CZ20023261A3 - Genetické markery pro zlepšené vlastnosti zvířecího masa - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu genetického hodnocení zvířat testováním na přítomnost alespoň jednoho genetického markéru, který ukazuje na přítomnost jednoho nebo více znaků, spojených s kvalitou masa. Tímto způsobem je hlavně analysována variabilita genu receptoru pro melanokortin-4 (MC4R), případně variabilita jiných markérů, ukazujících na přítomnost těchto příznivých znaků.

Dosavadní stav techniky

Mezi jednotlivými zvířaty, rovněž jako mezi plemeny, existují genetické rozdíly, které mohou být využity šlechtitelskými způsoby pro získání zvířat s požadovanými vlastnostmi. Čínská plemena jsou například známa dosažením pohlavní zralosti v raném věku a velkou velikostí vrhu, zatímco americká plemena jsou známa větší rychlostí růstu a libovostí.

Dědivost těchto požadovaných znaků je však většinou nízká a standardními šlechtitelskými způsoby, selektujícími jedince na základě fenotypové variability, nelze zachytit veškerou existující genetickou variabilitu nebo interakce komplexních genů.

Několika skupinami byla pro studium DNA prasat použita analysa délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP). Jung et al., Theor, Appl, Genet., 77:271-274 (1989), začleněný zde citací, uveřejňuje použití analysy RFLP pro předvedení genetické variability mezi dvěmi plemeny prasat. Polymorfismus byl předveden na třídě I genů prasečího leukocytámího antigenu (SLA) těchto plemen. Hoganson et al., Abstract for Annual Meeting of Midwestem Section of the American Society of Animal Science, 26-28.3.1990, začleněný zde citací, popisuje polymorfismus prasečích genů hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) u čínských prasat, který je také předveden pomocí analysy RFLP. Jung et al., Theor, Appl. Genet., 77:271-274 (1989), začleněný zde citací, popisuje analysu RFLP třídy I genů SLA u některých kanců. Autoři prohlašují, že tyto výsledky naznačují existenci určitého spojení mezi prasečími geny SLA/MHC třídy I a produkčními a funkčními znaky. Dále prohlašují, že použití restrikčních fragmentů třídy I SLA jako genetických markérů může představovat budoucí potenciál pro zlepšování růstových vlastností prasat.

Možnost sledovat konkrétní výhodnou genetickou alelu zahrnuje nový a zdlouhavý způsob identifikace molekulárního markéru DNA pro hlavní účinný gen. Tento markér může • · · · · · · · · ·· ·· ···· být vázán na jediný gen s hlavním účinkem nebo může být vázán na více genů s aditivními účinky. DNA markéry mají několik výhod; jejich segregaci (štěpení) lze snadno a jednoznačně sledovat a DNA markéry jsou kodominantní, tj., heterozygotní a homozygotní zvířata lze snadno odlišit. Když je markerový systém jednou určen, lze činit selekční rozhodnutí velmi snadno, protože DNA markéry mohou být testovány kdykoliv po odebrání vzorků krve nebo tkáně od jednotlivých nedospělých jedinců nebo dokonce embryí.

Použití genetických rozdílů mezi receptorovými geny se stalo cenným markerovým systémem pro selekci. Například US patenty č. 5 550 024 a 5 674 526, vydané na jméno Rothschild et al., popisují polymorfismus v rámci prasečího genu receptoru estrogenů, který je spojen s větší velikostí vrhu, a jsou zde začleněny citací. Patent US č. 5 935 754 popisuje polymorfní markéry prasečího genu receptoru prolaktinu, které jsou spojeny s větší velikostí vrhu a celkovou reprodukční účinností. Asi jednou z nejdůležitějších charakteristik u zvířat, produkujících maso, je kvalita masa. Kvalita masa je vlastnost, která se velmi obtížně zjišťuje, protože tento komplexní znak je utvářen mnoha různými aspekty, objektivními i subjektivními. Seznam faktorů, které určují kvalitu masa, i jiných potravin, je dosti dlouhý (Wood et al., Proceedings of The Nutrition Society (1999) 58:363-370). Zahrnuje nepřítomnost biologického rizika (zdravotní nezávadnost potravin) a prevenci zneužívám zvířat (blaho zvířat). Rovněž zahrnuje smyslovou přitažlivost masa, tj., jeho chuť neboli kvalitu jako jídla a vnímání jeho vlivu na zdraví konzumenta, zvláště ve vztahu k množství a druhu tuku.

Kvalita syrového vepřového masa je ovlivněna velkým počtem genetických a negenetických faktorů. Posledně jmenované obsahují podmínky hospodářství, dopravy, jatek a zpracování. Specialisté na maso provedli rozsáhlé výzkumy těchto faktorů, které vedly k významným zlepšením kvality. Část tohoto výzkumu byla také věnována genetickému pozadí u prasat a některé studie vyjevily důležitost genetických faktorů. Toto vše přispělo k poznání, že šlechtitelský výběr prasat a použití genových technologií může hrát důležitou roli při zvyšování kvality vepřového masa.

Informace na úrovni DNA mohou pomoci fixovat konkrétní hlavní účinný gen, ale mohou také sloužit při selekci kvantitativního znaku, na který již selektujeme. Molekulární údaje navíc k fenotypovým údajům mohou zvyšovat přesnost selekce a tudíž i selekční odpověď. Velikost navíc získané odpovědi v selekčním programu využívajícím markéry (markér assisted selection, MAS) byla z teoretického hlediska brána v úvahu mnoha pracovníky. Obecně vzato je MAS výhodnější pro znaky s nízkou dědivostí a pro znaky, jejichž selekce podle fenotypu je nákladná. Kvalita masa je brána jako obzvláště výborná • · ··· ··· ··· ·· ···· příležitost pro využití MAS. Například Meuwissen, T.H.E. a Goddard, M.E. (1996) „The use of Markér Haplotypes in Animal Breeding Schemes“, Genet. Sel. Evol., 28:161-176, vzali do úvahy účinek použití markérů při selekci na znaky, jako je reprodukce a kvalita masa, které je velmi obtížné zlepšovat tradičními způsoby. Jejich výsledky jsou velmi povzbudivé a naznačují, že pro znaky jako je kvalita masa, je-li tento znak je měřen po porážce, může být dosaženo až 64% zvýšení citlivosti.

Nejlepším způsobem pro genetické zlepšování kvality masa je vskutku nalezení relevantních DNA markérů přímo v populaci, která je selektována. Měření kvality masa lze provádět kontinuálně na několika zvířatech nukleárních populací šlechtitelských organizací. Protože celkové hodnocení kvality masa může být provedeno pouze po porážce, musí být údaje sbírány na vyřazených zvířatech a nikoli na zvířatech potenciálně určených pro další šlechtění.

Tyto fenotypové údaje o kvalitě masa jsou sbírány proto, aby byla umožněna detekce relevantních DNA markérů, validace markérů z experimentálních populací a nebo testovány kandidátské geny. Signifikantní markéry nebo geny mohou být potom začleněny přímo do selekčního procesu. Výhodou této molekulární informace je, že ji lze získat již ve velmi mladém věku šlechtěných zvířat, což znamená, zeje možno provádět předběžnou selekci, založenou na DNA markérech, dříve než je ukončeno provedení růstového testu. To je velmi výhodné pro systém celkového testování a selekce.

Z předchozího výkladu je zřejmé, že existuje potřeba způsobu jak zlepšit charakteristiky kvality masa identifikací a selekcí zvířat se zlepšenými charakteristikami masa.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí genetického markéru, založeného na MC4R genu nebo nacházejícího se uvnitř tohoto genu, který ukazuje na výhodné charakteristiky masa, jako ty, které jsou představované hodnotami pH, mramorováním, barvou a ztrátou masné Šťávy samovolným odkapáním.

r Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí metody zjišťování přítomnosti tohoto genetického markéru.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí způsobu vyhodnocování zvířat, který zvyšuje citlivost selekce a šlechtění na požadované znaky.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu je využití amplifikačního testu PCR, což vede k velkému urychlení při určování přítomnosti markéru.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí kitu pro vyhodnocení vzorku živočišné DNA pro identifikaci genetického markéru.

Tyto a další předměty, provedení a výhody vynálezu budou zřejmé po uvedení následujícího popisu a patentových nároků tohoto vynálezu, které následují.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká objevení polymorfismu v rámci genu pro receptor melanokortinu-4 (MC4R), který je spojen se znaky kvality masa zvířat. Tento gen je mezi druhy vysoce konzervován a očekává se, že zde popsané odlišné alely budou rovněž korelovat s variabilitou tohoto genu u jiných zvířat, produkujících maso, jako je hovězí dobytek, ovce, kuřata atd.. Toto polymorfní místo bylo již popsáno v dřívější patentové přihlášce PCT/US99/16982, publikační číslo WO 00/06777, jejíž obsah je zde začleněn citací. V této dřívější přihlášce bylo zjištěno, že toto místo významně koreluje s přírůstkem hmotnosti a příjmem potravy, jinými slovy se znaky, které zahrnují rychlost růstu prasat. Je překvapivé, že přes to, že rychlost růstu je obecně považována za negativně korelovanou s kvalitou masa, tento markér koreloval s výhodnými znaky kvality masa, jako jsou hladina pH, mramorování, barva a samovolná ztráta masné šťávy odkapáním. Tyto multigenově založené charakteristiky bylo dříve obtížné spojovat s lokusy kvantitativních znaků a současná zdokonalování charakteristik masa se soustřeďovala na pochopení a kontrolu mnoha faktorů, tj. ns hospodářské provozy, dopravu a/nebo jateční zařízení, které ovlivňují kvalitu masa, včetně výskytu PSE (pále, soft, exudative - bledé, měkké, vodnaté), RSE (red, soft, exudative červené, měkké, vodnaté) a DFD (dark, firm, dry - tmavé, pevné, suché) masa. V souhlase s tímto vynálezem umožňuje spojení polymorfismu MC4R s těmito znaky, aby byly identifikovány genetické markéry pro specifická plemena nebo genetické linie, které označí zvířata s výhodnými charakteristikami masa již v raných fázích jejich života.

Genotyp markéru zahrnuje polymorfismus v rámci MC4R genu, jehož výsledkem je záměna guaninu za adenin a mutace s chybným smyslem kodonu (GAU) kyseliny asparagové (D) na kodon (AAU) asparaginu (N) v pozici, která odpovídá aminokyselinové poloze 298 v proteinu lidského MC4R, což má za výsledek Taql restrikční místo v jedné alele tohoto genu. V jednom uspořádání tohoto vynálezu je restrikční obrazec Taq\, který identifikuje tento polymorfismus, použit pro testování přítomnosti nebo nepřítomnosti markérů, spojených s požadovanými znaky masa. Tento vynález obsahuje testy pro detekci markéru nebo vázaných markérů, stejně jako sekvence v MC4R genu, které mohou být použity k sestrojení amplifikačních primerů pro takovýto test (SEQ ID NO: 1). Vynález kromě toho obsahuje způsob použití tohoto testu ve šlechtitelských programech pro selekci zvířat a kit pro provedení tohoto testu.

