CZ300539B6

CZ300539B6 - Fermentor pracující s pevnou fází a zpusob fermentace v pevné fázi

Info

Publication number: CZ300539B6
Application number: CZ20003988A
Authority: CZ
Inventors: Lüth@Peter; Eiben@Ute
Original assignee: Prophyta Biologischer Pflanzenschutz Gmbh
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2009-06-10
Also published as: CN1305524A; JP2002513557A; CA2329815A1; CA2329815C; PL188683B1; RO120977B1; BG64130B1; DE19920020A1; NO20005438L; UA65616C2; RU2235767C2; US6620614B1; AU4601199A; ATE208810T1; TR200003179T2; JP4180798B2; NZ507738A; EP1073708A2; ID28122A; BR9910580B1

Abstract

Rešení se týká fermentoru pracujícího s pevnou fází, zejména pro velká množství, jakož i zpusobu fermentace pevné fáze. Úkol rešení spocívá ve vyvinutí fermentoru, pracujícím s pevnou fází pro velké objemy a v príprave zpusobu fermentace, který dovoluje hospodárné využití fermentace mikroorganismu v pevné fázi se slabou konkurencí ve velkých fermentorech. Fermentor pracující s pevnou fází se vyznacuje tím, že predstavuje etážový fermentor, pricemž jsou nad sebou usporádána alespon dve prodyšná a pro vodu propustná etážová dna (4), která jsou spojena se stenami nádoby tak, že ani vzduch ani voda nemuže bocne proudit kolem nich, na etážových dnech (4) se nachází kultivacní substrát (5) pro organismy urcené ke kultivaci, pod každým etážovým dnem (4) je umísteno chladicí zarízení (6), a fermentor je uzavren poklopem (1).

Description

Fermentor pracující s pevnou fází a způsob fermentace v pevné fázi

Oblast techniky

Vynález se týká fermentoru pracujícího s pevnou fází, zejména pro velké objemy, jakož i způsobu fermentace v pevné fázi.

Dosavadní stav techniky

Hloubková fermentace nebo fermentace pracující s pevnou fází slouží k hromadné kultivaci mikroorganismů s cílem získat buď mikroorganismy samotné, nebo produkty látkové výměny, nebo mikrobiologicky obměněný substrát, kupříkladu pro potřeby potravinářského průmyslu. Zatímco se dnes již stavějí hloubkové fermentory, (tj. fermentory s kapalným živným substrátem), o kapacitě až 200 000 litrů, ještě se nepodařilo zkonstruovat „solid-state fermentor“, (tj. fermentor s tuhým živným substrátem), s hospodárně relevantními objemy, které by po delší čas kontaminací mohly být udržovány bez cizích mikroorganismů a současně umožňovaly optimální vedení kultury mikroorganismů. Určité filamentové houby však potřebují povrchové struktury, na kterých se mohou vyvíjet a vytvářet spory. Největší fermentor k produkci filamentových hub, s kapacitou 50 litrů, při zabránění jakékoliv cizí kontaminace, stojí v INRA ve Francii (Durand 1997, ústní sdělení). Kapacita tohoto fermentoru však není zdaleka postačující k tomu, aby hospodárně vytvářela produkci houbových spor, které se mohou kupříkladu použít jako biologický ochranný prostředek pro rostliny.

Fermentace v pevné fázi „solid-state fermentation“, (SSF), je definována jako růst mikroorganismů — obvykle hub - na pevných substrátech v definované plynné fázi, avšak bez volné vodní fáze. SSF se používala v určitých oblastech Orientu, Asie a Afriky již v antických dobách k výrobě kvašené stravy, enzymatických produktů (Kóji) nebo jedlých hub. V západních zemích se již od roku 1940 koncentroval zájem na zaplavovací fermentací; SSF se naproti tomu používala pouze ke zpracování organických odpadů. Na základě určitých předností oproti hloubkové fermentací však mnohé instituce a podniky projevují nově zájem o SSF. Její přednosti oproti hloubkové fermentací jsou následující:

- možnost efektivní produkce sekundárních metabolitu jako jsou enzymy, aromatické látky, vonné a barvicí látky, jakož i farmaceutické účinné látky

- možnost výroby mikroorganismů jako biologických činidel v ochranných prostředcích pro rostliny

- odstranění toxínů nebo jiných škodlivých substancí z potravin a krmiv, popřípadě jejich obohacení proteiny nebo vitaminy.

