, s výhodou 0,1 až 100 mg, na pacienta vážícího 70 kg, přičemž je možné tuto dávku podávat po částech. Přesné množství podávaného prostředku a způsob a formapodávání může záviset na velikosti, věku a pohlaví pacienta a na konkrétním onemocnění nebo stavu,'' který se léčí a na jeho závažnosti, v souladu s principy používanými v lékařské praxi., ^De-ri-vá-fe^pept-idu^obecného^Vzorce^I^nebu^j^ho^f ářmáčěuricky ^ přijatelná sůl se může také s výhodou podávat pro léčebné a profylaktícké účely společně s jedním nebo . více farmako-iogickými činidly, které, jsou v této oblasti obecně známé jako cenné látky při léčbě nebo zmírnění symptomů (nebo jako činidla upravující onemocnění) jednoho nebo více onemocnění nebo stavů uvedených výše, jako je NSAID (jako je ibuprofen nebo piroxicam), analgetika {jako je paracetamol), kortikosteroidy, svalové relaxanty, inhibitory lípoxygenázy, , methotrexát, ( azathioprin, D-penicillamin, Cyklospor.in A nebo terapie monoklonálnírni protilátkami (jako je anti-CD4 nebo anti-TNF). Při diabetů mohou být peptidové sloučeniny podávány společně s insulinem nebo jinými léčivy pro diabetes nebo komplikace .. m. .....i.- rr j i. i i .irtrni- ~•‘im *Hi ί·^ -f·* —*-’» '*#** míM1*"·*' i ··*<·· *****φφ»*&* u/i. i· J|.l r 11 .... nri*. n diabetů (jako je inhibitor aldosreduktázy). Je třeba poznamenat, že taková kombinovaná léčba tvoří další aspekt podle předkládaného vynálezu. V souladu s dalším aspektem předkládaný vynález poskytuje' způsob léčby autoimunních nebo zánětlivých onemocnění zprostředkovaných T-buňkami závislými na MHC třídy II, například jednoho nebo více onemocnění nebo stavů uvedených výše, přičemž způsob zahrnuje podávání účinného množství derivátu peptidu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli teplokrevným živočichům, (včetně člověka), pokud takovou léčbu potřebují. Předkládaný vynález také poskytuje použití derivátu peptidu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli při přípravě nových léčiv pro
•« 9 m * » * * · · · · • « * ··· « « « · · · » ·«*· I· 4* • · · • · · a · 9 • · · · aa ·· 42 použití při léčbě autoimunních nebo zánětlivých onemocnění zprostředkovaných T-buňkami závislými na MHC třídy II.
Kromě výše uvedeného použití sloučenin při léčbě člověka, derivát peptidu obecného vzorce I je také využitelný ve veterinární léčbě podobných stavů u teplokrevných živočichů, jako jsou psi, kočky, koně a dobytek. Obecně se při takové fcTé"č b'ě"""d'e' r i vá pep rrdu^obec ného^ v zurc e^r~ podává’^ v-ana-logícké rrr množství a analogickým způsobem, jako je popsáno výše při podávání člověku. Deriváty peptidů obecného vzorce I jsou také cenné jako farmakologivké nástroje při vývoji a standardizaci testovacích systémů pro hodnocení účinkůmoleku MHC třídy II na laboratorní zvířata jako jsou kočky, psi, králíci, opice, krysy a myši, při výzkumu nových nebo zlepšených léčebných činidel nebo diagnostických činidel. Předkládaný vynález bude dále ilustrován následujícími příklady, které vynález neomezují, ve kterých, pokud není uvedeno jinak:
Ji] zahušťování | a odpařování se provádí pomocí rotačního odpařování za vakua; (ii) operace se provádí při teplotě místnosti, t.j. při teplotě 18 až 26 °C; (iii) výtěžky, pokud jsou uvedeny, jsou určeny pouze pro lepší srozumitelnost a nejsou nutně maximálními dosažitelnými výtěžky, které lze získat po důsledném výzkumu; (iv) používají se následující zkratky (i ve schématech 1 a 2) .
Phv = 5-fenylvaleryl; Boc = terc-butoxykarbonyl; tBu = terc-butyl; DMF = Ν,Ν-dimethylformamid; HOBT = 1-hydroxy-benzo-triazol; Met = methionin; Fmoc = 9-fluorenylmethyloxykarbonyl; Fmoc-Pip-ÓH = N-(9-fluorenylmethoxykarbonyl)piperidin-4karboxy-lová kyselina; Fmoc-Papa-OH = 4-[N-(9-fluorenylmethoxy- 43 • · ··· ·#·· • «4« · ft · • · • · karbonyl)amino]fenyloctová kyselina; Z nebo CbZ = benzyloxy-karbonyl; Pmc=2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl; Pb£ * 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sul£onyl; Trt = tri-tyl; THF = tetrahydrofuran; DMSO = dimethylsulfoxid; HBTU = 2-(IH-benzotriazol-lyl)-1,1,3,3 -tetramethyluroniumhexafluoro-fosfát; DIPEA = diisopropylethylamin; TFA = trifluoróctová kyselina; HPLC = vysokotlaká kapalinová chromatografie; a RP-HPLC = vysokotlaká kapalinová chromatografie na reverznrTazT (která se, pokud není uvedeno jinak, provádí na koloně Vydac C18 218TP54, 4,6 x 250mm); (v) velmi rychlá chromatografie a chromatografie na silikagelu se provádí na Merck Kíeselgel 60 (č. 9385) získaném od E.
Merck, Darmstadt, Německo; (vi) lH NMR spektra se určují při 200 MHz· v deuterochloroformu nebo perdeuterodimethylsulfoxidu (d6-DMSO) za použití tetramethylsilanu (ΤΜΞ) jako vnitřního standardu, a jsou vyjádřena jako hodnoty chemického posunu (delta) v milióntinách vzhledem k TMS za použití běžných zkratek pro označení ~ —důležitých. - píku:*_*s.singlet m,.^mul.tiplet ;„t„triplet . š,, široký, d, doublet; (vii) pro zavedení Lys, Thr, Arg nebo ' His zbytků se použily následující Fmoc-chráněné aminokyseliny: pro Lys: Fmoc-Lys(Boc)-OH; pro Thr: Fmoc-Thr(OtBu)-OH; pro Arg: Fmoc-Arg(Pmc) -OH nebo ’Fmoc-Arg(Pbf)-OH; a pro His:· Fmoc-His(Trt)-OH; (viii) pokud se ve vzorci objeví -II-, znamená to zbytek L-aminokyseliny vzorce II, jak je uvedeno níže, bývají uvedeny hodnoty η, X, R1 a R2; a (ix) pokud se ve vzorci objeví -lila-, znamená to skupinu obecného vzorce lila, jak je uvedeno níže. Μ · • · ♦ * · • Φ I «* • φ • Λ · Φ · · · · · * * · ******* Φ Φ φ Φ *······ Μ · 44 Příklady provedení vynálezu Příklad 1 Příprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip~NH2 (sekv. Č . : 1) (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina,· R^R^-CHjCH^OCHjCHj- och3ch2och3) 1.1 Příprava N2-(9-f luorenylmethyloxykarbonyl)-N4, N4-bis (2 - [2 -(2-methoxyethoxy)ethoxyjethyl)-L-asparaginu
(a) l-Brorr,-2- (2-methoxyethGxy) ethan (3C g) se v dusíkové atmosféře přidá k míchajícímu se roztoku N-benzyldiethanolaminu (10 g) v tetrahydrofuranu (100 ml) . Po částech se potom za chlazení vodní lázní přidá hydrid sodný (5,3 g, 60% disperze v minerálním oleji). Po dokončení přidávání se směs míchá 2 hodiny a po částech se přidá další hydrid sodný (4,4 g 60% disperse v minerálním oleji). Směs se potom nechá míchat 16 hodin při teplotě místnosti. K reakční směsi se opatrně přidá voda (50 ml) a rozloží se tak přebytek hydridu sodného a ze. směsi se odpaří organická rozpouštědla. Ke zbytku se přidá voda a směs se pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové okyselí na pH 2 a potom se extrahuje diethyletherem (2x100 ml). Extrakty se vylijí. pH vodné vrstvy se potom'pomocí přidání 45 • · ♦ · koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného upraví na 12 a extrahuje se diethyletherem (2x150 ml). Etherové extrakty se spojí, promyjí solankou, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se do sucha. Zbytek se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za použití' gradientu chloroform až 5 '% methanol/chloroform za nasycení koncentrovaným vodným roztokem amoniaku. Příslušné frakce se spojí a odpaří do sucha za získání gumovité látky (12 g) . Přidá se methanol (100 ml), potom 10% palladium na uhlí (2,5 g) a mravenčan amonný (7,2 g) a směs se míchá v dusíkové atmosféře 1 hodinu při 6 0 °C. Směs se potom ochladí, filtruje a odpaří do sucha. Zbytek se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za použití gradientu chloroform až 10 % methanol/chloroform za nasycení koncentrovaným vodným roztokem amoniaku. Příslušné frakce se spojí a odpaří do sucha za získání N,N-bis(2 - (2 - (2 -methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)aminu ve formě gumy (7,1 g).; NMR (deuterochloroform) : 2,8 (m, 4H) , 3,3 (s·;· GH), '3,45 (m, 4H), 3,6 (m, 16H). "(b) N-Methylmorfol in’* { 17 6^)7-^ cc-benzylester "'kyseliny -N-terc-butyloxykarbonyl-L-asparagové (2,6 g) , hydroxybenzotriazol (2,16 g) a hydrocruorid 1-(3-dimethyiaminopropyI)-3-etnyikarbo-diimidu (1,68 g) se za míchání přidá k N,N-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)aminu (2,5 g) v dimethylformamidu (12 ml) . Směs se míchá 16 hodin a potom se přidá 2% kyselina octová ve vodě (50 ml. Směs se extrahuje diethyletherem (2x50 ml) a spojené organické extrakty se promyjí roztokem hydrogenuhliČitanu sodného a suší se nad síranem horečnatým. Těkavé látky se odpaří za získání α-benzylesteru kyseliny N2-terc-butyloxykarbonyl-N^N^-bis (2- [2- (2-methoxyethoxy) ethoxy] -ethyl)-L-asparagové ve formě gumy (2,8 g); 46 NMR (deucerochloroform): 1,4 (s, 9H), 2,9 (m, ih), 3,2 (m, 1H), 3,4 (s, 6H) , 3,6 (m, 24H) , 4,6 (m, 1H) , 5,2 (kv, 2H) , 5,8 (d, 1H), 7,4 (s, 5H). (c) 10% Palladium na uhlí (0,8 g) a cyklóhexen (1,6 g) se přidá k roztoku a-benzylesteru kyseliny N2-terc-butyloxykarbonyl-N4, N4-bis (2- [2- (2 -methoxyethoxy) ethoxy] -ethyl) -L-asparagóvé (2,6 g) v methanolu (20 ml) a směs se 2 hodiny zahřívá na 55 °C. Směs se potom ochladí, filtruje a odpaří. Ke zbytku se přidá aceton (20 ml) a voda (8 ml) a; koncentrovaná kyselina chlorovodíková (2 ml) . Směs se zahřívá 1 hodinu na 55 °C, ochladí se a pomocí přebytku pevného hydřogenuhličitanu sodného se pH upraví na 7. Ke . směsi se přidá fluorenylmethylsukcin-imidylkarbonát (1,36 g) a směs se míchá 16 hodin. Těkavé složky se odpaří a zbytek se extrahuje' mezi vodu (25 ml) a diethylether (50 ml).Vodná vrstva se oddělí a pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové se okyselí na pH 3. Směs’ se’ potom extrahuje dichlormethanem (50 ml). Organický extrakt se promyje vodou, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se za ^.získáníluorenylmethyloxykarbonyl)--NÍ, NÍ-bis (2--(2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)-L-asparaginu [níže uvedený jako Fmoc-Asp(PE)-OH] (2 g) ve formě gumy; „NMR .(deuterochlorofor.m) : 2,8 (kv, 1H) , 3,4 (kv, 1H) , 3,4 (s, 6H) , 3,6 (m, 24H) , 4,2-4,6 (m, 4H) , 6,3 (d, IH) , 7,4 (m, 4H) , 7,6 (m, 2H) , 7,8 (d, 2H) . 1.2 příprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina; R1=R2=-CH2CH2OCH2-CH2OCH2CH2OCH3) - *
Peptid se připraví pomocí Fmoc syntézou na pevné fázi, přičemž se vyjde z pryskyřice „Fmoc Rink Amid MBHA Resin" (Novabiochem, 0,50 g; 0,25 mmol), v postupu se kombinuje automatizovaná • * l *’ · IM · 47 I « · · t* ·· »*«···· ·* * syntéza a ruční syntéza za použití Bond Elut zkumavky (Varian, 15 ml, opatřena na dně filtrem).
Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-pryskyřice se nejprve získá za použití ABI 431 přístroje pro autometickou syntézu peptidů pomocí odstranění chráních skupin z pryskyřice a následnou kondenzací a odstranění chránící skupiny z Fmoc-Pip-OK (353 mg, 1 mmol}, Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) , Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) a Fmoc-Val-OH (339 mg, 1 mmol), za podmínek doporučených výrobcem pro jednoduché acylace zahrnující HBTU/HOBT. Po odstraněni chránících skupin se pryskyřice promyje dimethylformamidem (10x10-20 ml) . Karboxylová kyselina (1 mmol) se aktivuje HBTU (1 ekvivalent), HOBT (1 ekvivalent) a DIPEA (2 ekvivalenty) v dimethylformamidu asi 11 minut před převedením na pryskyřici. Acylace se provádí přibližně 60 minut a pryskyřice se potom promyje dimethylformamidem (10 x 10-20 ml). Odstraněné chránící skupiny Fmoc. v. každém.kroku se provádí pomocí 20% roztokupiperidinu v dimethylformamidu (dvě zpracování s 5 ml vždy po 10 minutách) . Po každém odstranění chránící skupiny se pryskyřice důkladně promyje"dimethylformamíděm "{SxloHml')'
Zbvvaiící zbvtkv v sekvenci se oostuoně kondenzuií a odstraňuií * J A J· L· i~ J v· se z nich chránící skupiny ručně. Kondenzace se provádí pomocí přidání roztoku vhodné N-Fmoc chráněné aminokyseliny (1 mmol), dimethylformamidu (1,5 ml), HOBT (165 mg, 1 mmol) a diisopropylkarbodiimidu (155 μΐ, 1 mmol) k pryskyřici. Kondenzace probíhá přibližně 30 minut, promyje se dimethylformamidem (5x10 ml) au malého množství pryskyřice se zkontroluje, zda kondenzace proběhla úplně pomocí Kaiserova testu (E. Kaiser, a kol., (1970), Anal. Biochem. 34, 595).
Odstranění chránící skupiny se provede tak, jak je popsáno výše. Tímto způsobem se Fmoc-Asp (PE)-OH (323 mg, 0,5 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) , Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) , Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) a kyselina 5-fenylvalerová (178 48 φ Φ • «* · · • · Φ Φ · • « • * a · • · • Φ • a ' ·· ·· ·*»·♦·· • « · · • * ·· Φ · • 9 · «Φ Φ· mg, 1 mmol} postupně kondenzují k pryskyřici. Kyselina fenyl-valerová se kondenzuje dvojnásobně než se dosáhne pozitivního výsledku Kaiserova testu.
Peptid se --odštěpí z pryskyřice za -použití směsi kyseliny trifluoroctové (7,9 ml) a triethylsilanu (0,395 ml). Po 2 hodinách se pryskyřice promyje dichlormethanem (asi 150 ml) a výsledný roztok se odpaří do sucha. Vzniklá pevná látka se extrahuje mezi ether (25 ml) a vodu (25 ml) a potom se etherová vrstva extrahuje dalším podílem vody (2x25 ml). Vodné vrstvy se spojí a suší za chladu.
Surový produkt se čistí pomocí preparátivní RP-HPLC (Vydac 218TP1022 kolona, 250mm x 22mm), surová látka se nanese v 10 ml směsí 20% acetonitril/voda. Chromátografie probíhá za eluce gradientem acetonitril/voda obsahujícím 0,1 % kyseliny trifluoroctové při průtoku 12 ml/minutu. Frakce obsahující produkt se spojí a suší za mrazu za získání -Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (kde II je zbytek L-aminokyseliny vzorce II, kde n = 1; X = karbonylová skupina a R1 = R2 = ~CH2CE3ÓCH2CH2ÓCH2CH;och3·) jako'*b'íle^pevné' 1 á tky""(33“mg'
Produkt se charakterizoval pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýza aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC (Vydac C18 kolona, 218TP54, 4,6x250mm, eluce acetonitril a voda obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové, za použití gradientu 10-50 % acetonitrilu gradient za 30 minut, průtok. ..1,.0.. ..ml./min.)., .-.-Z-j ištěna- 94%- čistota,·· ·retenční-..čas -23,-2-9-- -minuty.
Hmotová spektroskopie, m/e (ES") 1220,7 (MH+).
Analýza aminokyselin (kyselá hydrolýza po dobu 24 hodin za použití roztoku 6N kyseliny chlorovodíkové obsahující 1 % fenolu při 130 °C) poskytla Ala 5,82, Val 0,98, Asp 1,19. 49 • «
Fmoc-Pip-OH se získá způsobem, který je analogický způsobu popsanému v E. Atherton a R. C. Sheppard ("Solid fase peptid synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, strana 51) z N-Fmoc-L-methioninu:
Fmoc-Pip-OH: NMR (perdeuterodimethylsulfoxid) 1,3 (m, 2H) , 1,7 (m,· 2H) , 2,5 (m, 2H) , 2,9 (t, 2H) , 3,7 (m, 1H) , 4,2 (t, 1H) , 4,4 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,7 (d, 2H), 7,9 (d, 2H);
Hmotová spektroskopie m/e (ES*) 352,2 (MH*) Příklad 2 Příprava Phv-II-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (sekv. č.: 2) (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina; R1=R2=-CH2CH2OCH2- CH2OCH2CH2OCH3)
Syntéza se provede za použití podobného způsobu jako je popsáno v příkladu 1.2 pomocí postupné kondenzace (ruční) Fmoc-Lys(Boc)-OH (468 mg, 1 mmol) , Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) , Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Asp (PE)-OH (323 mg, 0,5 jrimql) a kyseliny^5-fenylvalerové ,(178.,mg,_1^mmol) ..na^Fmoc-VaLz. Ala-Ala-Ala-Pip-NH-prvskyřici {získáno za použití ruční kondenzace), Peptid se odštěpí z pryskyřice a surový produkt se čistí za použití podobných podmínek jako jsou podmínky popsané v příkladu 1. 'Produkt byl charakterizován pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. ŘP-HPLC (gradient 20-50 % acetonitrile za 30 minut, průtok 1,0 „ml/minutu)...,retenční ..čas. .=. .16,.4- .minuty. ........ , .. . --------- - ......-
Hmotová spektroskopie, m/e (ES*) 1277,8 (MH+) .
Analýza aminokyselin poskytla Asp 1,07, Lys 1,05, Ala 4,9, Val 0,92. 50 I « t • * · • « « · ·· Μ • « • · · • «· · ··♦· Příklad 3 Příprava Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala~Papa-NH2 (sekv. č.: 3) (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina; 1^=^=-CH2N0C (CH2CH2. OCříj),)
3.1 Příprava N2-(9-fluorenylmethyloxykarbonyl)-N4,N4-bis (N,N-bis(2-methoxyethyl)karbamoylmethyl}-L-asparaginu
„(a). „Nrmethylmorfolin -(2..g).,- hydroxybenzotriazol—(4 ~g)v-bis (2-' methoxyethyl)amin (3,5 g) a hydrochlorid 1-(3-dimethylamino-propvl)-3-ethylkarbodiimidu (3,3 g) se při da ke kyselme N-(benzyloxykarbonyl}iminodioctové (2,7 g) v dimethylformamidu (15 ml) a směs se míchá 16 hodin. Těkavé podíly se odpaří a extrahují se mezí vodu a dichlormethan. Organický extrakt se promyje vodou, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na' silikagelu za eluce gradientem chloroform až 10 % methanol/chlorform za získání N-(benzyloxykarbonyl)iminodi-(N,N-bis(2-methoxyethyl)]-acetamidu ve formě gumy (2,3 g); NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): 3,1-3,4 (4 singlety způsobené rotamery, 12H) , 3,5 (m, 16H) , 4,2 (s, 4H) , 5,05 (s, 2H) , 7,3 (m, 5H) . 51 • « t · · 9 · d*·* • · · ··· ·· »· (b) 10% Palladium na uhlí (0,2 g) a cyklohexen (2 ml) se přidají k N-(benzyloxykarbonyl)iminodi-[N,N-bis(2-methoxy- ethyl)]acetamidu (3,5 g) v ethanolu (20 ml) a směs se míchá při 55 °C v dusíkové atmosféře 4 hodiny. ReakČní směs se ochladí, filtruje a odpaří. K roztoku zbytku v- dimethyl· formamidu (15 ml) se za míchání přidá N-methylmorfolin (1,4 g), hydroxybenzo-triazol (1,85 g) , α-benzylester kyseliny N-terc-butyloxy-karbonyl-L-asparagové (2,4 g) a 'hydrochlorid 1-(3dimethyl-aminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (1,6 g) . ,Směs se míchá 16 hodin a potom se přidá 2% kyselina octová ve vodě (50 ml) a extrahuje se diethyletherem (2 x 50 ml) . Spojené organické extrakty se promyjí roztokem hydrogenuhličitanu sodného, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se za získánía-benzylesteru N2-terc-butyloxykarbonyl-N4,N4-bis[N,N-bis(2-methóxyethyl)-karbamoylmethyl]-L-asparaginu(4,1 g) ve formě gumy; ’ NMR (perdeuterodimethylsulfoxid) : 1,4 (s, 9Ή), 2,6 (m, 2H) , 3,2 (překrývající se singlety způsobené rotamery, 12H), 3,4 - (m, 16H) , 4,0-4,4 (m, 5H) , 5,1 (s, 2H) , 6,8 (d, 1H) , 7,4.{s, 5H) . (c)“f Použitím* analogického^poštupu' "j a ko-*· v “příkladu!, čášťi“*Tc) , ale za použití α-benzylesteru N3-terc-butyloxykarbonyl-N4, N4-bis [N,N-bis (2-methoxyethyl)"-karbamoylmethyl] -L-asparaginu (4 g) jako výchozí látky, se získá N2'-(9-fluorenylmethyloxykárbonyl)-N4,N4-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl} karbamoylmethyl]-L-asparagin f a (níže uváděný jako Fmoc-Asp (TE) -OH) (3 g) ve formě .gumy,· NMR (deuterochloroform) : 2,,8 (m, 1H) , 3,1 (m, 1H) , 3,3 (překrývající se singíety způsobené rotamery), 12H), 3,6 (m, 16H) , 4,2-4,8 (m, 8H) , 6,4 (d, 1H) , 7,4 (m, 4H) , 7,6 (d, 2H) , 7,8 (d, 2H) . 3.2 Příprava Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH2 (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina; R1=R2=-CHzCON (CH2CH2-OCH3)2)
• · 1 • * t « ♦* ·♦ 52
Syntéza se provádí podobným zpsůobem, jako je popsáno pro příklad 1,2 pomocí odstranění chránící skupiny z pryskyřice a postupné kondenzace a odstranění chránící skupiny s Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, (2S)-[(3R)-3-(N-9-fluorenylmethyloxykarbonyl-amino)-2-oxo-pyrrolidin-l-yl]propionovou kyselinou (Fmoc-IIIa-OH) , Fmoc-Thr (OtBu)-OK, Fmoc-Asp (TE) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH a 5-fenylvalerovou kyselinou při příslušných kondenzačních krocích, které se provádí ručně. Produkt byl charakterizován pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC (gradient 10-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0 ml/minutu) , retenční čas = 21,88 minuty.
Hmotová spektroskopie, m/e (ES+) 1395,8 (MH*) .