Bylo zjištěno, že receptor pro melanokortin-4 (MC4R) je důležitým mediátorem dlouhodobé hmotnostní homeostase. Antagonisté MC4R mohou při soustavném podávání zvyšovat příjem potravy a tělesnou hmotnost. Skuladottir, G.V., et al., „Long term orexigenic effect of a novel melanocortin 4 receptor selective antagonist“, British J, of Pharm.. 126(1(:2734(1999).

Lu et al., Nátuře (Oct 27, 1994), 371 (6500):799-802 navrhl na základě studia antagonismu vůči syndromu obezity aguti, že receptory melanokortinu se účastní při kontrole příjmu potravy a energetické rovnováze. Huszar et al.. Cell (Jan. 10, 1997)88(1):131-41 zjistil, že inaktivace genu receptoru melanokortinu-4 (MC4R) měla za výsledek syndrom obezity v dospělosti u myší, a prokázal významnou roli MC4R proteinu v regulaci energetické rovnováhy ve vztahu k syndromu obezity aguti. MC4R protein kromě toho zprostředkovává účinek leptinu, jedné z významných signálních molekul v energetické homeostasi (Seeley et al., 1997).

V souhlase s tímto vynálezem byla lokalizována varianta či polymorfismus v genu MC4R a tato genetická variabilita je spojena s fenotypovými rozdíly ve znacích kvality vepřového masa, projevujících se jako pH, mramotrování, barva a ztráta odkapáním.

V jednom provedení vynálezu je poskytnut test pro detekci přítomností požadovaného genotypu u zvířat. Tento test zahrnuje analysu genomové DNA, isolované z krve, tkáně, spermií nebo jiných vhodných zdrojů genetického materiálu použitím příměrů a standardních způsobů, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR), poté digesci DNA restrikčními enzymy (například Taq I nebo jiným enzymem, který štěpí ve stejném G <->A místě), čímž vzniknou fragmenty genu o proměnlivé délce, a separaci alespoň několika fragmentů od ostatních (například použitím elektroforesy).

Tyto fragmenty lze rovněž detekovat hybridizací s nukleotidovou sondou (například radioisotopem značené sondy cDNA), která obsahuje celou nebo alespoň část cDNA sekvence genu MC4R k separovaným fragmentům a srovnáním výsledků této hybridizace s výsledky testu s genovou sekvencí, o níž je známo, že tento markér obsahuje, nebo se sekvenci, o níž je známo, že tento markér neobsahuje. Selekce a použití sond pro detekci MC4R sekvencí, založené na známých a uveřejněných sekvencích MC4R, je odborníkům obecně známo. Touto sondou může být libovolná sekvence, která bude hybridizovat se separovanými produkty digesce a umožní detekci.

Jiné provedení vynálezu poskytuje sadu (kit) pro testování přítomnosti genových sekvencí MC4R genetického markéru, kde tento markér ukazuje na přítomnost dědičných znaků kvality masa. Tato sada ve výhodném provedení také obsahuje nové PCR primery obsahující 4 až 30 sousedících basí na obou stranách polymorfismu, aby byl získán amplifikační systém umožňující detekci polymorfismu náhrady A za G PCR digescí PCR produktů. Sekvence obklopující polymorfní místo je uvedena v SEQ ID NO: 1, obrázek 1.

Bylo popsáno také několik primerů, včetně SEQ ID NO: 5 a 6, SEQ ID NO: 9 a 10 a mapovací primery 7 a 8. Výhodné primery jsou SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 10.

Další provedení zahrnuje způsob šlechtění, při kterém je test shora uvedeného typu proveden na několika vzorcích DNA od různých zvířat nebo zvířecích embryí, které jsou selektovány a na základě těchto výsledků jsou určitá zvířata buď vybrána nebo jsou vyřazena z dalšího šlechtění.

Podle tohoto vynálezu je ve výhodném provedení popsán polymorfismus genu MC4R, identifikovatelný pomocí Taq I restrikčního obrazce. Jak je známo, restrikční obrazce nejsou přesným určením velikostí fragmentů ajsou pouze odhadem. Pokud jsou použity primery SEQ ID NO: 6 a 7, je možno polymorfismus určit pomocí třech elektroforetických zón v PCR produktu, který byl digerován Taq I, o 466, 225 a 76 párech basí pro homozygotní genotyp (alela 1); dvou zón o 542 a 225 párech basí pro další homozygotní genotyp (alela 2) a čtyř zón pro heterozygotní genotyp o 542, 466, 225 a 76 párech basí. Pokud jsou použity výhodné primery, SEQ ID NO: 10 a 11, obsahují po digescí taq zóny o 156 a 70 párech basí pro alelu 1 a jeden fragment o 226 párech basí pro alelu 2. Odborník snadno uzná, že použití jiných podmínek pro primery PCR a jiných restrikčních obrazců pro identifikaci alely 2, pomocí zde uvedených MC4R sekvenčních dat nebo jiných dat pro těsně vázané lokusy, nepředstavuje nic jiného než rutinní optimalizaci parametrů a je zahrnuto v rozsahu tohoto vynálezu. Markér pro zlepšené charakteristiky masa, jak je zřejmé ze všech čtyř zde sledovaných ukazatelů (alela 2). Genotyp s alelou 2 byl dříve spojován s větší rychlostí růstu. Toto je překvapivé, protože současný stav znalostí nám říká, že mezi rychlostí růstu a kvalitou masa je negativní korelace.

Polymorfismus spojený s obrazci fragmentů byl kromě toho identifikován i na úrovni nukleotidů. Polymorfismus místa Taq I byl sekvenován současně s obvyklou částí řetězce, obklopující místo. Viz SEQ ID NO:1. Sekvence sousedící s částmi řetězce, účastnících se polymorfismu, usnadnily vývoj PCR testu, ve kterém je primer, obsahující 4 až 30 sousedních basí, odebraný ze sekvence, která bezprostředně sousedí se sekvencemi, které se účastní polymorfismu, použit ve spojení s polymerasovou řetězovou reakcí, aby byla tato • · • i · · • · » »» · oblast silně zesílena před ošetřením Taq I restrikčním enzymem. Tyto primery nemusí být přesně komplementární; přijatelné jsou i v podstatě ekvivalentní sekvence.

Ze sekvenčních dat bylo zjištěno, že v alele 2 je v poloze 678 PCR produktu uvedeném na obrázku 1 guanin nahrazen adeninem, případně v aminokyselinové poloze 298 analogického lidského MC4R proteinu je v MC4R proteinu změněn kodon kyseliny asparagové (GAU) na kodon asparaginu (AAU). PCR test pro tento polymorfismus použil forward primeru 5'TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:5) a reversního primeru 5'-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3'(SEQ ID NO:6). Prasečí specifické primery použité pro fyzikální mapování byly forward primer 5'-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3' (SEQ ID NO:7) a reversní primer 5-CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3'(SEQ ID NO: 8). Výsledný zesílený produkt obsahující asi 750 párů basí poskytl po digesci s Taq I alelické fragmenty o 466, 225 a 76 párech basí (alela 1) nebo o 542 a 225 párech basí (alela 2). Nejvýhodnější primery, které po digesci s Taq I poskytly buď 2 nebo 1 fragment jsou SEQ ID NO: 10 a 11. Alela 1 vytváří fragmenty o 156 a 70 párech basí, zatímco alela 2 tvoří jediný fragment o 226 párech basí.

Markér může být identifikován libovolným způsobem, známým běžnému odborníkovi, jenž identifikuje přítomnost nebo nepřítomnost jednotlivé alely nebo markéru, včetně například analysy jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP), RFLP analysy, analysy heteroduplexů, gradientově gelové elektroforesy v denaturujících podmínkách, alelické PCR, elektroforesy v teplotním gradientu, ligasové řetězové reakci, přímého sekvenování, minisekvenování, hybridisace nukleových kyselin a detekce typů mikrouspořádání MC4R genu a vyšetření na existenci polymorfhího místa. Další způsoby zahrnují ještě Invader Assay, která zahrnuje isotermickou amplifikaci, spočívající na katalytickém uvolnění fluorescence. Viz Third Wawe Technology na www.twt.com, což vše se považuje za zahrnuté do rozsahu tohoto vynálezu.

Je možno použít jeden nebo více dalších restrikčních enzymů a/nebo sond a/nebo primerů. Další enzymy, sestrojené sondy a primery mohou být určeny rutinním experimentem běžnými odborníky a považují se za zahrnuté v rozsahu tohoto vynálezu.

Další možné způsoby obsahují jiné než gelové analysy, jako je TaqMan™ (Perkin Elmer). V tomto systému jsou označeny oligonukleotidové PCR primery, které hraničí s danou mutací a umožňují PCR zesílení této oblasti. Třetí oligonukleotidová sonda je pak určena pro hybridisaci s oblastí, která obsahuje base, které podléhají změnám u různých alel tohoto genu. Tato sonda je označena fluorescenčními barvivý jak na 5', tak i na 3' konci. Tato barviva jsou vybrána tak, že ve vzájemné blízkosti je jejich fluorescence navzájem zhášena a nemohou být detekovány. Prodloužení Taq DNA polymerasou od PCR primeru, umístěného na 5' konci templátu vzhledem k sondě vede k odštěpení barviva, připojeného k 5' konci napojené sondy pomoct 5' nukleasové aktivity polymerasy Taq DNA. Tím dojde k odstranění zhášecího účinku, čímž je umožněna detekce fluorescence barviva na 3' konci sondy. Rozlišení mezi různými DNA sekvencemi je důsledkem skutečnosti, že jestliže hybridisace sondy na templátovou molekulu není úplná, tj., existuje určitý nesouhlas mezi řetězci, nedojde k uvolnění barviva. Zhášení fluorescence bude odstraněno tedy pouze tehdy, bude-li nukleotidová sekvence sondy zcela komplementární s templátovou molekulou, ke které je vázána. Reakční směs může obsahovat sekvence dvou různých sond, z nichž každá je sestrojena proti jiné alele, která může být přítomna; je tedy možno detekovat obě alely v jedné reakci.

Přestože použití RFLP je jedním způsobem detekce polymorfismu, mohou být použity i jiné způsoby známé v oboru. Tyto způsoby zahrnují i ty, které analysují produkt polymorfního genu a detekují polymorfismus detekcí výsledných rozdílů v genovém produktu.

Přestože výhodnou metodou separace restrikčních fragmentů je gelová elektroforéza, je možno k separaci a určování velikosti restrikčních fragmentů používat i jiné alternativní metody, známé odborníkům.

Je možné provádět nepřímý výběr na základě polymorfismu s alternativními DNA markéry, přičemž tyto způsoby jsou rovněž v rozsahu tohoto vynálezu. Může být zjištěna vazba mezi specifickými alelami alternativních DNA markérů a alelami DNA markérů, o kterých je známo, že jsou spojeny s genem MC4R, o kterém bylo již dříve známo, že je spojen s určitým znakem. Příklady markérů v publikované chromosomové mapě PiGMaP, které jsou spojeny s genem MC4R, zahrnují S0331, BHT0433 a S0313. Toto platí rovněž také pro jiné druhy, například u člověka se MC4R gen nachází na chromosomu 18q21.3-q22.