Rozlišuje se zásadně šest typů fermentorů pracujících s pevnou fází - „solid-state fermentorů“:

1. Misko vitý bioreaktor - „Tray Bioreactor“

2. Bioreaktor s náplňovou vrstvou - „Packed Bed Bioreactor“

3. Rotačně válcovitý bioreaktor - „Rotary Drum Bioreactor“

4. Bioreaktor s natřásanou pevnou fází - „Swing-Solid-State Bioreactor“

5. Míchaný vanovitý bioreaktor - „Stirred Vessel Bioreactor“

6. Bioreaktor s fluidním ložem vzduch-pevná fáze - „Air-Solid Fluid ized-Bed Bioreactor“

První typ - miskovitý bioreaktor, u kterého se substrát, určený k fermentací, plošně zpracovává jen ktomu účelu v rozprostírající se nádrži, a inkubuje se ve speciálním k tomu účelu klimatizovaném prostoru („Kojí“ - prostor, Raman Murthy, Μ. V.; Karanth, N. G.; Raghava Rao, K. S. M. S.: Advance in Applied Microbiology 38 (1993), 99 - 147), je sice pro výrobu větších množství produktu vhodný, u tohoto způsobu se ale musí nepatrná kontaminace cizími zárodky zanedbat.

- 1 CZ 300539 B6

Navíc jsou reaktor a příslušný způsob velmi nákladné na místo a práci. Dále se musí se substrátem, určeným k ferrnentaei v nádržích ručně pohybovat. Pro výrobu větších množství houbových spor druhů se slabou konkurencí není vhodný.

U bioreaktoru s náplňovou vrstvou se vlhký granulovaný substrát, který se nachází v uzavřené nádrži, očkuje mikroorganismem, který se, aniž by se substrát pohyboval, v ní vyvíjí. Ktomu účelu musí být substrát stále profukován proudem vzduchu. Vznikají následující problémy, které nepřipouštějí použít velká množství substrátu.

1. Mikroorganismus produkuje teplo (300 kJ na kg suché hmoty a na hodinu, Saucedo-Castaneda, G.; Gutierrez-Rojas, M.; Bacquet, G.; Raimbault, M.; Viniegra-Gonzales, G.: Biotechnologie and Bioengeniering 35 (1990), 802- 808), které může být odváděno buď skrz vnější stěnu nádrže, nebo pomocí zvýšeného proudění vzduchu (teplo odebírané vypařující se látkou). U nádrží s velkými objemy není toto možné. Mikroorganismy zpomalují s přibývajícím vývojem tepla svůj růst a nakonec odumírají.

2. Stálým provětráváním substrát vysychá. Tím podmíněný „únik“ způsobuje vzduchové kanály, jejichž existence již nezaručuje rovnoměrné provětrávání substrátu. Pozvolné vysychání substrátu kromě toho vede ke zhoršenému růstu mikroorganismu.

Rotačně válcovitý bioreaktor sestává z válcovité nádrže, která je uspořádána vodorovně a otočně uložena. Nádrž je nejvýše až do třetiny svého objemu naplněna granulovaným kultivačním substrátem, na kterém roste mikroorganismus. Teplo vznikající růstem mikroorganismu může být v široké míře odváděno přes částečně chlazený plášť nádrže. To se uskutečňuje při pomalém otáčení válce, což vede k tomu, že substrát vždy znova a znova přichází do kontaktu s pláštěm a jeho teplo může být odváděno na něj. Tento způsob má ale tu nevýhodu, že uvnitř pohybujícího se substrátu působí střihové síly, které vedou zejména k ničení vyvíjejících se houbových struktur, (jako jsou mycelium, nosič spor, plodnice). U mnohých hub tím není tak cíl kupříkladu vysoké výtěžnosti spor dosažitelný. Problém vysychání je u tohoto typu fermentoru v široké míře řešen tak, jelikož odpařování vody ze substrátu není nutné (teplo odebírané vypařující se látkou není potřebné), od větrá vání může být prováděno vlhkým vzduchem. Kromě toho by bylo zvlhčování substrátu, ve kterém je zajištěno dobré rozdělování volné vody pohybem, realizovatelné také pomocí rozprašovacích trysek. U velkých množství kultivačního substrátu dochází ovšem u tohoto typu fermentoru k dalším problémům:

1. Konstrukce velkých fermentorů je velmi nákladná.

2. Plynulým pohybem fermentoru může dojít ke zhrudkovatění vlhkého substrátu.

3. Směrem ven jsou potřebná rozhraní, (například přívod a odvod vzduchu, přívod vody), která se vlivem rotace fermentoru mohou snadno stát zdroji cizí kontaminace.

