CZ2000490A3 - Interleukin-18-vazebné proteiny, příprava a použití - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká proteinu vázajícího interleukin-18 (IL-18), dále zde označovaného IL-18BP, který je schopen vázat

IL-18. Tento vynález se zejména týká solubilního IL-18BP, který lze získat z tělesných tekutin, solubilních IL-18BP, které lze získat expresí vhodných DNA vektorů v hostitelských buňkách, virem kódovaných homologů IL-18BP, které lze získat expresí vhodných DNA vektorů v hostitelských buňkách, vektorů exprimujícich různé IL-18BP, vektorů využitelných k expresi IL-18BP u lidí a jiných savců, protilátek proti proteinům IL-18BP, terapeutického použití řečených IL-18BP spočívajícího v modulaci a/nebo blokování aktivity IL-18, terapeutického použití řečených expresních vektorů při modulaci a/nebo blokování aktivity IL-18 a použití protilátek.

Dosavadní stav techniky

V r. 1989 byla v séru myší popsána aktivita, indukovaná endotoxinem, která byla schopná indukovat interferon-γ (IFN-γ) v kulturách myších slezinných buněk (Nakamura et al., 1989, InfectImmun. 57:590-595). Tato sérová aktivita působila nikoli jako přímý induktor interferonu IFN-γ, ale spíše jako kostimulátor, společně s IL-2 nebo s mitogeny. Purifikací aktivity ze séra myši vystavené šoku endotoxinem byl nalezen zdánlivě homogenní protein o velikosti 50-55 kDa (Nakamura et al., 1993, Infect-lmmun. 61:64-70). Jako kostimulátory tvorby IFN-γ mohou působit i jiné cytokiny, avšak skutečnost, že působením neutralizujících protilátek proti IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 nebo TNF nedošlo k neutralizaci této sérové aktivity naznačuje, že se jedná o odlišný faktor. V r. 1995 prokázali stejní badatelé, že endotoxinem indukovaný kostimulátor tvorby IFN-γ je • · ··

-2«

přítomen v extraktech jater myší, které byly předtím inokulovány bakterií P. acnes (31). V tomto modelu dochází k expanzi populace jaterních makrofágů (Kupfferových buněk) a malá dávka bakteriálního lipopolysacharidu (LPS), jež u myší, které neobdrželi injekci P. acnes není letální, se u těchto myší stává letální. Faktor, nazvaný IFN-y-indukující faktor (IGIF) a později označený jako interíeukin-18 (IL-18), byl vyčištěn do homogenity z 1200 g jater myší inokulovaných P. acnes. Z částečných aminokyselinových sekvencí purifikovaného IL-18 byly odvozeny degenerované oligonukleotidy a ty byly použity ke w klonování myší IL-18 cDNA (Okamura et al., 1995, Nátuře 378:88-91). IL-18 je 18-19 kDa protein obsahující 157 aminokyselin, který nevykazuje žádnou zjevnou podobnost s žádným proteinem v databázích. Molekuly mRNA kódující IL-18 a interleukin-12 (IL-12) jsou snadno detegovatelné v Kupfferových buňkách a aktivovaných makrofágách. Rekombinantní IL-18 indukuje IFN-γ účinněji než IL-12, zřejmě prostřednictvím samostatné dráhy (Okamura et al., 1995, Nátuře 378:88-91). IL-18, podobně jako aktivita indukovaná v séru endotoxinem, sám o sobě neindukuje IFN-γ, nýbrž působí primárně jako kostimulátor společně s mitogeny nebo IL-2. IL-18 zvyšuje proliferaci buněk T, zřejmě prostřednictvím signalizační dráhy závislé na IL-2, zvyšuje in vitro tvorbu Th1 cytokinů a vykazuje synergismus v kombinaci s IL-12 při stimulaci tvorby IFN-γ (Micallef et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26:1647-1651).

Neutralizující protilátky proti myšímu IL-18 byly schopné zabránit letálnímu účinku nízkých dávek LPS u myší, jež byly předtím inokulovány P.acnes. Jiní autoři popsali významnou roli IFN-γ ve zprostředkování letálního účinku LPS u takto inokulovaných myší. Například neutralizující anti-IFN-γ protilátky chránily myši proti šoku podobnému Shwatzmanovu šoku (Heremans et al., 1990, J. Exp. Med.

171:1853-1869) a myši postrádající IFN-γ receptor, na které bylo • · · · působeno galaktosaminem, byly resistentní vůči smrti indukované účinkem LPS (Car et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1437-1444). Nebylo tudíž neočekávané, že neutralizující protilátky proti myšímu IL-18 chránily myši naočkované P.acnes před letálním účinkem LPS (Okamura et al., 1995, Nátuře 378:88-91). Zásah proti myšímu IL-18 též chránil přežívající myši před těžkou jaterní cytotoxicitou.

Poté, co byla nakloňována myší forma, byla popsána v r. 1996 lidská cDNA sekvence pro IL-18 (Ushio et al., 1996, J. Immunol. 156:4274-4279). Rekombinantní lidský IL-18 vykazuje stejnou aktivitu jako přirozený IL-18 (Ushio et al., 1996, J. Immunol. 156:4274-4279). Lidský rekombinantní IL-18 nemá přímý IFN-y-indukující účinek na lidské buňky T, působí ale jako kostimulátor tvorby IFN-γ a dalších cytokínú charakteristických pro Th1 subpopulaci buněk T (Ushio et al., 1996, J. Immunol. 156:4274-4279). Dosud se má zato, že IL-18 primárně působí jako kostimulátor tvorby Th1 cytokinů (IFN-γ, IL-2 a faktoru stimulujícího tvorbu kolonií granulocytů a makrofágů) (Kohno et al., 1997, J. Immunol. 158:1541-1550) a rovněž jako kostimulátor cytotoxicity klonů myších NK buněk (přirozených zabíječů) zprostředkované FAS ligandem.

Nakloňováním IL-18 z postižených tkání a sledováním genové exprese IL-18 byla zjištěna úzká souvislost mezi tímto cytokinem a autoimunitními chorobami. U neobézních diabetických (NOD) myší se spontánně vytváří autoimunitní insulitida a diabetes, které mohou být urychleny a synchronizovány jedinou injekcí cyklofosfamidu. V pankreatu NOD myši byla pomocí RT-PCR prokázána IL-18 mRNA v prvních fázích insulitidy. Hladiny IL-18 mRNA se působením cyklofosfamidu rychle zvyšovaly a předcházely vzestupu hladiny IFNγ mRNA a následnému diabetů. Je zajímavé, že tyto kinetiky sledují profil IL-12-p40 mRNA, takže dochází k těsné korelaci hladin jednotlivých mRNA. Nakloňování IL-18 cDNA z pankreatické RNA ··· · • · a následné určení sekvence ukázalo, že tato sekvence je identická s 1L-18 sekvencí nakloňovanou z Kupfferových buněk a z in vivo aktivovaných makrofágů. Dále, makrofágy NOD myši reagovaly na cyklofosfamid expresí IL-18, zatímco makrofágy Balb/c myší v paralelním pokuse nikoli. Exprese IL-18 je tedy u autoimunních NOD myší regulována abnormálně a úzce souvisí s rozvojem diabetů (Rothe et al., 1997, J. din. Invest. 99:469-474).

IL-18 může hrát roli v imunoregulaci nebo v procesu zánětu tím, že zesiluje funkční aktivitu Fas ligandu na Th1 buňkách (Dao et al., 1996, Cell-lmmunol. 173:230-235). IL-18 je rovněž exprimován v kůře nadledvin a mohl by proto být secernovaným neuroimunomodulátorem s důležitou funkcí v koordinaci imunitního systému následně po vystavení účinkům stresu (Conti et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:2035-2037).

In vivo je IL-18 produkován štěpením prekursoru pro-IL-18 a jeho endogenní aktivita zřejmě zodpovídá za tvorbu IFN-γ při letalitě zprostředkované P.acnes a LPS. S ohledem na tuto aktivitu, představuje blokování biologické aktivity IL-18 při chorobných stavech terapeutickou strategii pro mnoho lidských chorob. K tomuto účelu lze použít solubilních receptorů nebo protilátek blokujících IL-18 receptory vázané na buňkách.

Proteiny vázající cytokiny (solubilní receptory cytokinů) odpovídají extracelulárním, ligand vázajícím doménám buněčných povrchových receptorů pro tyto cytokiny. Vznikají buď alternativním sestřihem pre-mRNA, společné pro receptor na buněčném povrchu, nebo proteolytickým štěpením povrchového receptoru. Takovéto solubilní receptory byly již popsány, mezi jinými pro IL-6 a IFN-γ (Novick et al., 1989, J. Exp. Med. 170:1409-1414), TNF (Engelmann et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1531-1536), IL-1 a IL-4 (Maliszewski et al., 1990, J.

• · ···· ·· · · · · · • * · · · · ♦ · · .

• · ··· · · · · « · · · * · · · · ······· ·| „

5· · · ··· · · · · ♦· ··· ·· · ..

Immunol. 144:3028-3033), IFN-α/β (Novick et al., 1994, Cell 77:391400; Novick et al., 1992, FEBS Lett. 314:445-448) a další. Jeden cytokin-vazebný protein, osteoprotegerin (OPG, též známý jako OCIF, tj. faktor inhibující osteoklasty), který je členem receptorové rodiny

TNFR/Fas, je zřejmě prvním příkladem solubilního receptoru, který existuje pouze ve formě secernovaného proteinu (Anderson et al., 1997, Nátuře 390:175-179; Simonet et al., 1997, Cell 89:309-319; Yasuda et al., 1998, Endocrinology 139:1329-1337).

Podstata vynálezu io Předkládaný vynález poskytuje IL-18 - vazebné proteiny (proteiny IL-18BP) a virově kódované homology IL-18BP (dále v textu virové IL-18BP), a jejich fúzované proteiny, muteiny, funkční deriváty, aktivní fragmenty a cirkulárně permutované deriváty, všechny schopné vázat se k IL-18. Vynález rovněž poskytuje způsob izolace 15 proteinů IL-18BP z lidských tekutin a postup na jejich získání rekombinantními technikami. Vynález také poskytuje expresní vektory pro IL-18BP, vhodné k expresi IL-18BP v lidech a jiných savcích. Specifické IL-18BP, virově kódované homology IL-18BP, jejich fúzované proteiny, muteiny, funkční deriváty, aktivní fragmenty a 2o cirkulárně permutované deriváty podle vynálezu jsou využitelné při modulaci a/nebo blokování biologických aktivit IL-18.

Vynález dále poskytuje replikovatelné expresní vektory obsahující DNA úseky vhodné pro expresi různých IL-18BP v hostitelských buňkách, hostitelské buňky takto transformované a proteiny a polypeptídy vytvořené expresí v takovýchto hostitelích.

Dále vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující vhodná vehikula a proteiny IL-18BP, nebo virové IL-18BP, nebo vektory k jejich expresi v lidech a jiných savcích, pro léčbu chorob nebo stavů, jež vyžadují modulaci nebo blokování aktivity IL-18.

Vynález dále poskytuje protilátky namířené proti proteinům IL-18BP a virovým IL-18BP, vhodné pro jejich afinitní purifikaci a imunostanovení.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká různých IL-18BP a virových IL-18BP, které se vážou k IL-18. Takovéto IL-18BP proteiny mohou mít schopnost modulovat a/nebo blokovat biologické aktivity IL-18. Termín “proteiny IL-18BP a virové IL-18-BP“ zahrnuje maturní protein (bez signální sekvence), protein obsahující signální sekvence, muteiny IL18BP a virových IL-18-BP, deriváty IL-18BP a virových IL-18-BP, zkrácené formy IL-18BP a virových IL-18-BP, a jejich sole.

Vynález se dále týká replikovatelných expresních vektorů vhodných pro expresí různých IL-18BP nebo virových IL-18BP v hostitelských buňkách a hostitelských bakteriích. Vynález se dále týká expresních vektorů vhodných pro expresi různých IL-18BP nebo virových IL-18BP v lidech a jiných savcích.

Vynález se dále týká DNA molekul kódujících různé IL-18BP, virové IL-18BP, muteiny, fúzované proteiny, funkční deriváty, aktivní frakce a jejich směsi. Tato DNA může být genomovou DNA, cDNA, syntetickou DNA, produktem PCR reakce nebo jejich kombinacemi. Tyto DNA mohou být vneseny do replikovatelných expresních vektorů pro expresi různých IL-18BP a virových IL-18BP v hostitelských buňkách podle vynálezu. Vynález rovněž zahrnuje DNA molekuly schopné hybridizovat k shora uvedeným DNA za stringentních podmínek a kódující proteiny nebo polypeptidy, které jsou rovněž schopné vázat IL-18.

·· ···· • · • · ··

Jedna takováto DNA kóduje IL-18BP zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:10, opatřenou na 3' konci stop kodonem.

Expresní vektory vhodné pro expresi různých IL-18BP a virových

IL-18BP vlidech a jiných savcích, tj. pro genovou terapii, mohou být virové vektory nebo jiné typy vektorů, do kterých jsou vneseny IL-18BP gen nebo IL-18BP cDNA nebo DNA kódující virový IL-18BP takovým způsobem, který v lidech a jiných savcích umožňuje účinnou expresi IL-18BP nebo virového IL-18BP. DNA molekuly hybridizující za io stringentních podmínek k shora uvedeným DNA, a kódující proteiny nebo polypeptidy, jež jsou schopné vázat se k IL-18, jsou rovněž zahrnuty do vynálezu.

Izolaci IL-18BP lze podle vynálezu provést např. tak, že lidská tekutina jako moč nebo sérum, se nechá protéci chromatografickým is sloupcem, ke kterému je navázán IL-18, a následně se eluuje zachycený IL-18BP.

Různé IL-18BP a virové IL-18BP mohou být rovněž připraveny rekombinantními technikami, tj. exprimováním IL-18BP ve vhodném hostiteli, přičemž se použije funkčního připojení promotorů, enhancerů exprese, regulačních sekvencí atd. vhodných pro konkrétního hostitele, které např. umožní expresi genu ve správné orientaci.