Činidla vhodná pro použití předkládaného vynálezu mohou být obsažena ve vhodných křtech (soupravách). Křty poskytují nezbytný materiál, zabalený ve vhodných obalech. Kit obsahuje minimálně činidlo pro identifikaci polymorfismu v genu MC4R, který je spojen se znaky kvality masa. Je výhodné, když činidlo, které identifikuje polymorfismus, je PCR setem (sada primerů, DNA polymerasy a čtyř nukleosidtrifosfátů), který hybridisuje s MC4R genem nebo s jeho fragmentem. Je výhodné, když je obsažen PCR set a restrikční enzym, který štěpí sekvenci MC4R na nejméně jednom místě. Kit výhodně dále obsahuje doplňkové prostředky, jako jsou pufry nebo činidla pro detekci nebo měření detekovatelných částic nebo poskytnutí kontroly. Podle přání mohou být také obsažena i jiná činidla, použitá při hybridiaaci, prehybridisaci, extrakci DNA, vizualizaci a podobné účely.

·* Μ • · · · 1 »’· «· «·«·

Genetické markéry, způsoby a kity podle tohoto vynálezu jsou použitelné ve šlechtitelských programech pro identifikaci a/nebo výběr na charakteristiky masa v plemenech, liniích a nebo populacích zvířat. Kontinuální výběr a šlechtění zvířat, která jsou minimálně heterozygotní a výhodně homozygotní, na požadovaný polymorfismus, spojený s jednotlivými znaky, může vést k plemenům, liniím nebo populacím, které mají tyto požadované znaky. Tento markér je tedy selekčním nástrojem.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je sekvence uváděná pro MC4R u prasat (SEQ ID NO: 1). „X“ představuje polohu polymorfismu.

Obrázek 2 představuje srovnám sekvence DNA mezi lidským (SEQ ID NO:2) a MC4R genem u prasete (SEQ ID NO: 1).

Obrázek 3 představuje srovnání aminokyselinové sekvence u lidského (SEQ ID NO:2) a MC4R genu prasete (SEQ ID NO:4).

Obrázky 4a, 4b a 4c jsou vazebné údaje pro MC4R u CRI-MAP.

Obrázek 5 znázorňuje parciální nukleotidové a aminokyselinové sekvence MC4R genu u prasete. Translace aminokyselin ukazuje aminokyselinovou substituci v kodonu 298.

Obrázek 6 znázorňuje násobné porovnání domnělé sedmé transmembránové domény MC4R u prasete s jiný i MC4R a GPCR ”* představuje pozice MC4R u prasete v předpovězených sekvencích. Ostatní aminokyselinové sekvence byly získány z database GenBank (přístupové číslo P 32 245 (SEQ ID NO: 12), P 70 596 (SEQ ID NO: 13), P 41 983 (SEQ ID NO: 14), P 56 451 (SEQ ID NO:15), P 34 974 (SEQ ID NO:16), P 41 968 (SEQ ID NO:17), P 33 033 (SEQ ID NO:18), Q 01 718 (SEQ ID NO:19), Q 01 726 (SEQ ID NO:20), q 28 031 (SEQ ID NO:21), AF 011 466 (SEQ ID NO:22), P 21 554 (SEQ ID NO:23), P 18 089 (SEQ ID NO:24), P 30 680 (SEQ ID NO:25), P 47 211 (SEQ ID NO:26)). Chybná varianta MC4R u prasete má nahrazenou aminokyselinu N za D v pozici, která je označena šipkou. Zbytek Asp (D) je vysoce konservován mezi MC4R a zbytek Asn (N) je dobře konservován u většiny ostatních GPCR.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady jsou předvedeny pro ilustraci a nikoliv jako omezení vynálezu.

• · · · · ····

Příklad 1

PCR-RFLP test receptoru melanokortinu-4 - Taq I polymorfismus a genetické mapování vazby genu MC4R

Primery:

Primery byly sestrojeny pro homologní oblasti sekvencí MC4R u člověka a u myši (GenBank přístupová čísla s77 415, případně u67 863). Tyto primery byly použity pro zesílení sekvence o 750 párech basí MC4R genu u prasete.

MC4R1: 5' TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG 3' (SEQ ID NO:5)

MC4R2: 5' CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA 3' (SEQ ID NO:6)

Podmínky testu PCR:

10X Promega pufr	1,0 μΐ
25mMMgCl2	0,6 μΐ
dNTP směs (2,5 pmol každý)	0,5 μΐ
25 pmol/μΐ MC4R1	0,1 μΐ
25 pmol/μΐ MC4R4	0,1 μΐ
redest. sterilní voda	7,5 μΐ
genomová DNA (12,5 ng/μΐ)	1,0 μΐ

Ve zkumavce se smísí 10 μΐ směsi 1 a DNA a převrství se minerálním olejem. Poté proběhne následující program PCR: 94 °C po 2 minuty; 35 cyklů při 94 °C po 30 sekund; 58 °C po 1 minutu a 72 °C po 30 sekund. Konečné prodloužení při 72 °C po 15 minut.

μΐ produktu PCR bylo kontrolováno na standardním 1% agarosovém gelu, aby bylo potvrzeno úspěšné zesílení a odstraněna negativní kontrola.

Velikost produktu je 750 párů basí. Digesce byla provedena následujícím způsobem:

Taa I digesční reakční směs 10 ul reakce

PCR produkt 5,0 μΐ

10X 7α<//ΝΕ pufr 1,0 μΐ

BSA (10 mg/ml) 0,1 μΐ

7α^Ι enzym (20 u/μΐ) 0,5 μΐ • · · · · · · · ··· · · · · · · redest. sterilní voda 3,4 μΐ

Byla připravena směs pufru, enzymu, BSA a vody. Do každé zkumavky obsahující DNA bylo přidáno 5 μΐ. Tato byla poté inkubována při 65 °C nejméně 4 hodiny až přes noc. Reakční digesčni směs byla smísena s nanášecím barvivém a celkový objem byl nanesen na 3% agarosový gel. Hlavní zóny alely 1 byly 466, 225 a 76 párů basí. Genotyp s alelou 2 měl zóny 542 a 225 párů basí. Heterozygotní genotyp vykazoval zóny alely 1 i alely 2.

Výsledky:

Zesílený produkt PCR měl 750 párů basí. Sekvence PCR produktu potvrdily, že produkt PCR je genem MC4R s 97,6% a 92,2% identitou na úrovni aminokyselin, respektive DNA vůči odpovídajícím lidským sekvencím (viz obr. 2 a 3).

Taql digesce produktu PCR poskytla alelické fragmenty o 466, 225 a 76 párech basí (alela 1) nebo 742 a 225 párech basí (alela 2). Heterozygot měl oba typy alel. U tří-generaěních mezinárodních referenčních rodů, použitých pro mapování tohoto genu vazebnou analysou byla pozorována dědičnost mendelovského typu.

Polymorfismus mezi alelou 1 a alelou 2, který je výsledkem náhrady A za G v poloze 678 produktu PCR ukázal mutace s chybným smyslem kodonu kyseliny asparagové (GAU) na kodon asparaginu (AAU) v poloze 298. aminokyseliny proteinu MC4R (viz obrázek 1, SEQ IDNO:1).

Frekvence alel byly určeny na základě vzorků DNA z malého počtu zvířat různých plemen (tabulka 1). Alela 1 byla pozorována s frekvencí 1 u Meishan, ale nebyla pozorována vůbec nebo jenom s velmi malou frekvencí u Hampshire a Yorkshire. Frekvence alely 1 u Landrace, případně Chester White byly 0,5.

Obrázky 2 a 3 ukazují rozdíly mezi sekvencí DNA a sekvencí aminokyselin v genu MC4R u prasete a člověka (SEQ ID NO:2 až 4).

Tabulka 1

Frekvence alely 1 v různých plemenech prasat

Plemeno	Počet zvířat	Frekvence alely 1
Meishan	8	1
Large White	8	0,56
Yorkshire	6	0,08
Hampshire	5	0
Landrace	4	0,5
Chester White	4	0,5
Minzu	2	1
divoké prase	2	1

Vazebné analysy:

Dvoubodové a vícebodové vazebné analysy byly provedeny na genotypech z referenčních mezinárodních rodů. Viz obrázky 4a až 4c. Data byla analysována pomocí programu CRI-MAP. MC4R byl průkazně vázán na některé markéry chromosomu 1 prasete (SSC). Nejtěsněji vázané markéry v případě dvoubodové analysy (rekombinační frakce a LOD skoré je v závorkách) jsou SO 331 (0,02, 21,97), BHT 0 433 (0,02, 21,32) a SO 313 (0,00, 17,76). Vícebodová analysa poskytla nejlepší mapu pořadí markérů a MC4R (se vzdálenostmi vKosambi cM): KGF-5,8-CAPN3-2,5-MEF2A-6,l-MC4R-5,6-SO 313.

Pro přiřazení MC4R do cytogenetické oblasti byla použita sada somatických buněčných hybridů prasete a hlodavců. PCR produkty specifických primerů prasete byly zesíleny v klonech 7, 5, 16, 18 a 19. MC4R byl lokalizován na SSClq 22 až 27.

Příklad 2

Objevení chybné varianty genu (MC4R) receptoru melanokortinu-4 u prasete

Pro zjištění, jestli existuje spojení mezi polymorfismem genu MC4R a fenotypovou variabilitou, byly testovány mutace na velkém počtu individuálních zvířat několika různých linií prasete. Růstové analysy a záznamy z testů kvality ukázaly průkazná spojení mezi MC4R genotypy s hřbetním sádlem, rychlostí růstu a příjmem potravy v Četných liniích. Je pravděpodobné, že variantní aminokyselinový zbytek MC4R mutace způsobuje významnou změnu funkce MC4R. Tyto výsledky podpírají funkční signifikanci chybné mutace MC4R a naznačují, že srovnatelné genomy, založené na modelových druzích, mohou být stejně důležité pro použití u hospodářských zvířat, jako v humánní medicině.

Zjištění mutací u leptinu a receptoru leptinu poskytlo další informace o genetickém založení regulace energetické rovnováhy (Zhang et al. 1994; Tartaglia et al. 1995). Genetické studie, používající živočišné modely, usnadnily zjištění hlavních dědičných příčin obezity (Andersson 1996; Pomp 1997; Giridharan 1998). Dále byly zjištěny jiné geny, které jsou zahrnuty v metabolické dráze nervové signalizace energetické homeostase (Flier a Maratos-Flier 1998; Schwartz et al. 1999). Hlavní zájem mezi možnými signalizačními molekulami, zahrnutými v regulaci energetické homeostase je receptor melanokortinu-4 (MC4R). Reakce MC4R na signalizaci leptinu je vazbou mezi příjmem potravy a tělesnou hmotností (Seeley at al. 1997; Marsh et al. 1999). Neuropeptid Y (NPY) signalizující v centrálním nervovém systému je také zprostředkován proteinem MC4R (Kask et al. 1998). Některé mutace MC4R, včetně posunových a nesmyslných mutací, jsou spojeny s dominantně děděnou obezitou u lidí (Vaisse et al. 1998; Yeo et al. 1998). Byly také učeny některé další mutace měnící smysl u lidí (Gotoda et al. 1997; Hinney et al. 1999), ale dosud nebyla ještě charakterizována funkční průkaznost u těchto mutací.

