CZ2010687A3

CZ2010687A3 - Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové

Info

Publication number: CZ2010687A3
Application number: CZ20100687A
Authority: CZ
Inventors: Huerta-Angeles@Gloria; Chládková@Drahomíra; Šmejkalová@Drahomíra; Buffa@Radovan; Velebný@Vladimír
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-03-21
Also published as: AR082965A1; WO2012034544A2; CZ305040B6; WO2012034544A3

Abstract

Zpusob prípravy vysoce substituovaných amidu kyseliny hyaluronové s kontrolovatelným stupnem substituce, pripravených v polárním aprotickém prostredí z kyselé formy kyseliny hyaluronové v prítomnosti ethylchlorformiátu, pomocí primárního aminu.

Description

(57) Anotace:

Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové s kontrolovatelným stupněm substituce, připravených v polárním aprotickém prostředí z kyselé formy kyseliny hyaluronové v přítomnosti cthylchlorformiátu. pomocí primárního aminu.

CZ 2010-687 A3

Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové

Oblast techniky

Technické řešení se týká způsobu přípravy amidových derivátů kyseliny hyaluronové s vysokým stupněm substituce, které jsou dále použitelné v medicíně, farmacii a pro přípravu hydrogelů v tkáňovém inženýrství.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hyaluronová je lineami heteropolysacharid skládající se z opakujících se disacharidových jednotek kyseliny D-glukuronové a 7V-acetyl-D-glukosaminu. Jedná se o nerozvětvený polysacharid, který pokud je izolovaný z přírodního zdroje, může dosahovat molekulové hmotnosti v rozmezí od 50 000 do 5 000 000 Da v závislosti na způsobu izolace a výchozím materiálu.

Kyselina hyaluronová je hlavní složkou mezibuněčné hmoty a díky svým viskoelastickým vlastnostem je důležitou součástí Teologických, fyziologických a biologických funkcí v těle. Díky své vysoké lubrikační kapacitě, schopnosti vysoké sorpce a zadržování vody je často aplikována v oční chirurgii. Likviduje volné kyslíkové radikály a ovlivňuje proliferaci i diferenciaci buněk. Dále zabraňuje ukládání kolagenu a tím podporuje hojení ran a zamezuje vzniku jizev.

Pro široké klinické použití nativní kyseliny hyaluronové je problematická především její velmi rychlá degradace v roztoku a poměrně špatné mechanické vlastnosti. Zlepšení těchto vlastností a zároveň zvýšení odolnosti proti degradaci lze dosáhnout chemickou modifikací hyaluronanu.

Z tohoto důvodu byla v posledních letech pozornost zaměřena na přípravu syntetických hyaluronových derivátů, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, a po určitých úpravách mohou být aplikovatelné jako biodegradabilní a biokompatibilní materiály v medicíně, chirurgii a tkáňovém inženýrství. Jednou z vhodných úprav materiálu jsou síťovací reakce, kdy se z modifikované kyseliny hyaluronové vytváří hydrogely.

• · · • · * • · · • · · • · · · ·

Hydrogely jsou hydrofílní sítě polymerů, které mohou být používány pro kontrolní distribuci léků, bioaktivních a jiných látek v organismu, jako skafoldy nebo kožní plniva. Důležitou podmínkou pro přípravu hydrogelů je stabilita derivátů, které jsou použity jako vstupní prekurzory pro síťovací reakci.

Pro tvorbu hydrogelů byla vyzkoušena řada modifikovaných derivátů hyaluronanu. Jedněmi z nich byly i amidové deriváty. Tyto deriváty si zasloužily velkou pozornost z důvodu jejich poměrně vysoké stability vůči degradaci a hydrolýze ve fyziologických podmínkách v prostředí bez enzymatické aktivity.