Analýza aminokyselin poskytla Asp 1,04, Thr 0,93, Ala 3,12, Arg 0,92·.
Fmoc-Papa-OH se získá analogickým způsobem, jako je popsáno v E. Atherton a R. C. Sheppard ("Solid fase peptid ^ synthesis: i a practical approach1', IRL press, 1989, strana 51) z N-Fmoc-L-methíoninu:
Fmoc-Papa-OH: NMR (perdeuterodimethylsulfoxid) 3,5 (s, 2H) , 4,25 (t, 1H) , 4,5 (d, 2H) , 7,1 (d, 2H) , 7,4 (m, 6H) , 7,75 (d, 2H) , 7,9 (d, 2H) , 9,6 (s, 1H) ;
Hmotová spektroskopie m/e (ES+) 372,1 (M-H)'. (2S)-2-((3R)-3-(N-[9-fluorenylmethyloxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-l-yl]propionová kyselina (Fmoc-IIIa-OH) se získá následujícím způsobem: 53 φ • φ φ . • »
φ φ · »«· · (i) Příprava Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe
S O n
Ni H
O
O N-methylmorfolin (5,6 g), hydrochloridu methylesteru L-alaninu (3,9 g) , HOBT (4,6 g) a 1-(3-diraethylaminopropyl) -3-ethyl-karbodiimid-(5,3 g) se přidá k roztoku Boc-(D)-methioninu (7 g, 0,023 mol) v suchém dimethylformamidu (50-ml) . Směs se míchá přes noc. Rozpouštědlo se odstraní odpařením a zbytek se extrahuje mezi dichlormethan (100 ml) a 5% vodný .roztok kyseliny octové (50 ml). Za stání krystalizuje KOBT a odstraní se filtrací a organická vrstva se oddělí apromyje se vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, suší se nad síranem hořečnatým a odpaří. Zbytek (8,5 g) se 'čistí pomocí velmi rychlé chromatografie na nálevce s fritou za eluce směsí dichlormethan a ether (0 až 100 % ether). Frakce obsahující produkt se spojí a odpaří za získání ' Boc- (D) -Met-(L)-Ala-OMe ^ -^1,. 1—- I- | ~ ........... ** — 'h-uw... -4* 1' -+........... JI' . .nr I · **a*+****»******l*m*l"· (7,2 gj ve formě gumy, která krystalizuje stáním; NMR (deuterochlorcfcrm) : 1,4 (d, 3H) , 1,45 (s, 9H) , 1,95 (m, 1H) , 2,1 (s, 3H) , 2,1 (m, 1H) , 2,6 (m, 2H) , 3,75 (s, 3H) , , 4,3 (š s, 1 H) , 4,6 (m, 1 H) , 5,3 (m, 1 -K) , 6,9 (š s, 1 H} . (ii) Příprava methyl (2S)-2-[(3R)-3 -(N-[terc-butyloxykarbonyl]-amino)-2-oxopyrrolidin-l-yl]propionátu
O
Poznámka: Tato sekvence musí být připravena za suchých podmínek se suchým rozpouštědlem, jinak probíhá epimerace. Methyljodid 54 * ♦ * • · * • · • · • ψ 9 * Ο · • ♦ ♦·
(10 ml) se "přidá k Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe (8 g) ve směsi dimethylřormamidu (20 ml) a dichlormethanu (20 ml) a směs se nechá 15 hodin stát a potom se odpaří do sucha. Přidá se další dichlormethan (2x50 ml) a znovu se odpaří, aby se odstranil zbytek methyljodidu a zbytek se rozpustí ve směsi dimethylformamid (300 ml) a dichlormethan (300 ml) , Směs se ochladí přibližně na 5 °C a najednou se přidá hydrid sodný (0,76 g 80% disperze v minerálním oleji) a směs se míchá při teplotě místnosti 2 hodiny. Přidá se nasycený vodný roztok chloridu amonného (50 ml) a směs se odpaří do sucha a potom se extrahuje mezi ether a vodu. Etherový extrakt se promyje solankou a suší se a odpaří se za získání gumy, které se čistí pomocí velmi rychlé chromatografie a nálevce s fritou (25 % ethylacetát .-hexan až 100 % ethylacetát) za získání methyl (2S) -2- [ (3R)-3-(N-[terc-butyloxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl)propionátu ve formě gumy (4,2 g) , která krystalizuje stáním: NMR (deuterochloroform) : 1,4 (s, 9H), 1,4 (d, 3H), 1,8 (m, 1H) , 2,6 (m, 1H) , 3,4 (m, 2H) , 3,7 (m, 3H) , 4,2 (m, 1H) , 4,9 (kv, 1H) , 5,2 (šs, 1H) . _________ jim***· ·» *. »'i iWW"fí - ^ “ 1 1,r+ *** (iii) Příprava kyseliny (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-fluorenylmethyl-oxykarbonyl)amino)-2-oxopyrrolidin-l-yl]propionové (Fmoc-IIIa- OH)
OH
Methyl (2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butyloxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-l-yl)propionát (4 g) se zahřívá k varu ve směsi acetonu (60 ml) , vody (4 0 ml) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (24 ml) 3 hodiny a směs se odpaří do sucha. · 4 · · I I • · 4 4 ·· « · · ·«« e • · · · ··· ··*· 44 44 « · * • · t * * · * 4 t · 4 ftft I» 55 Přidá se voda a odpaření se opakuje. Zbytek se rozpustí ve vodě (15 ml) a přidá se přebytek pevného hydogenuhličitanu sodného. Přidá se 9-fluorenylmethylsukcinimidylkarbonát (5,2 g) v acetonu (30 ml). Směs se míchá 16 hodin a potom se rozpouštědlo odstraní odpařením a zbytek se extrahuje mezi vodu a ether. Vodná vrstva se oddělí, okyselí se pomocí kyseliny chlorovodíkové na pH 3 a extrahuje se dichlormethanem. Organická vrstva se promyje vodou, suší se nad síranem hořečnatým a odpaří se za získání bílé pěny, která krystalizuje po trituraci etherem za získání kyseliny (2Ξ)-2-[(3R)-3-(N-(9-fluorenylmethyloxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-l-yl)propionové (4,2 g) jako bílé pevné látky, teplota tání 190-193 °C (za rozkladu); NMR (deuterochloroform) : 1,4 (d, 3H), 2,0 (m, 1H), 2,6 (m, 1H) , 3,4 (m, 2H), 4,2 (t, 1H), 4,4 (m, 3H), 4,9 (m, 1 H), 5,8 (šs, 1 H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,7 (d, 2H). Příklad 4 Příprava ^Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val - Ala- Ala- Ala- Píp-NH2 '“(sěkv 4) (vzorec II: n=l; X=karbonylová. skupina,· R^R^-CHjCON (CH2-CH2OCH3)2) Příprava se provádí za použití podobného způsobu jako v příkladu 1,2, za použití Fmoc-Asp(TE)-OH místo Fmoc-Asp(PE)-OH ve vhodném kondenzačním stupni......_ . . ...... ,
Produkt byl charakterizován pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC (gradient 10-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0 ml/minuta), retenční čas = 23,9 minuty.
Hmotová spektroskopie, m/e (E£T) 1274,7 (MH*) . * 9 9 * * « t · t ·· 4 · ·«·« · φ 9 9 9* ««·dl·· ·· ·· Μ * • 9 • · · *9 * * • 9 · * 99 ·* 56
Analýza aminokyselin Asp 1,03, Ala 5,94, Val 0,98. Příklad 5 Příprava Phv~Arg-A.la-Ala-IlIa~Ala-II-Ala~Papa~NH2 (sekv.. Č.. : 5). (vzorec II: n=l; X=karbonylová skupina; r^r^-C^CHjOCHjCHj-OCHjCHjOCHj) Příprava se provádí za použití podobného způsobu jako v příkladu 1,2, pomocí postupné kondenzace a odstraněních chráních skupin (ručně) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH. Fmoc-
Asp(PE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Ala-OH (dvakrát), Fmoc-Arg(Pbf)-OH a 5-fenylvalerové kyseliny, následného odštěpení pryskyřice a čištění pomocí preparativní RP-HPLC. Produkt byl charakterizován pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC (gradient 10-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0 ml/minuta) , retenční čas --20-,45 minuty.
Hmotová spektroskopie: m/e (ES+) 656,4 (M^H**) . „ —__ I J ..I i" - iiT 11 m ·+·’·*" "I·""*·" '“*· ·' 111 Μ·Ψ· ^** »·****► .
Analýza aminokyselin: Arg 1,06, (Ala + lila) 4,85, Asp 1,09 Příklad 6 Příprava Phv-Arg-Ala-Ala-II-Thr-lila-Ala-Papa-NH2 (sekv. č.: 6) (vzorec II: n=l: X=karbonylová skupina; Rl=R2=CK2CON [ (CH2-CH,0)3CH3]2 57
♦ « « φ ΦΦΦ · # Φ ·· ·Φ 6·1 Příprava Ν2-{9-fluorenylmethyloxykarbonyl) -Ν'*,ΙΓ-bis [Ν,Ν- bis(2- [2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)karbamoylmethyl]-L-asparaginu (CH2CH20)3CH.
H I OH 2a použití analogického způsobu jako v příkladu 3.1 pro přípravu Fmoc-Asp(TE)-OH, ale za použití úměrného množství bis(2-2 [-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)aminu v části (a) místo bis(2-methoxyethyl)aminu, se získá N2-(9-fluorenylmethyloxy-karbonyl) -U4,-bis[N;N-bís(2-[2-(2-metnoxyethoxy)ethoxy]-ethyl)karbamoylmethyl]-L-asparagin (níže uvedený jako Fmoc-Asp(TPE)-OH) ve formě oleje; - NMR (deuterochloroform) : 2,9 (m, 1 H) , 3,1 (m, 1 H) , 3,4 (m, 12K) , 3,6 (m, 45H), 4,2-4,6 (m, 8H) , 7,4 (m, 4H) ^ 7,6 (m, 2H) , 7,8' (d, 2H) . Při provádění kroků (a) a (b) se získají následující meziprodukty v tomto pořadí: N- (benzyloxykarbony 1).iminodi-Í.N„,-.N^bis--(-2- [2 --(•2-methoxyethoxy) -ethoxy]ethyl)]-acetamid; NMR (deuterochloroform); 3,4 (m, 12H) , 3,6 (m, 48H) , 4,3 (s, 2H), 4,4 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,3 (s, 5H). α-benzylester N2-terc-butyloxykarbonyl-N4, N4-bis [N,N-bis (2- [2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)karbamoylmethyl]-L-asparaginu; «Λ ·· · • * • # • ι « • · * v • » ·· * IM · · • · * • · · · 58 NMR (deuterochloroform): 1,9 (s, 9H) , 2,7 (m, 1H) , 3,05 (m, 1H), 3,4 (m, 12H), 3,6 (m, 48H), 4,4 (m, 5H), 5,2 {s, 2H), 5,9 (šd, 1H), 7,4 (m, 5H}.
6.2 Příprava Phv.-Arg-Ala-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NHZ (vzorec IX: n=l; X= karbony lová skupina,· R1=R2 = -CHjCH2OCH2CH2“ OCH2CH2OCK3) Příprava se prováděla za použití podobného postupu jako je popsáno v příkladu 1.2, postupnou kondenzací a odstraněním chránících skupin (ručně) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-0H, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TPE)-OH, Fmoc-Ala-OH (dvakrát), Fmoc-Arg-(Pbf)OH a 5-fenylvalerové kyseliny, následným odštěpením pryskyřice a čištěním pomocí preparátivní RP-HPLC. Produkt se charakterizoval pomocí HPLC, hmotové spektroskopie' a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. t .RP-HPLC (gradient 10-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0 ml/minuta); retenční čas = 23,61 minuty. ^5)9tová„spektroskopie :-m/e~ (ES" )-17487 0—(MH*) —---
Analýza aminokyselin: Arg 1,01, Ala 3,18, lila 1,05, Asp 0,97. Thr 0,78 . Příklad 7 * Příprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH2 (sekvence č.: 7) (vzorec II: n=l; X=karbonýlová skupina; R^R^-CHjCON (CH2- CH2OCH3)2) Příprava se prováděla za použití podobného postupu jako je popsáno v příkladu 1.2, postupnou kondenzací a odstraněním chránících skupin (ručně) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, 1« · « · · • t · t · « ·«· I · I »•1*· • I · « I I « · · tf » · * · • · · » 59
Fmoc-Ala-OH (třikrát) a 5-fenylvalerové kyseliny, následným odštěpením pryskyřice a čištěním pomocí preparativní RP-HPLC. Produkt se charakterizoval pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC {gradient 20-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0- ml/minuta) , retenční čas = 16,07 minuty.
