[go: up one dir, main page]

CZ237398A3 - Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1 - Google Patents

Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1 Download PDF

Info

Publication number
CZ237398A3
CZ237398A3 CZ982373A CZ237398A CZ237398A3 CZ 237398 A3 CZ237398 A3 CZ 237398A3 CZ 982373 A CZ982373 A CZ 982373A CZ 237398 A CZ237398 A CZ 237398A CZ 237398 A3 CZ237398 A3 CZ 237398A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hyaluronate
protein
composition
disease
interleukin
Prior art date
Application number
CZ982373A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ299025B6 (cs
Inventor
David S. Collins
Michael P. Bevilacqua
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/798,414 external-priority patent/US6096728A/en
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ237398A3 publication Critical patent/CZ237398A3/cs
Publication of CZ299025B6 publication Critical patent/CZ299025B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1
Oblast, techniky
Vynález se týká oblasti zánětů. Přesněji řečeno, vynález popisuje přípravky použitelné k prevenci nebo léčbě zánětlivých onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Zánět je obranná reakce organizmu na poranění, jako například poranění způsobená mechanickým poškozením, infekcí nebo stimulací antigenem. Zánetlivá reakce může být považována za patologickou v případech, kdy je indukována nepatřičným stimulem, jako například nějakým autoantigenem, je-li nepřiměřeně intenzívní nebo přetrvává-li i po odstranění agens, které tuto reakci vyvolalo.
Zatímco porozumění etiologii zánětu je stále nedokoi nalé, v nedávné době bylo získáno množství informací týkajících se molekulárních aspektů zánětlivých procesů.
Výzkum v této oblasti vedl k identifikaci určitých cytokinů, u nichž se předpokládá, že hrají při zprostředkování zánětů klíčovou úlohu. Cytokiny jsou extracelulární proteiny, které ovlivňují činnost buněk, zvláště pak buněk nacházejících se v bezprostřední blízkosti místa syntézy a uvolňování cytokinů. Interleukin-1 (IL-1) je jedním z nejúčinnějších dosud identifikovaných cytokinů zánětu a předpokládá se, že tento cytokin je hlavním mediátorem u mnoha onemocnění a patologických stavů označovaných jako „onemocnění zprostředkovaná interleukinem-1.
......-1 ·· ··*· ·· ·· «» ·· « · 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99 9 9 9 9 · • · · « · · · · « ·· · · · ·· ♦ · 9 9
IL-1, produkovaný (nejenom, ale především) buňkami makrofágové/monocytární linie, se může vyskytovat ve dvou formách: IL-1 alfa (IL-ia) a IL-1 beta (IL-ΐβ).
Za onemocnění nebo patologický stav označovaný jako „onemocnění zprostředkované interleukinem-1 je považováno spontánně se vyskytující nebo experimentálně navozené onemocnění nebo patologický stav, které je spojeno se zvýšeným výskytem IL-1 v tělních tekutinách nebo tkáních, nebo pří kterém buňky nebo tkáně izolované z takto postiženého organizmu produkují v kultuře zvýšená množství IL1. V mnoha případech jsou „onemocnění zprostředkované interleukinem-1 navíc charakterizována ještě následujícími dvěma podmínkami: (1) patologické nálezy spojené s příslušným onemocněním nebo chorobným stavem mohou být v experimentálních živočišných modelech mimikovány podáním IL-1; a (2) patologie příslušného onemocnění nebo chorobného stavu navozeného v experimentálních živočišných modelech mohou být inhibovány nebo odstraněny podáním látek inhibujících aktivitu IL-1. U většiny „onemocnění zprostředkovaných interleukinem-l jsou z výše zmíněných tří podmínek splněny alespoň dvě podmínky a v mnoha případech těchto onemocnění pak všechny tři podmínky. Seznam akutních a chronických zánětlivých onemocnění zprostředkovaných interleukinem-1 (IL-1) zahrnuje (nejenom) následující onemocnění: akutní panktreatitida,
ALS, Alzheimerova choroba, kachexie/anorexie, astma, ateroskleróza, chronický únavový syndrom, horečka, diabetes (např. insulinový diabetes), glomerulonefritida, odmítnutí štěpu hostitelem, hemoragický šok, hyperalgézie, zánětlivé onemocnění střev, zánětlivá kloubní onemocnění včetně osteoartritidy, psoriatické artritidy a revmatické artritidy, ischemie včetně mozkové ischemie (např. poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemora_ .2..
t · * * # · * * · · · · « 9
9 · ♦ · · · · « · · · ·«· · · · · « · ·· 4 · * ·β ·« · gie nebo mrtvice; každá z těchto poruch může vést k neurodegeneraci), plicní onemocnění (např. ARSD), mnohotný myelom, roztroušená skleróza, myeloidní (např. AML a CML) a jiné leukémie, myopatie (například metabolismus svalových proteinů, zvláště při sepsi), osteoporóza, Parkinsonova choroba, bolest, předčasný porod, lupénka, poškození při obnovení průtoku krve, septický šok, vedlejší účinky radioterapie, dočasné onemocnění mandibulárního kloubu, metastázující nádory, zánětlivé stavy, které jsou důsledkem natažení, podvrtnutí, poškození šlachy, ortopedické operace, infekce nebo jiných zánětlivých procesů.
Záněty kloubů jsou chronická kloubní onemocnění, která různou měrou postihují lidi na celém světě. Revmatická artritida je kloubní onemocnění, při němž dochází k pozvolné erozi chrupavky a kosti činností proliferující, invazivní pojivové tkáně nazývané panus, odvozené ze synoviální membrány. Tímto onemocněním mohou být postiženy periartikulární struktury jako například tíhový váček, pochvy šlach a šlachy a rovněž extraartikulární (mimokloubní) tkáně jako například podkoží, kardiovaskulární systém, plíce, slezina, lymfatické uzliny, kosterní svalstvo, nervový systém (centrální a periferní) a oči (Silberberg, Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II;strana 1828, 1985). Osteoartritida je běžné kloubní onemocnění charakterizované degenerativními změnami chrupavky kloubů a reaktivní proliferací kostí a chrupavek obklopujících kloub. Osteoartritida je buněčně zprostředkovaný aktivní proces, který může být důsledkem nepatřičné reakce chondrocytů na katabolické nebo anabolické podněty. V časné fázi osteoartritidy dochází ke změnám v určitých molekulách tvořících matrix chrupavky kloubu (Thonar a další,
Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz
-3-------- —• · · · · · • ♦ · * « a » · · · • · · · « * · · ···· * « · ···· · · • · * ♦· 9 9 9 9 · 9 (ed.), 19:635 až 657, 1993; Shinmei a další, Arthritis
Rheum., 35:1304 až 1308, 1992).
Předpokládá se, že revmatická artritida je důsledkem vystavení imunogeneticky susceptibilního hostitele určitému antigenu. Antigeny, které mohou potenciálně vyvolat imunitní reakce, jejichž důsledkem je vznik revmatické artritidy, mohou být endogenního nebo exogenního původu.
Mezi potenciální endogenní antigeny patří kolagen, mukopolysacharidy a revmatické faktory. Exogenní antigeny zahrnuj í. mykoplazmy, mykobaktérie, spirochety a viry. Vedlejší produkty imunitní reakce (například prostaglandiny a kyslíkové radikály) vyvolají zánět synovia a spustí destruktivní změny v kloubu (například kolagenázu).
Existuje široké spektrum závažnosti tohoto onemocnění, nicméně u množství pacientů dochází v průběhu nemoci k recidivám (zhoršení stavu) a remisím (vymizení projevů nemoci) s celkovým schématem vyznačujícím se postupnou destrukcí a deformací kloubu. Klinické příznaky mohou zahrnovat symetrickou polyartritidu periferních kloubů spojenou s bolestí, citlivostí, otoky a ztrátou funkce takto postižených kloubů; ranní ztuhlost; a ztrátu chrupavek, erozi kostní hmoty a subluxaci (neúplné vykloubení) kloubů po přetrvávajících zánětech. Mezi extraartikulární (mimokloubní) příznaky patří výskyt revmatických nodulů, revmatická vaskulitida, pleuropulmonální záněty, skleritida (zánět bělimy), Sjogrenův syndrom, Feltyho syndrom (splenomegalie a neutropenie), osteoporóza a ztráta hmotnosti (Katz, Am. J. Med, 79:strana 24, 1985; Krane a Simon, Advances in Rheumatology, Sunderman (ed.), 70(2):263 az 284, 1986). Tyto klinické příznaky mají za následek vysoký stupeň morbidity způsobující narušení každodenního života pacientů.
4• ·
Úloha interleukinu-1 při artritidě byla vyvozena z výsledků dvou nezávislých přístupů. Za prvé, v synoviální membráně a synoviální tekutině artritických kloubů byly zjištěny zvýšené hladiny interleukinu-1 a mRNA kódující IL-1 (viz. například Buchán a další, „Third Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology, Londýn, Anglie, 19. až 21 prosinec, 1988, J. Rheumatol., 25(2); Fontana a další, Rheumatology Int., 2:49 až 53, 1982; Duff a další, Monokines and Other NonLymphocytic Cytokines, M. Powanda a další (editoři), strany 387 až 92, Alan R. Liss, lne., 1988) .
Za druhé bylo prokázáno, že aplikace interleukinu-1 do zdravé tkáně kloubu vede ve velkém počtu případů k erozi chrupavky a kosti. Při jednom experimentu bylo prokázáno, že intraartikulární injekce IL-1 vedou u králíků k destrukci chrupavky in vivo (Pettipher a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:8749 až 8753, 1986).
V jiných studiích bylo prokázáno, že IL-1 způsobuje ve tkáňových explantátech destrukci jak chrupavky, tak kosti (Saklatavala a další, Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen a Thornhill (editoři), strany 291 až 298, Alan R. Liss, lne., 1987; Stashenko a další, The American Association of Immunologists, 183:1464 až 1468, 1987). Jednou z obecně přijímaných teorií vysvětlujících příčinnou souvislost mezi IL-1 a artritidou je teorie, že IL-1 stimuluje u různých typů buněk (jako například fibroblastů a chondrocytů) produkci a sekreci prozánětlivých nebo degradaČních sloučenin jakými jsou například prostaglandin E2 nebo metaloproteinázy.
Antagonista receptoru pro interleukin-1 (IL-Ira) je lidský protein, který funguje jako přirozený inhibitor interleukinu-1. Antagonista receptoru pro interleukin-1 (IL-lra) byl popsán jako potenciální agens pro použití φ · φ φ · · φφφ · · · φ · · «φ φ φφ φφ ·* · · při klinické léčbě onemocnění zprostředkovaných IL-1 (Australský patent 649245). IL-lra má nicméně relativně krátký poločas života a při léčbě onemocnění zprostředkovaných IL-1 by tudíž bylo výhodné podávat IL-lra v přípravcích pro řízené uvolňování léčiva.
Jednou z látek použitelnou v přípravcích pro řízené uvolňování léčiva je kyselina hyaluronová. Kyselina hyaluronová je přirozeně se vyskytující mukopolysacharid složený z kyseliny D-glukuronové a N-acetyl-D-glukosaminu spojených v nevětveném řetězci. Tento polymer má průměrnou molekulovou hmotnost 5x1O6 až 6xl06 a vykazuje vynikající biokompatibilitu. V chrupavce kloubů hraje kyselina hyaluronová důležitou úlohu při vytváření matrix chrupavky tím, že agreguje s proteoglykany. Navíc bylo popsáno, že při patologických stavech, jakými jsou například revmatická artritida, osteoartritida a infekční artritida, dochází ke změnám v koncentracích a molekulových hmotnostech kyseliny hyaluronové v kloubu, a ze tyto skutečnosti vedou ke změnám ve složení synoviální tekutiny.
Za účelem zlepšení reologických vlastností nebo prodloužení doby degradace určitých léčiv bylo využito jak chemického zesíúování, tak derivatizace kyseliny hyaluronové (Cortivo a další, Biomaterials, 2:727 až 730, 1991; Benedetti a další, J. Controlled Release, 13:33 až 41,
1990; Hunt a další, J. Controlled Release, 12:159 až 169,
1990) .
Bylo prokázáno, že injekce vysokomolekulárních derivátů kyseliny hyaluronové může obnovit poškozenou vrstvu kyseliny hyaluronové na chrupavce kloubu a kyselina hyaluronová tedy může být účinná při léčbě určitých kloubních onemocnění v klinických testech (nebo při testech prováděných v základním výzkumu). Příkladem vědeckých, prací popisujících použití derivátů kyseliny hyaluronové
6.....
·* ···« φ· ·» • · * * * · « * · » ·«·· • · » » * » · · « ·· »· « ·« ·* k léčbě patologických stavů kloubů jsou například publikace Nizolek a White, Cornell Vet., 71:355 až 375, 1981; Namiki a další, Int. J. Chem. Pharmacol., Therapy and Toxicol., 20:501 až 507, 1982; Asheim a Lindblad, Acta Vet Scand., 17(4):379 až 394, 1976; Svanstrom, Proceedings of the 24th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, St Louis, MO, strana 345 až 348, 1978; Wigren a další, Upsala J. Med. Sci. Suppl., 17:1 až 20, 1975; Gingerich a další, Res. Vet. Sci., 30:192 až 197, 1980. Použití kyseliny hyaluronové v lidských kloubech je popsáno v publikaci Peyron a další, Pathologie Biologie, 22(8):731 až 736, 1974. Intraartikulární použiti kyseliny hyaluronové u koní je komerčně podpořeno ve spojeni s přípravky Hylartil™ a Hilartin V™ společnosti Pharmacia a přípravkem Synacid™ společností Sterivet. Ačkoliv jsou symptomy, jako například bolest nebo ztuhlost kloubů, vážnými problémy při léčbě kloubních onemocnění, použití kyseliny hyaluronové tyto příznaky nezmírňuje.
Kyselina hyaluronová byla rovněž použita jako nosič při aplikaci léčivých látek. Vědecká publikace autorů Rydell a další, Clinical Orthopaedics and Related Research, 80:25 až 32, 1971, popisuje použití kyseliny hyaluronové jak samostatně, tak spolu s kortisonem, v kloubech různých živočichů, zvláště pak koní. Jiná vědecká práce popisuje přípravu mikročástic na bázi esterů kyseliny hyaluronové a jejich použití k intranasální aplikaci insulinu (Illum a další, J. Controlled Release, 29:133 až 141, 1994). Samotné mikročástice byly připraveny způsobem emulzifikace/odpaření rozpouštědla a následně na jednu hodinu umístěny do roztoku insulinu a poté lyofilizovány. Po podání ovcím bylo zjištěno, že průměrná biologická dostupnost odpovídá 11% biologické dostupnosti insulinu podávaného subkutánně. Tento systém byl rovněž využit jako
7- --• to ··♦· • · * * to · * · · · • « · · · · ·· · · · · ·*· to · to · · ·· · «* «to ·· ** nosič při aplikaci růstového faktoru nervových buněk (Ghezzo a další, Int. J. Pharm., 87:21 až 29, 1992). Bylo nicméně rovněž publikováno, že při injekční aplikaci fyziologických koncentrací (3 mg/ml) vysokomolekulární (molekulová hmotnost 6xl06) nebo nízkomolekulární (molekulová hmotnost 5xlOs) kyseliny hyaluronové spolu s radioaktivně značených albuminem do kolenních kloubů psů bylo, ve srovnání s aplikací nižších koncentrací kyseliny hyaluronové (0,03 mg/ml pro vysokomolekulární kyselinu hyaluronovou a 0,3 mg/ml pro nízkomolekulární kyselinu hyaluronovou), dosaženo poněkud většího objemu distribuce albuminu a vyšší rychlosti clearence (Myers a Brandt, J.
Rheumatol., 22:1732 až 1739, 1995). Tato skutečnost naznačuje, že kombinace kyseliny hyaluronové spolu s nějakým proteinem, jako například IL-lra, nebude při léčbě zánětlivých onemocnění (zvláště je-li podávána ve formě intraartikulárni injekce) účinnější než samotná kyselina hyaluronová.
Cílem vynálezu je poskytnout přípravky a způsoby použitelné k léčbě zánětlivých onemocnění zprostředkovaných IL-1. Tento a další cíle vynálezu budou zřejmé z následujících popisů.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje časovou závislost sérových koncentrací IL-lra po subkutánní injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 2 znázorňuje časovou závislost množství ILlra zbylého v kloubech morčat po intraartikulárni injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo . _._.Q----·· φ·«· ·· ·♦ «♦ ·* • * · · · · ♦ · « · • · « « · ·«♦ « » » · « · · · a · * * · • · ·» · * ·♦ ·· v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 3 znázorňuje časovou závislost koncentrace IL-lra v synoviální tekutině králíků po intraartikulární injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 4 znázorňuje vyhodnocení závažnosti onemocnění v kolenních kloubech potkanů imunizovaných bovinním kolagenem typu II, po intraartikulární injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou. Závažnost onemocnění byla sledována histologickými metodami. Jednotlivé sloupce označují zánět synovia (prázdný sloupec), panus (tečky, řidčeji) , celkové poškození chrupavky (tečkování, hustší), poškození kosti (čárky) a kloub jako celek (plný sloupec) .
Obrázek 5 znázorňuje nukleotidovou sekvenci (SEK. ID.
Č: 1) kódující rekombinantní lidský IL-lra (rhuIL-lra) .
Na obrázku je rovněž znázorněna aminokyselinová sekvence (SEK. ID. Č: 2) rhuIL-lra s methioninem jako počáteční aminokyselinou označeným Mn, kde n je rovno 0 nebo 1.
Obrázek 6 znázorňuje vliv (časová závislost) injekčního podávání (jednou denně) IL-lra (lOOmg/kg) v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (plné trojúhelníky), IL-lra (lOOmg/kg) pouze v citrátovém pufru (prázdné trojúhelníky), kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru (plná kolečka), samotného citrátového pufru (prázdné kroužky) na průměr kotníku potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II.
Prázdné čtverečky označují normální stav.
Obrázek 7 znázorňuje vliv injekčního podávání (jednou denně) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyalu9 ·* ««*· *· ·« *· ♦» ·· · « φ « · · · » « · · · t ··· * ♦ · · ««· · · · · · · a · « ·« · * * · · · ronovou ve srovnání s injekčním podáváním IL-lra pouze v citrátovém pufru, kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru, samotného citrátového pufru na hmotnost tlapek potkanů (na konci experimentu) postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. První sloupec označuje normální stav.
Obrázek 8 znázorňuje vliv injekčního podávání (jednou denně) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou ve srovnání s injekčním podáváním IL-lra pouze v citrátovém pufru, kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru, samotného citrátového pufru na intenzitu zánětu (plný sloupec), tvorbu pannu (šikmé šrafování), poškození chrupavky (tečky) a poškození kosti (krátké čárky) u potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II.
Obrázek 9 znázorňuje vliv (časová závislost) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou injekčně podávaného jednou denně (plná kolečka), jednou za 48 hodin (plné kosočtverce) a jednou za 72 hodin (plné trojúhelníky) ve srovnání s injekčním podáváním kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru (jednou denně) nebo ve srovnání s neléčeným stavem (prázdné trojúhelníky) na průměr kotníku potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. Prázdné čtverečky označují normální stav.
Obrázek 10 znázorňuje vliv IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou injekčně podávaného jednou denně, jednou za 48 hodin a jednou za 72 hodin ve srovnání s injekčním podáváním kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru (jednou denně) nebo ve srovnání s neléčeným stavem na hmotnost tlapek potkanů (po skončení experimentu) postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. První sloupec označuje normální stav.
10• · ·*«· • · ·· ·» ♦· • « · ··« · · » • · * · · ··· · ·' · • · · ··»· · »* · «4 «· ·· ··
Podstata vynálezu
Vynález se týká farmaceutického přípravku obsahujícího polymer pro řízené uvolňování léčiva (například hyaluronát) a proteinový inhibitor IL-1 (například IL-lra) jako agens k léčbě zánětlivých onemocnění zprostředkovaných IL-1. Popisovaný způsob léčby může být využit jak ve veterinární, tak v humánní medicíně.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují směs polymeru pro řízené uvolňování léčiva (například hyaluronát) a proteinového inhibitoru IL-1 (například IL-lra). Cílem charakteristického provedení vynálezu je aplikace farmaceutického přípravku obsahujícího hyaluronát a proteinový inhibitor IL-1 (například IL-lra) vedoucí k relativnímu prodloužení přítomnosti zvýšených koncentrací IL-lra; viz. prozatímní přihláška US 60/011419, podaná 9. února 1996 Collinsem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases (číslo spisu A-365P), prozatímní přihláška US 60/032789, podaná 6. prosince 1996 Collinsem a Bevilacquaou, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases (číslo spisu A-365AP) a prozatímní přihláška US _, podaná 23. ledna 1997
Collinsem a Bevilacquaou, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases (číslo spisu A-365P). Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Inhibitorem interleukinu-1 může být jakýkoliv protein schopný specificky inhibovat aktivaci buněčných receptorů
1T ·· ···· • v «·*« · · · • « · · ♦ ··· · · · » « » · ·' · · * ·· * *· ♦* · ·*
IL-1. Jednotlivé skupiny inhibitorů interleukinu-1 jsou: antagonisté receptoru pro interleukin-1, jako například IL-lra popsaný níže; monoklonální protilátky namířené proti receptoru pro IL-1 (EP 623674); proteiny vážící IL1 jako například rozpustné receptory pro IL-1 (Přihlášky US 5492888, 5488032, 5464937, 5319 071 a 5180812); monoklonální protilátky namířené proti IL-1 (WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, US 4935343, EP 364778, EP 267611 A EP 220063); a pomocné proteiny receptoru pro IL-1 (WO 96/23067), Zmíněné publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Výhodně používané IL-lra (jak glykosylované tak neglykosylované), jakož i způsoby jejich přípravy a použití jsou popsánu v přihlášce US 5075222 (v tomto textu označované jako přihláška '222); WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221 A WO 96/22793. Zmíněné publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Tři zvláště užitečné formy IL-lra (IL-lraa, IL-lraP a IL-lrax) a jejich varianty jsou popsány v přihlášce '222.
IL-lraa je charakterizován jako molekula s molekulovou hmotností 22 až 23 kDa (stanoveno pomocí SDS-PAGE) a izoelektrickým bodem přibližně 4,8, která je z kolony Mono Q pro FPLC eluována pufrem Tris-HCl (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 52 mM. IL-lraP je charakterizován jako molekula s molekulovou hmotností 22 až 23 kDa (SDS-PAGE), která je z kolony Mono Q eluována pufrem Tris-HCl (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 48 mM. Jak IL-lraa, tak IL-lrap jsou glykosylovány. IL-lrax je charakterizován jako protein s molekulovou hmotností 20 kDa (SDSPAGE) , který jez kolony Mono Q eluován pufrem Tris-HCl (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 48 mM, a tento «· φφφφ φφ φφ φφ φφ «φ φ φφφ φφφφ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφφφ φ φ φφ φ φφ φφ ·· φφ protein není glykosylován. Všechny tři zmíněné inhibitory mají podobné funkční a imunologické vlastnosti.