Výběr založený na charakteristikách růstu má obrovský význam pro produkci vepřového masa, vzhledem k nákladům na krmivá a spotřebitelské preferenci libového masa. Účinné genetické zlepšení těchto kvantitativních znaků může být zvětšeno použitím výběru využívajícího markéry (MAS) při použití genetických map s velkou hustotou (Dekkers a van Arendonk 1998; Rothschild a Plastow 1999). Důležitým nástrojem přitom je srovnávací mapování, používající dobře propracované mapy genů člověka a myši, které pomáhají při zjišťování odpovídajících oblastí genomu nebo hlavních genů, kontrolujících růst a kvalitativní znaky u prasete. Biologické porozumění komplexním znakům u člověka a u modelových druhů otevírá alternativní přístup pro zjišťování genů, které odpovídají za ekonomicky významné znaky u hospodářských zvířat. Vazba některých lokusů kvantitativních znaků (quantitative trait loci (QTL)) byla úspěšně použita spolu s fenotypově divergentními plemeny a analysami kandidátských genů pro studium znaků tučnosti a růstových znaků (Yu et al.1995; Casas-Carillo et al. 1997; Knorr et al. 1997; Knott et al. 1998; Rohrer et al. 1998; Wang et al. 1998; Paszel et al. 1999), ale doposud nebyly zjištěny žádné individuální geny se zásadním účinkem na růst a kvalitativní znaky u komerčních populací. Úloha MC4R při příjmu potravy a obezity naznačuje, že by mohl být důležitým genetickým markérem pro znaky spojené s růstem u prasete.

Materiály a metody

Zvířata. Prasata byla chována za normálních produkčních podmínek za dohledu PIC zaměstnanců v plemenářských hospodářstvích ve Spojených státech i v Evropě.

PCR zesílení fragmentu prasečího genu MC4R. Primery byly sestrojeny z homologních oblastí sekvencí lidského a krysího MC4R (GenBank, přístupové č. s77415, resp. u67863). Primery byly: forward primer: 5 - TGG GGG TAG CCA AGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:5) a reverzní primer: 5-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3' (SEQ ID NO:6). PCR reakce byla provedena použitím 12,5 ng DNA genomu prasete, lx PCR pufr, 1,5 mM MgCh, 0,125 mM dNTP, 0,3 mM každého primeru a 0,35 U taq DNA polymerasy (Promega) v 10 μΐ konečného objemu. Podmínky pro PCR byly následující: 2 minuty při 94 °C; 35 cyklů po 30 sekundách při 94 °C, 1 minutu při 56 °C, 1 minutu a 30 sekund při 92 °C a koncové 15 minutové prodloužení v Robocycleru (Stratageb, La Jolla, CA).

Sekvenování a detekce mutací. Bylo provedeno sekvenování PCR produktů z několika jednotlivých prasat z různých plemen a sekvence byly porovnány, aby mohly být odkryty jakékoliv změny nukleotidů. Sekvenování bylo provedeno na ABI sekvenátoru 377 (Applied Biosystems). Sekvence MC4R prasete byla uložena do GenBank a má přístupové číslo AF 087937. Sekvenční analysa odkryla jednu substituci nukleotidu umístěnou ve štěpném místě pro Taql restrikční endonukleasu (Kim et al. 1999). Byla sestrojena sada příměrů, aby byl vytvořen malý fragment genu MC4R, který obsahoval pouze jedno informativní restrikční místo Taql pro specifikaci polymorfního místa a pro usnadnění PCR-RFLP testu. Tyto primery byly: forward 5'-TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG-3'(SEQ ID NO:9) a reverzní:

5-ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3' (SEQ ID NO: 10).

Výsledky

Identifikace mutací měnících smysl v genu MC4R prasete. Gen MC4Rje tvořen přibližně 1 kb kódující sekvencí, obsaženou v jediném exonu. Fragment MC4R genu prasete o 750 párech basí byl produkován PCR (Kim et al. 1999). Sekvence tohoto PCR produktu potvrdila, že PCR produkt je MC4R genem s 92,2%, resp. 97,6% identitou nukleotidů, resp. aminokyselin s lidskou sekvencí MC4R. Četná porovnání sekvencí z jednotlivých zvířat různých plemen ukázala jednoduchou nukleotidovou sekvenci (G za A; obrázek 5). Tento polymorfismus odhalil mutaci měnící smysl, která nahradila kyselinu asparagovou (GAU) asparaginem (AAU) v pozici, která je identická s pozicí aminokyseliny 298 u lidského proteinu MC4R. Pro potvrzení této záměny base jsme sestrojili primery specifické pro prase, lemující polymorfní místo, a analysovali jsme polymorfismus pomocí 7a^I PCR-RFLP gelu. Alela 1 produkovala PCR-RFLP fragmenty o 156 a 70 párech basí a alela 2 produkovala PCR-RFLP fragment o 226 párech basí. Heterozygoty měly fragmenty jak alely 1, tak i alely 2. Nad starty každé elektroforetické dráhy jsou vyznačeny markéry molekulové hmotnosti a genotypy MC4R.

Mutace MC4R měnící smysl ie vysoce konzervovánou oblastí v rámci receptorů melanokortinu (MCR). MCR je podskupinou receptorů spojených s G-proteiny (GPCR), které obsahují určité konzervované strukturní prvky, společné pro většinu ostatních GPCR, ale celková aminokyselinová identita mezi MCR a ostatními GPCR je obecně malá (Tatro 1996). Porovnání orientace předpověděných aminokyselinových sekvencí MC4R prasete s MC4R proteiny z jiných druhů, jinými MCR proteiny nebo s reprezentativními GPCR ukázalo, že kyselina asparagová, nacházející se v poloze 298 v sedmé transmembránové doméně, je v MC4R proteinech vysoce konzervovaná (obrázek 6). Je však zajímavé poznamenat, že tato pozice je ve většině ostatních GPCR obsazena asparaginem. MCR proteiny vykazují 40 až 80% identitu aminokyselin mezi sebou navzájem (Tatro 1996), ale druhá intracytoplasmatická smyčka a sedmá transmembránová doména jsou v rámci MCR proteinů vysoce konzervovány (Gantz et al. 1993). Některé ze vztahů mezi MCR strukturou a funkcí byly objeveny studiemi přirozených a experimentálních mutací u člověka a myši (Robbins et al. 1993; Valverde et al. 1995; Frandberg et al. 1998). Tyto studie naznačují, že některé mutace ve vysoce konzervovaných oblastech způsobují strukturální změny a mění funkci receptoru. Substituční Asp298Asn mutace může mít vliv na funkci receptoru. Toto však bude vyžadovat další testování, i když je známo, že změna homologního zbytku v MC4R (Asp298Asn) je spojena s pěknou pletí a zrzavými vlasy u člověka (Valverde et al. 1995).

Příklad 3

Kvantita i kvalita jsou popisné termíny, velmi důležité v masném průmyslu. Jakmile je zvíře přeměněno na maso a maso se pohybuje po distribuční síti, od jatek a zpracovatelů k maloprodejcům a konečně ke spotřebitelům, stává se faktor kvality stále důležitějším. Je zřejmé, že kvantitu i kvalitu ovlivňují ekonomické úvahy.

Stav bledého, měkkého a vodnatého (PSE) vepřového a všeobecně velmi vysoká variabilita kvality vepřového byla uznána a popsána do roku 1960 a oba „defekty“ kvality byly označeny jako mající nižší hodnotu pro další zpracování a horší pro spotřebitele. I když tomuto tématu bylo v průběhu poloviny století věnováno enormní množství výzkumu, dohled nad kvalitou ukázal, že v roce 1963 bylo 18 % a v roce 1992 16 % vepřového masa v USA podřadné kvality (PSE). V důsledku toho existence genetických markérů, spojených jak se schopností změnit úroveň znaků (tj., barvy masa, schopnosti vázat vodu, křehkosti nebo mramorování), rovněž jako schopností snížit variabilitu u znaků kvality masa, poskytuje výbornou možnost pro dramatické zlepšení kvality masa. Za prvé, genetické markéry umožňují, aby byly učiněny významné kroky v požadovaném směru znaků kvality (například zlepšování technologického výtěžku zpracovávané kýty a snížení ztrát vlhkosti u čerstvých kýt a kotlet, výběrem proti genu RN u prasete). Za druhé, genetické markéry pomohou snížit rozdíly v kvalitě masa, protože můžeme relevantní geny ve šlechtitelské populaci zafixovat.

Kvalita masa je standardně měřena na jatkách podle ukazatelů jako pH masa, barva (použitím různých přístrojů a způsobů, např., Minolta (Min)), mramorování a ztráta odkapáním.

Průmyslem jsou například obecně přijímány následující popisy požadovaných znaků kvality masa na základě jejich ekonomické hodnoty v různých článcích řetězce dodávky vepřového:

Loin Minolta Lightness (L*) (barva kotlety): Rozsah 43 až 47 jednotek (od tmavší do světlejší barvy) je přijatelný, ale L* 43 je lepší; tj., má v tomto rozsahu obecně vyšší ekonomickou hodnotu**

Loin Japanese Color Score (JCS)(barva kotlety): Rozsah od 2,5 do 5,0 jednotek (od světlejší k tmavější) je přijatelný, ale JCS 3 až 4 je lepší.

Loin Marbling (hladina vnitrosvalového tuku v kotletě): Vyšší obsah vnitrosvalového tuku je obecně lepší, protože je spojen se zlepšenými kulinářskými znaky kvality masa.

Loin pHu (pH24 kotlety): (základní kyselost masa, měřená 24 hodin po porážce; tento znak je jednoduchým nejdůležitějším znakem kvality vepřového); —Rozsah 5,50 až 5,80 je požadovaný, ale 5,80 je lepší, protože pozitivně ovlivňuje barvu a (nízkou) ztrátu vlhkosti masa.

Ham Minolta Lightness (L*) (barva kýty): Rozsah 43 až 52 jednotek je přijatelný, ale nižší (43) je lepší.

Ham pHu (pH24 kýty): vyšší, tj., 5,80 je lepší

Ztráta masné šťávy samovolným odkapáním, neboli ztráta vlhkosti: rozsah od 1 % až 3 % je přijatelný, ale nižší jsou lepší.

* * to může být závislé na trhu, například v Japonsku je tmavé vepřové preferováno. Sosnicki, A.A., E.R. Wilson, E.B.Sheiss, A. de Vnes, 1998 „Is there a cost effective way to produce high quality pork ?“ Reciprocal Meat Conference Proceedines. Vol. 51.

Výsledky

Tabulka 1

Postup pomocí nejmenších čtverců pro různé genotypové třídy MC4R, založený na vzorku 1146 zvířat ze šesti genetických linií (preferované třídy jsou vytištěny tučně)

Znak	Genotyp
	11	12	22	P hodnota
pHu kotleta	5,70	5,70	5,73	<0,01
pHukýta	5,69	5,69	5,72	<0,07
Kýta barva (Minolta)	48,44	48,39	47,38	<0,03
Ztráta odkapáním	2,29	2,43	2,10	<0,07
Vnitrosvalový tuk kotleta	2,17	2,18	2,25	<0,42
Dny do 110 kg*	169,2	168,5	166,4	<0,0001
* Velikost vzorků byla pro tento znak by	a 2366

Průkazný vliv genotypového markéru byl zjištěn pro konečnou hodnotu pH (PH24), barvu (Min) a ztrátu odkapáním a žádoucí trend byl pozorován pro mramorování.