Různé IL-18BP a virové IL-18BP a vektory pro expresi IL-18BP v lidech a jiných savcích mohou být použity při léčbě nebo zmírňování stavů, při kterých se účastní IL-18 nebo které jsou působeny nadbytkem zevně dodávaného nebo vnitřně vytvářeného IL-18. Mezi takovéto stavy patří např. autoimunitní choroby, diabetes l.typu, revmatoidní artritida, odhojování transplantovaného štěpu, zánětlivé choroby střeva, sepse, roztroušená sklerosa, ischemická choroba srdeční (včetně srdečních infarktů), ischemické poškození mozku,

999

9 9 9 9 9 9 9 chronická hepatitida, lupénka, chronická pankreatitida, akutní pankreatitida a podobně.

Podle vynálezu byl IL-18BP izolován z normální lidské moči v jednom chromatografickém kroku. Preparát hrubé frakce lidských proteinů moči, koncentrovaný z 500 litrů normální lidské moči, byl nanesen na sloupec agarosy, k níž byl navázán lidský IL-18. Kolona byla promyta a zachycené proteiny eíuovány při nízkém pH. Eluované frakce byly neutralizovány a alikvoty byly analyzovány pomocí SDSPAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek a s barvením io stříbrem. V eluovaných frakcích byl obsažen specifický proteinový pruh o velikosti přibližně 40 kDa (Obr. 1).

Tento ~40 kDa protein byí identifikován jako protein vázající

125

IL-18 podle své schopnosti specificky se kovalentně provázat s IIL-18 (Obr. 2). Pro další charakterizaci ~40 kDa proteinu byla stanovena N-koncová proteinová sekvence. Alikvoty eluovaného proteinu byly po SDS-PAGE elektroforeticky přeneseny na PVDF membránu a podrobeny mikrosekvenační analýze. Alikvoty eluovaného proteinu byly podrobeny i přímé mikrosekvenační analýze. V obou případech byly získány dvě polypeptidové sekvence. Hlavní sekvence a minoritní sekvence, která odpovídala fragmentu lidského defensinu (přírůstkové číslo databáze p11398), počínaje aminokyselinovým zbytkem 65. Po odečtení známé sekvence defensinu zůstala následující sekvence:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A

1...5....10..

kde x představuje dosud neurčený aminokyselinový zbytek.

Pro získání delší a přesnější sekvence a pro identifikaci případných cysteinových zbytků bylo postupováno takto: alikvot eluované frakce byl redukován DTT za denaturujících podmínek, poté ·« A··· • · A • · AAA

• · · · · • · · · A · • AAAA · « « « byl reagován s 4-vinylpyridinem, odsolen na mikroultrafiltračním zařízení (Ultrafree, mezní velikost 10,000 Da, Millipore) a podroben proteinové mikrosekvenační analýze. Po 1 .sekvenačním cyklu byl zbývající protein reagován s o-ftalaldehydem, aby se blokovaly všechny N-koncové aminokyseliny kromě Pro, a pokračovalo se pak v sekvenaci. Tímto způsobem byla získána následující jediná proteinová sekvence:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT io (T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=neznámé; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu)

Výsledná sekvence se významně liší od sekvencí všech

A známých proteinů v proteinových databázích. Avšak prohledání databáze při The Institute of Genomic Research (TIGR) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) pomocí vyhledávacího programu tblast odhalilo cDNA sekvenci označenou THC123801, jejíž otevřený čtecí rámec (218 kodonů) obsahuje aminokyselinovou sekvenci vysoce homologní s N-koncovou sekvencí IL-18BP. Homologie je zde níže ukázána:

1........TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT. . .40

VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE

100 (Horní sekvence (1-40) přísluší IL-18BP izolovanému podle vynálezu;

spodní sekvence (51-100) je odvozená z cDNA uvedené v TIGR souboru THC123801).

cDNA sekvence THC123801 je však pouze tzv. EST (expressed sequence tag), tj. náhodně vybraný cDNA klon. Nikdy nebylo zkoumáno, zda tento EST obsahuje otevřený čtecí rámec, zda z genu • · • ··· *-»·* ···* odpovídajícímu ESTu nebo z ESTu samotného je exprimován nějaký protein, ani nebyla nikdy určena žádná funkce proteinu kódovaného THC123801. Vůbec nebylo známo nic o tom, že THC123801 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující IL-18BP.

IL-18BP afinitně purifikovaný z moče si uchoval schopnost vázat svůj značený ligand (¹²⁵I-IL-18) a po kovalentním provázání se vytvořil komplex o molekulové hmotnosti 58 kDa. Molekulová hmotnost tohoto komplexu odpovídá 1:1 poměru mezi ~40 kDa IL-18BP a 19 kDa IL18 (Obr. 2).

io IL-18BP afinitně purifikovaný z moče blokoval biologickou aktivitu lidského i myšího IL-18. Přidání IL-18BP k lidskému nebo myšímu IL-18 tedy blokovalo schopnost IL-18 indukovat v přítomnosti lipopolysacharidu (LPS) tvorbu interferonu-γ v kulturách myších slezinných buněk (Obr. 3).

Pro účely tohoto popisu se výraz “biologická aktivita IL-18“ týká mezi jiným alespoň jedné z následujících biologických vlastností:

(i) indukce IFN-γ v různých typech buněk jako jsou mononukleární buňky, myší splenocyty, lidské monunukleární buňky periferní krve, lidské KG-1 buňky a buňky T, primárně jako kostimulátor s mitogeny IL-1, IL-12, TNF-α, LPS, (ii) zvýšení proliferace buněk T, (iii) zvýšení tvorby Th-1 cytokinů in vitro, primárně jako kostimulátor, (iv) synergismus s IL-12 při zvýšení tvorby IFN-γ, kostimulační účinek na tvorbu IFN-γ a dalších cytokinů Th1 buněk, •· #·*· ···

999

9 9

9 9

9 9 • 9 9 • 9 • ·

(v) kostimulační účinek na cytotoxicitu klonů myších přirozených zabíječů (NK buněk) zprostředkovanou FAS ligandem, (vi) indukce aktivace NF-κΒ v lidských KG-1 buňkách, pravděpodobně indukcí tvorby p50 NF-κΒ homodimeru a p65/p50 NF-κΒ heterodimeru, (vii) indukce IL-8.

Výraz “vazba klL-18“, jak se zde užívá, znamená schopnost io IL-18BP vázat IL-18, o čemž svědčí např. vazba afinitně purifikovaného IL-18BP k značenému IL-18 v Příkladu 2 níže zde uvedeném.

Výraz “modulace aktivity IL-18“, jak se zde užívá, znamená schopnost IL-18BP modulovat jakoukoli aktivitu IL-18 jiným způsobem než jejím blokováním, např. částečnou inhibici, zvýšením a podobně.

Výraz “blokování aktivity IL-18“, jak se zde užívá, se týká schopnosti IL-18BP blokovat alespoň jednu ze shora uvedených biologických aktivit IL-18. Příkladem této blokující aktivity IL-18BP je schopnost IL-18BP blokovat v myších splenocytech expresi IFN-γ související s IL-18. Jak bude podrobněji ukázáno níže, modulační nebo blokující aktivita IL-18BP je částečně způsobena tím, že IL-18BP inhibuje aktivaci NF-κΒ cytokinem IL-18. Dále ještě IL18BP blokuje alespoň jednu z následujících aktivit IL-18, jmenovitě indukci IFN-γ v lidských a myších buňkách, indukci IL-8 a aktivaci

NF-κΒ.

DNA sonda pro screening (prohledávání) cDNA knihoven byla připravena z RNA lidských Jurkat T-buněk pomocí RT-PCR a specifických sense a antisense primerů navržených podle TIGR sekvence. Identita výsledného PCR produktu byla potvrzena sekvenční • 9 ♦ ···

9 9 • * · ·· • · 9

9 · “9 9 999 ·· 99 • 9 9 9 • 9 9 ·

9 9 9 • 9 9 9 <« analýzou DNA. Tento PCR produkt byl označen radioaktivním ³²P a použit jako sonda při screeningu čtyř lidských cDNA knihoven odvozených z monocytu periferní krve, Jurkat T-buněk, PBMC (mononukleárních buněk periferní krve) a lidské sleziny. Různé nezávislé cDNA klony odpovídaly čtyřem sestřihovým variantám IL-18BP (SEQ ID NO:1, 3, 5 a 7). Všechny sestřihové varianty kódovaly předpokládané solubilní secernované proteiny. Nejhojněji zastoupený protein (IL-18BPa) měl otevřený čtecí rámec pro 192 kodonú, přičemž kódoval signální peptid, zde někdy též nazývaný “zaváděcí sekvence“, w dlouhý 28 aminokyselinových zbytků, následovaný maturním předpokládaným IL-18BPa, jehož prvních 40 zbytků se dokonale shodovalo s N-koncovou proteinovou sekvencí močového IL-18BP (SEQ ID NO:2). Umístění cysteinových zbytků naznačovalo, že tento polypeptid patří do imunoglobulinové (Ig) nadrodiny. Je zajímavé, že každý ze čtyř Gin zbytků maturního IL-18BPa představoval potenciální N-glykosylační místo. Tři další sestřihové varianty IL-18BP byly méně zastoupené než IL-18BPa. Kratší, 1 kb dlouhá IL-18BPb cDNA kódovala 28 aminokyselinových zbytků signálního peptidu, po kterých následoval maturní protein o 85 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:4). Třetí variantu, IL-18BPc, představovala 2,3 kb cDNA, kódující signální peptid 28 aminokyselinových zbytků dlouhý, po kterém následovalo 169 aminokyselinových zbytků maturního IL-18BP (SEQ ID NO:6). Čtvrtá varianta, IL-18BPd, kódovala 28 aminokyselinových zbytků signálního peptidu, následovaných maturním IL-18BP o 133 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:8).

Pro nalezení případných dalších sestřihových variant IL-18BP byla lidská genomová knihovna screenována sondou odpovídající plné délce IL-18BP cDNA. V knihovně bylo nalezeno pět genomových klonů různé délky. U všech těchto klonů byla provedena sekvenace 30 s použitím vnějších a vnitřních primerů. Dohromady byla z těchto klonů sestavena 7,8 kb dlouhá sekvence (SEQ ID NO:9). V rámci této 7,8 kb

* ♦» · • · · * • · » · * • ♦ · ··*»··« genomové sekvence nebyl nalezen žádný exon, který by kódoval transmembránový (TM) receptorový úsek. Všechny varianty sdílejí společný začátek translace, kódují stejný 28 aminokyselinových zbytků dlouhý signální peptid a solubilní maturní proteiny o různých velikostech a s různými C-koncovými sekvencemi. IL-18BP lokus obsahuje na mínus řetězci další gen, jenž kóduje protein 1 jaderného mitotického aparátu (NUMA1, nuclear mitotic apparatus protein 1). Z tohoto zjištění vyplývá lokalizace IL-18BP genu na lidský chromosom 11 q13 (Sparks et al., 1993, Genomics 17:222-224).

Pro kompletní proteinovou sekvenci IL-18BPa se hledaly homologie v GenPept databázi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) s použitím Smith Watermannova algoritmu. Bylo zjištěno, že v několika Poxvirech se exprimují homology IL-18BP jako secemované proteiny s dosud neznámou funkcí. Dříve již bylo popsáno, že viry kódují různé receptory cytokinů a že takovéto virově kódované molekuly slouží jako “atrapy“ receptoru, které inhibují imunitní odpovědi tím, že neutralizují příslušný cytokin (přehled podává Spriggs, MK, 1994, Curr. Opin. Immunol., 6:526-529). Vynález se proto dále týká virově kódovaných homologů IL18BP, jež mohou rovněž blokovat nebo modulovat biologickou aktivitu IL-18. Příklady virově kódovaných homologů IL-18BP jsou uvedeny v Tabulce 1.

Podle vynálezu může být virem kódovaný homolog IL-18BP exprimován v prokaryotickém nebo eukaryotickém hostiteli. Výraz “virem kódovaný homolog IL-18BP“, jak se zde užívá, se týká podobnosti alespoň z 50% u sekvence o délce alespoň 70 aminokyselinových zbytků. Výhodněji, má alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80%, nebo nejvýhodněji, alespoň 90% podobnost v sekvenci o 100 aminokyselinových zbytcích.

.··.:··· .*%.·>.

• ···· « ·, ♦ . z: ;

., i í í · ? i ···· · · ·» · -14-·· ··· »· j *··**·»*

Tabulka 1. Virově kódované proteiny vykazující vysokou homologii s lidským IL-18BP

GenPept sekvence typ viru

MCU60315_54	U60315 virus Molluscum contagiosum subtyp 1
MCU60315_53	U60315 Molluscum contagiosum subtyp 1
SWPHLSB_12	L22013 virus prasečích neštovic
CV41KBPL_14	virus kravských neštovic
VVCGAA_5	virus černých neštovic
UO1161_3 174	Ectromelia (virus myších neštovic)
VVU18340_6	virus pravých neštovic
VVU18338_7	virus pravých neštovic
VVU18337_7	virus pravých neštovic
VARCG_7 173	virus pravých neštovic
MCU60315_51	virus Molluscum contagiosum
HNABV_1	nový virus asoc. s virem hepatitidy non-A, non-B

IL-18BPa byl exprimován v opičích COS7 buňkách. K tomuto účelu byla IL-18BPa cDNA vnesena do savčího expresního vektoru pEF-BOS. Aby se usnadnila purifikace rekombinantního produktu, byla na 3'-konec otevřeného čtecího rámce IL-18BP přidána ve stejné fázi kazeta kódující (His)₆ sekvenci. COS7 buňky byly transientně io transfekovány expresním vektorem a posléze bylo bezsérové médium těchto buněk (150 ml) zkoncentrováno a purifikováno chromatografíí na nosiči s chelátem kovu. Na SDS-PAGE (barvené stříbrem) migroval IL-18BPa jako jeden pruh za redukujících i neredukujících podmínek • · • ΦΦΦ *· · • φ φ » · φ φ • ···* Φ φ • · Φ

a měl stejnou zdánlivou molekulovou hmotnost jako IL-18BP z moče. Analýza proteinové sekvence tohoto preparátu přinesla stejnou Nkoncovou sekvenci jako v původním močovém IL-18BP. Westernová analýza IL-18Pba s použitím protilátek získaných proti močovému IL5 18BP prokázala pruh o stejné molekulové hmotnosti jako v případě proteinu z moče. Kromě toho, při analýze ímunoprecipitací s následnou SDS-PAGE a autoradiografií byl IL-18-BPa schopen vytěsnit značený ¹²⁵I-IL-18BP močového původu z vazby k protilátce. IL-18BPa tedy strukturně odpovídá IL-18BP izolovanému z moče.