Jeden popsaný způsob pro produkci IL-lra zahrnuje izolaci IL-lra z lidských monocytů, které tento protein přirozeně produkují. Druhý způsob zahrnuje izolaci genu kódujícího IL-lra, zaklonování tohoto genu do vhodných vektorů a typů buněk, expresi zmíněného genu za účelem produkce inhibitorů a izolace takto připravených inhibitorů. Ve výhodných provedeních je používán tento druhý způsob, který je ukázkovým příkladem obecných rekombinantních metod. Rekombinantní přístupy jsou částečně upřednostňovány proto, Že umožňují dosáhnout vyšších výtěžků proteinu ve větší čistotě. Do rozsahu vynálezu tudíž spadá i IL-lra obsahující na N-konci methionin, což je důsledkem exprese v prokaryotickém expresívním systému jakým je například exprese v E. coli.
Jak je zmíněno výše, vynález, se rovněž týká modifikovaných forem IL-lra. Termín „modifikované formy IL-lra, použitý v této přihlášce, zahrnuje polypeptidové varianty, ve kterých byla aminokyselinová sekvence IL-lra pozměněna tím, že v ní byly některé aminokyseliny (1) odstraněny („deleční varianty), (2) nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky („substituční varianty) nebo (3) vloženy („varianty s vloženými aminokyselinami).
Co se týká delečních variant IL-lra, počet odstraněných aminokyselinových zbytků v polypeptidu se přibližně pohybuje v rozmezí 1 až 30 zbytků, obvykleji pak 1 až 10 zbytků a typicky v rozmezí 1 až 5 po sobě jdoucích aminokyselinových zbytků, Do rozsahu vynálezu spadají delece na N-konci, C-konci nebo ve vnitřní sekvenci. Delece v aminokyselinové sekvenci IL-lra mohou být provedeny v oblastech vykazují nízký stupeň homologie k sekvencím přítomným u jiných zástupců rodiny IL-1. Delece provedené
13- «« «>* ·· ·* ·· ·* • · · · · · · · * • « · « · *·· · · » » ft · · · · · · · · ·· · ·♦ ·· ·« ·· v oblastech s vysokým stupněm homologie k jiným zástupcům rodiny IL-1 budou s větší pravděpodobností daleko výrazněji modifikovat biologickou aktivitu IL-1.
Co se týká variant IL-lra s vloženými aminokyselinovými zbytky, jedná se obvykle o přidání aminokyselinových sekvencí na N-konec a/nebo C-konec, přičemž počet přidaných aminokyselinových zbytků se pohybuje v rozmezí 1 až )
100 nebo více aminokyselin. Jeden nebo více aminokyselie, nových zbytků může být vloženo rovněž do vnitřní oblasti ’ . sekvence. Do vnitřní oblasti sekvence je obvykle vkládáno přibližně 1 až 10 aminokyselinových zbytků, obvykleji pak až 5 zbytků a typicky 1 až 3 aminokyselinové zbytky.
Příkladem variant s aminokyselinovými zbytky vloženými na N-konec je IL-lra s methioninem (například jako artefakt exprese v buněčné kultuře rekombinantních bakterií) , jiným aminokyselinovým zbytkem nebo sekvencí aminokyselin vloženou na N-konec. Dalším příkladem variant s inzercí na N-konci je fúzní protein se signální sekvencí, jakož i s jinými pre-pro sekvencemi, kde tyto sekvence usnadňují sekreci daného proteinu z rekombinantních hostitelských buněk. Každý polypeptid může obsahovat signální sekvenci zvolenou tak, aby byla rozpoznávána a procesována, tj. odštěpena signální peptidázou, hostitelskou , buňkou. Pro expresi v prókaryotických hostitelských buň4 kách, které nejsou schopny rozpoznávat a procesovat na* tivní signální sekvenci IL-lra, může každý polypeptid obsahovat prokaryotickou signální sekvenci vybranou například ze skupiny zahrnující vedoucí sekvence alkalické fosfatázy, penicilinázy nebo tepelně stabilního enterotoxinu II. Pro expresi v buňkách kvasinek může každý polypeptid obsahovat signální sekvenci vybranou například ze skupiny zahrnující vedoucí sekvence invertázy, faktoru alfa nebo kyselé fosfatázy. Pro expresi v savčích buňkách
T4'~ »· ·*** ** ·* t« 99 ·· 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 9 · · · ··· * · · 9 · · ·« » ·♦ ·* ·· ·« může každý polypeptid obsahovat nativní signální sekvenci IL-lra, nicméně mohou být rovněž použity jiné savčí signální sekvence jako například sekvence odvozené z jiných zástupců rodiny IL-1.
Varianty s aminokyselinovými zbytky vloženými na Ckonec zahrnují chimérické proteiny, kde každý takový protein obsahuje IL-lra připojený k části nebo celé konstantní doméně těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Z těchto chimérických proteinů jsou ve vý_hodném provedení_používány proteiny, .jejichž část odvozená od imunoglobulinu obsahuje všechny domény s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, jako například IgG, IgA, IgM nebo IgE (zvláště pak IgG, například IgGl nebo IgG3). Odborník zajisté pochopí, že v části odvozené od imunoglobulinu může být odstraněna nebo substituována (jednou nebo více aminokyselinami) jakákoliv aminokyselina, nebo zde může být vložen jeden nebo více aminokyselinových zbytků, a to pokud IL-lra stále funguje jako antagonista receptoru pro IL-1 a imunoglobulinová část vykazuje jednu nebo více z jejích charakteristik.
U substitučních variant IL-lra je alespoň jeden aminokyselinový zbytek z aminokyselinové sekvence IL-lra odstraněn a na jeho místo je vložen zbytek odlišný. Mezi takové substituční varianty patří alelické formy, jež jsou charakterizovány přirozeně se vyskytujícími změnami v nukleotidové sekvenci u populace daného druhu, přičemž tyto změny mohou, ale nemusí, vést ke změně aminokyselinové sekvence. Odborník může využít informace týkající se vazby nebo aktivního místa daného polypeptidu k výběru možných míst mutací. Příklady substitučních variant jsou uvedeny v WO 91/17184, WO 92/16221 a WO 96/09323.
~ ·* *♦*· ·* »« fc· ·· • a a a a a a a a a • a a « a a·» a a a a • aa a a a a · a aa a aa1 a» aa aa
Jeden způsob, který slouží k identifikaci aminokyselinových zbytků nebo oblastí proteinů vhodných k mutagenezi, je „mutageneze záměnou za alanin, jak je popsána v článku autorů Cunningham a Wells (Science,
244:1081 až 1085, 1989; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při této metodě je identifikován jeden nebo skupina aminokyselinových zbytků (například nabité zbytky jako například Arg, Asp, His, Lys a Glu) a tyto jsou následně nahrazeny neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami (ve výhodném provedení alaninem nebo polyalaninem). Tato záměna má vliv na interakci zmíněných aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buněk. Aminokyseliny, jejichž funkce je zmíněnými substitucemi ovlivněna, jsou dále modifikovány zavedením dalších aminokyselinových zbytků nebo záměnou stávajících aminokyselin v místech substitucí. Takže shrnuto: je nalezeno cílové místo pro zavedení změn do aminokyselinové sekvence, za účelem optimalizace mutace v tomto místě může být provedena „mutageneze záměnou za alanin nebo náhodná mutageneze a tímto způsobem připravená varianta polypeptidu je testována za účelem nalezení optimální kombinace požadovaná aktivita/stupeň aktivity.
Místa, která jsou z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky nej zajímavější, zahrnují oblasti, v nichž se aminokyseliny v IL-lra podstatně liší ve velikosti, náboji a/nebo hydrofobicitě postranního řetězce od míst v proteinech podobných IL-lra, jako například v IL-lra jiných druhů nebo jiných zástupců rodiny IL-1. Dalšími místy, zajímavými z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky, jsou oblasti, v nichž jsou aminokyseliny IL-lra identické s aminokyselinami v proteinech podobných IL-lra. Taková _________ _________________1.6_________ __________... _________________________ φφ «·»* «* *· ·· »· • « * Φ Φ Φ Φ Φ · φ * * φ « φφφ « φφ φ • ΦΦ φφ·· Φ Φ
Φ»Φ φ> φφ φφ Φ· místa jsou obvykle důležitá pro biologickou aktivitu daného proteinu. Na počátku jev těchto místech provedena v podstatě konzervativní záměna. Takové konzervativní záměny jsou zobrazeny v Tabulce 1. ve sloupci s názvem „Výhodná substituce. Dojde-li po zavedení těchto substitucí ke změně biologické aktivity, následuje zavedení podstatnějších změn (sloupec Příklady jiných substitucí) a/nebo mohou být do sekvence přidány (adice) nebo ze sekvence odstraněny (delece) aminokyseliny a u takto získaných produktů je testována jejich aktivita.
Tabulka 1
Aminokyselinové substituce
Původní aminokyselina Výhodná substituce Příklady jiných substitucí
Ala (A) Val Val; Leu; Ile
Arg (R ) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu
“ Cys (C) Ser Ser
Gin (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro Pro
His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg
Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Leu (L) Ile Ile; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P) Gly Gly
li, • fc
Aft rtflíl P 1 c c č c
r. fi r τ
i. r.'C * ' f. *; : C fi 1' fi £
PC Hfi c «1 r <;
fi' f ιί ♦ r *t c' >:· >» »?. i o *r f «:
.Ser (S) Thr · Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr (Yb - ' Phe-’ Trp; Phe; Thr; Ser
' 'Val- (V) · ' - ' · Leu Leu; Ile; Met; Ala;
? .# Phe’; nórleucin
' ...... i
M·
Předpokládá se,- že výsledkem konzervativních1změn v aminokyselinové'sekvenci {a odpovídajících změn - • ·. Ί, j · ... · u k...v kódující riukleotídové sekvenci) ill-lra bude vytvoření proteinů, které budou'funkčně a svými'^ chemickými charakteristikami4 podobné ILf-lřaV Podstatných změn vě funkci a/nebo .chemických charakteristikách IL-lrá může být naproti tomu 1 j. ' ,, Λ h, dosažéno zavedením substitucí·; ' které podstatně pozměňuj í (a)- strukturu*hlavního· řetězce pólypeptidu -vmístě substituce, 'například pozměňují konformaci cc-helixu nebo β, * .... .. '' . '4 j i. j · r l i- p skládaného listu; (b) náboj'nebo hýdřofobicitu dané molekúnj ”, f ř 1 I i ‘ * .
'ly v cílovém místě; nebo (c) velikost postranního řetězce.
'· J , fc >' · r ' ' i ' X
Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky jsou na , · ' #' 1 i. » f Ί : * základě společných charakteristik postranního řetězce děle*1 *.· ny ďó následujících skupin: 1'
1?’ Hydrofobní: nórleucin,1 Met,' Áía, Val,' Leu,'Ile;
2. ’ Neutrální hydrofilní; Cys, Set,'Thr;”’
- T_ ' η -· ‘ V ' m ’ - 1 > ' ' .· * ' i '. <·
3. Kysele: Asp, Glu;
’4 . Zásadité': Ásri, Gln,^ His,‘ Lys, Árg;
í L f, j·^ \ΐ· ' 1
5. Zbytky ovlivňující orientaci řetězce: Gly,“ Pro; a
6. Aromatické: Trp,'Tyr', Phé.‘
Nekonzervativní záměny mohou zahrnovat záměnu některého
- r · 1 ' t * ·,· , - . · s , zástupce jedne z těchto skupin za aminokyselinu z jiné skupiny. Tyto substituce mohou být’ zavedeny do oblastí ÍL-lra, které jsou nebo nejsou homologní s oblastmi u jiných zástupců rodinyIL-1' i! .
«· «··· · · ♦ t • · · · · ··* · · · · • · · · i · · « « «·· »»· • · · · · · · « · • 4 1 *· C»« ·· ··
Charakteristické mutace v aminokyselinové sekvenci ILlra mohou zahrnovat substituce „nepřirozenými aminokyselinami na N-konci, C-konci nebo v jakémkoliv místě proteinu, které je modifikováno připojením sacharidu prostřednictvím N-glykosidické nebo O-glykosidické vazby. Takové záměny mohou být zvláště užitečné a jejich příkladem je vložení nějaké aminokyseliny (například cysteinu), která je výhodně používána k připojení polymeru rozpustnému ve vodě za účelem vytvoření derivátu popsaného v dalším textu. Sekvence IL-lra může být dále modifikována vložením nebo odstraněním míst pro N- nebo O-glykosylaci. Sekvence rozpoznávané při N-glykosylaci (na asparaginu) zahrnují tripeptidy, které jsou specificky rozpoznávány enzymy odpovědnými za Nglykosylaci. Zmíněné tripeptidy mají bud' sekvenci Asn-XaaThr nebo Asn-Xaa-Ser, v níž symbol Xaa zastupuje jakoukoliv aminokyselinu vyjma prolinu.
Ve specifickém provedení vynálezu vykazují varianty vysoký stupeň homologie k aminokyselinové sekvenci IL-lra (SEK. ID. Č: 2). Termín „vykazující vysoký stupeň homologie používaný ve vynálezu označuje skutečnost, že stupeň homologie přesahuje ve výhodném provedení vynálezu 70%, ve výhodnějším provedení pak přesahuje hranici 80% a nejvýhodně ji pak přesahuje 90% nebo 95%. Procento homologie, tak jak je chápáno v této přihlášce, je definováno jako procento aminokyselinových zbytků přítomných v kratší ze dvou sekvencí, které jsou srovnávány, přičemž při přiřazování odpovídajících si aminokyselinových zbytků mohou být, za účelem maximalizace přiřazení, do řetězce o délce 100 aminokyselin zavedeny čtyři mezery. Tento předpis je navržen v publikací Dayhoff, „Atlas of Protein Science and Structure, svazek 5, strana 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C., 1972, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto • to · to to * • to • toto* to to • •to ···· · ··· ·· ·* ·· toto vynálezu. Jako varianty „vykazující vysoký stupeň homologie jsou varianty IL-lra, které mohou být izolovány na základě křížové reaktivity s protilátkami proti aminokyselinové sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č: 2, nebo varianty, jejichž geny mohou být izolovány s využitím hybridizace s DNA (nebo jejími částmi) znázorněnou jako SEK. ID. Č:l.
Produkce variant IL-lra je detailně popsána v dalším textu. Tyto varianty mohou připraveny zavedením příslušných záměn do nukleotidové sekvence DNA kódující varianty IL-lra nebo chemickou syntézou požadovaných variant IL-lra prováděnou in vitro. Odborníkům je zřejmé, že může být provedeno množství delecí, inzercí a substitucí (a jejich kombinací) za předpokladu, že výsledné varianty IL-lra budou biologicky aktivní.
Techniky mutageneze sloužící k substituci, inzerci nebo deleci jedné nebo více zvoleným aminokyselin jsou odborníkům dobře známé (například přihláška US 4518584, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při vytváření každé změny v aminokyselinové sekvenci existují dvě hlavní proměnné: umístění mutovaného místa a podstata mutace. V návrhu každé varianty budou umístění mutovaného místa a postata mutace záviset na biochemické(-ých) charakteristice (charakteristikách) , která bude měněna. Každé mutované místo může být modifikováno samostatně nebo spolu s jinými místy, například (1) nejprve substitucí konzervativní aminokyselinou a poté, v závislosti na dosažených výsledcích, méně konzervativní substitucí, (2) delecí cílového aminokyselinového zbytku nebo (3) vložením jednoho nebo více aminokyselinových zbytků do místa přiléhajícímu ke zvolenému místu.
Chemicky modifikované deriváty IL-lra nebo různých variant IL-lra mohou být odborníkem připraveny s využitím postupů popsaných v tomto vynálezu. Ke konjugaci mohou být • * lít· « · · · • φ · · ··· · ♦ « · · • φ φ · φ φ φ · · *· použity glykosylované, neglykosylované nebo deglykosylované IL-lra nebo varianty IL-lra. Obvykle budou použity neglykosylované IL-lra nebo varianty IL-lra. Mezi chemické sloučeniny vhodné k derivatizaci IL-lra nebo variant IL-lra patří polymery rozpustné ve vodě.
Použití polymerů rozpustných ve vodě je žádoucí zejména proto, že protein, ke kterému je tento polymer připojen, nebude ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí, precipitovat. Ve výhodném provedení bude zmíněný polymer přijatelný pro farmaceutickou přípravu léčivého produktu nebo přípravku. Odborník bude schopen zvolit požadovaný polymer na základě takových úvah, jako například bude-li konjugát polymer/protein používán terapeuticky, a jestliže ano, pak vzhledem k požadovanému dávkování, požadované době setrvání v krevním oběhu a rezistenci vůči proteolýze.
Mezi vhodné, farmaceuticky přijatelné, polymery rozpustné ve vodě patří (nejenom) polyethylenglykol (PEG), polyethylenglykolpropionaldehyd, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, monomethoxypolyethylenglykol, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol (PVA), polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, poly(paminokyseliny) (buď homopolymery nebo kopolymery s náhodnou sekvencí), póly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homůpolymery polypropylenglykolu (PPG) a jiné polyalkenoxidy, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly (POG) (například glycerol) a jiné polyoxyethylované polyoly, polyoxyethylováný sorbitol nebo polyoxyethylováná glukóza, polymery karbohydrátů, Ficoll nebo dextran, a jejich směsi.
Termín „polyethylenglykol používaný v přihlášce zahrnuje jakoukoliv z forem polyethylenglykolu, která byla pou2.1. ·* «*·· « « · · · · · · · • · · · « ·«· · · · • · · «»·» · ·« · ·♦ ·· ·· žita k přípravě derivátu jiných proteinů, jako například mono-(Cl až CIO) alkyloxy- nebo aryloxy-polyethylenglykol. Vzhledem ke své stabilitě ve vodě, je výhodná výroba polyethylenglykolpropionaldehydu.
Zmíněné polymery rozpustné ve vodě mohou mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené. Tyto polymery rozpustné ve vodě mají obvykle průměrnou molekulovou hmotnost v intervalu přibližně 2 kDa až přibližně 100 kDa (termín „přibližně naznačuje, že v preparátech polymeru rozpustného ve vodě se vyskytují molekuly s vyšší nebo naopak nižší molekulovou hmotností než udává daný údaj). Průměrná molekulová hmotnost polymeru rozpustného ve vodě spadá ve výhodném provedení do intervalu přibližně 5 kDa až přibližně 50 kDa, výhodněji pak do intervalu přibližně 12 kDa až přibližně 25 kDa a nejvýhodněji se pohybuje kolem 20 kDa. Obecně platí, že čím je vyšší molekulová hmotnost daného polymeru nebo čím je polymer rozvětvenější, tím, vyšší poměr polymer:protein je nutno použít.
Každý polymer rozpustný ve vodě by měl být k proteinu připojen s ohledem na možné ovlivnění funkčních a antigenních domén tohoto proteinu. Obecně lze říci, že derivatizace může být provedena za podmínek vhodných pro reakci proteinu s aktivovanou molekulou polymeru. Mezi aktivovatelné skupiny polymeru, které mohou být použity pro připojení polymeru k aktivním zbytkům na proteinu, patří: sulfon, maleinimid, sulfuhydryl, thiol, trifluormethansulfonát, tresylát, aziridin, oxiran a 5-pyridyl.
Polymery rozpustné ve vodě jsou obvykle k danému proteinu připojeny prostřednictvím a- nebo ε-aminoskupin aminokyselin nebo reaktivních -SH skupin. Do rozsahu vynálezu nicméně rovněž spadá připojení polymerů rozpustných ve vodě k jakékoliv reaktivní skupině daného proteinu, kde tato skupina je dostatečně reaktivní, aby mohla být za vhodných ·· ··*· • · · · ·« φφ *· · ♦ V φ · · · · «· · *···· φ·φφ reakčních podmínek připojena k danému polymeru rozpustnému ve vodě. Polymer rozpustný ve vodě může tudíž být kovalentně navázán k proteinu prostřednictvím reaktivních skupin jako například volné aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Aminokyselinovými zbytky s volnou aminoskupinou mohou být lysin a N-koncový aminokyselinový zbytek. Aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou zahrnují kyselinu asparágovou, kyselinu glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Aminokyselinou s reaktivní -SH skupinou může být cystein.
Postupy sloužící k přípravě konjugátů proteinů a polymerů rozpustných ve vodě budou obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s polymerem rozpustným ve vodě za podmínek, které umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polymeru rozpustného ve vodě; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Reakční podmínky pro jednotlivé konjugační reakce mohou být zvoleny z podmínek v současnosti známých nebo podmínek v budoucnu vyvinutých. Tyto podmínky by nicméně měly být zvoleny tak, aby modifikovaný protein nebyl vystaven (nebo aby toto vystavení bylo minimalizováno) podmínkám, jako například teplotě, rozpouštědlům nebo hodnotám pH, které by protein inaktivovaly. Obecně lze říci, že optimální reakční podmínky budou stanoveny případ od případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků. Například čím větší bude poměr polymeru rozpustného ve vodě ku proteinu, tím větší bude procento konjugovaného produktu. Optimální poměr (vzhledem k účinnosti reakce tak, aby se v reakční směsi nevyskytoval nadbytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) může být stanoven v závislosti na požadovaném stupni derivatizace (například mono-, di-, tri-deriváty a podobně), molekulové hmotnosti zvoleného polymeru, typu polymeru (rozvětvený nebo nerozvětvený polymer) a reakčních podmínkách. Poměr • · ·· · ··· · · · · · » «« · ·· *« ·· «· polymeru rozpustného ve vodě {například PEG) ku proteinu bude obvykle v intervalu 1:1 až 100:1. Pomocí standardních purifikačních postupů, jakými jsou například (mimo jiné) dialýza, vysolování, ultrafiltrace, ionexová chromatografie, gelová chromatografie a elektroforéza, může být z každé reakční směsi izolován jeden nebo více konjugátů.
V některých případech může být zvláště žádoucí protein chemicky modifikovaný na N-konci. Polymer, rozpustný ve vodě může být zvolen na základě molekulové hmotnosti, požadovaném větvení atd., poměru počtu molekul polymeru rozpustného ve vodě k počtu molekul proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typu reakce použité pro navázání polymeru a způsobu izolace zvoleného proteinu s daným polymerem navázaným na N-konec. Způsobem k získání proteinu chemicky modifikovaného na N-konci (tj. oddělením takového produktu od jiných produktů) může být purifikace proteinu chemicky modifikovaného na N-konci z populace proteinových molekul s polymerem navázaným jiným způsobem. Selektivní chemické modifikace Nkonce může být rovněž dosaženo redukční alkylací, při níž je využito rozdílné reaktivity odlišných typů primárních aminoskupin (lysin oproti N-konci) dostupných při derivatizaci daného proteinu. Za vhodných reakčních podmínek je, za použití polymeru nesoucího karboxylovou skupinu, dosaženo v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci. Selektivního navázání polymeru rozpustného ve vodě na Nkonec proteinu je možné například dosáhnout tak, že je reakce prováděna při hodnotě pH umožňující využít rozdílů v hodnotách pKa mezi ε-aminoskupinou lysinu a aaminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Při této selektivní derivátizaci je připojení polymeru rozpustného ve vodě cílené: konjugace daného polymeru s proteinem probíhá přednostně na N-konci tohoto proteinu a ve významné míře nedochází k modifikaci dalších reaktivních skupin, t· « • · · * · · • « « *··· · » · · • · · · · Φ · · · ·· · ·· ·Φ ·· ·· jako například postranních řetězců lysinu. Při redukční alkylaci mohou být polymery rozpustné ve vodě stejného typu jak je popsáno výše a tyto polymery by měly mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu použitelnou k vazbě na protein.