I když velikosti těchto účinků na jednotlivé genotypy se příliš nelišily, jsou komerčně významné z hlediska rozdílů v kvalitě masa. Z výsledků v tabulce 1 můžeme vidět, že alela 2 je výhodnou alelou pro všechny čtyři znaky kvality masa v tomto souboru. Zajímavé je, že tato alela je výhodnou alelou pro růst, jak popisuje WO 00/06 777. Toto je velmi důležité zjištění, přestože je poněkud neočekávané. Obecně existuje negativní korelace mezi rychlostí růstu a kvalitou masa. Všeobecně se vskutku přijímá, že kvalita masa se snížila v souvislosti se šlechtitelským výběrem na zvýšenou rychlost růstu.

V některých situacích můžeme předpokládat, že spojení mezi genotypovým markérem a znakem se může lišit ve směru. To bude případ, kdy zde použitý markér je vázán na • · · ·· · · · «·· · · ···· polymorfismus nebo na gen, který způsobuje tento účinek. V této situaci bude MC4R markér stále mít použití, pokud bude toto spojení prokázáno experimentálně.

Zde sledované znaky jsou pouze některé ze znaků, které lze použít pro sledování kvality masa. Mohou být použity i mnohé jiné, které jsou s těmito znaky v korelaci. Můžeme tedy očekávat, že podobné vlivy by bylo možno pozorovat i na takových ekonomicky důležitých znacích, jako schopnost držet vodu a vazebná kapacita, dietní kvalita a ztráta při tepelné úpravě, a že tyto znaky lze také rozšířit na příbuzné znaky kulinářské kvality, jako je křehkost, šťavnatost, vůně a chuť. Viz Sosnicki, shora.

Předkládaný vynález se týká identifikace průkazných vztahů mezi genotypovými markéry MC4R a kvalitou masa. Odborníci mohou získat i markéry pro jiné geny v této oblasti genomu prasete (chromosom 1 prasete), které budou rovněž vhodné pro šlechtitelský výběr na tyto znaky, pomocí markérů (MAS).

Příklad 4

Celkem 257 kusů prasat linie, odvozené od Pietran, bylo poraženo a byly určeny charakteristiky kvality masa v době porážky a v průběhu pojatečního zpracování a odležení. MC4R genotypy byly určeny zde popsaným způsobem. Byly vypočteny vztahy mezi genotypovými markéry a znaky kvality masa. Tyto výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Byly získány průkazné vztahy pro konečnou hodnotu pH (pHu) a barvu (Minolta L) u kýty. Kýty ze zvířat s genotypem 2,2 byly výhodné v obchodě, který dává přednost těmto charakteristikám.

Tyto vztahy lze také použít pro výběr rodičů jatečních prasat nebo pro zlepšení výchozích šlechtitelských materiálů při liniovém šlechtění. Naproti tomu, zpracovatelé kýt si mohou zvolit nákup prasat s výhodným genotypem, aby zlepšili celkovou kvalitu produktu (poražené kusy s 2,2 budou mít lepší barvu a lze u nich očekávat lepší výtěžnost masa než u zvířat 1,1 nebo 1,2). Kromě toho dojde výběrem jednotlivých genotypů ke snížení rozdílů v kvalitě v důsledku rozdílných MC4R genotypů.

Tabulka 2

MC4R genotypy a pH₂4 kýty a barvy kýty (Min L) linií založených na Pietran, které byly vybrány na nepřítomnost Halothan genu (halothanový test)

Genotyp	n	pHu	MinL
11	119	5,72	49,70
12	101	5,73	50,03
22	37	5,80	47,83
P		<0,04	<0,09

Předkládaný vynález se týká vztahu mezi MC4R genotypem a charakteristikami kvality masa, jako jsou pH, barva a mramorování u prasete. Tyto znaky jsou pak spojeny s vizuálním vzezřením, zpracovatelností a znaky kulinářské kvality masa, jako je lahodnost.

Tyto znaky popisují také kvalitu masa u jiných druhů, jako u hovězího a ovčího. Protože existuje poměrně těsná vývojová vazba mezi prasetem a jinými masnými druhy, může být předpověděno, že variabilita těchto genů je podobně spojena s kvalitou masa i u těchto jiných druhů. Polymorfismus genu MC4R může být u těchto jiných druhů identifikován použitím stejného způsobu a výsledky použity pro asociační analysu.

Přestože je tento vynález popsán s ohledem na konkrétní složení, teorie efektivity apod., bude odborníkům v této oblasti zřejmé, že není úmyslem jej omezit na uváděná ilustrační provedení, a že mohou být provedeny modifikace, aniž by došlo k odklonu od záměru nebo od ducha tohoto vynálezu, tak jak je uveden v připojených patentových nárocích. V záměru vynálezu je, že všechny tyto zřejmé modifikace a variace jsou obsaženy v rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích. Patentové nároky jsou zamýšleny tak, aby pokryly patentované komponenty a kroky v libovolném pořadí, jaké je účinné pro dosažení zde zamýšlených cílů, pokud by souvislost výslovně nesvědčila o opaku.

Následující citace jsou zde formou odkazu zahrnuty ve své celistvosti:

Andersson LB (1996), Ann Med.. 28:5-7

ArdenKC (1990), Cvtogenet. Cell Genet. 53:161-165

Barinaga M (1996), Science 271:913

Bray GA (1978), Physiol Rev, 59:719-809

Casas-Carillo E (1997), J Aním Sci 75:2047-2053

Chajlani V Biochem. Biophvs. Res. Commun. 195, 866-873

Chen H (1995), Cell 84, 491-495

Chua SC (1996), Science 271, 994-996

Chung WK (1996). Genome Res. 6, 431-438

Cioffi JA (1996). Nátuře Med. 2, 585-589

Cybulski MI (1991), Proč, Nati. Acad. Sci. 88:7859-7863

Dekkeres JCM (1998), Genet. Res. 71:257-275

Flier JS (1998), Cell 92:437-440

Frandberg P (1997). Biochem. Biophvs. Res. Commun, 263 :489-492

Frankel WN (1996) Nat Genet 14:371-373

Gantz (1993), J, Biol. Chem, 268. 15174-15179

Gantz (1994), Biochem, Biophys. Res. Commun.. 200, 1214-1220

Gantz I (1993a), J. Biol. Chem. 268, 8246-8250

GiridharanNV (1998), Indián J Med Res 108:225-242

Gotoda T (1997), Diabetoloeia 40:976-979

Goureau A (1996). Genomics. 36:252-262

Griffon N (1994). Biochem. Biophvs. Res.Commun.. 200. 1007-1014

Helm J (1994). J. Anim.

Hinney J (1994), J Clin Endocrinol Metab 84:1438-1486 Huszar (1997), CeU 88:131-141

Kask A (1998), Biochem Biophvs Res Commun 248:245-249

Kim KS (2000), J Animal Sci 78:791-792

Knorr C (1997), Anim Genet 28:124-128

Knott SA (1998), Genetics 149:1069-1680

Labbe O (1994), Biochemistry, 33, 4543-4549

Lee GH (1996), Nátuře 379, 632-635

Lu Dongsi (1994), Nátuře 371:799-802

Marsh DJ (1999), Nat Genet 21:119-122

Meuwissen, T.H.E. a Goddard, M.E. (1996) „The use of Markér Haplotypes in Animal

Breeding Schemes“, Genet. Sel. Evol., 28:161-176

Montjoy KG (1992), Science 257, 1248-1251

Montjoy KG (1994), Mol. Endocrinol. 8, 1298-1308

Paszek A (1966), Proceed. Midwest. ASAS Meeting, s. 24

Paszek AA (1999), Mamm Genome 10:117-122

Phillips M (1996), Nátuře Genetics 13:18-19

Pomp D (1997), Behav Genet 27:285-306

Robbins LS (1993), Cell 72:827-834

Robic A (1996), Mamm. Genome 7, 438-445

Rohre GA (1998), J Anim Sci 76:2247-2245

Rothschild MF (1996), PNAS 93:201-205

Rothschild MF (1999), AgBiotechNet 1:1-8

Schwartz MW (1999), AmJClinNutr 69:584-96

Seeley RJ (1997), Nátuře 390:349

TartagliaLA (1995), Cell 83:1263-1271

Tatro JB (1996), Neuroimmunomodulation 3:259-284

Truett GE (1995), Mamm. Genome 6, 25-30 Vaisse C (1998), Nat Genet 20:113-114 Valverde P (1995), Nat Genet 11:328-330 Wang L (1998), J Anim Sci 76:2560-2567

Warner CM (1991), Tmmunogenetics of the MHC, VCH Publishers, NY, NY, str. 368-397

Winick JD (1996), Genomics 36, 221-222

Xy Y (1994), Biol. Reprod. 51:695-699

Yeo GS (1998), Nat Genet 20:111-112

Yerle M (1996), Cytogenet Cell Genet. 73, 194-202

Youngs CR (1993), J. Anim. Sci., 1561-1565

Yu TP /1995), J Anim Sci 73:1282-1288

Zhang Y (1994). Nátuře 372:425-432

Ziang ZH (1999), Mamm Genome 12:191-193.

♦· · · • · · · · ·

1/13

g	o	u	H	H	rf	H	0
rf	H	0	0	H	o	0	0
0	Ej	H	H	0	H	0	H
Ej	rf	H	0	rf	0		0
rf	Ej	g	0	0	rf	rf	rf
0	rf		Ej	Ej	H	0	0
H	rf	lá	rf	rf	H	0	rf
0	o	j3	H	0	Ej	rf	0
H	tj	Em	Η	Ej	d	0	0
H	0	b	H	rf	0	H	O
rf	rf	0	Em	0	Ej		0
0	y	o	0	tj	rf	0	Em
0		u	Ej	rf	0	H	rf
fí	u	H	rf	rf	H	Em	0
lá	Ε-»	o	H	0	H	0	H
|á	h	rf	0	• o	0	H	0
0	Ej	H	rf	h	H	0	0
rf	0	Ej	H	Em	H	0	H
0	<	b	H	0	Em	0	H
E-*	0	O	H	0	H	rf	0
O	rf	Ej	Ej	P	0	rf	H
u	Q:	*b	rf	O	Em ·	tj	rf
řp.		0	tj	0	0	rf	0
ř<	u	&	P	<s.	0	0	rf

Em §

o u

s §

i g

O

H

O

O g g λ ts g

« B

I o

i o

o s

s e

u

I

I

B i

Ě

O o

g o

u o

i o

o

B

H

H

in

0	Ej	H	Ej	0	P	P	0	rf	0
rf	rf	Em	rf	s	w	Ej	rf	0	0
rf	0	fcM	0	o	0	rf	O	Em	Em
rf		0	0	0	rf	0	rf	|ítí	Fj
H	0	0	rf	Em	0	Em	rf	0	0
Ej	tj	H	E+	0	0 ·	0	H	rtj	H
rf	rf	0	0	tj	rf	Em	Em	rf	0
É-*	rf	0	rf	rf	Ej	0	rf	0	E-t
0	Ej	0	0	Em	rf	0	0	0	0
0	rf	rf	0	0	0 ·	0	rf	.0	0
«—f	rM	rM	r-i	•M	r—1	rM	rM	H	rM
o	in	O	in	o	in	O	in	O	LTI
tM	«—(	OJ	OJ	m	m			in	in

