CZ297711B6 - Zpusob prípravy derivátu hyaluronanu vázaných éterovou nebo aminovou vazbou - Google Patents

Abstract

Zpusob prípravy derivátu hyaluronanu, o molekulové hmotnosti 10 az 10 000 000 g.mol.sup.-1.n. obsahující substituent vázaný éterovou vazbou, pri nemzv alkalickém prostredí reaguje 2-alkyloxymethyloxiran, 2-alkylthiooxymethyloxiran, nebo 2-aryloxymethyloxiran, respektive 2-arylthiomethyloxiran s hydroxylovou skupinou hyaluronanu nebo s deriváty hyaluronanu, které obsahují volnou aminoskupinu, hydrazidovou, hydrazinovou nebo hydroxylaminovou skupinu.

Description

Způsob přípravy derivátů hyaluronanu vázaných éterovou nebo aminovou vazbou

Oblast techniky

Vynález se týk způsobu přípravy derivátů hyaluronanu, obsahujících substituent vázaný éterovou nebo aminovou vazbou, který nabízí použití v kosmetice nebo farmacii.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronan je přírodní lineární polysacharid složený z disacharidických jednotek spojených navzájem β-1,4 glykosidickými vazbami, které obsahují kyselinu D-glukoronovou a V-acetyl-D— glukosamin spojené navzájem β-1,3 glykosidickou vazbou.

Tento glykosaminoglykan má molekulovou hmotnost 10 až 10 000 000 g.mof¹ a je jedním z glykosaminoglykanů přítomných v extracelulámí matric, synoviální tekutině kloubů a strukturní části chrupavky. Hraje významnou roli při pohybu buněk, buněčné diferenciaci, hojení ran a rakovině metastázi (Prestwich G. D., Marecak D.M., Mareček D. F. et al.: Controlled chemical modification of hyaluronic acid: synthesis, applications, and biodegradation of hydrazide derivatives. Joumal of Controlled Release 1998, 53, 93-103).

Dosud byly převážně studovány hydrofobní deriváty kyseliny hyaluronové nebo její soli, jejichž substituent byl váhán esterovou (Della Valle F., Romeo A., (Fidia S.p.A): US 4 965 353) nebo amidovou vazbou (Hamilton R., Fox E. M., Acharya R. A. et al. (Genzyme Corporation): US 4 937 270) na karboxyl kyseliny glukuronové.

Protože se hydrofobní substituenty k hyaluronanu připojují přes karboxylovou skupinu, dochází k výrazné změně rozložení elektrických nábojů u takto substituovaného hyaluronanu, což je spojeno nejen se změnou fyzikálních vlastností, ale i biologické aktivity. Proto byly vyvinuty deriváty, jejichž substituent je vázán přes hydroxylovou skupinu kyseliny hyaluronové. Navíc estery hyaluronanu jsou poměrně snadno odbouratelné v tkáních díky existenci tkáňových esteráz.

Alkylační proces, která zachovává v molekule karboxylovou skupinu a acetylamin byl popsán Lapčíkem a Veselým (Lapčík L., Veselý M.: Workshop 95: Chemistry, Prague, 23-26. ledna 1995) a probíhá ve dvou krocích. V prvním kroku zmiňovaného procesu se vytvoří alkoxy-sulfonyloxy komplex polymeru. V druhém kroku zreaguje výše uvedený komplex s alkoholem ve vodném alkalickém prostředí s přídavkem DMSO za vzniku alkylovaného hyaluronanu. Substituce toluensulfonylou primárním alkoholem probíhá za přísně kontrolované teploty, neboť zde existuje nebezpečí kovalentního provázání molekul hyaluronové kyseliny mezi sebou.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je odstranit nedostatky dosavadního stavu techniky, které spočívají v případě esterů hyaluronanu v jejich relativně snadné odbouratelnosti a zároveň ve ztrátě náboje molekuly. Postup podle Lepčíka a Veselého na druhé straně poskytuje minimální výtěžky vzhledem k nestabilitě komplexu a kontrola reakce (stupně substituce) ve velmi obtížná. Vynález popisuje způsob přípravy hydrofobizovaných derivátů hyaluronanu, který eliminuje výše uvedené nedostatky a který vede k derivátům, jež je možné použít jako aktivní látku v kosmetice, nosič nízkomolekulámích látek ve farmacii i kosmetice, součást složitějších systémů (liposomy, mikroemulze) a dále jako stabilizující látku v oftalmologii.