Může být použit polyethylenglykolpropionaldehyd nesoucí jednu reaktivní aldehydovou skupinu.
Do rozsahu vynálezu specificky spadají proteiny derivatizované jednou nebo více (například 2 až 4) molekulami PEG. Navázání polyethylenglykolu může být provedeno jakoukoliv reakcí v současnosti za tímto účelem používanou. Postupy sloužící k přípravě proteinového produktu s připojenou molekulou (molekulami) polyethylenglykolu budou obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s polyethylenglykolem (jako například s reaktivním esterem nebo derivátem polyethylenglykolu nesoucím aldehydovou skupinu) za podmínek, které umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolu; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Obecně lze říci, že optimální reakční podmínky těchto reakcí budou stanovovány případ od případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků.
Odborníkům je známo množství způsobů použitelných k připojení polymeru rozpustného ve vodě k proteinu; viz. například přihláška EP 0401384, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu; Malik a další, Exp. Hematol. 20:1028 až 1035, 1992; Francis, Focus on Growth Factors, 3 (2) : 4 až 10, 1992 (Mediscript, Mountain Court, Friěrn Barnet Lané, Londýn, N20 OLD, UK); EP 0154316; EP 0401384; WO 92/16221; WO 95/34326; a další publikace, které jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Navázání polyethylenglykolu může být provedeno acylační nebo alkylační reakcí proteinu s reaktivní molekulou polye25
II 4444 ·* ·· · ·
4 4 4 4 4 4 4 4 4
4# 4 4 4444 4 4« 4 • 44 4444 4 4
4 44 44 ·» 4· thylenglykolu. Mezi proteinové produkty podle vynálezu patří proteiny s navázanou (navázanými) molekulou (molekulami) polyethylenglykolu, kde je (jsou) tato (tyto) molekula (molekuly) připojena prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin. Zmíněné produkty mohou obsahovat jednu nebo více molekul polyethylenglykolu (například 2 až 6 a ve výhodném provedení 2 až 5 molekul PEG). Molekuly polyethylenglykolu jsou obvykle k danému proteinu připojeny prostřednictvím ctného ε-aminoskupin aminokyselin, nicméně do rozsahu vynále’-zu rovněž spadá připojení těchto molekul prostřednictvím jakékoliv aminoskupiny připojené k danému proteinu a to v případě, je-li tato aminoskupina dostatečně reaktivní k tomu, aby mohla být za vhodných reakčních podmínek připojena k molekule polyethylenglykolu.
Při acylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu s proteinem. Polymer (-y) používaný při acylačních reakcích byl měl obsahovat jednu reaktivní esterovou skupinu. K navázání polyethylenglykolu může být využita jakákoliv známa nebo v budoucnosti objevená reaktivní molekula polyethylenglykolu. Ve výhodném provedení je jako aktivovaný ester polyethylenglykolu používán ester s Nhydroxysukcinimidem (NHS). Termín „acylační navázání používaný ve vynálezu zahrnuje, bez jakýchkoliv omezení, následující typy vazeb mezi terapeutickým proteinem a polymerem rozpustným ve vodě (jakým je například polyethylenglykol): amid, karbamát, urethan a podobně; víz. Chamow, Bioconjugate Chem., 5:133 až 140, 1994. Jako reakční podmínky mohou být zvoleny jakékoliv podmínky v současnosti používané (nebo v budoucnosti objevené) pro navázání polyethylenglykolu, nicméně reakce by neměla probíhat za podmínek (teplota, hodnota pH nebo povaha rozpouštědla), které vedou k inaktivaci modifikovaných proteinů.
26.
·· ···♦ ♦ » ·« »· »· • * · · · · • « ··· * · · · • v · · · · · » · tt t ·· ·· ·· #«
Výsledkem acylačního navázání polyethylenglykolu obvykle bude protein s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Ve výhodném provedení bude spojující vazbou vazba amidová. Rovněž výhodné je, aby vzniklý produkt obsahoval téměř výhradně (například > 95%) jednu, dvě nebo tři molekuly polyethylenglykolu na jednu molekulu proteinu. V závislosti na použitých reakcních podmínkách může nicméně dojít ke vzniku produktů s vyšším počtem navázaných molekul polyethylenglykolu. Je-li to žádoucí, může být z reakční směsi (zvláště od nezreagováných reaktantů) odděleno více produktů s navázaným polyethylenglykolem, a to s využitím standardních purifikačních postupů včetně (mimo jiné) dialýzy, vysolování, ultrafiltrace, chromatografie na iontoměničích, gelové filtrace nebo elektroforeticky.
Při alkylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce derivátu polyethylenglykolu nesoucího na konci molekuly aldehydovou skupinu s proteinem v přítomnosti redukčního činidla. Polymer (-y) používaný při redukční alkylační reakci byl měl obsahovat jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Příkladem polyethylenglykolu s reaktivní aldehydovou skupinou je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stabilní ve vodném prostředí, nebo jeho mono Cl až CIO alkyloxy nebo aryloxy deriváty (viz. Patentová přihláška US 5252714).
Výsledkem alkylačního navázání polyethylenglykolu může být rovněž protein s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Reakční podmínky můžou být rovněž upraveny tak, aby docházelo k navázání polyethylenglykolu v podstatě pouze na α-aminoskupinu na N-konci proteinu (tj . vznik produktu s jedinou navázanou molekulou polyethylenglykolu) . Molekula(-y) polyethylenglykolu jsou ve výhodném provedení k proteinu připojeny vazbou -CH2-NH-. S odkazem ·· »·*> ** ·> «V 1
A a * · A · · · • a a · » ·♦· * · · • A A A A A A · na skupinu -CH2- je tento typ vazby označován jako „alkylová vazba.
Redukční alkylace sloužící k přípravě v podstatě homogenní populace konjugátů monopolymer/protein bude obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s reaktivní molekulou polyethylenglykolu, a to za podmínek pro redukčních alkylaci a při hodnotě pH, které umožní selektivní modifikaci a-aminoskupiny na N-konci zmíněného proteinu; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Derivatizace prováděná metodou redukční alkylace tak, aby byl protein derivatizován pouze jednou molekulou polyethylenglykolu, obvykle využívají rozdíly v hodnotách pKa mezi aminoskupinami lysinu a a-aminoskupinami na N-konci (hodnota pKa odpovídá hodnotě pH, při které má 50% aminoskupin kladný náboj (je protonizováno) a 50% aminoskupin protonizováno není).
Tato reakce je prováděna při hodnotě pH umožňující využít rozdílů v hodnotách pKa mezi ε-aminoskupinou lysinu a α-aminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Obecně lze říci, že při nižším pH bude žádoucí použít větší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tzn. čím méně reaktivní je N-koncová α-amínoskupína, tím větší množství polymeru je nutno použít k dosažení optimálních podmínek). Jeli hodnota pH vyšší, nemusí být poměr polymer/protein tak vysoký (tzn., že čím reaktivnější skupiny jsou dostupné, tím méně molekul polymeru je třeba). Hodnoty pH používané pro účely popsané v této přihlášce spadají do intervalu 3 až 9 a ve výhodném provedení do intervalu 3 až 6. Při redukční alkylaci by redukční Činidlo mělo být stabilní ve vodném prostředí a ve výhodném provedení by mělo účinně redukovat pouze Schiffovu bázi vytvořenou v počátečním kroku této reakce. Výhodně používanými redukčními činidly jsou
Φφ
Μ ···♦ • φ Φ Φ Φ · ·· · • φ Φ · * ··· · ♦ · • φ · ΦΦΦΦ Φ
Φ φ ΦΦ ΦΦ ·* tetrahydroboritan sodný, kyanoborohydrid sodný, dimethylaminboran, trimethylaminboran a pyridinboran. Zvláště výhodné je použití kyanoborohydridu sodného jako redukčního činidla. Ostatní reakční podmínky, jako například rozpouštědlo, reakční čas, teploty a podobně a způsoby purifikace reakčních produktů, mohou být stanoveny případ od případu na základě publikovaných informaci týkajících se přípravy derivátů proteinů s využitím polymerů rozpustných ve vodě.
Za podmínek naznačených výše bude alkylací v redukčním prostředí dosaženo selektivního připojení polymeru rozpustného ve vodě (obsahujícího reaktivní skupinu jako například aldehydovou skupinu). Konjugace s polymerem proběhne přednostně na N-konci proteinu a nedojde v podstatě k žádným modifikacím jiných reaktivních skupin jako například aminoskupin postranních řetězců lysinu. V preparátu bude ve výhodném provedení více než 90% konjugátů monopolymer/protein a výhodněji pak více než 95% konjugátů monopolymer/protein, přičemž ostatní pozorovatelné molekuly budou nezreagované (tzn. protein postrádající molekulu polymeru).
Derivatizace polyethylenglykolem může být rovněž specificky prováděna s využitím polymerů rozpustných ve vodě obsahujících alespoň jednu reaktivní hydroxylovou skupinu (například polyethylenglykol), která je schopna reagovat s látkou nesoucí reaktivní karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou skupinu. Při reakci dojde k přeměně hydroxylové skupiny na Michaelův akceptor a tím k vytvoření „aktivovaného linkeru použitelného k modifikaci nej různějších proteinů za účelem vytvoření „vylepšených biologicky aktivních konjugátů. Termín „reaktivní karbonyl, nitril nebo sulfon, používaný v přihlášce, označuje karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou skupinu připojenou ke dvojuhlíkovému řetězci nesoucímu na druhém uhlíku (uhlík odlišný od uhlíku nesoucího karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou
29*· «««· « « · · * · · · · ·« · ·· ·· »· *· skupinu) reaktivní místo použitelné pro specifickou reakci s thiolovou skupinou (WO 92/16221).
Aktivované linkery mohou být monofunkční, bifunkční nebo multifunkční. Užitečnými činidly (použitelnými ve zmíněných postupech) nesoucími reaktivní sulfonovou skupinu jsou (nejenom) chlorsulfon, vinylsulfon a divinylsulfon.
V jednom provedení vynálezu je polymer rozpustný ve vodě aktivován Michaelovým akceptorem. WO 95/13312 popisuje, mezi jinými, polyethylenglykoly (rozpustné ve vodě) aktivované sulfonovou skupinou, které jsou použitelné pro vysoce selektivní připojení ke thiolovým skupinám (namísto, aminoskupin) na molekulách nebo površích. Tyto deriváty polyethylenglykolu jsou odolné (v delším Časovém intervalu) vůči hydrolýze ve vodných prostředích při hodnotách pH přibližně 11 nebo méně a mohou vytvářet vazby s molekulami za vzniku konjugátů, které jsou rovněž odolné vůči hydrolýze. Vazba, kterou jsou spojeny polyethylenglykol a biologicky aktivní molekuly, zahrnuje sulfonovou skupinu připojenou ke thiolové skupině a má strukturu PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, kde písmeno W reprezentuje biologicky aktivní molekulu a kde činidlem nesoucím sulfonovou skupinu je vinylsulfon nebo aktivní ethylsulfon. Dvěma zvláště užitečnými homobifunkčními deriváty jsou PEG-bis-chlorsulfon a PEG-bis-vinylsulfon.
Přihláška US 08/473809, podaná 7. Června, 1995, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu, popisuje způsoby přípravy linkerů s aktivovanou sulfonovou skupinou. Tyto způsoby zahrnují získání sloučeniny nesoucí reaktivní hydroxylovou skupinu a přeměnu této skupiny na reaktivní Michaelův akceptor, čímž je vytvořen aktivovaný linker. Při zmíněné přeměně je jako rozpouštědlo použit tetrahydrogenfuran (THF). Přihláška US 08/611918, podaná 6. března, 1996, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto
0 *· totototo • to • to * · to · · · · • to to ····· · ··· · to · to to · «· · to· ·· ·« ·* vynálezu, popisuje metodu purifikace aktivovaných linkerů, kde tato metoda využívá k separaci linkerů na základě jejich velikosti a povaze koncové skupiny chromatografií na obrácené fázi.
Polynukleotidy
Do rozsahu vynálezu dále spadají polynukleotidy, které kódují IL-lra a varianty IL-lra. Na základě předkládaného popisu a za použití tabulky kodonů může odborník snadno určit všechny nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence IL-lra nebo variant IL-lra.
K přípravě zmíněných polynukleotidů a expresi proteinů kódovaných těmito polynukleotidy mohou být využity rekombinantní techniky popsané dále v textu. Například vložením nukleotidové sekvence kódující IL-lra nebo nějakou z variant IL-lra do vhodného vektoru může odborník snadno připravit velká množství požadované nukleotidové sekvence.
Tyto sekvence mohou být použity k přípravě detekčních sond nebo amplifikačních primerů. Jinou možností je vložení polynukleotidu kódujícího IL-lra nebo nějakou z variant ILlra do expresívního vektoru. Zavedením takto připraveného expresívního vektoru do vhodného hostitele může být produkováno velké množství požadovaného proteinu.
Jak je popsáno v dalším textu, existuje množství dostupných systémů hostitel/vektor použitelných k amplifikaci požadovaných nukleotidových sekvencí a/nebo k produkci požadovaných proteinů. Tyto systémy zahrnují (bez omezení) plazmidy, virové nebo inzerční vektory a prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky. Odborník může přizpůsobit systém hostitel/vektor, použitelný k amplifikaci nebo expresi heterologní DNA, pro produkci nebo expresi sekvencí podle vynálezu.
3.1.
,4 b
Ví r> π Γ' v Oj C C ol c e
Ol ř C- ς
O· t Q t5‘ ty
OJ nr.f ty c ty 0' • I- ty Cí * r «jíhř ·?
íMjol «?♦·;
Odborníci dále zajisté pochopí/Že do rozsahu vynálezu spadají i degenerované nukleotidové sekvence kódující ILlra o sekvencích zobrazených na obrázku 5 a rovněž nukleotidové sekvence, které hybridizují (ve výhodném provedení za podmínek vyžadujících vysokou míru- komplementarity) s komplementárními1 sekvencemi zmíněných nukleotidových sekvencí (Maniatis a další, Molecular Oloning, A Laboratory Manual,. Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, strana-387. až 389,f 1992)., Příkladem takových hybridizačních podmínek1 je hybřidizace.. v pufru'4 χ- SSC při 62 až 67°C následovaná promýváním v,· 0>l x SSC při 62, až, 67 °c po dobu jedné.hodiny.TJiným-příkladem hybridizačních.podmínek vyžadujících vysokou míru komplementarity je hybřidizace v 45 až,.55% formamidu,r 4x SSC'při 40. až 45°C: Do rozsahu vynálezu rovněž Spadají-sekvence DNAř| které hybridizují se sekvencí komplementární k. nukleotidové'.sekvenci zobrazené jako SEK'., JD ·.. Č: 1 za podmínek vyžadujících nižší míru komplementarity. . Vynález se /rovněž týká. sekvencí; kódujících .varianty IL-lra. Příkladem-hybridizačních:ipodmínek vyžadujících nižší►míru komplementarity je hybřidizace v pufru 4 x SSC při 45' až 55°C nebó;hybřidizace v pufru s.přídavkem 30 až 40% 'formamidu při' 40' až 45°C. . ... ’ v
I Do rozsahu.'vynálezu rovněž spadají rekombinantní konstrukty-DNA obsahující' vektorovou DNA spolu se sekvencemi DNA. kódujícími požadované-proteiny. V,každém takovém konstruktu je nukleotidová sekvence kódující požadovaný-protein (s, nebo bez signálního peptidu) funkčně spojena . , . s vhodnou řídící nebo regulační sekvencí umožňující replikaci a/nebo expresi požadovaného proteinu v hostitelské buňce ; ’ .
t r· * říp1 w-
V ·· φ«Φ« ▼▼ -Ό
Φ Φ · Φ Φ Φ · · · · · « Φ φ Φ ΦΦ »*··
Φφφ · β Φ β Φ φ
ΦΦ φ ΦΦ ΦΦ Φ* ··
Exprese rekombinantních proteinů Příprava polynukleotidů
Nukleotidové sekvence kódující IL-lra nebo varianty ILlra mohou být snadno získány různými postupy včetně (nejenom) chemické syntézy, screeningu genomové nebo cDNA knihovny, screeningu expresívní knihovny a/nebo amplifikací cDNA s využitím PCR. Tyto a jiné postupy použitelné k izolaci zmíněných nukleotidových sekvencí jsou uvedeny v publikacích Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labóratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994; Berger a Kimmel, Methods in Enzymology:
Guide to Molecular Cloning Techniques, svazek 152, Academie Press, lne., San Diego, CA. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Chemická syntéza nukleotidových sekvencí může být provedena postupy v současnosti dobře známými; viz. například publikace Engels a další, Angew. Chem. Intl. Ed., svazek 28, strany 716 až 734, 1989; a Wells a další, Gene, 34: strana 315, 1985. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Zmíněné postupy zahrnují, mimo jiné, syntézu nukleotidových sekvencí s využitím fosfotriesterové, fosforamiditové a H-fosfonátové metody. Dlouhé nukleotidové sekvence, například sekvence' delší než přibližně 100 nukleotidů, mohou být syntetizovány ve formě několika fragmentů. Tyto fragmenty mohou být následně spojeny dohromady a tím je vlastně vytvořena nukleotidové sekvence kódující požadovaný protein. Ve výhodném provedení je používána standardní syntéza na polymerním nosiči a fosforamiditový přístup.
V V WW -- -• *' * · '* · ·,·.·· · · · ··«·· · '♦ · ♦ « « « · · · · · »« · ·· ·· «· ··
Jinou možností získání příslušné nukleotidové sekvence je screening vhodné knihovny cDNA (tj. knihovny připravené z jedné nebo více tkání, u kterých se předpokládá, že exprimují daný protein) nebo genomové knihovny (knihovny připravené z celkové genomové DNA). Zdrojem pro cDNA knihovnu je obvykle tkáň z jakéhokoliv organizmu, u něhož se předpokládá, že exprimuje požadovaný protein v dostatečném množství. Zdrojem pro genomovou knihovnu může být jakákoliv tkáň nebo tkáně z jakéhokoliv savce nebo jiného druhu, u něhož se předpokládá, že nese gen kódující požadovaný protein.
Přítomnost DNA kódující požadovaný protein může být v hybridizačních médiích testována pomocí jedné nebo více nukleotidových sond (oligonukleotidů, fragmentů cDNA nebo genomové DNA, které vykazují přijatelnou míru homologie k cDNA nebo genu, který má být klonován), které budou selektivně hybridizovat s cDNA nebo genem (geny) nacházejícími se v příslušné knihovně. Sondy používané pro takové testování (screening) obvykle kódují krátkou oblast sekvence DNA ze stejného nebo příbuzného druhu jako byl organizmus použitý k vytvoření knihovny. Sondy mohou být rovněž degenerované (jak je zmíněno v dalším textu).
Hybridizace je obvykle uskutečněna „nasednutím oligonukleotidové sondy nebo cDNA na klony, a to za takových podmínek, které brání nespecifickým vazbám, ale které umožňují navázání klonů vykazujících značnou míru homologie se sondou nebo primerem. Podmínky hybridizace a promývání hybridizačních membrán částečně závisejí na velikosti (tj. počtu nukleotidů) cDNA nebo oligonukleotidové sondy a na degeneraci sondy. Při volbě hybridizačniho média je rovněž zvažována pravděpodobnost identifikace daného klonu (tj. zda-li je testována cDNA nebo genomová knihovna).
(/ »
• ··♦ • · · ·· » t · · · · » ·« *« ·» ·»
Jestliže je jako hybridizačni sonda použit fragment DNA (jako například cDNA), jsou typickými hybridizačními podmínkami podmínky popsané v publikaci Ausubel a další, 1994, viz. výše. Po hybridizaci je hybridizační médium nahrazeno promývacím roztokem jehož složení závisí na několika faktorech jako například velikosti sondy, předpokládaném procentu homologie sondy a klonu, testovaném hybridizačním médiu, počtu testovaných klonů a podobně. Příklady promývacích roztoků (které zachovávají „našedlé pouze dvojice sonda/klon s vysokou komplementaritou), obvykle o nízké iontové síle a používané při relativně vysokých teplotách, jsou: 0,015 M NaCl, 0,005 M citronan sodný a 0,1% SDS při teplotě 55 až 65 °C; jiný promývací roztok má složení 1 mM Na2EDTA, mM NaHP04, pH 7,2 a 1% SDS při teplotě přibližně 40 až 50°C; další promývací roztok má složení 0,2 x SSC a 0,1%
SDS při teplotě 55 až 60°C.
Existují rovněž postupy pro promývání hybridizačních membrán za podmínek, kdy jsou ke screeningu hybridizačních médií použity oligonukleotidové sondy. První protokol například využívá 6 x SSC s 0,05% difosforečnanu sodného při teplotě v intervalu 35°C až 63°C (v závislosti na délce sondy). Například sondy o 14 bazích jsou promývány při 35 az 40°C, sondy o 17 bazích při 45 až 50°C, sondy o 20 bazích při 52 až 57°C a sondy o 23 bazích při 57 až 63°C. Jestliže je pozorována vysoká intenzita nespecifických vazeb, může být teplota zvýšena o 2 až 3°C. Druhý protokol využívá k promývání chlorid trimethylamonia (TMAC). Jeden takový promývací roztok má složení 3M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,2% SDS.
Další metodou vhodnou k získání požadované nukleotidové sekvence je polymerá.zová řetězcová reakce (PCR) . Při této metodě je za použití reverzní transkriptázy z poly(A)+RNA nebo celkové RNA připravena cDNA. Následně jsou k této cDNA · ««VI ww »-w --- -» • · » · « · * * * • · · · « ··« · · · » * * · · · « * ·· fr »· ·* ·· ·· přidány dva primery, obvykle komplementární ke dvěma odděleným úsekům cDNA (oligonukleotidy) kódujícím požadovaný protein, spolu s nějakou polymerázou jako například polymerázou Taq. Tato polymeráza amplifikuje oblast cDNA nacházející se mezi dvěma použitými primery.
Oligonukleotidové sekvence použité jako sondy nebo primery by měly být přiměřeně dlouhé a dostatečně specifické, aby byly minimalizovány nespecifické vazby, ke kterým může docházet při screeníngu nebo amplifikaci pomocí PCR. Přesná sekvence sond nebo prímerů je obvykle založena na sekvenci konzervativních nebo vysoce homologních oblastí. Sondy nebo primery mohou být rovněž úplně nebo částečně degenerované, tzn., že mohou obsahovat směs sond/primerů, kde všechny kódují stejnou aminokyselinovou sekvenci, avšak s využitím různých kodonů. Alternativou k přípravě degenerovaných sond je umístění inosinu do některých nebo do všech pozic kodonů, které jsou mezidruhově odlišné. Oligonukleotidové sondy nebo primery mohou být připraveny postupy chemické syntézy DNA popsanými v předchozím textu.