2/13

O u g š e I ά o

g

Η Η s g §

u u

B u

s

T\J QCFDZ-- Ί1Λ1

«·:

T—1 o

V£>

in u>

o r

Tu 'Tool-YUd j

3/13

o	p—p	O	H
tn	Η — H	r-1
r-i	H — E->	M	jL|
	*< — < .
			o

š e=e

o	5-řť o	d— O o
n	0 — 0 <h	H — H tn
co	H — H co	S — o r

S-3

o «-Ι co o

o ¢0 o

oc o

co f* o

r-

		-š		-Š
o		<D		4)		tu
m		01		(Q		©
fc		fc		fc		fc
<í<		Ί<		Μ»
ω	tn	O	tn	O	tn	o	in
e	H	E	rt	E	i-t	E	H
1		1	•Ί»	1		t
e	t^·	C		C	r-	tí	t*
o		O		. O	r-	O
o	m	0	co	υ	co	O	<n

o co r*

i • · · ·

4/13

220 230 240 250 260 270 ο — Ο *< —& a=š ο—α ο

Š-g

Η — Η §—I ο C5 σι (Η σι Ο

Ο

U

Ο

ο Η —Η	Ο	U—U	• Ο
σι υ — U	ιη	U Η	γΜ
σι Η—Η	Ί*	Η — Η	ιη
Η— Η		Ρ —Ρ

Ο §

Β

ο			ο		U—Ο	ο
Γ-		Ο · £	σι		Ο—ϋ	σι
00		ί1) — Γ0	σι		*5—£4	σι
	ο	1? ·”“ Ο		ο	3 υ		ο
	η	Ο — CJ		00	Η—Η		Μ*

ΙΊ σι

B-B

ο	[	4 Ο	ο
ιο	I	5—ρ	Μ
00	«	ί —rij	οι
•	ο ί	3—0
		3—Ο

—řC δ=ι σι ο

Γσι ο

ΙΟ η

a :Β :8 :Β

Β :§

Β :Β ο

ο ο

σ>

ο rσι

ο ο

ιη g:

Š^: £

g:

ο· ϋ· :g •υ :g •ο

Ο ο

β>

•cf

	*ť—*S	ιο		J —Ο ο
	0—3	σι	(	3-—© °
ο	ř$—*ζ	β	θ S	3 — ρ Η	ο
ιη	Ο —-ρ		Η I	á —ο	Γ-
σι	Η — Η		5f *	ί—ί<

Ο :8 υ

ο ο

σι ο

«Η

Ο βο ο

:=i ^rt

ο ν>

*4·

Ο ίο «Η

Ο

ΙΟ ο

Η

	• k		Μ		Μ		Μ
	Μ*		Μ»		*3<		Μ*
ιη	Ο	ιη	Ο	ιη	U	ιη	Ο	ιη
Μ	Ε	<Η	Ε	«-Ι	Ε	<—1	ε	ι-Ι
.	I	<«	I	Μ«	I	•φ	1	Ί*
Γ—	C	Γ—	β	Γ-	G	Γ-	β	Γ-
η-	Ο	I-	0	Γ-	Ο	ι-	0	Ι-
η	Ο	η	Ο	Ο)	υ	ο	υ	Ο)

5/13 o

Γιη o

co in u •o •u •p p :§ :8 p

o H n O· co H

H

P •B •H o t-« <n ř-t Φ H ei δ

H p

p ^:S

S^:

O	p— o	o	u	H o	O — P	o
ř-	O — P	tn	o	— P σι	P — P	in
d	Η— H	es	u	— P CS	H — A	m
d	o P—P	d	o A	— A d	o H—A	d

	t	-t —Ho	rf— <	o	A-R	o
*	Ϊ	5 —p ko	H — H	cs		a
	t	3 Ad	rt — rt	cs	U rt	<s
	O {	•C-H di	o O — P	d .	o P «—P	d

on •rt d

	P—p	r-	O — O ω
	A—S	es	P— P m
O	rt—rt	H	o rt-řť d
CO	P—P
«0	A— A		o* 2 — 2

:B8

	o		01		(0
	•		•		• «
	u				M
	rt·		rt1		rt·
U>	O	w '	U	tn	O	cn	m
d	E	d	E	d	e	d	«Ht
rt·.	1	rt<	1	rt·	1	rt*
r-	C	Γ-	R	Γ—	C	r-	r*
r·	0	t-	O	Γ-	O	r-	r>
<n	υ	o	υ	CQ	υ	to	co

6/13

Qa <u

Τ'

C/T ?5

Pa <tf «

kl

O

E

0) t“<

«Η <0 a

ka o>

o

E

Pa

a)

Pa

-4J <6

I kt

M*

O

E

Pa

0)

Pa rH

Φ rH rH (Q <u

1-1 r4 (0 a

k ·<*

O

E

7/13

Ο <Λ

Κ f

W ω

Ο

Í5 •«η >

ω η

ο

Η fe fe f* Η «4 > ^—— ο *3 Ι£> Ρ

O O Η IA

Ο ιη

t· °	O —- U o
O	to —W O
tl .	O W — H H	O
in	t* CO H	<o
ss	r4 »-l — M	ct
G	O — O
G	> — >

fe <1) fe rsj

0) rt

h υ

E fe

0) fe ·$ d

<u r-4 r-4 <0 •

M xř ϋ

E fe <u o<

Lp d

Φ r-4

M ·«# o

E fe

Φ fe r

d

0» h

sř o

E fe <D fe

X (tí

I

M

O

E

Sfc 'VůWín--' 'XLč']

8/13

S0082 MC4R riL frakce = i

CGA MC4R re«k- frakce =

S0020

S0079

S0155

S0122

S0313

S0312

S0311

S0416

MC4R r :|ek. frakce = MC4R ríek. frakce = MC4R r|efc. frakceI

I

MC4R rek. frakce - ( ·

MC4R jfek. frakce^ MC4R jpek· frakce =

MC4R tele. frakce« i

MC4H rek. frakce =

0.05, loď =

0.14, loď 0.18, loď =

0.12, loď =

0.14, loď; =

0.18, loď =

0.00, loď =

0.20, loď «

0.17, loď »

0.20, loď

14.74

6.88

5.32

10.35

7.68

5.17

17.76

5.60

7.18 = 3.21

S.0331	MC4R	jrek. frakce=	0.02,	loď «	21.91
80396	MC4R	1 rek. frakce=	0.16,	loď =	7.85
BHT0433	MC4R	(rek. frakce =	0.02,	loď =	21.32
S0536	MC4R	irek· frakce =	0.03,	loď =	15.61
CAPN3	MC4R	irek. frakce =	0.12,	loď =	6.65

·· · ·

9/13 i

j

	co CD • in rH	co N< • o	m co • co	CD Ν' « rd rd	co ch • Ch	o rd • r~	CO • r* rd	in n< •
CO	CO	1 1 ch
	co	i Ί	II	II	II	II	II	II	II	II
co	-ď	co			í.		-		<
	rd	i ΓΝ	*d	•b	•tí	•0	«6	«ϋ	•0	•d
			o	0	o	0	0	O	o	o
			rH	rd	«Η	rd	rd	rd	rd	i—(.
II	II	• 11			t
•0				*
•0	• »6	σ>	CN	m	ch	Ν'	r-	o	Ch
O	0	o	o	CN	CN	rd	CN	CN	o	CN
rd	rd	«—1	•	•	•	•	•	•	•	•
			o	o	o	o	o	o	o	o
<h	in	o	o	r*	o	o	o	o	o	N*
o	o	o	o	o	o	o	o	o	o	o
•	•	•	•	•	• .	•	•	«	• *	4
o	o	o	o	o	o	o	.o	o	o	O
II	N'	II	II	II	B	n	0	II	II	11
u ϋ	ú	i	i «ϋ	$ ií	<ύ -V «	u •š	-V (tí	JSf (0	a Í-5	P -ΣΖ <c
k	M	k	k	k	k	k	k	k	k	k
Ψ»	«Η	-««	•W	Ή	«Η	«Η	«W	IW	• «W	<k
	-5-f				-V	ΛΪ	-V		-íz	-xi
Φ	Φ	Φ	0)	0)	Φ	ω	0)	Φ	Φ	Φ
k		k	k	k	k	k	k	k	k	k
Pí	pg	pí	(4	Pí	Pí	Pí	Pí	Pí	Pí	Pí
	o		Ν'	•n<	<*	n«	N<	n« ·	Ν'	Ν'
u	u	O	u	O	α	O	o	Q	O
£	£	£	£	£	£	£	£	a	£	£
	3	oí	CN		o	σ>	in	CN	Γ0	CN
	9*	OP		CN	r-	m	CN	rd	r4
fa	fa	•Ν'	O	C	O	o	rd	r4	m	ro
o		U	O	O	O	o	o	O	o	O
		£	CO	o	CO	co	co	CO	co	CO

7\) Aool-~3'Ló?

• 9

10/13 i

l

cn	r~	i Ν’	ca	vo	CN	γ—	in	N<	CN	cn
o	tH	rH	ro	Ν’	CO	r-	ca	Γ	tn	τΗ
Ch	N*	CN	σ»	ca	r-i	tn		VO	Ν’	vo
		: cn			CN	<—(			r4	CN
II	11 i	II	II	II	II	II ’	ll	II	II	11
•6	•O ΐ	•0	•0	•0		*tí	•ú	»0	*Ú	*0
O	O ΐ	0	0	0	o	o	o	0	0	0
p4	K i	r4	i—l	•4	<4		rH	r4	«4	i4
Ctí	Ή i	o	N<	CO	O	tn	co		O	O
CN	CO ;	o	CN	ca	O	o	<4	»4	O	O
o	I o · t	o	O	o	O	o	O	O	O	O
o	Oj	tn	m	N«	in	o	O	O	O	O
o	OÍ	o	o	»4	o	o	o	O	rH	. O
•	« l	•	•	•	•	•	•	•	•	«
o	o i	o	o	o	o	o	o	o	o	o

0 3	li u -M <d		Jř <ď	4	& -M (tí	gJ -ií rt	V v -ií d	8 -s	4	í
k	H	k	k	k	k	k	k	k	k	k
<m	Ή ·	44	44	44	44	44	44	m	44	44
•	t -ií			.Λ1		-3	-á	-ií	-J	-ií
0)	φ	<U	<J>	fl)	Φ	a>	ω	a)	<D	Φ
k	k	k	k	k	k	k	k	k	k	k
&	É		OS	OS	OS	Pí	Pí	os	Pí	os
N*	ψ	Ν’	Ν’	N*	Ν’	N·	N<	N*	Ν’	Ν»
o	o	u	a	O	o	U	O	O	U	O
a		a	a	a	a	a	a	a	a	a
				tn	ca
				co	ca
r4	<O	»4	vo	ca	Ν’	vo	ca			Pí
t4	<4	cn	Ch	o	O	ca			CN
ca	f=#	cn	ca	Ε-»		m	to		ÍH	Ν»
o	o	o	o	W	«	o	<3	o	PQ	O
ca	P>	ca	ca	«	P5	ca	u	M	a	a

