CZ303443B6

CZ303443B6 - Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, zpusob jejich výroby, jejich použití a prostredek je obsahující

Info

Publication number: CZ303443B6
Application number: CZ20110081A
Authority: CZ
Inventors: Chodounská@Hana; Kapras@Vojtech; Vyklický@Ladislav; Borovská@Jirina; Vyklický@Vojtech; Valeš@Karel; Stuchlík@Aleš; Rambousek@Lukáš
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i.; Fyziologický ústav Akademie ved CR, v. v. i.
Priority date: 2011-02-15
Filing date: 2011-02-15
Publication date: 2012-09-12
Also published as: CZ201181A3; EP2675821A1; WO2012110010A1; US20130338383A1; EP2675821B1

Abstract

Slouceniny obecného vzorce I, zpusob jejich výroby a jejich použití pro lécení ruzných onemocnení CNS, zejména pro lécení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuroprenašecového systému, následku ischemického poškození CNS, neurodegenerativních zmen a poruch CNS, afektivní poruchy, deprese, PTSD a nemocí souvisejících se stresem, anxiety, schizofrenie a psychotické poruchy, bolesti, závislostí, roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomu. Dále se rešení týká použití sloucenin obecného vzorce I pro výrobu veterinárního a humánního farmaceutického prípravku pro lécení výše uvedených nemocí a farmaceutických prípravku tyto slouceniny obsahujících.

Description

Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, způsob jejich výroby, jejich použití a prostředek je obsahující

Oblast techniky

Tento vynález se týká steroidních katíoníckých sloučenin, způsobu jejich výroby a jejich použití. Zvláště se tento vynález týká derivátů pregnanolonu substituovaných v poloze 3alfa, které mají v této poloze skupinu schopnou vytvořit kation. Takové deriváty mohou být užitečné pro léčení některých onemocnění centrálního nervového systému (CNS), zvláště pak pro léčbu ischemického poškození CNS, neurodegenerativních změn a poruch, afektivní poruchy, deprese, posttraumatické stresové poruchy (PTSD) a nemocí souvisejících se stresem, anxietu, schizofrenie a psychotické poruchy, bolesti, závislosti a roztroušené sklerózy, epilepsie a glíomů a jiných nádorů centrální nervové soustavy.

Dosavadní stav techniky

Glutamát je hlavním excitačním neuropřenašečem v centrálním nervovém systému savců. Během výlevu glutamátu z presynaptické terminály odpovědi post synaptického neuronu vznikají prostřednictvím ionotropních a metabotropních glutamátových receptorů. Metabotropní receptory fungují prostřednictvím vazby na Gp rotě iny a mobilizují vápníkové ionty z intracelulámích kompartmentů. Aktivace ionotropních receptorů vede ke zvýšení propustnosti postsynaptické membrány pro sodné, draselné a vápenaté kationty otevřením iontových kanálů, které jsou součástí receptorů.

Typickým příkladem ionotropního glutamátového receptoru jsou N-methyl-D-aspartátové receptory (NMDAR), receptory AMPA (a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionátové) a kianátové receptory. Ačkoliv současné poznatky naznačují úlohu různých podtypů rodiny glutamátových receptorů v glutamátem indukované excitotoxicitě, za klíčového hráče v těchto procesech jsou považovány ionotropní receptory. Aktivace ionotropních glutamátových receptorů vede ke změnám v intracelulámích koncentracích iontů, především vápenatých a sodných. Současné výzkumy ukazují, že kromě vápníku může vést k zániku vápenatých a sodných. Současné výzkumy ukazují, že kromě vápníku může vést k zániku neuronů i zvýšení intracelulámích hladin Na⁺. U neuronů v hipokampální kultuře a v retině může vést aktivace glutamátových receptorů k poškození neuronů prostřednictvím Na⁺ kationtů dokonce i bez přítomnosti extracelulámího vápníku. Toxicita vyšších hladin glutamátu je však zpravidla spojována se vzestupem intracelulámích hladin Ca' . V současnosti je poměrně dobře prokázáno, že existuje přímý vztah mezi nadměrným průnikem vápníku do buněk a glutamátem navozeným poškozením neuronů. Glutamátem vyvolané patologické zvýšení intracelulárního vápníku je připisováno déletrvající aktivaci ionotropních glutamátových receptorů. Zvýšení intracelulárního vápníku může spustit sestupnou neurotoxickou kaskádu, která zahrnuje odpřažení mitochondriálního elektronového transportu od syntézy ATP a nadměrnou aktivaci enzymů jako kalpainu a dalších proteas, proteinkinas, syntézy NO, kalcineurinů a endonukleas. Změny v aktivitě těchto neuronů mohou vést k produkci toxických reaktivních molekul, jako volných kyslíkových radikálů (oxid dusný, superoxid, peroxid vodíku), ke změnám v architektuře cytoskeletu a k aktivaci genetických signálů, vedoucích k apoptóze a k poškození funkce mitochondrií (Villman a Becker, 2007).

Řada prekliníckých studií dokládá výraznou schopnost NMDA antagonistů zabránit excesivnímu působení glutamátu na nervové buňky a tím omezit narušení funkcí CNS. Nicméně jejich neuroprotektivní potenciál je z klinického pohledu malý. Vzhledem k faktu, že NMDA receptory jsou jedněmi z nej rozšířenějších typů receptorů v CNS, vede podání NMDA antagonistů k řadě závažných nežádoucích účinků, od narušení motoriky po indukci psychóz schizofrenního typu. Na druhou stranu velká rozmanitost NMDA receptorů, jejích rozdílná distribuce na synapsích i mimo ně a různé funkční stavy tohoto receptoru nabízejí možnost hledat sloučeniny selektivně

- 1 CZ 303443 B6 ovlivňující pouze určitou skupinu NMDA receptoru a tím omezit výskyt neočekávaných a nežádoucích účinků při zachování neuroprotektivního působení.

Předchozí výsledky ukázaly, že přirozeně se vyskytující 3a,5p-pregnanolon-sulfát wse-dependentním způsobem ovlivňuje aktivitu NMDA receptorů. V důsledku tohoto mechanismu působení vykazuje výraznější inhibiční působení na NMDA receptorech tonicky aktivovaných glutamátem než na fázicky aktivovaných NMDA receptorech během synaptického přenosu. Právě aktivace extrasynaptických tonicky aktivovaných NMDA receptorů je zásadní pro excitotoxické působení glutamátu (Petrovíc et al., 2005).

Proto jsme zahájili vývoj a testování nových NMDA antagonistů odvozených od neurosteroidů. Tyto zcela nově syntetizované sloučeniny vykazují afinitu k extrasynaptickým NMDA receptorům. Co je však ještě důležitější, předchozí elektrofyziologické studie ukázaly, že tento typ látek se váže pouze na dlouhodobě otevřené NMDA receptory. Předpokládaným neuroprotektivním mechanismem účinku je tedy blokace excesivního vtoku vápníku do buňky prostřednictvím dlouho otevřených NMDA receptorů. K ostatním typům NMDA receptorů nemají uvedené sloučeniny afinitu, předpokládá se tedy, že nebudou ovlivňovat přenos signálu mezi neurony.

V posledním desetiletí se biomedicínský výzkum soustředil na studium role neurosteroidů v patofyziologii řady neuropsychiatrických chorob a zhodnocení jejich terapeutického potenciálu. Mechanismus účinku neurosteroidů je spojován s jejich aktivitou na NMDA a GABA_a receptorech. Experimentální studie na zvířecích modelech poukazují na jejich potenciál k léčbě řady nemocí centrálního nervového systému, především neurodegenerativních chorob, roztroušené sklerózy, afektivních poruch, alkoholismu, bolesti, insomnie či schizofrenie (Morrow, 2007; Weaver, 2000).

Neurosteroidy hrají zásadní roli také v regulaci reaktivity na stres a s tím souvisejícími poruchami CNS. Hladina neurosteroidů krátkodobě po vystavení stresu stoupá, jedná se o adaptivní mechanismus. Naproti tomu experimentální modely chronického stresu a deprese u laboratorních hlodavců ukazují sníženou koncentraci neurosteroidů jak v mozku, tak v plasmě. Podobné nálezy nacházíme i u pacientů trpících depresí nebo premenstruačním syndromem. To poukazuje na narušení homeostatických mechanismů v CNS u neuropsychiatrických chorob souvisejících se stresem.