Současný stav přípravy amidových derivátů hyaluronanu pro následnou gelaci je založen na používání různých reakčních podmínek, které však vedou pouze k relativně nízkým stupňům amidace (do 30%) (WO/2000/001733 (AI)). Velkou nevýhodou některých současných postupů je především to, že vlastní amidaci předchází deacetylace hyaluronanu (WO/2000/001733 (AI)). Amidový derivát hyaluronanu je následovně síťován až do vzniku hydrogelů. Síťování azidů a alkinů, které jsou navázány na polysacharid přes amidickou vazbu, je nejčastěji katalyzováno měďnými kationty, které jsou toxické. Čím nižší je stupeň substituce amidových derivátů vstupujících do reakce, tím větší množství katalyzátoru musí být použito (WO/2008/031525A1).

Podstata vynálezu

Nízký stupeň amidových derivátů hyaluronanu může být navýšen aplikací specifických reakčních podmínek. Hlavní podstatou tohoto vynálezu je postup přípravy amidů kyseliny hyaluronové, při kterém dochází k selektivní amidaci karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové za vzniku vysoce substituovaných produktů. Princip reakce spočívá v aktivaci karboxylové skupiny hyaluronanu pomocí ethylchlorformiátu, v přítomnosti báze, přičemž vzniklý intermediát - aktivovaný hyaluronan - následně reaguje s primárním aminem R-NHí za vzniku amidu kyseliny hyaluronové podle schématu 1:

aprotické prostředí, báze, RNH₂ o

Schéma 1 Amidace kyseliny hyaluronové kde R je alkylový lineární nebo rozvětvený řetězec Ct - C₃o, volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin. Příprava probíhá s výhodou v polárním aprotickém prostředí, zejména v dimethylsulfoxidu. Kyselina hyaluronová je s výhodou v kyselé formě a má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozmezí 10 až 500 kDa, zejména 350 až 500 kDa.

Ve výhodném provedení vynálezu probíhá reakce při teplotě 25 °C po dobu 8 až 24 hod, s výhodou po dobu 12 hod.

Stupeň substituce kyseliny hyaluronové ve způsobu přípravy podle vynálezu je s výhodou řízen molámím množstvím přidaného aminu R-NII2, přičemž primární amin se s výhodou přidá do reakce v čase 0,1 až 2 hod po přídavku ethylchlorformiátu a v molámím množství 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu. Primárním aminem R-NH₂ může být například CH=C-CH₂-NH₂, NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-N₃ nebo NH₂(CH₂)₅-CH₃.

Ve výhodném provedení vynálezu je látkové množství přidaného ethylchlorformiátu v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.

Bází použitou ve způsobu podle vynálezu může být trialkylamin, například triethylamin, a to s výhodou v látkovém množství v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů báze vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.

Výhodou oproti známým analogům je volitelně vysoký stupeň substituce, který vede k výrazné změně fyzikálně-chemických vlastností. Blokování karboxylové skupiny hyaluronanu v síťovaných produktech má za následek nižší bobtnavost, a tudíž lepší mechanickou stabilitu připravených síťovaných produktů.

·· · ·

. · · · • · ·· ··

Amidové deriváty hyaluronanu připravené tímto způsobem vykazují kontrolovatelný stupeň substituce v rozmezí 10-99 %. Stupeň substituce je kontrolovaný molárním poměrem primárního aminu, ethyl chlorformiátu a báze.

Amidové deriváty jsou vysoce stabilní vůči degradaci a hydrolýze, a proto mohou být použity pro tvorbu stabilních hydrogelů. V případě vysokého stupně substituce jek síťovací reakci třeba jen velmi malé množství katalyzátoru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem

0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 100 kDa a polydisperzitě 1,9 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO₃ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,3957 g

Mw derivátu po reakci: 80 kDa.

Stupeň substituce ~ 44%.