U hrubého a purifikovaného IL-18BPa byla testována schopnost inhibovat biologickou aktivitu IL-18. IL-18BPa inhiboval aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách (Obr. 9). Tyto výsledky potvrzují identitu IL-18BPa cDNA jakožto cDNA kódující biologicky aktivní IL-18BP.

Vynález se dále týká muteinů a fragmentů IL-18BP a virových

IL-18BP, a fúzovaných proteinů sestávajících z IL-18BP proteinů divokého typu a virových IL-18BP, nebo jejich muteinů nebo jejich fragmentů, fúzovaných k jinému polypeptidu nebo proteinu, a schopných vázat IL-18BP nebo jeho homology.

Termín “muteiny“, jak se zde užívá, se týká analogů IL-18BP, nebo analogů virových IL-18BP, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků přirozeného IL-18BP nebo virového IL-18BP nahražen jinými aminokyselinovými zbytky, nebo je deletován, nebo je jeden nebo více aminokyselinových zbytků přidán k přirozené sekvenci IL-18BP nebo virového IL-18BP, aniž by se schopnost výsledných produktů vázat IL-18 výrazně změnila ve srovnání s IL18BP divokého typu nebo virového IL-18BP divokého typu. Tyto muteiny se připravují známými technikami syntézy a/nebo místně cílené mutageneze, nebo jakýmikoli jinými známými technikami pro to vhodnými.

• ·

C ······ ·

- IΟ - ·· ··· _{e ee}

Jakýkoli takový mutein má s výhodou sekvenci aminokyselin dostatečně blízkou sekvenci IL-18BP nebo virového IL-18BP, aby měl v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP. Jednou z aktivit IL-18BP je jeho schopnost vázat IL-18. Pokud má mutein podstatnou vazebnou aktivitu vůči IL-18, může být použit při purifikaci IL-18, například prostřednictvím afinitní chromatografie, a lze tedy říci, že má v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP. Zda má daný mutein v podstatě stejnou aktivitu jako IL-18BP může tedy být určeno na základě běžných experimentů, při kterých je např. takovýto mutein podroben jednoduchému sendvičovému kompetičnímu testu, jako je radioimunoanalýza nebo ELISA stanovení, aby se zjistilo, zda se váže nebo neváže k vhodně značenému IL-18.

Ve výhodném provedení má jakýkoli takový mutein alespoň 40% identitu nebo homologii se sekvencí IL-18BP nebo virově kódovaného homologu IL-18BP. Výhodněji má s touto sekvencí alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80%, nebo nejvýhodněji, alespoň 90% identitu nebo homologii.

Muteiny IL-18BP polypeptidů nebo muteiny virových IL-18BP, které mohou být použity podle vynálezu, nebo nukleové kyseliny, jež je kódují, zahrnují konečný soubor v podstatě odpovídajících sekvencí jako substitučních peptidů nebo polynukleotidů, jež mohou být normálně získány osobou běžně znalou oboru, bez nepřiměřeného experimentování, na základě poznatků a instrukcí zde prezentovaných. Pro podrobný popis proteinové chemie a struktury viz. Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, SpringerVerlag, New York, 1978; a Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Propertíes, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, které jsou zde tímto zahrnuty odkazem. Pro pojednání o substitucích v nukleotidových sekvencích, například o preferencích pro kodony, viz

Ausubel et al., 1987-1995, Current Protocols in Molecular Biology,

- 17 kap. A.1.1-A.1.24, Greene Publishing Associates, lne. and Wiley & Sons, lne., New York; a Sambrook et al., Molecular CJoning: A Laboratory Manual, Dodatky C a D, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Výhodné záměny pro muteiny podle vynálezu jsou tzv.

“konzervativní“ substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce vlL-18BP polypeptidech nebo proteinech nebo virových IL-18BP mohou zahrnovat synonymní aminokyseliny v rámci skupiny, jejíž členové mají dostatečně podobné fyzikálně-chemické vlastnosti, takže w substice mezi členy skupiny zachová biologickou funkci molekuly, Grantham (1974), Science 185:862-864. Je jasné, že inserce a delece aminokyselin mohou být ve shora definovaných sekvencích prováděny bez změny jejích funkce, zejména pokud inserce nebo delece zahrnou pouze několik aminokyselin, např. méně než třicet as výhodou méně než deset, a neodstraní se nebo se nepřesunou na jiné místo aminokyseliny, jež jsou důležité pro vytvoření funkční konformace, např, cysteinové zbytky (viz. Anfinsen, “Principles That Govern The Folding of Protein Chains“, Science (1973) 181:223-230). Proteiny a muteiny vytvořené takovými delecemi a/nebo insercemi spadají do rozsahu vynálezu.

Avšak cysteinové zbytky, které nejsou nezbytné pro biologickou aktivitu mohou být nahraženy jinými zbytky, např. ve snaze, vyhnout se tvorbě nežádoucích intramolekulárních nebo intermolekulárních disulfidových vazeb, které mohou působit snížení aktivity IL-18BP.

Výhodné skupiny synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce I. Výhodnější skupiny synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce II; a nejvýhodnější skupiny synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce III.

• ·

- 18 » · · 4 > · · 4 «· ··

TABULKA 1
Výhodné skupiny synonymních aminokyselin
Aminokyselina	Synonymní skupina
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin,	Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
lle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle
Phe	Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu,	Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu,	Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg	, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg	1, Glu
Met	Phe, lle, Val, Leu, Met
Trp	Trp

• ·

- 19 • e · · • · • · ·· • · ♦

TABULKA II

Výhodnější skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina	Synonymní skupina
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn,
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

-20 • · 9 9 9 9 • · ·

9 9 99 ·· 9 9

9 9

9 9 9 9 • 99 9

9 9 9 9 « ·

TABULKA ill

Nejvýhodnější skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina	Synonymní skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lle	lle, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, lle, Leu
Trp	Trp

• ·

Příklady postupů pro zavádění aminokyselinových substitucí do proteinů, jež lze použít při přípravě muteinů IL-18BP polypeptidů nebo proteinů, nebo muteinů virových IL-18BP, zahrnují všechny známé metodické kroky, například postupy uvedené v US patentech

RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 a 4,737,462 autorů Mark et al.; 5,116,943 autorů Koths et al., 4,965,195 autorů Namen et al.; 4,879,111 autorů Chong et al.; a 5,017,691 autorů Lee at al.; a US patent No. 4,904,584 pojednávající o proteinech substituovaných lysinem (Shaw et al.).

ίο V jiném výhodném provedení vynálezu má jakýkoli mutein

IL-18BP nebo virového IL-18BP aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci IL-18BP, nebo virovému IL-18BP. Termínem “v podstatě odpovídající“ se rozumí proteiny s drobnými změnami v sekvenci přirozeného proteinu, které nemají vliv na základní vlastnosti přirozených proteinů, zejména co se týká jejich schopnosti vázat IL-18. Typy změn, které obecně vyhovují kategorii “v podstatě odpovídající“ jsou takové, jež jsou výsledkem konvenčních technik mutageneze DNA kódující tyto proteiny, vedoucích k několika drobným modifikacím, a následného vyšetření na požadovanou aktivitu způsobem diskutovaným shora. Vedle vazby k IL-18 mohou muteiny též modulovat a/nebo blokovat aktivitu IL-18.

Muteiny podle vynálezu zahrnují proteny kódované nukleovou kyselinou, například DNA nebo RNA, která hybridizuje za stringentních podmínek k DNA nebo RNA kódující IL-18BP nebo virový IL-18BP podle vynálezu. Vynález rovněž zahrnuje takovouto nukleovou kyselinu, která je též využitelná jako sonda při identifikaci a purifikaci žádané nukleové kyseliny. Kromě toho, by taková nukleová kyselina byla prvním kandidátem na stanovení, zda kóduje polypeptid, u nějž je zachována funkční aktivita IL-18BP podle • · · ·

-22 vynálezu. Termín “stringentní podmínky“ se týká podmínek hybridizace a následného promývání, které jsou osobami znalými oboru konvenčně označovány jako „stringentní“. Viz Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, kap. 6.3 a 6.4 (1987, 1992), a

Sambrook et al., supra. Příklady stringentních podmínek zahrnují, bez omezení, promývání v podmínkách 12-20°C pod vypočtenou T_m studovaného hybridu v např. 2 x SSC a 0,5% SDS po dobu 5 min, 2 x SSC a 0,1% SDS po dobu 15 min; 0,1 x SSC a 0,5% SDS při 37°C po dobu 30-60 min a nakonec 0,1 x SSC a 0,5% SDS při 68°C podobu io 30-60 min. Osoby zběhlé v oboru jsou si vědomi, že podmínky stringence též závisí na délce DNA sekvencí, oligonukleotidových sond (např. 10-40 baží) nebo smíšených oligonukleotidových sond. Používají-li se smíšené sondy, je výhodnější použít tetramethylamonium chlorid (TMAC) místo SSC. Viz Ausubel, supra.

Vynález dále zahrnuje nukleové kyseliny, které kódují IL-18BP podle vynálezu, jež však mají vzhledem k degeneraci genetického kódu odlišnou nukleotidovou sekvenci. Takováto DNA, která případně nehybridizuje za stringentních podmínek k DNA sekvencím uvedeným v Obr. 4 až 7, je však nicméně schopná kódovat IL-18BP podle vynálezu, je rovněž součástí vynálezu.

Termín “fúzovaný protein“ se týká polypeptidu obsahujícího IL-18BP nebo virový IL-18BP, nebo jejich mutein, ve fúzi s jiným proteinem, který má například prodloužený poločas přítomnosti v tělesných tekutinách. IL-18BP nebo virový IL-18BP tak může být fúzován k jinému proteinu, polypeptidu ap., např. k imunogiobulinu nebo jeho fragmentu. Může být také fúzován k polyethylenglykolu (PEG), aby se prodloužil jeho poločas.

• · · · · · • 9 • · ··

-23 Termín “soli“ se zde týká solí karboxylových skupin a solí vzniklých adicí protonu na aminoskupiny IL-18BP, virového IL-18BP, jejich muteinů nebo fúzovaných proteinů. Soli karboxylové skupiny se mohou tvořit způsoby známými v oboru a zahrnují anorganické soli, např. sodné, vápenaté, amonné, železité nebo zinečnaté soli ap., a soli s organickými bázemi jako např. soli tvořené s aminy, jako je triethanolamin, s argininem nebo lysinem, piperidinem, prokainem, apod. Soli vzniklé adicí protonu k aminoskupinám zahrnují např. soli s minerálními kyselinami jako je např. kyselina chlorovodíková nebo io sírová, a soli s organickými kyselinami jako je např. kyselina octová nebo šťavelová. Takovéto soli musí samozřejmě mít v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP.

Termín “funkční deriváty“, jak se zde užívá, zahrnuje deriváty IL-18BP nebo virového IL-18BP ajejich muteinů a fúzovaných 15 proteinů, které lze připravit např. derivatizací funkčních skupin postranních řetězců aminokyselinových zbytků nebo N- nebo C-koncových skupin s použitím metod známých v oboru; tyto deriváty jsou zahrnuty do vynálezu, je-li zachována jejich farmaceutická přijatelnost, tj., nedochází k zničení aktivity proteinu, která je 20 v podstatě podobná aktivitě IL-18BP nebo virových IL-18BP, a deriváty nedodávají toxické vlastnosti prostředkům, které je obsahují. Tyto deriváty mohou polyethylenglykolové postranní řetězce antigenní místa a prodlužovat poločas IL-18BP nebo virového IL-18BP 25 v tělesných tekutinách. Další deriváty zahrnují alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acyl deriváty volných aminoskupin aminokyselinových zbytků vytvořené s acylovými zbytky (např. alkanoylovými nebo karbocyklickými 30 aroylovými skupinami) nebo O-acyl deriváty volných hydroxylových zahrnovat maskovat například jež mohou • · 99 9 9 «· « • · · 9«· • · · · · 9 · 9 · • · ··· · · · · οζ *- · · » · ·

- ζ4 - ·· ··· .· · skupin (např. serinových nebo threoninových zbytků) vytvořené s acylovými zbytky.

Vynález pokrývá jako “aktivní frakce“ IL-18BP nebo virového IL-18BP, muteinů a fúzovaných proteinů, jakýkoli fragment nebo prekursory polypeptidového řetězce proteinové molekuly nebo proteinové molekuly v asociaci s molekulami nebo zbytky s ní spojenými, např. cukernými nebo fosfátovými zbytky, nebo agregáty proteinové molekuly nebo cukerných zbytků, za podmínky, že tato frakce si v podstatě uchová schopnost vázat IL-18.

io Termín “cirkulárně permutované deriváty“ , jak se zde užívá, se týká lineární molekuly, jejíž konce byly navzájem spojeny, buď přímo nebo prostřednictvím linkeru, za vzniku kruhové molekuly, která je potom otevřena na jiném místě za vzniku nové lineární molekuly s jinými konci než má původní molekula. Cirkulární permutace zahrnují molekuly, jejichž struktura je shodná s molekulou, jež byla cirkularizována a poté otevřena. Cirkulárně permutovanou molekulu tedy lze syntetizovat de novo jako lineární molekulu, aniž by se uplatnil cirkularizační a štěpící krok. Příprava cirkulárně permutovaných derivátů je popsána v WO95/27732.

Proteiny IL-18BP nebo virové IL-18BP mohou být produkovány různými rekombinantními buňkami, prokaryotickými jako např. E. coli, nebo eukaryotickými jako kvasinkami nebo hmyzími buňkami. Způsoby konstrukce vhodných vektorů nesoucích DNA, jež kóduje IL-18BP, a vhodných k transformaci např. E. coli, savčích buněk a kvasinek, nebo k infekci hmyzích buněk, s cílem produkovat rekombinantní IL-18BP nebo virový IL-18BP jsou v oboru dobře známy. Viz například Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology“ Current Protocols, 1993; Sambrook et al., “Molecular Cloning:

• « 9 ♦ • · 9 9 •9 · 9 9 • 9 9 9

99

A Laboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989.