Steroidní sloučeniny ovlivňují aktivitu a plasticitu neuronů a gliových buněk během časného vývoje a později mají důležitou trofíckou a neuroprotektivní roli v dospělém nervovém systému. Steroidy jsou produkovány pohlavními žlázami a nad ledvinkami, stejně tak jako v CNS. Do mozku, prodloužené míchy a periferních nervů se steroidní sloučeniny dostávají krevním řečištěm. Nicméně některé steroidy (neurosteroidy) jsou produkovány přímo v centrální nervové soustavě. Mezi nejlépe prozkoumané neurosteroidy patří pregnenolon, progesteron, dehydroepiandrosteron (DHEA) a jejich redukované metabolity a sulfátové estery. O regulaci syntézy neurosteroidů v CNS není známo příliš mnoho poznatků, avšak obecně se soudí, že jejím podkladem jsou interakce více typů buněk. Například syntéza progesteronu Schwannovými buňkami u periferních nervuje regulována difuzními signály z neuronů.

Neurotrofické a neuroprotektivní účinky neurosteroidů byly ukázány jak v buněčných kulturách, tak in vivo. Progesteron hraje důležitou roli v neurologickém zotavení z traumatického poškození mozku a míchy prostřednictvím mechanismů, zahrnujících ochranu před excitotoxickým poškozením buněk, před peroxidací lipidů a indukcí specifických enzymů. Například po přetnutí spinal ní míchy potkanů progesteron zvyšuje počet astrocytů, exprimujících MŽ-syntázu těsně nad a pod místem přetnutí.

Tento stero i d rovněž hraje roli v regulaci formování nových my e línových pochev. To bylo ukázáno u regeneruj ícího potkanního nervus sciaticus v kultuře sensorických neuronů a Schwan-2 CZ 303443 B6 nových buněk. Progesteron rovněž posiluje myelinizaci prostřednictvím aktivace genů, kódujících proteiny účastnící se myelinizace.

Jak již bylo řečeno, neurosteroidy významně modulují funkci membránových receptorů pro neuropřenašeěe, zejména GABA_a receptorů, NMDA receptorů a signál - receptorů. Tyto mechanismy jsou zodpovědné za psychofarmakologické účinky steroidů a částečně vysvětlují jejich antikonvulzivní, anxiolytické, neuroprotektivní a sedativní účinky, stejně jako jejich vliv na procesy učení a paměti. Například u pregnanolon-sulfátu bylo prokázáno, že je schopen zvrátit kognitivní deficit u zvířat vyššího věku a že má protektivní účinek na paměť v několika modelech amnézie. Nové studie dokládají přímý vliv neurosteroidů i na nitrobuněěné receptory. Ačkoliv například nejsou doklady o přímé vazbě na glukokortikoidní receptor, neurosteroidy modulují účinek kortikoidů nepřímo, prostřednictvím interakcí s proteinkínasami A, C, MAPK (mitogeny aktivovaná proteinkinasa) nebo CAMK (kalmodulin-dependentní proteinkinasa). Navíc byl prokázán vliv pregnanolonu a pregnanolon-sulfátu na proteiny asociované s mikrotubuly a na akceleraci polymerace mikrotubulú, čímž dochází k ovlivnění neuronální plasticity. Tyto nově popsané účinky neurosteroidů jsou dosud velmi málo prozkoumané, lze však předpokládat jejich roli v neuroprotektivitě.

Sulfátové estery neurosteroidů hrají fyziologickou roli v regulaci receptorů excitačních i inhibič20 nich neuropřenašečů a participují na přirozených protektivních vlastnostech tkáně centrálního nervového systému. Sulfatované estery ajejich analogy jsou nadějnými molekulami v terapii chorob centrálního nervového systému. Nicméně v nervové tkáni je poměr mezi neurosteroidy ajejich sulfatovanými estery udržován enzymaticky. Umělé podání sulfatovaných esterů nemusí v důsledku enzymové aktivity vést k zlepšení sledovaných funkcí. Zde předkládané molekuly představují metabolicky stabilnější analogy sulfatovaných esterů, které vzhledem ke své struktuře snadněji procházejí přes hematoencefalickou bariéru. Sulfatované a tedy polární stero i dní sloučeniny obecně hematoencefalickou bariérou nepronikají, ale bylo zjištěno, že pregnanolonsulfát podaný nitrožilně přes hematoencefalickou bariéru proniká (Wang et al., 1997), nicméně poměr mezi sulfatováným a nesulfatovaným steroidem se v mozku nemění. V transportu sulfato30 váných analogů se pravděpodobně uplatňují aktivní mechanismy spojené s transportním proteinem organických iontů (OATP), který je exprimován v buňkách mozkové tkáně.

Výhodou zde popsaných sloučenin je to, že si uchovávají podobné farmakologické i fyziologické vlastnosti jako pregnanolon-sulfát, mající terapeutický potenciál, přičemž však nejsou odbourá35 vány sulfatasami.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I

v němž

R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³-R²-C(R^l3)-R⁴- kde R² znamená (CH_m)„- kde m je 0 až 2, n je 1 až 18 tvořený přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, který může být dále substituován primární nebo sekundární amino skupinou, která může být bud’ volná, nebo, v případě

-3CZ 303443 B6 primární aminoskupiny, chráněná odstranitelnou chránící skupinou, zvolenou z tert-butyloxykarbonylu, tritylu, benzyloxykarbonylu, 9—fluorenylmethoxykarbonylu či p-nitrobenzyloxykarbonylu, R³ znamená kationickou skupinu zvolenou z guanidylové skupiny obecného vzorce a,

R⁸ (a), popřípadě amoniové skupiny obecného vzorce b (b), přičemž R⁵ a R¹² znamenají vodíkové atomy nebo alkylové čí alkenylové skupiny s 1 až 18 atomy uhlíku, které tvoří přímý nebo větvený řetězec,

R¹³ je atom kyslíku a R⁴ je atom kyslíku.

Dále je předmětem předloženého vynálezu způsob výroby derivátů pregnanolonu, substituovaných v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I podle nároku 1, kde R¹ má stejný význam jako bylo uvedeno výše, přičemž substituent R3 je guanidylová skupina vzorce a, R⁴znamená atom kyslíku, při němž reakční směs, obsahující 3alfa-hydroxy-5beta-pregnan-20-on vzorce

‘0 (Π), arginin chráněný vhodnými chránícími skupinami a dimethylaminopyridin, se rozpustí ve vhodném bezvodém rozpouštědle pod inertní atmosférou, reakční směs se pak ochladí v ledové lázni a za míchání se po kapkách přidává kondenzační činidlo, jímž je dicyklohexylkarbodiimid nebo 1(3 dimethyíamino-propyl) 3 -ethylkarbodiimid. rozpuštěné ve vhodném rozpouštědle; za chránění proti přístupu vzdušné vlhkosti se reakční směs míchá 10 až 48 h při teplotě v rozmezí 0 až 50 °C, poté se nalije do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného nebo draselného a produkt se extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře rozpustný, následně se spojené organické fáze promývají nasyceným roztokem chloridu sodného do odstranění přítomného hydrogenuhličitanu, extrakt se vysuší a rozpouštědlo se odpaří; surový materiál se přelije minimálním množstvím acetonu a vysrážena močovina se odfiltruje k získání sloučeniny obecného vzorce I, která se může dále podrobit přečištění, přičemž případná chránící skupina arginínové

-4CZ 303443 B6 struktury se odstraní tak, že se získaná sloučenina rozpustí ve směsi karboxylové kyseliny a alkoholu, k tomuto roztoku se přidá hydrogenační katalyzátor, s výhodou Pd/C nebo platinová čerň a po hydrogenací se katalyzátor odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří.