¹II NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, 5 ppm):

2,01 (s, 3H,8a), 3,36 (bs, 1H, 2b), 3,46 (bs, 1H, 5a,), 3,54(bs, lH,4a), 3,70 (bs, 2H, 3a a 3b), 3,83 (bs, 1H, 4b), 3,90 (bs, lH,5b), 3,91 (d,lH, la) 4,10 (d,lH, 1 β), 4,50 (bs,2H, laa lb)

DOSY NMR:

log D (2,03 ppm CHj-CO-NH-Polymer) —10,5 m²/s log D(2,7 ppm -CH₂ NH-R) -10,5 m²/s • * ·· ··

-5• · · · · ·· • *··*· · ·, • · · · ·· • · ·· ··· ·· log D(3,0 ppm -CH₂NH-R) — 10,5) m²/s

Příklad 2

Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem

0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 248 kDa a polydisperzitě

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO₃ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,3957 g

Mw derivátu po reakci: 120 kDa

Stupeň substituce = 98 %.

^!H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1

DOSY NMR: viz příklad 1

Příklad 3

Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem

0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 366 kDa a polydisperzitě

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,125 g (1,36 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku

-6• ··· ·

NaCl a NaHCO₃ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,3957 g

Mw derivátu po reakci: 177,4 kDa

Stupeň substituce = 50 %.

^]H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1

DOSY NMR: viz příklad 1

Příklad 4

Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem

0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 393 kDa a polydisperzitě

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,111 g (1,32 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO₃ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,4452 g

Mw derivátu po reakci: 240 kDa

Stupeň substituce = 60 %, ^lH NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1

DOSY NMR: viz příklad 1

Příklad 5

Amidace kyseliny hyaluronové propargylaminem

0,5 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 485 kDa a polydisperzitě

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq ) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,111 g (1,32 mmol) hydrochloridu propargylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,4452 g

Mw derivátu po reakci: 133,4 kDa

Stupeň substituce = 88 %.

’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 1

DOSY NMR: viz příklad 1

Příklad 6

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 42 kDa a polydisperzitě

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCO₃(celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

-s-

Výtěžek reakce: 0,8001 g

Mw derivátu po reakci: 20 kDa

Stupeň substituce = 75 %.

^lH NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm):

5H,6a,3b,4b,3a,5b), 4,50( bs,2H, laalb)

DOSY NMR:

log D (2,03 ppm CT/j-CO-NH-Polymer) —10,5 m²/s log D(2,7 ppm -CH₂ NH-R) -10,5 m²/s log D(3,0 ppm -CH₂NH-R) -10,5) m²/s

Příklad 7

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1,6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (4 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do díalyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCC>3 (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,8067 g

Mw derivátu po reakci: 20 kDa

Stupeň substituce = 50 %.

’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

Příklad 8

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1.6 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,8067 g

Mw derivátu po reakci: 20 kDa

Stupeň substituce = 40 %.

*H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, 6 ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

Příklad 9

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 72 kDa a polydisperzitě

1.7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCOa (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,7826 g

-10« · • · • · • «

Mw derivátu po reakci: 52 kDa

Stupeň substituce = 54 %.

^]H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

Příklad 10

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azido propylaminem

1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 70 kDa a polydisperzitě

1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (5 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 24 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,7826 g

Mw derivátu po reakci: 35 kDa

Stupeň substituce = 60 %.

’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

Příklad 11

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 393 kDa a polydisperzitě

1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi

•	·♦	··	• ··
•		• ·	• *	• A	A	A
•	•	♦ ·	• ·	•	•	•
	··	• · ·	··· ·	•	•	•
	•	• «	«	•	A	•
*	*	««	♦ ·	4« A		A A

- 11 přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropy laminu a reakční směs se míchá dalších 8 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCC^ (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,7826 g

Mw derivátu po reakci: 165 kDa

Stupeň substituce = 85 %.

^!H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

Příklad 12

Amidace kyseliny hyaluronové 3-azidopropylaminem

1,0 g kyseliny hyaluronové (kyselá forma) o molekulové hmotnosti 485 kDa a polydisperzitě

1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (3 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,228 g (2,65 mmol) 3-azidopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 10 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 12-14 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCl a NaHCOj (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,7826 g

Mw derivátu po reakci: 177 kDa

Stupeň substituce = 98 %.