• · 9 9

-25 »···«* 9

Pro potřeby exprese proteinů IL-18BP nebo virových IL-18BP je DNA kódující IL-18BP nebo virový IL-18BP, jejich fragmenty, muteiny nebo fúzované proteiny, s funkčně připojenými transkripčními a translačnímí regulačními sekvencemi, vnesena do vektorů, jež jsou schopné integrovat požadované genové sekvence do chromosomu hostitelské buňky. K selekci buněk, jež do svých chromosomů stabilně integrovaly vnesenou DNA, se používá jeden nebo více markérů, které umožňují selekci hostitelských buněk obsahujících expresní vektor. Markér může udělovat prototrofii auxotrofnímu hostiteli, resistenci io vůči biocidním látkám, např. antibiotikům, nebo resistenci vůči těžkým kovům jako např. mědi apod. Gen selektovatelného markéru může být připojen přímo k DNA sekvencím, jež mají být exprimovány, nebo může být vnesen do stejné buňky pomocí kotransfekce. Pro optimalizaci syntézy mohou být potřebné i další regulační elementy; ty is zahrnují signály pro sestřih, transkripční promotory, enhancery a terminační signály.

DNA molekula, jež má být vpravena do zvolených buněk je s výhodou součástí plasmidového nebo virového vektoru, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Výhodné prokaryotické plasmidy jsou deriváty plasmidu pBR322. Výhodné eukaryotické vektory zahrnují BPV, vakcínii, SV40, 2-μιπ plasmid atd., nebo jejich deriváty. Takovéto plasmidy a vektory jsou dobře známy v oboru (Bollon et al., 1980, J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48; Botstein et al., 1982, Miami Wint. Symp. 19:265-274; Broach, J.R., v “The Molecular

Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, str. 445-470 (1981); Broach, 1982, Cell 28:203-204; Maniatis, T., v “Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol.3: Gene Expression“, Academie Press, NY, str. 563-608 (1980)). Po konstrukci vektoru obsahujícího DNA sekvenci pro expresi, může být expresní vektor vnesen do buňky vhodného hostitele s použitím kterékoli z řady vhodných metod, jako je

- 26 transformace, transfekce, lipofekce, konjugace, fúze protoplastů, elektroporace, použití kalcium fosfátového koprecipitátu, přímá mikroinjikace atd.

Hostitelské buňky používané ve vynálezu mohou být prokaryotické nebo eukaryotické. Výhodní prokaryotičtí hostitelé zahrnují bakterie jako jsou E. coli, Bacillus, Streptomyces,

Pseudomonas, Salmonella, Serratia atd. Nejvýhodnějším prokaryotickým hostitelem je E. coli. Mezi zváště zajímavé bakteriální hostitele patří E. coli K12 kmen 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 io (ATCC 31537), E. coli W3110 (F‘, lambda', prototrofní) (ATCC 27325). V těchto hostitelích nebude protein glykosylovaný. Prokaryotický hostitel musí být kompatibilní s replikonem a s regulačními sekvencemi v expresním plasmidu.

Jelikož však jsou přirozené IL-18BP glykosylovány, dává se přednost eukaryotickým hostitelům před prokaryotickými. Výhodnými eukaryotickými hostiteli jsou savčí buňky, například lidské, opičí, myší, a CHO (Chinese hamster ovary tj. ovariární buňky čínského křečka) buňky, neboť zajišťují posttranstační modifikace proteinů, včetně složení do správné konformace, správné tvorby disulfidových vazeb,

2o jakož i glykosylaci ve správných místech proteinové molekuly. K posttranslační modifikaci peptidů, včetně glykosylace s vysokým zastoupením mannosy, dochází rovněž v kvasinkách a hmyzích buňkách.

Při produkci heterologních proteinů v kvasinkách a hmyzích buňkách se uplatňují různé strategie rekombinantní DNA využívající silné promotory a plasmidy o vysokém počtu kopií. Kvasinky a hmyzí buňky rozeznávají zaváděcí sekvence na produktech klonovaných savčích genů a secernují maturní IL-18BP. Po zavedení vektoru se hostitelské buňky pěstují na selektivním médiu, ve kterém rostou pouze buňky obsahující vektor. Exprese klonovaných genů vede

- 27 ·,Γ' • 999

9 9

99 99

99 * » 9 9

9 9 · ♦ · · 9 9 • · 9 9

99 k tvorbě IL-18BP, virového IL-18BP, fúzovaných proteinů, nebo jejich muteinů či fragmentů. Shora zmíněné klonování, izolace a identifikace klonu, charakterizace a postupy při sekvenaci jsou podrobněji popsány níže v textu v Příkladech.

Exprimované proteiny se pak izolují a purifikují konvenčními postupy zahrnujícími extrakci, srážení, chromatografíí, elektroforesu apod., nebo afinitní chromatografíí například s použitím antí-IL-18BP monoklonálních protilátek imobilizovaných na gelovém nosiči io v chromatografické koloně. Hrubě preparáty obsahující rekombinantní IL-18BP se nanesou na kolonu, přičemž IL-18BP se naváže k specifické protilátce na sloupci, zatímco nečistoty projdou kolonou. Po promytí se protein z gelu eluuje za podmínek obvykle užívaných k tomuto účelu, tj. při vysokém nebo nízkém pH, například pH 11 nebo pH 2.

Vynález se dále týká vektorů využitelných pro expresi IL-18BP nebo virového IL-18BP nebo jejich derivátů v savcích a konkrétně v lidech. Vektory pro krátkodobou a dlouhodobou expresi genů v savcích jsou dobře známy z literatury. Z různých studií vyplynulo, že vnesení genu např. do kosterního svalu, hladkého svalu cévní stěny a do jater má za následek systémové hladiny terapeutických proteinů. Kosterní sval je výhodný terč, protože má velkou masu, je vaskularizován a je snadno přístupný. S úspěchem se však použily i jiné cílové buňky, zejména prekursory imunitních buněk z kostní dřeně. V současnosti dostupné vektory pro expresi proteinů, například ve svalu, zahrnují plasmidovou DNA, liposomy, konjugáty DNA s proteiny, a vektory na bázi adenoviru, adeno-asociovaného viru a herpesviru. Nejúspěšnější z nich, co se týká délky působení a hladiny genové exprese, jakož i bezpečnostního hlediska, byly

-28 .*·.:

» · 9 ♦ • · · · · • · 9 • to ♦« 9

9 9 • · 9

9 9 vektory na bázi adeno-asociovaného viru (AAV) (Kessler, P.D. 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:14082-14087).

Postupy pro konstrukci AAV-odvozeného vektoru byly podrobně popsány (Snyder et al., 1996, Current Protocols in Human Genetics, kapitoly 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons) a jsou zahrnuty do vynálezu. Ve stručnosti, plasmid psub201, obsahující genom AAV divokého typu, se štěpí restrikčním enzymem Xbal a liguje s DNA fragmentem obsahujícím účinný eukaryotický promotor, např. promotor cytomegaloviru, konsensní sekvenci Kozákové, DNA sekvenci kódující io IL-18BP nebo virový IL-18BP, nebo jejich muteiny nebo fúzované proteiny nebo fragmenty, dále vhodnou 3' nepřekládanou oblast a polyadenylační signál, například polyadenylační signál z opičího viru SV40. Výsledným rekombinantním plasmidem, spolu s pomocným AAV plasmidem, např. pAAV/Ad, se kotransfekují savčí buňky, např. lidské

T293 buňky. Kultury se pak infikují adenovirem jakožto pomocným virem, a po 48-60 hodinách se sklidí supernatanty kultur. Supernatanty se frakcionují srážením síranem amonným, purifikují se centrifugací v CsCI hustotním gradientu, dialyzují se, a poté se zahřejí na 56°C, aby se zničily všechny adenoviry, zatímco výsledný rekombinantní AAV, který je schopný exprimovat IL-18BP nebo virový IL-18BP, nebo jejich muteiny nebo fúzované proteiny, zůstává při tomto kroku neporušený.

Fyziologická funkce solubilních cytokinových receptorů nebyla dosud objasněna. Solubilní receptory vážou své specifické ligandy a ve většině případů inhibují jejích biologickou aktivitu, jak bylo například ukázáno v systému TNF (Engelmann et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1531-1536). Jen ve velmi málo případech, například u IL-6, solubilní receptor zvyšuje biologickou aktivitu. Experimenty ukázaly, že rekombinantní solubilní TNF receptor, též známý jako TBP (TNF

- 29 • · · · *

«» » · 9

9 · _fiV

9 9*\

9 9 • * · ·« binding protein, TNF-vazebný protein), zabraňoval ve zvířecích modelech septickému šoku, a že solubilní formy IL-1 receptoru měly výrazné inhibiční účinky na rozvoj in vivo alloreaktivity u myších příjemců alloštěpu.

Podobně mohou IL-18BP a virové IL-18BP podle vynálezu nalézt použití jako modulátory aktivity IL-18, např. v případech diabetů

I. typu, sepse, autoimunitních chorob, odhojování transplantátu, revmatoidní artritidy, zánětlivývh chorob střeva, roztroušené sklerosy, ischemické choroby srdeční včetně akutních srdečních infarktů, io ischemického poškození mozku, lupénky, chronické hepatitidy a akutní hepatitidy. Mohou tedy být použity např. při jakékoli chorobě, při níž endogenní tvorba nebo exogenní podávání IL-18 indukuje chorobu nebo zhoršuje stav pacienta.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících farmaceuticky přijatelný nosič a IL-18BP nebo virový IL-18BP podle vynálezu, nebo jejich aktivní muteiny, fúzované proteiny a jejich soli, funkční deriváty nebo aktivní frakce.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících farmaceuticky přijatelný nosič a např. virový vektor jako je kterýkoli z řečených AAV-odvozených virových vektorů nebo jiný vektor exprimující IL-18BP nebo virový IL-18BP nebo jejich muteiny, fragmenty nebo fúzované proteiny, který je vhodný pro podání lidem a jiným savcům s cílem dosáhnout in vivo exprese IL-18BP nebo virového IL-18BP, nebo jejich muteinů nebo fragmentů nebo fúzovaných proteinů podle vynálezu, tj. pro použití v genové terapii.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se připravují smícháním IL-18BP nebo virového IL-18BP nebo jejich derivátů nebo vektorů pro jejich expresi s fyziologicky přijatelnými nosiči a/nebo stabilizátory a/nebo excipienty a směs se upraví do formy pro

3o dávkování, např. lyofilizací do dávkových lahviček. Aplikace může být • ·

- 30 • ··<» * K · • · · rW · · · « « * • * * · » « · ·· · ·· 99 při aplikaci • · * · » · · ·· ·*· podle kteréhokoli z uznávaných způsobů používaných podobných prostředků a bude záviset na stavu, který se léčí, tedy například nitrožilně, nitrosvalově, podkožně, místní injekční nebo zevní aplikací, nebo kontinuální infúzí atd. Množství aktivní látky, které se bude aplikovat, závisí na způsobu aplikace, léčené chorobě a stavu pacienta. Místní injekce bude například vyžadovat menší množství proteinu, v závislosti na tělesné hmotnosti, než nitrožilní infúze.

Proteiny IL-18BP nebo virové IL-18BP nebo vektory, které je exprimují in vivo, jsou tedy indikovány pro léčbu autoimunitních chorob, diabetů I. typu, revmatoidní artritidy, odhojování transplantátu, zánětlivývh chorob střeva, sepse, roztroušené sklerosy, ischemické choroby srdeční včetně akutních srdečních infarktů, ischemického poškození mozku, chronické hepatitidy, lupénky, chronické pankreatitidy a akutní pankreatitidy a podobných chorob, při kterých dochází k nenormální expresi IL-18 vedoucí k nadbytku IL-18, nebo v případech komplikací vyvolaných exogenně dodaným IL-18.

Vynález zahrnujé také protilátky proti IL-18BP nebo virovému IL-18BP, jakož i proti jejich muteinům, fúzovaným proteinům, solím, funkčním derivátům a aktivním frakcím. Termín “protilátka“ zahrnuje polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimérní protilátky, anti-idiotypové (anti-ld) protilátky namířené proti protilátkám, které mohou být značené, v solubilní nebo vázané formě, humanizované protilátky, jakož i jejich fragmenty získané jakoukoli známou technikou, jako je, ale bez omezení, enzymatické štěpení, peptidová syntéza nebo rekombinantní technologie.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populace molekul protilátek získaných ze séra zvířat imunizovaných antigenem.

• 9

- 31 9 9 · *'» ·

9 9

9 · ··

9 9 «

9 9 •9 999 · · • 9 9 9

9 9 9 9 9 •99 ·· 9 ·· 99 · 9 ·

9 « « •9 9· · · « 9

99

Monoklonální protilátka obsahuje v podstatě homogenní populaci protilátek specifických pro antigen, přičemž tato populace obsahuje v podstatě podobná vazebná místa pro epitop. Monoklonální protilátky mohou být získány metodami dobře známými v oboru. Viz například s Kohler a Milstein, Nátuře 256:495-497 (1975); U.S. Patent No.

4,376,110; Ausubel et al. supra; Harlow a Lané, ANTIBODIES:

A LAB ORÁTORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992, 1993), v nichž io obsažené odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem. Takovéto protilátky mohou příslušet do kterékoli třídy imunoglobulinů, včetně

IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a jejich podtříd. Hybridom produkující mAb podle vynálezu může být kultivován in vitro, in sítu nebo in vivo. Vzhledem k produkci vysokých titrů monoklonálních protilátek in vivo nebo in šitu se tomuto způsobu produkce v současnosti dává přednost.