Výhodně se vhodné chránící skupiny zvolí ztosylové, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylové, 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-suIfonylové, mesityl-2-sulfonylové, 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonylové, 1,2-dimethylindol-3-sulfonylové, ω,ω'-bis-tertbutyloxykarbo-nylové, ω-nitro, trifluoroacetylové, ω,ω-bis-benzyloxykarbonylové či z ω,ω'bis-allyloxykarbonylové skupiny a jako vhodné rozpouštědlo se použije chloroform, dichlorio methan, benzen, toluen nebo acetonitril.

Jedno z výhodných provedení způsobu podle předkládaného vynálezu spočívá v tom, že reakční směs se míchá 10 až 12 hodin, použitým organickým rozpouštědlem je s výhodou ethylacetát, k přečištění produktu se použije krystal i zace nebo chromatografie na sloupci silikagelu a k roz15 puštění produktu v případě odstraňování chránící skupiny se použije s výhodou směs kyseliny octové s methanolem, přičemž doba hydrogenace se s výhodou zvolí jako 72 hodin.

Dalším význakem způsobu výroby podle předloženého vynálezu je to, že chránící skupina argininové struktury sloučeniny obecného vzorce I získané jak bylo popsáno výše, jíž je benzyloxy20 karbonylová nebo 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonylová (Pbť) skupina, se odstraní působením trifluoroctové kyseliny na chráněný derivát, přičemž se reakční směs nechá reagovat 16 až 72 hodin při teplotě mezi 0 až 50 °C, pak se směs nalije do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu zvoleném zNaHCO₃ nebo KHCO₃, produkt se extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře rozpustný, zvoleném z chloroformu a dichlor25 methanu či d i chlore thanu, spojené organické fáze se promyjí 5% obj./obj. vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, extrakt se vysuší sušicím činidlem a rozpouštědlo se odpaří; surový materiál se případně čistí například krystal i žací, která poskytne dihydrochlorid sloučeniny obecného vzorce I.

Význakem způsobu výroby podle vynálezu je dále, že reakční směs se ponechá reagovat při teplotě místnosti, přičemž použitým hydrogenuhliěitanem je s výhodou NaHO₃ a jako sušicí činidlo se použije síran horečnatý nebo síran sodný a rozpouštědlo se s výhodou odpaří destilací pod vakuem.

Dále je předmětem vynálezu také způsob výroby sloučeniny obecného vzorce I popsané výše, kde R¹ znamená totéž co výše, přičemž R³ je kvartémí amoniová sůl obecného vzorce b

(b), s různou délkou řetězců spojujících amoniovou skupinu s karboxy lem, tvořícím esterovou vazbu se sloučeninou obecného vzorce II, jak je popsána výše, jehož podstata spočívá v tom, že se vhodná sůl kvartérní ω-aminokarboxylové kyseliny suspenduje v bezvodém dichlormethanu pod inertní atmosférou, do reakční směsi o teplotě -50 až + 20 °C se přidá vhodné chlorační činidlo, zvolené ze skupiny, zahrnující thionylchlorid, oxychlorid fosforečný a dichlorid kyseliny šťave45 lové, přičemž reakci lze usnadnit vhodným katalyzátorem; reakční směs se potom míchá 8 až 72 hodin k rozpuštění všech pevných součástí, těkavé složky směsi se následně odpaří ve vakuu, surový produkt se rozpustí ve směsi bezvodého nitromethanu a pyridinu pod inertní atmosférou, přidá se sloučenina II

-5 CZ 303443 B6

na pH 4,0 5% (obj./obj.) vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, organické podíly se extra5 hují do chloroformu, který se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného; získaný roztok se vysuší sušicím činidlem a rozpouštědlo se odpaří, nezreagovaný výchozí materiál se pak odstraní promytím benzenem a produkt se dále, pokud je to vhodné, částí například krystalizací ze směsi vhodných rozpouštědel, která poskytne sloučeninu vzorce I, kde R³ odpovídá obecnému vzorci b, tzn. R³ je kvartemí amoniová sůl.

io

Dále je význakem způsobu podle předkládaného vynálezu to, že teplota reakční směsi je s výhodou 0 °C, jako chlorační činidlo se s výhodou použije dichlorid kyseliny šťavelové a jako katalyzátor dimethylformamid, přičemž míchání reakční směsi se provádí nejprve 16 hodin a po přidání sloučeniny vzorce III pak 4 hodiny; jako sušicí činidlo se použije síran hořečnatý nebo sodný, rozpouštědlo se odpaří destilací pod vakuem a přečištění produktu krystalizací se provádí ze směsi chloroformu a n—heptanu.

Předložený vynález dále zahrnuje deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I který byl uveden výše, pro použití k léčení neuropsychiatric20 kých poruch, souvisejících s nerovnováhami glutamátergního neuropřenašečového systému, jako jsou ischemické poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativní změny a poruchy centrální nervové soustavy, afektivní poruchy, deprese, post-traumatická stresová porucha a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, bolest, závislosti, roztroušená skleróza, epilepsie, gliomy.

Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I popsaného výše pro výrobu veterinárního a humánního farmaceutického přípravku pro léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuropřenašečového systému, ischemického poškození CNS, neurodegenerativních změn a poruch CNS, afektivní poruchy, deprese, posttrau30 matické stresové poruchy a nemocí souvisejících se stresem, anxiety, schizofrenie a psychotických poruch, bolesti, závislosti roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomů.

Předmětem předloženého vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek, který obsahuje jako aktivní složku deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obec35 ného vzorce I popsaného výše.

Předmětem vynálezu je konečně i použití derivátů pregnanolonu, substituovaných v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I popsaného výše pro výrobu standardů neuroprotektiv a neuroleptik, případně analytických standardů používaných v experimentálním výzkumu a v analytické chemii či jako sloučenin obsažených v potravinových doplňcích či kosmetických přípravcích určených pro zlepšování reakcí jednotlivých částí organismu na zvýšený stres zejména oxidativní, nutriční a způsobený volnými radikály, případě na stárnutí.

Vynález je založen na výsledcích pokusů, v nichž jsme zkoumali vliv pregnanolon-sulfátu na nativní a rekombinantní NMDA receptory. Ty ukázaly, že tento přirozeně se vyskytující neurosí eroíd i nh i buje odpovědi, vyvolané exogenní aplikací specifických agonistů NMDA receptoru. Prokázali jsme, že se pregnanolon-sulfát váže pouze na aktivované receptory (use-dependentní účinek), ale neváže se do iontového kanálu jako některé látky typu Mg²⁺, ketamin, dizocilpinu nebo memantinu. Rychlost vazby a mechanismus účinku pregnanolon-sulfátu zapříčiňuje vyšší

-6CZ 303443 B6 inhibiční působení na receptory tonicky aktivované glutamátem než na fázicky aktivované receptory během synaptického přenosu. Nově bylo zjištěno, že námi syntetizované analogy, kterých se týká vynález, vykazují na NMDA receptorech stejný mechanizmus působení jako pregna nolon-sulfát.

Aplikace pregnanolon-sulfátu v důsledku enzymové aktivity v CNS nevede k zlepšení sledovaných funkcí, ovšem zde předkládané molekuly představují mnohem výhodnější analogy, které nejsou hydrolyzovatelné sulfatasami.

Různé strukturní modifikace námi připravených sloučenin obecného vzorce I navíc ukázaly pouze minimální rozdíly v jejich biologické účinnosti. Tyto nálezy tak potvrzují získané elektroťyziologické výsledky (patch-clamp), sledující kinetiku vazby zmíněných látek na NMDA receptory.

Údaje dosud publikované jinými pracovišti potvrzují schopnost antagonistů NMDA receptoru předcházet excesivnímu vylití glutamátu a následnému poškození centrální nervové soustavy, což vede ke změnám v chování pokusných zvířat. Ovšem klinické využití takových antagonistů je omezené, vzhledem k tomu, že jejich aplikace vede k celé řadě nejrůznějších vedlejších účinků, projevujících se od poškození motoriky po indukci psychotických příznaků.