ν\_)Ίθν^·^Ι.2ΤΥ’ i

i

I

I

11/13 i

i i

i

0	E.ÍSR 1	0.18	18.4	0.0
1	sjoooe	-		18.4
	i	0.12	11.9
7	GGA I	0.03	2.8	30.3
3	$0312	0.05	4.9	33.1
4	$0122 |	0.09	9.4	38.1
8	1 kGF i	0.06	5.8	47.4
6	(CAPN3	0.02	2.5	53.2
9	IMEF2A j	0.06	6.1	55.7
5	|MC4R	0.06		61.8
	i ·	5.6	•
10	ÍS0313	0.00		67.4
		0.0
11	ÍS0082	0.03	3.4	67.4
12	jS0079 1	o; 03	2.5	70.8
14	l S0142	0.01	1.0	73.3
13	; S0020	0.04	4.3	74.4
15	i S0311	0.00	0.0	78.7
16	; S0155 i	0.12	12.2	78.7
17	S0113	0.20	21.0	90.9
18	Í S0302 i	0.22	23.4	111.9
19	í S0112			135.3

i

'n i

κ> 'τ&νί * * ·« ►» ·* ·· « ·« • · · · 9 * · * · « « * · · · Μ ··*· · * 9 »9 c · 4 ·

	, 13/13
I 1 pMC4R	V ......MSHFNLYL l L1MCNS1IDPLIYAL....	♦
hMC4R	......MSHFNLYL ILIMCNSI IDPLIYAL....	..304
rMC4R	......MSHFNLYLILIMCNAVIDPLIYAL....	..304
ovčí MC5R ,	......MSHFNMYLILIMCNSVIDPLIYA......	..286
hovězí MC5R:	......MSHFNMYLILIMCNSVIDPLIYA......	..286
hovězí MC2R ’	......MSLFQVNGVLIMCNAIIDPFIYAL....	..268
hMC3R	„„„„AHFNTYLVLIMCNSVIDPLIYA......	„327
mMC3R •	........AHFNTYLVLIMCNSVIDPLIYA......	„290
hMC2R	......MSHFNMYL1L1MCNSVMDPL1YA......	„268
hMCÍR	........SYFNLFLILIICNSVVDPLIYA......	„299
bEDG-2R :	......LAYEKFFLLLAEFNSAMNPIIYSYR..	„314
hEDG-4R ΐ	...................FLLLAEANSLVNAAVYSCR..	„298
lidský canncjb	.„„„.„.VFAFCSMLCLLNSTVNPLIYAL....	„399
hH2AB	.............FQFFFWIGYCNSSLNPVIYTI....	„290
rSSR2	.............FDFVVILTYANSCANPILYAFL..	„315
hGALI-R :	..........................LAYSNSSVNPIIYAFL..	..306

a · a „a ···· ' • *·· ·· ·· * ♦· ··· · · · * · ···· · ·«··· • · a · · ··· a· ··· ··· · ·· · · ····

	SEZNAM SEKVENCÍ
<110>	Iowa State University Research Foundation
<120>	Genetické markéry pro zlepšené vlastnosti zvířecího masa
<130>	ISURF 2697
<140>	09/538,165
<141>	2000-03-30
<160>	26
<170>	Patentová verze 3.0
<210>	1
<211>	746
<212>	DNA
<213>	Sus scrofa

<400> 1 acaagaatct gcattcaccc atgtactttt tcatctgtag cctggctgtg gctgatat gc 60 tggtgagcgt ttccaatggg tcagaaacca ttgtcatcac cctattaaac agcacgga ca 120 cggacgcaca gagtttcaca gtgaatattg ataatgtcat tgactcagtg atctgtag ct 180 ccttactcgc ctcaatttgc agcctgcttt cgattgcagt ggacaggtat tttactat ct 240

Strana 1 • · ·

tttatgctct ccagtaccat aacattatga cagttaagcg ggttggaatc atcatcag tt 300 gtatctgggc agtctgcacg gtgtcgggtg ttttgttcat catttactca gatagcag tg 360 ctgttattat ctgcctcata accgtgttct tcaccatgct ggctctcatg gcttctct ct 420 atgtccacat gttcctcatg gccagactcc acattaagag gatcgccgtc ctcccagg ca 480 ctggcaccat ccgccaaggt gccaacatga agggggcaat taccctgacc atcttgat tg 540 gggtctttgt ggtctgctgg gcccccttct tcctccactt aatattctat atctcctg cc 600 cccagaatcc atactgtgtg tgcttcatgt ctcactttaa tttgtatctc atcctgat ca 660 tgtgtaattc aa 720 catcatcrat cccctgattt atgcactccg gagccaagaa ctgaggaa ccttcaaaga

746 gatcatctgt tgctat

<210>	2
<211>	840
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

<400> 2 atatcttagt tt 60 tcatctgcag ca 120 ttatcatcac tg 180 ataatgtcat tt 240 caattgcagt gattgtggca atagccaaga acaagaatct gcattcaccc atgtactt cttggctgtg gctgatatgc tggtgagcgt ttcaaatgga tcagaaac cctattaaac agtacagata cggatgcaca gagtttcaca gtgaatat tgactcggtg atctgtagct ccttgcttgc atccatttgc agcctgct ggacaggtac tttactatct tctatgctct ccagtaccat aacattat

Strana 2

ga 300 cagttaagcg ggttgggatc agcataagtt gtatctgggc agcttgcacg gtttcagg ca 360 ttttgttcat catttactca gatagtagtg ctgtcatcat ctgcctcatc accatgtt ct 420 tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct atgtccacat gttcctgatg gccaggct tc 480 acattaagag gattgctgtc ctccccggca ctggtgccat ccgccaaggt gccaatat ga 540 agggagcgat taccttgacc atcctgattg gcgtctttgt tgtctgctgg gccccatt ct 600 tcctccactt aatattctac atctcttgtc ctcagaatcc atattgtgtg tgcttcat gt 660 ctcactttaa cttgtatctc atactgatca tgtgtaattc aatcatcgat cctctgat tt 720 atgcactccg gagtcaagaa ctgaggaaaa ccttcaaaga gatcatctgt tgctatcc cc 780 tgggaggcct ttgtgacttg tctagcagat attaaatggg gacagagcac gcaatata gg 840 <210> 3 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> různé provedení <222> ()..() <223> X může být libovolná aminokyselina

Strana 3 <400>

Gin Leu

Leu Leu

Leu His

Met Leu

Leu Asn

Asn Val

Ser Leu

Leu Gin

Ser Cys

130

Tyr Ser

145

Phe Val Ser Pro Glu Val Phe

Glu Asn Ile Leu Val Ile Val

25

Ser Pro Met Tyr Phe Phe Ile

40

Val Ser Val Ser Asn Gly Ser

Ser Thr Asp Thr Asp Ala Gin

Ile Asp Ser Val Ile Cys Ser

Leu Ser Ile Ala Val Asp Arg

100 105

Tyr His Asn Ile Met Thr Val

115 120

Ile Trp Ala Ala Cys Thr Val

135

Asp Ser Ser Ala Val Ile Ile

150 • · · · · · · · · ··· ·· ·· · ·· • · · · · · · • · · · ·*··· • · · · · · · ·· »·· ··· ··· · · ····

Val Thr Leu Gly Val Ile Ser

15

Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn

Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp

Glu Thr Ile Ile Ile Thr Leu

Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp

80

Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys

95

Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala

110

Lys Arg Val Gly Ile Ser Ile

125

Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile

140

Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe

155 160

Strana 4 • · · v · ·· · · • 9 · · ·· ·· · ··

Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met

165 170 175

Ala Arg Leu His Ile Lys Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala

180 185 190

Ile Arg Gin Gly Ala Asn Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu

195 200 205

Ile Gly Val Phe Val Val Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Ile

210 215 220

Phe Tyr Ile Ser Cys Pro Gin Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser

225 230 235 240

His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile Ile Asp

245 250 255

Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Arg Ser Gin Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys

260 265 270

Glu Ile Ile Cys Cys Tyr Pro Leu Gly Gly Leu Cys Asp Leu Ser Ser

275 280 285

Arg Tyr Ala Pro Pro Glu Asn Asp Ile Xaa Val Ile Cys Asn Phe Ile

290 295 300

Asp Glu Asn Thr Ile Ala Leu

305 310 <210> 4 <211> 248

Strana 5

	• • •	0 · • • • · ·	•	• · 0 « • 0 0 0 ·	• • 0	• · • 0 · 0 · 0 0	• • 0
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Lys Asn Leu His Ser Pro	Met Tyr Phe	Phe	Ile	Cys	Ser	Leu	Ala Val
1 5		10					15
Ala Asp Met Leu Val Ser	Val Ser Asn	Gly	Ser	Glu	Thr	Ile	Val Ile
20	25					30
Thr Leu Leu Asn Ser Thr	Asp Thr Asp	Ala	Gin	Ser	Phe	Thr	Val Asn
35	40				45
Ile Asp Asn Val Ile Asp	Ser Val Ile	Cys	Ser	Ser	Leu	Leu	Ala Ser
50	55			60
Ile Cys Ser Leu Leu Ser	Ile Ala Val	Asp	Arg	Tyr	Phe	Thr	Ile Phe
65 70			75				80
Tyr Ala Leu Gin Tyr His	Asn Ile Met	Thr	Val	Lys	Arg	Val	Gly Ile
85		90					95
Ile Ile Ser Cys Ile Trp	Ala Val Cys	Thr	Val	Ser	Gly	Val	Leu Phe
100	105					110
Ile Ile Tyr Ser Asp Ser	Ser Ala Val	Ile	Ile	Cys	Leu	Ile	Thr Val
115	120				125
Phe Phe Thr Met Leu Ala	Leu Met Ala	Ser	Leu	Tyr	Val	His	Met Phe

130 135 140

Strana 6

Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys

145 150

Gly Thr Ile Arg Gin Gly Ala Asn

165

Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val

180

Leu Ile Phe Tyr Ile Ser Cys Pro

195 200

Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu

210 215

Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu

225 230

Phe Lys Glu Ile Ile Cys Cys Tyr 245

Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr

155 160

Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr

170 175

Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His

185 190

Gin Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe

205

Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile

220

Arg Ser Gin Glu Leu Arg Lys Thr

235 240

<210>	5
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Sus	scrofa
<400> 5 tggcaatagc 20	caagaacaag
<210>	6
<211>	20

Strana 7 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 caggggatag caacagatga 20

<210>	7
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Sus scrofa

<400> 7 ttaagtggag gaagaagg 18

<210>	8
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Sus scrofa

<400> 8 cattatgaca gttaagcgg 19

<210>	9
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Sus scrofa

Strana 8 • · · · · ·· · · • ··· ·· ·· · « · ··· · · ·· · ·· ·· · ···· · ··· · · ··· ·· ··· ··· ··· · · ···· <400> 9 taccctgacc atcttgattg 20

<210>	10
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Sus scrofa

<400> 10 atagcaacag atgatctctt tg 22

<210>	11
<211>	24
<212>	PRT
<213>	Sus scrofa
<400>	11

Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile

10 15

Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 20

<210>	12
<211>	24
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	12

Strana 9

Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile

10 15

Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu

20
<210>	13
<211>	24
<212>	PRT
<213>	Rattus norvegicus
<400>	13

Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ala Val

10 15

Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val

10 15

Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala 20 <210> 15 <211> 23

Strana 10 • · · * · ·· ·♦ • ··· ·· ·· · ♦ « <212> PRT <213> Savčí druhy <400> 15

Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val

10 15

Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Met Ser Leu Phe Gin Val Asn Gly Val Leu Ile Met Cys Asn Ala Ile