Podobným fermentorem jako je rotačně válcovitý bioreaktor, je bioreaktor s natřásanou pevnou fází, jenže zde není míchání substrátu zapříčiněno rotujícím pohybem, nýbrž natřásacím pohybem. Jinak zde platí stejné, již výše zmíněné výhody a nevýhody. Omezení objemu tohoto fermentoru je však dodatečně ještě dáno tím, že konstrukce komplikovaného natřásacího mechanismu by sotva mohla připustit hmotnost naplněné nádrže přes 100 kg.

Míchaný vanovitý bioreaktor si můžeme představit jako uzavřenou káď, ve kterém se pohybuje míchadlo. U tohoto typu reaktoru jsou problémy při použití velkých množství substrátu již předznamenány, protože ta se již nemohou ohybovat rovnoměrně, aniž by nedocházelo k ničení ve struktuře substrátu.

V bioreaktoru s fluidním ložem vzduch-pevná fáze se kultivační substrát pro mikroorganismy uchovává nepřetržitě ve fluidním loži, k čemu je potřebný poměrně velký objem prostoru reaktoru. Vzduch požadovaný k zachování fluidního lože se vede v okruhu. Ve vzduchu musí být přesně udržován určitý obsah vlhkosti. K udržení fluidního lože vyžaduje tento způsob velmi mnoho energie. V již probíhajícím AiF projektu (Bahr, d.; Menner, M.: BlOforum 18 (1995), 16-21) mohlo být sice ukázáno, že kultivace kvasnicových buněk ve fluidním loži je možná.

-2 CZ 300539 B6

Toho však bylo dosaženo jen v relativně malém měřítku a při srovnání se hloubkovou fermentací jen s relativně malou výtěžností. Vícetýdenní kultivace filamentových hub na velkém množství granulovaného kultivačního substrátu (přes 100 kg na vsázku) je s touto technologií možná jen s úctyhodně vysokými náklady.

Další fermentory podle stavu techniky jsou příliš malé na to, aby se s nimi získalo hospodárně rentabilní množství houbových spor, (viz dokumenty EP-A1 0 683 815 a FR 85.08555), nebo není při postačující kapacitě fermentoru možné po delší časový úsek vyloučit kontaminaci kultivačního substrátu cizími zárodky, (viz dokument DE 4406632 Cl).

Úkol vynálezu spočíval proto v tom, vyvinout SSF fermentor pro velká množství a připravit způsob fermentace pevné fáze, který umožní hospodárné využití SSF mikroorganismy se slabou konkurencí ve velkých fermentorech.

Přitom má být

1. zabráněno cizí kontaminaci fermentoru, (tj, zachování sterilních podmínek během celého procesu fermentace),

2. odváděno teplo vznikající houbovitou látkovou výměnou, aniž by docházelo k vysychání substrátu (zvýšeným průsakem vzduchu a využitím tepla odebíraného vypařující se látkou),

3. zabráněno vzniku střihových sil ve fermentoru (vlivem neexistence pohybu kultivačního substrátu), a

4. garantováno rovnoměrné odvětrávání při současném zabránění vysychání, a regulace pres teplotu substrátu.

Podstata vynálezu

Vynález se realizuje podle nároků. Úkol byl podle vynálezu řešen pomocí etážového fermentoru, který má kapacitu alespoň 50 litrů, výhodně 500 litrů až 1000 litrů, ale umožňuje i větší kapacity. Celková konstrukce sestává z válcovité nebo oválné nádoby, (obr. 1), která může být nahoře uzavřena poklopem 1, který je podle vynálezu opatřen popřípadě odvodem 2 vzduchu, jakož i otvorem 3 k naočkování fermentoru.

V nádobě, která je zkonstruována jako vzduchotěsný a vodotěsný obal, se nacházejí nad sebou uspořádaná prodyšná a pro vodu propustná etážová dna 4, která slouží k zachycení kultivačního substrátu 5 pro mikroorganismy určené ke kultivaci.

Kultivační substrát sestává podle příslušného požadavku na výživné látky mikroorganismu určeného ke kultivaci z různých materiálů. Aby se zajistila postačující propustnost vzduchu, má tento materiál výhodně granulovanou strukturu. Může kupříkladu sestávat z obilí, sbalků z otrub nebo z jiných organických odpadních produktů, odpadů ze zpracování cukru nebo granulátů napuštěných živným roztokem.