Vektory
DNA kódující požadovaný protein může být, za účelem dalšího klonování (amplifikace DNA) nebo za účelem exprese, vložena do vektorů. Vhodné vektory jsou komerčně dostupné nebo mohou být specificky vytvořeny. Volba nebo vytvoření vhodného vektoru bude záviset na (1) bude-li vektor použit k amplifikaci DNA nebo k expresi; (2) velikosti DNA vkládané do vektoru; a (3) hostitelské buňce, která bude tímto vektorem transformována. Každý vektor obsahuje, v závislosti na své funkci {amplifikace DNA nebo exprese DNA) a slučitelnosti s použitou hostitelskou buňkou, různé sekvence. Tyto sekvence obvykle zahrnují (nejenom) jednu nebo více z následujících: signální sekvence, počátek re36 ww 1WI1 -- -- -β t «««· · · · * a a · a ·« · · · · « » « a· a · · a ·*··»· a * a aaaa « a • a a ·* ·· ·· ·· plikace, jeden nebo více genů pro selekční markéry, promotor, posilovač transkripce, terminátor transkripce a podobně. Tyto sekvence mohou být získány z přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány s -využitím známých postupů.
Příkladem vhodných prokaryotických vektorů jsou bakteriofágy jako například bakteriofágy odvozené od bakteriofága lambda nebo plazmidy z E. coli (například pBR322, colEl, pUC, F-faktor a plazmidy odvozené od plazmidu Bluescript1 (Stratagene, LaJolla, CA)). Za tímto účelem mohou být rovněž použity jiné vhodné exprešívní vektory různých typů, které jsou v současnosti používané v kombinaci s hostitelskými buňkami popsanými v dalším textu.
Signální sekvence
Nukleotidová sekvence kódující signální sekvenci může být vložena do místa přiléhajícího k 5' konci sekvence kódující požadovaný protein (signální sekvence například být součástí vektoru nebo může být Částí nukleotidové sekvence kódující požadovaný protein). Nukleotidová sekvence kódující nativní signální sekvenci IL-lra je například známa (přihláška US 5075222).
Počátek replikace
Exprešívní a klonovací vektory obvykle obsahují nukleotidovou sekvenci, která umožňuje replikaci tohoto vektoru v jedné nebo více hostitelských buňkách. V klonovacím vektoru tato sekvence obvykle umožňuje replikaci tohoto vektoru nezávislou na replikaci hostitelské chromozomální DNA a zahrnuje počátek replikace nebo autonomně se replikující sekvenci. Tyto sekvence jsou známy. Počátek replikace z plazmidu pBR322 je vhodný pro většinu Gram-negativních baktérií a různé počátky replikace (například SV40, polyoma, adenovirus, VSV nebo BPV) jsou použitelné pro klonovací • · « · · · · · « · * *44 · · · · · « · · f »·* *44 , _ *444 · 4
4* f ·· 99 ·· ·« vektory savčích buněk. U savčích expresívních vektorů není obvykle počátek replikace potřebný {například počátek replikace SV40 je často používán pouze proto, že obsahuje časný promotor).
Selekční gen
Expresívní a klonovací vektory obvykle obsahují nějaký selekční gen. Tento gen kóduje „selekční markér nezbytný pro přežití a růst transformovaných hostitelských buněk kultivovaných v selekčním médiu. Hostitelské buňky, které nejsou daným vektorem transformovány, nebudou obsahovat selekční gen a nebudou tudíž schopny přežívat v kultivačním médiu. Obvykle využívané selekční geny kódují proteiny, které (a) propůjčují nositeli rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například vůči ampicilinu, neomycinu, methotrexátu nebo tetracyklinu; (b) komplementují auxotrofní deficience buněk; nebo (c) dodávají životně důležité látky, které nejsou dostupné z komplexních médií.
Jiné selekční geny mohou být použity k amplifikaci exprimovaných genů. Amplifikace je proces, při kterém jsou geny nutné k produkci proteinu nezbytného pro růst, v chromozomech následných generací hostitelských buněk tandemově zmnoženy. Příklady vhodných selekčních markérů pro savčí buňky jsou dihydrofolát reduktáza (DHFR) a thymidin kináza. Transformované buňky jsou vystaveny selekčnímu tlaku, kterému jsou schopny přizpůsobit se (a přežít) pouze transformované buňky, a to na základě fungování markérů přítomných ve vektorech. Selekčního tlaku je dosaženo kultivací transformovaných buněk za podmínek, při kterých je koncentrace selekčního agens v médiu postupně měněna, což vede k amplifikaci jak selekčního genu, tak DNA kódující požadovaný protein. Výsledkem je syntéza zvýšeného množství požadovaného proteinu z amplifikované DNA.
·· *»·· ·* ♦· I · ·
I · · · ·
Například buňky transformované selekčním genem pro DHFR jsou nejprve identifikovány kultivací všech transformantů v kultivačním médiu obsahujícím methotrexát, kompetitivního antagonistu DHFR. Při použití DHFR divokého typu jsou vhodnými hostitelskými buňkami linie buněk křečcích ovarií deficientní v aktivitě DHFR (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77(7):4216 až 4220, 1980; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Transformované buňky jsou následně vystaveny zvýšeným koncentracím methotrexátu. To vede k syntéze mnoha kopií genu pro DHFR a současně s tím k syntéze mnoha kopií jiných sekvencí DNA nacházejících se v expresívním vektoru, jako například DNA kódující požadovaný protein.
Promotor
Expresívní a klonovací vektory obvykle obsahují promotor, který je rozpoznáván hostitelským organizmem a je funkčně připojen k nukleotidové sekvenci kódující požadovaný protein. Promotor je nepřekládaná sekvence umístěná proti směru transkripce (5) od startovního kodonu strukturního genu (obvykle ve vzdálenosti 100 až 1000 bp) , která řídí transkripci a translaci dané nukleotidové sekvence jako například sekvence kódující požadovaný protein. Promotory mohou být rozděleny do dvou skupin, inducibilní promotory a konstitutivní promotory. Inducibilní promotor spouští zvýšenou transkripci DNA pod svou kontrolou jako odpověď na přítomnost nebo absenci nějaké nutriční složky nebo změnu teploty. V současnosti je známo velké množství promotorů rozpoznávaných různými potenciálními hostitelskými buňkami. Promotor může být funkčně připojen k DNA kódující požadovaný protein tak, že je štěpením restrikčními enzymy odstraněn promotor ze zdrojové DNA a tento je nahrazen požadova39.....
• to totototo • to to ··· · to « « ·» to toto··· ··*· toto· ··*· · « «· to *· ·· Oto toto nou promotorovou sekvencí. Promotorové sekvence nativního IL-lra může být použita k řízení amplifikace a/nebo exprese DNA kódující tento protein. Ve výhodném provedení je nicméně používán heterologní promotor a to za předpokladu, že umožňuje, ve srovnání s nativním promotorem, dosažení silnější transkripce a větších výtěžků exprimovaného proteinu, a že je kompatibilní se zvoleným hostitelským systémem.
K řízení amplifikace a/nebo exprese DNA kódující IL-lra může být například použita jakákoliv z nativních promotorových sekvencí jiných zástupců rodiny IL-1.
Promotory vhodné pro použití v prokaryotických hostitelích zahrnují promotorové systémy beta-laktamázy a laktózy; promotorové systémy alkalické fosfatázy a tryptofanu (trp); systém genu bakteriální luminiscence (luxR) a hybridní promotory jako například promotor tac. Jiné známé bakteriální promotory jsou rovněž použitelné. Nukleotidové sekvence promotorů byly publikovány a odborník tudíž bude schopen za použití linkerů nebo adaptorů (které obsahují požadovaná restrikční místa) připojit tyto promotory k požadované sekvenci (sekvencím) DNA.
V současnosti jsou dobře známy promotorové sekvence pro použití v buňkách kvasinek. Promotory vhodné pro použití v savčích buňkách jsou v současnosti rovněž známy a zahrnují sekvence získané z genomů jako například polyoma víru, viru planých neštovic (varicela), adenoviru (jako například adenoviru 2), bovinního papilloma viru, viru způsobujícího vznik sarkomů u ptáků, cytomegaloviru, nějakého retroviru, viru hepatitidy typu B a ve výhodném provedení viru SV40 (Simian virus 40). Jinými vhodnými savčími promotory jsou heterologní savčí promotory, například promotory heat-shock proteinů a promotor aktinu.
~ 40— -4 4 4 4
4 4 444 4444 *4 4 44444 4 44 4
4«t 4444 4 4
4* 4 44 44 44 00
Posilovače transkripce (enhancery)
Expresívní a klonovací vektory obvykle obsahují sekvenci posilovače transkripce, která u vyšších eukaryot vede zvýšení intenzity transkripce sekvence DNA kódující požadovaný protein. Posilovače transkripce jsou elementy DNA fungující v pozici cis (pozn. tj. na stejném vláknu DNA, na němž je i sekvence kódující požadovaný protein), které jsou obvykle dlouhé 10 až 300 bp, a které ovlivňují promotor tak, aby docházelo ke zvýšení intenzity transkripce. Posilovače transkripce jsou relativně nezávislé na orientaci a umístění. Mohou se nalézat proti i po směru transkripce od transkripční jednotky. Kvasinkové posilovače transkripce jsou ve výhodném provedení používány spolu s kvasinkovými promotory. Je známo několik sekvencí posilovačů transkripce· ze savčích genů {například genů kódujících globin, elastázu, albumin, alfa-feto protein a insulin).
Příkladem posilovačů transkripce použitelných k aktivaci eukaryotických promotorů jsou rovněž virové posilovače transkripce, jako například posilovač transkripce SV40, posilovač transkripce časného promotoru cytomegaloviru, posilovač transkripce polyoma viru a posilovače transkripce adenoviru. I když mohou být posilovače transkripce umístěny jak proti směru transkripce, tak i po směru transkripce od DNA kódující požadovaný protein, obvykle jsou umístěny proti směru transkripce od promotoru.
Terminátor transkripce
Expresívní vektory použité v eukaryotických hostitelských buňkách obvykle obsahují sekvenci nezbytnou k ukončení transkripce a ke stabilizaci mRNA. Takové sekvence mohou být obvykle získány z 5' (a příležitostně 3') konců nepřekládaných oblastí eukaryotických DNA nebo cDNA.
Tyto oblasti obsahují nukleotidové sekvence přepisované
..—41 -
jako polyadenylační fragmenty v nepřekládané části mRNA kódující požadovaný protein.
Konstrukce vektorů
Vytvoření vhodných vektorů, z nichž každý obsahuje jednu nebo více z výše uvedených sekvencí (spolu se sekvencí kódující požadovaný protein), může být uskutečněno pomocí standardních ligačních reakcí. Izolované plazmidy nebo fragmenty DNA jsou restrikčně Štěpeny, upraveny a v požadovaném pořadí ligovány tak, aby byl vytvořen daný vektor. Za účelem potvrzení vytvoření požadované sekvence, může být ligační směs použita k transformaci buněk E. coli a transformanty mohou být selektovány pomocí známých postupů popsaných výše. Z transformovaných buněk jsou připravena větší množství příslušného vektoru a štěpením restrikčními endonukleázami a/nebo sekvenací je potvrzena přítomnost požadovaného konstruktu.
Může být rovněž použit vektor sloužící k transientní expresi DNA kódující požadovaný protein v savčích buňkách. Obecně lze říci, že transientní exprese zahrnuje použití expresívního vektoru, který je v hostitelské buňce schopen účinné replikace a tím dochází k akumulaci mnoha kopií tohoto vektoru v dané hostitelské buňce, a následně je syntetizováno velké množství požadovaného proteinu kódovaného expresívním vektorem. Každý transientní expresívní systém zahrnující vhodný expresívní vektor a hostitelskou buňku umožňuje snadnou pozitivní identifikaci proteinů kódovaných klonovanými DNA, jakož i rychlý screening požadovaných biologických nebo fyziologických vlastností těchto proteinů, tj.. identifikaci biologicky aktivních variant IL-lra.
Hostitelské buňky
Do rozsahu vynálezu rovněž spadá množství rekombinantních hostitelských buněk, které obsahují nukleotidovou sekvenci použitelnou k expresi požadovaného proteinu. Příkladem prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk jsou bakteriální, savčí, rostlinné a hmyzí buňky a buňky kvasinek a hub.
Prokaryotické hostitelské buňky zahrnují (výčet není limitující) eubaktérie jako například Gram-negativní nebo Gram-pozitivní organizmy (například E. coli (HB101, DH5a, DH10 a MC1061); zástupce rodu Bacillus jako například B. subtilis; zástupce Pseudomonas jako například P. aeruginosa; Streptomycety; Salmonella typhimurium; nebo Serratia marcescans). V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován v E. coli.
Mimo prokaryotických hostitelských buněk mohou být jako hostitelské buňky vhodné pro expresi požadovaného proteinu použity eukaryotické mikroorganizmy jako například filamentózní houby nebo kvasinky. Mezi nižšími eukaryotickými hostitelskými mikroorganizmy jsou nejčastěji používány pekařské kvasnice (Saccharomyces cerevisiae), nicméně dobře popsané a snadno dostupné jsou i jiné rody, druhy a kmeny.
Požadovaný protein může být v glykosylované formě exprimován jakoukoliv z velkého počtu vhodných hostitelských buněk odvozených z mnohobuněčných organizmů. Tyto hostitelské buňky jsou schopny komplexního processingu a provádějí glykosylaci. V principu může být použita jakákoliv buněčná kultura z vyšších eukaryotických buněk, a to jak buněk obratlovců tak bezobratlých, včetně rostlinných a hmyzích buněk. V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován s využitím bakulovirového systému.
.........-,---.--43----—---Q <1 i·· 0 »·,»;
«Τ ·': č il ř .·;
•d j? ť.
<ίπ fi i» ft ft i'·
Μ Μ «Ί »' r r: «;
»! lír i: ·· ť b' ipi! f; r fi ř - íi ♦:
L W i“ Γ «' 4':
ΙΪ «i .· »' < «11 ť,? «· ♦ * · i :
<i ♦ »' i1 «' 4'
Jelikož je kultivace buněk obratlovců (tkáňová kultura) známým postupem,* mohou .být tyto-buňky používány. Příkladem použitelných savčích hostitelských buněčných linií jsou (nejenom) linie.CV1 odvozená z opičích ledvin transformovaná SV40 (COS-7), buněčná linie odvozená z ledvin lidského , embrya (buňky 293 nebo buňky 293 upravené za účelem kultivace v suspénzní kultuře), ledvinné buňky mláďat křečků nebo buňky křeččích ovarií1. Dalšími vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou (výčet není .limitující) buňky HeLa, myší buňky L-929, linie 3T3 odvozené *z. myší- Swiss, Balb-c nebo NIH,t a křečci, buněčné linie· BHK a HaK.}V charakteristickém provedení^ vynálezu .může být:požadovaný protein exprimován V:.buňkách COS.·: . .. l ,ť v . .
t. «. Hostitelské .buňky., mohou býttransformovány a ve výhodném·. provedení/transfekovány požadovanou nukleovou kyselinou/; a to za vhodných podmínekíumožňujících- expresi, této nukleotidové: sekvence.. Výběr;.vhodných: hostitelských buněk: a způsoby transformace,, kultivace; 'tamplifikace^testování (screeningu): a .produkce a purifikace produktů jsou'
V;současnosti dobře známy (Gething aSambrook, Nátuře, 293: 620.až 62.5, 1981; nebo alternativně .Kaufman a další, Mol. Cell / Biol, 5(7) 1750,až 1759, 1985;. nebo přihláška US
4419446. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do.popisu tohoto /vynálezu). Savčí buňky bez. buněčné stěny mohou být například transfekovány postupem využívajícím precipitaci s fosforečnanem.vápenatým'. K transfekci může.být rovněž-použita.elektroporace,. mikroinjekce a jiné,známé techniky. · - , -- , .
Požadovaný protein může být rovněž.produkován homologní rekombinací' nebo' pomocí'rekombinantníchr postupů využívajících zavedení řídících prvků do· buněk, které jižjobsahují DNA kódující požadovaný protein;· Homologní rekombinace je technika původně vyvinutá ke směrování genů zavádějících ·· φ* · ·· «· φ · · · · φ φ • « φ«ΦΦ φ φ· · φ φ φ φ » φ
Φ Φ · ΦΦ φ φ Φ9 ΦΦ nebo odstraňujících mutace v transkripčně aktivních genech (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 6:
301, 1989; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Základní metoda byla vyvinuta za účelem zavedení specifických mutací do daných oblastí savčího genomu (Thomas a další,
Cell, 44: 419 až 428, 1986; Thomas a Capecchi, Cell, 51;
503 až 512, 1987; a Doetschman a další, Proč. Nati. Acad.
Sci. USA, 85: 8583 až 8587, 1988; tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu) nebo za účelem opravy určitých mutací v defektních genech (Doetschman a další, Nátuře, 330: 576 až 578, 1987; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu).
Příklady takových postupu jsou popsány v přihlášce US 5272071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 a WO 94/31560. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Při homologní rekombinaci může být sekvence DNA, která má být vložena do genomu, směrována do požadované oblasti daného genu připojením ke směrující DNA. Směrující DNA je sekvence DNA komplementární (homologní) k nějaké oblasti genomové DNA. V průběhu replikace genomové DNA se malé části směrující DNA, které jsou komplementární k dané oblasti genomu, dostanou do kontaktu s rodičovským řetězcem genomové DNA. Obecnou vlastností DNA zavedené do buněk je její schopnost hybridizace a následné rekombinace s jinými částmi endogenní DNA, a to prostřednictvím sdílených homologních oblastí. Je-li takový komplementární řetězec připojen k oligonukleotidu obsahujícímu mutaci nebo jinou sekvenci DNA, je tento oligonukleotid, jako důsledek rekombinace, rovněž začleněn do nově syntetizovaného řetězce. Dů- ... . sledkem proofreadingu (korektury při syntéze DNA) je
45-------skutečnost, že nová sekvence DNA může sloužit jako templát pro syntézu dalšího řetězce. Transfekovaná DNA je tudíž začleněna do genomu.
Je-li sekvence příslušného genu známa (například nukleotidová sekvence požadovaného proteinu), může být sekvence řídící expresi (úsek DNA komplementární ke zvolené oblasti daného genu) syntetizována nebo získána jiným způsobem (například vhodným restrikčním štěpením nativní DNA v místech sousedících s danou oblastí). Tento úsek DNA slouží po zavedení do buňky jako směrující sekvence a bude hybridizovat s homologní oblastí v genomu. Nastane-li tato hybridizace během replikace DNA, bude zmíněný úsek a jakákoliv sekvence k tomuto úseku připojená, fungovat jako Okazakiho fragment a bude přepsán do nově syntetizovaného dceřiného řetězce DNA.
K úsekům směrující DNA jsou připojeny oblasti DNA, které mohou ovlivňovat expresi požadovaného proteinu. Do genomu příslušné hostitelské buňky je například vložen, v místě a orientaci vhodné k ovlivnění transkripce DNA kódující požadovaný protein, prvek promotor/posilovač transkripce, supresor nebo exogenní prvek modulující transkripci. Tento řídící prvek nekóduje požadovaný protein, ale namísto toho řídí transkripci části DNA přítomné v genomu hostitelské buňky. Exprese požadovaného proteinu není tudíž dosaženo transfekcí DNA kódující tento protein, ale použitím směrující DNA (obsahující úseky homologní k oblastem požadovaného endogenního genu) připojené k regulačním segmentům, které poskytují sekvenci endogenního genu signály rozpoznávané při transkripci daného proteinu.
Kultivace hostitelských buněk
Způsoby kultivace jednotlivých druhů rekombinantních hostitelských buněk používaných k produkci požadovaného ·· φφφφ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φφφ φφφφ φ φ « φ « φφφ * φ φ φ φφφ Φ*·Φ φ φφ φ φφ φφ φφ φφ proteinu se budou lišit v závislosti na množství faktorů a úvah; optimální postup pro produkci požadovaného proteinu bude odborníkům v dané situaci zřejmý a může být stanoven bez přílišného experimentování. Rekombinantní hostitelské buňky jsou kultivovány ve vhodném médiu a exprimovaný protein může být z kultivačního média (nebo z buněk, je-li exprimován intracelulárně) izolován a purifikován s využitím vhodných technik odborníkům známým.
Rekombinantní buňky sloužící k produkci požadovaného proteinu mohou být kultivovány v médiu vhodném k indukci promotorů, selekci vhodných rekombinantních hostitelských buněk nebo k amplifikací genu kódujícího požadovaný protein. Do kultivačních médií můžou být (je-li to nezbytné) přidány hormony a/nebo jiné růstové faktory (například,in< pl sulin, transferin nebo epidermální růstový faktor), soli (například chlorid sodný, ionty vápníku, hořčíku nebo fosforečnanový anoin), nukleosidy (například adenosin a thymidin), antibiotika (například gentamícín), stopové prvky (definované jako anorganické sloučeniny obvykle přítomné mikromolárních koncentracích) a glukóza nebo jiné zdroje energie. Odborníkům je rovněž zřejmé, že do kultivačních médií mohou být ve vhodných koncentracích přidány rovněž další sloučeniny. Odborníci rovněž dobře znají vhodné podmínky kultivace (jako například teplota, pH a podobně) zvolených hostitelských buněk.
Vzniklý produkt exprese může být následně purifikován téměř do homogenity za použití postupů v současnosti známých. Příklady způsobů purifikace jsou popsány v přihláškách US 5075222 a WO 91/08285. Ve výhodném provedení je produkt exprese produkován v podstatě čisté formě. Termínem v podstatě Čistý je označována skutečnost, že v nemodifikované formě má IL-lra poměrně vysokou specifickou aktivitu, ve výhodné provedení v intervalu přibližně • 9 ·4 »4 ·· ·« 4 · « a · · · * • · · · · ··· · · · • · f · » 4 · · * •44 44 44 »···
150000 až 500000 jednotek receptorů/mg, jak je definováno v publikacích Hannum a další, Nátuře, 343: 336 až 340,
1990; a Eisenberg a další, Nátuře, 343: 341 až 346, 1990.
Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Je rovněž zřejmé, že jednotlivé varianty IL-lra mohou mít rozdílné specifické aktivity.
Farmaceutické přípravky
Farmaceutické přípravky budou obvykle obsahovat terapeuticky účinné množství (alespoň jednoho z následujících)
IL-lra, nějaké varianty IL-lra nebo jejich chemických derivátů (souborně v této přihlášce označované jako produkt
IL-lra), spolu s látkou sloužící k řízenému uvolňování, * < >
v optimálním případě v nějakém vehikulu. Vehikulum ve výhodném provedení zahrnuje jednu nebo více farmaceuticky a fyziologicky přijatelných látek pro formulaci přípravků obsahujících produkt IL-lra a látku pro řízené uvolňování.