Chimérní protilátky jsou molekuly, jejichž různé části jsou odvozené z různých živočišných druhů, jako např. u chimérních

2o protilátek, které mají variabilní oblast odvozenou z myší monoklonální protilátky a konstatntní část z lidského imunoglobulinu. Chimérní protilátky se zejména používají pro snížení imunogenity při klinické aplikaci a pro vyšší výtěžky. Například v situaci, kdy myší mAb poskytují vyšší výtěžky z hybridomů, ale u lidí vyvolávají imunitní odpověď, používají se takovéto lidské/myší chimérní monoklonální protilátky. Chimérní protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známé v oboru (Cabilly et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:32733277 (1984); Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nátuře 312:643-646 (1984); Cabilly et al.,

Evropská patentová přihláška 125023 (publikovaná 14.listopadu

9« #

• 9 ··

- 32 9· 9·9 * · • 9 999 • 9 • ·

999

9 « 9 · • 9 · · • 99999 •99 • 9 ·

1984); Neuberger et al., Nátuře 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Evropská patentová přihláška 171496 (publikovaná 19.února 1985); Morisson et al., Evropská patentová přihláška 173494 (publikovaná

5.března 1986); Neuberger et al., PCT přihláška WO 8601533 (publikovaná 13.března 1986); Kudo et al., Evropská patentová přihláška 184187 (publikovaná 11.června 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška No. WO 9702671 (publikovaná 7.května 1987); Liu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., io Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); a Harlow a Lané, ANTIBODIES:

A LABORATORY MANUAL, supra. Tyto odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, která rozpoznává unikátní determinanty na molekule protilátky, zpravidla spojené s vazebným místem pro antigen. Anti-ld protilátka může být připravena imunizací zvířete stejného druhu a genetického typu (např. kmene myši) ze kterého pochází mAb, vůči které se anti-ld připravuje.

Imunizované zvíře rozpozná a bude reagovat na idiotypové determinanty imunizující protilátky tím, že začne vytvářet protilátku proti těmto idiotypovým determinantám (anti-ld protilátku). Viz např. U.S. Patent No. 4,699,880, který je zde v úplnosti zahrnut odkazem.

Anti-ld protilátka může být rovněž použita jako “imunogen“ na vyvolání imunitní odpovědi v ještě dalším zvířeti, za vzniku tzv. antianti-ld protilátky. Anti-anti-ld může být epitopově identická s původní mAb, která vyvolala anti-ld. Takto je možné s použitím protilátek namířených proti idiotypovým determinantám mAb identifikovat další klony exprimující protilátky s identickou specifitou.

* 0 ♦ ♦·<» « 0 0 0 0 0 00 0 0 0

-33.

Monoklonální protilátky vytvořené proti IL-18BP a příbuzným proteinům podle vynálezu, mohou tedy být použity k navození anti-ld protilátek ve vhodných zvířatech, jako jsou myši kmene BALB/c. Slezinné buňky z takto imunizovaných myší se použijí ke konstrukci anti-ld hybridomů, jež budou produkovat anti-ld monoklonální protilátky. Dále, anti-ld monoklonální protilátky mohou být navázány na nosič jako je hemocyanin měkýše šášně lodní (KLH) a použity k imunizaci dalších myší kmeneBALB/c. Sérum těchto myší bude obsahovat anti-anti-ld protilátky s vazebnými vlastnostmi původní mAb io specifické pro IL-18BP epitop nebo epitopy virového IL-18BP.

Anti-ld monoklonální protilátky tedy mají své vlastní idiotypové epitopy, neboli “idiotopy“, strukturně podobné hodnocenému epitopu, jako například IL-18BP nebo virový IL-18BP.

Termínem “humanizovaná protilátka“ se rozumí např. protilátky získané manipulací myších protilátek metodami genového inženýrství tak, aby byly slučitelnější s lidským tělem. Takovéto humanizované protilátky mají u lidí sníženou imunogenitu a lepší farmakokinetiku. Mohou být připraveny technikami známými v oboru, jak je popsáno

2o například pro humanizované anti-TNF protilátky v Molecular Immunology, 30(16):1443-1453 (1993).

Termínem “protilátka“ se rovněž rozumí, že zahrnuje jak celé molekuly tak jejich fragmenty, jako například Fab a F(ab')2, které jsou schopné vázat antigen. Fab a F(ab')₂ fragmenty nemají Fc fragment protilátky, rychleji vymizí z cirkulace a mohou mít nižší nespecifickou tkáňovou vazbu než celá protilátka (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316325 (1983)). Je zřejmé, že Fab a F(ab')₂ a další fragmenty protilátek využitelných podle vynálezu mohou být použity k detekci a kvantifikaci

IL-18BP nebo virového IL-18BP s použitím metod zde uvedených pro t 0 9 0 9 ·♦ 99

- 34 ·» »«»i • 9 9 • 9 9 99

9 9 •9 9

999

9

9 9

9 9 9 • 9 999

9 9

9

99 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 · celé molekuly protilátek. Takovéto fragmenty se zpravidla získávají proteolytickým štěpením, přičemž se užívají enzymy jako papain (na získání Fab fragmentů) nebo pepsin (na získání F(ab')₂ fragmentů).

O protilátce lze říci, že je “schopná vázat“ molekulu, pokud je schopná specificky interagovat s molekulou a tím molekulu vázat k protilátce. Termínem “epitop“ se míní ta část jakékoli molekuly, která může být vázána protilátkou a která může být také rozpoznána touto protilátkou. Epitopy nebo “antigenní determinanty“ zpravidla sestávají io z chemicky aktivních povrchových seskupení molekul, jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce, se specifickou trojrozměrnou strukturou a specifickými nábojovými vlastnostmi.

“Antigen“ je molekula nebo část molekuly, která může být vázána protilátkou, a která dále může vyvolat u zvířete tvorbu protilátky schopné vázat se k epitopu tohoto antigenu. Antigen může mít jeden nebo více epitopů. Specifickou reakcí, o níž byla řeč shora, se rozumí, že antigen reaguje vysoce selektivně se svojí odpovídající protilátkou a nikoli s velkým množstvím jiných protilátek, které mohly být vyvolány jinými antigeny.

Protilátky, včetně fragmentů protilátek, využitelné podle vynálezu, mohou být použity ke kvantitativní nebo kvalitativní detekci IL-18BP nebo virového IL-18BP, nebo příbuzných proteinů ve vzorcích nebo k detekci buněk, které exprimují takovéto proteiny podle vynálezu. Toho může být dosaženo imunofluorescenčními technikami, jež využívají fluorescenčně značené protilátky (viz níže) v kombinaci s detekcí mikroskopií, průtokovou cytometrií nebo fluorometrií.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) využitelné podle vynálezu se mohou použít v histologii k in šitu detekci IL-18BP nebo virového IL• 0

- 35 • 4 0 • 4 044

0 ·

0 4

000 • 4 «

4

0 0 • 40« •40 04 4 «

18BP a příbuzných proteinů podle vynálezu s použitím imunofluorescenční nebo imunoelektronové mikroskopie. fn sítu detekce může být provedena po odebrání histologického vzorku od pacienta přidáním značené protilátky podle vynálezu k takovémuto vzorku. Protilátka (nebo fragment) je s výhodou použita tak, že značená protilátka (nebo fragment) je aplikována nebo přiložena k biologickému vzorku. Použitím takového postupu je možné stanovit nejen přítomnost IL-18BP nebo virového IL-18BP nebo příbuzných proteinů, ale také jeho distribuci ve vyšetřované tkáni. Osoby běžně io zběhlé v oboru si při použití vynálezu ihned uvědomí, že kterákoli z celé řady histologických metod (jako například barvící postupy) může být modifikována, aby bylo dosaženo takovéto in šitu detekce.

Takovéto testy na IL-18BP nebo virový IL-18BP nebo příbuzné proteiny podle vynálezu typicky zahrnují inkubaci biologického vzorku, jako například biologické tekutiny, extraktu tkáně, čerstvě odebraných buněk jako lymfocytů nebo leukocytů, nebo buněk, které byly inkubovány v tkáňové kultuře, v přítomnosti značené protilátky schopné identifikovat IL-18BP nebo příbuzné proteiny, a detekci protilátky pomocí kterékoli z celé řady technik dobře známých v oboru.

Biologický vzorek může být zachycen na pevnou fázi nebo nosič jako nitrocelulosu, nebo na jinou pevnou fázi nebo nosič, který umožňuje imobiiizaci buněk, buněčných částí nebo rozpustných proteinů. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty vhodnými pufry a následně inkubovány s detegovatelně značenou protilátkou v souladu s vynálezem, jak bylo uvedeno shora. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty pufrem podruhé, aby se odstranila nenavázaná protilátka. Množství vázané značky na pevné fázi nebo nosiči může potom být detegováno obvyklými prostředky.

- 36 ·* φφφφ • φ * ♦ · ♦ ·« ♦ φ · φφ · φφ • · φ φ φ φ φ φ φφφφφ • φ φ • φ φ » φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

Termíny “pevná fáze“, “nosič pevné fáze“, “pevný nosič“, nebo “nosič“ se rozumí jakákoli pevná fáze nebo nosič schopné vázat antigen nebo protilátky. Dobře známé pevné fáze nebo nosiče zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dextran, nylon, amylasy, přírodní a modifikované celulosy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pro účely vynálezu může být nosič buď do určité míry rozpustný nebo nerozpustný. Pevná fáze může mít prakticky libovolnou konfiguraci, nutné je pouze, aby navázaná molekula byla schopná se vázat k antigenu nebo protilátce. Pevná fáze nebo nosič tedy mohou být sférické jako u kuliček, válcovité jako u vnitřního povrchu zkumavky nebo vnějšího povrchu tyčinky. Povrch může také být plochý jako u listu nebo proužku, atd. Výhodné pevné fáze nebo nosiče zahrnují polystyrénové kuličky. Osoby znalé oboru budou znát mnoho dalších vhodných nosičů pro vazbu protilátek nebo antigenů, anebo budou schopny tyto zjistit pomocí rutinního experimentování.

Vazebná aktivita dané šarže protilátky podle vynálezu může být stanovena pomocí dobře známých metod. Osoby znalé oboru budou schopné určit běžným experimentováním funkční a optimální podmínky pro každé stanovení.

2o Další kroky jako promývání, míchání, třepání, filtrování a podobně, mohou být zařazeny do procedury jak je obvyklé nebo nutné v konkrétní situaci.

Jeden ze způsobů jak může být protilátka podle vynálezu 25 detegovatelně označená je navázat protilátku k enzymu a použít ji v enzymoimunoanalýze (EIA). Tento enzym pak následně bude v přítomnosti vhodného substrátu reagovat se substrátem za vzniku chemického produktu, detegovatelného například spektrofotometricky, fluorometricky nebo visuálně. Enzymy, jež mohou být použity k

3o značení protilátek zahrnují, ale bez omezení, malátdehydrogenasu, • 9 • 9

- 37 99 9999 • * • 9 ·· >9 9

9 9 • 9 999

9 9 • · · 9

99999

9 9

9« 9 «9 9

9 9

9 9

9 9 9

99 stafylokokovou nukleasu, delta-5-steroid isomerasu, kvasinkovou alkoholdehydrogenasu, alfa-glycerofosfátdehydrogenasu, triosofosfátisomerasu, křenovou peroxidasu, alkalickou fosfatasu, asparaginasu, glukosaoxidasu, beta-galaktosidasu, ribonukleasu, ureasu, katalasu, glukosa-6-fosfátdehydrogenasu, glukoamylasu a acetylcholinesterasu. Detekce může být provedena kolorimetrickými metodami, jež využívají chromogenních substrátů enzymů. Detekce může být provedena též visuálním porovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu se standardy připravenými za podobných podmínek.

Detekce může být dosaženo s použitím kterékoli z řady dalších imunostanovení. Po radioaktivním označení protilátek nebo jejich fragmentů je například možné detegovat IL-18BP nebo virový IL-18BP pomocí radioimunoanalýzy (RIA). Dobrý popis RIA metody lze najít v is Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, autorů Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) se zvláštním poukazem na kapitolu, kterou napsal Chard, T., “Úvod do radioimunoanalýzy a příbuzných technik“, která je zde zahrnuta odkazem. Radioaktivní izotop je detegován pomocí gama-počítače nebo kapalinového scintilačního počítače nebo autoradiografií.

Dále je možné protilátku podle vynálezu označit fluorescenční sloučeninou. Po vystavení fluorescenčně značené protilátky světlu o vhodné vlnové délce, může být přítomnost protilátky detegována díky fluorescenci. Mezi nejběžněji užívané sloučeniny k fluorescenčnímu značení patří fluorescein isothiokyanát, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-ftalaldehyd, a fluoreskamin.

Protilátka může být též značena kovy vydávajícími fluorescenci jako jsou např. ¹⁵²Eu nebo další lanthanidy. Tyto kovy mohou být

- 38 ·· ··*A A A

A A A A· • A A A •A «

AA AAA

A· A A A A

A AAA • A AAA· a A * A

AA A ·· AA • A A A • · A A

A A A A

A A A A

AA AA navázány k protilátce prostřednictvím skupin chelatujících kovy, jako např. kyselina diethylentriaminpentaoctová (ETPA).

Protilátka může být též značena navázáním biotinu. Biotinylovaná protilátka pak může být detegována avidinem nebo streptavidinem navázaným k fluorescenční sloučenině nebo k enzymu jako peroxidasa nebo k radioaktivnímu izotopu a podobně.

Protilátka může být též značena navázáním chemiluminiscenční sloučeniny. Přítomnost chemiluminiscenčně označené protilátky je pak stanovena podle luminiscence vycházející v průběhu chemické reakce. Příkladem obzvláště užitečných sloučenin pro chemiluminiscenční značení jsou luminol, isoluminol, theromatický akridiniový ester, imidazol, akridiniová sůl a ester oxalátu.

Podobně mohou být k značení protilátky podle vynálezu použity bioluminiscenční sloučeniny. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence, vyskytující se v biologických systémech, ve kterých je účinnost chemiluminiscenční reakce zvyšována katalytickým proteinem. Přítomnost bioluminiscenčního proteinu se stanovuje detekcí luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

Molekula protilátky podle vynálezu může být použita v imunostanovení, známém též jako “dvojstranná“ nebo “sendvičová“ analýza. V typickém imunometrickém stanovení se určité množství neznačené protilátky (nebo fragmentu protilátky) naváže k pevné fázi nebo nosiči a přidává se určité množství solubilní značené protilátky, které umožňuje detekci a/nebo kvantifikaci ternárního komplexu mezi protilátkou na pevné fázi, antigenem a značenou protilátkou.