Počet pater je závislý na nárocích příslušné kultury mikroorganismu určeného ke kultivaci, jakož i na manipulovatelnosti s celým fermentorem. Při více patrech by mohlo být zásobování kyslíkem, potřebné pro růst mikroorganismů, (víz dále), v horních vrstvách kultivačního substrátu narušeno. Velmi mnoho pater také zhoršuje manipulovatelnost s fermentorem. Podle vynálezu může být ve fermentoru umístěno dvacet nebo více pater.

Etážová dna jsou spojena se stěnami nádoby takovým způsobem, že ani vzduch ani voda nemohou kolem nich proudit z boku. Vzdálenost etážových den od sebe je závislá na optimální tloušťce vrstvy kultivačního substrátu, která je zase určována nároky mikroorganismu určeného ke kultivaci.

-3CZ 300539 B6

Pod etážovými dny se nacházejí chladicí zařízení 6, která mohou být zkonstruována jako chladicí spirály nebo chladicí desky. S jejich pomocí se odvádí reakční teplo z kultivačního substrátu. V jedné z výhodných variant mohou, když se vychází od každého chladicího zařízení, mohou čnít plechy z kovu s vysokou tepelnou vodivostí skrz příslušná etážová dna dovnitř do kultivačního substrátu, (viz obr. 2). Tím se usnadní odvádění reakčního tepla. K odebrání kultivačního substrátu po dokončení procesu fermentace se chladicí zařízení i spolu s chladicími plechy odtáhne směrem dolů od etážových den. Potom se může kultivační substrát, porostlý mikroorganismy, odebrat, aniž by přitom chladicí plechy překážely.

Chladicí zařízení mohou být také uspořádána v určité vzdálenosti nad etážovými dny. V tomto případě by se měla instalovat tak, aby probíhala uprostřed vrstvy s kultivačním substrátem. Uložení chladicích zařízení ve vrstvách substrátu, a to rovnoběžně s etážovými dny, je třeba uvažovat zejména pro případ, že se v procesu fermentace vytváří velmi mnoho reakčního tepla.

Ve dnu fermentoru se nachází přívod 7 vzduchu, kterým se do fermentoru fouká sterilní zvlhčený vzduch. Vzduch profukuje všechny vrstvy substrátu a opouští fermentor odtokem 2 vzduchu umístěným na poklopu L

Meziprostory, nacházející se mezi jednotlivými patry, ve kterých jsou také umístěna chladicí zařízení, zajišťují rovnoměrné rozdělování vzduchu v celém fermentoru. Jestliže není k odvětrání fermentoru k dispozici žádný zvlhčený vzduch, tak může být vzduch také zvlhčován uvnitř samotného fermentoru. To se uskutečňuje tak, že alespoň nejspodnější etážové dno není naplněno kultivačním substrátem, nýbrž vodu zachycujícím granulovaným materiálem, který je nejprve profukován přiváděným vzduchem, dříve než vzduch pronikne dále do fermentoru. Tím se zvlhčuje. Při velké potřebě vody vyvíjejícím se organismem může být ke zvlhčován í v určitých odstupech instalováno ve fermentoru více takovýchto pater. Množství přiváděného vzduchu je závislé na potřebě kyslíku mikroorganismu určeného ke kultivaci. Může se měnit mezi 1 a 100 litry za hodinu na litr kultivačního substrátu.

K naočkování kultivačního substrátu mikroorganismem určeným ke kultivaci se fermentor, potom co byl jeho obsah nejprve sterilizován, naplní až přes nej hořejší vrstvu kultivačního substrátu sterilní vodou. K tomu účelu je na dnu fermentoru umístěn přítok 8 vody, před kterým je zapojen sterilizující filtr. Přítok 8 vody však může být také instalován i na jiném místě fermentoru, (např. na poklopu i). Po naplnění se k tomu účelu uspořádaným otvorem 3 v poklopu i přivede násada. Tyto otvory 3 k naočkování fermentoru mohou být zejména při velmi mnoha patrech také umístěny mezi jednotlivými etážovými dny. V prvním případě se uskutečňuje rozdělování násady ve fermentoru výlučně při opětovném vypouštění vody se ktomu účelu uspořádaným otvorem 9 ve dnu fermentoru.

Násada, (suspenze mikroorganismů), protéká tímto způsobem všemi vrstvami kultivačního substrátu a zůstává v nich v postačujícím množství se zachycovanou vodou. Při příliš mnoha protékaných vrstvách vzniká, kupříkladu v závislosti na povaze kultivačního substrátu, zře db vací efekt. To znamená, že se mikroorganismy vlivem protékaného kultivačního substrátu odfiltrovávají, takže jejich koncentrace ve vodě je směrem dolů stále menší. Aby se tomu zabránilo, mohou být u další varianty umístěny otvory k přivádění násady do fermentoru také mezi etážovými dny. S jejich pomocí může být již během naplňování fermentoru vodou přiváděna násada, která se potom rozděluje jak proudem vody směrovaným nahoru, tak i také dolů.