Polymer pro řízené uvolňování může být vybrán ze skupiny zahrnující polymery erodující (rozpadající se) v celém objemu (například kopolymery kyselina polymléčná/kyselina polyglykolová (PLGA), polymerní směsi PLGA, blokové kopolymery polyethylenglykolu a kyseliny mléčné a glykolové, póly (kyanoakryláty); polymery erodující (rozpadající se) pouze v povrchové vrstvě (například polyanhydridy a polyorthoestery); estery hydrogelů (například polyoly Pluronic, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, kopolymery anhydrid kyseliny maleinové/alkylvinylether, póly(2hydroxymethylmetakrylát) (pHEMA), kyselina metakrylová (MAA), směsi pHEMA a MAA, celulóza (například karboxymethylcelulóza); hyaluronát, alginát, kolagen, želatina, albumin a škroby a dextrany) a směsi výše uvedených sloučenin; přípravky na bázi lipozomů nebo mikročástice. Výše . ..48—_
Φ· ΦΦ·Φ ·· ·· ·· φφ • · · φ φ · φ · · • · · φ · »·· * · φ'.
• · φ · · * · *· φ φφ φφ ·· *· uvedené sloučeniny (a jejich směsi) mohou ovlivnit fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearence in vivo proteinů podle vynálezu a jejich derivátů. Optimální složení farmaceutického přípravku pro požadovaný protein bude odborníkem určeno v závislosti na způsobu podávání a požadovaném dávkování. Příklady farmaceutických přípravků jsou popsány v publikacích Gombotz a Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 až 351, 1995; a Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. 'vydání, Mack Publishing Co., Easton,
PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Specifické směsi pro řízené uvolňování jsou dostupné od následujících dodavatelů: DepoTech
Corp., San Diego, CA (Depofoam’*, multivesikulárnř?liposomy) ♦ <
a Alkermes, lne., Cambridge, MA (ProLease™, mikročástice PLGA).
Jedno charakteristické provedení vynálezu popisuje systémy pro aplikaci léčiva založené na použití hyaluronátu, a to v rozpustné nebo nerozpustné, zesíéované formě. Termín hyaluronát používaný v této přihlášce zahrnuje hyaluronát, kyselinu hyaluronovou, její soli (například hyaluronát sodný), estery, ethery, enzymaticky připravené deriváty a zesífované gely kyseliny hyaluronové a chemicky modifikované deriváty kyseliny hyaluronové (například hylan). Nemodifikovaná nebo modifikovaná kyselina hyaluronová slouží jako nosič, který umožňuje řízené uvolňování léčiva z daného systému.
Použitým hyaluronátem může být jakýkoliv typ hyaluronátu v současnosti za těmito účely využívaným. Hyaluronát může být extrahován z různých zdrojů jako například kohoutí ch hřebínků, pupečníkových šňůr nebo bakteriálních kultur jako například hemolytických streptokoků skupiny A nebo C. Příklady jednotlivých forem hyaluronátu jsou uvedeny ·* ·««· ♦ · · «·· ··»» ♦ 9 · · · ··· · · ♦ · ··· ···· * · «· « 4» ·· ·· «« v publikacích Peyron a Balazs, Path. Biol., 22 (8) :731 až 736, 1974; Isdale a další, J. Drug Dev.,(2):93 až 99, 1991; Larsen a další, Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129 až 1134, 1993; Namiki a další, International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology,
20(11):501 až 507, 1982; Meyer a další, Journal of Controlled Release, 35:67 až 72, 1995; Kikuchi a další, Osteoarthritis and Cartilage, 4:99 až 110, 1996; Sakakibara a další, Clinical Orthopaedics and Related Research, 229:282 až 292, 1994; Meyers a Brandt, 22(9):1732 až 1739, 1995; Laurent a další, Acta Orthop Scand, 66(226):116 až 120, 1995; Cascone a další, Biomaterials, 16(7):569 až 574, 1995; Yerashalmi a další, Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267 až 273, 1994; Bernatchez a další, Journal of Biomedical Materials Research, 27(5) :*677 až 681, 1993; Tan a další, Australian Journal of Biotechnology, 4(1):38 až 43, 1990; Gombotz a Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 až 351, 1995; přihláška US. 4582865, 4605691, 4636524,
4713448, 4716154, 4716224, 4772419, 4851521, 4957774,
4863907, 5182326, 5202431, 5336767, 5356883, Evropská patentová přihláška 0507604A2 a 0718312A2; a WO 96/05845.
Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Hyaluronát by měl být používán v takové čistotě, aby v organizmu savce podstupujícího léčbu nevyvolával žádné nepříznivé nebo toxické reakce. To znamená, že by měl být zbaven pyrogenů, a měl by obsahovat pouze tak malé množství proteinů a/nebo nukleových kyselin (se kterými je přirozeně asociován), aby nevyvolával výraznou imunitní odpověď organizrnu. Vhodné postupy purifikace hyaluronátu jsou popsány v přihláškách US 4141973, 5411874, 5442053, 5559104,
5563051 a japonských přihláškách číslo 14594/1977,
67100/1979 a 74796/1980. Tyto přihlášky jsou zde uvedeny
50“ φφ φφφφ ·· ·φ φ φ φ φ φ · • · φ · · φφφ ♦ · · · φ ·. · φφ φ φφ φφ φφ *
φφ záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Hyaluronát může být použit ve formě volné kyseliny nebo ve formě jakékoliv farmaceuticky přijatelné soli. Jako sůl hyaluronátu je možné zmínit sůl alkalických kovů jako například sodnou nebo draselnou sůl a sůl kovů alkalických zemin jako například vápenatou nebo horečnatou sůl. Ve výhodné provedení je zdrojem hyaluronátu kultura vhodného mikroorganizmu.
Ve vynálezu může být použit hyaluronát o molekulové hmotnosti spadající do širokého intervalu. Molekulová hmotnost hyaluronátu se obvykle pohybuje v rozmezí Ο,ΙχΙΟ6 až lxlO7, ve výhodném provedení v rozmezí 0,5xl06 až 5xl06, výhodněji pak v rozmezí lxlO6 až 5xl06 a nejvýhodněji v intervalu 1x10 až 4x10 (například v intervalu 1x10 až 2xl06) .
Zvýšení molekulové hmotnosti hyaluronátu zesilováním může být provedeno mnoha způsoby. V přihlášce US 4716224 popisuje Sakuria a další zesilovanou kyselinu hyaluronovou a její soli připravené zesilováním kyseliny hyaluronové nebo jejich solí prostřednictvím polyfunkčního epoxidu.
V přihlášce US 4863907 popisuje Sakuria a další zesilované glykosaminoglykany nebo jejich soli připravené zesilováním glykosaminoglykanů nebo jejich solí prostřednictvím polyfunkční sloučeniny epoxidu. V evropské přihlášce 0507604A2 popisuje Huang a další iontově zesítované polysacharidy obsahující karboxylové skupiny, kde látkou použitou k tomuto zesíťování byla sloučenina s trojmocným kationtem.
V přihláškách US 4716154 a US 4772419 popisuje Malson a další zesilováni kyseliny hyaluronové prostřednictvím binebo polyfunkčních epoxidů nebo odpovídajících halohydrinů, epihalohydrinu nebo halidů, a divinylsulfonu. V přihlášce US 4957744 popisuje della Valle a další zesilované estery
4« «444
4· 4· 44 *4 · · · 4 4 · 4 * · « · · 4 4 · · · > · 4
4 * 4 444 4 4 ·· « «4 ·· 44 44 kyseliny hyaluronové připravené esterifikací karboxylových skupin kyseliny hyaluronové vícesytnými alkoholy.
V přihláškách US 4582865, US 4605691 a US 4636524 popisuje Balazs a další zesífování kyseliny hyaluronové a jejich solí a jiných polyšacharidů prostřednictvím reakce s divinylsulfonem. V přihláškách US 5128326 a US 4582865 popisuje Balazs a další zesířování kyseliny hyaluronové pomocí formaldehydu, epoxidů, polyaziridylových sloučenin a divinylsulfonu. V přihlášce US 4713448 popisuje Balazs a další chemickou modifikaci kyseliny hyaluronové prováděnou reakcí s aldehydy, jako například formaldehydem, glutaraldehydem a glyoxalem, a rovněž uvádí možnost vzniku zesilovaných produktů. V přihlášce US 5356883 popisuje Kuo a další zesíúování kyseliny hyaluronové reakcí s biskarbodiimidy. V EP 07Í8312A2 popisuje Nguyen zesířování kyseliny hyaluronové nebo jejích solí a jiných polyšacharidů reakcí s di- nebo polyanhydridy.
V závislosti na konečném použití produktu může být koncentrace hyaluronátu v těchto produktech (vzhledem k rozpustným polymerům) v intervalu přibližně 0,5¾ až 5% (hmotnostně) nebo více, ve výhodném provedení v rozmezí 0,1% až 4% (hmotnostně) a výhodněji pak v rozmezí 1% až 3% (hmotnostně). Koncentrace inhibitoru IL-1 se může pohybovat v širokém rozmezí a ve výhodném provedení by měla být zvolena v závislosti na rozpustnosti daného inhibitoru IL-1, na jeho farmakologické aktivitě, požadovaných účincích koncového produktu a podobně.
Zesilovaný hyaluronát je obvykle rozpuštěn v nějakém rozpouštědle (například fyziologickém roztoků) na takovou viskozitu, aby vzniklý roztok (gel) mohl procházet injekční jehlou. Materiál o nízké viskozitě velmi usnadňuje injekční podávání například tím, že umožňuje použití koncentrovaných vodných roztoků hyaluronátu v dávkách o praktické velikos52 * »w·· ·· «« • * · · • · « · · >♦· · · · · € · · · · » · · · ·« ·· ·· ·« · · ti. Jestliže je viskozita 1% vodného roztoku hyaluronátu při 37°C nižší než přibližně 200 c/s (stanoveno pomocí Cannon-Manningova semímikroviskozimetru postupy popsanými v ASTM D 445 a D 2515) může být tento roztok snadno použit v dávkách pro injekční aplikaci o objemu přibližně 10 mililitru, kde každá z těchto dávek obsahuje přibližně 100 miligramů aktivní složky.
Systémy pro aplikaci léčiva podle vynálezu obsahují následující složky:
1) roztoky hyaluronátu s rozpuštěnou nebo dispergovanou léčivou látkou;
2) gel na bázi zesilovaného hyaluronátu vytvářející makromolekulám! klec, ve které je léčivá látka dispergována;
3) gel na bázi směsi zesilovaného hyaluronátu spolu s přinejmenším jedním dalším hydrofilním polymerem, v němž je léčivá látka dispergována; a
4) gel na bázi zesilovaného hyaluronátu nebo gel na bázi směsi zesilovaného hyaluronátu spolu s přinejmenším jedním dalším hydrofilním polymerem obsahující léčivou látku, která je kovalentně připojena k makromolekule kyseliny hyaluronové nebo dalšího použitého polymeru.
Existuje několik způsobů smíchání léčivé látky a gelu a z toho vyplývá, že může být získáno několik typů produktů.
Jeden z těchto způsobů zahrnuje difundování léčivé látky do gelu, je-li tento gel umístěn do roztoku zmíněné léčivé látky. Difúze je obvykle velmi pomalá a závisí na koncentraci léčivé látky, teplotě roztoku, velikosti částic tvořících gel a podobně. Produktem získaným tímto postupem je gel, v němž je léčivá látka rovnoměrně dispergována.
Produkt stejného typu může být připraven dehydratací gelu na bázi hyaluronátu a následnou rehydratací tohoto gelu roztokem léčivé látky. K dehydrataci gelu může být
4»
4 · 4 4 f 4 4 4 • 4 4 4 444* 4 44
44« 4 4 4 4 4
4 «4·· 4« 44 použito organické rozpouštědlo mísitelné s vodou nebo může být voda z gelu odstraněna sušením. Ve výhodném provedení je nicméně využíváno rozpouštědla, nebolí po vysušení při nízké nebo zvýšené teplotě nelze dosáhnout nabobtnání gelu odpovídajícímu počátečnímu stavu. Na druhé straně, po dehydrataci prováděné pomocí rozpouštědla je možné dosáhnout nabobtnání gelu na objem odpovídající objemu gelu před dehydratací. Ve výhodném provedení jsou jako rozpouštědla používány ethanol a izopropanol a ketony jako například aceton. Mohou být nicméně použita i jiná rozpouštědla.
K získání produktů tohoto typu může být využit ještě jiný postup. Při tomto postupu je koncentrovaný gel kyseliny hyaluronové vzniklý zesífovací reakcí prováděnou v poměrně koncentrovaném roztoku hyaluronátu ponechán bobtnat v roztoku léčivé látky, . ;.s,
Ačkoliv pomocí všech tří zmíněných metod je možné získat v podstatě totožné produkty, každá z těchto metod má, ve srovnání se dvěma zbývajícími metodami, určité výhody při přípravě určitého produktu, a tudíž volba použité metody by měla záviset na úvahách beroucích v potaz takové parametry jako charakter léčivé látky, požadovaná koncentrace léčivé látky v systému, rychlost uvolňování léčivé látky a podobně.
Za účelem získání roztoku hyaluronátu s rozpuštěnou nebo dispergovanou léčivou látkou může být využit jakýkoliv konvenční postup. Hyaluronát získaný z jakéhokoliv zdroje může být rozpuštěn ve vodě nebo fyziologickém roztoku na požadovanou koncentraci a v takto připraveném roztoku může být léčivá látka rozpuštěna nebo dispergována. Jinou možností je smíchání roztoku nebo disperze léčivé látky s roztokem hyaluronátu. Koncentrace polymeru je volena v závislosti na výsledném použití připraveného produktu a
4 4*41 9*9 • 9 9 *«·*« · · · • · i * * * 4 · ·· · «« 4 · *· ♦ · molekulové hmotnosti hyaluronátu. Zvolená koncentrace léčivé látky závisí na požadované aktivitě výsledného produktu.
Za účelem naplnění zesilovaného nabobtnaného gelu léčivou látkou difúzí, muže být tento gel umístěn do roztoku dané léčivé látky. Čas nutný k dokončení tohoto procesu závisí na velikosti částic gelu, poměru objemu nabobtnaného gelu k objemu původního vzorku, teplotě, intenzitě míchání, koncentraci léčivé látky v roztoku a podobně. Vhodnou volbou kombinace těchto parametrů může být naplnění nabobtnaného gelu léčivou látkou dosaženo v poměrně krátkém čase.
Za účelem dehydratace zesilovaného gelu pomocí nějakého rozpouštědla je dostačující umístit tento gel v jakékoliv formě (například malých částic nebo ve formě membrány) do rozpouštědla, ve výhodném provedení těkavého rozpouštědla (například izopropanolu) , a ponechat ho v tomto rozpouštědle dostatečně dlouho, aby došlo k odstranění vody z daného gelu. Množství odstraněné vody závisí na velikosti částic nebo tloušťce membrány, poměru gel/rozpouštědlo a podobně. Je-li to žádoucí, může být působení rozpouštědlem opakováno několikrát. Rozpouštědlo může být z gelu odstraněno sušením za normálního tlaku nebo při pokojové nebo zvýšené teplotě ve vakuu. Tímto způsobem dehydratovaný gel nabobtná po vložení do roztoku léčivé látky na původní objem.
Přípravky hyaluronátu jsou dostupné od následujících dodavatelů: BioMatrix, lne., Ridgefield, NJ (Synvisc™, směs hylanu ve formě kapaliny a hylanu ve formě gelu v poměru 90:10); Fidia S.p.A., Abano Terme, Itálie (Hyalgan™, sodná sůl kyseliny hyaluronové pocházející z hřebínků kohoutů (molekulová hmotnost přibližně 500000 až 700000)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japonsko (Artz™, 1¾ roztok kyseliny hyaluronové pocházející z hřebínků kohoutů (molekulová hmotnost přibližně 700000)); Pharmacia AB, Stockholm, Švédsko (Healon™, kyselina hyaluronové pocházející •to to»·· • to toto toto toto ·· ·*·· ···· • to · ·· tototo · · to to to «· ·· to# toto ··· ··* »· ···« » · • to 4 ·· ·· »· ·» z hřebínků kohoutů, molekulová hmotnost přibližně 4xl06) ; Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoať”, rekombinantní kyselina hyaluronová); Pronova Biopolymer, lne,, Portsmouth, NH (kyselina hyaluronová FCH, vysokomolekulární (molekulová hmotnost přibližně 1,5 až 2,2 x 106) , kyselina hyaluronová připravená z kultur Streptococcus zooepidemicus; hyaluronát sodný MV, molekulová hmotnost přibližně 1,0 až 1,6 x 106, a hyaluronát sodný LV, molekulová hmotnost přibližně 1,5 až 2,2 x 106) ; Calbiochem-Novabiochem AB,
Lautelfingen, Švýcarsko (kyselina hyaluronová, sodná sůl (katalogové číslo (rok 1997) 385908) připravená z mikroorganizmů rodu Streptococcus); Intergen Company, Purchase, NY (kyselina hyaluronová pocházející z hřebínků kohoutů, molekulová hmotnost vyšší než 1 x 10e) ; Diosynth lne., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ a Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japonsko.
Primární rozpouštědlo ve vehikulu může být svým charakterem vodné nebo nevodné. Vehikulum může navíc obsahovat další farmaceuticky přijatelné pomocné látky k modifikaci nebo udržování pH, ve výhodném provedení v rozmezí hodnot 6,0 až 7,0, výhodněji pak na hodnotě 6,5 (například pufry jako citronany, fosforečnany nebo aminokyseliny jako například glycin); plniva pro lyofilizované přípravky (například manitol nebo glycin); látky k modifikaci nebo udržování osmolarity (například manitol nebo chlorid sodný); povrchově aktivní látky (například polysorbát 20, polysorbát 80,
1«
Triton, Pluronic); viskozity; čirosti; barvy; sterility; stability (například sacharóza a sorbitol); antioxidanty (například siřičitan sodný nebo hydrogensiřičitan sodný); konzervační látky (například kyselina benzoová a kyselina salicylová); vůni přípravku; ochucovadla a ředící látky; rychlost rozpouštění (například solubilizátorý nebo solubilizují látky jako například alkoholy, polyethylenglykoly a —
• · »·«· *· · · · ·· • · · · · · ···· ♦ · · ····· ···· • · · 9 · · · « · ♦ · · · · ·· ·♦ ·· chlorid sodný); rychlost uvolňování; emulsifikátory; suspenzační Činidla; rozpouštědla; plniva; aplikační vehikula; zřeďovadla; pomocné látky a/nebo farmaceutické adjuvans. Optimální složení farmaceutického přípravku pro požadovaný protein bude odborníkem stanoveno v závislosti na způsobu aplikace a požadovaném dávkování (viz. například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Charakteristické farmaceutické přípravky mají následující složení: 10 mM citronan sodný, 140 mM chlorid sodný, 0,5 mM EDTA, 0,1% polysorbát 80 ve vodě (hmotnostně), pH 6,5 (přípravek s citronanovým pufrem); a 10 mM fosforečnan sodný, 140 mM chlorid sodný, 0,01% až 0,1% polysorbát 80 ve vodě (hmotnostně) a volitelně 0,5 mM EDTA, pH 6,5 (přípravek s fosforečnanovým pufrem).
Ve výhodném provedení vynálezu je IL-lra (ve formě jemných částic) rozpuštěn nebo rozsuspendován v 0,1% až 5% (w/v; hmotnost na objem) roztoku hyaluronátu nebo solí kyseliny hyaluronové (například hyaluronátu sodného), a to jako suchý prášek nebo rozpuštěný ve vodě nebo ve vodném rozpouštědle (například fyziologických roztocích jako například nějaké sodné soli rozpustné ve vodě, 3 až 5% roztocích glukózy a 3 až 5% roztocích xylitolu a přípravcích s citronanovým nebo fosforečnanovým pufrem). Hyaluronát a IL-lra mohou být smíchány různými postupy jako například vstřikováním roztoku IL-lra v jedné stříkačce do druhé stříkačky obsahující hyaluronát (a zpět), mícháním nebo mikrofluidizací. Směsi IL-lra mohou být skladovány při teplotách 0°C až 5°C, aniž by docházelo k degradaci nebo agregaci proteinu. Koncentrace hyaluronátu se může pohybovat v intervalu 0,1 až 5% (w/v), výhodně používaná koncentrace • · ·«<· φ φ φ · «φ φφ φφ φ φ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφφ φ «
ΦΦ Ο φφ ΦΦ ΦΦ φφ je nicméně 2%. Podobně, výsledná koncentrace IL-lra v přípravku se může pohybovat v rozmezí 0,1 až 200 mg/ml, ve výhodném provedení se jedná o koncentraci 100 mg/ml. pH výsledného roztoku nebo suspenze je ve výhodném provedení upraveno na hodnotu 6,0 až 7,5.
Jakmile byl farmaceutický přípravek formulován, může být tento skladován ve sterilních ampulkách ve formě roztoku, suspenze, gelu, emulze, pevné látky nebo ve formě dehydratovaného nebo lyofilizovaného prášku. Přípravky mhou být skladovány bud' ve formě určené k přímému použití nebo ve formě (například lyofilizované) vyžadující před vlastní aplikací rekonstituci. Ve výhodném provedení jsou tyto přípravky skladovány při teplotách nejvýše 4°C, výhodněji pak při -70°C. Ve výhodném provedení jsou přípravky obsahující ,IL-lra skladovány a aplikovány při fyziologickéríTpH nebo při hodnotě pH blízké fyziologickému pH. V současné době se má zato, že skladování a aplikace přípravků o vysokém pH (tj. pH vyšším než 8) nebo o nízkém pH (tj. pH nižším než 5) je nežádoucí, a ve výhodném provedení by pH přípravku mělo spadat do intervalu 6,0 až 7,0, výhodněji pak by pH přípravku mělo mít hodnotu 6,5.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k používání souprav (kitů) sloužících k přípravě jednotlivých aplikačních dávek. Zmíněné soupravy mohou zahrnovat dvě nádobky: první obsahující protein v pevném stavu a druhou obsahující kapalný přípravek. Soupravy spadající do rozsahu tohoto vynálezu jsou jednokomorové nebo vícekomorové přednaplněné injekční stříkačky; přednaplněné injekční stříkačky (například kapalné stříkačky a lyostříkačky jako například Lyo-Jecť, dvoukomorové přednaplněné lyostříkačky) mohou být získány od společnosti Vetter GmbH, Ravensburg, Německo.
• » φφφ* φφ * · φφ φφ • φ · φφφ φφφφ • φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφφ φφφφ φ φ φφ φ φ ♦ φφ ·· φφ
Inhibitory IL-1 (například produkty IL-lra) mohou být pacientům podávány v terapeuticky účinných množstvích za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (jak jsou definována výše), včetně zánětlivých onemocnění kloubů (například psoriatické arthritidy a.revmatické arthritidy). Termín pacient označuje jak zvířata (například kočky, psy a koně), tak lidi.