Hmotová spektroskopie: m/e (ES") 1395,7 (MH*)
Analýza aminokyselin: Arg 1,01, Ala 3,06, Asp 1,02, Thr 0,92, Pro 0,92, Gly 1,05 Příklad 8 Příprava Phv-II-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH2 (Sekvence č.: 8) (vzorec II: n=2; X=karbonylová skupina; R1=R2=-CH2CON (CH2-CHaOCH,)2) 8.1 Příprava N2-(9-fluorenylmethyloxykarbonyl)-N4,N4-bis [N,N-_ u bis (2-methoxyethyl),karbamoylmethyl].-L-glutaminu>-~»‘~~"~ —»-—-
Za použití analogického způsobu jako v příkladu 3.1 pro přípravu Fmoc-Asp(TE)-OH, ale za použití příslušného množství 60 ·» · • · • 4 · ·» ·· · • ♦· t α-benzylesteru N-terc-butyloxykarbonyl-L-glutamové kyseliny v části (b) místo α-benzylesteru N-terc-butyloxykarbonyl-L-asparagové kyseliny, se získá N2-(9-fluorenylmethyloxy- karbonyl) -N^N^-bis [Ν,Ν-bis (2-methoxyethyl) karbamoylmethyl] -L-glutamin (níže uvedený jako Fmoc-Glu(TE)-OH) ve formě oleje: NMR (deuterochloroform): 2,0-2,4 (m, 4H), 3,3 (m, 12H), 3,5 (m, 1SH) , 4,2-4,6 (m, 8H) , 7,4 (m, 4H) , 7,6 (m, 2H) , 7,8 Cd, 2H) . Při kroku (b) se získá následující meziprodukt: a-ben2ylester N^terc-butyloxykarbonyl-N^N^-bís [Ν,Ν-bis (2-methoxyethyl) -karbamoylmethyl]-L-glutaminu ve formě gumy; NMR (deuterochloroform): 1,4 (s, 9H) , 2,0 (m, 1H), 2,2 (m, 1H), 2,4 (m, 2H) , 3,3 (s, 12H) , 3,5 (m, 16H) , 4,1-4,5 (m, 5H) , 5,2 (s, 2H), 7,3 (s, 5H). 8.2 Příprava Phv-II-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH2 (vzorec II: n=2; X=karbonylová skupina,- R1=R2=-CH2CON (CH2-CH2OCH3)3) 1/· i*"1» Ví ví n —. » JvOiiaCii^ CLt, u. Příprava se prováděla za použití podobného postupu jako je popsáno v příkladu 1.2, postupnou chránících skupin (ručně) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(TE)-OH a 5-fenylvalerové kyseliny, následným odštěpením pryskyřice a čištěním pomocí preparativní RP-HPLC. Produkt se charakterizoval pomocí HPLC, hmotové spektroskopie a analýzy aminokyselin, jak je uvedeno níže. RP-HPLC (gradient 10-50 % acetonitril za 30 minut, průtok 1,0 ml/minutu, retenční čas = 22,23 minuty.
Hmotová spektroskopie: m/e (ES+) 1472,2 (MH*) .
*% « · I * · · ψ * · * ·· • · * ···· · • t * * · *······ ·· ·· 61
Analýza aminokyselin: Arg 0,95, Ala 2,17,"His 0,98, Glu 0,99, Val 0,92, lila 0,96. Příklad 9
Sloučeniny podél předkládaného vynálezu je možno podávat při léčebném nebo profvlaktickém použití teplokrevným živočichům -j-ako je člověk ve formě běžných farmaceutických prostředků, přičemž typický příklad je následující:
Roztok pro injekční podávání 0,01 to 100 mg aktivní složky se rozpustí ve 2 ml vodného nosiče pro injekční podávání za získání koncentrace aktivní složky 0,01 to 100 mg/ml. Vodné vehíkulum pro injekční podávání je pufrováno na pH mezi 5 až 8 za použití farmaceuticky přijatelných pufrovacích látek (například fosfátu nebo acetátu) a obsahuje farmaceuticky přijatelná činidla upravující tonus (například chlorid sodný nebo dextrózu) ,· pomocí kterých se získá isotonický roztok. Vehikulum může popřípadě také obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné přísady, jako jsou rozpouštědla (například'”dímethylsulfoxid, ethanol, propylen-glykol nebo polyethylenglykol) konzervační látky a antioxidanty. Použitou aktivní látkou může být sloučenina uvedená v příkladech cýše a může být běžně přítomna ve formě farmaceuticky přijatelné soli.
Poznámka: (1) Pro peptidy... obsahující- skupinu· · vzorce"· IV'/' (Sj’ -2- [ 1 - (9 -fluorenylmethyloxykarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl] propionová kyselina (Fmoc-IV-OH) může být z./skána následujícím způsobem: 62 62 - · · * · • ♦ • ♦ « «·· · · · * · φ · * ♦ ·· i · · ··· * » • · * · · • ·· ♦♦♦♦ »· ·· (i) Příprava (RS)-2-allyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolinu
\J
Methylester N-benzyloxykarbonylprolinu (13 g) v tetrahydro-furanu (20 ml) se v dusíkové atmosféře při -78 °C přikape k lithiumdiisopropylamidu (27,5 ml, 2M v hexanu/tetrahydrofuranu) v tetrahydrofuranu (100 ml) . Směs se míchá 30 minut a potom se přikape allyljodid (5,5 ml) a směs se míchá dalších 30 minut a potom se nechá ohřát na teplotu místnosti. Směs se potom přidá k vodnému roztoku chloridu amonného (200 ml) a extrahuje se etherem (2x200 ml). Etherová vrstva se odpaří a.zbytek se čistí pomocí chromatograf ie na silikagelu za použití'~gradientu -hexanu až 20 % ethylacetát/hexan. Po odpaření vhodných frakcí do sucha se získá methyl (RS)-2-allyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolinát, (9 g) ve formě oleje. 8,5 g této látky se1 rozpustí v methanolu (40 ml) a přidá se hydroxid sodný (4,5 g) ve vodě (20 ml) a směs se zahřívá 60 minut k varu. pH směsi se potom pomocí koncentrovaně kyseliny chlorovodíkové upraví na 7 a methanol se odpaří. Potom se pH směsi upraví na 3 a směs se extrahuje etherem (2x5 0 ml) . Spojené etherové extrakty se odpaří za získání: (RS).-2_-:allyl-N-. (benzyloxykarbonyl)prolinu ve formě gumy; NMR (perdeuterodimethylsulfoxid (100 °C)): 1,9 (m, 2H), 2,1 (m, 2H) , 2,6 (kv, 1H) , 2,9 (kv, 1H) , 3,4 (m, 1H) , 3,6 (m, 1H) , c, 0 (m, 4H), 5,75 (m, 1H), 7,3 (m, 5H). 63 • · * • · · · ·
(ii) Příprava methylesteru [ (RS) -2’-allyl-N- (benzyloxy-karbonyl)]prolyl-(S)-alaninu
J 11 0=\ 0
O 0
HOBt (7,7 g), N-methylmorfolin . (6,6 g), hydrochlorid methylesteru L-alaninu (4,5 g) a 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid (5,7 g) se přidá k ,{RS)-2-allyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolinu (6,5 g) v dimethylformamidu (30 ml) a směs se míchá 18 hodin- a potom se-odpaří. Zbytek se extrahuje mezi ether a vodu, filtruje, čímž se odstraní HOBt a organická vrstva se oddělí. Organická vrstva se odpaří a zbytek se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za použití gradientu 20 % ethylacetátu v hexanu až 50 % ethylacetátu v hexanu. Příslušné frakce... se—spoj í*. -a—odpaří — do - sucha**" za"'**' zí skáni “ “ methyle" s’ t e ru [(RS)-2-allyl-N-(benzyloxykarbonyl)]prolyl-(S)-alaninu (7 g) ; NMR (perdeuterodimethylsulfoxid (100 °C)) : některé zdvojené píky způsobené směsí diastereomerů, 1,25' a 1,3· (2d, ‘ 3H) , 1,75 '(m, 2H) , 2,2 (m, 2H) , 2,65 (m, 1H) , 2,9 (m, 1H) , 3,4 (m, 1H) , 3,65 (2s, 3H) , 3,7 (m, .1 H) , 4,3 (2kv( 1 H) , 5,0 (m, 4H) , 5,7 (m, 1H), 7,3 (m, 5H), 7,4 a 7,5 (šs, 1 H) . (iii) Příprava methyl (S)-2-(l-benzyloxykarbonyl-6-oxa-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionátu. (CbZ-IV-OMe)
O 0
O
O
N 64 • » 4* 4» * ♦ · • · β * * • t · · «·« ·*·«
Oxid osmičelý (1,5 ml 4% vodného roztoku) se přidá k methylesteru[(RS)-2-allyl-N-(benzyloxykarbonyl)]prolyl-(£)-alaninu (1,45 g) ve směsi methanol (30 ml) a voda (20 ml) . Směs se míchá 10 minut v argonové atmosféře a po částech se přidá 2,45 g jodistanu 'sodného. Směs se míchá 2 hodiny a potom se přidá 100 ml vody a směs se extrahuje ethylacetátem (2x70 ml).