Násada použitelná pro naočkování fermentoru sestává z vysoce koncentrované suspenze malých jednotek schopných klíčení, (výhodně ze spor, konidií nebo bakteriálních zárodků) mikroorganismu určeného ke kultivování.

Za předpokladu rovnoměrného a postačujícího naočkování fermentační nádoby je průběh kultivace, to je (doba kultivace a produkční výtěžnost), jakož i kvalita produktu kultivace, (např. hou-4CZ 300539 B6 bových spor), v široké míre závislá na parametrech řízení kultivace. To sestává v první řadě v přívodu zvlhčeného vzduchu a regulace teploty. Objemový proud vzduchu je třeba sladit s kapacitou steřílizačního vzduchového filtru. Teplotní vedení ve fermentoru se zajišťuje pomocí chlazení instalovaného ve fermentoru. Kapacita chlazení musí být dimenzována tak, aby se z kultivačního substrátu mohlo odvádět veškeré reakční teplo a aby se mohla pro kulturu mikroorganismu udržovat optimální teplota. Požadovaná kapacita chlazení je také závislá na tloušťce vrstvy a tím i na objemu kultivačního substrátu. Čím více je kultivačního substrátu pro růst mikroorganismů k dispozici, tím více reakčního tepla se vytváří. Proto se musejí oba parametry společně optimalizovat. Usiluje se o co možná nejrychlejší vývoj mikroorganismů, jakož i o vysokou produkční výtěžnost, přičemž po stanovení cíle fermentaee přicházejí jako produkt v úvahu houbové spory, buňky bakterií, enzymy, antibiotika, barviva a další látky.

K dispozici jsou dvě varianty provedení fermentoru podle vynálezu.

Varianta 1., (obr. 3)

Fermentor sestává z průchozího válce nebo hranolu, který je dole pevně uzavřen. Válec, (zpravidla je jím kruhový válec, nebo hranol), mohou mít průměr 1 m a více. Jejich výskaje omezena technickou manipulovatelností s nimi, jakož i možností udržení optimálních podmínek pro mik20 roorganismu určený ke kultivaci. Realizovatelné výšky jsou 2 m a více.

Do tohoto válce nebo hranolu se ze shora umístí etážová dna 4, naplněná kultivačním substrátem

5. Na vnitřní straně nádrže se nacházejí prstence, nebo v případě, že se použije hranolovitého krytu, jinak tvarovaná zařízení 11 k uložení etážových den 4. Každý prstenec nebo jinak tvarova25 né úložné zařízení je opatřen tepelně stabilním těsněním JO, kupříkladu ze silikonu, na které se svými vnějšími hranami pokládají etážová dna 4, čímž je dán vzduchotěsný a vodotěsný uzávěr mezi etážovými dny 4 a stěnami nádoby. Prstence nebo jinak tvarovaná úložná zařízení se mohou z kiytu sejmout. Chladicí zařízení 6 pod etážovým dnem 4, které může kupříkladu sestávat z chladicí spirály z měděné trubky, se pomocí rychlospojky 13 spojí s potrubími 14 k odtoku a přítoku chladicí kapaliny, která se nacházejí pod fermentorem. Každé etážové dno 4 je opatřeno okrajem 12. jehož výška se řídí podle tloušťky vrstvy kultivačního substrátu. Tím se zabráni tomu, aby kultivační substrát padal do nádoby fermentoru a tu znečišťoval.

Fermentor je nahoře pevně uzavřen poklopem J_. Je dimenzován jako tlaková nádoba a může být tedy sterilizován přivedením horké páiy pod tlakem. Není proto potřebné použít autoklávu.

Varianta 2., (obr. 4)

Fermentor sestává z více válců nebo hranolů se vždy malou výškou, (výhodně cca 7 až 30 cm), které mohou mít kruhovou, oválnou, obdélníkovou, nebo sjiným počtem rohů uspořádanou základní plochu. Do jednotlivých válců nebo hranolů je vždy namontováno vzduchotěsné a vodotěsné dno. Pode dnem se nachází chladicí zařízení a na dnu leží substrát ke kultivaci organismů. Válce nebo hranoly slouží jako patra 4 sestaveného fermentoru. Jsou uspořádány nad sebou a vůči sobě utěsněny pomocí tepelně stabilních těsnění 15, která jsou umístěna na okrajích.