Hlavní výhodou 3alfa-substituováných derivátů pregnanolonu je závislost jejich antagonistického účinku na míře excitace NMDA receptorů, což se projevuje nepřítomností vážných vedlejších účinků, typických pro dosud testované (případně používané) kompetitivní NMDA antagonisty, zatímco příznivý efekt těchto antagonistů zůstává zachován.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. IA znázorňuje proudovou odpověď, vyvolanou aplikací 1 mmol.T¹ glutamátu a reverzibilní inhibici takové proudové odpovědi sloučeninou z příkladu 2, aplikovanou v koncentraci 10 μτηοΙ.Γ¹ současně s glutamátem v intervalech znázorněných obdélníky bez výplně při pozitivním i negativním udržovaném membránovém potenciálu -60 a +60 mV. Snímání bylo pořízeno technikou patch-clamp zkultivovaných HEK293 buněk skloňovanými NR1/NR2B NMDA receptory. Míra inhibice vyvolaná sloučeninou z příkladu 2 byla vypočtena podle vzorce:

(l-a/b)*100 (%).

Obr. 1B je diagram prokazující nezávislost průměrné inhibice indukované sloučeninou z příkladu 2 (10 μΐϊίοΙ.Γ¹) v intervalech znázorněných obdélníky bez výplně, vynesené na ose y, na hodnotách udržovaného membránového potenciálu, znázorněných na ose x.

Příklady provedení vynálezu

Seznam zkratek:

DMSO dimethylsulfoxid

DMAP dimethylaminopyridin

DCC dicyklohexylkarbodiimid

DMF dimethylformamid

HRMS hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením

Boc /erc-butoxy karbonyl

Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl

-7CZ 303443 B6 m multiplet bm široký multiplet d dublet t triplet

El ionizace elektronovým nárazem

ESI ionizace elektrosprejem ekv. ekvivalent

IČ infračervená spektroskopie

MS hmotnostní spektroskopie

NMR nukleární magnetická rezonance

Et ethyl

Z-Bu terciární butyl

Ac acetyl

HEK lidské embryonální ledvinové buňky

GFP zelený fluorescentní protein

IC₅o koncentrace, při které dochází k 50% inhibici

Opti-MEM®I minimální esenciální médium, výrobek firmy Invitrogen DHEA 5-dehydroepiandrosteron

EGTA kyselina ethylenglykoltetraoctová

EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová

HEPES kyselina (4—(2-hydroxyethyl)—1-piperazinethanesulfonová

Biologická aktivita na buněčných kulturách

Míra inhibice aktivovaného NMDA receptorů steroidnimi kationickými sloučeninami byla stanovena in vitro elektrofyziologicky na kultivovaných HEK293 buňkách (Human Embryonic Kidney 293 cells) 24 až 48 hodin po transfekci DNA plazmidy, kódujícími NR1—laaNR2B podjednotku NMDA receptorů. Transfekované buňky byly identifikovány pomocí fluorescence GFP (green fluorescent protein), jehož gen byl transfekován společně s geny obou receptorových podjed30 notek.

Aplikační roztoky obsahující steroid byly připraveny přidáním příslušného množství čerstvě připraveného zásobního roztoku (20 mmol.l ¹ steroidu rozpuštěného v DMSO) do extracelulámího roztoku s obsahem 1 mmol.l^-1 kyseliny glutamové a 10 pmol.l“¹ glycinu. Stejné množství DMSO bylo přidáno i do všech ostatních aplikačních roztoků.

Proudové odpovědi vyvolané extracelulámí aplikací roztoku kyseliny glutamové (1 mmol.l ') byly snímány z celé buňky pomocí techniky pate h-c lamp, která se využívá jako nástroj pro studium přenosu nabitých částic přes modelové í reálné biologické membrány. Proudy byly měřeny při membránovém potenciálu -60 a +60 mV. Testované steroidní sloučeniny snížily amplitudu odpovědi indukované kyselinou glutamovou. Při použití koncentrace steroidu 10 pmol.r¹ se hodnota měřeného proudu v průměru snížila o 65 až 70 %. Pro srovnání lze uvést, že inhibice endogenním neurosteroidem 5(3-pregnanolon-3a-yl-sulfátem v koncentraci 100 pmol.l“¹ má hodnotu 67 %.

-8CZ 303443 B6

Příklad 1

20-Oxo-5f3-pregnan-3a-y 1-(25)-2-( benzyloxykarbonylamino)-5-(3-nitroguanidino)pentanoát

Do vysušené baňky o objemu 100 ml s magnetickým míchadlem, obsahující směs sloučeniny II (300 mg, 0,94 mmol), N_a-(carbonyIoxybenzyl)-N_w-nitro-L-guanidinu (366 mg, 1,03 mmol) a DMAP (12 mg; 0,09 mmol) pod argonovou atmosférou bylo přidáno 20 ml bezvodého acetonitrilu a vzniklý roztok ochlazen v ledové lázni. Potom byl za míchání při kapán l mol.l ¹ roztok io dicyklohexylkarbodiimidu v benzenu (1,41 ml; 1,41 mmol). Poté byla reakční směs vyjmuta z chladicí lázně a za teploty místnosti míchána 16 h. Reakce byla ukončena přidáním nasyceného roztoku NaHCCE (50 ml), organické podíly byly extrahovány do EtOAc (3x25 ml), promyty nasyceným roztokem chloridu sodného (50 ml), sušeny bezvodým MgSO₄, filtrovány a rozpouštědla byla odpařena ve vakuu. N,N-Dicyklohexylmočovina byla odstraněna krystalizací za použití malého množství acetonu a odfiltrována. Filtrát byl koncentrován za sníženého tlaku a v toluenu nanesen na sloupec silikagelu (30 g), Eluce směsí petrol ether - aceton (7:3, obj ./obj.) a následné odpaření rozpouštědel poskytlo 20-oxo-5(3-pregnan-3ct-yl-(2S)-2-(benzyloxykarbonylamino)-5-(3-nitroguanidino)pentanoát jako bílou pěnu (473 MG; 77% výtěžek).

’H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 7,41 - 7,31 m (5H, fenyl), 5,67 (d, IH J - 8,0 Hz, NHCbz), 5,12 (s, 2H, C//₂-Ph), 4,84 - 4,74 (m, IH, 3-CH), 4,37 -4,28 (m, IH, 2'-CH), 3,63 - 3,52 (m, IH, 5'a-CH), 3,35 - 3,23 (m, IH, 5'b-CH), 2,57 (t, IH, J = 9,0 Hz), 2,12 (s, 3H, 21-CH0, 0,94 (s, 3H, 19-CH₃), 0,60 (s, 3H, I8-CH₃).

^,3CNMR (101 MHz, CDC1₃) δ 209,54; 171,34; 159,24, 135,94, 128,70, 128,52, 127,77, 76,34, 67,59, 63,80, 56,60, 52,27, 44,32, 41,87, 40,45, 40,22, 39,09, 35,80, 34,88, 34,61, 32,09, 31,67, 31,51, 26,88, 26,51,26,25, 24,41,24,33, 23,22, 22,93, 20,88, 13,42.

IČ (CHCb): 3397 (NH), 1729 (C-O. ester), 1702 (C=O, keton), 1626, 1606 (C=NH), 1515 30 (karbamát), 1387 (CH₃), 1348 (NO₂), 1291, 1277 (CO), 1232 (karbamát), cm’¹.

ESI m/z 654.1 (45%, [M+H]⁺), 676.3 (100%, [M+Na]⁺); HRMS-ESI m/z 654.3861 ([M+H]⁺, pro C35H52O7N5 vypočteno 654.3861).

Příklad 2

20-Oxo-5p-pregnan-3a-yl-L-argininatodiacetát

Sloučenina z příkladu 1 (216 mg; 0,33 mmol) byla rozpuštěna ve směsi kyseliny octové (0,5 ml) a methanolu (9,5 ml). K roztoku bylo přidáno Pd/C (10%, 44 mg) a reakční směs byla míchána pod mírným přetlakem vodíku za teploty místnosti 72 h. Poté byl katalyzátor odfiltrován přes křemelinu a rozpouštědla byla odpařena. Chromatografie na silikagelu (4 g) v MeOH:AcOH:H₂O poskytla 20—oxo-5(3-pregnan-3a-yl-L-argininatodiacetát (187 mg; 95% výtěžek).