Spojené extrakty se suší a odpaří za získání 1,4 g gumy. Guma se rozpustí v dichlormethanu {30 ml) a přikape se triethylsilan (0,65 g) a kyselina trifluoroctová (4 g) . Směs se míchá 3 hodiny, odpaří se a zbytek se extrahuje mezi vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného a ether. Etherový extrakt se oddělí a odpaří do sucha. Zbytek se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za použití gradientu 25 % ethylacetát v hexanu až 100 % ethylacetát. Příslušné frakce se spojí a odpaří do sucha za získání methyl (S)-2 -(l-benzyloxykarbonyl-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionátu (0,8 g); NMR (perdeuterodimethylsulfoxia (100 °-C)) : některé -zdvojené píky způsobené směsí diastereomerů, 1,25 a 1,35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H) , 3,1-3,5 (m, 4H), 3,6 a 3,65 (2s, 3H), 4,5 a 4,65 (2kv, ΊΗΓΓ'5', 05 "(mT2H)7'!*25~Tm, SK)". ' (ív) Příprava (S)- 2 -(β-οχο-1,7-diazaspiro-[4,4]non-7-yi)propi-onové kyseliny (H-IV-OH)
N H
O ΌΗ
Uhličitan draselný (2,5 g) se přidá k methyl (S)-2-(1-benzyloxykarbonyl-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionátu (3,3 g) ve směsi methanol (40 ml) a voda (40 ml) a směs se míchá, při teplotě místnosti 10 hodin. Pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové se pH upraví na 5 a směs se odpaří do sucha. Zbytek se rozpustí ve vodě (40 ml) a pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové se pH upraví na 3. Směs 65 #* Φ * 9 * * Φ • Φ Φ·· Itlt t · · · » I ·· • β · φ φ » · φ Μ ·· se extrahuje dichlormethanem (2x50 ml). -Spojené extrakty se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se za vzniku pěny (2,8 a). Pěna se rozpustí v methanolu (20 ml) a přidá se cyklohexen (0,7 g) a 10% palladium na uhlí (0,5 g) . Směs se zahřívá 2 hodiny k varu, ochladí se', filtruje á filtrát se odpaří za získání (S)-2-(6-oxo-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionové kyseliny ve formě pěny (1,9 g) ; NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): některé zdvojené píky způsobené směsí diastereomerů, 1,25 a 1,3 (2s, 3H) , 1,8 (m, 4H), 2,0 (m, 2K), 3,0 (m, 2H) , 3,3 (m, 2H) , 4,5 (m, 1H) . (v) Příprava (S)-2-[1-(9-fluorenylmethyloxykarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro-[4,4]non7-yl]propionové kyseliny (Fmoc-IV-OH)
KliM. ............. I ' liWf·- H-
Přebytek pevného hydrogenuhličitanu sodného se přidá ke kyselině (Ξ) -2-(6-oxo-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionové (0,42 g) ve vodě (2 ml) a potom se přidá 9-fluorenylmethyl-sukcinimidylkarbonát (0,7 g) v acetonu (3 ml). Směs se míchá 18 hodin. Směs se potom nalije do vody {10 ml), extrahuje se '“'etherem' (10'ml) a vodná vrstva se oddělí. (Etherový extrakt se vylije). Pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové se pH vodné vrstvy upraví na 3 a potom se extrahuje dichlormethanem· (2x10 ml). Extrakty se spojí, suší nad síranem hořečnatým a odpaří za získání (S)-2-[1-(9-fluorenylmethyloxykarbonyl)-6-oxo-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl]propionové kyseliny (0,62 g) ve formě bílé pěny; 66 NMR (perdeuterodimethylsulfoxid (100 °C)')';" některé zdvojené píky způsobené směsí diastereomerú, 1,3 (2d, 3H), 1,6-2,0 (m, 6H) , 3,05 (m, 1H) , 3,2-3,45 (m, 3H) , 4,2-4,4 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,8 (m, 4H). (2) Pro sloučeniny obsahující skupinu vzorce Va, (3S)-3-(9-fluorenylmethoxykarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-1-octová kyselina může být připravena následujícím způsobem: . (i) (3S)-3-Amino-s-kaprolaktam (25 g) a triethylamin (19,7 g) se rozpustí v tetrahydrofuranu ίΟΛΛ τϊ,Τ \ \ Λ. V VJ UIJ. / a ochladí se na 5°C. Během 30 minut se přikape benzylchlorformiát (33 g) v tetrahydrofuranu (50 ml) . Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 18 hodin a potom se nalije do vody (500 ml). Reakční směs se extrahuje ethylacetátem (3x100 ml). Spojené extrakty se suší nad síranem horečnatým a odpaří. Zbytek se trituruje etherem (40 ml) a filtruje se za získání 20 g (S)-3-benzyloxykarbonylamino-6-kaprolaktamu ve formě bílé pevné látky; NMR _ (perdeuterodimethylsulfoxid),:. .*1,1-2—.(m,—.6H)-, —2,9-3,2 (m,~ 2H) , 4,1-4,25 (m, 1H) , 5,0 (s, 2H) ,· 7,25-7,4 (m, 5H) , 7,75 (t, 1H) . (ii) Směs hydridu sodného (2 g) v dimethylformamidu (100 ml) se ochladí v proudu argonu na 0°C.· Po částech se během 2 0 minut přidá (3S)-3-benzyloxykarbonylamino-s-kaprolaktam (10 g) takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřekročila 5 °C. --Míchání-pokračuje při--0-40* minut a během 10 'minut seT přikape terc-butylbromacetát (8,2 g) . Reakční směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a dalších 18 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se nalije do vody (600 ml) a extrahuje se ethylacetátem (6x75 ml). Spojené extrakty se promyjí vodou (3x100 ml), suší se nad síranem horečnatým a odpaří. Zbytek se čistí pomocí MPLC na silikagelu za eluce směsí 20 % ethylacetát/dichlormethan za získání terc-butyl (3S)-3-benzyloxykarbonylamino-2-oxoperhydro-azepin-l-acetátu {15 g) ve formě oleje; NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): 1,4 (s, 9H) , 1,5-1,9 (m, 6H) , 3,5-3-,6-5 (m, 1H) , 3,9-4,15 (m, '2HJ , 4,4 (m, 1H) , 5,0 (ε, 2H) , 7,1 (d, 1H), 7,35 <m, 5H);
Hmotová spektroskopie: m/e (ES") 377 (MH*) . (iii) tert-Butyl (3S)-3-benzyloxykarbonylamino-2-'oxoperhydro-azepin-l-acetát (15 g) se rozpustí v ethanolu (150 ml) a propláchne se argonem. Přidá se 10% palladium na uhlí (1,5 g) a baňka se evakuuje a naplní se vodíkem z balónku. Reakční směs se míchá 4 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se potom propláchne argonem a filtruje se přes křemelinu.. Filtrát se odpaří za získání terc-butyl (3S)-3-amino-2-oxoperhydroazepin-1-acetátu (7,7 g) ve formě viskózního oleje; 6H) , '3,2-2H), 3,95- NMR (deuterochloroform) : 1,45 (s, 9H)1,55-2,05 (m, 3,3 (d, 1H), 3,55-3,75 (dva překrývající se dublety, 4,25 (kv, 2H).
Hmotová spektroskopie: m/e (ES*) 243,2 (MH*) . (iv) Roztok terc-butyl (3S)-3-amino-2-oxoperhydroazepin-l-acetátu (7 g) v tetrahydrofuranu (50 ml) se přidá k roztoku uhličitanu sodného (3 g) ve vodě (30 ml) . Potom se během 3 0 minut za míchání přikape roztok N- (9-fluorenylmethoxykarbonyl-oxy) sukcimimidu (9,7 g) v tetrahydrofuranu (100 ml). Přidá se 2OO'~mÍ" ""vódý a" "reakční směs se extrahuje ethylacetátem (3x100 ml). Spojené extrakty se promyjí 100 ml solanky, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se. Zbytek se čistí pomocí MPLC na silikagelu za eluce nejprve dichlormethanem a postupně až směsí 15 % ethylacetát/dichlomethan za získání terc-butyl (3S)-3-(9-fluorenylme thoxykarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-l-acetátu (10,9 g) jako čirého oleje; *· Φ 9 tlil • · * « ·· » * * 9»· · t • 9 * · · «····*· «9 *9 » * » • « · t · · · • I * » *· ·· 68 NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): 1,45 '(s7^ 9H)', 1,5-2,15 (m, 6H) , 3,1-3,25 (m, 1H) , 3,6-3,75 (m, 1 H) , 4,0-4,5 (m, 5H) , 6,25 (d, 1 H), 7,25-7,45 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,75 (d, 2H);
Hmotová spektroskopie :..m/e . (ES*) . 465,2.. (MH*) . v) terc-Butyl (3 S)-3-(9-fluorenylmethoxykarbonylamino)-2-oxo-perhydroazepin-l-acetát (10,5 g) se rozpustí v dichlormethanu (30 ml) a přidá se kyselina trifluoroctová (20 ml) , Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 18' hodin. Přidá 'se dichlormethan (100 ml) a reakční směs se promyje vodou (4x100 ml), suší se nad síranem horečnatým a odpaří se. Zbytek Se čistí pomocí MPLC na silikagelu za eluce směsí 25 % ethylacetát/dichlormethan, potom ethylacetátem, za získání , oleje. Po trituraci isohexanem se získá bílá pěna, která se filtruje a suší za vakua pří 60 °C za získání (3S) -3- <9- 3 fluorenylmethoxykarbonylamíno) -2-oxoperhydroazepin-l-octové '# kyseliny (5,5 g); (m, 1H), 3,15-3/4 4,25-4,45 , (m,....2H) , 7,85 (d, 2H); >íÍ|lbiW»ii 111 |i--w ,wm IÉHN Ílil NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): 1,4-1,95 (m, 1H), 3,55-3,7 (m, 1H) , 3,9-4,2 (m, 2H) , 7,15 (d, 1H) , 7,25-7,45 (m, 4H) , 7,75 (tri, 2H) ,
Hmotová spektroskopie: m/e'(ES’) 407,1 (M-H)'. «· · *
70 Schéma 1
.HO r’r*n rVn yo y° / r’r3nh f
(CH2)n BocNH
O
BocNH NíP°
BocNl· OCHjPh OCHzPh • # · ♦ * · • · é ·
r OH
O * * » I *« I » · *»t « < * · · · < *·*···· · · ·* r'rsn V— o Γ-»· (?H2>n
h2n γ / OH
O NH. r:r2n
(CHJ 8ocNH^\^° OCH.Ph
NH.CO.OPh(4-NO.)^ (CH2)„ 8ocNH r’r2nh O. OCH2Ph NH.CG.NF/R 1 (ch2),.o oocHr. v>- \ OCH„Ph g#<«- rm finn·ίΐ·ϋ· «nw-wk· i* # r in um··
i ' I i Y NH.CO.NRR'(CH2}n NH.CO.Nn'R‘i -<r NH.C0.NR'R'
FmocNH
OH
HjN
(CH2)n OH (ch2},·
BocNH v OH
R'R*NH OHI(CH2)n R^^.CO.C! O.CO.NR'R2 o.co.nrV,2 o.co.nr'r2
Z.NH
0 W„ OCHjPh
Z.NH
O (CH.) Vn h2n
OH (CHa)„ o
FmocNH
O OH OCH2Ph 71 Schéma 2
Z— N
HjNKCH^pl^R , (CH2)a.CO..OH "{CH2}a.CO.O;Bu cr O Λ [(CH2}Ď0]mR3
HN X[(CH2)„OLH" Z—N O ía = 0 w o • « · * » · • · · · *· tt
_> HN o /
2—N « I Φ 99 « 9 « *»· * · 9 I · · · «9» i·** ·· *· /[(CH2)(OjgR7 ^[(CH2)(0]gR7
-H /((CH2]aO!mR7 I \ (CH2) "((CH2)sO]mR'
(CH2)a v OR o ((CH2LOLR7
HN '[CCH2)bO]mR7
HN o /[(ch^glr7 -¾_NI (CHa}„ / '(CH2)3 /((CHjJ^O^R7 -N-
O /((CH2)aO]mR7j-N \ /
2—N
(CH^ KCH2>«.°]mR KCHJ/OIR7- w. * o o
KCHa)bO]mR
. (CH,) OH
PhCHjN hal.(^n.) CO.O. Bu 2'e (d = 1 or 3) or :Bu.O.CO. ->
PhCH2N trM \ nir/ri v r.n rísi, ' “ í'c ~' ' *2'a------- (CH2)cO(CH2)d.CO.O;Bu (d = 2)
HN
PhCH2N
C_H 2)e O (CH 2}d. C O. O H
(CH2)cO(CH2}a.CO.OH
PhCH2N (CH2).0(CH2)dC0N / ^[(CH2)eOjpRb \ /[(CH2)eO]pRD (CH2)cO(CH2)eCON [(CH2)eOlpRb
HN /KCH2)eO|pRs (CH2)cO(CH2)dCON / l(CH ) OJdR° \ /-Kch^p^r0 {CH2)cO(CH2)dCON í(CH2)eO]pRĎ A: * * * · ·»· M·· a o· »·* I · • * » *· »· 72
Seznam sekvencí (1) Obecné informace: (1) Žadatel:
(A) Jméno: ZENECA LIMITED (B) Ulice: 15 STANHOPE GATE (C) CITY: Londýn (E) Stát: Velká Británie
(P) Poštovní kód (ZIP): W1Y 6LN (G) Telefon: 0171 304 5000 (H) Telefax: 0171 304 5151 (I) Telex: 0171 834 2042 (ii) Název vynálezu: Deriváty peptidů, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje (iii) Počet sekvencí: 8 (iv) Počítačová forma: (A) Typ nosiče: Floppy disk (B) ^Počítač: IBM PC compatible
