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CN1215340A - 包含白介素－1抑制剂和控释聚合物的组合物 - Google Patents

包含白介素－1抑制剂和控释聚合物的组合物 Download PDF

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CN1215340A
CN1215340A CN97193632A CN97193632A CN1215340A CN 1215340 A CN1215340 A CN 1215340A CN 97193632 A CN97193632 A CN 97193632A CN 97193632 A CN97193632 A CN 97193632A CN 1215340 A CN1215340 A CN 1215340A
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CN
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CN97193632A
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D·S·科林斯
M·P·贝维拉瓜
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Amgen Boulder Inc
Original Assignee
Amgen Inc
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Abstract

药用组合物包含(a)有效量的控释聚合物和(b)有效量的IL－1ra。该组合物表现出对炎症的治疗效果,并可用于治疗IL－1介导的炎症性疾病,特别是关节疾病。

Description

包含白介素-1抑制剂和控释聚合物的组合物
                        发明领域
本发明涉及炎症领域。更具体地讲，本发明涉及用于预防或治疗炎症疾病的组合物。
                        发明背景
炎症是机体对诸如机械损伤、感染或抗原刺激引起的损伤的防御反应。当用诸如自身抗原之类的不当刺激物诱导炎症时，在除去损伤剂后可以以过大的形式或持久地病理性地表达炎症反应。
尽管人们对炎症的病因学的认识较少，但最近已经获得了关于炎症分子方面的相当多的资料。这种研究导致据信在炎症调节中作用(figure)显著的某些细胞因子的鉴定。细胞因子是修饰细胞、特别是在细胞因子合成和释放速发区域(immediate area)中的细胞行为的胞外蛋白。白介素-1(IL-1)是已经发现的其中一种最有效的炎性细胞因子和被认为是为被称为“白介素-1介导疾病”的许多疾病和紊乱中的关键介质的细胞因子。由巨噬细胞/单核细胞谱系的细胞产生的IL-1可以以两种形式产生：IL-1 alpha(IL-1α)或IL-1 beta(IL-1β)。
如果自发性或实验性疾病或紊乱与体液或组织中较高水平的IL-1相关，或从所述机体中取出的细胞或组织在培养中产生较高水平的IL-1，那么所述疾病或紊乱被认为是“白介素-1介导的疾病”。在许多情况下，由以下另外两种状况也可识别这类白介素介导的疾病：(1)可以通过给与IL-1在动物中实验性地模拟与所述疾病或紊乱有关的病理学发现；以及(2)可以通过用抑制IL-1作用的药物治疗，抑制或消除所述疾病或紊乱的实验性动物模型中诱导的病理。在大多数白介素-1介导的疾病中，遇到至少三种状况中的两个，在许多白介素-1介导的疾病中，遇到所有三种状况。非全部的急性和慢性白介素-1(IL-1)介导的炎症疾病的一览表包括(但不限于)以下：急性胰腺炎；ALS；早老性痴呆；恶病质/厌食；哮喘；动脉粥样硬化；慢性疲劳综合征；发热；糖尿病(例如胰岛素性糖尿病)；肾小球性肾炎；移植排斥反应；出血性休克；痛觉过敏；炎性肠病；关节的炎症性疾病，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；缺血性损伤，包括小脑缺血(例如由创伤引起的脑损伤、癫痫、出血或中风，每种都可能导致神经变性)；肺病(例如ARDS)；多发性骨髓瘤；多发性硬化；髓细胞性白血病(例如AML和CML)和其它白血病；肌病(例如肌蛋白代谢，尤其是在脓毒症中)；骨质疏松；帕金森氏病；疼痛；早产；牛皮癣；再灌注损伤；脓毒性休克；放疗的副作用、暂时性下颌关节病、肿瘤转移；或由劳累、扭伤、软骨损害、创伤、整形外科、感染或其它疾病产生的炎症疾病。
关节的炎症性疾病是慢性关节疾病，在不同程度上使全世界上百万人痛苦和残废。类风湿性关节炎是软骨和骨被称为血管翳(由滑膜衍生)的增生性的侵入性连结组织慢慢侵蚀掉的关节疾病。该该病可能涉及诸如肌囊、腱鞘和腱的关节周结构以及关节外组织，诸如皮下组织、心血管系统、肺、脾、淋巴结、骨骼肌、神经系统(中枢和外周)和眼(Silberberg(1985),Anderson′s Pathology,Kissane(编辑)，Ⅱ:1828)。骨关节炎是一种特征为关节软骨的变性性变化和损伤关节周围骨和软骨的反应性增生的常见关节疾病。骨关节炎是细胞介导的活性过程，可能由软骨细胞对异化和同化刺激物的不当反应引起的。报道了在早期骨关节炎中发生关节软骨的某些基质分子的变化(Thonar等(1993),Rheumatic disease clinics of North America,Moskowitz(编辑)，19:635-657和Shinmei等(1992),Arthritis Rheum.,35:1304-1308)。
据信类风湿性关节炎是由相关抗原呈递给免疫遗传易感宿主引起的。可能潜在引发导致类风湿性关节炎的免疫应答的抗原可能是外源性的或内源性的。可能的内源抗原包括胶原蛋白、粘多糖和类风湿因子。外源抗原包括支原体、分支杆菌、螺旋体和病毒。所述免疫反应的副产物使所述滑膜发炎(即前列腺素和氧游离基)并触发破坏性关节变化(即胶原酶)
疾病的严重程度是不同的，但许多病人经历一段时间的间歇性复发和缓解，总形式为缓慢进行性关节破坏和变形。临床表现可以包括伴有疼痛的外周关节对称性多关节炎、触痛、肿胀和受影响关节功能的丧失；早晨性僵硬；和软骨的丧失、骨物质的侵蚀和持久性炎症后的关节半脱位。关节外的表现包括类风湿性结节、类风湿性结节性脉管炎、胸膜肺性炎、巩膜炎、干燥综合征(sicca syndrome)、Felty氏综合征(脾大和中性白细胞减少症)、骨质疏松和体重减少(Katz(1985),Am.J.Med.,79:24和Krane和Simon(1986),Advances in Rheumatology,Synderman(编辑)，70(2):263-284)。临床表现导致高度的发病率，导致扰乱所述病人的日常生活。
两个不同方面的证据已经暗示白介素-1参与关节炎。首先，在滑膜组织和关节流体中已经发现白介素-1的水平较高和编码白介素-1的mRNA水平较高。参见例如Buchan等，“Thrid Annual General Meeting ofthe British Society for Rheumatology”英国伦敦，11月，19-21,1988,J.Rheumatol.,25(2)；Fontana等，(1982),Rheumatology Int.,2:49-53；和Duff等，(1988),Monokines and Other Non-Lymphocytic Cytokines,M.Powanda等(编辑)，第387-392页(Alan R.Liss,Inc.)。
第二，将白介素-1给与健康的关节组织已经表明在多种情况下导致软骨和骨的侵蚀。在一个实验中，给兔关节内注射IL-1表现出引起体内软骨破坏(Pettipher等，(1986),Proc Nat’l Acad Sci.U.S.A.,83:8749-8753)。在另一项研究中，表明IL-1在组织外植体中引起软骨和骨的变性(Saklatavala等(1987),Development of Diseases of Cartilageand Bone Matrix,Sen和Thornhill(编辑)，第291-298页(Alan R.Liss,Inc.)和Stashenko等，(1987),The American Association of Immunologists,183:1464-1468)。用来解释IL-1和关节炎之间原因连结的一个一般接受的理论是，IL-1刺激诸如成纤维细胞和软骨细胞的各种细胞类型，以产生和分泌原炎性或变性性化合物，诸如前列腺素E2和金属蛋白酶。
白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是一种作为IL-1天然抑制剂的人类蛋白。IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)已经公开为用于临床治疗IL-1介导疾病的潜在药物(澳大利亚专利649245号)。然而，IL-1ra的半衰期相对短。因此，最好是给与控释制剂中的IL-1ra，以治疗IL-1介导的疾病。
用于控释制剂中的一种材料是透明质酸。透明质酸是由非支链的D-葡糖苷酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺残基组成的天然存在的粘多糖。该聚合物的平均分子量为(5-6)×106，表现出出色的生物相容性。在关节软骨中，透明质酸在通过与蛋白多糖聚集构建所述软骨基质中起重要作用。此外，已经报道了在诸如类风湿性关节炎、骨关节炎和感染性关节炎的病理状态下，所述关节中透明质酸的浓度和分子量改变，引起所述滑液性质的改变。
透明质酸的化学交联和衍生已经用来提高其流变学性质或增加某些药物的降解时间(Cortivo等，(1991),Biomaterials,2:727-730；Benedetti等，(1990),J.Controlled Release,13:33-41和Hunt等(1990),J.Controlled Release,12:159-169)。
已经表明，在临床和基础研究中注射高分子量的透明质酸衍生物可以修复关节软骨表面上受损的透明质酸层，并可以有效地治疗某些种类的关节疾病。描述使用这类透明质酸衍生物治疗关节疾病的科学出版物的实例包括Nizolek和White(1981),Cornell Vet.,71:355-375；Namiki等(1982),Int.J.Chem.Pharmacol.,Therapy and Toxicol.,20:501-507；Asheim和Lindblad(1976),Acta Vet Scand,17(4):379-394；Svanstrom(1978),Proceedings of the 24th Annual Convention of theAmerican Association of Eqine Practitioners,St Louis,Mo.，第345-348页；Wigren等，(1975),Upsala J Med Sci.增刊，17:1-20；和Gingerich等，(1980),Res Vet Sci,30:192-197。Peyron等，(1974)(Pathologie Biologie,22(8):731-736)报道了在人关节中使用透明质酸。由于Pharmacia的HylartilTM和Hylartin VTM产品和Sterivet的SynacidTM产品，已经在商业上促进在马关节中关节内使用透明质酸。然而，尽管诸如疼痛和僵硬之类的症状在治疗关节疾病方面成为严重的问题，但透明质酸不能直接改善这类症状。
另外，透明质酸已经用于药物传递。描述在各种动物、特别是马关节中单独和与可的松一起使用透明质酸的一个科学出版物是Rydell等，(1971),Clinical Orhtopaedics and Related Research,80:25-32。另一科学出版物描述将来自透明质酸酯的微球体制剂用于胰岛素的鼻传递(Illum等(1994),J.Controlled Release,29:133-141)。通过乳化/溶剂蒸发技术可以制备空白球体，接触胰岛素溶液1小时，然后冻干。当将其给与羊时，发现与通过皮下途径给与胰岛素相比，平均生物利用度为11％。该系统也已经用作神经生长因子的传递装置(Ghezzo等，(1992),Int.J.Pharm.,87:21-29)。然而，已经报道了当给狗膝盖注射生理浓度(3mg/ml)的高分子量(Mr 6×106)或低分子量(Mr 5×105)透明质酸与放射活性的白蛋白时，所述白蛋白分布体积和清除率略微超过减低高分子量透明质酸浓度(0.03mg/ml)或低分子量透明质酸浓度(0.3mg/ml)的膝盖分布体积和清除率(Myers和Brandt(1995),J.Rheumatol.,22:1732-1739)。该参考文献提示，在治疗炎症性疾病中，特别是当通过关节内注射给与时，透明质酸与诸如IL-1ra的蛋白的联合不会比单独的透明质酸更有效。
本发明的一个目的是提供用于治疗IL-1介导的炎症性疾病的治疗方法和组合物。由下文的描述，本发明的该目的和其它目的会变得显而易见。
                        发明概述
本发明涉及包含控释聚合物(例如透明质酸衍生物(透明质酸衍生物))和作为治疗IL-1介导炎症性疾病的蛋白性IL-1抑制剂(例如-1ra)的药用组合物。在此所指的治疗类型是用于哺乳动物，包括人类。
                        附图简述
参考附图，本发明的多个方面和优点会变得显而易见，其中：
图1显示皮下注射或者柠檬酸盐缓冲液(CSEP)中的单独的IL-1ra或CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra后的IL-1ra血清水平。
图2显示关节内注射或者CSEP中的单独的IL-1ra或CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra后，在豚鼠关节中残余的IL-1ra量。
图3显示关节内注射或者CSEP中的单独的IL-1ra或CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra后，兔回收滑液中残余的IL-1ra浓度。
图4显示关节内注射或者CSEP中的单独的IL-1ra或CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra后，用牛Ⅱ胶原免疫的兔膝关节中疾病严重性的组织学评价。
图5显示编码重组人IL-1ra(rhuIL-1ra)的核酸序列(SEQ IDNO:1)。也显示rhuIL-1ra的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，其起始氨基酸为Mn，其中n等于0或1。
图6显示与CSEP中的IL-1ra或CSEP中的透明质酸或单独的CSEP相比，每日注射一次(QD)所示CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra对已建立Ⅱ型胶原关节炎的大鼠的踝关节直径随时间的影响。
图7显示与CSEP中的IL-1ra或CSEP中的透明质酸或单独的CSEP相比，每日注射一次(QD)所示CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra对已建立Ⅱ型胶原关节炎的大鼠的足趾重量的影响。
图8显示与CSEP中的IL-1ra或CSEP中的透明质酸或单独的CSEP相比，每日注射一次(QD)所示CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra对已建立Ⅱ型胶原关节炎的大鼠的炎症、血管翳形成和软骨和骨损害的影响。
图9显示与CSEP中的透明质酸(QD)或不治疗相比，每日注射一次(QD)、每二日注射一次(Q2D)或每三日注射一次(Q3D)所示CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra对已建立Ⅱ型胶原关节炎的大鼠的踝关节直径随时间的影响。
图10显示与CSEP中的透明质酸(QD)或不治疗相比，每日注射一次(QD)、每二日注射一次(Q2D)或每三日注射一次(Q3D)所示CSEP中的与透明质酸混合的IL-1ra对已建立Ⅱ型胶原关节炎的大鼠的足趾重量的影响。
                        详细说明
本发明的药用组合物含有控释聚合物(例如透明质酸衍生物)和蛋白性IL-1抑制剂(例如IL-1ra)的混合物。在一具体实施方案中，本发明涉及给与含有透明质酸衍生物和蛋白性IL-1抑制剂(例如IL-1ra)的药用制剂，导致相对长时间的IL-1ra水平的提高。Collins于1996年2月9日申请的临时申请传送文件(transmittal letter)中题为“用于治疗炎症性疾病的组合物和方法”(代理律师登录号为A-365P)的美国临时申请60/011,419号、Collins和Bevilacqua于1996年12月6日申请的临时申请传送文件中题为“用于治疗炎症性疾病的组合物和方法”(代理律师登录号为A-365A-P)的美国临时申请60/032,789号、Collins和Bevilacqua于1997年1月23日申请的临时申请传送文件中题为“用于治疗炎症性疾病的组合物和方法”(代理律师登录号为A-365B-P)的美国临时申请______号，公开的说明书通过引用结合到本文中。
白介素-1抑制剂可以是能够特异性地防止细胞受体活化为IL-1的任何蛋白。白介素-1抑制剂的类别包括：白介素-1受体拮抗剂，诸如下述的IL-1ra；抗IL-1受体单克隆抗体(EP 623674)；IL-1结合蛋白，诸如可溶性IL-1受体(美国专利5,492,888、5,488,032、5,464,937、5,319,071和5,180,812)；抗IL-1单克隆抗体(WO 9501997、WO9402627、WO 9006371、美国专利4,935,343、EP 364778、EP267611和EP 220063)；和IL-1受体辅助蛋白(WO 96/23067)，这些专利通过引用结合到本文中。
美国专利5,075,222(本文称为’222专利)、WO 91/08285、WO91/17184、AU 9173636、WO 92/16221和WO 96/22793中描述了优选的IL-1ra(糖基化和非糖基化的)以及制备和使用它们的方法，这些专利通过引用结合到本文中。