Způsob přípravy derivátů hyaluronanu o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.mor’ obsahují substituent vázaný éterovou vazbou spočívá v tom, že se 2-alkyloxymethyloxiran respektive

-1 CZ 297711 B6

2-alkylthiomethyloxiran, nebo 2-aryloxymethyloxiran respektive 2-arylthiomethyloxiran, váže v alkalickém prostředí k hyaluronové kyselině nebo jejím derivátům.

2-Alkyloxymethyloxirany, 2-alkylthiomethyloxirany, nebo 2-aryloxymethyloxirany respektive

2-arylthiomethyloxirany, se připraví z alkoholů, hydroxaminokyselin, fenolů, hydro-xysulfonových kyselin, hydroxykarboxylových kyselin a hydroxyketonů resp. jejich simých analogů podle Mouzin G., Cousse H., Rieu J-P. et al.: A Convenient One-Step Synthesis of Glycidyl Ethers. Synthesis 1983, 2, 117-119 reakcí epichlorhydrinu v 50% roztoku hydroxidu sodného a hydroxylové nebo thiolové sloučeniny s použitím transferového katalyzátoru jako je hydrogensíran 10 tetrabutylamonia. Připravené meziprodukty se izolují extrakcí diethyléterem a promýváním nasyceným roztokem chloridu sodného. Nakonec se čistí vakuovou destilací. Navázání 2-alkyloxymethyloxiranu éterovou vazbou k hyaluronanu je založeno na otevření epoxidového kroku derivátu v alkalickém prostředí.

x = o,s

R = alkyl nebo aryl

Reakční schéma vázání 2-alkyloxymethyloxiranu éterovou vazbou

2-alkyloxymethyloxiran respektive 2-aryloxymeethyloxiran nebo 2-alkylthioomethyloxiran respektive 2-arylthiomethyloxiran se váže také k aminoskupině, hydrazinové či hydrazidové skupině připojené k hyaluronanu například prostřednictvím 1,4-diaminobutanu, nebo hydrazidu adipové kyseliny. Výše uvedené oxiranové sloučeniny reagují rovněž s aminovou skupinou 25 deacetylovaného hyaluronanu. Reakce je založena na otevření epoxidového kruhu derivát v alkalickém prostředí a reakci aminoskupiny hyaluronanu.

R = alkyl nebo aryl

Reakční schéma vázání 2-aIkylmethyloxiranu nebo 2-arylmethyloxiranu přes dusík

Jelikož hyaluronan není rozpustný v bezvodém organickém rozpouštědle, je pro tuto reakci využívána demineralizovaná voda, která zajišťuje průběh reakce v homogenním systému. Reakce 35 probíhá v alkalickém prostředí. pH roztoku může být upraveno hydroxidem alkalických kovů. Do reakční směsi je přidáváno takové množství alkálií, aby pH bylo vyšší než 8. Pro reakci je doporučováno pH v rozsahu 8-11. Při vyšších pH probíhá také konkurenční alkalická hydrolýza polymemího řetězce hyaluronanu. Při syntéze hydrofobních derivátů hyaluronanu s vyššími alkyly (C_l0-C₂₀) je vhodné použít směs demineralizované vody s vodou mísitelným organickým rozpouštědlem.

Reakce hyaluronanu s epoxidovou sloučeninou může být provedena i v nevodném prostředí pakliže hyaluronan je ve formě soli rozpustné v takovém prostředí (nikoli jako sodná nebo draselná sůl, nýbrž např. jako tetrabutylanmoniová). Tato sůl poměrně dobře rozpustná v organických rozpouštědlech jako jsou např. acetonitril, dimethylsulfoxid, A.A-dimethylformamid, ve kterých je rovněž dobře rozpustný např. i 2-oktyloxymethyloxiran, 2-decyloxymethyloxiran a 2dodecyloxymethyloxiran. Navázání alkylového řetězce v tomto případě probíhá v homogenním systému. Připravený derivát je pak nutné převést zpět na sůl alkalického kovu.

V závislosti na požadovaném stupni substituce je reakční teplota v rozsahu 10 až 45 °C a reakční doba 1 až 48 h. Stupeň substituce je definován jako počet substituentů vztažených na jednu dimerovou jednotku hyaluronanu.