Inhibitor IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být aplikován místně, enterálně nebo parenterálně včetně (výčet není limitující) injekcí a infuzí aplikovaných intravenózně, intramuskulárně, intraarteriálně, intrathekálně, intrakapsulárně, intraorbitálně, intrakardiálne, intradermálně, intraperitoneálně, transtracheálně, subkutánne, subkutikulárně, intraartikulárně, subkapsulárně, subarachnoidálně, intraspinálně, intraventrikulárně a intrasternálně. Inhibitor IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být rovněž za účelem systemického podání aplikován orálně nebo přes sliznice, tj. intranazálne, sublingválně (pod jazyk), bukálně nebo rektálně. Ve výhodném provedení jsou inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) podávány ve formě injekcí aplikovaných intraartikulárně, subkutánne, intramuskulárně nebo intravenózně. V jednom charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra), za účelem léčby revmatické arthritidy nebo osteoarthritidy, podávány intraartikulárně. V jiném charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra), za účelem léčby revmatické arthritidy, zánětlívého onemocnění střev, roztroušené ♦· A··» ♦ A
A A sklerózy, mnohotného myelomu nebo myeloidní (například AML nebo CML) a jiných leukémií, podávány subkutánně nebo intramuskulárně. V dalším charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) podávány intravenózně za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemorhagie nebo mrtvice, nebo za účelem léčby odmítnutí štěpu hostitelem; nebo mohou být podávány intraventrikulárně za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu.
Bez ohledu na způsob podávání vyžaduje léčba onemocnění zprostředkovaných IL-1 aplikaci jedné nebo několika dávek (ve stanoveném režimu dávkování) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak ILlra) v účinných množstvích, tj. množství, účinných k prevenci, potlačení nebo zmírnění příznaků daného onemocnění, jako například k neutralizaci postupné destrukce chrupavku kloubu, jež je způsobena degradací proteoglykanům, které jsou složkami chrupavky kloubu. Jelikož jsou hyaluronát i IL-lra přirozeně se vyskytujícími látkami v organizmu savců, předpokládá se, že neexistuje horní mez tolerované dávky. Jako při každé léčbě je nicméně rozumné používat dávky nepřevyšující množství nezbytná k dosažení požadovaného účinku.
Specifická dávka je vypočítána v závislosti na přibližné tělesné hmotnosti nebo ploše těla pacienta. Mezi další faktory zohledňované při stanovení vhodného dávkování patří povaha léčeného nebo předcházeného onemocnění nebo patologického stavu, závažnost onemocnění, způsob podávání a věk, pohlaví a celkový zdravotní stav pacienta. Odborníci jsou schopni provést další zpřesnění výpočtů nezbytných ke stanovení vhodného dávkování při léčbě, a to zvláště ve světle
60’ ··♦· stanovení a informací o dávkách popsaných v této přihlášce. Dávkování může být rovněž stanoveno s využitím známých postupů pro určení dávkování používaných spolu s odpovídajícími údaji o reakci organizmu na podávanou dávku.
Frekvence podávání jednotlivých dávek závisí na povaze onemocnění nebo patologického stavu pacienta, a rovněž na farmakokinetických parametrech daného inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) použitého v přípravku a na způsobu aplikace. Inhibitor IL-1 (ve výhodném provedení například produkt ILlra a výhodněji pak IL-lra) může být aplikován pouze jednou anebo, v případech závažných nebo déletrvajících poruch, může být podáván denně (nebo méně častěji) nebo může být aplikován ve velké počáteční dávce následované kontinuálním přísunem nebo prodlouženým uvolňováním. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá využití jiných režimů kontinuálního nebo téměř kontinuálního dávkování. Výsledkem chemické derivatizace mohou například být formy s prodlouženým účinkem, které umožňují dosažení kontinuální přítomnosti dané látky v krevních oběhu v předvídatelných množstvích odvozených od stanoveného režimu dávkování.
Výhodně používané režimy dávkování produktů IL-lra při léčbě onemocnění zprostředkovaných IL-1 (včetně zánětlivých onemocnění kloubů jako například revmatické arthritidy a psoriatické arthritidy) jsou popsány v přihlášce AU 9173636. Tyto režimy zahrnují: (1) intraartikulární injekci IL-lra podávanou opakovaně za účelem prevence nebo léčby recidivy arthritidy a (2) opakovaně aplikované subkutánní injekce produktu IL-lra. Při parenterální aplikaci může být jedna dávka až 200 mg, obvykle méně než 150 mg a nejčastěji až 100 mg. Při aplikaci do kloubní dutiny je farmaceutický přípravek ve výhodném provedení podáván ve formě jedné in61 • ·
4 · ·
4 4 «4 jekce o objemu 3 až 10 ml obsahující dávku maximálně 200 mg/ml, obvykle méně než 150 mg a nejčastěji až 100 mg produktu IL-lra rozpuštěného ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanovým pufrem (PBS). Tento přípravek je do kloubní dutiny aplikován jednou za 7 až 10 dní. V tomto případě je aplikace provedena 4 až 5-krát a je-li to nezbytné, při jednotlivých podáních mohou být dávky rozdílné.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být aplikovány spolu s dalšími léčivými látkami vhodnými k léčbě daného onemocnění. Produkt inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být aplikován samostatně nebo v kombinaci s jedním nebo více protizánětlivými léčivy. Informace týkající se následujících sloučenin mohou být nalezeny v publikacích The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15. vydání, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ, 1992; a Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
V současnosti používaná léčba onemocnění zprostředkovaných IL-l (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například revmatická arthritida), zahrnuje v první řadě použití léčivých látek k potlačení bolesti a zánětu, označovaných jako nesteroidní protizánětlivá léčiva (NSAID). Dále pak nastupuje použití kortikosteroidů, pomalu účinkujících antirevmatik (SAARD - slow acting antirheumatic drugs) nebo léčiv modifikujících onemocnění.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) a jednoho nebo více NSAID za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické arthritidy • ·♦ · • · • φ • φ « · φφ φ* • ♦ · * • φ φ φ φ φ · φ φ · • φ · « φ · »« a/nebo revmatické arthritidy); a odmítnutí Štěpu hostitelem. Protizánětlivý účinek NSAID je, alespoň Částečně, důsledkem inhibice syntézy prostaglandinů (Goodman a Gilman v publikaci The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. vydání, MacMillán, 1985). NSAID jsou rozděleny do devíti skupin: (1) deriváty kyseliny salicylové; (2) deriváty kyseliny propionové; (3) deriváty kyseliny octové; (4) deriváty kyseliny fenamové; (5) deriváty kyseliny karboxylové; (6) deriváty kyseliny butanové; (7) oxikamy; (8) pyrazoly a (9) pyrazolony.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedeni například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) a jednoho nebo více derivátů kyseliny salicylové, jejích prekurzorů ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelných solí. Zmíněné deriváty kyseliny salicylové, její prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acetaminosalol, aloxiprin, aspirin, benorylát, bromosaligenin, acetylsalicylát vápenatý, cholin magnesium trisalicylát diflusinal, etersalát, fendosal, kyselinu gentisovou, acetylsalicylát lysinia, mesalamin, salicylát morfolinia, 1-naftylsalicylát, olsalazin, parsalmid, fenylacetylsalicylát, fenylsalicylát, salacetamid, kyselinu salicylamid O-octovou, salsalát a sulfasalazin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny salicylové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky
4444 *4 ·» 4 « 4 4 w 4 4 « · · 4 • · 4 4 4 ··· · 4 4 4 • · · 4 · 4 4 4 4 •4 4 «4 44 ·· 4» přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: alminoprofen, benoxaprofen, kyselinu bukloxovou, karprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminia, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loxoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, kyselinu protizinovou, pyridoxiprofen, suprofen, kyselinu tiaprofenovou a tioxaprofen. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny propionové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení j například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acemetacin, alclofenak, amfenak, bufexamak, cinmetacin, klopirak, delmetacin, diklofenak sodný, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenklorak, kyselinu fenklozovou, fentiazak, furofenak, glukametacin, ibufenak, indomethacin, isofezolac, isoxepak, lonazolak, kyselinu metiazinovou, oxametacin, oxpinak, pimetacin, proglumetacin, sulindak, talmetacin, tiaramid, tiopinak, tolmetin, zidometacin a zomepirak. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny octové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-l (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) —
*· ·*»· φ* φφ φφ φφ • · · · φ φ * · • φ φ · φφφ φφφ • · φ φ Β φ φ φ • · φ φφ φφ φφ φφ v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny fenamové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny fenamové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: kyselinu emfenamovou, etofenamát, kyselinu flufenamovou, isonixin, kyselinu meklofenamovou, meklofenamát sodný, kyselinu medofenamovou, kyselinu mefanamovou, kyselinu niflumovou, talniflumát, terofenamát, kyselinu tolfenamovou a ufenamát. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny fenamové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: clidanac, díflunisal, flufenisal, inoridin, ketorolac a tinoridin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny karboxylové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny butanové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny butanové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přija65 ·· ···· • · 4 • 4a • * 4 • · 4 ·· » «· ·» • 4 4·
4 · · 4 • 4 4 « a • 4 · 4
44 • 4 44 • 4 4 9 • 9 9 4 • 444 94· a 4 a 4 telné soli zahrnují: bumadizon, butibufen, fenbufen a xenbucin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny butanové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: droxikam, enolikam, isoxikam, piroxikam, sudoxikam, tenoxikam a4hydroxyl-1,2-benzthiazin 1,1-dioxid 4-(N-fenyl)karboxamid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné oxikamy vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazoly, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné pyrazoly, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: difenamizol a epirizol. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazoly vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazolony, jejich prekurzo66 *· »»»· 4* »4 w * · * *44 «44» »4 4 44 444 4 444 •44 4444 4 4
4 44 44 44 4· ry ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné pyrazolony, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: apazon, azapropazon, benzpiperylon, feprazon, mofebutazon, morazon, oxyfenbutazon, fenylbutazon, pipebuzon, propylfenazon, ramifenazon, suxibuzon a thiazolinobutazon. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazolony vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více z následujících NSAID: kyselina ε-acetamidokapronová, S-adenosylmethionin, kyselina 3-amino-4-hydroxybutanová, amixetrin, anitrazafen, antrafenin, bendazak, bendazak lysinia, benzydamin, beprozin, broperamol, bukolom, bufezolak, ciproquazon, kloximát, dazidamin, deboxamet, detomidin, difenpiramid, difenpyramid, difisalamin, ditazol, emorfazon, fanetizol- mesylát, fenflumizol, floktafenin, flumizol, flunixin, fluproquazon, fopirtolin, fosfosal, guaimesal, guaiazolen, isonixirn, lefetamin HCl, leflunomid, lofemizol, lotifazol, klonixinát lysinia, meseklazon, nabumeton, niktindil, nimesulid, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paranylin, perisoxal, citrát perisoxalu, pifoxim, piproxen, pirazolak, pirfenidon, proquazon, proxazol, thielavin B, tiflamizol, timegadin, tolektin, tolpadol, tryptamid a sloučeniny označené firemními kódovými čísly jako například 480156S, AA861, AD1590, AFP802:, AFP860, AI77B,
AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382,
EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102,
PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, ♦ · *·«4 *· «i 4« • · · 4 · 4 4 · • 4 4 4*444 4 4 4 • 4 · · 4 4 4 · *4 4 44 4» 44
SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (kyselina 4benzoyl-l-indankarboxylová), TVX2706, U60257, UR2301 a WY41770. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné NSAID vykazující analgetické a protizánětlivé účinky obdobné výše uvedeným NSAID.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více kortikosteroidy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-l (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy); odmítnutí štěpu hostitelem, a roztroušené sklerózy. Kortikosteroidy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují hydrokortizon a sloučeniny z hydrokortizonu odvozené, jako například 21-acetoxypregnenolon, alklomerason, algeston, amcinonid, beklomethazon, betamethazon, valerát betamethasonu, budesonid, chloroprednison, klobetasol, propionát klobetasolu, klobetason, butyrát klobetasonu, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kortison, kortivazol, deflazakon, desonid, desoximerazon, dexamethason, diflorason, diflukortolon, difluprednát, enoxolon, fluazakort, flukloronoid, flumethason, pivalát flumethasonu, flunisolid, flucinolon acetonid, flucionid, fluorocinolon acetonid, fluocinonid, fluorocinolon acetonid, butyl fluokortin, fluokortolon, fluorokortolon hexanoát, diflukortolon valerát, flurometholon, fluperolon acetát, flupredniden acetát, fluprednisolon, florandelonid, formokortal, halcinonid, halometason, halopredon acetát, hydrokorta68 ·· ···· *· ·· ·· ·· • · · · · » « · · • · · « · ··* a a a • a a a a a, a a ·· a aa aa aa aa mát, hydrokortison, hydrokortison acetát, hydrokortison butyrát, hydrokortison fosfát, sodná sůl hydrokortison 21-sukcinátu, hydrokortisotebutát, mezipredon, medryson, meprednison, methylprednikolon, mometason furoát, paramethason, prednikarbát, prednisolon, prednisolon 21diedrvaminoacetát, sodná sůl prednisolonfosfátu, sodná sůl prednisolon sukcinátu, sodná sůl prednisolon 21-msulfobenzoátu, sodná sůl prednisolon 21-stearoglykolátu, prednisolon tebutát, prednisolon 21-trimethylacetát, prednison,.prednival, předníliden, predniliden 21diethylaminoacetát, tixokortol, triamcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid a triamcinolon hexacetonid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné kortikosteroidy vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pomalu účinkujícím antirevmatickým léčivem (SAARD - slow-acting antirheumatic drug) nebo antirevmatickým léčivem modifikujícím onemocnění (DMARDS - disease modifying antirheumatic drug), jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy); odmítnutí štěpu hostitelem a roztroušené sklerózy. SAARD nebo DMARD, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: allokupreid sodný, auranofin, aurothioglukózu, aurothioglykanid, azathioprin, brequinar sodný, buφφ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ* * * φ · * φφφ · φ φ φ
Φφφ φφφφ φ φ φφ Φ φφ ΦΦΙ φφ Φ* cillamin, 3-aurothio-2-propanol-l-sulfonát vápenatý, chlorairťbucil, chloroquin, klobuzarit, kuproxolin, cyklofosfamid, cyklosporin, dapson, 15-deoxyspergualin, diacerein, glukosamin, solí zlata (například zlatá sůl cykloquinu, thiomalát sodnozlatný, thiosíran sodnozlatný), hydroxychloroquin, hydroxymočovinu, kebuzon, levamisol, lobenzarit, melittin, 6-merkaptopurin, methotrexát, mizoribin, mykofenolát mofetil, myoral, 2-chlor-N-(2chlorethyl)-N-methyl, D-penicillamin, imidazoly pyridinolu jako SKNF86002 a SB203580, rapamycin, thioly, thymopoietin a vinkristin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné SAARD a DMARD vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení ' například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory C0X2, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby akutních nebo chronických zánětů. Inhibitory C0X2, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují například celecoxib. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné inhibitory COX2 vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více bakteriostatiky, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby akutních nebo chronických zánětů. Bakteriostatika, jejich prekurzory ve formě esterů nebo
- '7Ό «· ·*«* » ’ « φ φ φ · · φ φ · φ φ φ φ φ φ »*· φ φ φ » φ φ · ΦΦΦΦ Φ V φφφ ΦΦ ΦΦ Φ· Φ Β jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují například ampicilin, amoxycílin, aureomycin, bacitracin, ceftazidim, ceftriaxon, cefotaxim, cefachlor, cefalexin, cefradin, ciprofloxacin, kyselinu klavulanikovou, kloxacilin, dikloxacilan, erythromycin, flokloxacilan, gentamicin, gramicidin, methicilan, neomycin, oxacilan, penicilín a vankomycin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobná bakteriostatika vykazující obdobné analgetické a 1 protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory TNF, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy); poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemoragie nebo mrtvice; a odmítnutí štěpu hostitelem. Tyto inhibitory TNF zahrnují sloučeniny a proteiny, které in vivo blokují syntézu nebo extracelulární uvolňování TNF. Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více z následujících inhibitorů TNF: proteiny vážící TNF (rozpustné receptory pro TNF), protilátky proti TNF, faktor stimulující růst kolonií granulocytů, thalidomid, BN
4248, tenidap, E 5531, tiapafant PCA 4248, nimesulid, panavir, rolipram, RP 73401, T peptid, MDL 201, 449A, (IR,
.............. . . ... 71 • 4 *4 ·* ···· • » • · * 4 » « i a » · • 4 44 · • 4 4 4 « • 4 * 4 ·· 44
44 · a · • · a · ·#· a a 4
4 ·< ··
3S) -cis-l-[9- (2,6-diaminopurinyl)]-3-hydroxy-4-cyklopenten hydrochlorid, (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamido) purin]-3acetoxycyklopentan, (IR,3R)-trans-l-[9-adenyl)-3azidocyklopentan hydrochlorid a (IR, 3R) - trans-l-[6hydroxy-purin-9-yl)-3-azidocyklopentan.
Proteiny vážící TNF jsou v současnosti známy (EP 308378, EP 422339, GB 2218101, EP 393438, WO 90/13575, EP 398327, EP 412486, WO 91/03553, EP 418014, JP
127800/1991, EP 433900, přihláška US. 5136021, GB 2246569, EP 464533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512528, EP 526905, WO 93/07863, EP 568928,
WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417563, prozatímní přihláška US 60/021443, podaná 9. července 1996 Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Tumor Necrosis Factor Binding Proteins (číslo spisu A-415P) , prozatímní přihláška US _, podaná
6.prosince 1996 Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor Binding Proteins (číslo spisu A-415A-P), prozatímní přihláška US _, podaná 23, ledna 1997 Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor Binding Proteins (číslo spisu A-415B-P) a prozatímní přihláška
US _, podaná 7. února 1997 Fisherem, Edwardsem a
Kieftem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor Binding Proteins (číslo spisu A-415C-P). Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Přihlášky EP 393438 a EP 422339 například popisují aminokyselinové a nukleotidové sekvence 30 kDa inhibito72 • to ···· • * • · to · • · • 1 ·· to· ·· toto • ··« » to * « • toto ··* < «to to • · · · · · · ··· toto· • « · to » to · to ·· toto >« ·* ru TNF (rovněž známého jako receptor p55) a 45 kDa inhibitoru TNF (rovněž známého jako receptor p75), jakož i jejich modifikovaných forem (například fragmentů, funkčních derivátů a variant). Přihlášky EP 393438 a EP 422339 rovněž popisují způsoby izolace genů kódujících tyto inhibitory, klonování těchto genů do vhodných vektorů a hostitelských buněk a jejich expresi za účelem produkce inhibitorů. Ve zmíněných přihláškách jsou rovněž popsány polyvalentní formy (tj. molekuly obsahující více než jednu aktivní část) výše zmíněných inhibitorů TNF. V jednom provedení vynálezu mohou být zmíněné polyvalentní formy vytvořeny například spojením (chemicky) alespoň jedné molekuly inhibitoru TNF a druhé části (1) pomocí klinicky přijatelného linkerů, například polyethylenglykolu (WO 92/16221 a WO 95/34326); (2) nějakého peptidového linkerů (Neve a další, Cytokine, 8(5):365 až 370, 1996); (3) připojením biotinu chemickou syntézou a následnou vazbou na avidin (WO 91/03553) ; a (4) vytvořením chimérických molekul protilátek (přihláška US 5116964, WO 89/09622, WO 91/16437 a EP 315062).
Mezi protilátky namířené proti TNF patří Fab fragment protilátky MAK195F (Holler a další, 1. mezinárodní sympozium o cytokinech v transplantátech kostní dřeně, 147); monoklonální protilátka CDP571 proti TNF (Rankin a další, British Journal of Rheumatology, 34:334 až 342, 1995); myší monoklonální protilátka BAYX1351 proti TNF (Kieft a další, 7. evropský kongres klinické mikrobiologie a infekčních onemocnění, 9); monoklonální protilátka CenTNF cA2 proti TNF (Elliott a další, Lancet, 344:1125 až 1127, 1994 a Elliott a další, Lancet, 344:1105 až 1110, 1994) .
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) r r re rr r r rr e c. c í f f r < f < c ‘ C Γ r f CCÍ· í- c » f c c f < < C f CCf r f c < r <· c c c < c c ( f v kombinaci (předběžná léčba,, následná léčba nebo souběžná léčba) s rozpustným rekombinantním lidským antigenem Fas nebo rekombinantními verzemi .tohoto antigenu, za úče.lem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výšek,-včetně akutních a chronických zánětu jako například zánětlivých onemocnění kloubu (napří.kladíosteóartritidy, psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy); a odmítnutí.'štěpu, hostitelem'.. Rozpust.ný, rekombinantní lidský antigen, Fas^ a/j eho varianty,jako například'-fúzní protein ,fas,^způsoby, izolace genu kódují'cích·,rozpustný rekombinantní lidský antigen Fas, klonování těchto>genů do-vhodných· vektorůa hostitelských buněk la.tpůsoby jejich expreseizakúčelem.produkce,těchto-inhibitorů jsou v současnosti známy ,(W0 ,96/20206, a Móuntz a ídalší,',J. .Immunology, 155:4,829 až 4837·. Tyto publikace - $ f jsou Zde uvedeny záměnou;za ipřenesení jejich celého-obsajhu do,popisu tohoto vynálezu). t ,.· i > „.···/ . -y ,, .· hcl Výše zmíněné informace!jsou uvedeny pouze:jako^přír ;klady amevylučují souběžné, použití: anti-arthritických /sloučenin/’které jsou odborníkům známé nebo kt.eré-móhou odborníci vyvodit'z principů popsaných ,v této přihlášce.
Ě-, . Je.zvláště výhodné ^formulovat přípravky obsahuj ící r ... idoplňkové protizánětlivé.sloučeniny.ve.formě jednotlivých *dávek;v a ;to za'.účelem .snadné, aplikace.,a rovnoměrného dávkování. .Termín forma jednotlivých dávekjak je chápán <v této přihlášce, označuje· fyzicky oddělené, jednotky. vhodné r jako jednotkové'dávky;aplikované léčenému' savci../· ů Každá jednotka obsahuje přesně .stanovené množství;, doplň-kových protizánětlivých sloučenin vypočítané tak,^ aby= spolu,spožadovaným 'farmaceutickým.nosičem vyvolalo.požadovaný terapeutický .účinek.^Termín 'Jfarmaceuticky,přijatelný < nosič, -Jak jě chápán-v.· tétorpřihlášcé ,-7 zahrnuje/ jakékoliv;z rozpouštědel, disperzní média,: obalové agens, φφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φ·· φφφφ φ φ φφφ φ φ φ φ
Φφφ φφφφ φ φφ φ φφ φφ φφ φφ antibakteriální a antifungální agens, látky upravující tonicitu, agens zpomalující absorpci a podobně, kde jsou tato agens slučitelná s aktivní složkou, způsobem aplikace a dalšími složkami přípravku a nejsou pro příjemce škodlivá. Použití těchto médií a agens je v současnosti známé (viz. například Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990). Charakteristickým příkladem farmaceuticky přijatelného nosiče je fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanovým pufrem. Do přípravku mohou být rovněž začleněny další aktivní látky.
Za účelem orální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivá sloučenina formulována s pomocnými látkami a použita ve formě poživatelných tablet, bukálních tablet, pastilek, tobolek, elixírů, suspenzí, sirupů oplatek a podobně nebo může být přímo začleněna do přijímané potravy. Tablety, pastilky, pilulky, tobolky a podobně mohou rovněž obsahovat následující složky: pojivo jako například tragant, arabskou gumu, kukuřičný škrob nebo želatinu; pomocné látky jako například fosforečnan sodný; rozvolňovadla jako například kukuřičný škrob, kyselinu alginovou a podobně; maziva jako například stearan horečnatý; sladidla jako například sacharózu, laktózu nebo sacharin; nebo ochucovadlo jako například pepermint, libavkovou silici nebo višňovou nebo pomerančovou příchuú. Jsou-li jednotlivé dávky ve formě tobolek, mohou mimo látek uvedených výše rovněž obsahovat nějaký kapalný nosič. K povrchové úpravě nebo za účelem jiných modifikací formy jednotlivých dávek mohou být použity nej různější další materiály. Tablety, pilulky nebo tobolky mohou být například obaleny šelakem, cukrem nebo oběma současně.