^lH NMR (500 MHz, CDCb; d₄-methanol, 4:1) δ 4,82 - 4,74 (m, 1H, 3-CH), 3,47 (t, 1H, J - 6,4 Hz, 2'-CH), 3,15 (t, 2H, J = 6,8 Hz, 5'-€H), 2,58 (t, IH, J - 8,8 Hz, 17-CH), 2,17 (s, 3H, 21CH₃), 2,01 (s, 6H,-OOCCH3), 0,96 (s, 3H, 19-CH₃),0,61 (s,3H, 18-CHx).

^l3CNMR (101 MHz, d₄-methanol) δ 212,41, 169,93, 78,62, 65,01, 58,03, 53,89, 45,55, 43,44, 41,95, 41,85, 40,38, 37,34, 36,11, 35,92, 33,36, 3 1,72, 28,94, 28,19, 27,75, 27,67, 25,80, 25,57, 24,07, 23,81,22,13, 13,88.

-9CZ 303443 B6

IČ (KBr): 3342, 3267,3167 (NH₃ ^l), 1726 (C=O, ester), 1699(C=O, keton + guanidinium), 1679, 1601), (guanidínium), 1551, 1408 (AcO ), 1387 (CH₃), 1364(COCH₃), 1235, 1167 (CO) cm '.

ESI m/z 475.3 (100%, [M-2AcOH+H]⁺; HRMS-ESI m/z 475.3640 ([M-2AcOH+H]⁺, pro C27H47O3N4 vypočteno 475.3643).

Příklad 3

20-Oxo-5[3-pregnan-3a-yl-2-[(tert-butoxykarbonyl)amino]-5-(3-{[2,2,4,5,7-pentamethyl2.3-dihydrobenzoťuran-6-yl]sulfonyl}guanidino)pentanoát

Do vysušené baňky o objemu 100 ml s magnetickým míchadlem, obsahující směs sloučeniny II (500 mg, 1,57 mmol), Boc-L-Arg(Pbf)-OH (994 mg, 1,88 mmol) a dimethylaminopyridinu (DMAP; 21 mg; 0,16 mmol) a naplněné argonem byl přidán bezvodý benzen (45 ml) a reakční směs byla ochlazena v ledové lázni. Poté byl přikapán roztok dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v benzenu (1 mol.f¹, 1,41 ml; 1,41 mmol). Směs byla zahřáta na laboratorní teplotu a míchána 16 hodin. Přidáním nasyceného roztoku NaHCO₃ (50 ml) byla reakce ukončena. Produkt byl extrahován do EtOAc (3x25 ml), organická fáze promyta nasyceným roztokem chloridu sodného (50 ml), sušena bezvodým MgSO₄, filtrována a rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku. Ν,Ν'-dicyklohexyl močovina byla odkrystalizována z malého množství acetonu a odfiltrována. Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku a chromatografován na sloupci silikagelu (50 g) ve směsi petro lether: aceton (7:3, obj./obj.). Odpařením rozpouštědel byl získán 20-oxo—5p—pregnan-3ayl-2-((tert-butoxy karbony l)amino)-5-( 3-(2,2,4,5,7-pentamethy 1-2,3-d i hydrobenzofuran-6yl)sulfonyl)guanidíno)pentanoát ve formě bílé pěny (1,29 g; 99% výtěžek).

[ct]_D + 53,0 (c 0,234, CHC1₃);

'HNMR (500 MHz, CDCh) δ 6,31 (bm, IH, guanidin), 6,04 (s, 2H, guanidin), 5,30 (d, IH, J = 7,7 Hz, NHBoc), 4,82 -4,74 (m, IH, 3-CH), 4,25 - 4,19 (bm, IH, 2'-CH), 3,40 - 3,30 (tn, IH, 5'a-CH), 3,25 - 3,15 (m, IH, 5'b-CH), 2,96 (s, 2H, CH₂), 2,59 (s, 3H, CH₃), 2,53 (s, 3H, CH₃), 2,53 (t, IH, J - 9,0 Hz), 2,10 (s, 3H, 21-CH₃), 1,46 (s, 3H, 2xCH₃), 1,43 (s, 9H, tBu), 0,94 (s, 3H, 19-CH₃), 0,59 (s, 3H, 18-CH₃).

¹³CNMR(101 MHz, CDC1₃) δ 209,55, 171,81, 158,70, 156,01, 138,37, 133,08, 132,35, 124,54, 117,42, 86,31, 80,49, 75,94, 63,79, 56,57, 44,29, 43,29, 41,88, 40,89, 40,41, 39,10, 35,80, 34,92, 34,62, 32,13, 31,49, 28,59, 28,35, 26,89, 26,57, 26,26, 24,39, 23,23, 22,91, 20,87, 19,21, 17,84, 13,40, 12,45.

IČ (CHCh): 3432, 3345 (NH), 1728 (C=O, ester), 1699 (C=O, keton), 1633, 1623, 1559 (guanidin), 1506 (NHBoc), 1408 (guanidin), 1393 (tBu), 1385, 1370, (CH₃), 1358 (COCH₃), 1158 (SO₂), cm’¹.

ESI m/z 827.5 (63%, [M+Hf), 849,5 (100%, [M+Na]*; HRMS-ESI m/z 827,49907 ([M+H]⁺, pro C45H71O8N4S vypočteno 827,49871).

Pro C45H70N4O8S (827,1) vypočteno: 65,34 % C, 8,53 % H, 6,67 N, 3,88 % S; nalezeno: 65,51 % C, 8,68 % H, 6,43 % N, 3,70 % S.

- 10CZ 303443 B6

Příklad 4

20-Oxo-5p-pregnan-3a-yl-Largininát dihydrochlorid

Sloučenina z příkladu 3 (430 mg; 0,52 mmol) byla rozpuštěna v neředěné kyselině trifluoroctové (0,5 ml) a míchána 48 h při teplotě místnosti. Reakční směs byla potom nalita do nasyceného roztoku NaHCO₃ (50 ml), produkt extrahován chloroformem (4x20 ml), organická fáze promyta roztokem HC1 (5%, 50 ml), vysušena bezvodým Na₂SO₄, přefiltrována a rozpouštědla byla io odpařena za sníženého tlaku. Krystalizace z chloroformu poskytla bílé krystaly dihydrochloridu

20—oxo-5β—pregnan 3a-yl-L argininátu (225 mg; 79% výtěžek).

[<x]_D +71,4 (c 0.224; MeOH);

Ή NMR (500 MHz, d₄-methanol) δ 4,92 - 4,88 m (1H, 3-CH), 4,84 - 4,74 (m, 1H, 3-CH), 4,06 (t, 1H, J = 6,4 Hz, 2^ř-CH), 3,27 (t, 2H, J = 6,8 Hz, 5'-CH), 2,64 (t, 1H, J = 8,8 Hz, 17-CH), 2,12 (s, 3H, 2I-CH3), 0,99 (s,3H, 19-CH₃), 0,61 (s,3H, 18-CH₃).

¹³C NMR (101 MHz, d₄-methanol) δ 212,41, 160,93, 78,62, 65,01, 58,03, 53,89, 45,55, 43,44, 20 41,95, 41,85, 40,38, 37,34, 36,11, 35,92, 33,36, 31,72, 28,94, 28,19, 27,75, 27,67, 25,80, 25,57,

24,07, 23,81,22,13, 13,88.

IR (KBr): 2935 (NH₃ ⁺), 1744 (C-O. ester), 1706 (C=O, keton), 1667, 1652, 1625 (guanidiniutn), 1385 (CH₃), 1358 (COCH₃), 1226, 1193 (CO), cm’¹.

ESI m/z 475.4 (100%, [M+2CI+Hf); HRMS-ESI m/z 475.36398 ([M-2-C1+H], pro C27H47O3N4 vypočteno 475,36427).