具体地说，在’222专利中描述了三种有用形式的IL-1ra(IL-1raα、IL-1raβ和IL-1rax)及其变异体。IL-1raα的特征为在SDS-PAGE上的分子量为22-23kD，等电点大约为4.8，在含约52mM NaCl的Tris缓冲液(pH为7.6)从Mono Q FPLC柱上洗脱。IL-1raβ的特征为22-23kD的蛋白，在48mM NaCl下从Mono Q柱上洗脱。IL-1raα和IL-1raβ都为糖基化的。IL-1rax的特征为20kD的蛋白，在48mM NaCl下从Mono Q柱上洗脱，为非糖基化的。所有这三种抑制剂都具有相似的功能和免疫学活性。
一个公开的生产IL-1ra的方法包括从人类单核细胞中分离天然产生的IL-1ra。第二个公开的方法包括分离负责编码IL-1ra的基因，在适当的载体和细胞类型中克隆该基因，表达该基因以产生该抑制剂并收获该抑制剂。后一方法一般为典型的重组DNA方法，是优选方法。重组DNA方法是优选的，部分原因是它们能够达到相对大量的纯度较高的蛋白。因此，本发明也包括由于在原核细胞(诸如大肠杆菌)中表达而含有N末端甲硫氨酰基团的IL-1ra。
如上所述，本发明也包括修饰形式的IL-1ra。本文所用的所述修饰形式的IL-1ra包括变异多肽，其中在IL-1ra的氨基酸序列的残基中氨基酸已经(1)缺失(“缺失变异体”)，(2)插入(“插入变异体”)或(3)置换(“置换变异体”)。
对于IL-1ra缺失变异体，每种多肽通常可以具有大约1-30个残基的氨基缺失，更常见的是缺失大约1-10个残基，最常见的是缺失大约1-5个邻近残基。也设想N末端、C末端和内部序列内缺失。IL-1ra氨基酸序列内的缺失可以在与IL-1家族其它成员同源性低的区域制备。IL-1ra氨基酸序列内的缺失可以在与IL-1家族其它成员序列大致同源的区域中制备，并且更可能显著修饰所述生物学活性。
对于IL-1ra插入变异体，每种多肽可以包括长度为1-100个残基或更多残基的氨基末端和/或羧基末端的融合、以及单个或多个氨基酸残基的内部序列内插入。内部插入通常可以为大约1-10个氨基酸残基，更常见的大约1-5个氨基酸残基，最常见的是大约1-3个氨基酸残基。
氨基末端插入变异体包括甲硫氨酸(例如作为该蛋白在细菌重组细胞培养物中的直接表达的人工产物)或另一氨基酸残基或序列的插入。氨基末端插入的另一实例包括单个序列的融合、以及或与其它前原序列的融合，以促进蛋白从重组宿主细胞分泌。每种多肽可以包含选定待识别或加工的信号序列，即被宿主细胞的信号肽酶切割的信号序列。对于不识别和加工天然IL-1ra信号序列的原核宿主细胞，每种多肽可以包含一个选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素Ⅱ前导序列的原核细胞信号序列。对于酵母细胞，每种多肽可以具有选自例如酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶前导序列的信号序列。对于哺乳动物细胞的表达，每种多肽可以具有IL-1ra的天然信号序列，尽管其它哺乳动物信号序列可以是例如得自其它IL-1家族成员的合适序列。
羧基长末端插入变异体包括嵌合蛋白，其中每种包括IL-1ra与人免疫球蛋白重链或轻链的所有或部分恒定区。优选这类嵌合蛋白其中每种的免疫球蛋白部分包含除人免疫球蛋白(诸如IgG、IgA、IgM或IgE，尤其是IG例如IgG1或IgG3)重链恒定区的第一个结构域外的所有恒定区。技术人员认识到，每个免疫球蛋白部分的任何氨基酸都可以缺失或用一个或多个氨基酸置换，或可以插入一个或多个氨基酸，只要所述IL-1ra仍拮抗所述IL-1受体，并且所述免疫球蛋白部分表现出一个或多个其特征性质。
对于IL-1ra置换变异体，每种这种多肽可以在IL-1ra中至少除去一个氨基酸残基，并且在其位置上插入一个不同的残基。置换变异体包括等位变异体，其特征在于在所述物种群体中天然存在的核苷酸序列的变化可以或不可以导致氨基酸的变化。本领域技术人员可以使用关于在可能的突变位点的选择中该多肽结合位点或活性位点的任何已知的资料。在WO 91/17184、WO 92/16221和WO 96/09323中指出了典型的置换变异体。
鉴定诱变蛋白的氨基酸残基或区域的一个方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989),Science,244:1081-1085，其说明书通过引用结合到本文中)。在该方法中，鉴定蛋白的一个氨基酸残基或一组靶残基(例如带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)置换，以实现所述氨基酸与该细胞内或该细胞外的周围水性环境相互作用。然后通过在置换位点上引入其它残基，精制证明对所述置换功能上敏感的那些残基。因此，预定引入氨基酸修饰的位点，以优化给定位点上突变的性能，可以进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛选产生的变异体多肽以优化组合所需的活性和活性程度。
用于置换诱变的最感兴趣的位点包括在IL-1ra发现的氨基酸在侧链大小、电荷和/或疏水性方面不同于IL-1ra样蛋白(诸如其它不同物种或IL-1家族的其它成员的IL-1ra)的位点。感兴趣的其它位点包括IL-1ra的具体残基与这类IL-1ra样蛋白相同的那些位点。这类位置一般对于蛋白的生物学活性是重要的。最初，通过以相当保守的方式置换修饰这些位点。这类保守置换示于表1“优选置换”的标题下。如果这类置换导致生物学活性的改变，那么引入更实际的改变(典型的置换)和/或可以制备其它插入/缺失，并筛选产生的多肽。
              表1
            氨基酸置换原始            优选          典型残基            置换          置换Ala (A)         Val       Val；Leu；IleArg (R)         Lys       Lys；Gln；AsnAsn (N)         Gln       Gln；His；Lys；
                      ArgAsp (D)         Glu       GluCys (C)         Ser       SerGln (Q)         Asn       AsnGlu (E)         Asp       AspGly (G)         Pro       ProHis (H)         Arg       Asn；Gln；Lys；
                      ArgIle (I)         Leu       Leu；Val；Met；
                      Ala； Phe；
                      正亮氨酸Leu (L)         Ile       正亮氨酸
                      Ile；Val；Met；
                      Ala； PheLys (K)         Arg       Arg；Gln；AsnMet (M)         Leu       Leu；Phe；IlePhe (F)         Leu       Leu；Val；Ile；
                      AlaPro (P)         Gly       GlySer (S)         Thr       ThrThr (T)         Ser       SerTrp (W)         Tyr       TyrTyr (Y)         Phe       Trp；Phe；Thr；
                      SerVal (V)         Leu       Ile；Leu；Met；
                      Phe；Ala；
                      正亮氨酸
对IL-1ra氨基酸序列的保守修饰(和对编码核酸序列的相应的修饰)预计产生具有相似功能和化学特性的蛋白。相反，可以通过选择在保持以下的作用方面显著不同的置换，完成在IL-1ra功能和/或化学特性方面的实际置换：(a)所述置换区多肽主链的结构，例如片层或螺旋构型，(b)所述靶位点上所述蛋白的电荷或疏水性或(c)所述侧链的大小。天然存在的残基根基普通的侧链性质分为几组：
1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；
3)酸性：Asp、Glu；
4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
5)芳族：Trp、Tyr、Phe；以及
6)影响链取向的残基：Gly、Pro。
非保守置换可以包括将这些组中其中一组中的一个成员交换为另一成员。这类置换的残基可以引入与其它IL-1家族成员同源或非同源的IL-1ra区中。
IL-1ra序列中的特异性突变可以包括N末端、C末端或可以通过加入N-连接或O-连接的碳水化合物修饰的该蛋白任何位点上的非天然氨基酸置换。这类修饰可以具有特殊用途，诸如在加入氨基酸(例如半胱氨酸)方面，这对于按下述连接水溶性聚合物以形成衍生物是有利的。此外，可以修饰IL-1ra的序列，以加入糖基化位点或缺失N-连接或O-连接糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点包括一个由适当的细胞糖基化酶识别的三肽序列。这些三肽序列或者为Asn-Xaa-Thr，或者为Asn-Xaa-Ser，这里Xaa可以是Pro以外的任何氨基酸。
在具体实施方案中，所述变异体大致与IL-1ra的氨基酸(SEQ IDNO:2)同源。本文所用的术语“大致同源”是指同源的程度优选超过70％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％，或最优选超过95％。本文所述的同源百分比按Dayhoff(Atlas of Protein Sequence andStructure,5:124(1972),National Biochemical Research Foundation,Washington,D.C.，其说明书通过引用结合到本文中)所述，将所述两个序列用待比较序列中相同的氨基酸残基对准，当可以导入长度为100个氨基酸的4个缺口以助于该对准时，以两个序列中的较小序列的发现的氨基酸残基的百分比计算。可以借助于抗体与SEQ ID NO:2氨基酸序列的交叉反应性分离的IL-1ra变异体或可以通过与SEQ ID NO:1的DNA或其区段杂交分离的其基因也包括为大致同源。
下面进一步详细地描述IL-1ra变异体的生产。可以通过将适当的核苷酸变化引入编码IL-1ra变异体的DNA中，或通过体外化学合成所需IL-1ra变异体，制备这类变异体。本领域技术人员会认识到，可以制备缺失、插入或置换的许多组合，条件是最后的IL-1ra变异体具有生物学活性。
用于置换、插入或缺失一个或多个选定氨基酸残基的诱变技术本领域技术人员熟知的(例如美国专利4,518,584，其说明书通过引用结合到本文中)。在每种氨基酸序列变异体的构建中有两个是原则上可变的，即所述突变位点和所述突变的性质。在设计每种变异体中，每个突变位点的位置和每个突变的性质取决于该修饰的生物化学特性。每个突变位点可以单个修饰或系列修饰，例如通过(1)根据达到的结果，用保守氨基酸选择置换第一个残基，然后用更多的基团选择进行置换，(2)缺失靶氨基酸残基或(3)将一个或多个氨基酸残基邻近定位的位点插入。
已知本文的说明书，本领域技术人员可以制备化学修饰的IL-1ra衍生物和IL-1ra变异体。用糖基化、非糖基化或去糖基化IL-1ra和IL-1ra变异体，可以制备缀合物。通常使用非糖基化IL-1ra和IL-1ra变异体。用于衍生IL-1ra和IL-1ra变异体的合适的化学部分包括水溶性聚合物。
希望是水溶性聚合物，因为连接每种聚合物的蛋白在诸如生理环境的水性环境中不沉淀。该聚合物最好对于治疗产物或组合物的制备是药学上可接受的。本领域技术人员能够根据以下这类考虑选择所需的聚合物：该聚合物/蛋白缀合物是否用于治疗，如果用于治疗，那么所需的剂量、循环时间和对蛋白水解的抗性。
合适的、临床上可接受的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、一甲氧基聚乙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酐共聚物、聚(β-氨基酸)(或者为均聚物，或者为随机共聚物)、聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)和其它聚环氧化物、聚环氧丙烷/乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨醇或聚氧乙烯化葡萄糖、colonic acid或其它碳水化合物聚合物、Ficoll或右旋糖和它们的混合物。
本文所用的聚乙二醇是指包括诸如单-(C1-C10)-烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇的用于衍生其它蛋白的任何形式。聚乙二醇丙醛由于它在水中的稳定性，可能在生产方面是有利的。
所述水溶性聚合物每种都可以具有任何分子量，可以支链的或非支链的。所述水溶性聚合物的每种的平均分子量通常为大约2-100kDa(术语“大约”表明在水溶性聚合物的制备中，某些分子会比所述分子量重些或轻些)。每种水溶性聚合物的平均分子量优选为大约5-50kDa，更优选为大约12-25kDa，最优选为大约20kDa。一般而言，分子量越大或支链越多，所述聚合物：蛋白的比率则越大。根据所需的治疗特征描述(例如缓释的持续时间、如果有的话，对生物学活性的作用、处理难易、抗原性的程度或缺乏和水溶性聚合物对治疗蛋白的其它已知作用)，可以使用其它大小。
考虑到对该蛋白的功能和抗原结构域的影响，所述水溶性聚合物的每种应该连接在该蛋白上。一般而言，可以在用来使蛋白与活化聚合物分子反应的适当条件下进行化学衍生。可以用来连接该聚合物与所述活性部分的活化基团包括以下：砜、马来酰亚胺、巯基、硫羟基、三氟甲磺酸酯、tresylate、氮丙啶、环氧乙烷和5-吡啶基。
每个所述水溶性聚合物一般连接到该蛋白的氨基酸的α-或ε-氨基或活性硫羟基上，但也设想水溶性基团可以在适当的反应条件下连接到该蛋白的任何反应基上，所述反应基具有足够活性以连接到水溶性基团上。因此，水溶性聚合物可以通过反应基(诸如游离氨基或羧基)共价连接到蛋白上。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基。具有游离羧基的那些氨基酸残基包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。具有活性硫羟基的那些氨基酸残基包括半胱氨酸残基。
制备与水溶性聚合物结合的蛋白的方法一般包括以下步骤：(a)在一些条件下使蛋白与水溶性聚合物反应，由此该蛋白变为与一个或多个水溶性聚合物连接，并且(b)获得该反应产物。每种结合的反应条件选自本领域技术人员已知的或随后发展的任何条件，但应该选择条件以避免或限制暴露于诸如可能失活待修饰蛋白的温度、溶剂和pH水平的反应条件。一般而言，在已知参数和所需结果的基础上，逐个(case-by-case)确定所述反应的最适反应条件。例如，水溶性聚合物：蛋白缀合物的比率越大，结合产物的百分比则越大。可以用诸如所需衍生程度(例如单、双、三等)、选定聚合物的分子量、该聚合物是否为支链或非支链以及所用的反应条件的因素，确定最适比率(鉴于反应效率，因为没有过量的未反应蛋白或聚合物)。水溶性聚合物(如PEG)与蛋白之比一般为1∶1-100∶1。可以由每种混合物，通过标准纯化技术，制备一种或多种纯化的缀合物，所述标准技术包括其中的透析、盐析、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和电泳。
人们可能具体需要N末端化学修饰的蛋白。人们可以根据分子量、支链等、在所述反应混合物中水溶性聚合物与蛋白(或肽)的比例、待进行的反应类型和获得选定N末端化学修饰蛋白的方法，选择水溶性聚合物。获得所述N末端化学修饰蛋白制剂的方法(即必要时从其它单衍生部分分离该部分)可以是从大量的化学修饰蛋白分子中纯化所述N末端化学修饰蛋白材料。可以通过利用在具体蛋白中可用于衍生的伯氨基不同类型(赖氨酸对所述N末端)的不同反应性，完成还原性烷基化选择性化学修饰。在合适的反应条件下，用含有羰基的聚合物达到该蛋白N-末端大致选择性的衍生。例如人们可以通过在使人们利用所述赖氨酸残基的ε-氨基和该蛋白N末端α-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应，选择性地将水溶性聚合物连接该蛋白的N末端。通过这种选择性衍生，控制水溶性聚合物连接到蛋白上：与该聚合物的结合主要发生在该蛋白的N末端，没有发生其它反应基(诸如所述赖氨酸侧链氨基)的显著修饰。使用还原性烷基化，所述水溶性聚合物可以属于上述类型，并应该具有用于偶联到该蛋白上的单个反应性醛。可以使用含有单个反应性醛的聚乙二醇丙醛。
本发明具体设想所述化学衍生蛋白包括单或多(例如2-4)PEG部分。
可以通过本领域已知的聚乙二醇化(pegylation)反应进行聚乙二醇化。制备聚乙二醇化蛋白产物的方法一般包括以下步骤：(a)使蛋白产物与聚乙二醇(诸如PEG的酯和醛衍生物)在一定条件下反应，由此该蛋白变得与一个或多个PEG基团连接，(b)获得该所述反应产物。一般而言，根据已知参数和所需结果，逐个确定所述反应的最适反应条件。
本领域技术人员可利用多种连接方法。参见例如EP 0 401 384，其说明书通过引用结合到本文中；也参见Malik等(1992),Exp.Hematol.,20:1028-1035；Francis(1992),Focus on Growth Factors,3(2):4-10,(Mediscript出版，Mountain Court,Friern Barnet Lane,London N20OLD，英国)、EP 0 154 316、EP 0 401 384、WO 92/16221、WO95/34326和本文引用的涉及聚乙二醇化的其它出版物，这些文献的说明书通过引用结合到本文中。