Veškerý materiál používaný při přípravě jakékoliv formy jednotlivých dávek by samozřejmě měl být ve farmaceutické
4 MM · <4
4 4 4 4 kvalitě a v používaném množství v podstatě netoxický. Doplňková protizánětlivá sloučenina může být navíc začleněna do přípravku pro řízené uvolňování léčiva. Množství doplňkového protizánětlivého léčiva v tomto terapeuticky využitelném přípravku je takové, aby byla získána vhodná dávka.
Za účelem parenterální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivá sloučenina formulována spolu se sterilním roztokem vhodným pro injekční aplikací. Sterilní roztok může být připraven včleněním požadovaného množství doplňkové protizánětlivé sloučeniny, spolu s dalšími složkami vyjmenovanými dále v textu, do vhodného farmaceuticky přijatelného nosiče a následnou sterilizací provedenou filtrací. Za účelem přípravy disperzí může být doplňková protizánětlivá sloučenina včleněna do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní médium a další požadované složky vybrané ze seznamu uvedeného výše. Sterilní roztoky vhodné pro injekční aplikaci mohou být připraveny začleněním alespoň jedné doplňkové protizánětlivé sloučeniny ve formě prášku a (volitelně) jakékoliv další požadované složky do roztoku sterilizovaného filtrací. Prášek (doplňkové protizánětlivé sloučeniny) může být připraven jakýmkoliv vhodným způsobem (například vakuovým sušením nebo lyofilizací).
Specifická dávka doplňkové protizánětlivé sloučeniny je vypočítána na základě přibližné tělesné hmotnosti nebo povrchu těla pacienta. Mezi další faktory zohledňované při stanovení vhodného dávkování patří povaha léčeného nebo předcházeného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění nebo patologického stavu, závažnost tohoto onemocnění, způsob podávání a věk, pohlaví a celkový zdravotní stav pacienta. Odborníci jsou schopni provést další zpřesnění výpočtů nezbytných ke stanovení vhodného dávkování při léč76---49 ·· • 9 • a • * a a · a a · • 9 9 ·· «9 44 4· bě zahrnující aplikaci jakéhokoliv z výše uvedených přípravků. Dávkování může být rovněž stanoveno s využitím známých postupů sloužících k určení dávkování používaných spolu s odpovídajícími údaji o reakci organizmu na podávanou dávku.
Do rozsahu vynálezu tudíž například spadá skutečnost, že lze měnit dávky doplňkových protizánětlivých sloučenin zvolených za účelem léčby daného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění, a to tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku. Jestliže některá z doplňkových protizánětlivých sloučenin vykazuje vedlejší účinky, může být tato pacientovi při kombinované terapii podávána pouze v některých obdobích. Například chronická léčba prostřednictvím methotrexátu je spojena s toxickými účinky na gastrointestinální trakt, játra, kostní dřeň a plíce (Sandoval a další, British Journal of Rheumatology, 34:49 až 56, 1995).
Testy sledující zlepšení stavu pacienta mohou zahrnovat specifické testy, při kterých je například stanovována reakce organizmu na zánět. Tyto testy zahrnují sledování rychlosti sedimentace erythrocytů (ESR) a výskyt reaktantů akutní fáze (APR). Jsou rovněž pozorovány otoky, atd. postižených částí těla. Rovněž jsou sledovány ústup ztuhlosti a zlepšení úchopu (je-li použitelné) a zmírnění bolesti pacienta. Je-li pacientův stav stabilizovaný, je mu podávána stejná dávka jednou týdně a rovněž jednou týdně je sledován jeho stav. Za předpokladu, že je stav pacienta stabilní, může léčba pokračovat. Po šesti měsících léčby jsou anatomické změny na kostře vyhodnoceny nějakou radiologickou zobrazovací metodou, například rentgenografií.
Po skončení každého období je pacient opět vyšetřen. Srovnání výsledků radiografie, ESR a APR před a po léčbě • · · · • v φ· ·ι ·« · • · ··· · * · · • · · · φφφ ♦ « φ ·
I · · « · «φ φ · φφ Φ· ukazuje na účinnost léčby. V závislosti na účinnosti léčby a stavu pacienta může být dávkování v dalším průběhu léčby zvýšeno nebo zachováno na stejné úrovni.
Ve výhodném provedení je vynález směrován k využití způsobů léčby zahrnujících použití IL-lra v jedné z následujících kombinací (volitelně), a to za účelem léčby nebo prevence onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy) a symptomů s nimi spojených: produkt ILlra (například IL-lra) a methotrexát; produkt IL-lra (například IL-lra) a jeden nebo více ze skupiny zahrnující methotrexát, sulfasazin a hydroxychloroquin; produkt ILlra (například IL-lra), methotrexát a hydroxychloroquin; produkt IL-lra (například IL-lra), methotrexát a sulfasazin; a produkt IL-lra (například IL-lra), methotrexát a nějaký inhibitor TNF, ve výhodném provedení TNFbp.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intraartikulární, subkutánní nebo intramuskulární) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak ILlra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s methotrexátem a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby arthritidy (například osteoartritidy, psoriatické arthritidy a/nebo revmatické arthritidy) a symptomů s ní spojených.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intravenózní nebo intraventrikulární) inhibitoru IL-1 {ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulova78— «a * λ·· • · « · · · « « · * · · ····· · · · • * * · * · · » ·· · ·· ·· · ·· ného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s tkáňovým aktivátorem plazminogenu a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemorhagie nebo mrtvice, kde každý z těchto stavů může vést k neurodegenéráci.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulární) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem) ), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jednou nebo více sloučeninami ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, cyklosporin, nějaký interferon (například interferon alfa, interferon beta, interferon gama nebo konzervativní interferon) a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby roztroušené sklerózy.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intravenózní) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jednou nebo více sloučeninami ze skupiny zahrnující methotrexát, nějaký kortikosteroid, FK-506, cyklosporin, rozpustný protein fas a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby odmítnutí štěpu hostitelem,
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulární) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného
79,—.
i ty
4' h
oft Ijťiprt ΟΛ· «Ρ Γ( ΓΓ •s c ň fltjjfr f c r č oj ; «· ř fitre r t r- c, μ i; c e r *' tr r c ff. t crt ί/ ή- f: Ij « ft C ff Of no e oc cr tr ct spólu: síípolymerem pro řízené uvolňování {například hyalu roňátem)) , volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s G-CSF a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby zánětlivého onemocnění střev.
' V charakteristickém.výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulární) inhibitoru IL-1 (ve'výhodném provedení například^ produktu- IL-lra a* výhodněji pak'IL-lra. formulovaného spolu-s polymerem'pro řízehé.;úvolňování (například.hyalu’rohatém))/^volitelně v kombinaci (předběžná-léčba; následná' léčba nebo souběžná léčba) s nějakým interferonem a (například : interferon 3 alfa;'. interferon beta, interfěron ' gama nebo* konzervativní interferon).p*a lto za účelem léčby mnohotného myelomu nebo myeloidních Knapříklad AMLnebo CML) nebo jiných leukémií 1 „h v- ’*’V r - * v
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby- zahrnuje podání (například subkutánní intraventrikulárňí. nebo* intrathekálnf).* inhibitoru IL-l· (vě výhodném » provedení například produktu'IL-lra a výhodněji'pak IL* Ira' formulovaného spolu’s polymerem-pro řízené-uvolňování '(například hyaluronátem)) p^volitelne v kombinaci (před- . běžná léčba;'následná'léčba nebo souběžná léčba)v ι-, Ί 's nějakým“NSAID (například.indomethacin) .a/nebo -TNFbp,ia toyža účelem léčbyrAlzheimerova onemocnění.) - k
-V-charakteristickém výhodném provedení zmíněný!způsob léčby záhrnuje podání (například lokální injekce, subkutánní - nebo; intramuskulárníj (inhibitoru IL-1, (ve·..výhodném provedení1 například; produktu f IL-lra ..a t;. výhodně ji' pak ILlra formulovaného spolu s3polymerempro řízené uvolňování (například hyaluronátem) );?.a to za účelem léčby dočasného onemocnění mándibulárníhoCkloubu. >.- <
*· Následuj ící^příklady.ýsouuvedeny za' účelem úplného1 dokreslení vynálezu? Jé pochopitelné,, že v popsaných pó-^80-----4 4 44 44 «· 4 4 • 4 4 4 4 • · 4 «444 stupech mohou být provedeny změny, aniž by došlo k odchýlení se od podstaty vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Standardní metody (nebo vhodné alternativní metody) použitelné v postupech popsaných v následujících příkladech jsou popsány v obecně uznávaných manuálech molekulární biologie jako například v publikacích Sambrook a další, Molecular Cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987 a Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Willey Interscience, New York, 1990. Všechny chemikálie byly buď analytické třídy čistoty nebo třídy USP.
Příklad 1
Příprava vzorku; Rekombinantní antagonista lidského receptoru pro IL-1 produkovaný v E. coli (rhuIL-lra), připravený v souladu s popisem v přihlášce US 5075222, byl formulován ve vodném roztoku 10 mM citronanu sodného, 140 mM chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 0,1% polysorbátu (hmotnostně), pH 6,5 (CSEP). Injekční stříkačky obsahující přípravek s IL-lra byly následně prostřednictvím uzavíracího kohoutu připojeny ke stříkačkách obsahujícím jeden z níže uvedených materiálů pro řízené uvolňování: hylan H-10™ ve formě kapaliny {Biomatrix, lne., Ridgefield, lne.), zesilovanou kyselinu hyaluronovou (molekulová hmotnost větší než 4xl06) buď ve formě prášku nebo prásku rekonstituovaného v PBS; kyselinu hyaluronovou (molekulová hmotnost větší než 570000) v PBS, odvozenou z kultur Streptococcus zooepidemicus (katalogové číslo H9390, Sigma, lne., St. Louis, MO) ve formě prášku; polyvinylpyrro81 «· «to·* ·· ·* ·· ·· • to · t · · ··* •to to · · to * · ·· to toto ·· toto ·· lidon (molekulová hmotnost l,3xl06) (katalogové číslo
43719-0, Aldridge Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) ve formě prášku; a karboxymethylcelulózu (karboxymethylcelulóza (katalogové číslo 06139), Polysciences, Inc., Warrington, PA) ve formě prášku. IL-lra byl s materiálem pro řízené uvolňování promíchán vstříknutím roztoku rhuIL-lra do stříkačky obsahující kyselinu hyaluronovou a následným několikanásobným převedením vzniklé směsi s jedné stříkačky do druhé tak, aby bylo dosaženo dokonalého promíchání .
Podobným postupem byly připraveny následující směsi:
(1) IL-lra (lOOmg/ml)/2% hylan H-10™; (2) IL-lra (lOOmg/ml)/1% kyselina hyaluronová; (3) IL-lra (lOOmg/ml)/0,5% hylan H-10™; (4) IL-lra (lOOmg/ml)/2% kyselina hyaluronová; (5) IL-lra (lOOmg/ml)/4% polyvinylpyrrolidon; a (6) IL-lra (lOOmg/ml)/3% karboxymethylcelulóza.
Tyto přípravky byly subkutánně injikovány samicím potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River, Portage, MI).
V různých časových intervalech po injekci byla pomocí katetrů zavedených do jugulární žíly (véna jugularis) zvířat odebírána krev. Centrifugací byly z odebrané krve následně odstraněny krvinky a pomocí soupravy pro stanovení metodou ELISA (Quantikine™ human IL-lra immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN), postupem doporučeným výrobcem, byl v plazmě stanoven obsah IL-lra. Získaná data jsou vyjádřena jako plazmatická koncentrace IL-lra {^g/ml IL-lra v plazmě) v závislosti na čase po injekci (jak jsou znázorněna v tabulce 2 a na obrázku 1).
- 82- I · · ♦ · »· • · * · * * « · « · ♦ · · · · «·« · Φ · · » * · · · · · ·« ··· ··· ··» *·♦* ♦ * ·· · Φ» ·· ·· «♦
Plazmatická koncentrace IL-lra (^g/ml) po subkutánní
Data neuvedena *4 • 4
4444 « 4
4*44 • 4 44 * <4 · • * ♦ · 4 *·4 • 4 · · *
Z tabulky 2 a obrázku 1 je vidět, že ve srovnání s aplikací samotného IL-lra má inkorporace IL-lra do hyaluronátu, polyvinylpyrrolidonu a karboxymethylcelulózy za následek vyšší plazmatickou koncentraci IL-lra v delším časovém intervalu.
Příklad 2
IL-lra v CSEP byl radioaktivně označen pomocí Na[125I] a následně postupem popsaným výše zainkorporován do roztoku hylanu H-10™ (výsledná koncentrace 2%). Radioaktivně značený IL-lra nebo IL-lra/hylan H-10™ byly intraartikulární injekcí vpraveny do kolen zadních končetin morčat (Charles River, Portage, MI). V různých časových intervalech po injekci byla zvířata usmrcena, kolenní klouby byly vyjmuty a radioaktivita změřena na čítači záření gama (postupem popsaným v publikaci van Lent a další, J. Rheumatol., 16:1295 až 1303, 1989), Množství IL-lra zbývajícího v jednotlivých časových intervalech v kloubech je znázorněny na obrázku 2. Z grafů podobných grafu na obrázku 2 byly vypočítány poločasy života IL-lra ve třech různých přípravcích obsahujících hyaluronát aplikovaných intraartikulárně. Tato data jsou uvedena v tabulce 3.
84------------·* ·· « · · · · * • » · · ·'«·· «» ·· • · · • · · • · « · · · · ·· « ♦· ·· • 4 »·
Tabulka 3
Poločasy života přípravků IL-lra v kloubech morčat po intraartikulární injekci
Přípravek Poměr Poločas života (hcJdiny)
Samotný IL-lra NA 1,36
IL-lra/hyaluronát 90/10 3,54
IL-lra/hyaluronát 8Q/20 2,45
IL-lra/hyaluronát 50/50 1,45
(a> Koncentrace IL-lra byla 100 mg/ml. Koncentrace hyaluronátu byla 2% (w/v).
(b> Poměr kapalného (nezesilovaného) hyaluronátu k hyaluronátu ve formě gelu (zesíčovaný) v přípravku.
Z tabulky 3 a obrázku 2 je patrné, že inkorporace ILlra do hyaluronátu vede po intraartikulární aplikaci k delšímu zadržování IL-lra v kolenních kloubech. Míra retence může být řízena poměrem zesilovaného (gel) a nezesilovaného (kapalina) hyaluronátu v přípravku.
Příklad 3
IL-lra v CSEP nebo přípravek obsahující IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™, tak jak jsou popsány výše, byly intraartikulární injekcí aplikovány do kolen zadních končetin králíků (Charles River, Portage, MI). V různých časových intervalech po injekci byla zvířata usmrcena, kolenní klouby byly vypláchnuty PBS, čímž byla získána synoviální tekutina. V této synoviální tekutině byla pomocí soupravy pro stanovení metodou ELISA (Quantikine™ human IL-lra immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN), postupem doporučeným výrobcem, stanovena koncentrace IL-lra ^g/ml). Získaná data jsou uvedena na obrázku 3 a v tabulce 4.
φ *ί ©t hf»f’C, ©<r r»< cc
0’ C; til t t' O,| C ť c ¢1 WůM . ť*· e(H c.
c c c ¢1 «·· ocet ¢¢¢-:
£ C ®i fr' ftí Λ ti' i? o® OC o ti *’«?.
Oř Cl « ¢1 oi c c7 , c
Τ' Tabulka-4
Poločasy života přípravků IL-lra v kolenních kloubech zadních končetin králíků po intraartikulární injekci
- . . , 'H
__- 2 — J - 1- _ 2 Cdd pu J.UJ CÍA-L-J— .j» . 1 » ϊ * / (hodiny) . ,T Λ f > ,·< . ; x /«»>,♦ f f , Samotný IL-lra . R '.>··. IL-lra .(lOOmg/ml)/hyaluronát - * ‘ \ : : (2% w/v) T-
, ·* .8· H 0,5 'J - Ii7-t 2 28 0 ’ .· i i· »< * 2440·« v
•UL,. : ... ..1,..111000=, - i. . : 6200.. :' í
# tř Ί 0 / 5 s-A? 5000 μί-'ϊ- í. =2400
,-t). .. ^0,5’ * : - 1 8090*’· 4 ♦ ND
f’....... -·]_- fc. . ' '1400 5150
1 ....... ..........”3450’ ’”'L 6830
1 3090 7180
1 ....... 1. . .. 1840 2620 i. . _ ř. ..
4 r- t * xx ..... - Λ . 56,98 224 » . . K. _ . * '* *·>* ->».
4 31,24 1600'
4 . >..... - + 62,43 * -1 , >V . r. ' 3250 . i ” 4 il r H - JS, - I
4 1+· *. ND* ..... - u ' ;·’ 237 1 1 i =
8 , i'.y = ίο - i 0,0641 >; . .. rr 575 . t χ ‘r ií 4 „x ,j.
8 ' : i u.. ... ·,;..'' 0,0312 . i* ·.- Jfi IV.1 .. 55,98 -.i Sů . f ‘
.. 8 ND 125
8 * ND ND*
24 ND* 0,5644
24 ND* 0,1539
24 ND* 0,8852
Data neuvedena
Uvedená data ukazují, že přípravek obsahující spolu s IL-lra i hyaluronát je po intraartikulární injekci scho·· ···· *· ·« ** »» v · « · » · · · « * • * · · · ·· · · · * ··· ··«· ft · ·« · ♦· ·· ·« »· pen prodlouženého uvolňování intaktního IL-lra do synoviální tekutiny.
Příklad 4
Samice potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River,
Portage, MI) byly ve dnech 0 a 7 imunizovány bovinním kolagenem typu II (Elastin Products, Owensville, MO). Ve 12 až 13 dni začalo docházet k vývinu arthritidy. Ve dnech 15 a 18 po počáteční imunizační dávce byl potkanům (8 zvířat/skupina) intraartikulární injekcí aplikován buď roztok hylanu H-10™ v CSEP (50 μΐ/koleno; celkově 1 mg hyaluronátu) nebo IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™ (50 μΐ/koleno,· 5 mg IL-lra/l mg hyaluronátu) . Kontrolní skupině postižené arthritidou nebyla aplikována žádná injekce. Ve 20 dni po počáteční imunizační dávce byli potkani usmrceni a histologickými technikami byla v odebraných kolenních kloubech stanovována závažnost onemocnění.
Z údajů znázorněných v tabulce 5 a na obrázku 4 vyplývá:
(a) léčba pomocí IL-lra podstatně potlačuje poškození chrupavky a kosti a má mírný vliv na zánět synovia; (b) ve srovnání s kontrolními vzorky bylo celkové poškození kloubů sníženo o 70%; a (c) ve srovnání s kontrolní skupinou neměla léčba samotným hyaluronátem na průběh onemocnění žádný blahodárný vliv.
______8_7_ ···· ·· ·· ·« · «4 · 4 4 4 · 4 · *
4 · 4 4 4*4 · 4 4 • 44 «449 4 4
4 49 9« 9· ··
Tabulka 5
Koncentrace IL-lra v synoviální tekutině po intraartikulární injekci
Přípravek Zánět sy- novia Panus Chrupavka (celkově) Poškození kosti Kloub (celkově)
Neléčení 3,2510,14 1,510,16 17,6912,27 1,4410,16 23,8812,57
hyaluronat (2% w/v) 2,8810,39 1,4410,22 16,8813,14 1,3110,28 22,513,87
IL-lra (100 mg/ml)/ hya- luronát (2% w/v) 2,0610,28 0,510,18 4,6911,77 0,1910,14 7,5312,33
Příklad 5
Samicím potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River, Portage, MI) byl do kořene ocasu a na třech místech na hřbetě (250 μΐ do každého místa) intradermální injekcí aplikován bovinní kolagen typu II (Elastin Products, Owensville, MO) v koncentraci 2 mg/ml v nekompletním Freundově adjuvans (Difco Laboratories, lne., Ann Arbor, MI), a to ve dnech 0 a 7. Dvanáctý den byl těmto zvířatům intraperitoneální injekcí aplikován endotoxin (typ LPS L3129, Sigma) v množství 3 mg/kg. V dalších 5 dnech byl pozorován nástup arthritidy a jakmile došlo k propuknutí onemocnění byli potkani náhodně rozděleni do skupin (6 až 8/skupina) a započala léčba. Léčba probíhala 6 dní (subkutánní injekce IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™ ve formě roztoku, jak je definováno výše, do hřbetu). Sedmý den po propuknutí onemocnění byla zvířata usmrcena a byla zjišťována hmotnost tlapek a zkoumány vzorky tkáně.
Měření šířky kotníku pomocí kaliperu bylo prováděno před propuknutím onemocnění, ve dni, kdy byly potkani rozděleni do skupin, a poté každý další den až do ukončení experimentu v sedmém dni. Získaná data byla následně
88--«φ »φφφ φ φ Φ · · ♦ · φ φ ·
Φ Φ Φ Φ · Φ*Φ· Φ · Φ Φ • Φ φ Φ Φ φ φ · · • Φ Φ ΦΦ ΦΦ φφ ΦΦ vyjádřena jako plocha pod křivkou, a to za účelem stanovení procentuálního omezení závažnosti průběhu arthritidy ve srovnání s kontrolní skupinou. Při ukončení experimentu byl tibiotarsální kloub příčným řezem oddělen na úrovni mediálního a laterálního kotníku, a to za účelem stanovení konečné hmotnosti tlapky, jako dalšího kritéria zánětu. Kotníky byly následně uloženy do formalínu a podrobeny zkoumání histologickými metodami (histopatologie) .