Pro C₂₇H₄₈C_!2N₄O₃ (547,6) vypočteno: 59,22 % C, 8,84 % H, 12,95 % Cl, 10,23 % N; nalezeno: 30 58,95 % C, 8,72% H, 13,11 % Cl, 9,99 % N.

Příklad 5

20-Oxo-5p-pregnan-3c(-yl-L-(methylguanidino)-acetát hydrochlorid

Bezvodý kreatin (59 mg; 0,5 mmol) byl rozpuštěn v tetrahydrofuranu (15 ml); po přidání sloučeniny II (160 mg, 0,5 mmol), bezvodého síranu horečnatého (2 g) a katalytického množství kyseliny sírové (0,02 ml) byla vzniklá směs míchána 16 h za laboratorní teploty. Reakční směs byla potom nalita do vody s ledem, produkt extrahován chloroformem (4x20 ml), organická fáze promyta ledovým roztokem NaHCO₃ (5%), 5% roztokem HC1 (20 ml), vysušena bezvodým Na₂SO₄, přefiltrována a rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku. Krystalizace z chloroformu poskytla 20-oxo-5[3-pregnan-3a-yl 2-(methylguanidino)-acetát hydrochlorid (107 mg; 47 %).

^lHNMR (500 MHz, d₄-methanol) δ 4,92 - 4,88 (m, 1H, 3-CH), 3,53 (s, 2H, N-CH₂), 3,04 (s, 3H, N-CH₃), 2,57 (t, 1H, J - 8,8 Hz, 17-CH), 2,12 (s, 3H, 21-CH₃), 0,99 (s, 3H, 19-CH₃), 0,61 (s, 3H, 18-CH₃).

IR (KBr): 2935 (NH₃ ⁺), 1744 (C=O, ester), 1706 (C=O, keton), 1667, 1652, 1625 (guanidinium), 1385 (CH₃), 1358(COCH₃), 1226, 1193 (CO), cm '.

ESI m/z 418.3 (100%, [M-CI+Hf); HRMS-ESI m/z 418.3073 ([M-C1+H]⁺, pro C₂₄H₄₀O₃N₃vypočteno 418,3070).

Příklad 6

20-Oxo-5[3 pregnan-3a-yl-4-(trimethy lamonium)—butanoát chlorid

3-Karboxy—Ν,Ν,Ν-trimethylpropan—1-aminium chlorid (připravený podle Lindstedt and Lindstedt, 1965, 321; 69 mg; 0,38 mmol) byl suspendován v bezvodém CH₂C1₂ (1 ml) v atmosféře argonu. K reakční směsi ochlazené v ledové lázni byl přidán po kapkách d i chlorid kyseliny šťavelové (0,5 ml; 5,82 mmol), následovaný katalytickým množstvím bezvodého DMF (3 μΙ; 0,03 mmol). Heterogenní směs byla temperována na laboratorní teplotu a při té míchána 16 h. Během této doby se vytvořil čirý roztok. Kapalné podíly směsi byly za sníženého tlaku odpařeny a pevný zbytek rozpuštěn v nítrometanu (2 ml) a bezvodém pyridinu (0,10 ml; 1,24 mmol) pod argonem. K tomuto roztoku byla přidána sloučenina II (100 mg; 0,31 mmol). Reakční směs byla míchána 4 hodiny a následně byla reakce ukončena přidáním vody (10 ml). Vzniklá směs byla okyselena na pH 4 vodným roztokem HC1 (5% obj./obj.). Produkt byl extrahován do CHC1₃ (3 x 20 ml), roztok promyt nasyceným vodným NaCl (10 ml), vysušen MgSO₄ a odpařen za sníženého tlaku. Nezreagovaný výchozí steroid II byl odstraněn triturací benzenem a zbylý produkt byl krystalizován ze směsi CHC1₃: w-heptan (1:1). Byly tak získány jehlicovité krystaly (134 mg; 89% výtěžek).

[a]_D = +88,4 (c 0,243);

¹H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 4,76 - 4,68 (m, 1H, 3-CH), 3,73 - 3,65 (bm, 2H, 4'-CH₂), 3,47 (s, 9H, NCH₃), 2,55 (t, 1H, J - 9,0 Hz, 17-CH), 2,49 (t, 2H, J = 6,2 Hz, 2'-CH₂), 2,12 (s, 3H, 21CH₃), 0,94 (s, 3H, 19-CH₃), 0,60 (s, 3H, 18-CH₃).

’ H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 4,76 - 4,68 (m, 1H, 3-CH), 3,73 - 3,65 (bm, 2H, 4'-CH₂), 3,47 (s, 9H, NCH₃), 2,55 (t, 1H, J = 9,0 Hz, 17-CH), 2,49 (t, 2H, J = 6,2 Hz, 2'-CH₂), 2,12 (s, 3H, 21CH₃), 0,94 (s, 3H, 19-CH₃), 0,60 (s, 3H, 18-CH₃).

¹³C NMR (101 MHz, CDC1₃) δ 209,47, 171,49, 75,20, 65,61, 63,79, 56,62, 53,45, 44,26, 41,83,

40,41, 39,13, 35,76, 34,96, 34,59, 32,19, 31,46, 30,27, 26,87, 26,59, 26,24, 24,37, 23,22, 22,89, 20,82, 18,46, 13,38.

IČ (CHCls): 2956 (NMe?), 1722 (C=O, ester), 1699 (C=O, keton), 1478 (NMe,⁺) 1386 (CH₃), 1360 (COCH0, 1230 (NMe₃ ⁺), 1188 (CO), cm’¹.

ESI m/z 446,6 (100%, [M-CI]⁺); HRMS-ESI m/z 446,3624 ([M-C1]⁺, pro C₂₈H₄₈O₃N vypočteno

446,3629).

Pro C₂₈H₄₈C1NO₃ (482,1) vypočteno: 69,75 % C; 10,03 % H, 7,35 % Cl, 2,91 % N; nalezeno: 69,59 % C, 9,99 % H, 2,82 % N, 7,12 % Cl.

Příklad 7

20-Oxo—5[3-pregnan—3ct-yl—6-(trimethylamonium)-hexanoát chlorid

Z 5-karboxy-N,N,N-trimethylpentan-l-amoniumchloridu (210 mg, 1 mmol) bylo analogickým postupem jako v příkladu 6 připraveno 101 mg 20-oxo-5[3-pregnan-3a-yl 6-{trimethylamonium)-hexanoát chloridu (výtěžek 76 %).

- 12 CZ 303443 B6 ’Η NMR (500 MHz, CDCI₃) δ 4,74 - 4,67 (m, IH, 3CH), 3,71 - 3,53 (bm, 2H, 5'CH₂), 3,45 (s, 9H, NCH₃), 2,56 (t, IH, J = 8,9 Hz, 17CH), 2,49 (t, 2H, J = 6,1 Hz, 2'CH₂), 2,12 (s, 3H, 21CH₃), 0,95 (s, 3H, 19CH₃), 0,61 (s, 3H, I8CH3).

IČ (CHCI3): 2958 (NMe₃ ⁺), 1720 (C=O, ester), 1700 (CO, keton), 1478 (NMe?) 1386 (CH₃), 1360 (COCH3), 1231 (NMe₃7 1187 (CO), cm’¹.

ESI m/z 474,4 (100%, [MCI]⁴); HRMS ES1 m/z 474,3949 ([MCI]⁴, pro C₂₈H₄₈Ú₃N vypočteno 474,3947).