Příklady provedení

Příklad 1

1,0g hyaluronátu sodného o molekulové hmotnosti 1,6.10⁶ gmol'¹ se rozpustil ve 160 ml 0,05 M NaOH. Do tohoto roztoku se přidalo 1,3 g 2-dodecyloxymethyloxiranu ve 2 ml acetonitrilu. Reakční směs se míchala na vodní lázni o teplotě 30 °C, při otáčkách 500 rpm po dobu 17 h. Produkt se přečistil ultrafíltrací a vysušil vakuovým odpařováním.

Derivát byl charakterizován pomocí IH NMR, kdy z poměru charakteristických chemických posunů methylové skupiny (0,9 ppm) na konci alkylového řetězce a methylové skupiny acetylu hyaluronové kyseliny (2,0 ppm) se určil stupeň substituce: DS = 1,1.

Molekulová hmotnost byla stanovena pomocí HPLC, SEC-MALLS: M_w = 1,0.10⁶ g.mol'¹ Sušina: 84,6 %.

Popel: 5,3 %.

IR: Pro vyšší stupeň substituce delším alkylovým řetězcem je výrazný pás valenční vibrace v(CH) při 2926 cm’¹ a 2856 cm’¹ (viz. obr. 3).

Příklad 2

1,0 g hyaluronátu sodného o molekulové hmotnosti 560 000 g.moL¹ se rozpustilo v 150 ml 0,lM NaOH a do tohoto roztoku se přidalo 1,5 g 2-hexyloxymethyloxiranu v 5 ml acetonitrilu a reakční směs se míchala na vodní lázni o teplotě 45 °C po dobu 23 h. Produkt se přečisti dialýzou proti destilované vodě (25 1) a sušil vakuovým odpařováním.

Elementární analýza:

DS (z'HNMR):

M_w (z HPLC, SEC-MALLS):

2,0 % N, 39,2 %C , 5,9 %H

0,13

000 g.mol'¹

-3CZ 297711 B6

Příklad 3

1,0 g hyaluronanu o molekulové hmotnosti 560 000 g.mol'¹ se rozpustilo ve 100 ml demineralizované vody a přidalo se 0,9 g tetrabutylhydrogensíranu amonného a smě se míchala po dobu 6 h. Po dialýze proti destilované vodě se produkt vysil vakuovým odpařováním a rozmíchal ve 100 ml DMSO. Do velmi jemné disperze se přidaly 2,0 g 2-decyloxymethyloxiranu a reakční směs se udržovala při pH 7,5 a míchala po dobu 20 h. Produkt se vyizoloval dialýzou, převedl na kyselou formu pomocí silně kyselého katexu a titrováním pomocí 0,lM NaOH se převedl na formu sodné soli.

Claims (5)

1. Způsob přípravy derivátů hyaluronanu, o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.mol’¹ obsahující substituent vázaný éterovou vazbou, vyznačující se tím, že v alkalickém prostředí reaguje 2-alkyloxymethyloxiran, 2-alkylthiooxymethyloxiran nebo 2-aryloxymethyloxiran, respektive 2-arylthiomethyloxiran s hydroxylovou skupinou hyaluronanu nebo s deriváty hyaluronanu, které obsahují volnou aminoskupinu, hydrazidovou, hydrazinovou nebo hydroxylaminovou skupinu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oxiranové deriváty se připraví reakcí epihalogenhydrinu v přítomnosti fázového přenášeče v roztoku hydroxidu sodného s hydroxylovými nebo thiolovými skupinami různých sloučenin, jako jsou alkoholy, polyalkoholy, fenoly, terpenoidy, steroidy, alkaloidy, oligosacharidy, α,β,γ-cyklodextriny, vitaminy, ωhydroxykarboxylové kyseliny a jejich simé analogy v přítomnosti transferového katalyzátoru.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že molekulová hmotnost hyaluronanu se pohybuje v rozmezí 1000 až 2 500 000 g.mol¹.

4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hyaluronan může být volnou kyselinou hyaluronovou nebo kteroukoli její farmakologicky přijatelnou solí.

5. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se tím, že reakce probíhá ve vodném prostředí nebo v organickém rozpouštědle.