Histopatologie: Před umístěním do dekalcifikátoru Surgipath I (Surgipath, Grayslake, IL) na dobu přibližně 1 týdne, byly kotníky uloženy do 10% formalínu o neutrálním pH. Po ukončení dekalcifikace byly odstraněny články prstů a kotníky byly řezem v podélné rovině rozděleny na dvě přibližně stejně velké poloviny. Tyto byly následně zality do parafinu, rozřezány a obarveny hematoxylinem a eosinem (za účelem obecného stanovení zánětu a poškození kosti) a toluidinovou modří (za účelem určení charakteristických změn chrupavky, a to podle následujících kritérií) :
Zánět = normální stav = minimální infiltrace buněk zánětu v periartikulární tkáni = mírná infiltrace = nepříliš intenzívní infiltrace s mírným otokem = výrazná infiltrace se silným otokem = masivní infiltrace s těžkým otokem
Poškození chrupavky = normální stav = minimální až mírné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, nepozorován žádný výrazný úbytek chondrocytů nebo narušení kolagenu '89 ·44· • 4 * • 4 4 • · 4 4 4
4 ·♦
4 4
4Γ 4 4'
4 4 4 • 4 4« · <4 = mírné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována ložiska mírného úbytku chondrocytů {povrchový úbytek) a/nebo narušení kolagenu = nepříliš velké snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska většího úbytku chondrocytů (střední až hlubší zóna) a/nebo narušení kolagenu = výrazné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska velkého úbytku chondrocytů (hlubší až hluboká zóna) a/nebo narušení kolagenu = masivní snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska ohromného úbytku chondrocytů (hluboká zóna až hraniční zóna) a/nebo narušení kolagenu
Resorpce kostí = normální stav = minimální malé oblasti resorpce, obtížně pozorovatelné při malých zvětšeních, nevýznamná přítomnost osteoklastů = větší počet oblastí resorpce, tyto oblasti obtížně pozorovatelné při malých zvětšeních, vyšší počet osteoklastů = zřetelná resorpce dřeňové trabekuly a kortikální kosti bez výskytu defektů v celé tlouštice kortexu, ztráta části medulární trámčiny (trabekuly), při malém zvětšení jsou pozorovatelné léze, početnější výskyt osteoklastú = defekty v celé tloušťce kortexu kosti, často spojené s distorzí zbylého povrchu kosti, výrazná ztráta dřeně, početné osteoklasty = defekty v celé tloušťce kortexu kosti, často spojené s distorzí zbylého povrchu kosti, výrazná ztráta dřeně kosti distální tibie, velký počet osteoklastú, výskyt resorpce rovněž v menších tarsálních kostech.
— ·· ·«*· * ·· • · · • · · » a • · « ·· ·· ·« ·« * · « · • Φ · • · »· φ·
Statistická analýza: Klinické údaje sledující tloušťku kotníku byly analyzovány stanovením plochy pod křivkou znázorňující podávané dávky a následnou analýzou změn. Pomocí Studentova testu byly v každé skupině analyzovány hmotnosti tlapek (průměr ± směrodatná odchylka).
Při podáváni 100 mg/kg IL-lra v CSEP (jedna dávka denně) nebyl pozorován žádný účinek. Oproti tomu aplikace IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny (jedna dávka denně, subkutánní injekce) měla v průběhu experimentu za následek zmenšení otoků o 62% a snížení, hmotností tlapek (na konci experimentu) o 74% (obrázky 6 a 7). Tyto výsledky jasně ukazují na lepší klinické účinky denního podávání IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny oproti aplikaci IL-lra v CSEP. Histologická analýza kotníkového kloubu navíc odhalila, že ve srovnání s potkany léčenými IL-lra v CSEP dochází u potkanů léčených IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny k podstatnému snížení intenzity zánětu, tvorby pannu a poškození chrupavky a kosti (obrázek 8).
Po ověření, že dávka IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaná jednou denně ve formě subkután- . nich injekcí je schopna modulovat vývin onemocnění, byly provedeny studie stanovující trvání tohoto účinku. U potkanů léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaným jednou denně bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 53% a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 78% (obrázky 9 a 10). U potkanů postižených arthritidou léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaným jednou za dva dny bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 35% a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 62%. U potkanů postižených ar«« «ΦΦΦ ♦ »Φ ΦΦ • φ Φ Φ · Φ Φ · Φ ·
Φ Φ Φ Φ Φ Φ*> · Φ Φ *
Φ · · ΦΦ ·Φ · <r »ΦΦ ΦΦΦ
Φ Φ » ΦΦΦΦ Φ Φ
ΦΦ · ΦΦ ΦΦ φβ ΦΦ thritidou léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaným jednou za tři dny bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 27% (nevýznamné) a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 19%. Tyto výsledky znovu ukazují za důležitost udržování plazmatické koncentrace IL-lra na minimální hladině 200 ng/ml, a to v období, kdy IL-1 účinkuje v patogenezi tohoto modelu.Přerušované blokování receptoru pro IL-1 má za následek snížení účinnosti. Potkanům, kterým byl přípravek aplikován jednou za tři dny, byl tento přípravek podán v 1. a 4. dni arthritidy. Je zajímavé, že měření kaliperem prováděná 24 hodin po aplikaci přípravku (ve 2. a 5. dni) naznačovala potlačení postupu arthritidy (obrázek 9). Měření prováděná dva nebo tři dny po aplikaci přípravku (před tím, než byla potkanům aplikována další dávka) ukazují postup onemocnění, což je pravděpodobně důsledkem nižších než optimálních plazmatických koncentrací IL-lra.
I když byl v předešlém textu vynález popsán jak obecně, tak s poukazem na výhodná provedení, je zřejmé, že ve světle tohoto popisu napadnou odborníka další obměny a modifikace tohoto vynálezu.
92--
44 4444 44 • 4 ·· • 4
• * • • • • 4 4 4 4
• • • • • 444 · 4 4 4
• • * * 4 * • 4 4 4·· 444
• • 4 * 4 • 4 4 4
44 • 41 »4 44
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Collins, David S.
Bevilacqua, Michael P.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1 (iii) POČET SEKVENCÍ: 2 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32 (C) MĚSTO: Praha 1 (D) .. STÁT: Česká Republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.3 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: nepřiděleno (B) DATUM PODÁNÍ: 7. února 1997 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
(vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/011419 (B) DATUM PODÁNÍ: 9. února 1996 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/032789 (B) DATUM PODÁNÍ: 6. prosince 1996 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (A-365B-P) (B) DATUM PODÁNÍ: 23. ledna 1997 (vili) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Zindric, Thomas D.
(B) ČÍSLO SPISU: 32185 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: A-365C.
(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
....... 93.
* · • «·« • · · · · · · · ,, * ♦· ♦♦ ·· · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 462 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK: ... .....
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 3..462 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka: Přítomnost počátečního methioninu není nezbytná (xi) POPIS SEKVENCE.: SEK, ID. Č.:l:
ATG CGA CCC Met Arg Pro 1 TCT GGG Ser Gly 5 AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC TTC AGA ATC 48
Arg Lys Ser Ser Lys 10 Met Gin Ala Phe Arg 15 Ile
TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC AAC CAA CTA GTT 96
Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Val
20 25 30
GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA GAA AAG ATA GAT 144
Ala Gly Tyr Leu Gin Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp
35 40 45
GTG GTA CCC ATT GAG CČT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC CAT GGA GGG 192
Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly
P 50 55 60
-1' AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG ACC AGA CTC CAG 240
r. Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gin
65 70 75 80
CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC -AGA AAG CAG GAC 288
Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gin Asp
90 95
AAG Lys CGC Arg TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC
Phe Ala Phe Ile 100 Arg Ser Asp 105
GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC
Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe
115 120
GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG
Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met
130 135
ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG
Thr Lys Phe Tyr Phe Gin Glu Asp Glu
145 150
AGT Ser 44 · • 4 • · • 4 GGC CCC ACC’ACC • 4 4 4 4 4 · ftGT Ser 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 <4 4 4 4 4 4 4 · TTT ·· Phe 44 4 · 4 4 4 44 4 38Έ
Gly Pro Thr Thr 110
CTC TGC ACA GCG ATG GAA GCT 384
Leu Cys Thr Ala 125 Met Glu Ala
CCT GAC GAA GGC GTC ATG GTC 432
Pro Asp Glu 140 Gly Val Met Vál
TAG ' 462 ★
IV” (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 154 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii> TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:2:
Met 1 Arg Pro Ser Gly 5 Arg Lys Ser Ser Lys 10 Met Gin Ala Phe Arg 15 Ile
Trp Asp Val Asn 20 Gin Lys Thr Phe Tyr 25 Leu Arg Asn Asn Gin 30 Leu Val
Ala Gly Tyr 35 Leu Gin Gly Pro Asn 40 Val Asn Leu Glu Glu 45 Lys Ile Asp
Val Val 50 Pro Ile Glu Pro His 55 Ala Leu Phe Leu Gly 60 Ile His Gly Gly
Lys 65 Met Cys Leu Ser Cys 70 val Lys Ser Gly Asp 75 Glu Thr Arg Leu Gin 80
Leu Glu Ala Val Asn 85 Ile Thr Asp Leu Ser 90 Glu Asn Arg Lys Gin 95 Asp
Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe
100 105 110 • 4 «4 4444 44 4|
4 4 4 4 4
4 · · 0444
44 * 4 « « · · 4 4 4 4 »
4 44 44 «44 444
4 · «
Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala
115 120 125
Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val
130 135 140
Thr T.vs Phe Tyr Phe Gin Glu Asp Glu *
145 150 ' - - /.

Claims (38)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1 vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství přípravku obsahujícího polymer pro řízené uvolňování a proteinový inhibitor interleukinu-l tomuto pacientovi.
  2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněným polymerem pro řízené uvolňování je ester hydrogelu.
  3. 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněným esterem hydrogelu je hyaluronát nebo sůl hyaluronátu.
  4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že zmíněným hyaluronátem je kyselina hyaluronová.
  5. 5. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že zmíněným hyaluronátem je hylan.
  6. 6. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že zmíněným hyaluronátem je hyaluronát sodný,
  7. 7. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněným esterem hydrogelu je polyvinylpyrrolidon.
    97 ----------·· '·«« ·· ·· ·* ·· ·« · * * · · · · · a a « «·»«» · * · · • · · »· · * ♦♦ ···*·· ··· ♦ · · · ♦ · al « 4· ·· ·· ··
  8. 8. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněným esterem hydrogelu je celulóza.
  9. 9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že zmíněnou celulózou je karboxymethylcelulóza.
  10. 10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněným proteinovým inhibitorem interleukinu-1 je antagonista receptoru pro IL-1 (IL-lra).
  11. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra je glykosylován.
  12. 12. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra není glykosylován.
  13. 13. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra má na N-konci methionin.
  14. 14. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra je produkován rekombinantními technikami.
  15. 15. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněným onemocněním je nějaké zánětlivé onemocnění kloubů vybrané ze skupiny zahrnující revmatickou arthritidu, osteoarthritidu a jiné zánětlivé stavy, které jsou důsledkem natažení, podvrtnutí, infekce, poškození chrupavky nebo ortopedického chirurgického zákroku.
  16. 16. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněný přípravek je aplikován intraartikulárně nebo subkutánně.
  17. 17. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje účinné množství směsi polymeru pro řízené uvolňování a' proteinového inhibitoru interleukinu-1.
  18. 18. Přípravek podle nároku 17 vyznačující se tím, že zmíněným polymerem pro řízené uvolňování je hyaluronát nebo sůl hyaluronátu.
  19. 19. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že zmíněným hyaluronátem je kyselina hyaluronová.
  20. 20. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že zmíněným proteinovým inhibitorem interleukinu-1 je antagonista receptoru pro IL-1 (ILlra) .
  21. 21. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra je glykosylován.
  22. 22. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra není glykosylován.
  23. 23. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, Že zmíněný IL-lra má na N-konci methionin.
    • 4 · ·*·
    4 * ♦ · »» * 4 · 4 4 *
    4 4 * · · · · ► 4 4 · «4 4«
  24. 24. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že zmíněný IL-lra je produkován rekombinantními technikami.
  25. 25. Přípravek podle nároku 17 vyznačující se tím, že tento přípravek se nachází ve formě vhodné pro aplikaci do kloubní dutiny.
    *3' t
  26. 26. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že hyaluronát je zde zastoupen v koncentraci v intervalu 0,1 až 5% (w/v).
  27. 27. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že IL-lra je zde zastoupen v koncentraci v intervalu 0,1 až 200 mg/ml.
  28. 28. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že hyaluronát je zde zastoupen v koncentraci v intervalu 0,1 až 5% (w/v) a IL-lra je zde zastoupen v koncentraci v intervalu 0,1 až 200 mg/ml.
  29. 29. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že hyaluronát je zde zastoupen v koncentraci přibližně 2% (w/v) a IL-lra je zde zastoupen v koncentraci přibližně 100 mg/ml.
  30. 30. Použití farmaceutického přípravku obsahujícího účinné množství směsi polymeru pro řízené uvolňování a proteinového inhibitoru ínterleukinu-1 při přípravě léčiva pro léčbu onemocnění zprostředkovaného IL-1.
    100
    II ···· « v
    4» ·4 • 4 · · · ·
    4 « 4 · · ··* • *4 · · · * · * • 4 » 4 · · 4
    44 · ·* «·
  31. 31. Použití podle nároku 30, kde zmíněným onemocněním je nějaké zánětlivé onemocnění kloubů.
  32. 32. Použití podle nároku 31, kde zmíněným onemocněním je nějaké zánětlivé onemocnění kloubů vybrané ze skupiny zahrnující revmatickou arthritidu, osteoarthritidu a jiné zánětlivé stavy, které jsou důsledkem natažení, podvrtnutí, infekce, poškození chrupavky nebo ortopedického chirurgického zákroku.
  33. 33. Použití podle nároků 30 až 32, kde zmíněný farmaceutický přípravek je aplikován intraartikulárně.
  34. 34. Použití podle nároků 30 až 33, kde zmíněným polymerem pro řízené uvolňování je hyaluronát nebo sůl hyaluronátu.
  35. 35. Použití podle nároku 34, kde zmíněným hyaluronátem je kyselina hyaluronová.
  36. 36. Použití podle nároků 30 až 35, kde zmíněným inhibitorem interleukinu-1 je IL-lra.
  37. 37. Použití podle nároku 6, kde zmíněný IL-lra zahrnuje alespoň jednu sloučeninu ze skupiny sestávající z: IL-lraa, IL-lraP a IL-lrax.
  38. 38. Použití podle nároku 37, kde zmíněným inhibitorem IL1 je lidský rekombinantní IL-lra.
CZ0237398A 1996-02-09 1997-02-10 Farmaceutická kompozice a její použití CZ299025B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1141996P 1996-02-09 1996-02-09
US3278996P 1996-12-06 1996-12-06
US3624197P 1997-01-23 1997-01-23
US08/798,414 US6096728A (en) 1996-02-09 1997-02-07 Composition and method for treating inflammatory diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ237398A3 true CZ237398A3 (cs) 1999-09-15
CZ299025B6 CZ299025B6 (cs) 2008-04-02

Family

ID=27486083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0237398A CZ299025B6 (cs) 1996-02-09 1997-02-10 Farmaceutická kompozice a její použití

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0904112B1 (cs)
JP (2) JP4344404B2 (cs)
KR (1) KR20040010739A (cs)
CN (1) CN1215340A (cs)
AT (1) ATE448797T1 (cs)
AU (1) AU724960C (cs)
BR (1) BR9707325A (cs)
CA (2) CA2539273C (cs)
CZ (1) CZ299025B6 (cs)
DE (1) DE69739656D1 (cs)
EA (2) EA001792B1 (cs)
ES (1) ES2334726T3 (cs)
HU (1) HU230160B1 (cs)
IL (1) IL125552A0 (cs)
MX (1) MX9806191A (cs)
NO (1) NO983543L (cs)
NZ (2) NZ331163A (cs)
SK (1) SK288144B6 (cs)
WO (1) WO1997028828A1 (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2312179T3 (es) 1996-12-06 2009-02-16 Amgen Inc. Terapia combinada que utiliza un inhibidor del il-1 para el tratamiento de enfermedades mediadas por el il-1.
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
HK1042114B (zh) 1998-10-23 2006-09-29 Amgen K-A, Inc. 与mp1受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
AT406054B (de) * 1998-11-04 2000-02-25 Andreas Bernkop-Schnuerch Verfahren zur verbesserung der mucoadhäsion von polymeren sowie deren herstellung und verwendung
ATE311868T1 (de) * 1999-06-21 2005-12-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd Arzneimittel für die rheumatoide arthritis
KR20020012320A (ko) * 1999-07-21 2002-02-15 그레고리 에이. 데모풀로스 동통, 염증 및 연골 퇴화를 억제하기 위한 용액 및 억제방법
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
MXPA02010787A (es) * 2000-05-03 2003-07-14 Amgen Inc Peptidos modificados como agentes terapeuticos.
US7324635B2 (en) 2000-05-04 2008-01-29 Telemaze Llc Branch calling and caller ID based call routing telephone features
AU2001259758A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-26 Immunex Corporation Interleukin-1 inhibitors in the treatment of diseases
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CA2423227C (en) 2000-10-12 2011-11-29 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
EP1409016B9 (en) 2001-06-26 2020-10-28 Amgen Fremont Inc. Antibodies to opgl
US6818613B2 (en) * 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
EP1465596A1 (en) * 2002-01-18 2004-10-13 Control Delivery Systems, Inc. Polymeric gel system for the controlled delivery of codrugs
AU2003234628B2 (en) 2002-05-21 2007-08-23 Amgen Inc. Substituted heterocyclic compounds and methods of use
DK1572946T3 (da) 2002-09-06 2012-07-02 Amgen Inc Terapeutisk humant monoklonalt anti-IL-1R1-antistof
US7553827B2 (en) 2003-08-13 2009-06-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of cycline compounds
US8273347B2 (en) 2003-05-13 2012-09-25 Depuy Spine, Inc. Autologous treatment of degenerated disc with cells
US7429378B2 (en) 2003-05-13 2008-09-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors
US7344716B2 (en) 2003-05-13 2008-03-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines
US8361467B2 (en) * 2003-07-30 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
HUE040595T2 (hu) 2004-04-02 2019-03-28 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Eljárás IL-1ra aggregációjának csökkentésére
EP1797127B1 (en) 2004-09-24 2017-06-14 Amgen Inc. Modified fc molecules
ES2436179T3 (es) * 2004-12-30 2013-12-27 Genzyme Corporation Regímenes para viscosuplementación intraarticular
EP1896072A4 (en) * 2005-06-24 2013-01-09 Univ Duke SYSTEM FOR DIRECT HEALTH MANAGEMENT BASED ON HEAT-CONTROLLED BIOPOLYMERS
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
GB0708376D0 (en) 2007-05-01 2007-06-06 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
US8323635B2 (en) 2007-11-14 2012-12-04 General Regeneratives, Ltd. Methods of using interleukin-1 receptor antagonist as a myeloprotective agent
US8986696B2 (en) 2007-12-21 2015-03-24 Depuy Mitek, Inc. Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints
US10106587B2 (en) 2008-02-27 2018-10-23 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
KR200451958Y1 (ko) * 2008-10-09 2011-01-21 (주)에이치시티 모바일기기용 카드형 안테나장치
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
US20110052561A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-03 Biomet Biologics,LLC Osteolysis treatment
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
CN101690801B (zh) 2009-10-26 2012-08-01 上海交通大学 白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物
DE202009017772U1 (de) 2009-12-10 2011-04-21 Orthogen Ag Kombinationspräparate mit Cytokin-Antagonist und Corticosteroid
RU2563830C2 (ru) * 2011-02-08 2015-09-20 Эббви Инк. Лечение остеоартрита и боли
EP2672985B1 (en) 2011-02-11 2016-04-27 Swedish Orphan Biovitrum AB (Publ) Citrate free pharmaceutical compositions comprising anakinra
WO2013016220A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
CA2847328A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Novozymes Biopharma Dk A/S Oral formulations containing hyaluronic acid for sustained drug release
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
US9758806B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Acellular compositions for treating inflammatory disorders
US9878011B2 (en) 2013-03-15 2018-01-30 Biomet Biologics, Llc Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions
CA2924661A1 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Ascendis Pharma Osteoarthritis Division A/S Hydrogel-linked il-1ra prodrug
US20160000936A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
CZ309295B6 (cs) * 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
WO2018022982A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Trustees Of Boston University Age-associated clonal hematopoiesis accelerates cardio-metabolic disease development
EP3600441A1 (en) 2017-03-22 2020-02-05 Genentech, Inc. Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
JP7241782B2 (ja) * 2018-06-22 2023-03-17 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 顎関節変性疾患の治療用の持続放出性組成物およびその方法
EP3836954B1 (en) 2018-08-13 2025-05-07 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
WO2020112853A1 (en) * 2018-11-28 2020-06-04 Genascence Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
JP7395210B2 (ja) * 2019-08-08 2023-12-11 アヴィデンス セラピューティクス， インコーポレイテッド ミクロスフェアに基づく注射用セレコキシブ製剤
WO2023222565A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for assessing the exhaustion of hematopoietic stems cells induced by chronic inflammation

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ATE289350T1 (de) 1989-04-21 2005-03-15 Amgen Inc Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafür kodierende dnas
IL95031A (en) 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc Method for the production of a human recombinant tumor necrosis factor inhibitor
CA2485553A1 (en) 1989-09-05 1991-03-21 Immunex Corporation Tumor necrosis factor - .alpha. and - .beta. receptors
AU649245B2 (en) * 1990-04-02 1994-05-19 Amgen, Inc. Methods for treating interleukin-1 mediated diseases
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
WO1991017184A1 (en) 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
NO940913L (no) * 1993-03-26 1994-09-27 Bristol Myers Squibb Co Preparater for kontrollert frigivelse av biologisk aktiv TGF-
JPH06321803A (ja) * 1993-05-17 1994-11-22 Kirin Brewery Co Ltd 水溶性ペプチドホルモンの徐放性製剤
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
AU8016094A (en) * 1993-10-12 1995-05-04 Mary Lake Polan Method of contraception
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
CA2192821A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Wayne R. Gombotz Controlled release polypeptide compositions and methods of treating inflammatory bowel disease
IT1269989B (it) 1994-09-21 1997-04-16 Dompe Spa Antagonisti recettoriali di il-1 ad aumentata attivita' inibitoria

Also Published As

Publication number Publication date
EA199800694A1 (ru) 1999-02-25
ATE448797T1 (de) 2009-12-15
SK103698A3 (en) 2001-01-18
AU2121397A (en) 1997-08-28
SK288144B6 (sk) 2013-12-02
WO1997028828A1 (en) 1997-08-14
HUP9902612A2 (hu) 1999-11-29
JP2007211027A (ja) 2007-08-23
ES2334726T3 (es) 2010-03-15
CA2244664C (en) 2008-06-03
IL125552A0 (en) 1999-03-12
HUP9902612A3 (en) 2001-11-28
HU230160B1 (hu) 2015-09-28
JP4344404B2 (ja) 2009-10-14
DE69739656D1 (de) 2009-12-31
CA2539273C (en) 2014-02-04
KR20040010739A (ko) 2004-01-31
NZ503548A (en) 2001-09-28
CZ299025B6 (cs) 2008-04-02
NO983543D0 (no) 1998-07-31
AU724960C (en) 2002-08-15
BR9707325A (pt) 1999-04-13
EP0904112A1 (en) 1999-03-31
CA2539273A1 (en) 1997-08-14
CN1215340A (zh) 1999-04-28
JP2001500472A (ja) 2001-01-16
CA2244664A1 (en) 1997-08-14
NZ331163A (en) 2000-07-28
NO983543L (no) 1998-10-08
EA200000825A1 (ru) 2001-02-26
MX9806191A (es) 1998-10-31
AU724960B2 (en) 2000-10-05
EP0904112B1 (en) 2009-11-18
EA001792B1 (ru) 2001-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ237398A3 (cs) Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním zprostředkovaným IL-1
US6294170B1 (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
US6096728A (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
CA2273852C (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
ES2288304T3 (es) Receptores tipo i del factor de necrosis tumoral truncados y solubles.
CA2273850A1 (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
AU748575B2 (en) Composition comprising interleukin-1 inhibitor and controlled release polymer
AU5400701A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170210