První patro leží vespod na dnu fermentoru, a poslední patro se nahoře uzavírá poklopem 1 fermentoru. Fermentor tak může být výhodně sestaven z deseti nebo více pater. Protože je obtížné zkonstruovat takto sestavený fermentor jako tlakovou nádobu, probíhá sterilizace fermentoru, s kultivačním substrátem uvnitř v autoklávu. Velikost fermentoru je tedy v první řadě závislá na kapacitě autoklávu, kterýje k dispozici. Bude muset proto v mnoha případech zůstat omezena na objem 500 až 1000 litrů. Během sterilizace v autoklávu není fermentor otevřen, to znamená, že jednotlivá patra jsou mírně, cca 5 mm, od sebe nadzvednuta. Tím se umožní dobrý přívod horké páry, způsobující sterilizaci, do vnitřní prostoru fermentoru. Po sterilizaci v autoklávu se fermentor pevně uzavře. Aby se po sterilizaci v autoklávu a před uzavřením, tedy během odebírání fermentoru z autoklávu, zabránilo kontaminaci fermentoru cizími zárodky, je každé patro opatře-5 CZ 300539 B6 no vnějším prstencem 16, který má za úkol překrýt mezeru vyskytující se mezi jednotlivými patry v otevřeném stavu.

Po uzavření fermentoru se chladicí zařízení 6, nacházející se pod etážovými dny, pomocí spojky 5 17 spojí s potrubími 14, která slouží k přítoku a odtoku chladicí kapaliny.

U jedné výhodné varianty provedení sestává granulovaný kultivační substrát, na kterém se mají vyvíjet mikroorganismy, z vrstvy silné 5 až 6 cm. Je uspořádáno nad sebou až deset takovýchto vrstev. Granulovaný kultivační substrát, uspořádaný ve vrstvách, se vždy ukládá na perforovalo ném a tím pro vzduch propustném dnu, pod kteiým se nachází chladicí spirála (vinutá měděná trubka), s jejíž pomocí může být odváděno teplo vznikající v substrátu. Přívod sterilně filtrovaného vzduchu se realizuje zespoda. Vlivem hermetického uzavření jednotlivých pater směrem do strany je vzduch přinucen rovnoměrně protékat všemi patry, tedy vrstvami s kultivačním substrátem, dříve než nahoře fermentor opět opustí. Na nejspodnějším etážovém dnu se nachází vodou nasycená vrstva, výhodně granulát SERAMIS, skrz kterou se vzduch vede, čímž se zvlhčuje.

Sterilizace fermentoru s již vloženým veškerým kultivačním substrátem probíhá výhodně pomocí páry ohřáté na 121 °C, výhodně v autoklávu, přičemž jednotlivá patrajsou během procesu sterili20 zace v autoklávu mírně od sebe nadzvednuta, takže může horká pára vnikat do jednotlivých pater.

Další údaje: objem:

množství kultivačního substrátu: objemový proud vzduchu: výkon chladicího systému:

500 litrů 250 litrů

1500 litrů za hodinu 2,5 kW

Na rozdíl od dosud používaných typů (fermentor s natřásanou pevnou fází nebo rotující fermentor), kde musí být k odvedení vody, odvětrání a zásobování vodou prováděno stálé přemísťování vrstev kultivačního substrátu, již není při použití způsobu podle vynálezu potřebné pohybovat se substrátem. Uložení kultivačního substrátu v etážových vrstvách, které jsou celé obepnuty uzavřeným obalem, poskytuje následující přednosti:

1. Vlastní hmotnost kultivačního substrátu nevede k zahuštění a tím ke snížení jeho prodyšnosti.

2. Vlivem instalace chladicího zařízení pod jednotlivými patry může být vznikající teplo snadno odváděno.

3. Vzhledem k relativně malé tloušťce pater, ale i k prostoru nacházejícího se mezi jednotlivými patry, je zajištěno rovnoměrné provětrávání vrstev substrátu.

4. Protože provětrávání substrátu slouží pouze pro přívod kyslíku, ale i k odvádění vznikajících plynů, a nikoliv ke chlazení substrátu, může se pracovat s velmi malým objemovým proudem vzduchu, který, protože vzduch je navíc zvlhčen, již nevede k vysychání substrátu.