具体地说，可以通过与反应性聚乙二醇分子的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。因此，按照本发明的蛋白产物包括所述PEG基团通过酰基或烷基连接的聚乙二醇化蛋白。这类产物可以是单聚乙二醇化的(例如含有2-6个PEG基团，最好含有2-5个PEG基团)。所述PEG基团一般连接该蛋白氨基酸的α-氨基或ε-氨基，但也设想所述PEG基团可以连接到连接该蛋白的任何氨基上，所述氨基在适当的反应条件下反应性足以使得连接一个PEG基团。
通过酰化的聚乙二醇化一般包括使聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物与该蛋白反应。对于所述酰化反应，选定的聚合物应该具有单个反应性酯基团。可以使用任何已知的或随后发现反应性的PEG分子进行所述聚乙二醇化反应。优选的活化PEG酯是酯化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG。本文所用的“酰化”设想包括(但不限于)该治疗蛋白和诸如PEG之类的水溶性聚合物之间的以下类型的连接：酰胺、氨基甲酸酯、尿烷等等(参见Chamow(1994),Bioconjugate Chem.,5(2):133-140)。反应条件选自聚乙二醇化领域的任何已知条件或随后开发的那些条件，但应该避免可能使待修饰蛋白失活的诸如温度、溶剂和pH的条件。
通过酰化的聚乙二醇化一般产生聚乙二醇化蛋白。所述连接键最好是酰胺。产生的产物也最好大致只有(例如＞95％)单、双或三聚乙二醇化。然而，根据所用的具体反应条件，可以形成一定量的聚乙二醇化程度较高的一些物质。如果需要，可以用标准纯化技术，包括其中的透析、盐析、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和电泳，从该混合物(特别是未反应物质)中分离更纯化的聚乙二醇化物质。
通过烷基化的聚乙二醇化一般包括使PEG的末端醛衍生物与该蛋白在还原剂存在下反应。对于还原性烷基化反应，选定的聚合物应该具有单个反应性醛基团。一个典型的反应性PEG醛是聚乙二醇丙醛，它是水稳定性的，或为单C1-C10烷氧基芳氧基衍生物(参见美国专利5,252,714)。
通过烷基化的聚乙二醇化也可以产生多聚乙醇化蛋白。另外，人们可以操作所述反应条件，以大致利于仅在该蛋白N末端的α-氨基上聚乙二醇化(即单聚乙二醇化蛋白)。在单聚乙二醇化或多聚乙二醇化的情况下，所述PEG基团最好通过-CH2-NH-基团连接该蛋白。具体参考-CH2-基团，该类型键本文称为“烷基”键。
产生大致均一群体的单聚合物/蛋白产物的还原性烷基化一般包括以下步骤：(a)使蛋白与反应性PEG分子在还原性烷基化条件、在适于允许在所述蛋白氨基末端的α-氨基选择性修饰的pH下反应，(b)获得所述反应产物。通过还原烷基化产生单聚乙二醇化产物的衍生，利用所述赖氨酸氨基和所述N末端α-氨基之间的pKa差异(pKa为50％的所述氨基质子化，而50％氨基未质子化的pH)。
在允许人们利用所述赖氨酸ε-氨基与该蛋白N末端残基的α-氨基之间pKa差异的pH下进行该反应。一般而言，如果该pH较低，则相对于蛋白需要较大过量的聚合物(即所述N末端α-氨基的反应性越低，则需要更多的聚合物来达到最适条件)。如果该pH较高，那么聚合物：蛋白之比不需要那么大(即可利用的反应性基团越多，那么需要的聚合物越少)。为了本发明的目的，该pH一般为3-9，最好为3-6。对于还原性烷基化，所述还原剂应该在水溶液中稳定，最好能够仅还原反应性烷基化初始过程中形成的Schiff碱。适当的还原剂可以选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。特别合适的还原剂为氰基硼氢化钠。可以根据与用水溶性聚合物衍生蛋白相关的公开的资料，逐个确定其它反应参数，诸如溶剂、反应时间、温度和产物纯化方法。
通过这种选择性衍生，控制水溶性聚合物(它含有诸如醛之类的反应性基团)与蛋白的连接：与该聚合物的结合主要发生在该蛋白的N末端，没有显著修饰其它反应性基团，诸如所述赖氨酸侧链氨基。该制剂通常为高于90％的单聚合物/蛋白缀合物，更常见为高于95％的单聚合物/蛋白缀合物，可观察到的其余分子为未反应的(即缺乏所述聚合物部分的蛋白)。
该聚乙二醇化也可以具体通过具有至少一个反应性羟基(例如聚乙二醇)的水溶性聚合物进行，所述反应性羟基可以与具有反应性羰基、腈或砜基团的试剂反应，将所述羟基转化为反应性Micheal受体，由此形成“活化接头”，以用于修饰各种蛋白，提供改进生物学活性的缀合物。“反应性羰基、腈或砜”是指二碳基团连接的羰基、腈或砜基，它们具有供由羧基、腈或砜基起第二个碳上进行硫羟基特异性偶联的反应位点(WO 92/16221)。
所述活化接头可以是单功能、双功能和多功能的。具有可以用于所述方法的反应性砜基团的有用试剂包括(但不限于)氯砜、乙烯砜和二乙烯砜。
在具体实施方案中，用Micheal受体活化所述水溶性聚合物。WO95/13312特别描述水溶性砜活化的PEG高度选择性地与硫羟基部分偶联，而不是与所述分子和表面的氨基部分偶联。这些PEG衍生物在不高于pH大约11的水性环境中对水解稳定较长时间，可以与分子形成键，以形成也是水解稳定的缀合物。所述PEG和所述生物学活性分子偶联的键包括与硫羟基部分偶联的砜部分，并具有PEG-SO2-CH2-CH2-S-W的结构，这里W代表所述生物学活性分子，并且其中所述砜部分为乙烯砜或活性乙砜。两个特别有用的同双功能衍生物为PEG-双-氯砜和PEG-双-乙烯砜。
1995年6月7日申请的美国专利申请08/473,809(其说明书通过引用结合到本文中)指出一个方法，通过获得具有反应性羟基化合物制备砜活化接头，并利用四氢呋喃(THF)作为所述转化溶剂，将所述羟基转化为反应性Micheal受体以形成活化受体。1996年3月6日申请的美国专利申请08//611,918号(其说明书通过引用结合到本文中)指出纯化所述活化接头的方法，在大小和端基官能度的基础上，利用疏水性相互作用色谱分离所述接头。多核苷酸
本发明还提供编码IL-1ra和IL-1ra变异体的多核苷酸。在本发明的基础上，并使用通用密码子表，本领域技术人员可以容易地确定编码IL-1ra和IL-1ra变异体氨基酸序列的所有核苷酸序列。
可以按照根据下面提出的描述进行重组表达技术，以产生这些多核苷酸并表达所述编码蛋白。例如，通过将编码IL-1ra或IL-1ra变异体的核酸序列插入合适的载体，本领域技术人员可以容易地产生大量的所需核酸序列。然后可以用所述序列产生检测探针，或扩增引物。另一方面，编码IL-1ra或IL-1ra变异体的多核苷酸可以插入表达载体中。通过将所需表达载体导入合适宿主中，可以大量生产所需蛋白。
正如进一步描述的，有多种宿主/载体系统可用于繁殖所需核酸序列和/或生产所需蛋白。这些包括(但不限于)质粒、病毒或插入载体和原核生物宿主和真核生物宿主。本领域技术人员可以改变能够繁殖或表达异源DNA的宿主/载体系统，以生产或表达本发明的序列。
此外，本领域技术人员会认识到，根据本说明书，所述核酸序列包括编码具有图5提出序列的IL-1ra的简并核酸序列和与这些核酸序列的互补物杂交(最好在严格杂交条件下)的那些核酸序列[Maniatis等(1982)，分子克隆(实验手册)，冷泉港实验室，第387-389页]。典型的严格杂交条件为于62-67℃在4×SSC中杂交，然后于62-67℃在0.1×SSC中清洗大约1小时。另一方面，典型的严格杂交条件于40-45℃在45-55％甲酰胺、4×SSC中杂交。也包括在松弛的杂交条件与SEQ ID NO:1提出的核酸序列的互补物杂交、编码IL-1ra变异体的DNA序列。这些松弛的严格杂交条件为于45-55℃在4×SSC，或于40-45℃用30-40％甲酰胺杂交。
本发明也提供包括载体DNA与编码所需蛋白的DNA序列的重组DNA构建物。在每种这样的DNA构建物中，编码所需蛋白(具有或不具有信号肽)的核酸序列操作性地与能够指导所需蛋白在选定宿主中复制和/或表达的适当的表达控制或调节序列。重组表达
多核苷酸的制备
编码IL-1ra或IL-1ra变异体的核酸序列可以容易地以多种方式获得，这些方式包括(但不限于)化学合成、cDNA或基因组文库筛选、表达文库筛选和/或cDNA的PCR扩增。Sambrook等(1989)分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等(1994),编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols出版社；Berger和Kimmel(1987),Methods in Enzymology:Guide toMolecular Cloning Techniques,Vol.152,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(这些说明书通过引用结合到本文中)中提出了用于分离这类核酸序列的这些方法和其它方法。
可以用诸如Engels等(1989)(Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734和Wells等(1985)(Gene,34:315)中提出的本领域熟知的方法完成核酸序列的化学合成，这些说明书通过引用结合到本文中。这些方法尤其包括核酸序列合成的磷酸三酯、氨基亚磷酸酯和H-膦酸酯法。大核酸序列，例如长度大于大约100个核苷酸的那些核酸序列可以作为几个片段合成。然后将所述片段连接在一起，形成编码所需蛋白的核酸序列。优选方法是采用标准氨基亚磷酸酯化学的聚合物支持的合成。
另一方面，可以通过筛选合适的cDNA文库(即由据信表达该蛋白的一种或多种组织源制备的文库)或基因组文库(一种由总基因组DNA制备的文库)。所述cDNA文库源通常为据信表达相当量所需蛋白的任何物种的组织。所述基因组文库源可以是任何哺乳动物或据信含有编码所需蛋白基因的其它物种的任何一种或多种组织。
可以在编码所需蛋白的DNA的存在方面，用一种或多种与该文库存在的cDNA或基因选择性杂交的核酸探针(具有与待克隆cDNA或基因的可接受水平同源性的寡核苷酸、cDNA或DNA片段)筛选杂交介质。通常用于这种筛选的探针编码来自与制备所述文库的物种相同或相似物种的DNA序列小区域。另一方面，如本文所讨论的，所述探针可以是简并的。
通过在阻止非特异性结合、但允许与该探针或引物具有显著水平同源性的那些克隆结合的严格条件下，将寡核苷酸探针或cDNA退火到所述克隆上完成杂交。典型的杂交和洗涤的严格条件部分取决于所述cDNA和寡核苷酸的大小(例如核苷酸的长度)以及该探针是否为简并的。在设计所述杂交介质中也考虑鉴定克隆的可能性(例如是否筛选cDNA或基因组文库)。
将DNA片段(诸如cDNA)用作探针时，典型的杂交条件包括Ausubel等((1994)编辑，见上述)提出的那些条件。杂交后，根据几个因素，诸如探针大小、预计的探针与克隆的同源性、待筛选杂交介质、待筛选克隆数等等，在适当的严格条件下洗涤所述杂交介质。严格洗涤溶液通常离子强度低，并在相对高的温度下使用，其实例如下：一个这种严格洗涤液是于55-65℃的0.015M NaCl、0.005M柠檬酸钠和0.1％SDS，另一种这类严格洗涤液为于大约40-50℃的1mMNa2EDTA、40mM NaHPO4,pH7.2和1％SDS；再一个严格洗涤液为于大约50-65℃的0.2×SSC和0.1％SDS。
也有使用寡核苷酸探针来筛选杂交介质的典型的严格洗涤条件的方案。例如第一个方案根据所述探针的长度，于约35-63℃的温度下使用6×SSC与0.05％焦磷酸钠。例如14个碱基的探针在35-40℃下洗涤，17个碱基的探针在45-50℃下洗涤，20个碱基的探针在52-57℃下洗涤，而23个碱基的探针在57-63℃下洗涤。当出现的背景非特异性结合高时，所述温度可以提高2-3℃。第二种方案使用氯化四甲铵(TMAC)用于洗涤。一个这种严格洗涤溶液为3M TMAC、50mM Tris-HCl,pH8.0和0.2％SDS。
获得合适核酸序列的另一种合适方法是聚合酶链式反应(PCR)。在该方法中，使用逆转录酶由poly(A)+RNA或总RNA制备cDNA。然后将通常与编码所需蛋白的cDNA(寡核苷酸)的两个独立区互补的两个引物与诸如Taq聚合酶之类的聚合酶加入所述cDNA中，所述聚合酶扩增两个引物之间的cDNA区。
选择作为探针或引物的寡核苷酸序列应该具有适当的长度和足够的明确性，以减少在筛选或PCR扩增期间可能发生的非特异性结合。所述探针或引物的实际序列通常基于保守或高度同源序列或区域。所述探针或引物可以可选地为完全或部分简并的，即可以含有都编码同一氨基酸序列但使用不同密码子的探针/引物的混合物。制备简并探针的另一种方法是将肌酐置于随物种改变的一些和所有密码子位置上。可以通过用于DNA的下述化学合成方法制备所述寡核苷酸探针或引物。载体
编码所需蛋白的DNA可以插入载体中，以用于进一步克隆(所述DNA的扩增)或表达。合适的载体为市售的，或可以具体构建所述载体。合适载体的选择或构建取决于(1)它是用于DNA扩增，还是用于DNA表达，(2)待插入该载体的DNA的大小，以及(3)待用该载体转化的宿主细胞。
每种载体都涉及操作性地与一个或多个以下表达控制或调节序列连接的编码所需蛋白的核酸序列，所述表达控制或调节序列能够指导、控制或者影响选定的宿主细胞表达所需蛋白。每种载体都含有不同的组分，取决于其功能(DNA的扩增或DNA的表达)和它与所述宿主细胞的相容性。所述载体组分一般包括(但不限于)以下的一种或多种：单一序列、复制起点、一个或多个选择或标记基因、启动子、增强子元件、转录终止序列等等。这些组分可以得自天然来源或用已知方法合成。
合适的原核克隆载体的实例包括诸如λ衍生物的噬菌体或来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322、colE1、pUC、F因子和Bluescript质粒衍生物(Stratagene,LaJolla,CA))。本领域已知的用于下述宿主细胞的多种类型中的其它合适的表达载体也可以用于此目的。信号序列
编码信号序列的核酸可以插到编码所需蛋白序列的5’，例如它可以是载体的组分或它可以是编码所需蛋白序列的一部分。例如，编码天然IL-1ra信号序列的核酸是已知的(美国专利5,075,222号)。复制起点
每个表达载体和克隆载体一般包括使该载体能够在一种或多种宿主细胞中复制的核酸序列。在克隆载体中，该序列通常为使该载体能够独立于所述宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。这类序列是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性菌，各种起点(例如SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点(例如通常仅使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。选择基因
每种表达载体和克隆载体通常都含有一个选择基因。当宿主细胞生长于选择培养基时，该基因编码所述转化宿主细胞的生存或生长所必需的“标记”蛋白。没有用该载体转化的宿主细胞不含有该选择基因，因此，它们不能在该培养基中生存。典型的选择基因编码(a)赋予对例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的抗生素或其它毒素的抗性，(b)互补营养缺陷型缺陷，或(c)供应不能从该培养基中获得的关键营养物。
其它选择基因可以用来扩增待表达基因。扩增是需要量很大的用来生产生长关键性蛋白的基因在重组细胞连续后代的染色体中一前一后重复复制的过程。哺乳动物细胞的适当选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。将细胞转化体置于只有转化体借助于存在于所述载体中的标记唯一适应生存的选择压力下。通过在连续改变该培养基中选择剂浓度的条件下培养转化细胞，来施加选择压力，由此导致该选择基因和编码所需蛋白的DNA都扩增。结果，由扩增的DNA合成较高量的所需蛋白。
例如首先通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂氨甲蝶呤的培养基中培养所有转化体，鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。但使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢细胞系(Urlaub和Chasin(1980),Proc.Natl.Acad.Sci,USA 77(7):4216-4220，其说明书通过引用结合到本文中。然后将转化细胞接触较高水平的氨甲蝶呤。这导致合成多拷贝DHFR基因，同时合成多拷贝的存在于所述表达载体中的其它DNA，诸如编码所需蛋白的DNA。启动子
每种表达载体和克隆载体通常含有由所述宿主生物识别的、并操作性连接编码所需蛋白的核酸序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5’)(一般在大约100-1000bp内)、控制诸如编码所需蛋白的特定核酸序列转录和翻译的非翻译序列。启动子常规可以分为两类中的一类，即诱导型启动子或组成型启动子。诱导型启动子是对培养条件中的某些变化(诸如存在或缺乏营养物或温度的变化)反应，起始较高水平由在其控制下的DNA的转录。由多种潜在宿主细胞识别的大量的启动子是熟知的。可以通过用限制酶消化，从所述源DNA除去启动子，然后插入所需启动子序列，将启动子操作性地连接编码所需蛋白的DNA。可以用IL-1ra天然启动子序列来指导编码所需蛋白的DNA扩增和/或表达。然而，如果异源启动子允许表达的蛋白的转录和产量水平都高于所述天然启动子，并且如果它与选择使用的宿主细胞相容，最好使用所述异源启动子。例如，其它IL-1家族成员的任一天然启动子序列可以用来指导编码所需蛋白的DNA的扩增和/或表达。
适用于原核生物宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶、色氨酸启动子系统；细菌发光(luxR)基因系统和杂交启动子，诸如tac启动子。其它已知的细菌启动子也是合适的。它们的核苷酸序列已经公开，由此使得本领域技术人员能够用供应任何所需限制位点需要的接头和连接物将它们与所需DNA序列连接。