(C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, verze #1,30 (ΞΡΟ) (vi} Údaje o předchozí, přihlášce: ... (A) Číslo přihlášky: GB 9611881.5 (B) Priorita dne: 7. 6. 1996 (vi) Údaje_ o předchozí přihlášce: (A) Číslo přihlášky: GB 9622890.3 (B) Priorita dne: 2. 11. 1996 (2) Údaje o sekvenci identifikační číslo 1: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 8 aminokyselin 73 • · · » »0 • * · «1« · · • » « · · t ·· ··« ·*·· «I ·· (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduchý (D) Topologie: lineární {ii} Typ molekuly: peptid .... (ix) Znaky: - (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 1 (D) Další informace :/produkt="jiný'7poznámka=115-fenylpenta-. noyl-Ala" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 4 (D) Další informace .· /produkt=" jiný" /poznámka= "(ϊ'ύ,Ν4- ‘i bis{2-(2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)]-Asn" * ' t (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 8 . mm .—.**^* *** —t~>** *· *> - v -nm* .j , —*· -»» ..a , ^... _·,_Τ|. j.. . j+,.λ . (D) Další informace:/produkt =»"j iný"/poznámka="Ala-piperi-din-9-karboxamiď1 (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo; 1: ř:
Xaa Ala Ala· Xaa Val Ala Ala Xaa ... 1 5 (2) Údaje o sekvenci identifikační číslo: 2: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid 74 74 • I ··· » t · ·» • · ·« * Ψ » · « · • · * »* (ix) Znaky: (A) Jraéno/označeni: Peptid (B) pozice: 1 (D) Jiné údaje : /produkt = " jiný"/poznámka= '.'S-Fenylpentanoyl-[N4,N4-bis (2- [2- (2-methoxyethoxy) ethoxy] ethyl)) Asn" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 8 (D) Jiné údaje: /product=!!jinýM/poznár , „ II Ti 1 yj- -I- 9- karboxamid" (xi) Popis sechvence; sekvence identifikační číslo: 2: Xaa Ala Ala Lys Val Ala Ala Xaa 1 5 (2) Údaje o sekvenci identifikační číslo 3: (i) Charakteristiky sekvence: (A) délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid , (B)_ Pozice: 1..............__........κ (D) Další informace: /produkt="jiný"/poznámka="S-Fenylpen-tanoyl-Ala" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 4 75 75 • · t • · · • t · » ·♦ ·· • · · *| • I ·*· · ··· M·· «* ·· (D) Jiné údaje ;/produkt = "j iný"/poznámka=" (N9,N9-bis [N,N- bis(2-methoxyethyl)karbamoylmethyl))-Asn" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 6 (D) Jiné údaje :/produkt=" j iný'"/poznámka=" [ (S)-2-( (R)-3-amino- 2 -oxopyrrolidin-1-y1)propanoyl]-Ala-4 -aminof enyl-acetamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 3:
Xaa Arg Ala Xaa Thr Xaa 1 5 (2) Údaje o sekvenci identifikační číslo 4: (i) Charakteristiky sekvence: (A) délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché , (D) Topologie: lineární k Mfc· > ; -*«- HH H-IFI'1 IW Í<li»l· mami tm Hť — f|| IV -j - . I||r| .. , (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 1 (D) Další informace :/produkt = "j iný,l/poznámka=n5-Fenylpeň tanoyl-Ala" (ix)- Znaky:-.:-.,,. . ............................ ....... ........„...... ... „ ........ .................. (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 4
(D) Jiné údaje :/produkt = "j iný"/poznámka=" (N<,N<1-bis [N,N bis (2-methoxyethyl)karbamoylmethyl])-Asn" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid • · i 76 ο • β «Μ ·Μ· (Β) Pozice: 8 (D) Jiné údaje:/produkt = " jinýl,/poznámka=,,Ala-piperidin-9“ karboxamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 9:
Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa 1 5 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 5: {i) Charakteristiky sekvence: (A) délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 1 ^ ** ^ i ti- ii riMiiirrrr ίγ tl*ι|β«*|Μιΐ·ιιι · ***** i :.mNniiuiw^ni :.: -1¾ -im1· T 1 ·Γί ^ (D) Jiné údaje:/produkt="jinýM/poznámka="5-Fenylpentanoyl-Arg" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 4 (D) Jiné údaje:/produkt="jiný"/poznámka^"[(S)-2-((R)-3-ami-no-2-oxopyrrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 5 (D) Jiné údaje: /produkt = "j iný"/poznámka=" [N4, ISf-bis (2- [2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)]-Asn" (ix) Znaky: v φ · * · · · · ·· « » β · φ φ « ·φ·» · φ β φ φ φ φ φ » φ φφ #« *«φ φφφφ φφ φφ 77 (A) Jméno/označení: Peptid — (Β) Pozice: 6 (D) Jiné údaje :/produkt^" j iný"/poznámka="Ala-9-aminofenyl -acetamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 5:
Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa 1 1 5 ff (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 6: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) · Topologie: lineární {ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid μΙΥΚ^Μ.'. #-«-.#«.. Ito i «)Ιίιΐ|>ιί .. 11 Wl > |l lfc)i ΙίμιΙ»^^ .4p+C_' ·· « ^ (B) Pozice: 1 (D) Jiné údaje:/produkt="jiný"/poznámka="5-Fenylpentanoyl-Arg" (ix)· Znaky: · .... .... ě· (A) Jméno/označení: Peptid ' (B) Pozice: 4 ~ . ______. ..JD)__ Jiné.. údaje: /produkt -,fj iný w/po známka ,N*-bis [N, N- bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy)ethyl)karbamoylmethyíj)-Asn" (ix) Znaky: (A) Jméno označení: Peptid (B) Pozice: 6 • ♦ * * • · f i II •M · « • e e i t » * · «*···*· «· ·» 78 (D) "^Jiné údaje :/produkt = "j iný"/póznámka=’' [ (S) -2- { (R) -3-amino-2-oxopyrrolidin-l-yl)propanoyl)-Ala-4--aminofenylacetamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 6: ' Xaa Ala Ala Xaa Thr Xaa ' ...... 1 5 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 7: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid ' (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 1 - ,(D) „Jiné údaje:/produkt =Jjjiný."/poznámka^"5-Fenylpentanoyl-^
Ala" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 4 ' (D) Jiné údaje:/produkt = " jiný''/poznámka=" (N4,N4-bis [N,N-bis(2-methoxyethyl)karbamoylmethyl])-Asn" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 8 (D) Jiné údaje: /produkt="jiný"/poznámka=,rGly-9-aminofenyl-acetamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 7:
Xaa Ala Ala Xaa Thr Pro Arg Xaa
·*· Φ»·Ι 1 ft · ·* • •t · « • β t ♦ · «* 79 5 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 8: (i) Charakteristiky sekvence: '(A) Délka:'6 aminokyselin *" "' T" ji,, (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topologie: lineární {i i) Typ molekuly:Jpeptid (ix) Znaky: · (A) Jméno/oznaČení: Peptid (B) Pozice: 1 (D) Jiné údaje:/produkt="jiný"/poznámka=M5-Fenylpentanoyl (N4,N4-bis(Ν,Ν-bis(2-methoxyethyl)karbamoylmethyl))-Gin" (ix) Znaky: (A) Jméno/označení: Peptid (B) Pozice: 6 (D) Jiné údaje:/produkt="jiný"/poznámka="[(S)-2-((R)-3 amino-2-oxopyrrolidin-1-yl) propanoyl]-Ala-9-aminofenyl-acetamid" (xi) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 8:
Xaá Arg Ala His Val Xáa 1 5

Claims (13)

  1. Wh* I I:·; • · ♦ « · 4 o a * s ·· a# a a a a ’ * a« • a* a • a 80 PAT E N T 0 V É N Á X « Derivát pept i xuu P - AA1 - AA2 - AA3 - AA4 - AA5 - AA6 - AA7 - AA8 - Q nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde P je hydrofobní zbytek; fyHřit-lfhpf' AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, kde l, 2 nebo 3 ze zbytků AAy AA' a AA7 jsou vybrány ze zbytlků L-aminokyselin obecného vzorce II R’ X R* (9Hz)n ^ ^0 h2n- y OH kde-n-je-celé -čísloví,< 2,^ 3-nebo-4;· X je skupina -NH-C0-, skupina -CO- nebo skupina -0.C0- ; R1 a R2 jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří (A) , (B) a (C) , kde (A) je skupina obecného vzorce - (CH2)a-C0-N(R3) (R4) , kde a je celé číslo 1 nebo 2 a R3 a R4 jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny, kterou tvoří skupina - [ (CH2)b0]m-Ra, kde Ra je methylová skupina nebo ethylová skupina a m je celé číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud mjel, b je 2 :nebo 3 a pokud m je 2, 3, 4 nebo 5, b je v každé jednotce r(CHj)b0- nezávisle vybráno z 2 a 3; (B) je skupina obecného vzorce - (CH2)c0(CH2)d-CO-N(R5) (R6) , kde c je celé číslo 2 nebo 3, d je celé číslo 1, 2 nebo 3, a R5 a Rs jsou nezávisle vybrány ze skupin obecného vzorce - [ (CH2) e0] -Rb, 81 * * é* • M t i 9 · i ·· ·* kde Rb jě" methylová skupina nebo ethylová skupina a p je celé číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud pjel, e je 2 nebo 3 a pokud p je 2, 3. 4 nebo 5. e je v každé jednotce -(CH2)eO- nezávisle vybráno z 2 a 3; a Jť • · I • · 4 • · « € ♦ * Μ (C) je skupina obecného vzorce - ['(CH2) ;Ó]g-Ř7, kde R7 je methylová skupina nebo ethylová skupina a g je celé Číslo 1, 2, 3, 4 nebo 5; pokud g je 1, f je 2 nebo 3 a pokud g je 2, 3, 4 nebo 5, hodnota f v každé jednotce (CH2)řO- je nezávisle 2 a 3,- nebo AA1, AA\ AA3, AA6, AA7, a ΑΑΘ jsou zbytky L-aminokyselin, kde jeden nebo více ze zbytků AA1 a AA7 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II, jak je definováno výše, a AA4 společně s AAS tvoří skupinu obecného vzorce III, lila, IV, IVa, V nebo Va; •A N 0 0 Ra
    IV !Va
    82 I · é* *»· · i » · i ι· ·· 4 · · ···· • 6 ( 4· 44 kde Ra, Rb a Rz jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a A je atom kyslíku nebo methylenová skupina; nebo AA1, AA2, AA3, AA4, AA5 a AAa jsou zbytky L-aminokyselin, kde jedna nebo obě skupiny AA1 a AA4 jsou vybrány ze zbytků L-aminokyselin obecného vzorce II, jak je definováno výše, a AAS společně s AA7 tvoří skupinu obecného vzorce III, lila, IV, IVa, V nebo Va, jak je definováno výše; a Q je hydroxylová skupina, aminoskupina, skupina NRcRd, kde Rc je vybráno ze skupiny, kterou tvoří alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, 2-karbamoylcyklopentylová skupina, 2-pyridylmethylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylmethylová skupina, 3-karbamoylfenylová skupina, 4-karbamoylfenylová skupina, 4-(karbamoylmethyl)-fenylová skupina, 4-(karboxymethyl)fenylová .skupina, 2-morřolinoethylová skupina a skupina obecného vzorce -A1 -G1, kde A1 je alkylenová skupina obsahující 3 až 7 atomu uhlíku nebo Al jje vybráno" ze" (1) skupin obecného vzorce -A2-B2-, kde A2 je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a B2 je alkylenová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo A2 je methylenová skupina a B2 je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová skupina; a (2) skupin obecného vzorce -A3-B3-C3-, kde A3 je methylenová skupina, B3 je p-fenylenová skupina nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a C3 je alkylenová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku; a G1 je skupina obecného vzorce -N=C[N(Rp) 2] 2, kde každá skupina Rp je nezávisle vybraná ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, methylová skupina, ethylová skupina a propylová skupina; a Rd »*· · ····· • · · · t Φ · ··· φ « • · · · · φ · « « •· ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ·· Φ» 83 je atom -vodíku nebo alkýlová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; nebo Q je l-piperazinylová skupina, 4-methyl-l- piperazinylová skupina, 4-(2-{2-hydroxyethoxy)ethyl)-l- v Λ' piperazinylová skupina, 4-amidino-l-piperazinylová skupina, 1-piperidylová skupina'nebo 1-piperi'dylová skupina .substituovaná v poloze 4, kde substituent v poloze 4 je vybrán ze skupiny, kterou tvoří karboxylová skupina, karbamoylová skupina, N-(2-aminoethyl) karbamoylová skupina a N-(4 7-aminobutyl) karbamoylová skupina; nebo.Q je sekvence 1 až 6 aminokyselinových zbytků nebo jejich amid.