’H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm): viz příklad 6

DOSY NMR: viz příklad 6

- 12·· ·· • · · * • · · • ··· · • · ·· ·· ·

Příklad 13

Amidace kyseliny hyaluronové hexyl aminem

1,7 bylo rozpuštěno v 50 ml DMSO při teplotě 60 °C. Po rozpuštění se roztok kyseliny hyaluronové nechá ochladit na laboratorní teplotu. Po ochlazení se přidá 0,922 ml triethylaminu (5 eq) a reakční směs se nechá míchat 10 minut. Poté se přidá 0,378 ml ethylchlorformiátu (3 eq) a reakční směs se nechá hodinu míchat. Poté se do reakční směsi přidá 0,253 g (2,5 mmol) hexylaminu a reakční směs se míchá dalších 12 hod při laboratorní teplotě, směs se naředí na celkový objem 200 ml a přelije do dialyzačních střev (cut-off 1214 kDa), kde se dialyzuje 3 x po 24 hod proti 0,1% roztoku NaCI a NaHCCh (celkový objem 10 1) a dále 3 x po 24 hod proti demi vodě. Dialyzovaný derivát se odpaří do sucha a vysuší pomocí acetonu. Struktura derivátu byla potvrzena NMR analýzou.

Výtěžek reakce: 0,7826 g

Mw derivátu po reakci: 200 kDa

Stupeň substituce = 88 %.

*H NMR přiřazené pomocí HSQC (500 MHz, NaOD, δ ppm):

0,8 (bs, 2H, 6), 1,2 (bs, 2H, 5), l,45(bs, 6H,3, 4 a 5), 1,8 (q,3H, 8), 2,01 (s, 3H,8a), 3,19 (bs, 1H, lot), 3,30(bs, 1H, 2b), 3,36(bs, 2H,3), 3,50 (bs, 3H,ip,6a,5a), 3,57(bs, lH,3b), 3,70 (bs, 4H, 6a,3b,4b,3a), 3,89 (bs, 5H,6a,3b,4b,3a,5b), 4,50( bs,2H, la a lb) DOSY NMR:

log D (2,03 ppm CV/j-CO-NH-Polymer) —10,5 m²/s log D(2,7 ppm -CH₂NH-R) -10,5 m²/s logD(3,0ppm -CH₂NH-R)-10,5) m²/s

Uvedené příklady provedení jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují ani ne vyčerpávají všechny varianty provedení vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy amidových derivátů kyseliny hyaluronové, vyznačující se tím, že se nejprve v přítomnosti báze aktivuje skupina COOH kyseliny hyaluronové ethylchlorformiátem za vzniku reaktivního intermediátu, který následně reaguje s primárním aminem R-NH₂ za vzniku amidu kyseliny hyaluronové dle schématu 1:

aprotické prostředí, báze, RNH_Z o

Schéma 1 kde R je alkylový lineární nebo rozvětvený řetězec Ci - C30, volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin.
2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že probíhá v polárním aprotickém prostředí, zejména v dimethylsulfoxidu.
3. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová je v kyselé formě a má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozmezí 10 až 500 kDa, zejména 350 až 500 kDa.
4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že reakce probíhá při teplotě 25 °C po dobu 8 až 24 hod, s výhodou po dobu 12 hod.
5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že stupeň substituce kyseliny hyaluronové je řízen molámím množstvím přidaného aminu R-NH₂.
6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že primární amin se přidá do reakce v čase 0,1 až 2 hod po přídavku ethylchlorformiátu.
7. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že primární amin se přidá do reakce v molámím množství 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimem hyaluronanu.
8. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že primárním aminem R-NH₂ je CHOCH₂-NH₂, NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-N3 nebo NH₂(CH₂)5-CH₃.

• « ·« • # v r» t » « · • · · · • · • · • · « < ·« ·· * * · · # • · · • • · · 4 * * ♦ · + * fc '* ·
9. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že látkové množství přidaného ethylchlorformiátu je v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.
10. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že bází je trialkyl amin, zejména triethylamin.
11. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že látkové množství přidané báze je v molámím poměru 3 až 5 ekvivalentů vzhledem k látkovému množství dimeru hyaluronanu.