用于酵母宿主的合适的启动子序列也是本领域熟知的。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子是熟知的，包括得自诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒的病毒基因组的启动子序列，最优选的猿猴病毒40(SV40)的启动子序列。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热激启动子和肌动蛋白启动子。增强子元件
每种所述表达载体和克隆载体通常含有增强子序列，以提高高等真核细胞的编码所需蛋白的DNA序列的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度为大约10-300bp，它作用于所述启动子，以提高其转录。增强子与取向和位置相对无关。已经发现它们位于转录单位的5’和3’端。酵母启动子最好使用酵母增强子。几种得自哺乳动物基因的增强子序列是已知的(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。另外，诸如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子之类的病毒增强子是激活真核生物启动子的典型增强元件。尽管可以将增强子剪接到载体的编码所需蛋白的DNA的位置5’或3’，但它通常位于该启动子的5’位点。转录终止
用于真核生物宿主细胞的每种表达载体通常含有终止转录和稳定所述mRNA所必需的序列。这类序列通常得自真核DNA或cDNA的5’和偶然的3’非翻译区。这些区含有作为编码所需蛋白的mRNA非翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。载体的构建
每种含有一个或多个以上列出组分(与编码所需蛋白的所述编码序列一起)的合适载体的构建可以通过标准连接技术完成。将分离的质粒或DNA片段切割、加尾，然后以所需顺序再连接，以产生所需的载体。为了证实已经构建了正确的序列，可以用连接混合物转化大肠杆菌，用上述已知技术选择成功的转化体。然后制备来自转化体的大量载体，通过限制性内切酶消化分析和/或测序，以证实存在所需构建物。
也可以使用提供编码所需蛋白的DNA在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。一般而言，瞬时表达包括使用能够在宿主细胞中足够复制的表达载体，使得所述宿主细胞积累许多拷贝的所述表达载体，再合成高水平的所述表达载体编码的所需蛋白。包含合适表达载体和宿主细胞的每个瞬时表达系统允许便利地阳性鉴定克隆DNA编码的蛋白以及提供快速筛选这类蛋白的所需生物学性质或生理学性质，即鉴定生物学活性的IL-1ra蛋白变异体。宿主细胞
本发明也提供多种重组宿主细胞的任何一种，其中每种含有用于表达所需蛋白的核酸序列。典型的原核生物和真核生物宿主细胞包括细菌、哺乳动物、真菌、昆虫、酵母或植物细胞。
原核生物宿主细胞包括(但不限于)真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物(例如大肠杆菌(HB101、DH5a、DH10和MC1061)；杆菌，诸如枯草杆菌；假单孢菌，诸如铜绿假单孢菌；链霉菌菌株；鼠伤寒沙门氏菌；或粘质沙雷菌。作为具体实施方案，所需蛋白可以在大肠杆菌中表达。
除原核生物宿主细胞外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物可以是表达所需蛋白的合适宿主。酿酒酵母或面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的，但大量的其它属、种和菌株是熟知的并且是一般可利用的。
所需蛋白可以以糖基化形式由多种来自多细胞生物的合适宿主细胞的任何一种表达。这类宿主细胞能够复杂地加工并具有糖基化活性。原则上，可以使用任何高等真核生物细胞培养物，无论这种培养物是涉及脊椎动物还是无脊椎动物，包括植物和昆虫细胞。作为具体实施方案，所需蛋白可以在杆状病毒细胞中表达。
可以使用脊椎动物，因为脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖是熟知的方法。有用的哺乳动物宿主细胞系包括(但不限于)用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、人胚肾系(293细胞或用于在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞)、幼体仓鼠肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞。其它合适的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa、小鼠L-929细胞、由Swiss、Balb-c或NIH小鼠衍生的3T3系和BHK或HaK仓鼠细胞系。作为具体实施方案，所需蛋白可以在COS细胞中表达。
可以在允许所述核酸序列表达的合适条件下，用所需核酸转染、最好是转化宿主细胞。合适宿主细胞的选择和转化、培养、扩增、筛选及产物生产和纯化的方法是本领域熟知的(Gething和Sambrook(1981),Nature,293:620-625,或者Kaufman等(1985),Mol.Cell Biol.,5(7):1750-1759，或美国专利4,419,446，这些参考的说明书通过引用结合到本文中)。例如对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用磷酸钙沉淀法。也可以使用电穿孔、微注射或其它已知技术。
可以通过同源重组或用重组生产方法，利用导入已含有编码所需蛋白的DNA的细胞中的控制元件生产所需蛋白也是可能的。同源重组是最初用于瞄准基因以在转录活性基因中诱导或更正突变而开发的技术(Kucherlapati(1989),Prog.in Nucl.Acid Res.and Mol.Biol.,36:301，其说明书通过引用结合到本文中)。作为将特定突变导入所述哺乳动物基因组的特定区域的方法开发了所述基本技术(Thomas等(1986),Cell,44:419-428；Thomas和Capecchi(1987),Cell,51:503-512和Doetschman等(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8583-8587，其说明书通过引用结合到本文中)或更正缺陷基因内的特定突变(Doetschman等，(1987),Nature,330:576-578,其说明书通过引用结合到本文中)。美国专利5,272,071、WO 92/01069、WO 93/03183、WO 94/12650和WO94/31560(这些说明书通过引用结合到本文中)中描述了典型的技术。
通过同源重组，待插入所述基因组的DNA序列通过将其连接到导向DNA上，可以导向目的基因的特定区域。导向DNA是与所述基因组DNA一区域互补(同源)的DNA。将与所述基因组特定区域互补的小段导向DNA在DNA复制过程中与母链接触。已经插入细胞的DNA的一般性质是杂交，并因此通过共享的同源区与内源DNA的其它物质重组。如果该互补链与含有突变或不同DNA序列的寡核苷酸连接，那么由于重组，也将其加入新合成链中。由于所述校读功能，DNA的新序列可以用作所述模板。因此，转移的DNA整合到所述基因组中。
如果已知特定的基因序列，诸如所需蛋白的核酸序列，那么可以合成表达控制序列(与该基因选定区域互补的一段DNA)，或者诸如通过天然DNA在结合目的区的特定识别位点上的合适的的限制而获得。该片段在插入所述细胞时用作导向序列，将与所述基因组内的其同源区杂交。如果在DNA复制期间发生这种杂交，那么该片段DNA和与其连接的任何其它序列将用作冈崎片段，并且将其倒缝在新合成的DNA子链中。
将DNA可以与所需蛋白表达相互作用的区域连接导向DNA的这些片段。将例如启动子/增强子元件、抑制基因或外源转录调节元件以足以影响编码所述所需蛋白的DNA转录的距离和取向插入计划中的宿主细胞基因组中。所述控制元件不编码所需蛋白，但控制该宿主细胞基因组中存在的DNA部分。因此，不用转染编码所需蛋白的DNA，而利用与提供具有转录所需蛋白可识别信号的内源基因序列的DNA调节区段偶联的导向DNA(含有与内源目的基因同源的区域)，可以达到所需蛋白的表达。所述宿主细胞的培养
根据许多因素和考虑，改变生产所需蛋白的一种或多种重组宿主细胞中每种的培养方法；通过最少实验，给定情况的最适生产方法对本领域技术人员是显而易见的。这类重组宿主细胞在合适的培养基中培养，然后可选地通过本领域技术人员已知的合适方法，从该培养基中(或如果是胞内表达，从所述细胞中)回收、分离和纯化表达的蛋白。
具体地说，用来生产所需蛋白的每种重组细胞可以在适于诱导启动子、选择合适重组宿主细胞或扩增编码所述所需蛋白的基因的培养基中培养。所述培养基可以根据需要添加激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生产因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核酸苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素)、微量元素(定义为通常以终浓度为微摩尔存在的无机化合物)和葡萄糖或另一种能源。正如本领域技术人员会认识到的，也可以包括适当浓度的其它添加剂。用于许多宿主细胞的合适的培养条件诸如温度、pH等等也是本领域技术人员熟知的。
然后用本领域已知的方法将产生的表达产物纯化为接近均质。美国专利5,075,222和WO 91/08285中指出了典型的纯化技术。表达产物最好以大致纯形式生产。如Hannum等((1990),Nature,343:336-340)和Eisenberg等((1990),Nature,343:341-346)(这两个文献的说明书通过引用结合到本文中)中定义的，“大致纯”是指未修饰形式的IL-1ra具有相当高的比活，其比活最好为大约150,000-500,000受体单位/mg。然而应该认识到，IL-1ra的变异体可以具有不同的比活。药用组合物
药用组合物一般每种通常最好在载体中包括治疗有效量的IL-1ra、IL-1ra变异体或其化学衍生物(下文统称为“IL-1ra产物”)中的至少一种和一种控释材料。所述载体最好包括与所述IL-1ra产物和控释材料混合的一种或多种药学上或生理上可接受的制剂材料。
所述控释聚合物可以选自本体磨耗聚合物(例如聚(乳酸-co-羟基乙酸))(PLGA)共聚物、PLGA聚合物掺混物、PEG、乳酸和羟基乙酸的嵌段共聚物、聚(酐)和聚(邻酯))；水凝胶酯(例如pluronic多元醇、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(pHEMA)、甲基丙烯酸(MAA)、pHEMA和MAA的掺混物、纤维素(例如羧甲基纤维素)、透明质酸衍生物、藻酸盐、胶原、明胶、白蛋白以及淀粉和右旋糖)和它们的组合物系统；或脂质体或微球体制剂。这类组合物可以影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本领域技术人员会根据给药途径和所需剂量，确定所需蛋白的最适药物配方。Gombotz和Pettit (1995) Bioconjugate Chem.,6:332-351和Reington’sPharmaceutical Science，第18版(1990),Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042，第1435-1712页中公开了典型的药用组合物(在此结合在本文中作参考)。具体的控释组合物可得自以下供应商：DepoTech Corp.,San Diego,CA(DepofoamTM，一种多泡状脂质体)和Alkermes,Inc.,Cambridge,MA(ProLeaseTM，一种PLGA微球体)。
在具体实施方案中，本发明涉及基于可溶性或不溶性交联形式的透明质酸衍生物的药物传送系统。本文所用的透明质酸衍生物计划包括透明质酸衍生物，透明质酸、其盐(如透明质酸钠)、透明质酸的酯、醚、酶促衍生物和交联凝胶、以及透明质酸化学修饰衍生物(诸如hylan)。未修饰或修饰透明质酸用作载体，提供从系统缓慢释放药物。
透明质酸衍生物可以为已经识别到的用于这类目的的任何类型。它可以从诸如公鸡鸡冠、脐带的各种非限制性材料、或从细菌培养物(诸如从溶血群A或C链球菌)中提取。在以下参考文献中公开了透明质酸衍生物的典型形式：Peyron和Balazs(1974),Path.Biol.,22(8):731-736；Isdale等(1991),J.Drug Dev.,4(2):93-99；Larsen等(1993),Journal of Biomedical Materials Research,27:1129-1134；Namiki等(1982),International Journal of Clinical Pharmacology,Therapy andToxicology,20(11):501-507；Meyer等(1995),Journal of ControlledRelease,35(6):67-72；Kikuchi等(1996),Osteoarthritis and Cartilage,4:99-110；Sakakibara等(1994),Clinical Orthopaedics and Related Research,299:282-292；Meyers和Brandt(1995),22(9):1732-1739；Laurent等(1995),Acta Orthop Scand,66(266):116-120；Cascone等(1995),Biomaterials,16(7):569-574；Yerashalmi等(1994),Archives ofBiochemistry and Biophysics,313(2):267-273；Bematchez等(1993),Journal of Biomedical Materials Research,27(5):677-681；Tan等(1990),Australian Journal of Biotechnology,4(1):38-43；Gombotz和Pettit(1995),Bioconjugate Chem.,6:332-351；美国专利4,582,865、4,605,691、4,636,524、4,713,448、4,716,154、4,716,224、4,772,419、4,851,521、4,957,774、4,863,907、5,128,326、5,202,431、5,336,767、5,356,883、欧洲专利申请0 507 604 A2号和0 718 312 A2号和WO 96/05845，这些文献的说明书通过引用结合到本文中。
透明质酸衍生物应该足够纯，以避免在受治疗哺乳动物中引起不利反应或毒性反应。这暗示它无热原，并具有足够低水平的与透明质酸衍生物天然相联的蛋白和/或核酸，使得不引起实际的免疫反应。美国专利4,141,973号、美国专利5,411,874、美国专利5,442,053号、美国专利5,559,104号、美国专利5,563,051号、日本专利申请14594/1977、67100/1979和74796/1980号中描述了合适的纯化方法，这些专利的说明书通过引用结合到本文中。
透明质酸衍生物可以为其游离酸形式或任何药学上可接受的盐形式。而且，作为盐，可以提及诸如钠盐或钾盐的碱金属盐和诸如钙盐或镁盐的碱土金属盐。优选的透明质酸衍生物源为合适微生物的培养物。
分子量范围很宽的透明质酸衍生物可以用于本发明。透明质酸衍生物的分子量一般为0.1×106-1×107，优选为0.5×106-5×106，更优选为1×106-5×106，最优选为1×106-4×106(例如1×106-2×106)。
已经以多种方式完成通过交联增加透明质酸衍生物的分子量。Sakuria等在美国专利4,716,224中公开了通过使透明质酸或其盐与多官能环氧化物交联制备的交联透明质酸或其盐。在美国专利4,863,907中，Sakuri等公开了通过使糖胺聚糖或其盐与多官能环氧化物交联制备的交联糖胺聚糖或其盐。Huang等在欧洲专利申请0 507 604 A2号中公开了使含羧基多糖离子交联，这里所述交联剂为具有三价阳离子的化合物。Malson等在美国专利4,716,154和美国专利4,772,419中公开了使透明质酸与双官能或多官能环氧化物或它相应的卤代醇、环氧卤丙烷或卤化物和二乙烯砜交联。在美国专利4,957,774中，dellaValle等公开了通过用多元醇酯化透明质酸的羧基制备的透明质酸交联酯。Balazs等在美国专利4,582,865、4,605,691和4,636,524中公开了通过与二乙烯砜反应，使透明质酸和其盐及多糖交联。在美国专利5,128,326和4,582,865中，Balazs等公开了使透明质酸与甲醛、环氧化物、多吖丙啶基化合物和二乙烯砜交联。在美国专利4,713,448中，Balazs等公开了通过与诸如甲醛、戊二醛和乙二醛的醛类反应修饰透明质酸，并指出已经发生交联的可能性。在美国专利5,356,883中，Kuo等公开了通过与双碳二胺反应交联透明质酸。在EP 0 718 312 A2中，Nguyen公开了通过与双或多酐反应交联透明质酸或其盐和其它多糖。
所述产物中的透明质酸衍生物浓度可以为所述可溶性聚合物的大约0.05-5％(重量)，根据该产品的最终用途，可以更高，优选为0.1-4％(重量)，更优选为1-3％(重量)。IL-1抑制剂的浓度可以在非常宽的限度内改变，最好应该根据所述IL-1抑制剂的溶解度、其药理学活性、所述最终产品的想要作用等等进行选择。
通常将交联透明质酸衍生物溶于溶剂(例如生理盐水)中至足以通过注射针头的粘度。低粘度材料由于允许例如使用实际大小剂量的浓缩透明质酸衍生物水溶液，非常有利于所述注射。因此，如果1％透明质酸衍生物水溶液的粘度在37℃时低于大约200c/s(按照ASTM D445和D 2515中的步骤用Cannon-Manning半微量粘度计测定)，例如可以容易地利用1％透明质酸衍生物水溶液，以注射大约10毫升含有大约100毫克活性组分的剂量。
按照本发明的药物传递系统包括以下：
1)溶解或分散药物物质的透明质酸衍生物溶液；