- 39 ·· «·<« • · · • · ··· • · · • · · ·· tt· ·· · • · 9 • t · · • · · ···«· • · · ·· *

9 9 « · · • 9 9 • · · ·· ··

Typická a výhodná imunostanovení zahrnují “forward“ analýzy, při kterých je protilátka navázaná na pevné fázi nejprve inkubována s testovaným vzorkem, aby se antigen ze vzorku navázal do binárního komplexu protilátka na pevné fázi - antigen. Po vhodné době inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se odstranily zbytky kapalného vzorku, včetně nenavázaného antigenu, je-li takový, a potom se přidá roztok obsahující neznámé množství značené protilátky (která slouží jako “reportérové molekula“). V průběhu druhé inkubace se značená protilátka komplexuje s antigenem, který je navázaný k pevné fázi io nebo nosiči prostřednictvím neznačené protilátky, a poté se pevná fáze nebo nosič podruhé promyje, aby se odstranila nenavázaná značená protilátka.

V jiném typu “sendvičového“ stanovení, které může být použitelné pro antigeny podle vynálezu, se provádějí tzv. “simultánní“ a “reverzní“ analýzy. Simultánní stanovení spočívá v jediném inkubačním kroku, ve kterém se protilátka vázaná k pevné fázi nebo nosiči a značená protilátka současně přidávají k testovanému vzorku. Po ukončení inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se

2o odstranily zbytky kapalného vzorku a nenavázaná značená protilátka. Přítomnost značené protilátky spojené s pevnou fází nebo nosičem se pak stanoví stejně jako v případě konvenčního “forward“ sendvičového stanovení.

Při “reverzním“ stanovení se nejprve přidá roztok značené protilátky ke kapalnému vzorku a po vhodné inkubační době následuje přídavek neznačené protilátky vázané na pevné fázi nebo nosiči. Po druhé inkubaci je pevná fáze konvenčním způsobem promyta, aby se odstranily zbytky testovaného vzorku a nenavázané značené protilátky. Stanovení značené protilátky spojené s pevnou fází nebo

3o nosičem se provede stejně jako v “simultánní“ a “forward“ analýze.

-40 99 999· • 9 9 • 9 999

9 · • · · ·· 999

9 • · · • · · · • · 9999 9 · ·

O

9 9

9 9

9 9

9 ·

Vynález též poskytuje DNA molekuly kódující proteiny podle vynálezu jak jsou shora definovány, replikovatelné expresní vektory obsahující takovéto DNA molekuly, hostitelské buňky, jež jsou transformované těmito expresními vektory a zahrnující prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky, s výhodou CHO buňky. Vynález rovněž zahrnuje způsob přípravy expresních vektorů, kódujících kterýkoli z proteinů podle vynálezu, za účelem jejich exprese v lidech a jiných savcích.

Vynález též zahrnuje způsob přípravy kteréhokoli z proteinů podle vynálezu spočívající v kultivaci transformované buňky v souladu s vynálezem a izolaci proteinu kódovaného DNA molekulou v expresním vektoru uvnitř takovéto transformované hostitelské buňky.

IL-18BP nebo virový IL-18BP se mohou, vedle použití na modulaci aktivity IL-18, samozřejmě použít i pro purifikaci samotného IL-18. Pro tento účel se IL-18BP nebo virový IL-18BP naváže k afinitní koloně a hrubá frakce IL-18 se nanese na kolonu. Zachycený IL-18 se pak získá z kolony např. elucí při nízkém pH.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje SDS-PAGE (elektroforesu v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným) IL-18-vazebného proteinu purifikovaného afinitní chromatografíí. Na kolonu agarosy s navázaným IL-18 byla nanesena hrubá směs močových proteinů (zahuštěných ultrafiltrací z 500 I normální lidské moče). Kolona byla promyta a zachycené proteiny eluovány při pH 2,2. Eluované frakce • · · *

- 41 - ....... · byly neutralizovány a alikvoty analyzovány pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek, gel byl barven stříbrem. Jednotlivé dráhy obsahovaly: 1: hrubá směs močových proteinů (nanáška 1,5pg); 2-9: eluáty 1-8 z kolony IL-18-agarosy; 10: markéry molekulové hmotnosti, velikosti v kDa uvedeny vpravo. Šipkou je označen pruh odpovídající IL-18BP.

Obrázek 2 ukazuje autoradiogram SDS-PAGE (7,5% akrylamid) komplexů obsahujících ¹²⁵I-IL-18 (zdánlivá molekulová hmotnost 19 io kDa) kovalentně provázaný s následujícími preparáty solubilního IL18-vazebného proteinu: dráha 1: roztok po promytí IL-18 afinitní kolony; dráha 2: eluát 2 z IL-18 afinitní kolony; dráha 3: eluát 3 z IL-18 afinitní kolony. Markéry molekulové hmotnosti jsou vyznačeny vpravo (v kDa). Šipka označuje kovalentně provázaný produkt (58 kDa).

Obrázek 3 ukazuje inhibiční účinek IL-18BP na tvorbu IFN-γ indukovanou IL-18.

(A) Myší splenocyty byly stimulovány (24 hod, 37°C) vyznačenými kombinacemi LPS (1 gg/ml) a lidského (hu) IL-18 (5 ng/ml), přidaným buď přímo, nebo po preinkubaci (1 hod, 37°C) s močovým IL-18BP a po 24 hod byla stanovena hladina myšího mulFN-γ v kultuře.

(B) Myší splenocyty byly inkubovány (24 hod) s LPS (1 pg/ml), spolu s myším IL-18 (10 ng/ml), který byl preinkubován (1 hod, 37°C) s rostoucími koncentracemi lidského IL-18BP.

(C) Myší splenocyty byly inkubovány (24 hod) s LPS (1 pg/ml), spolu s rostoucími koncentracemi lidského IL-18BP.

(D) Myší splenocyty byly inkubovány (24 hod) s ConA (1 pg/ml), spolu s rostoucími koncentracemi lidského IL-18BP.

• · · · (E) Lidské KG-1 buňky byly stimulovány faktorem TNF-a (20 ng/ml) a lidským hulL-18 (25 ng/ml), přidaným buď samotným, nebo po preinkubaci (1 hod, 37°C) s močovým IL-18BP.

Obrázek 4 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského

IL-18BPa. Signální peptid je podtržen.

Obrázek 5 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL-18BPb. Signální peptid je podtržen.

Obrázek 6 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL18BPc. Signální peptid je podtržen.

Obrázek 7 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského

IL-18BPd. Signální peptid je podtržen.

Obrázek 8 ukazuje sekvenci lidského IL-18BP genu. Lidský genomový klon (7,1 kb) byl sekvenován a sekvence byla porovnána se sekvencemi tří různých cDNA klonů izolovaných ze tří cDNA

2o knihoven. Společný iniciační kodon je dán nukleotidy 683-685. NuMA1 gen se nachází na negativním řetězci, od nukleotidu 3578 do konce.

Obrázek 9 ukazuje účinek rekombinantního IL-18BP na aktivitu lidského a myšího IL-18.

• ·

- 43 • ···· ·

Rekombinantní IL-18BPa s navázaným hexapeptidem His_e, His₆-IL-18BPa, byl transientně exprimován v buňkách COS7 a purifikován (rlL-18BP).

(A) Lidský IL-18 (5 ng/ml) byl po preinkubaci s His₆-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k myším slezinným buňkám společně s LPS (1 ILig/ml). Tvorba myšího mulFN-γ byla stanovena po 24 hodinách.

(B) Myší IL-18 (10 ng/ml) byl po preinkubaci s His₆-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k myším slezinným buňkám společně s LPS (1 H,g/ml). Tvorba myšího mulFN-γ byla stanovena po 24 hodinách.

(C) Lidský IL-18 (25 ng/ml) byl po preinkubaci s

COS7-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k lidským buňkám PBMC v přítomnosti IL-12 (10 ng/ml).

(D) Lidský IL-18 (25 ng/ml) byl po preinkubaci s COS7-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k lidským KG-1 buňkám v přítomnosti TNF-a (20 ng/ml) a byla stanovena tvorba lidského hulFN-γ.

Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících, nijak omezujících příkladech:

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1: Izolace IL-18-vazebného proteinu

Rekombinantní (E.coli) IL-18 (2,5 mg, Peprotech, NJ) byl navázán k nosiči Affigel-10 (0,5 ml, BioRad) podle pokynů výrobce a gelem byla naplněna chromatografická kolonka. Hrubá frakce močových proteinů (1000 x koncentrovaná, 500 ml) byla nanesena na kolonku při průtoku 0,25 ml/min. Sloupec byl promyt 250 ml 0,5 M NaCl v PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok). Vázané * · « · < • · • · ··

-44 proteiny pak byly eluovány roztokem 25 mM kyseliny citrónové pH 2,2 a benzamidinu (1 mM) a ihned neutralizovány roztokem 1M Na₂CC>3. Objem sbíraných frakcí byl 1 ml. Frakce byly analyzovány SDS-PAGE s barvením stříbrem. IL-18-vazebný protein byl eluován ve frakcích

č. 2-8 jako protein o molekulové hmotnosti ~40,000 Da (Obr. 1). Zhruba ~40 kDa pruh odpovídající IL-18BP poskytoval při barvení stříbrem výrazné žluté zabarvení. Různé frakce byly analyzovány pomocí kovalentního provázání s ¹²⁵1-IL-18, SDS-PAGE a autoradiografie, jak je popsáno v Příkladu 2. Ve frakcích 2-8, io eluovaných z kolony IL-18-agarosy (Obr. 2), tak byl potvrzen IL-18vazebný protein.

PŘÍKLAD 2: Kovalentní provázání afinitně purifikovaného IL18BP se značeným IL-18.

Vzorky (40 μΙ) IL-18BP z předchozího afinitně purifikačního kroku byly inkubovány (70 min při 4°C) s ¹²⁵I-IL-18 (5,000,000 cpm). Poté byl přidán disukcinimidylsuberát (DSS) rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (DMSO, 20 mM) do výsledné koncentrace 2 mM a směs byla ponechána 20 min při 4°C. Reakce byla zastavena

2o přídavkem 1 M Tris-HCI pH 7,5 a 1 M NaCI do výsledné koncentrace 100 mM. Po přidání vzorkového pufru s obsahem dithiothreitolu (DTT, 25 mM výsledná koncentrace) byly směsi analyzovány pomocí SDSPAGE (7,5% akrylamid) s následnou autoradiografií (Obr. 2).

Specifický pruh o molekulové hmotnosti 58 kDa, patrně obsahující ~40 kDa protein kovalentně provázaný s ~20 kDa ¹²⁵I-IL-18, byl pozorován ve frakcích eluovaných z IL-18 afinitní kolony (dráhy 2 a 3), ale nikoli v promývacím roztoku (dráha 1), který obsahoval všechny zbývající močové proteiny.

• · · · • · < 44«·

PŘÍKLAD 3: Analýza proteinové sekvence.

Eluované frakce z afinitní kolony podle Příkladu 1 byly rozděleny pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek a přeneseny z gelu elektroforeticky na PVDF membránu (Pro-Blot, Applied Biosystems, USA). Membrána byla obarvena Coomassie modří, ~40 kDa pruh byl vystřihnut a podroben sekvenační analýze v Procise mikrosekvenátoru (Applied Biosystems, USA). Takto byla získána následující hlavní sekvence:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A w 1...5....10..

kde x představuje dosud neurčený aminokyselinový zbytek.

Kromě ní byla získána i minoritní sekvence:

A-x-Y-x-R-l-P-A-x-A-l-A . ..5....10..

Kvůli této druhé sekvenci nebylo možné získat delší sekvenční data. Minoritní sekvence byla identifikována jako lidský defensin (přírůstkové č. p11398), počínaje aminokyselinovým zbytkem 65. Prohledání všech dostupných databází v NCBI a TIGR vyhledávacími programy blastp a tblastn nevedlo k nalezení žádného známého proteinu, který by odpovídal hlavní sekvenci.

Pro získání delší a přesnější sekvence a pro identifikací případných cysteinových zbytků byl jiný alikvot frakce eluované z IL-18-agarosy redukován DTT v 6 M guanidin HCl, poté byl reagován s 4-vinylpyridinem, odsolen na mikroultrafiltračním zařízení (Ultrafree, mezní velikost 10,000 Da, Millipore) a podroben proteinové mikrosekvenační analýze. Po l.sekvenačním cyklu byl filtr reagován s o-ftalaldehydem, aby se blokovaly všechny N-koncové

- 46 ·· · · • ·· aminokyseliny kromě Pro. Tímto způsobem byla získána pouze hlavní proteinová sekvence:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT

10 20 30 40 (T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=neznámé; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu).

V cyklech 6,7,8 a 11 byl zaznamenán slabý signál pro Thr, avšak vzhledem k nízké hodnotě signálu jsme považovali za rozumnější nepřidělovat pro tyto cykly specifický aminokyselinový zbytek.

Výsledná sekvence se významně liší od sekvencí všech známých proteinů v proteinových databázích. Avšak prohledání databáze TIGR pomocí vyhledávacího programu tblast odhalilo cDNA sekvenci označenou THC123801, jejíž otevřený čtecí rámec (218 kodonů) obsahuje aminokyselinovou sekvenci vysoce homologní s N-koncovou sekvencí IL-18BP. Homologie je zde níže ukázána:

1........TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT. . .40

I I I IIIII1111111IIIIIIIIII11111111II

VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE

100 (Horní sekvence (1-40) přísluší IL-18BP izolovanému podle vynálezu; spodní sekvence (51-100) je odvozená z cDNA uvedené v TIGR souboru THC123801).

• · 9 9 9 ·

-47 9 9

9 9

Předpokládaná proteinová sekvence, získaná translací cDNA THC123801, byla v pozicích 2 a 4 molekuly IL-18BP nejednoznačná. Potvrdila však pro pozice 6,7 a 8 a zřejmě i 11 v IL-18BP Thr zbytek.

PŘÍKLAD 4: IL-18BP je qlykoprotein.