Příklad 8

200xo-5|3~pregnan-3a-yl-2-(trimethylamonium)-acetát chlorid

Dichlorid betainu byl připraven zbetainu (62 mg, 0,4 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (1 ml) pod argonem. K reakční směsi ochlazené v ledové lázni byl přidán po kapkách oxalylchlorid (0,5 ml; 5,82 mmol), následovaný katalytickým množstvím bezvodého DMF (3 μΐ; 0,03 mmol). Heterogenní směs byla ponechána zahřát na laboratorní teplotu a míchána po dobu 16 h, za kterou se rozpustily všechny pevné podíly. Poté byla reakční směs za sníženého tlaku odpařena do sucha a pevný zbytek rozpuštěn v nitromethanu (2 ml) a bezvodém pyridinu (0,10 ml; 1,24 mmol) v argonové atmosféře. K roztoku chloridu byla přidána sloučenina II (100 mg; 0,31 mmol). Reakční směs byla míchána 4 h a následně byla reakce ukončena přidáním vody (10 ml). Vzniklá směs byla okyselena na pH 4 vodným roztokem HC1 (5% hm./hm.). Produkt byl extrahován do

CHCI3 (3 x 20 ml), spojené organické extrakty promyty nasyceným vodným NaCl (10 ml), vysušeny MgSO₄ a rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku. Nezreagovaný výchozí lipofilní materiál byl odstraněn vymytím benzenem a zbylý produkt byl krystalizován ze směsi CHCI₃: n~ heptan, 1:1. (81 mg; 62 %).

'H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 4,76 - 4,68 (m, IH, 3CH), 3,78 - 3,78 (d, 2H, 2CH₂), 3,49 (s, 9H, NCH₃), 2,53 (t, IH, J = 9,0 Hz, 17CH), 2,12 (s, 3H, 21CH₃), 0,94 (s, 3H, 19CH₃), 0,60 (s,3H, I8CH3).

IČ (CHC1₃): 2956 (NMe₃ ⁺), 1722 (CO, ester), 1699 (C=O, keton), 1478 (NMe?), 1386 (CH₃),

1360 (COCH₃), 1230 (NMe₃ ⁺), 1188 (CO), cm '.

ESI m/z 418,3 (100%, [MCI]⁴); HRMS-ESI m/z 418,3323 ([MCI]⁴, pro C₂₈H₄₈O₃N vypočteno 446,3319).

Příklad 9

Vliv pregnanolon sulfátu a jeho analogů na rekombtnantní NMDA receptory

HEK293 buňky (American Type Culture Collection, ATTC No. CRL1573, Rockville, MD) byly kultivovány v médiu Opti-MEM® I (lnvitrogen) s přídavkem 5% fetálního telecího séra při 37 °C a transfekovány NRl-la/NR2B/GFP plazmidy, jak bylo popsáno drive (Cais a další 2008). Stejná množství (0,3 pg) cDNA kódující NR1, NR2 a GFP (green fluorescent protein) (pQBI 25, Takara, Japonsko) byla smíchána s 0,9 μΐ Matra-A Reagent (IBA, Gottingen, Germany) a přidá50 na ke konfluentním HEK293 buňkám, kultivovaných v 24jamkové destičce. Po trypsinizaci byly buňky resuspendovány v médiu Opti-MEM® I, obsahujícím 1% fetální telecí sérum. Do směsi byla dále přidány 20 mmol.l·¹ MgCl₂, 1 mmol.l·¹ D,L-2-amino-5-fosfonopentanové kyseliny 3 mmol.l·¹ kynurenové kyseliny a buňky byly nasazeny na polylysinem potažená krycí sklíčka o průměru 25 mm. Po transfekci byly použity následující geny kódující podjednotky NMDA

- 13 CZ 303443 B6 receptoru: NRl-la (GenBank, přírůstkové č. U08261) a NR2B (GenBank, přírůstkové č. M91562).

Pro elektroíyzio logické pokusy byly použity kultury HEK293 buněk 16 až 40 hodin po transfek5 ci. Proudy, vzniklé při snímání z celé buňky, byly měřeny pomocí patch-clamp zesilovače (Axopatch ID; Axon Instruments, lne. Foster City, USA) po kompenzaci kapacity a sériového odporu (<10 ΜΩ) na 80 až 90 %). Agonistou indukované odpovědi byly filtrovány na 1 kHz (filtr 8-pole Bessel; Frequency Devices, Haverhill, USA), digitalizovány při 5 kHz a analyzovány softwarovým programem pClamp verze 9 (Axon Instruments), Borosilikátové mikropipety byly naplněny io intracelulámím roztokem, který obsahoval 125 mmol.f¹ D-glukonové kyseliny, 15 mmol.f¹chloridu česného, 5 mmol.!¹ EGTA, 10 mmol.f¹ HEPES, 3 mmol.f¹ chloridu hořečnatého, 0,5 mmol.f¹ chloridu vápenatého a 2 mmol.f¹ hořeěnaté soli ATP (pH upraveno na 7,2 roztokem hydroxidu sodného). Extracelulámí roztok (ECS) obsahoval 160 mmol.f¹ chloridu sodného, 2,5 mmol.f¹ chloridu draselného, 10 mmol.f¹ HEPES, 10 mmol.l ¹ glukózy, 0,2 mmol.f¹ EDTA a 0,7 mmol.f¹ chloridu vápenatého (pH upraveno na 7,3 roztokem hydroxidu sodného). Glycin byl přidán jak do testovacího, tak do kontrolního roztoku. Roztoky se steroidem byly připraveny z čerstvě připraveného zásobního roztoku (20 mmol.f¹) steroidu rozpuštěného vdimethylsulfoxidu (DMSO). Ve všech extracelulámích roztocích byla použita stejná koncentrace DMSO. Kontrolní a testovací roztoky byly aplikovány mikroprocesorem kontrolovaným systémem pro20 mývání, s rychlostí výměny roztoku v okolí buňky ~ 10 ms.

Proudové odpovědi vyvolané 100μΜ NMDA (v případě hipokampálních neuronů) byly měřeny při udržovaném membránovém potenciálu -60 mV. V souladu s předchozími výsledky pregnanolonsulfát snížil amplitudu NMDA-indukované odpovědi. Při použití 100 pmol.f¹ pregnanolon25 sulfátu byl průměrný inhibiční efekt 67,2 ± 8,2 % (n = 5) na rekombinantních NR1/NR2B receptorech (Petrovic a spol., J. Neurosci. 2005, 25(37), 8439 až 50). Syntetická analoga pregnanolon-sulfátu měla inhibiční efekt (obrázek 1) v koncentraci 10 pmol.f¹ (tak aby míra inhibice byla v rozmezí 30 až 70 % maximální inhibice). Relativní míra steroidem indukované inhibice byla použita pro výpočet IC_S0. IC₅₀ byly vypočítány z rovnice RI = 1 - (1/1 + ([steroid]/IC₅₀)^h), kde RI je relativní míra steroidem indukované inhibice a he je parametr Hillova koeficientu (1,2). Hodnoty IC₅o jsou uvedeny v následující tabulce.

Nově syntetizované analogy (z příkladů 2, 4 - 6) mají stejný mechanizmus působení na NMDA receptorech jako pregnanolon sulfát, liší se však svoji relativní afinitou (viz Tabulka 1).

Tabulka 1

testovaná látka - sloučenina z příkladu (č.)	relativní míra inhibice (%)	IC50 (pmol)	Počet buněk	Koncentrace (pmol.f¹)
Pregnanolon-sulfát	67,2 ± 8,2	55	5	100
Sloučenina z příkladu 2 a 4	69,2 ± 9,6	5,3+/-2,1	5	10
Sloučenina z přikladu 6	65,4 ±3,4	5,9+/-0,7	5	10

Výsledky ukazují, že syntetizované analogy pregnanolon-sulfátu mají stejný mechanismus působení na NMDA receptorech jako pregnanolon-sulfát, liší se však svojí relativní afinitou kNMDA receptoru. Všechny pokusy byly prováděny v souladu se Zákonem na ochranu zvířat proti týrání.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I io v němž

R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³-R²-C(R¹³)—R⁴-, kde R² znamená (CH_m)_n-, kde m je 0 až 2, n je 1 až 18 tvořený přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, který může být dále substituován primární nebo sekundární amino skupinou, která může být bud’ volná, nebo, v případě

15 primární aminoskupiny, chráněná odstranitelnou chránící skupinou, zvolenou z tert-butyloxykarbonylu, tritylu, benzyloxykarbonylu, 9-fluorenyl methoxy karbony lu ěi p-nitrobenzyloxykarbonylu, R³ znamená kationickou skupinu zvolenou z guanidylové skupiny obecného vzorce a,

R¹ (a).