2)形成分散药物物质的大分子笼蔽的交联透明质酸衍生物凝胶；
3)透明质酸衍生物的交联混合凝胶和至少一种其它分散药物物质的亲水性聚合物；以及
4)透明质酸衍生物交联凝胶或透明质酸衍生物的交联混合凝胶和含有共价连接到透明质酸大分子或另一聚合物的药物物质的至少一种其它亲水性聚合物。
有几种将药物与所述凝胶混合的方法，因此，有可以获得的几种产物类型。
其中一个方法包括当将凝胶放入药物溶液中时，将所述药物扩散到该凝胶中。该扩散过程通常是缓慢的，并取决于所述药物的浓度、该溶液的温度、所述凝胶颗粒的大小等。用该方法获得的产物为药物物质不均匀分散的凝胶。
通过将透明质酸衍生物凝胶脱水并将其在药物溶液中重溶胀，可以获得同一类型的产物。为了将凝胶脱水，人们可以使用水可混溶的有机溶剂，或者，可以通过干燥除去凝胶中的水。然而，最好使用溶剂，因为在低温或高温下干燥后，该凝胶不能重溶胀至其原始溶胀程度。另一方面，用溶剂脱水后，该凝胶溶胀至其处理前具有的同一体积。尽管也可以使用其它溶剂，但优选的溶剂为乙醇和异丙醇、诸如丙酮的酮类。
再一方法可以用来获得该类型的产物。该方法包括使浓缩透明质酸在药物物质溶液中溶胀，所述浓缩透明质酸是由在相对浓缩的透明质酸衍生物溶液中预先进行的交联反应产生的。
尽管这三种方法全都产生基本相同的产物，但对于具体产物所述方法的每一种相互比较时都具有某些优点，因此，应该考虑诸如该药物性质、该系统中该药物的所需浓度、传递速率等参数选择方法。
为了获得溶解或分散药物物质的透明质酸衍生物溶液，可以使用任何常规方法。可以将任何来源的透明质酸衍生物溶于水中或生理盐水中至所需浓度，然后将药物溶于或分散于产生的溶液中。另一方面，可以将药物的溶液或分散液与透明质酸衍生物溶液混合。根据该产物的最终用途和透明质酸衍生物的分子量选择该聚合物的浓度。根据该产物的所需活性选择该药物的浓度。
为了用所述扩散方法将药物装填于交联溶胀凝胶中，可以将该凝胶置于药物溶液中。完成该过程的时间取决于颗粒大小、凝胶溶胀比、该过程的温度、搅拌、该溶液中所述药物的浓度等。通过适当的组合这些参数，可以在相对短的时间内将溶胀凝胶装填入药物。
为了用溶剂将交联凝胶脱水，将任何形式的该凝胶(即细颗粒或膜)置于溶剂中是足够的，最好是挥发性溶剂(例如异丙醇)，并将其在该溶剂中保持足够的时间，以除去该凝胶的水。水除去的程度取决于所述颗粒的大小或所述膜的厚度、该凝胶/溶剂之比等等。如果需要，用溶剂处理可以重复几次。可以通过于室温下或高温下，在常压下或真空中干燥，除去该凝胶的水。由此脱水的凝胶当置于药物溶液中时，重溶胀至其原始溶胀比。
具体的透明质酸衍生物组合物可得自以下供应商：BioMatrix,Inc.Ridgefield,NJ(SynviscTM,hylan流体和hylan凝胶的90∶10的混合物)；Fidia S.p.A.,Abano Terme,Italy(HylaganTM，公鸡鸡冠来源透明质酸(～500,000至～700,000MW)的钠盐；Kaken Pharmaceutical Co.Ltd.,Tokyo，日本(ArtzTM，公鸡鸡冠来源透明质酸(～700,000MW)的1％溶液)；Pharmacia AB,Stockholm，瑞典(HealonTM，公鸡鸡冠来源透明质酸，～4×106MW)；Genzyme Corporation,Cambridge,MA(SurgicoatTM，重组透明质酸)；Pronova Biopolymer,Inc.Portsmouth,NH(透明质酸FCH，从兽疫链球菌的培养物中制备的高分子量(例如～1.5-2.2×106MW)透明质酸，透明质酸钠MV,～1.0-1.6×106MW和透明质酸钠LV,～1.5-2.2×106MW)；Calbiochem-Novabiochem AB,Lautelfingen，瑞士(透明质酸，由链球菌菌株制备的钠盐(1997 Company Catalognumber 385908))；Intergen Company,Purchase，纽约(公鸡鸡冠来源透明质酸，＞1×106MW)；Diosynth Inc.,Chicago,IL；Amerchol Corp.,Edison,NJ和Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.,Tokyo，日本)。
载体中的主要溶剂的性质可以或者是水性的或是非水的。另外，该载体可以含有用于改变或保持该pH的其它药学上可接受的赋形剂，该pH优选为6.0-7.0，更优选为6.5(例如柠檬酸盐、磷酸盐、诸如甘氨酸的氨基酸的缓冲液)；用于冻干制剂的填充剂(例如甘露醇和甘氨酸)、渗透性(例如甘露醇和氯化钠)；表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、去利通和pluronics)；粘度；澄明度；颜色；无菌；稳定性(例如蔗糖和山梨醇)；抗氧剂(例如亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；防腐剂(例如苯甲酸和水杨酸)；该制剂的气味；调味剂或稀释剂；溶出速率(例如助溶剂或增溶剂，诸如醇类、聚乙二醇和氯化钠)；释放速率；乳化剂；悬浮剂；溶剂；填充剂；传递载体；稀释剂；赋形剂和/或药用助剂。本领域技术人员根据给药途径和所需剂量，确定用于所需蛋白的最适药用制剂(参见例如Remington’s PharmaceuticalScience，第18版，(1990),Mack Publishing Co.,Easton PA 18042，第1435-1712页，其说明书通过引用结合到本文中)。具体的药用制剂如下：在水中的10毫摩柠檬酸钠、140毫摩氯化钠、0.5毫摩DETA、0.1％聚山梨醇酯80(w/w),pH6.5(“柠檬酸盐缓冲液制剂”)；和在水中的10毫摩磷酸钠、140毫摩氯化钠、0.1％(wt/wt)-0.01％聚山梨醇酯80(w/w)和可选的0.5毫摩EDTA,pH6.5(“磷酸盐缓冲液制剂”)。
在本发明的优选实施方案中，将精细颗粒形式的IL-1ra溶于或悬浮于0.1-5％w/v透明质酸衍生物或其盐(例如透明质酸钠)作为干粉或在水或在水性溶剂(例如生理盐水，诸如水溶性钠盐、3-5％葡萄糖溶液和3-5％木糖醇溶液和柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液)中的形式的溶液。可以用诸如将IL-1ra溶液从一个注射器来回吸注到含有该透明质酸衍生物的第二注射器中，或通过搅拌，或通过微量流化，将透明质酸衍生物和IL-1ra溶液混合。所述IL-1ra混合物可以贮存于0-5℃，而该蛋白不降解或聚集。透明质酸衍生物的浓度可以为0.1-5％w/v，但优选浓度为2％。同样，该制剂中的IL-1ra的终浓度可以为0.1-200mg/ml，但优选浓度为100mg/ml。最好调节产生的溶液或悬浮液，使其pH值为6.0-7.5。
一旦已经配制了所述药用组合物，则每种制剂可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉贮存在无菌小瓶中。这类组合物可以或者以现成形式或者以给药前需要复制形式(例如冻干的)贮存。这类制剂的优选贮存温度至少低至4℃，最好为-70℃。含有IL-1ra的制剂最好也在生理pH或接近生理pH下贮存和给药。现在据信在高pH(即高于8)或低pH(即低于5)的制剂中贮存和给药是不希望的，pH优选为6.0-7.0，更优选pH为6.5。
在具体实施方案中，本发明涉及生产单剂量给药单位的药盒。所述药盒每种可以含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。包括在本发明范围内的药盒为单室或多室预填充的注射器；预填充注射器实例(例如液体注射器和lyosyringe，诸如Lyo-Ject，一种双室预填充lyosyringe)可得自Vetter GmbH,Ravensburg，德国。
IL-1抑制剂(例如IL-1ra产物)每种可以以有效量给与患者，以治疗以上定义的IL-1介导的疾病，包括关节炎症性疾病(例如牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎)。名词“患者”计划包括动物(例如猫、狗和马)以及人类。
此外，每种所述IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)可以通过局部、肠内或胃肠外给药途径给药，这些途径包括(不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、transtracheal、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、心室内和胸骨内注射和灌注。IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)也可以通过口服给药，或通过粘膜给药，即通过鼻内、舌下、颊或直肠用于系统性传递。最好是IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)通过关节内、皮下、肌内或静脉内注射给药。作为非限制性实施例，在一个具体实施方案中，IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)可以关节内给药，以治疗类风湿性关节炎和骨关节炎。作为非限制性实施例，在另一具体实施方案中，IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)可以皮下或肌内给药，以治疗类风湿性关节炎、炎症性肠疾病、多发性硬化、多发性骨髓瘤或髓细胞性白血病(例如AML和CML)和其它白血病。作为非限制性实例，在再一具体实施方案中，可以静脉注射IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)，以治疗由于外伤、癫痫、出血或中风引起的脑损伤或治疗移植物抗宿主病，或心室内注射，以治疗由于外伤引起的脑损伤。
无论是何种给药方式，IL-1介导的疾病的治疗都需要有效量的IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)的一种剂量或总剂量疗程，即有效地预防、降低或减轻该疾病症状，诸如对抗由关节软骨分子组分的蛋白聚糖降解引起的关节进行性软骨损害。透明质酸衍生物和IL-1ra是哺乳动物中天然存在的物质，据信对所述耐受剂量没有内在的上限。然而，在所有医疗中，应审慎使用不高于达到所需作用必需的量。
具体剂量按照该患者大致的体重或表面积计算。确定适当剂量中的其它因素可以包括待治疗或待预防的疾病或紊乱、该疾病的严重性、给药途径和该患者的年龄、性别和医疗状态。本领域技术人员特别是根据本文公开的剂量资料和分析，可常规地作出对确定合适治疗剂量所需计算的进一步改进。也可以通过使用结合适当的剂量反应数据所用的确定剂量的已知分析确定该剂量。
给药频率取决于该患者的疾病或紊乱以及用于该制剂中IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)的药代动力学参数和给药途径。该IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)可以一次给药，或在严重和慢性的疾病的情况下，每日以较小的频率剂量给药，或与首次大团剂量给药，然后以连续给药剂量或以缓释传递给药。也设想可以实施连续剂量或接近连续剂量的其它模式。例如化学衍生可以导致具有连续存在于血流中缓释形式，其可预计量基于确定的疗程。
在AU 9173636中提出了使用治疗IL介导疾病的IL-1ra产物的优选模式，所述疾病包括诸如类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎之类的关节炎症性疾病。这些模式包括：(1)按预防或治疗关节炎的发作所需的周期性地单次关节内注射给与IL-1ra，(2)定期皮下注射IL-1ra产物。当胃肠外给药时，该单位剂量可以高达200mg，一般高达150mg，更一般高达100mg。当关节腔内给药时，该药用组合物最好由3-10ml注射器单次注射，该注射器的剂量含有高达200mg/ml，一般高达150mg，更一般高达100mg的溶于等渗磷酸缓冲盐水中的IL-1产物。将该制剂在关节腔内给药，频率为每7-10天1次。以这样一种方式，连续进行4-5次给药，同时，如果需要则改变该剂量。
本发明的药用组合物可以与其它适于该治疗适应症的其它治疗剂一起给药。IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)和任何一种或多种其它抗炎药可以分别给药或联合给药。在“TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy”，第16版，Merck,Sharp &Dohme研究实验室，Merck & Co.,Rahway,NJ(1992)和“Pharmaprojects”,PJB Publications Ltd.中可以发现关于以下化合物的资料。
以上定义的、包括诸如关节炎症性疾病的急性和慢性炎症在内的IL-1介导疾病的现有治疗包括用于控制疼痛和炎症的一线药物，分类为非类固醇抗炎药(NSAIDs)。二线药物包括皮质类固醇，慢作用抗风湿药(SAARDs)或调节疾病(DM)药。
在具体实施方案中，本发明涉及使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)和任何一种或多种NSAID用于治疗以上定义的IL-1介导疾病，包括诸如关节炎症性疾病的急性和慢性炎症(例如骨关节炎，牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)；和移植物抗宿主病。NSAID具有其抗炎作用，至少部分是由于抑制前列腺素的合成(Goodman和Gilman,“the Pharmacological Basis of Therpeutics”,MacMillan第7版(1985))。NSAID可以表征为9组：(1)水杨酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；(4)芬那酸(fenamic acid)衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；(7)oxicams；(8)吡唑衍以及(9)吡唑酮。
在具体实施方案中，本发明涉及使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)和任何一种或多种水杨酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐。这类水杨酸衍生物、其药物前体酯和其药学上可接受的盐包括：乙酰氨萨罗、氧化铝缩乙酰水杨酸、阿斯匹林、贝诺酯、溴水杨醇、乙酰水杨酸钙、三水杨酸胆碱镁、二氟苯水杨酸(diflusinal)、etersalate、苯吲柳酸、龙胆酸、乙二醇水杨酸酯、水杨酸咪唑、乙酰水杨酸赖氨酸、meslamine、水杨酸吗啉、水杨酸1-萘酯、olsalazine、parsalmide、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、乙酰水杨酰胺、O-乙酸乙酰水杨酰胺、双水杨酯和水杨酸偶氮磺胺吡啶。结构相关的、具有镇痛和抗炎性质的水杨酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种丙酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。这类丙酸衍生物、其药物前体酯和其药学上可接受的盐包括：阿明洛芬、苯洛芬、布氯酸、卡洛芬、dexindoprofen、非诺洛芬、flunoxaprofen、fluprofen、氟比洛芬、furcloprofen、布洛芬、布洛芬铝、ibuproxam、吲哚洛芬、异洛芬(isoprofen)、酮洛芬、loxoprofen、miroprofen、萘普生、oxaprozin、piketoprofen、pimeprofen、吡洛芬、普拉洛芬、吩噻嗪丙酸、pyridoxiprofen、舒洛芬、噻洛芬酸和tioxaprofen。结构相关的、具有镇痛和抗炎性质的丙酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种乙酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述乙酸衍生物、其药物前体酯和其药学上可接受的盐包括：阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、delmetacin、双氯灭痛、乙哚乙酸、felbinac、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、furofenac、葡美辛、异丁芬酸、消炎痛、isofezolac、isoxepac、氯那唑酸、甲嗪酸、oxametacin、oxpinac、pimetacin、丙谷美辛、舒林酸、talmetacin、羟哌苯噻酮、tiopinac、托美丁、zidometacin和佐美酸。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的乙酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种芬那酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述芬那酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：enfenamicacid、依托芬那酯、氟芬那酸、isonixin、甲氯芬那酸、甲氯芬那酸钠、medofenamic acid、甲灭酸(mefanamicacid)、尼氟灭酸、他尼氟酯、氯苯氨茴酯、托芬那酸和ufenamate。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的芬那酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种羧酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述羧酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：环氯茚酸、二氟苯水杨酸、flufenisal、inoridine、ketorolac和替诺立定。