  2. 2. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sul, podle nároku 1, kterým je derivátem peptidu obecného vzorce P-AA^AZ^-A^-II-AA^AA^Wť-A^-Q, kde AA1, AA2, .AA3, ‘ AA1, AA1, AA7 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, P a Q mají 'stejný význam, jako bylo definováno v nároku 1, a II je' zbytek L-aminokyseliny obecného vzorce II, jak je definováno v .nároku 1.
  3. 3. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, podle nároku 1, kterým je derivátem peptidu obecného vzorce., P-AAý-AA2 - AA3 -II Ia - AA8 -11 - AA8 -Q, kde — skupiny* AA1 ,—ΑΑ-;- · AA3·,··*' AA1 *a-AAa jsou zbytky L-aminokyselin, P a Q mají stejný význam jako· je uvedeno v nároku 1, II je zbytek L-aminokyseliny obecného vzorce II, jak je definováno v nároku l, a lila je skupina obecného vzorce lila,.jak je definováno .v nároku 1.
  4. 4. Derivát peptidu nebo .jeho farmaceuticky přijatelná sůl, podle nároku I, kterým je derivátem peptidu obecného vzorce P-AA2-AA2 -AA3 - II - AA1 - IIIa-AAa -Q, kde skupiny AA2, AA2, AA3, AA1 a AA8 jsou zbytky L-aminokyselin, P a Q mají stejný význam, jako je definováno v nároku 1, II je zbytek L-aminokyseliny obecného vzorce II, jak je definováno v nároku 1, a' lila je skupina obecného vzorce lila, jak je definováno v nároku 1. 1 Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, 2 podle nároku 1, kterým je derivátem peptidu obecného vzorce * • · · ** • · • · · ··· · · 0»#· · · ·«« ·· ·· ··· *··· ·« *» 84 Ρ - II - ΑΑ2-ΆΑ3-ΑΑ4-ΑΑ3~ II Ia-AAS-Q, kde ΑΑ2, ΑΑ3, ΑΑ4, ΑΑ5 a ΑΑ3 jsou zbytky L-aminokyselin, P a Q mají stejný význam, jako je definováno v nároku 1, II je zbytek L-aminokyseliny obecného vzorce II, jak je definováno v nároku 1, a lila je skupina *** obecného vzorce lila, jak je definováno v nároku 1. 6. 'Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde P je alifatická skupina, aromatická skupina nebo smíšená alifaticko/aromatická organická skupina obsahující 5 až 20 atomů uhlíku nebo 'heterocyklická nebo smíšená alifaticko/heterocyklická organická skupina obsahující 5 až 2 0 atomů uhlíku a 1, 2 nebo 3 heteroatomy vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, atom síry a atom dusíku.
  5. 7. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde ve zbytku L-aminokyseliny obecného vzorce II, n je 1 nebo 2, X je karbonylová skupina a R1 a R2 jsou obe stejné skupiny obecného vzorce (A) nebo obě stejné skupiny obecného vzorce PC)', jak je - definováno “v" nároku'* li "' * ;"τηΓ ·--*«*“ - ·- - ··**— * ~
  6. 8. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podle nároku 7, kde R1 a R2 jsou obě skupina vzorce -'CHjCHjOCHjCHjOCHjCHjOCH, nebo obě skupina -CH2CON (CH2CH2OCH3) 2 nebo jsou obě skupina -CH2CON [ (CH2CH20) 3CH2] 2.
  7. 9. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde AA1 až AA9, pokud jsou přítomny, jsou vybrány za zbytků následujících aminokyselin: AA1 je vybráno z Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluoralaninu; AA2 je vybráno z Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Přo, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoralaninu a N6-diethylLys; 85 • t • »» • · · * · • t M • · · ···» i • · t « · I·· ···· ·· »· AA3 je vybráno z Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a N3-diethylDap; AA' je vybráno z Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, Jrlis a Ns-diethylLys; AAS je vybráno z Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser, a N3-diethylDap; AA6 je vybráno z Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu,. Sar, His a Dap,· AA7 je vybráno z Pro, Ala, Lvs, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Die; a AA3 je vybráno z Ala, Gly, Dap, azaalaninu a azaglycinu. ICL Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podle kteréhokoli z nároku 1 až 9, kde Q je vybráno ze skupiny, kterou tvoří 4-karbamoyl-l-piperidylová·. skupina a 4-.(karbamoyl-methyl)anilinoskupina.
  8. 11. Derivát peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podle .kteréhokoli, z^nároků..,,l„aze 10JjB kde„hydrofobn£_ skupinou aP je 5-fenylvalerylová skupina.
  9. 12. Derivát peptidu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kterým je sloučenina
    O ch3och2ch2X N CFÍjOCHjCH/ CH2CH,OCK / J N\ CI-LCH,OCH, z'
    0 Phv-Ala-Arg-Ala-N * H nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kde Phv je 5-fenylvalerylová skupina. 86 * I « I M * * » í ·· ·· • t • · β ··· Φ 4 O · · * « »·· ·»·« ·* ♦· 1-3. Derivát peptidu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kterým je sloučenina fu ou onu ou nru ru nru v—> I I^WI t-jWi >2^ Nv I.Λν, CH2CHzOCH2CH2OCH,CH2OCH3
    CH2CH2OCHzCH2OCH2CH2OCH3 ch2ch2och2ch2och2ch2och3 Phv-Arg-Al3-A!a~N/ '"'V" 1 nr ~ N H il H0 0
    Ala — N —(s /hCH,CONH, H ^ nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, .kde Phv je 5-fenyl-valerylová skupina.
  10. 14. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje derivát peptidu obecného vzorce I nebo jeho farmaceutickypřijatelnou- sůl”poule kteréhokoli z nároků 1' až 13, společně s farmaceuticky, přijatelným ředidlem nebo nosičem. »*'*-* **** «W vkií. ·ι, 4fe M .-.,..1....... .....
  11. 15. Způsob přípravy derivátu peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje postupnou kondenzaci ve vhodném pořadí vhodně chráněných aminokyselin nebo sekvencí dvou nebo více vhodně chráněných aminokyselin, vhodně chráněné ' skupiny obecného vzorce H-II-OH, H-III-OH, fí-IIIa-OH, H-IV-OH, H-IVa-OH, H-V-OH nebo H-Va-OH a popřípadě vhodně chráněné skupiny obecného vzorce H-Q, následovanou případnou úpravou funkční skupiny N-koncové aminoskupiny, zavedením hydrofobní skupiny P a odstraněním jakýchkoli zbývajících chránících skupin a jakéhokoli pevného nosiče. 16. · Způsob léčby T-buňkami zprostředkovaného na MHC .třídy II závislého autoimunního nebo zánětlivého onemocnění vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství derivátu peptidu L<! í 87 ♦ · I · • · · « · · • « * · · ·· *· M« ·*·« I · ·« «·· * · • * * M *f obecného .vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 1 teplokrevným savcům v případě, že takovou léčbu potřebuj í. JL7. Způsob podle nároku 1S vyznačující se tím, že se léčí revmatoidní arthritida a- cystická fibróza.
  12. 18. Použití derivátu peptidu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 1 pro přípravu «i nových léčiv pro použití při léčbě T-buňkami zprostředkovaného na MHC třídy II závislého autoimunního nebo zánětlivého onemocnění.
  13. 19. Chráněná nebo nechráněná aminokyselina obecného vzorce II nebo její sůl, kde η, X, R1 a R2 mají stejný význam, jako je definováno v nároku 1. ♦
CZ0372698A 1997-11-19 1998-11-17 Substituované imidazolidinové deriváty, zpusob jejich prípravy, jejich pouzití a farmaceutické prostredky, které je obsahují CZ297564B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19751251A DE19751251A1 (de) 1997-11-19 1997-11-19 Substituierte Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmezeutische Präparate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ372698A3 true CZ372698A3 (cs) 1999-06-16
CZ297564B6 CZ297564B6 (cs) 2007-02-07

Family

ID=7849203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0372698A CZ297564B6 (cs) 1997-11-19 1998-11-17 Substituované imidazolidinové deriváty, zpusob jejich prípravy, jejich pouzití a farmaceutické prostredky, které je obsahují

Country Status (30)

Country Link
US (2) US6331552B1 (cs)
EP (1) EP0918059B1 (cs)
JP (1) JP4567821B2 (cs)
KR (1) KR100738820B1 (cs)
CN (1) CN1330638C (cs)
AR (1) AR016011A1 (cs)
AT (1) ATE243708T1 (cs)
AU (1) AU755893B2 (cs)
BR (1) BR9804695B1 (cs)
CA (1) CA2254420C (cs)
CZ (1) CZ297564B6 (cs)
DE (2) DE19751251A1 (cs)
DK (1) DK0918059T3 (cs)
ES (1) ES2202718T3 (cs)
HK (1) HK1020949A1 (cs)
HR (1) HRP980602B1 (cs)
HU (1) HU229481B1 (cs)
ID (1) ID21305A (cs)
IL (1) IL127132A (cs)
MY (1) MY118313A (cs)
NO (1) NO325303B1 (cs)
NZ (1) NZ332855A (cs)
PL (1) PL194692B1 (cs)
PT (1) PT918059E (cs)
RU (1) RU2239641C2 (cs)
SI (1) SI0918059T1 (cs)
SK (1) SK284851B6 (cs)
TR (1) TR199802344A2 (cs)
TW (1) TWI230155B (cs)
ZA (1) ZA9810543B (cs)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19821483A1 (de) * 1998-05-14 1999-11-18 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
US6972296B2 (en) 1999-05-07 2005-12-06 Encysive Pharmaceuticals Inc. Carboxylic acid derivatives that inhibit the binding of integrins to their receptors
US6723711B2 (en) 1999-05-07 2004-04-20 Texas Biotechnology Corporation Propanoic acid derivatives that inhibit the binding of integrins to their receptors
DE19922462A1 (de) * 1999-05-17 2000-11-23 Aventis Pharma Gmbh Spiro-imidazolidinderivate, ihre Herstellung ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
KR20020067050A (ko) 1999-12-28 2002-08-21 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 염증성, 자기면역 및 호흡기 질환의 치료에 유용한브이엘에이-4 의존성 세포 결합의 비펩티드계 억제제
GB0010105D0 (en) * 2000-04-26 2000-06-14 Ml Lab Plc Cell ablation
DE10111877A1 (de) 2001-03-10 2002-09-12 Aventis Pharma Gmbh Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
DE10111876A1 (de) 2001-03-10 2002-09-19 Aventis Pharma Gmbh Bis(trifluormethyl)hydantoine als Zwischenprodukte für pharmazeutische Wirkstoffe
US20030154499A1 (en) * 2001-06-08 2003-08-14 Monika Wasel-Nielen Mouse unable to express functional alpha-4 integrin protein, and methods for assaying compounds or agents for alpha-4 integrin protein antagonist activity and a genetic marker for evaluating efficacy of modulators of signaling activity of a VLA-4 receptor
AU2002315415A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Aventis Pharmaceuticals Inc. Chiral preparation of a diastereomeric compound
DE10134366A1 (de) * 2001-07-14 2003-01-23 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung der enantiomeren Formen von 2-substituierten 2-(2,5-Dioxoimidazolidin-l-yl)-essigsäure- Derivaten
DE10137595A1 (de) * 2001-08-01 2003-02-13 Aventis Pharma Gmbh Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung
SI1474425T1 (sl) * 2002-01-07 2006-10-31 Eisai Co Ltd Deazapurini in njihove uporabe
WO2004007444A2 (en) * 2002-07-11 2004-01-22 Vicuron Pharmaceuticals, Inc. N-hydroxyamide derivatives possessing antibacterial activity
WO2004033632A2 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Hydantoin derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases and/or tnf-alpha converting enzyme (tace)
WO2004083163A1 (ja) * 2003-03-17 2004-09-30 Ube Industries, Ltd. ３－アミノ－３－アリールプロピオン酸ｎ－アルキルエステル及びその製造方法並びに光学活性３－アミノ－３－アリールプロピオン酸及びその対掌エステルの製造方法
EA009646B1 (ru) 2003-05-30 2008-02-28 Рэнбакси Лабораториз Лтд. Замещённые производные пиррола и их применение в качестве ингибиторов hmg-coa
EP1948599A1 (en) 2005-11-08 2008-07-30 Ranbaxy Laboratories Limited Process for (3r, 5r)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-isopropyl-3-phenyl-4- [(4-hydroxy methyl phenyl amino) carbonyl]-pyrrol-1-yl]-3, 5-dihydroxy-heptanoic acid hemi calcium salt
WO2008103378A2 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple sclerosis by administration of alpha-fetoprotein in combination with an integrin antagonist
BRPI0911652A2 (pt) 2008-04-11 2015-08-04 Merrimack Pharmaceuticals Inc Ligantes de albumina sérica humana e seus conjugados
BRPI0917785B1 (pt) * 2008-08-22 2020-08-04 Saudi Aramco Technologies Company Catalisadores e métodos para a síntese de polímeros
DE102009012314A1 (de) 2009-03-09 2010-09-16 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Oxo-heterocyclisch substituierte Alkylcarbonsäuren und ihre Verwendung
DK3722808T3 (da) 2010-10-25 2024-12-09 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder til bestemmelse af forskelle i alpha-4-integrinaktivitet ved korrelation af forskelle i svcam- og/eller smadcam-niveauer
EP3112353A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-04 Studiengesellschaft Kohle MbH Substituted imidazolium sulfuranes and their use
TWI856956B (zh) * 2018-04-12 2024-10-01 美商莫菲克醫療股份有限公司 人類整合素α４β７拮抗劑
US11292782B2 (en) 2018-11-30 2022-04-05 Nuvation Bio Inc. Diarylhydantoin compounds and methods of use thereof
JP2022543444A (ja) * 2019-08-05 2022-10-12 ポリプラス トランスフェクション カチオン性ポリマーにグラフトしたトリアゾール化合物を含む核酸分子を細胞にトランスフェクトするための組成物及びその用途
WO2021076902A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Morphic Therapeutic, Inc. INHIBITING HUMAN INTEGRIN α 4 β 7

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE235866C (cs)
DE2937779A1 (de) 1979-09-19 1981-04-09 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Aminosaeurederivate und verfahren zu ihrer herstellung
DE3044236A1 (de) 1980-11-25 1982-06-16 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Aminosaeurederivate und verfahren zu ihrer herstellung
FR2503155A2 (fr) 1980-10-02 1982-10-08 Science Union & Cie Nouveaux imino diacides substitues, leurs procedes de preparation et leur emploi comme inhibiteur d'enzyme
FR2487829A2 (fr) 1979-12-07 1982-02-05 Science Union & Cie Nouveaux imino acides substitues, leurs procedes de preparation et leur emploi comme inhibiteur d'enzyme
US4350704A (en) 1980-10-06 1982-09-21 Warner-Lambert Company Substituted acyl derivatives of octahydro-1H-indole-2-carboxylic acids
DE3177130D1 (de) 1980-08-30 1990-01-11 Hoechst Ag Aminosaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung.