Alikvoty (0,3 ml) eluovaných frakcí podle Příkladu 1 byly dále purifikovány gelovou filtrací na sloupci Superosy 12 (1 x 30 cm, Pharmacia, Švédsko). Kolona byla ekvilibrována a promývána roztokem PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a azidu sodného (0,02%) při průtoku 0,5 ml/min a frakce byly sbírány po 1 min. IL-18-vazebný protein byl identifikován pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem jako ~40 kDa protein ve frakcích 20-25. Na vzorek obsahující ~40 kDa protein (frakce 23, 50 μΙ, ~50 ng bílkoviny) bylo působeno enzymem N-glykosidasou F (PNGasa F, Biolab) podle návodu výrobce. Ve stručnosti, alikvot byl denaturován varem v přítomnosti 5% SDS po dobu 10 min a pak inkubován v 10 x G7 pufru (2,5 μΙ), 10% NP-40 (2,5 μΙ) s PNGasou F (1 μΙ) 1 hod při 37°C. Vzorek byl analyzován pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek a porovnán s neštěpeným vzorkem IL-18BP ze stejné frakce po Superose 12. Bylo zjištěno, že působením PNGasy pruh IL-18BP zmizel a byly získány nové pruhy odpovídající 30 kDa (těsně nad pruhem PNGasy) a 20 kDa. Odstranění ~40 kDa pruhu naznačuje, že se jedná o N-glykosylovaný protein.

PŘÍKLAD 5: IL-18BP blokuje biologickou aktivitu IL-18.

Schopnost IL-18BP izolovaného zmočí blokovat aktivitu IL-18 byla stanovena měřením tvorby IFN-γ v mononukleárních buňkách po indukci cytokinem IL-18. IL-18 indukuje IFN-γ je-li přidán k buňkám

- 48 buď s malým množstvím LPS, IL-12, IL-2, nebo jiných stimulátorů. Aktivita IL-18 byla testována s myšími splenocyty, lidskými PBMC (mononukleárními buňkami periferní krve) a s lidskou buněčnou linií KG-1. Slezinné buňky, připravené ze zdravé myši, byly promyty a suspendovány v koncentraci 5x10⁶ buněk/ml do RPMI 1640 média doplněného 10% fetálním bovinním sérem. Kultury o objemu 1 ml byly stimulovány LPS (buď 0,5 nebo 1 pg/ml) spolu s rekombinantním lidským nebo myším IL-18 (buď 0,5 nebo 5 ng/ml). Lidský IL-18vazebný protein (0,5 nebo 50 ng/ml) byl přidán k rekombinantnímu io IL-18 před jeho přidáním k slezinným buňkám. Po 24 hod kultivaci byly slezinné buňky podrobeny třem cyklům zmrazení (-70°C) a roztáni (pokojová teplota), centrifugací byly odstraněny buněčné zlomky a supernatanty byly testovány na obsah IFN-γ s použitím ELISA souprav pro myší IFN-γ (Endogen). Jak je ukázáno na Obr. 3A,

IL-18BP blokuje aktivitu (lidského) hulL-18 v myších splenocytech v závislosti na dávce. Naopak, kontrolní solubilní interferon-α/β receptor neměl žádný účinek. Aktivita rekombinantního myšího IL-18 byla lidským 1L-18BP podobně inhibována, což naznačuje, že lidský IL18BP rozpoznává myší IL-18 (Obr. 3B). Vysoké koncentrace LPS indukují v myších splenocytech endogenní IL-18, což má za následek tvorbu IFN-γ. Tato tvorba IFN-γ indukovaná LPS (10 pg/ml) byla rovněž inhibována močovým IL-18BP (Obr. 3C). Concanavalin A (con A) aktivuje buňky T k tvorbě IFN-γ v nepřítomnosti IL-18 (Fantuzzi et al., 1998, Blood 91:2118-2125), a skutečně, tato indukce IFN-γ concanavalinem A nebyla inhibována ani vysokou koncentrací IL-18BP (Obr. 3D). Tento výsledek prokázal, že IL-18BP působí jako specifický inhibitor biologické aktivity IL-18 a nikoli jako nespecifický inhibitor tvorby IFN-γ. IL-18BP také inhiboval aktivitu lidského IL-18 indukovanou v lidských KG-1 buňkách kombinací IL-18 a TNF-a (Obr. 3E).

• · · • ·

-49 « · • · ·

Shora uvedená data ukazují, že močový IL-18BP inhibuje aktivitu lidského i myšího IL-18 měřeno koindukcí tvorby IFN-γ v lidských a myších mononukleárních buňkách. Koncentrace IL-18BP, která snížila aktivitu IL-18 o více než 90%, byla srovnatelná s vlastní 5 koncentrací IL-18, což svědčí o vysoké afinitě mezi oběma těmito proteiny.

PŘÍKLAD 6: Izolace cDNA klonů kódujících IL-18BP.

Celková RNA z Jurkat buněk T (CRL 8163, sbírka ATCC) byla io reversně transkribována SuperScript RNasa H' reversní transkriptasou (Gibco-BRL) s použitím randomních primerů (Promega, Madison Wl). Výsledné cDNA fragmenty byly pak amplifikovány pomocí PCR s Taq DNA polymerasou (Sigma) a primery odpovídajícími nukleotidům 2444 (sense) a 500-481 (reversní) v klonu TIGR THC123801. Bylo použito 30 cyklů hybridizace (55°C, 2 min) a extenze (70°C, 1 min).

Výsledné PCR produkty byly rozděleny elektroforézou v agarosovém gelu (1%) a po eluci z gelu klonovány do vektoru pGEM-Teasy TA (Promega). DNA z jednotlivých klonů byla sekvenována s použitím T7 a SP6 primerů.

Výsledný fragment o velikosti 477 bp (párů baží) byl radioaktivně označen ³²P metodou náhodných primerů. Značená sonda bylo použita ke screeningu různých lidských cDNA a genomových knihoven. Z knihoven byly dvojmo pořízeny otisky na nitrocelulosových filtrech, které byly hybridizovány se sondou při 60°C v pufru 6xSSC, 10x Denhardtův roztok, 0,1% SDS a 100pg/ml DNA z lososích spermií. Filtry byly promyty a exponovány přes noc při -80°C na Kodak XAR film. Plaky příslušející klonům, jež vyšly pozitivně na obou filtrech, byly přečištěny. Z XpCEV9 klonů byly vyštěpeny plasmidové DNA a ligací cirkularizovány. cDNA klony • ·

• · » z ostatních knihoven byly izolovány podle instrukcí výrobce. DNA sekvenace izolovaných klonů byla provedena na automatizovaných sekvenátorech Model 373A a 377 (Applied Biosystems) s použitím sense a antisense primerů. Všechny klonovací postupy se prováděly podle standardních protokolů (Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989).

Screenovány byly následující knihovny: lidská cDNA knihovna z monocytů připravená v XpCEV9 klonovacím vektoru (Gutkind et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:1500-1507), laskavě poskytnutá T Mikim; io lidská cDNA knihovna z leukemických Jurkat T buněk, lidská cDNA knihovna z leukocytů periferní krve a lidská cDNA knihovna ze sleziny, všechny z firmy Clontech (Palo Alto, CA). Lidská genomová knihovna z placenty ve vektoru lambda FIX II byla z firmy Stratagene (La Jolla,

CA).

Byly získány a charakterizovány cDNA klony odpovídající čtyřem odlišným IL-18BP sestřihovým variantám. Všechny sestřihové varianty kódovaly pro předpokládané solubilní secernované proteiny. Nejhojněji zastoupený klon (IL-18BPa) měl otevřený čtecí rámec 192 kodonů dlouhý a kódoval signální peptid o délce 28 aminokyselin, po kterých následoval maturní předpokládaný IL-18BPa, jehož prvních 40 zbytků (SEQ ID NO: 10) se perfektně shodovalo s N-koncovou proteinovou sekvencí močového IL-18BP (SEQ ID NO:2). Poloha cysteinových zbytků naznačovala, že tento polypeptid patří do imunoglobulinové (lg) nadrodiny. Každý ze čtyř Gin zbytků maturního

IL-18BPa by mohl být N-glykosylačním místem. Ostatní tři sestřihové varianty IL-18BP byly podstatně méně zastoupené.

Jiná 1 kb IL-18BPb cDNA kódovala maturní protein o 85 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:4). Třetí variantu, IL-18BPc, představovala 2,3 kb cDNA, jež kódovala maturní IL-18BP o 169 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:6). Čtvrtá varianta, IL-18BPd,

- 51 ·· ···♦ • · •

kódovala maturní IL-18BP o 133 aminokyselinách (SEQ ID NO:8). V pro-mRNA byla zjištěna dvě místa intron-exon sestřihu. Sestřih v těchto dvou místech spolu s dalším 5' exonem v IL-18BPd umožňuje v různých cDNA klonech vznik 3 odlišných 5' UTR (nepřekládaných oblastí). Je proto docela možné, že různé varianty IL-18BP mohou vznikat jako odpověď na specifické transkripčně regulační signály.

Doposud nebyla zjištěna žádná cDNA, jež by kódovala receptor s transmembránovou doménou.

io PŘÍKLAD 7: Konstrukce savčího expresního vektoru, produkce rekombinantního IL-18BP, hodnocení biologické aktivity rekombinantního IL-18BP.

Kódující oblast IL-18BPa cDNA byla amplifikována pomocí PCR s těmito primery:

sense primer

5'TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA a reversní primer

5' ATATCTAGATTAATGATGATGATG ATGATGACCCTGCTGCTGTGGA

CTGC.

PCR produkty byly štěpeny restrikčním enzymem Xbal a klonovány do Xbal místa expresního vektoru pEF-BOS (Mizushima a Nagata, 1990, Nud. Add Res. 18:5322-5328) za vzniku pEF-BOS-IL-18BPa. Konstrukce rekombinantních plasmidů byla ověřena sekvenováním DNA.

K transfekci bylo inkubováno 6x10⁷ COS7 buněk v 1,4 ml TD pufru obsahujícím DNA plasmidů pEF-BOS-IL-18BPa (10 μg) a DEAE-dextran (120 μ9) po dobu 30 min při pokojové teplotě, jak bylo popsáno (Sompayrac a Danna, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA • ·

- 52 ·· 9 * · · ♦ ·»·· «· • · · • * · • · · • · 9

78:7575-7573). Buňky pak byly promyty médiem DMEM-10%FBS, nasazeny na 4 hod v DMEM-10, promyty a inkubovány 3-5 dnů v bezsérovém DMEM. Kultivační médium bylo sebráno, zahuštěno 6x ultrafiltrací (membrána s mezní velikostí 10 kDa) a produkt, IL-18BP5 His₆, byl zachycen na kolonce Talon (Clontech) a eluován imidazolem podle návodu výrobce.

Imunologická křížová reaktivita močového a rekombinantního COS7-exprimovaného IL-18BP byla stanovena následovně: močový IL-18BP (5 pg) byl označen radioaktivním ¹²⁵l postupem s chloraminem ίο T. Supernatanty COS7 buněk (250 μΙ) byly smíchány (1 hod, pokojová teplota, výsledný objem 500 μΙ) s protilátkou proti močovému IL-18BP zředěnou 1:1000 v PBS, 0,05% Tween 20 a 0,5% hovězí serumalbumin (promývací pufr). Poté byl přidán ¹²⁵l-značený močový IL-18BP (10⁶ cpm) a po 1 hodině byla přidána protein G-Sepharosa (20μΙ). Suspense byla ponechána 1,5 hod při 4°C, kuličky Sepharosy pak byly izolovány a promyty 3x promývacím pufrem a 1x roztokem PBS. Materiál zachycený na kuličkách byl eluován vzorkovým pufrem, elektroforeticky rozdělen v SDS-PAGE (10% akrylamid) za redukujících podmínek a následně autoradiografován.

IL-18BPa migroval v SDS-PAGE (barvení stříbrem) jako jeden pruh za redukujících i neredukujících podmínek a měl stejnou zdánlivou molekulovou hmotnost jako močový IL-18BP (data neukázána). Stanovená proteinová sekvence tohoto preparátu vykázala stejnou N-koncovou sekvenci jako u močového IL-18BP, což dokazuje, že IL-18BP izolovaný z moči nebyl degradovaný na N-konci.

Westernová analýza IL-18BPa pomocí protilátek namířených proti močovému IL-18BP identifikovala pruh o stejné molekulové hmotnosti jakou měl protein z moči. Kromě toho bylo imunoprecipitací a následnou SDS-PAGE a autoradiografií prokázáno, že IL-18BPa je

-53 •» 0000 • 0 0 0 00 ¹ 0 0 • •00 • « 0 • 0 0 • 0 0 * 0 0 ·· 00 schopen vytěsnit močový ¹²⁵I-IL-18BP z vazby na protilátku. IL-18BPa proto strukturně odpovídá močovému IL-18BP.

U hrubého a purifikovaného IL-18BPa byla testována schopnost inhibovat biologickou aktivitu IL-18. Bylo zjištěno, že IL5 18BPa inhiboval IFN-y-indukující aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách, přičemž míra této inhibice závisela na dávce (Obr. 9).

Výsledky různých biologických stanovení jakož i test změny elektroforetické pohyblivosti (Příklad 8) prokázaly, že inhibice IL-18 io aktivity je skutečnou vlastností klonovaného IL-18BP a nikoli nějakých nečistot doprovázejících IL-18BP izolovaný zmočí, jako například kopurifikujícího fragmentu defensinu.