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的羧酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种丁酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述丁酸衍生物、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：丁丙二苯肼、异丁苯丁酸、联苯丁酮酸和联苯丁酸。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的丁酸衍生物也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种oxicam、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述oxicam、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：droxicam、enolicam、伊索昔康、吡罗昔康、sudoxicam、藤诺息卡和4-羟基-1,2-苯并噻嗪1,1-二氧化-4-(N-苯基)-甲酰胺。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的oxicam也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种吡唑、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述吡唑、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：二苯米唑和甲嘧啶唑。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的吡唑也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种吡唑酮、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)。所述吡唑酮、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：炎爽痛、azapropazone、苄哌立隆、戊烯保泰松、单苯保泰松、苯吗比林、羟基保泰松、丁炎酮、丁唑酮、丙基非那宗、ramifenazone、琥丁唑酮和噻唑丁炎酮。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的吡唑酮也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种以下NSAID:ε-乙酰氨基癸酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4羟基丁酸、阿米特林、anitrazafen、安曲非宁、苄达酸、苄达酸赖氨酸酯(bendazac lysinate)、消炎灵、beprozin、broperamole、布可龙、bufezolac、ciproquazone、cloximate、dazidamine、deboxamet、detomidine、联苯吡胺、difenpyramide、difisalamine、双苯吡醇、依莫法宗、fanetizole mesylate、fenflumizole、氟喹氨苯酯、flumizole、氟胺烟酸、氟丙喹宗、fopirtoline、fosfosal、guaimesal、guaiazolene、isonixirn、lefetamine HCl、leflunomide、lofemizole、lotifazole、lysin clonixinate、meseclazone、nabumetone、nictindole、nimesulide、奥谷蛋白、orpanoxin、oxaceprolm、oxapadol、胍苯叉芴、哌立索唑、异唑柠檬酸盐、哌酰苯肟、piproxen、pirazolac、pirfenidone、丙喹酮、胺丙噁二唑、thielavin B、tiflamizole、timegadine、甲苯酰吡咯乙酸、tolpadol、tryptamid和由诸如以下公司编号命名的那些NSAID：480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、BW540C、CHINOIN127、CN100、EB382、EL508、F1044、FK-506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ONO3144、PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、TA60、TAI-901(4-苯甲酰-1-(1,2-二氢化茚)甲酸、TVX2706、U60257、UR2301和WY41770。具有与以上NSAID相似镇痛和抗炎性质的结构相关的NSAID也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种皮质类固醇、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗以上定义的IL-1介导的疾病，所述疾病包括急性和慢性炎症，诸如关节炎症性疾病(例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)；移植物抗宿主病和多发性硬化。皮质类固醇、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：氢化可的松和由氢化可的松衍生的化合物，诸如21-乙酸基孕烯醇酮、alclomerasone、阿吉东、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、戊酸倍他米松、丁地去炎松、氯泼尼松、氯氟美松、丙酸氯氟美松、氯氟美松酮、丁酸氯倍他松、氯可托尼、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、deflazacon、地奈德、desoximerasone、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟噁米松、氟二氯松、氟米松、新戊酸氟米松、9-去氟肤轻松、flucinolone acetonide、氟轻松醋酸酯、肤轻松丙酮化合物、氟考丁酮、氟考龙、己酸氟考龙、戊酸二氟考龙、氟米龙、醋酸氟培龙、fluprenidene acetate、氟氢化泼尼松、flurandenolide、氟甲酰龙、氯氟松、halometasone、醋酸卤泼尼松、氢可松氨酯、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、磷酸氢化可的松、氢化可的松21-琥珀酸钠、hydrocortisone tebutate、甲哌地强龙、甲羟孕酮、甲基强的松、6甲氢化泼尼松(methylprednicolone)、mometasone furoate、对氟米松、prednicarbate、去氢泼尼松、21-二乙氨基乙酸(21-diedryaminoacetate)去氢泼尼松、去氢泼尼松磷酸钠、去氢泼尼松琥白酸钠、去氢泼尼松21-硬羟基乙酸(21-stearoglycolate)钠、prednisolone tebutate、21-三甲基乙酸去氢泼尼松、泼尼松、泼尼松龙戊酸酯、泼尼立定、21-二乙氨基乙酸泼尼立定、替可的松、氟羟泼尼松龙、去炎松、triamcinolone benetonide和氟羟泼尼松龙己酮化合物。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的皮质类固醇也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种缓慢作用抗风湿药(SAARD)或调节疾病抗风湿药(DMARDS)、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗以上定义的IL-1介导的疾病，所述疾病包括急性和慢性炎症，诸如关节炎症性疾病(例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)；移植物抗宿主病和多发性硬化。SAARD或DMARDS、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括：别铜硫脲钠、金诺芬、金硫葡糖、金硫乙酰苯胺、咪唑硫嘌呤、brequinar sodium、bucillamine、3-硫金基-2-丙醇-1-磺酸钙、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁札利、铜克索林、环磷酰胺、环孢菌素、氨苯砜、15-deoxyspergualin、diacerein、氨基葡糖、金盐(例如环喹(cycloquine)氯金酸钠、硫代苹果酸金钠、硫代硫酸金钠)、羟基氯喹、羟基脲、酮保泰松、左旋四咪唑、羟苯基氯氨茴酸、蜂毒肽、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、mizorbine、mycophenolate mofetil、金硫乙酸钙、氮芥、D-青霉胺、诸如SKNF86002和SB203580的吡啶酚(pyridinol)咪唑、雷帕霉素、硫醇、胸腺生成素和长春新碱。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的SAARD或DMARD也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种COX2抑制剂、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗急性和慢性炎症。COX2抑制剂、其药物前体酯或其药学上可接受的盐的实例包括例如celecoxib。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的COX2抑制剂也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种抗微生物剂、其药物前体酯或其药学上可接受的盐使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗急性和慢性炎症。抗微生物剂、其药物前体酯或其药学上可接受的盐包括例如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、金霉素、杆菌肽、头孢噻甲羧肟、头孢曲松、头孢噻肟、cephachlor、头孢氨苄、头孢拉定、环丙沙星、棒酸、邻氯青霉素、双氯青霉素(dicloxacillan)、红霉素、氟氯青霉素(flucloxacillan)、庆大霉素、短杆菌肽、二甲氧基苯青霉素(methilan)、新霉素、甲苯异噁唑青霉素(oxacillan)、青霉素和万古霉素。具有相似镇痛和抗炎性质的结构相关的抗微生物剂也将包括在该组中。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种TNF抑制剂使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗以上定义的IL-1介导的疾病，所述疾病包括急性和慢性炎症，诸如关节炎症性疾病(例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)；由外伤、癫痫、出血或中风引起的脑损伤；和移植物抗宿主病。这类TNF抑制剂包括阻断TNF体内合成或胞外释放的化合物和蛋白质。在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)任何一种或多种以下TNF抑制剂使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra):TNF结合蛋白(可溶性TNF受体)、抗TNF抗体、粒细胞集落刺激因子；酞胺哌啶酮；BN50730；tenidap；E 5531；tiapafant PCA 4248；nimesulide；panavir、rolipram；RP 73401；肽T、MDL 201,449A；盐酸(1R,3S)-顺-1-[9-(2,6-二氨基嘌呤基)]-3-羟基-4-环戊烯；盐酸(1R,3S)-反-1-[9-(2,6-二氨基)嘌呤]-3-乙酰氧基环戊烷；盐酸(1R,3R)-反-1-[9-腺嘌呤基)-3-叠氮基环戊烷和(1R,3R)-反-1-[6-羟基-嘌呤-9-基)-3-叠氮基环戊烷。
TNF结合蛋白是本领域公开的(EP 308 378、EP 422 339、GB 2218 101、EP 393 438、WO 90/13575、EP 398 327、EP 412 486、WO 91/03553、EP 418 014、JP 127,800/1991、EO 433 900、美国专利5,136,021号、GB 2 246 569、EP 464 533、WO 90/01002、WO 92/13095、WO 92/16221、EP 512 528、EP 526 905、WO93/07863、EP 568 928、WO 93/21946、WO 93/19777、EP 417563、Fisher、Edwards和Kieft于1996年7月9日申请的美国临时专利申请60/021,443(临时申请传送文件上的名称为“肿瘤坏死因子结合蛋白”，代理律师登录号为A-415P)、Fisher、Edwards和Kieft于1996年12月6日申请的美国临时专利申请________(临时申请传送文件上的名称为“低分子量肿瘤坏死因子结合蛋白”，代理律师登录号为A-415A-P)、Fisher、Edwards和Kieft于1997年1月23日申请的美国临时专利申请________(临时申请传送文件上的名称为“低分子量肿瘤坏死因子结合蛋白”，代理律师登录号为A-415B-P)和Fisher、Edwards和Kieft于1997年2月7日申请的美国临时专利申请________(临时申请传送文件上的名称为“低分子量肿瘤坏死因子结合蛋白”，代理律师登录号为A-415C-P)，这些文献的说明书通过引用结合到本文中。
例如，EP 393 438和EP 422 339指出了“30kDa TNF抑制剂”(也已知为p55受体)和“40kDa抑制剂”(也已知为p75受体)及其修饰形式(例如片段、功能衍生物和变异体)的氨基酸序列和核酸序列。EP393 438和EP 422 339也公开了分离负责编码所述抑制剂的基因、在合适载体和细胞类型中克隆该基因和表达该基因以产生所述抑制剂的方法。另外，也已经公开了上述TNF抑制剂的多价形式(即包含一个以上活性部分的分子)。在一个实施方案中，可以例如通过用例如聚乙二醇(WO 92/16221和WO 95/34326)的临床上可接受的接头将至少一种TNF抑制剂和另一部分化学偶联，通过肽接头(Neve等(1996)，Cytokine,8(5):365-370)，通过偶联到生物素上然后结合到链亲和素(WO 91/03553)，最后通过构建嵌合抗体分子(美国专利5,116,964号、WO 89/09622、WO 91/16437和EP 315062)，构建所述多价形式。
抗TNF抗体包括MAK 195F Fab抗体(Holler等(1993)，第1届骨髓移植中的细胞因子研讨会，147)；CDP 571抗TNF单克隆抗体(Rankin等(1995),British Journal of Rheumatology,34:334-342)；BAYX 1351鼠抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(Kieft等(1995)，第7次临床微生物学和传染病大会，9)；CenTNF cA2抗TNF单克隆抗体(Elliott等(1994),Lancet,344:1125-1127和Elliott等(1994),Lancet,344:1105-1110)。
在具体实施方案中，本发明涉及结合(预治疗、治疗后或同时治疗)可溶性重组人Fas抗原或其重组形式使用IL-1抑制剂(例如优选为IL-1ra产物，更优选为IL-1ra)治疗以上定义的IL-1介导的疾病，所述疾病包括急性和慢性炎症，诸如关节炎症性疾病(例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)；和移植物抗宿主病。可溶性重组人Fas抗原及其变异体(诸如Fas融合蛋白)、分离负责编码可溶性重组人Fas抗原基团的方法、在合适的载体和细胞类型中克隆该基因的方法以及表达该基因以产生所述抑制剂的方法是已知的(WO 96/20206和Mountz等，J.Immunology,155:4829-4837，其公开内容通过引用结合到本文中)。
以上作为实例，不排除本领域技术人员已知的或本领域技术人员使用本说明书提出的指南达到的与这些抗关节炎药同时使用的其它处理。
尤其是最好在剂量单位中配制另外的抗炎化合物的组合物，以易于给药和剂量的均匀性。本文所用的“剂量单位形式”是指适用作给与待治疗哺乳动物患者的单元剂量的物理上分离的单位，每一单位都含有计算的预定量的产生所需治疗作用的其它抗炎化合物以及所需的药用载体。本文所用的“药学上可接受的载体”包括可与所述活性组分和给药模式和该制剂的其它组分相容并对该受治疗者无害的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。这类介质和试剂的使用是本领域熟知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990),Mack PublishingCo.,Easton,PA 18042，第1435-1712页)。典型的药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。补充的活性组分也可以加入所述组合物中。