5. Jelikož pohyb substrátu již není potřebný, může se mechanické ničení houbových struktur, (jakojsou nosiče spor, plodnice ajiné struktury), vyloučit.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je dále blíže popsán a vysvětlen na příkladech jeho provedení podle připojených výkresů, které znázorňují na obr. 1 principiální schéma fermentoru, na obr. 2 chladicí zařízení fermentoru s plechy na odvádění tepla, na obr. 3 výřez fermentoru, sestávajícího z průchozího válce, a na obr. 4 výřez sestaveného fermentoru.

-6CZ 300539 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Hromadná kultivace Beauveria brongniartii za účelem získání houbových konidií.

Fermentor použitý ke kultivaci Beauveria brongniartii má kapacitu cca 50 litrů. Má tvar válce o průměru 30 cm a výšce 70 cm. Vnější obal fennentoru sestává z tepelně stabilního skla. Do fer10 mentoru bylo vestavěno 8 pater, jejichž dna sestávají ze síta z ušlechtilé oceli, o šířce ok 3 mm. Vzdálenost etážových den vůči sobě činila 8 cm. Spodní dno bylo naplněno 6 cm silnou vrstvou granulátu SERAMIS. Nad ním ležících sedm pater obsahovalo jako kultivační substrát drcená ječná zrna. Tloušťka vrstvy kultivačního substrátu činila cca 6 cm. Celkem bylo použito 30 litrů kultivačního substrátu.

Fermentor byl sterilizován pomocí autoklávu. K tomu účelu byl obsah fennentoru ohříván pomocí horké páry po dobu půl hodiny na 121 °C. Poklop fermentoru byl během procesu sterilizace v autoklávu mírně otevřen, aby se umožnilo vnikání páry do vnitřního prostoru fennentoru. Po sterilizaci v autoklávu byl poklop ihned uzavřen.

K naočkování byl fermentor až po nej hořejší vrstvu kultivačního substrátu naplněn sterilní vodou. Přitom byla použita 500 cm² kapsle typu S+S-EXELON PES 20/5 HC (Schleicher a Schuell, Dassel). Poté byla přivedena násada k tomu účelu uspořádaným otvorem v poklopu. Naočkování fermentoru proběhlo pod laminámím boxem. Jako násada bylo použito 100 ml sus25 penze konidií s 1 x 10⁹ konidií na ml. Po přivedení násady nejhorejší vrstvou kultivačního substrátu se voda vypustila ventilem na dnu fermentoru. Tím byly všechny vrstvy substrátu rovnoměrně kontaminovány houbovými konidiemi.

Po naočkování fermentoru byl fermentor ínkubován v prostoru o teplotě 20 °C. Uskutečnilo se napojení na přívod vzduchu, jakož i na chladicí systém. Objemový proud vzduchu činil během celého procesu fermentaee 150 litrů na hodinu. Jako chladicí kapaliny bylo použito vody se vstupní teplotou 17 °C. Regulace chlazení bylo nastaveno tak, že při překročení 22 °C v kultivačním substrátu se skrz chladicí spirály čerpala chladicí kapalina, až bylo opět dosaženo teploty 20 °C. Tímto způsobem mohla být udržována průměrná teplota substrátu na cca 21 °C během celé doby kultivace.

Cílem kultivace byla co možná nejvyšší výtěžnost houbových konidií. Skleněným pláštěm fermentoru mohl být průběh kultivace velmi dobře pozorován. Po přibližně deseti dnech byl celý kultivační substrát potažen bílým myceliem. Vytvořením konidií a nosičů konidií změnilo toto mycelium od třináctého dne svůj vzhled. Dostalo práškovitou strukturu. Po přibližně devatenácti dnech ztratil fermentor značně na selektivitě látkové výměny. Zmenšil se vývin tepla, čímž se znatelně snížila frekvence chlazení. Kultivační substrát byl po dvaceti jednom dnu po naočkování fermentoru vyjmut a pomocí speciální filtrační techniky byly z kultivačního substrátu, porostlého zcela Beauveria brogniartii, získány konidie.

Celkem mohlo být pomocí etážového fermentoru získáno 3,3 x 10¹³ konidií.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Fermentor pracující s pevnou fází, vyznačující se tím, že představuje etážový fermentor, přičemž nad sebou jsou uspořádána alespoň dvě prodyšná a pro vodu propustná etážová dna (4), která jsou spojena se stěnami nádoby tak, že ani vzduch ani voda nemůže bočně proudit kolem io nich, na etážových dnech (4) se nachází kultivační substrát (5) pro mikroorganismy určené ke kultivaci, pod každým etážovým dnem (4) je umístěno chladicí zařízení (6), a fermentor je uzavřen poklopem (1).
2. Fermentor podle nároku 1, vyznačující se tím, že představuje průchozí válcovitou, oválnou, obdélníkovou, nebo s jiným počtem rohů uspořádanou nádrž s alespoň jedním otvorem (
3) pro násadu.