10 15

Ile Asp Pro Phe Ile Tyr Ala Leu 20 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 17

Ala His Phe Asn Thr Tyr Leu Val Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile

10 15

Strana 11

Asp Pro Leu Ile Tyr Ala 20

<210>	18
<211>	22
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	18
Ala His	Phe	Asn Thr	Tyr	Leu	Val
1		5
Asp Pro	> Leu	Ile Tyr 20	Ala
<210>	19
<211>	23
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	19
Met Ser His	Phe Asn	Met	Tyr	Leu
1		5
Met Asp Pro	Leu Ile 20	Tyr	Ala
<210>	20
<211>	22
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens

Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile

15

Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val

15

Strana 12 • · « · · ·· · · • ··· · · · · · · ·

9 9 · · · · · ·· ··· ··· ··· 99 9999 <400> 20

Ser Tyr Phe Asn Leu Phe	Leu	Ile
1	5
Asp Pro	Leu	Ile 20	Tyr	Ala
<210>	21
<211>	25
<212>	PRT
<213>	Bos taurus
<400>	21
Leu Ala	Tyr	Glu	Lys	Phe	Phe	Leu
1			5
Met Asn	. Pro	Ile 20	Ile	Tyr	Ser	Tyr
<210>	22
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	22
Phe Leu	. Leu	Leu	Ala	Glu	Ala	Asn
1			5
Ser Cys	; Arg

Leu Ile Ile Cys Asn Ser Val Val

15

Leu Leu Ala Glu Phe Asn Ser Ala

15

Arg

Ser Leu Val Asn Ala Ala Val Tyr

15

Strana 13

<210>	23
<211>	22
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	23
Val Phe Ala	Phe Cys
1		5
Pro Leu Ile	Tyr Ala
		20
<210>	24
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	24

Phe Gin Phe Phe Phe Trp Ile Gly Tyr Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro

10 15

Val Ile Tyr Thr Ile 20 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25

Strana 14

	Λ	*	«
« ·	• «	V ·	• r	r «	•
« ·	•	•	*	« «	4
* ·	•		•	• ·	4
	4 · ·	« « *	» » ·	• 4	• 4 4 ·

Phe Asp Phe Val Val	Ile	Leu Thr
1	5
Ile Leu	Tyr Ala Phe	Leu
	20
<210>	26
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	26
Leu Ala	Tyr Ser Asn	Ser	Ser Val
1	5

Tyr Ala Asn Ser Cys Ala Asn Pro

15

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Leu

15

Strana 15 νφχ^'ίχ — TMJ

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob identifikace zvířete, které má genotyp ukazující na přítomnost výhodných znaků kvality masa, vyznačující se tím, že (a) se získají vzorky nukleové kyseliny z uvedeného zvířete a (b) testují se na přítomnost polymorfismu v rámci genu MC4R ve vzorku nebo polymorfismu k němu vázaného, přičemž tento polymorfismus je takový, který je spojen s výhodnými znaky kvality masa, jako jsou pH, mramorování, barva a ztráta okapáním.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus je charakterizován kodonem pro kyselinu asparagovou - GAU, který je změněn na kodon asparaginu - AAU na aminokyselinové pozici analogické aminokyselině 298 produktu lidského genu MC4R.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený kodon kyseliny asparagové na pozici 298 produktu genu MC4R je spojen s charakteristikami zlepšené kvality masa.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zvířetem je prase.
5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se polymorfismus identifikuje metodou s použitím oligonukleotidů, specifických pro alely.
6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se uvedený polymorfismus identifikuje pomocí PCR zesílení a restrikce.
7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že stupeň identifikace polymorfismu se vybere ze skupiny zahrnující analysu délkového polymorfismu restrikčních fragmentů - RFLP, heteroduplexní analysu, analysu konformačního polymorfismu jednoduchých řetězců - SSCP, elektroforesu na gradientových gelech v denaturujícím prostředí - DGGE, gelovou elektroforesu v gradientu teploty - TGGE a použití vázaných genetických markérů.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že stupeň identifikace polymorfismu zahrnuje analysu RFLP.
9. 9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že navíc zahrnuje krok zesílení sekvence genu MC4R.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že navíc obsahuje krok digesce zesílené oblasti restrikční endonukleasou Taq I.
11. 11. Zesílené sekvence genu podle nároku 10, kde primery, použité pro jejich zesílení, jsou vybrány ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 11.
12. 12. Jednoduché vlákno oligonukleotidového primeru použitelného pro detekci nukleotidu 678 z SEQ ID NO: 1, přičemž tento primer je tvořen nukleotidovou sekvencí, která má asi 4 až 30 sousedících basí ze SEQ ID NO: 1 a lemuje pozici 678.
13. 13. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ ID NO:6.
14. 14. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ ID NO:7.
15. 15. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ ID NO:8.
16. 16. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ DD NO:9.
17. 17. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ ID NO: 10.
18. 18. Oligonukleotid podle nároku 12, kde oligonukleotid má sekvenci nukleotidů představovanou SEQ ID NO: 11.
19. 19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený primer je SEQ ID NO: 6 a 7 a uvedený polymorfismus je v poloze 678 uvedené zesílené sekvence.
20. 20. Způsob identifikace zvířete, které má požadovaný genotyp ukazující na přítomnost výhodných charakteristik kvality masa, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) získání vzorku nukleové kyseliny, (b) digesci tohoto vzorku restrikčním enzymem, který rozpoznává stejné místo jako Taq I, k získání fragmentů, (c) rozdělení fragmentů získaných digesci a (d) identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti Taq I místa v kodonu pro polohu aminokyselinového kodonu v poloze 298 produktu genu MC4R.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje výběr zvířat s požadovaným genotypem pro šlechtění.
22. 22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedené místo je identifikovatelné podle fragmentů o 466,225 a 76 párech basí, když v basi 678 je přítomen guanin, a fragmentů o 542 a 225 párech basí, když je přítomen adenin, pokud je použit restrikční enzym, který štěpí na stejném rozpoznávacím místě jako Taq I.
23. 23. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedené místo je identifikovatelné podle fragmentů o 156 a 70 párech basí, pokud je přítomna alela 1, a podle fragmentu o 226 párech basí, pokud je přítomna alela 2, pokud je použit restrikční enzym, který štěpí na stejném rozpoznávacím místě jako Taq I.
24. 24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že stupeň identifikace zahrnuje detekování místa Taq I zesílením.
25. 25. Kit na vyhodnocování vzorků nukleové kyseliny zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje nádobu s činidlem, které určuje polymorfismus v genu MC4R.
26. 26. Kit podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedené činidlo je primer, který zesiluje gen MC4R nebo jeho fragment.
27. 27. Kit podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále zahrnuje DNA polymerasu, která štěpí MC4R gen, forward primer a reversní primer, přičemž tyto primery jsou schopny zesílení oblasti genu MC4R, která obsahuje polymorfní místo.
28. 28. Primer pro testování přítomnosti polymorfního Taq I místa v genu MC4R, kde primer zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ. ID NO:6, SEQ. ID NO:7, SEQ. Π) NO:8, SEQ. ID NO:9, SEQ. ID NO: 10 a SEQ. ID NO: 11.
29. 29. Způsob selekce zvířat podle požadovaných znaků zlepšené kvality masa, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    (a) získání vzorku nukleové kyseliny zvířete, (b) identifikace polymorfismu charakterizovaného polohou nukleotidu 678 sekvence SEQ ID NO: 1 genu MC4R a (c) výběru zvířat, která mají v poloze 678 nukleotid spojený s požadovanými znaky.
30. 30. Způsob nepřímé selekce na polymorfismus genu MC4R, vyznačující se tím, že se pro nepřímou selekci použijí určité alely alternativního DNA markéru, přičemž tímto alternativním DNA markérem je markér, který je vázán blízko genu MC4R.
31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že vázaný markér je vybrán ze skupiny, zahrnující S0331, BHT0433 a S0313.
32. 32. Způsob identifikace zvířat, která mají požadovaný genotyp ukazující na přítomnost výhodných znaků kvality masa, vyznačující se tím, že zahrnuje zjištění vztahu mezi genotypem MC4R a daným znakem tak, že se získá vzorek zvířat příslušné linie nebo plemene, připraví se vzorek nukleové kyseliny od každého zvířete ze vzorku zvířat, určí se genotyp genu MC4R a vypočte se vztah mezi MC4R genotypem a znakem.
33. 33. Způsob výběru zvířat, která mají požadovaný genotyp MC4R ukazující na výhodné znaky kvality masa, vyznačující se tím, že zahrnuje získání vzorku nukleové kyseliny od zvířete, identifikaci genotypu genu MC4R u zvířete a výběr těch zvířat, která mají genotyp spojený s požadovanými znaky.
34. 34. Způsob určení potenciální kvality masa zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje získání vzorku nukleové kyseliny uvedeného zvířete a testování přítomnosti polymorfismu genu MC4R v tomto vzorku nebo přítomnosti polymorfismu vázaného k tomuto genu, přičemž uvedený polymorfismus je takový, který je spojen s výhodnými charakteristikami kvality masa, jako jsou pH, mramorování, barva a ztráta masné tekutiny samovolným odkapáním.
35. 35. Způsob výběru zvířat pro šlechtění, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) získání vzorku nukleové kyseliny od uvedeného zvířete;

    (b) testování přítomnosti polymorfismu genu MC4R v tomto vzorku nebo přítomnosti polymorfismu vázaného k tomuto genu, přičemž uvedený polymorfismus je takový, který je spojen s výhodnými charakteristikami kvality masa, jako jsou pH, mramorování, barva a samovolná ztráta masné tekutiny odkapáním, a (c) použití MC4R genotypu jako části selekčního indexu založeného na zjištěné hodnotě účinku.
36. 36. Způsob segregace zvířat, aby byla zajištěna uniformita suroviny na jatkách, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) získání vzorku nukleové kyseliny od uvedeného zvířete a (b) testování přítomnosti polymorfismu genu MC4R v tomto vzorku nebo přítomnosti polymorfismu vázaného k tomuto genu, přičemž uvedený polymorfismus je takový, který je spojen s výhodnými charakteristikami kvality masa, jako jsou pH, mramorování, barva a samovolná ztráta masné tekutiny odkapáním.
37. 37. Způsob výběru zvířat pro šlechtění, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) získání vzorku nukleové kyseliny od uvedeného zvířete;

    (b) testování přítomnosti polymorfismu genu MC4R v tomto vzorku nebo přítomnosti polymorfismu vázaného k tomuto genu, přičemž uvedený polymorfismus je takový, který je spojen s výhodnými charakteristikami kvality masa, jako jsou pH, mramorování, barva a samovolná ztráta masné tekutiny odkapáním, a (c) výběr zvířat s výhodnou alelou pro začlenění do chovného stáda.
38. 3 8. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus je polymorfismem v jediném nukleotidu v rámci genu MC4R nebo polymorfismem vázaným k tomuto genu, tak, že je spojen s variabilitou kvality masa.
39. 39. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus je komplexním polymorfismem obsahujícím opakovanou vazebnou varianci, například mikro satelity, inserce nebo delece.