对于口服治疗给药，另一抗炎化合物可以与赋形剂一起加入，并以可咽下的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等等形式使用，或它可以与膳食中的食物一起直接加入。所述片剂、锭剂、胶囊等等也可以含有以下组分：粘合剂，诸如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、海藻酸等等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、冬青油或草莓或橙调味料。当该剂量单位形式为胶囊时，它除含有以上类型的材料外，可以含有液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在，或者修饰该剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或这两者包衣。当然，用来制备任何剂量形式的任何材料应该是药学是纯的，并且所用的量大致是无毒的。此外，所述另外的抗炎化合物可以加入控释制剂中。这种治疗有用的组合物中所述另外的抗炎化合物的量使得获得合适的剂量。
对于胃肠外给药治疗，每种抗炎化合物可以与无菌注射液一起加入。可以通过将所需量的所述另外的抗炎化合物与各种其它以下列举组分(需要的)一起加入合适的药学上可接受的载体中，然后进行过滤灭菌，制备所述无菌注射液。在分散液的情况下，可以通过将所述另外的抗炎化合物加入含有基本分散介质和所需的以上列举的其它组分的无菌载体中，制备每种分散液。在无菌注射液的情况下，可以通过将至少一种所述另外的抗炎化合物的粉剂和可选的预先灭菌过滤的溶液中的所需组分加入，制备每种注射液，其中所述粉剂通过合适技术(例如真空干燥和冷冻干燥)制备。
所述另外的抗炎化合物的具体剂量按照该患者大致的体重或表面积计算。确定合适剂量中的其它因素可以包括待治疗或待预防的急性或慢性炎症性疾病或紊乱、该疾病的严重性、给药途径和该患者的年龄、性别和医疗状况。本领域技术人员可以常规进行涉及上述每种制剂的合适治疗剂量所需的计算的改进。也可以通过使用结合合适剂量反应数据使用的确定剂量的已知分析确定剂量。
因此，例如可以改变选定治疗特定急性或慢性炎症性疾病的另外的抗炎化合物的剂量，以达到所需的治疗效果也在本发明范围内。当其中一个所述另外的抗炎化合物具有副作用时，它可以在联合治疗的两者另一的疗程内给与患者。例如长期氨甲蝶呤治疗与胃肠、肝、骨髓和肺毒性有关(Sandoval等(1995),British Journal of Rheumatology,34:49-56)。
监测疾病好转的试验可以包括针对例如确定对炎症系统性反应的特定试验，包括红细胞沉降率(ESR)和急性期反应物(APR)。观察患病机体部分的肿胀等。也观察该患者僵硬和紧握(即可应用)的改善和疼痛的减轻。如果该患者状态稳定，则以每周同样剂量再治疗，每周进行评价。如果该病人的状态稳定，该治疗可以继续。治疗6个月后，通过放射性成象，例如通过X放射照相术测定该骨骼的解剖学变化。
每个疗程结束时，再评价该患者。比较治疗前后的放射线学评价，ESR和APR表明所述治疗的功效。根据所述治疗的功效和该患者的状态，在治疗时间内，该剂量可以增加或保持不变。
最好是，本发明涉及一种方法，包括使用IL-1ra和可选的一种以下组合物，以治疗或预防以上定义的IL-1介导的疾病，所述疾病包括诸如关节炎症性疾病(例如骨关节炎和类风湿性关节炎)的急性和慢性炎症和与此有关的症状，上述组合物为：IL-1ra产物(IL-1ra)和氨甲蝶呤；IL-1ra产物(IL-1ra)和任何一种或多种氨甲蝶呤、sulphasazine和羟基氯喹；IL-1ra产物(IL-1ra)和氨甲蝶呤和羟基氯喹；IL-1ra产物(IL-1ra)和氨甲蝶呤和sulphasazine；以及IL-1ra产物(IL-1ra)、氨甲蝶呤和TNF抑制剂，最好是TNFbp。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)氨甲蝶呤和/或TNFbp给与(例如关节内、皮下或肌内注射)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra)与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制，以治疗关节炎(例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎和/或类风湿性关节炎)和与此有关的症状。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)组织血纤维蛋白酶原激活剂和/或TNFbp给与(例如静脉内或心室内)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗由外伤、癫痫、出血或中风引起的脑损伤，所述每种疾病都可以导致神经变性。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)皮质类固醇、环孢菌素、干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素或共有干扰素)中的一种或多种和/或TNFbp给与(例如静脉)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗多发性硬化。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)氨甲蝶呤、皮质类固醇、FK-506、环孢菌素、可溶性fas蛋白中的一种或多种和/或TNFbp给与(例如静脉)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗移植物抗宿主病。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)G-CSF和/或TNFbp给与(例如皮下或肌内)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗肠炎症性疾病。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素或共有干扰素)给与(例如皮下或肌内)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗多发性骨髓瘤或髓细胞性白血病(例如AML和CML)和其它白血病。
在具体实施方案中，该方法包括可选地结合(预治疗、治疗后或同时治疗)NSAID(例如消炎痛)和/或TNFbp给与(例如皮下、心室内或鞘内)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗早老性痴呆。
在具体实施方案中，该方法包括给与(例如局部注射、皮下或肌内注射)IL-1抑制剂(例如优选IL-1ra产物，更优选IL-1ra，与控释聚合物(例如透明质酸衍生物)一起配制)，以治疗暂时性下颌关节疾病。
包括以下实施例以更全面的说明本发明。应该理解，在提出的方法中可以不违背本发明的精神而进行修改。
                        实施例
在广泛认可的分子生物学手册中，诸如Sambrook等，分子克隆，第2版，冷泉港实验室出版(1987)和Ausabel等，Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates/Wiley Interscience，纽约(1990)，提供了以下实施例中描述的许多步骤或合适的其它步骤的标准方法。所有的化学药品获得为分析级或为USP级。
                      实施例1
样品的制备：在水中的10毫摩尔柠檬酸钠、140毫摩尔氯化钠、0.5毫摩尔EDTA、0.1％聚山梨醇酯(w/w),pH6.5(CSEP)中配制一般按照美国专利5,075,222号指出的方法制备的大肠杆菌来源的人重组IL-1受体拮抗剂(rhuIL-1ra)。通过一个调节旋塞，将含有配制的IL-1ra的注射器与含有其中一种以下控释材料的注射器连接：H-10TM hylan流体(Biomatrix,Inc.,Ridgefield,Inc.)，一种或者为干粉或者为在PBS中复制的干粉的交联透明质酸(Mr≥4×106)；PBS中的得自兽疫链球菌(商品目录#H9390,Sigma,Inc.,St.Louis,MO)培养物的干粉透明质酸(Mr≥570,000)；聚乙烯吡咯烷酮(Mr1.3×106)(商品目录#43,719-0,Aldridge Chemical Co.,Inc.,Milwaukee,WI)干粉；以及羧甲基纤维素(羧甲基纤维素(商品目录#06139,Polysciences,Inc.,Warrington,PA)干粉。然后通过将该rhuIL-1ra溶液注射到含有透明质酸的注射器中将该IL-1ra与该控释材料混合，并将所述内容物来回注射几次，以确保混合。
因此，制备以下制剂：(1)IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan；(2)IL-1ra(100mg/ml)/1％透明质酸；(3)IL-1ra(100mg/ml)/0.5％H-10TM hylan；(4)IL-1ra(100mg/ml)/2％透明质酸，(5)IL-1ra(100mg/ml)/4％聚乙烯吡咯烷酮；以及(6)IL-1ra(100mg/ml)/3％羧甲基纤维素。
给雌性Lewis大鼠(200-250g,Charles River,Portage,MI)皮下注射各种制剂。在注射后各种时间，通过插入所述动物颈静脉的导管取血。将所述血液离心，以除去血细胞，用ELISA试剂盒(QuantikineTM人IL-1ra免疫检定，R&D Systems,Minneapolis,MN)按照厂商的指示分析留下的血浆的IL-1ra。该数据以随注射后时间变化的血浆IL-1ra(血浆中的μg/ml IL-1ra)表示，如表2和图1所示。
                表2：皮下注射后的血浆IL-1ra(μg/ml)
注射后的时间(小时) 单独的IL-1ra IL-1ra(100mg/ml)/H-10TM hylan(2％w/v) IL-1ra(100mg/ml)/H-10TM hylan(1％w/v) IL-1ra(100mg/ml)/H-10TM hylan(0.5％w/v) IL-1ra(100mg/ml)/透明质酸衍生物(Mr≥5.7×105)(2％w/v) IL-1ra(100mg/ml)/PVP(4％w/v) IL-1ra(100mg/ml)/CMC(3％w/v)
0 0.0682±0.023 0.027±0.012 0.007±0.002 0.02±0.008 0.007±0.004 0.502±0.311 ND*
0.167 4.186±0.082 2.515±0.429 1.65±0.147 3.085±0.492 2.341±0.278 1.623±0.247 ND*
0.25 ND* ND* ND* ND* ND* ND* 1.93±0.58
0.5 7.658±0.267 4.429±0.567 4.096±0.395 7.167±0.656 4.489±0.309 2.642±0.712 2.46±0.57
1 13.659±2.21 5.98±0.825 5.881±0.865 9.23±0.417 6.217±0.551 4.809±1.936 3.54±0.56
2 9.813±1.135 6.201±0.697 6.708±0.534 11.225±0.759 5.704±0.714 5.461±0.899 5.05±0.94
4 5.252±0.055 6.12±0.834 5.532±0.852 9.225±0.948 6.495±0.945 7.248±1.186 4.49±0.62
8 1.082±0.142 3.354±0.279 4.744±0.716 5.146±0.449 3.438±0.546 8.4 47±2.406 4.27±0.53
12 0.043±0.01 2.024±0.231 1.896±0.1 ND* 4.559±0.322 2.231±0.825 2.37±0.22
24 0.01±0.003 0.345±0.073 0.252±0.059 0.07±0.016 0.112±0.016 0.04±0.005 0.4 6±0.08
48 ND* 0.061±0.032 0.012±0.005 0.01±0.004 0.013±0.006 ND* 0.19±0.12
72 ND* ND* 0.008±0.003 0.008±0.003 0.004±0.003 ND* 0.85±0.42
*数据未提出。
如表2和图1所示，将IL-1ra加入透明质酸衍生物、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素中导致与单独给与的IL-1ra相比，IL-1ra血浆水平较长时间升高。
                        实施例2
CSEP中的IL-1ra用Na[125I]进行放射性标记，然后按上述加入H-10TM hylan流体(终浓度为2％)中。给豚鼠(Charles River,Portage,MI)后腿膝盖关节内注射放射性活性的IL-1ra和IL-1ra/H-10TM hylan混合物。在注射后各个时间，处死所述动物并取出膝关节，按van Lent等(1989)(J.Rheumatol.,16:1295-1303)所述方法在γ计数器中计数。图2显示在每个时间点时保留在所述关节中的IL-1ra的量。IL-1ra在三种不同透明质酸衍生物制剂中的关节内半衰期由诸如图2的图表计算并示于表3。
表3：关节内注射后IL-1ra制剂在豚鼠关节中的半衰期
制剂(a)     比率(b) 半衰期(小时)
单独的IL-1raIL-1ra/透明质酸衍生物IL-1ra/透明质酸衍生物IL-1ra/透明质酸衍生物     NA90/1080/2050/50     1.363.542.451.45
(a)IL 1ra浓度为100mg/ml。当可使用时，透明质酸衍生物浓度为2％(w/v)。(b)制剂中流体(非交联)与凝胶(交联)透明质酸衍生物之比。
如表2和图3所示，将IL-1ra加入透明质酸衍生物中导致在关节内给药后，在膝关节中IL-1ra保留较长时间。保留的程度可以通过该制剂中交联(凝胶)与非交联(流体)透明质酸衍生物之比来控制。
                      实施例3
将上述CSEP中的IL-1ra或IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan制剂关节内注射到兔(Charles River,Portage,MI)的后腿膝盖中。在注射后各个时间时，杀死所述动物并用PBS灌洗所述膝盖，以回收所述滑液。用ELISA试剂盒(QuantikineTM，人IL-1ra免疫检定，R&D Systems)按照厂商的指示测定回收的滑液中的IL-1ra浓度。该数据示于表4和图3。
表4：关节内注射后IL-1ra制剂在兔后腿
          膝盖关节中的半衰期
    注射后的时间(小时) 单独的IL-1ra IL-1ra(100mg/ml)/透明质酸衍生物(2％w/v)
    0.5     2280     2440
    0.5     11000     6200
    0.5     5000     2410
    0.5     8090     ND*
    1     1400     5150
    1     3450     6830
    1     3090     7180
    1     1840     2620
    4     56.98     224
    4     31.24     1600
    4     62.43     3250
    4     ND*     237
    8     0.0641     575
    8     0.0312     55.98
    8     ND*     125
    8     ND*     ND*
    24     ND*     0.5644
    24     ND*     0.1539
    24     ND*     0.8852
*数据未提出。
该数据表明，IL-1ra的透明质酸衍生物制剂在关节内注射后能够将完整的IL-1ra较长时间地缓释到所述滑液中。
                    实施例4
在第0天和第7天用牛Ⅱ型胶原(Elastin Products,Owensville,MO)免疫雌性Lewis大鼠(200-250g,Charles River,Portage,MI)。在第12-13天开始发生关节炎。在初次免疫后第15天和第18天，给所述大鼠(8只动物/组)关节内注射或者CSEP中的H-10TM hylan流体(50μl/膝盖；总共1mg透明质酸衍生物)或者IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan(50μl/膝盖；5mg IL-1ra/1mg透明质酸衍生物)。关节炎对照组不接受注射。初次免疫后第20天时，杀死所述大鼠，收集膝关节用于疾病严重性的组织学评价。如表5和图4所示：(a)用IL-1ra治疗显著抑制软骨和骨损害，并对滑膜炎有中等作用；(b)与对照相比，总关节损害降低70％，以及(c)单独用透明质酸衍生物治疗与疾病对照相比没有有益作用。
      表5：关节内注射后滑液中的IL-1ra浓度
制剂 滑膜炎 血管翳 总软骨 骨损害     关节总数
未治疗 3.25±0.14  1.5±0.16  17.69±2.27  1.44±0.16  23.88±2.57
透明质酸衍生物(2％w/v) 2.88±0.39  1.44±0.22  16.88±3.14  1.31±0.25  22.5±3.87
IL-1ra(100mg/ml)/透明质酸衍生物(2％w/v) 2.06±0.28  0.5±0.18  4.69±1.77  0.19±0.14  7.53±2.33
                      实施例5