US4344949A (en) 1980-10-03 1982-08-17 Warner-Lambert Company Substituted acyl derivatives of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acids
DE3174844D1 (en) 1980-10-23 1986-07-24 Schering Corp Carboxyalkyl dipeptides, processes for their production and pharmaceutical compositions containing them
US4374847A (en) 1980-10-27 1983-02-22 Ciba-Geigy Corporation 1-Carboxyalkanoylindoline-2-carboxylic acids
DE3226768A1 (de) 1981-11-05 1983-05-26 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Derivate der cis, endo-2-azabicyclo-(3.3.0)-octan-3-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung
IE55867B1 (en) 1981-12-29 1991-02-14 Hoechst Ag New derivatives of bicyclic aminoacids,processes for their preparation,agents containing these compounds and their use,and new bicyclic aminoacids as intermediates and processes for their preparation
DE3210496A1 (de) 1982-03-23 1983-10-06 Hoechst Ag Neue derivate bicyclischer aminsaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung sowie neue bicyclische aminosaeuren als zwischenstufen und verfahren zu deren herstellung
DE3211397A1 (de) 1982-03-27 1983-11-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Spiro (4.(3+n))-2-aza-3-carbonsaeure-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung
DE3211676A1 (de) 1982-03-30 1983-10-06 Hoechst Ag Neue derivate von cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung sowie neue cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren als zwischenstufen und verfahren zu deren herstellung
DE3227055A1 (de) 1982-07-20 1984-01-26 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue derivate der 2-aza-bicyclo(2.2.2)octan-3-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung sowie 2-aza-bicyclo(2.2.2)octan-3-carbonsaeure als zwischenstufe und verfahren zu deren herstellung
DE3242151A1 (de) 1982-11-13 1984-05-17 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue derivate tricyclischer aminosaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung, sowie neue bicyclische aminosaeuren als zwischenstufen und verfahren zu deren herstellung
DE3246503A1 (de) 1982-12-16 1984-06-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Derivate der cis, endo-2-azabicyclo-(5.3.0)-decan-3-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung
DE3643012A1 (de) 1986-12-17 1988-06-30 Hoechst Ag 2,3-disubstituierte isoxazolidine, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung
DE3818850A1 (de) 1988-06-03 1989-12-07 Hoechst Ag Oligopeptide mit zyklischen prolin-analogen aminosaeuren
DE4009506A1 (de) * 1990-03-24 1991-09-26 Hoechst Ag Hydantoinderivate
DE4126277A1 (de) * 1991-08-08 1993-02-11 Cassella Ag Hydantoinderivate
DE69309044T3 (de) * 1992-01-13 2004-12-23 Biogen, Inc., Cambridge Behandlung von asthma
DK0625912T3 (da) * 1992-02-12 1997-10-27 Biogen Inc Behandling af inflammatorisk tarmsygdom
DE4207254A1 (de) * 1992-03-07 1993-09-09 Cassella Ag 4-oxo-2-thioxoimidazolidin-derivate
DE4213634A1 (de) * 1992-04-24 1993-10-28 Cassella Ag 2,4-Dioxo-imidazolidin-Derivate
DE4224414A1 (de) * 1992-07-24 1994-01-27 Cassella Ag Phenylimidazolidin-derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE4228717A1 (de) * 1992-08-28 1994-03-03 Cassella Ag Imidazolidin-Derivate
WO1994015958A2 (en) 1993-01-08 1994-07-21 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Peptide inhibitors of cell adhesion
ES2137354T3 (es) 1993-01-12 1999-12-16 Biogen Inc Moleculas de anticuerpo anti-vla4 recombinante.
DE69407758T3 (de) 1993-02-09 2007-05-24 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Antikörper zur behandlung von insulinabhängigem diabetes
DE4308034A1 (de) * 1993-03-13 1994-09-15 Cassella Ag Neue Heterocyclen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE4427979A1 (de) * 1993-11-15 1996-02-15 Cassella Ag Substituierte 5-Ring-Heterocyclen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
WO1995015973A1 (en) 1993-12-06 1995-06-15 Cytel Corporation Cs-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same
PT804237E (pt) 1994-01-25 2006-10-31 Elan Pharm Inc Anticorpos humanizados contra a molecula de adesao leucocitaria vla-4
EP0767674A4 (en) * 1994-06-29 1999-06-16 Texas Biotechnology Corp METHOD FOR INHIBITING THE BINDING OF INTEGRIN ALPHA 4 BETA 1 TO VCAM-1 OR FIBRONECTIN
US5811391A (en) 1994-08-25 1998-09-22 Cytel Corporation Cyclic CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using same
GB9524630D0 (en) 1994-12-24 1996-01-31 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6306840B1 (en) 1995-01-23 2001-10-23 Biogen, Inc. Cell adhesion inhibitors
DE19515177A1 (de) 1995-04-28 1996-10-31 Cassella Ag Hydantoinderivate als Zwischenprodukte für pharmazeutische Wirkstoffe
US6248713B1 (en) 1995-07-11 2001-06-19 Biogen, Inc. Cell adhesion inhibitors
PT796855E (pt) * 1996-03-20 2002-07-31 Hoechst Ag Inibicao da reabsorcao nos ossos e antagonistas de vitronectina
NZ333904A (en) 1996-07-25 2000-06-23 Biogen Inc VLA-4 and IIb/IIIa cell adhesion inhibitors
PL323130A1 (en) * 1996-11-15 1998-05-25 Hoechst Ag Application of heterocyclic compounds in production of a pharmaceutic agent, novel heterocyclic compounds and pharmaceutic agent as such
DE19647380A1 (de) * 1996-11-15 1998-05-20 Hoechst Ag 5-Ring-Heterocyclen als Inhibitoren der Leukozytenadhäsion und VLA-4-Antagonisten
DE19647381A1 (de) * 1996-11-15 1998-05-20 Hoechst Ag Neue Heterocyclen als Inhibitoren der Leukozytenadhäsion und VLA-4-Antagonisten
DE19648053C1 (de) 1996-11-20 1998-03-12 Siemens Ag Elektromagnetisches Schaltgerät
WO1998042656A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Cytel Corporation Novel compounds

Also Published As

Publication number Publication date
KR100738820B1 (ko) 2008-02-20
ZA9810543B (en) 1999-05-19
PL194692B1 (pl) 2007-06-29
NZ332855A (en) 2000-06-23
SK284851B6 (sk) 2006-01-05
NO985368L (no) 1999-05-20
US6521654B2 (en) 2003-02-18
ID21305A (id) 1999-05-20
NO985368D0 (no) 1998-11-18
CZ297564B6 (cs) 2007-02-07
SI0918059T1 (en) 2003-12-31
US6331552B1 (en) 2001-12-18
CA2254420C (en) 2009-05-26
IL127132A (en) 2005-03-20
BR9804695B1 (pt) 2010-11-30
ATE243708T1 (de) 2003-07-15
PT918059E (pt) 2003-11-28
IL127132A0 (en) 1999-09-22
AU9242198A (en) 1999-06-10
PL329790A1 (en) 1999-05-24
SK158098A3 (en) 1999-06-11
NO325303B1 (no) 2008-03-25
HUP9802653A3 (en) 2000-09-28
HRP980602B1 (en) 2006-07-31
HU229481B1 (hu) 2014-01-28
RU2239641C2 (ru) 2004-11-10
AR016011A1 (es) 2001-05-30
DE19751251A1 (de) 1999-05-20
EP0918059A1 (de) 1999-05-26
MY118313A (en) 2004-09-30
CN1225360A (zh) 1999-08-11
ES2202718T3 (es) 2004-04-01
CN1330638C (zh) 2007-08-08
US20020143043A1 (en) 2002-10-03
TR199802344A2 (xx) 1999-06-21
BR9804695A (pt) 2001-05-22
KR19990045365A (ko) 1999-06-25
DE59808804D1 (de) 2003-07-31
EP0918059B1 (de) 2003-06-25
HU9802653D0 (en) 1999-01-28
JPH11246531A (ja) 1999-09-14
CA2254420A1 (en) 1999-05-19
HRP980602A2 (en) 1999-08-31
HUP9802653A2 (hu) 1999-09-28
JP4567821B2 (ja) 2010-10-20
DK0918059T3 (da) 2003-10-13
AU755893B2 (en) 2003-01-02
TWI230155B (en) 2005-04-01
HK1020949A1 (en) 2000-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ372698A3 (cs) Substituované imidazolidinové deriváty, způsob jejich přípravy, jejich použití a farmaceutické prostředky, které je obsahují
KR100451522B1 (ko) 펩티드유도체
USRE41287E1 (en) Cyclic agonists and antagonists of C5A receptors and G Protein-coupled receptors
JP3468528B2 (ja) ペプチド誘導体
JP5073154B2 (ja) α−フェトプロテインペプチドおよびその使用
US6355617B1 (en) Peptide derivatives
US6207644B1 (en) Peptide analogues containing a 7-membered lactam ring
US6184207B1 (en) Inhibitors of peptide binding to MHC class II proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20151117