popřípadě amoniové skupiny obecného vzorce b

RVI + N >10 (b),

25 přičemž R⁵ až R¹² znamenají vodíkové atomy nebo alkylové či alkenylové skupiny s 1 až 18 atomy uhlíku, které tvoří přímý nebo větvený řetězec,

R¹³ je atom kyslíku, a

30 R⁴ je atom kyslíku.
2. Způsob výroby derivátů pregnanolonu, substituovaných v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I podle nároku 1, kde R¹ má stejný význam jako v nároku 1, přičemž substituent R3 je guanidylová skupina vzorce a, R⁴ znamená atom kyslíku, vyznačující se

35 t í m , že se reakční směs, obsahující 3alfa-hydroxy-5beta-pregnan-20-on vzorce II

- 16CZ 303443 B6 arginin chráněný vhodnými chránícími skupinami a dimethylaminopyridin, se rozpustí ve vhod5 ném bezvodém rozpouštědle pod inertní atmosférou, reakční směs se pak ochladí v ledové lázni a za míchání se po kapkách přidává kondenzační činidlo, jímž je dicyklohexylkarbodiimid nebo l-(3-dimethylamino-propyl)-3-ethylkarbodiÍmÍd, rozpuštěné ve vhodném rozpouštědle; za chránění proti přístupu vzdušné vlhkosti se reakční směs míchá 10 až 48 h při teplotě v rozmezí 0 až 50 °C, poté se nalije do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného nebo draselío ného a produkt se extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře rozpustný, následně se spojené organické fáze promývají nasyceným roztokem chloridu sodného do odstranění přítomného hydrogenuhličitanu, extrakt se vysuší a rozpouštědlo se odpaří; surový materiál se přelije minimálním množstvím acetonu a vysrážena močovina se odfiltruje k získání sloučeniny obecného vzorce I, která se muže dále podrobit přečištění, přičemž případná chránící skupina

15 arginínové struktury se odstraní tak, že se získaná sloučenina rozpustí ve směsi karboxylové kyseliny a alkoholu, k tomuto roztoku se přidá hydrogenační katalyzátor, s výhodou Pd/C nebo platinová čerň a po hydrogenaci se katalyzátor odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří.
3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že vhodné chránící skupiny

20 se zvolí ztosylové, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylové, 2,2,4,6,7 -pentamethy 1-2,3dihydrobenzofuran-5-sulfonylové, mesityl-2-sulfonylové, 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonylové, l,2-dimethylindol-3-sulfonylové, ω,ω-bis-tert-butyloxykarbonylové, ω-nitro, trifluoroacetylové, ω,ω -b i s-benzyloxy karbony love či z ω,ω'-bis-allyloxykarbonylové skupiny a jako vhodné rozpouštědlo se použije chloroform, dichlormethan, benzen, toluen nebo aceto25 nitril.
4. Způsob výroby podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že reakční směs se míchá 10 až 12 hodin, přičemž organickým rozpouštědlem je s výhodou ethylacetát, k přečištění produktu se použije krystalizace nebo chromatografie na sloupci silikagelu a k rozpuštění pro30 duktu v případě odstraňování chránící skupiny se použije s výhodou směs kyseliny octové s methanolem, přičemž doba hydrogenace se s výhodou zvolí jako 72 hodin.
5. Způsob výroby podle nároků 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že chránící skupina arginínové struktury sloučeniny obecného vzorce I, jíž je benzyloxykarbonylová nebo 2,2,4,6,735 pentamethy 1-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonylová skupina, se odstraní působením trifluoroctové kyseliny na chráněný derivát, přičemž se reakční směs nechá reagovat 16 až 72 hodin při teplotě mezi 0 a 50 °C, pak se směs nalije do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu zvoleného zNaHCO₃ nebo KHCO₃, produkt se extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře rozpustný, zvoleným ze skupiny, zahrnující chloroform, dichlormethan a dichlorethan,

40 spojené organické fáze se promyjí 5% obj./obj. vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, extrakt se vysuší sušicím činidlem a rozpouštědlo se odpaří, načež se surový materiál případně čistí, například krystalizací, která poskytne díhydrochlorid sloučeniny obecného vzorce I.
6. Způsob výroby podle nároku 5, vyznačující se tím, že reakční směs se ponechá

45 reagovat při teplotě místnosti, přičemž použitým hydrogenuhličitanem je s výhodou NaHCO₃ a jako sušicí činidlo se použije síran hořečnatý nebo síran sodný a rozpouštědlo se výhodně odpaří destilací pod vakuem.

- 17CZ 303443 B6
7. Způsob výroby sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, kde R¹ má stejný význam jako bylo uvedeno výše, přičemž substituent R³ je kvartémí amoniová sůl vzorce b

R¹² (b), s různou délkou řetězců spojujících amoniovou skupinu s karboxylem, tvořícím esterovou vazbu se sloučeninou obecného vzorce II jak je popsána v nároku 2, vyznačující se tím, že vhodná sůl kvartémí ω-aminokarboxylové kyseliny se suspenduje v bezvodém dichlormethanu pod inertní atmosférou, do reakční směsi o teplotě 50 až +20 °C se přidá vhodné chloraění činidlo, zvolené ze skupiny, zahrnující thionylchlorid, oxychlorid fosforečný a dichlorid kyseliny šťavelové, přičemž reakci lze usnadnit vhodným katalyzátorem, potom se reakční směs míchá 8 až 72 hodin do rozpuštění všech pevných součástí, následně se těkavé složky směsi odpaří ve vakuu, surový produkt se rozpustí ve směsi bezvodého nitromethanu a pyridinu pod inertní atmosférou, pak se přidá sloučenina Π na pH 4,0 5% obj./obj. vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, organické podíly se extrahují do chloroformu, který se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, získaný roztok se vysuší sušicím činidlem, rozpouštědlo odpaří a nezreagovaný výchozí materiál se pak odstraní promytím benzenem a produkt se dále, pokud je to vhodné, čistí například krystalizací ze směsi vhodných rozpouštědel, která poskytne sloučeninu vzorce I, kde R³ odpovídá obecnému vzorci b.
8. Způsob výroby podle nároku 7, vyznačující se tím, že teplota reakční směsi je s výhodou 0 °C, přičemž jako chloraění činidlo se s výhodou použije dichlorid kyseliny šťavelové a jako katalyzátor dimethylformamid, míchání reakční směsi se provádí nejprve 16 hodin, po přidání sloučeniny vzorce II pak 4 hodiny, přičemž jako sušicí činidlo se použije síran hořečnatý nebo sodný, rozpouštědlo se odpaří destilací pod vakuem a přečištění produktu krystalizací se provádí ve směsi chloroformu a n-heptanu.
9. Deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I podle nároku 1, pro použití, při léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s nerovnováhami glutamátergního neuropřenašečového systému, jako jsou ischemické poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativní změny a poruchy centrální nervové soustavy, afektivní poruchy, deprese, post-traumatická stresová porucha a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, bolest, závislosti, roztroušená skleróza, epilepsie, gliomy.
10. Použití derivátů pregnanolonu, substituovaných v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I popsaného v nároku 1, pro výrobu veterinárního a/nebo humánního farmaceutického přípravku pro léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuropřenašečového systému, jako jsou ischemické poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativní změny a poruchy centrální nervové soustavy, afektivní poruchy, deprese,

- 18CZ 303443 Βό post-traumatická stresová porucha a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, bolest, závislosti, roztroušená skleróza, epilepsie, gliomy.
11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku 5 deriváty pregnanolonu, substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I popsaného v nároku 1.
12. Použití derivátů pregnanolonu, substituovaných v poloze 3alfa kationickou skupinou, obecného vzorce I popsaného v nároku 1, pro výrobu standardů neuroprotektiv a neuroleptik, připadlo ně analytických standardů používaných v experimentálním výzkumu a v analytické chemii či jako sloučenin obsažených v potravinových doplňcích či kosmetických přípravcích určených pro zlepšování reakcí jednotlivých částí organismu na zvýšený stres zejména oxidativní, nutriční a způsobený volnými radikály, případně na stárnutí.