在第0天和第7天，在雌性Lewis大鼠(200-250g,Charles River,Portage,MI)尾部基部和背上3个部位(分成的250μl)皮内注射弗氏不完全佐剂(Difco Laboratoryies,Inc.,Ann Arbor,MI)中的牛Ⅱ型胶原(Elastin Products,Owensville,MO)。在第12天，给它们腹膜内注射3mg/kg内毒素(LPS L-3129型，Sigma)。在接下来的5天内开始发生关节炎，当大鼠发病时，将它们随机分到研究组中(6-8只/组)并开始治疗。所述大鼠治疗6天(在背部皮下注射上述IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TMhylan流体)，然后在关节炎的第7天杀死大鼠，以进行足重量评价和组织收集。
在关节炎发病前、随机分组当天和随后的每个研究日用卡尺测量踝关节的宽度，直至关节炎等7天时结束该研究。然后该数据以用来从对照测定对个关节炎持续时间的抑制百分比分曲线下的面积表示。结束时，在踝的内侧和外侧水平横切胫跗关节，以测定后爪重量作为另一个炎症测量数据。然后将踝关节收集在福尔马林中用于病理组织学评价。
病理组织学：将踝关节收集到10％中性缓冲的福尔马林中至少24小时后，置于Surgipath脱钙仪Ⅰ(Surgipath,Graslake,IL.)中大约1周。完成脱钙时，修剪足趾，将所述踝关节在纵向平面横切，产生大约相等的两半。将这些关节加工以进行石蜡包埋，切片并用苏木精和曙红染色，以按照以下标准一般评价炎症和骨损害，用甲苯胺蓝染色，以具体评价软骨变化：炎症
0=正常
1=炎症细胞最少量地浸润到关节周组织
2=轻度浸润
3=中度浸润并且中度水肿
4=显著浸润并且显著水肿
5=严重浸润并且严重水肿软骨损害
0=正常
1=甲苯胺蓝染色最小程度至轻度的丧失，没有明显的软骨细胞丧
失或胶原瓦解
2=甲苯胺蓝染色轻度丧失，病灶轻度(表面)软骨细胞丧失和/或胶
原瓦解
3=甲苯胺蓝染色中度丧失，多病灶中度(深至中间区)软骨细胞丧
失和/或胶原瓦解
4=甲苯胺蓝染色显著丧失，多病灶显著(深至深区)软骨细胞丧失
和/或胶原瓦解
5=甲苯胺蓝染色严重扩散丧失，多病灶严重(深至变异标志(tide
mark))软骨细胞丧失和/或胶原瓦解骨吸收
0=正常
1=最小程度，吸收区小，低倍放大时不容易看出，破骨细胞稀少
2=轻度，吸收区更多，低倍放大时不容易看出，破骨细胞更多
3=中度，髓状小梁和骨密质吸收明显，皮质中没有全部厚度的缺
损，某些髓状小梁损失，低倍放大时损害明显，破骨细胞更多
4=显著，皮质骨中全厚度缺损，通常留下的皮质表面外观变形，
髓状小梁显著丧失，破骨细胞更多
5=严重，皮质骨中全厚度缺损，通常留下的皮质表面外观变形，
远侧胫骨的髓状骨显著丧失，破骨细胞更多，较小的跗骨中存
在吸收
统计学分析：通过测定该给药曲线下的面积分析踝宽度的临床数据，随后分析方差。用“学生”T检测分析每组的足趾重量(平均值±SE)的差异。
与每日给与单次CSEP中的100mg/kg剂量的IL-1ra缺失功效相反，每日1次(QD)皮下(SQ)注射几个剂量的IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体，导致62％超时(over time)抑制足趾肿胀和74％抑制后爪重量(图6和图7)。这些结果明显地证明每日给与IL-1ra(l00mg/ml)/2％H-10TM hylan流体相对CSEP中的IL-1ra的优良临床作用。另外，踝关节切片的组织学分析表明用IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体(而非CSEP中的IL-1ra)治疗的大鼠中炎症、血管翳形成和软骨和骨损害显著降低(图8)。
证实每日1次皮下注射IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体能够调节疾病进程后，研究测定作用的持续时间。每日用IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体治疗的大鼠53％的超时抑制足趾肿胀和78％的抑制后爪重量(图9和图10)。每2天用IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体治疗的关节炎大鼠35％的超时抑制足趾肿胀和62％的抑制后爪重量。每3天用IL-1ra(100mg/ml)/2％H-10TM hylan流体治疗的关节炎大鼠27％的超时抑制(不显著)肿胀和19％的抑制足趾重量。这些结果再次证明，在该模型的发病机理中IL-1有效的期间内保持最小血液浓度至少为200ng/ml的重要性。间断地阻断IL-1受体导致功效较小。每3天治疗的大鼠在关节炎第1天和第4天给药。有趣的是，给药(第2天和第5天)后24小时用卡尺测量表明抑制关节炎的进程(图9)。然而，在给与大鼠下一个剂量之前给药后2天或3天进行的测量反映疾病进程，可假定由于该期间低于最适血液浓度引起的。
尽管以上已经概述和通过有效实施方案描述了本发明，但应该理解，本领域技术人员会想到根据以上描述进行其它变化和修改。
                      序列表(1)一般资料
(ⅰ)申请人：COLLINS,David S.
            BEVILACQUA,Michael P.
(ⅱ)发明名称：治疗炎症性疾病的组合物和方法
(ⅲ)序列数：2
(ⅳ)通信地址：
    (A)收信人：AMGEN INC.
    (B)街道：1840 De Havilland Drive
    (C)城市：Thousand Oaks
    (D)州：加州
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：91320-1789
(ⅴ)计算机可读形式：
    (A)媒体类型：软盘
    (B)计算机：IBMPC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS
    (D)软件：Patent In Release#1.0，版本#1.30
(ⅵ)当前申请数据
    (A)申请号：US尚未颁发
    (B)提交日期：1997年2月7日
    (C)分类：
(ⅶ)在先申请数据
    (A)申请号：US 60/011,419
    (B)提交日期：1996年2月9日
(ⅶ)在先申请数据
    (A)申请号：US 60/032,789
    (B)提交日期：1996年12月6日
(ⅶ)在先申请数据
    (A)申请号：US(代理律师登录号A-365B-P)
    (B)提交日期：1997年1月23日
(ⅷ)代理律师/代理人资料
    (A)姓名：ZINDRICK,Thomas D.
    (B)注册号：32,185
    (C)参考/档案号：A-365C(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)顺序特征：
    (A)长度：462个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：1...462
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：misc_特征
    (B)位置：1...3
    (D)其它资料：/注释=“起始甲硫氨酸是可选的”
(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:1:ATG CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC TTC AGA ATC        48Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile1               5                  10                  15TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC AAC CAA CTA GTT        96Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val
         20                  25                  30GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA GAA AAG ATA GAT       144Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp
     35                  40                  45GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC CAT GGA GGG       192Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly
 50                  55                  60AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG ACC AGA CTC CAG       240Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln65                  70                  75                  80CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC AGA AAG CAG GAC       288Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp
             85                  90                  95AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC ACC ACC AGT TTT       336Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe
        100                 105                 110GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA GCG ATG GAA GCT       384Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala
    115                 120                 125GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA GGC GTC ATG GTC       432Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val
130                 135                 140ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAG                               462Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu  *145                 150(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)顺序特征：
    (A)长度：154个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:2:Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile1               5                  10                  15Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val
         20                  25                  30Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp
     35                  40                  45Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly
 50                  55                  60Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln65                  70                  75                  80Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu ASn Arg Lys Gln Asp
             85                  90                  95Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe
        100                 105                 110Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala
    115                 120                 125Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val
130                 135                 140Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu  *145                 150

Claims (38)

1．治疗患有IL-1介导的疾病的病人的方法，包括给与有需要的患者治疗有效量的组合物，所述组合物包含控释聚合物和蛋白性白介素-1抑制剂。
2．权利要求1的方法，其中所述控释聚合物为水凝胶酯。
3．权利要求2的方法，其中所述水凝胶酯为透明质酸衍生物(hyaluronan)或其盐。
4．权利要求3的方法，其中所述透明质酸衍生物为透明质酸。
5．权利要求3的方法，其中所述透明质酸衍生物为hylan。
6．权利要求3的方法，其中所述透明质酸衍生物为透明质酸钠。
7．权利要求2的方法，其中所述水凝胶酯为聚(乙烯吡咯烷酮)。
8．权利要求2的方法，其中所述水凝胶酯为纤维素。
9．权利要求8的方法，其中所述纤维素为羧甲基纤维素。
10．权利要求1的方法，其中所述蛋白性白介素-1抑制剂为IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。
11．权利要求10的方法，其中所述IL-1ra糖基化。
12．权利要求10的方法，其中所述IL-1ra非糖基化。
13．权利要求10的方法，其中所述IL-1ra为甲硫氨酰IL-1ra。
14．权利要求10的方法，其中所述IL-1ra用重组DNA方法生产。
15．权利要求1的方法，其中所述疾病为关节炎症性疾病，选自类风湿性关节炎、骨关节炎和由劳累、扭伤、外伤、感染、软骨损害或整形外科引起的其它炎症性疾病。
16．权利要求1的方法，其中通过关节内注射或皮下注射给与所述组合物。
17．药用组合物，包括有效量的控释聚合物组合物和蛋白性白介素-1抑制剂。
18．权利要求17的组合物，其中所述控释聚合物为透明质酸衍生物或其盐。
19．权利要求18的组合物，其中所述透明质酸衍生物为透明质酸。
20．权利要求18的组合物，其中所述蛋白性白介素-1抑制剂为IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。
21．权利要求20的组合物，其中所述IL-1ra糖基化。
22．权利要求20的组合物，其中所述IL-1ra非糖基化。
23．权利要求20的组合物，其中所述IL-1ra为甲硫氨酰IL-1ra。
24．权利要求20的组合物，其中所述IL-1ra用重组DNA方法生产。
25．权利要求17的组合物，它为适于给与关节腔内的制剂形式。
26．权利要求18的组合物，其中所述透明质酸衍生物存在的范围为0.1-5％w/v。
27．权利要求20的组合物，其中所述IL-1ra存在的浓度范围为0.1-200mg/ml。
28．权利要求18的组合物，其中所述透明质酸衍生物存在的范围为0.1-5％w/v，所述IL-1ra存在的范围为0.1-200mg/ml。
29．权利要求18的组合物，其中所述透明质酸衍生物存在的浓度约为2％w/v，所述IL-1ra存在的浓度约为100mg/ml。
30．药用组合物在制备治疗IL-1介导的疾病的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的控释聚合物和蛋白性白介素-1抑制剂。
31．按照权利要求30的用途，其中所述IL-1介导的疾病为关节炎症性疾病。
32．按照权利要求31的用途，其中所述关节炎症性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎和由劳累、扭伤、外伤、感染、软骨损害或整形外科引起的其它炎症性疾病。
33．按照权利要求30至32的用途，其中关节内给与所述药用组合物。
34．按照权利要求30-32的用途，其中所述控释聚合物为透明质酸衍生物或其盐。
35．按照权利要求34的用途，其中所述透明质酸衍生物为透明质酸。
36．按照权利要求30-35的用途，其中所述IL-1抑制剂为IL-1ra。
37．按照权利要求36的用途，其中所述IL-1ra包含至少一种选自IL-1raα、IL-1raβ和IL-1rax的一种化合物。
38．按照权利要求37的用途，其中所述IL-1抑制剂为人重组IL-1ra。
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