20 3. Fermentor podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že z chladicího zařízení (6) vyčnívají skrz příslušná etážová dna (4) do kultivačního substrátu plechy z kovu s vysokou tepelnou vodivostí.
4. Fermentor podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se t í m , že se na nádrži

25 nachází přívod (8) vody, ve dnu fermentoru přívod (7) vzduchu, stejně tak i odtok (9) pro vodu, a na poklopu (1) je uspořádán otvor k odtoku (2) vzduchu, etážová dna (4), naplněná kultivačním substrátem (5), jsou umístěna za sebou, k čemuž jsou ve vnitřní straně nádrže umístěny prstence nebo jinak tvarovaná zařízení (11) k uložení etážových den (4), která jsou opatřena tepelně stabilním těsněním (10), a

30 etážová dna (4) mají okraj (12), jehož výška je závislá na tloušťce vrstvy kultivačního substrátu (5), rovněž i chladicí zařízení (6), která jsou přes rychlospojku (13) spojena s potrubími (14) pro odtok a přítok chladicí kapaliny, která se nacházejí mimo fermentor.

35 5. Fermentor podle nároku 4, vyznačující se tím, že se ve dnu nebo poklopu (1) fermentoru nachází přítok (8) vody.

6. Fermentor podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se v poklopu (1) nachází otvor pro násadu, a popřípadě mezi jednotlivými etážovými dny (4) další otvory

40 k naočkování.

7. Fermentor podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že fermentor obsahuje více válcovitých, oválných nebo hranolovitých nádrží, které slouží jako patra a které jsou uspořádány nad sebou, takže první nádrž dosedá dole na dno fermentoru a poslední nádrž je

45 uzavřena poklopem (1), a nádrže jsou vůči sobě utěsněny tepelně stabilními těsněními (15) a opatřeny vnějším prstencem (16), každá z těchto nádrží má prodyšné a pro vodu propustné dno (4), na kterém se nachází kultivační substrát (5) a pod ním chladicí zařízení (6), které je pomocí spojky (17) spojeno s odtokovými a přítokovými potrubími (14) pro chladicí kapalinu, která se nacházejí mimo fermentor.

8. Fermentor podle některého z nároků 1 až 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že kultivačním substrátem (5) jsou porézní granuláty, kteréjsou opatřeny živným roztokem nebojsou přírodními granulovanými materiály.

-8CZ 300539 B6

9. Fermentor podle nároku 8, vy z n ač u j í c í se tí m , že přírodními granulovanými materiály jsou obilí, pelety z otrub nebo odpady z výroby cukru.
5 10. Fermentor podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se alespoň na nej spodnějším etážovém dnu (4) nachází zvlhčená vrstva.

11. Fermentor podle nároku 10, vyznačující se t í m , že zvlhčenou vrstvou je granulovaný materiál schopný zachycovat vodu, s extrémně vysokým objemem pórů.

io

12. Fermentor podle nároků 1 až 10, v y z n a č u j í c í se t í m , že chladicí zařízení (6) jsou umístěna v určité vzdálenosti nad a rovnoběžně s etážovými dny (4).

13. Fermentor podle nároku 12, vyznačující se tím, že chladicí zařízení (6) jsou insta15 lována uprostřed vrstvy s kultivačním substrátem.

14. Způsob fermentace v pevné fázi se zařízením podle některého z nároků 1 až 13, vyznačuj í c í se t í m , že se kultivační substrát, který se ve fermentoru nachází na více etážových dnech, rovnoměrně očkuje, je plně protékán relativně malým objemovým proudem vzduchu, a

20 pomocí chladicího systému se pro příslušný proces kultivace nastavuje optimální teplota.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že naočkování množitelným mikroorganismem pomocí naplnění fermentoru vodou, do které se přidávají v postačujícím množství zárodky, se provádí způsobem, že všechny vrstvy jsou jak při naplňování, tak i při odtékání

25 rovnoměrně protékány a očkovány.

16. Způsob podle některého z nároků 14 nebo 15, vyznačující se tím, že chladicí kapacita se v závislosti na objemu kultivačního substrátu dimenzuje tak, aby se z kultivačního substrátu odvedlo veškeré reakční teplo.