PŘÍKLAD 8: Stanovení posunu elektroforetické pohyblivosti

Byl rovněž studován účinek močového a rekombinantního

IL-18BP na IL-18-indukovanou aktivaci NF-κΒ v lidských KG-1 buňkách. Lidské KG-1 buňky (4x10® buněk v 1 ml RMPI) byly stimulovány buď hulL-18 (10 ng/ml) nebo hulL-18 preinkubovaným s IL-18BP (20 min, pokojová teplota). Po 20 min při 37°C byly buňky třikrát promyty předchlazeným roztokem PBS a ihned zamraženy v kapalném dusíku. Buněčné pelety byly resusupendovány v trojnásobném objemu pufru A (20 mM Tris pH 7,6, 0,4 M NaCI, 0,2 mM EDTA, glycerol (20% obj.), 1,5 mM MgCI₂, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0,4 mM PMSF, 1 mM Na₃VO₄, 2 pg/ml leupeptin, 2 μ9/ηηΙ pepstatin a 2 μg/ml aprotinin). Buněčné zlomky byly odstraněny centrifugací (15,000 x g, 15 min) a alikvoty supernatantu byly zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při -80°C. Koncentrace proteinu byla určena stanovením podle Bradfordové (BiaRad), jako standard byl použit hovězí serumalbumin. Dvouřetězcový • ·

- 54 • ·· ·· • · • · · • · · · · • · • · • · • · • « ·· ·· oligonukleotid odpovídající vazebnému elementu pro NF-kB (10 pmol, Promega) byl radioaktivně označen [³²P]dCTP (300 Ci/mmol) T4 polynukleotidkinasou (New England Biolabs). Volné nukleotidy byly odstraněny centrifugací na mikrokolonkách. Extrakty (10 pg proteinu) připravené z buněk, na něž bylo působeno IL-18 nebo IL-18 plus IL-18BP, byly inkubovány (15 min při pokojové teplotě) se značenou sondou (3x10⁴ cpm), póly dl.dC (500 ng, Pharmacia) a denaturovanou DNA z lososích spermií (100 ng, Sigma) v 20 μΙ pufru obsahujícího HEPES (pH 7,5, 10 mM), 60 mM KCI, 1 mM MgCI₂, 2 mM EDTA, 1 io mM DTT a glycerol (5% obj.) Směsi pak byly naneseny na 5% nedenaturující polyakrylamidový gel a byla provedena elektroforéza při 185V v 0,5 x TBE (40 mM Tris HCI, 45 mM kyselina boritá, 2,5 mM EDTA). Gely byly vysušeny pod vakuem a přes noc autoradiografovány při -80°C. Výsledek ukázal, že IL-18 indukoval is vytvoření p50 NF-κΒ homodimeru a p65/p50 heterodimeru. Močový i rekombinantní IL-18BP inhibovaly aktivaci NF-κΒ cytokinem IL-18, měřeno posuvem elektroforetické pohyblivosti s extrakty KG-1 buněk a radioaktivně značeným oligonukleotidem odpovídajícím NF-kB konsensní sekvenci.

PŘÍKLAD 9: Exprese IL-18BP v E.coli, kvasinkách a hmyzích buňkách.

IL-18BP může být produkován také jinými rekombinantními buňkami jako jsou prokaryotické buňky, např. E. coli, nebo jiné eukaryotické buňky, například kvasinky a hmyzí buňky. Pro konstrukci vhodných vektorů, jež nesou DNA kódující IL-18BP a jsou vhodné pro transformaci E. coli a kvasinkových buněk nebo pro infekci hmyzích buněk za účelem produkce rekombinantního IL-18BP, lze použít dobře známé postupy. V případě exprese v kvasinkách se vyštěpený inzert •A A

-55 DNA kódující IL-18BP (Příklad 6) zaklonuje do expresních vektorů vhodných k transfekcí kvasinkových buněk. Pro expresi v hmyzích buňkách se DNA kódující IL-18BP zaklonuje do bakuloviru a hmyzí buňky se infikují tímto rekombinantním bakulovirem. Pro expresí v E.coli se DNA kódující IL-18BP upraví místně cílenou mutagenezou s vhodnými oligonukleotidy tak, aby se těsně před první kodon maturního IL-18BP dostal iniciační ATG kodon. Jinou možností jak připravit takovouto DNA je použití PCR a vhodných sense a antísense primerů. Takto modifikované molekuly cDNA se pak postupy dobře io známými v oboru vnesou do vhodně konstruovaných prokaryotických expresních vektorů (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

PŘÍKLAD 10: Konstrukce adeno-asociovaného expresního vektoru pro in vivo expresi IL-18-BPa.

Funkční gen kódující IL-18BPa se konstruoval na základě plasmidu pcDNA3 (Invitrogen, San Diego CA). IL-18BP cDNA obsahující na 5'konci konsensní sekvenci Kozákové byla ligována do Xbal místa plasmidu pcDNA3 způsobem, kterým se zrušilo toto restrikční místo. Nová Xbal místa se vnesla pomocí místně cílené mutageneze před neomycinovou kazetu (báze 2151 původní pcDNA3 sekvence) a za SV40 polyadenylační signál (báze 3372 původní pcDNA3 sekvence). Tento meziprodukt byl potom štěpen Xbal a výsledný 4,7 kb minigen byl vnesen do Xbal místa plasmidu psub201 jak bylo popsáno (Snyder et al., 1996, Current Protocols in Human Genetics, kapitoly 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons). Výsledný rekombinantní plasmid byl kotransfekován s pomocným AAV plasmidem pAAV/Ad do lidských buněk T293. Kultury pak byly infikovány adenovirem v roli pomocného viru a po 48-60 hodinách »*»«

- 56 - ..... ..· :

inkubace byly buňky sklizeny. Po třech cyklech zamražení - roztátí a centrifugačním odstranění buněčných zlomků byl k supernatantu přidán síran amonný do 33%-ho nasycení. Směs pak byla centrifugována a ze supernatantu byl vysrážen rAAV přidáním síranu amonného do 50%-ho nasycení. Virus pak byl dále purifikován centrifugací v CsCI, dialyzován a nakonec 15 min zahřát na 56°C, aby se zničil jakýkoli adenovirus.

PŘÍKLAD 11: Konstrukce rekombinantních fúzovaných proteinů ILio 18BP.

Proteiny obsahující IL-18BP fúzovaný ke konstantní oblasti lgG2 těžkého řetězce lze získat následujícím způsobem: do DNA kódující IL-18BP se místně cílenou mutagenezou s vhodnými oligonukleotidy zavede unikátní restrikční místo těsně před a za kódující sekvencí. Do plasmidu nesoucího konstantní oblast lgG2 těžkého řetězce, např. pRKCO42Fc1 (Byrn et al., 1990, Nátuře 344:667-670) se podobnou místně cílenou mutagenezou zavede stejné unikátní restrikční místo co možná nejblíže k Asp 216 v lgG1 těžkém řetězci takovým způsobem, aby se ve fúzovaném proteinu zachoval čtecí rámec.

Fragment dsDNA obsahující 5' nepřekládanou sekvenci a kódující IL18BP se připraví štěpením v unikátních restrikčních místech nebo pomocí PCR s vhodně navrženými primery. Mutovaný pRKCD42Fc1 je podobně štěpen za vzniku velkého fragmentu obsahujícího plasmid a lgG1 sekvence. Ligací obou fragmentů pak vznikne nový plasmid kódující polypeptidový prekursor, který obsahuje IL-18BP a asi 227 Ckoncových aminokyselin lgG1 těžkého řetězce (oblast “pantu“ a domény CH2 a CH3). DNA kódující fúzované proteiny se z plasmidu mohou izolovat digescí příslušnými restrikčními enzymy a poté vnést do účinných prokaryotických nebo eukaryotických expresních vektorů.

- 57 9« 999 9 • · * 999 *9 9

PŘÍKLAD 12: Příprava chemicky modifikovaných IL-18BP.

Zvýšení poločasu IL-18BP v plasmě lze dosáhnout chemickou modifikací IL-18BP polyethylenglykolem (PEG). Modifikaci lze provést kovalentním navázáním PEG k cysteinovému zbytku v molekulách IL-18BP. Konstruují se i mutantní IL-18BP, které mají cysteinový zbytek navíc na amíno-konci, v glykosylačních místech a na karboxykonci každé molekuly IL-18BP. Mutagenezu lze provést pomocí PCR s použitím oligonukleotidů obsahujících požadovanou mutaci. Tyto io mutantní proteiny se exprimují obvyklým způsobem, dobře známým v oboru. Proteiny se pak modifikují navázáním molekul PEG a vyhodnotí se jejich aktivita.

PŘÍKLAD 13: Příprava polyklonálních protilátek proti IL-18BP.

Králíkům bylo nejprve podkožně injikováno 5 μg čistého preparátu močového IL-18BP v emulzi s kompletním Freundovým adjuvans. O tři týdny později bylo opět podkožně injikováno 5 pg preparátu IL-18BP v nekompletním Freundově adjuvans. V 10 denních intervalech byly pak dány dvě další injekce IL-18BP ve formě roztoku

2o v PBS. Po 10 dnech od poslední imunizace byli králíci vykrváceni. Tvorba protilátek byla sledována radioimunoanalýzou. K různým ředěním (1:50, 1:500, 1:5,000 a 1:50,000) králičího séra byly přidány ¹²⁵l-značený 1L-18BP (166,000 cpm) a suspenze kuliček protein Gagarosy (20 μΙ, Pharmacia) v celkovém objemu 200 μΙ. Směs byla ponechána 1 hod při pokojové teplotě, kuličky byly pak 3x promyty a vázaná radioaktivita byla změřena. Jako negativní kontrola bylo použito králičí antisérum proti lidskému leptinu. Titr antiséra proti IL- 58 99

9999 9 « • 99« • 9 9 • 9

999

9 • 9 9 * · 9 9

9 9999 ·· 9 ·

9 · • 9 · •9 9 •9 «

18BP byl mezi 1:500 a 1:5000, přičemž titr negativní kontroly byl nižší než 1:50.

PŘÍKLAD 14: Příprava monoklonáiních protilátek proti IL-18BP.

Samicím myší Balb/C (3 měsíce starým) byly nejprve injikovány

2 pg purifikovaného IL-18BP v emulzi s kompletním Freundovým adjuvans a o tři týdny později podkožně v nekompletním Freundově adjuvans. Tři další injekce antigenu v roztoku PBS byly dány podkožně v 10 denních intervalech. Poslední posilovači dávky byly podány intraperitoneálně 4 a 3 dny před fúzí myši, která vykazovala io nejvyšší titr pro vazbu ve stanovení pomocí IRIA (viz níže). K fúzi se použily buňky NSO/1 myelomové linie a lymfocyty připravené ze sleziny a mízních uzlin imunizované myši. Suspenze fúzovaných buněk byla rozpipetována do mikrokultivačních destiček a hybridomy selektovány v DMEM doplněném HAT a 15% koňským sérem.

Hybridomy, které produkovaly protilátky proti IL-18BP, byly dále klonovány metodou limitního ředění a injikovány do myší kmene Balb/C, které byly senzibilizované přistáném pro tvorbu ascitů. Izotypy protilátek byly stanoveny s použitím komerčně dostupné ELISA soupravy (Amersham, UK).

Screening hybridomů produkujících anti-IL-18BP monoklonální protilátky se prováděl takto: Supernatanty hybridomů se testovaly na přítomnost anti-IL-18BP protilátek obrácenou radioimunoanalýzou na pevné fázi (IRIA). Jamky ELISA destiček (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) byly potaženy (10 pg/ml, 100 μΙ/jamka) IL-18BPa25 His₆ purifikovaným na Talon kolonce. Po inkubaci přes noc při 4°C byly destičky 2x promyty roztokem PBS obsahujícím BSA (0,5%) a Tween 20 (0,05%) a poté blokovány v promývacím roztoku nejméně 2 hod při 37°C. Na destičky pak byly přidány supernatanty z kultur hybridomů (100 μΙ/jamka) a destičky byly inkubovány 4 hod při 37°C.

- 59 ♦ •

φ φ

»φ φφ

ΦΦ·· φ φ Φφφφ * * φ • φ φ ΦΦ φφ φ φ φ · • φ φ Φ • · ΦΦΦΦ » φ φ • φ « *Φ φφ » φ Φ φ Φ φ • Φ φ Φ φ φ φφ

Destičky byly 3χ promyty a do jamek byl přidán na 2 hod při pokojové teplotě kozí anti-myší imunoglobulin konjugovaný s křenovou peroxidasou (HRP, Jackson Labs, 1:10,000, 100 μΙ/jamka). Destičky byly 4x promyty a do jamek byl přidán ABTS (2,2'-azino-bis (3ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina), Sigma) a H₂O₂ jako substrát. Vzniklé zabarvení bylo měřeno v automatické ELISA čtečce. Vzorky poskytující OD alespoň 5x vyšší než hodnota negativní kontroly byly považovány za pozitivní.

PŘÍKLAD 15: Afinitní chromatografie IL-18BP s monoklonálními protilátkami.

Protilátky proti IL-18BP lze použít při purifikaci IL-18BP afinitní chromatografíí. Ascitická tekutina obsahující monoklonální protilátku secernovanou hybridomem byla purifikována srážením síranem amonným při 50% nasycení s následnou důkladnou dialýzou proti PBS. Asi 10 mg imunoglobulinů bylo pak navázáno k 1 ml suspenze Affigel 10 (BioRad USA) podle návodu výrobce.

Na 0,5 ml kolonku Affigelu nesoucího anti-IL-18BP protilátku bylo naneseno při 4°C a průtoku 0,25 ml/min 250 ml lidských močových proteinů (ekvivalent 250 I surové moče). Kolonka byla promývána PBS dokud nebyl proteklý roztok prostý proteinů. IL-18BP byl eluován 25 mM citrátovým pufrem pH 2,2 (8 frakcí o objemu kolonky) a ihned neutralizován 1M Na₂CO₃. Další purifikace tohoto preparátu lze docílit chromatografíí na základě gelové filtrace.

PŘÍKLAD 16: ELISA test.

K povrchu jamek mikrotitračních destiček (Dynatech, nebo Maxisorb firmy Nunc) se naváže anti-IL-18BP monoklonální protilátka

- 60 «« ···· • 4 • 444 ·

9 4

9 4«

4 ···· • 9 4 ·· · • * · r • · 9 *· ··· (bezsérový hybridomový supernantant nebo imunoglobuliny tekutiny) inkubací přes noc při 4°C. Destičky se promyjí roztokem PBS obsahujícím BSA (0,5%) a Tween 20 (0,05%) a dále jsou blokovány stejným roztokem nejméně 2 hod při 37°C. Zkoumané vzorky se naředí 5 blokovacím roztokem a přidají se do jamek (ΙΟΟμΙ/jamka) na 4 hod při 37°C. Destičky se pak 3x promyjí roztokem PBS obsahujícím Tween 20 (0,05%) a přidá se králičí anti-IL-18BP sérum (1:1000,

ΙΟΟμΙ/jamka) na další inkubaci přes noc při 4°C. Destičky se poté 3x promyjí a na 2 hod při pokojové teplotě se přidá kozí anti-králičí io imunoglubulin konjugovaný s křenovou peroxidasou (HRP, Jackson Labs, 1:10,000, 100 μΙ/jamka). Destičky se 4x promyjí a přidá se ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina), Sigma) a H₂O₂ jako substrát. Vzniklé zabarvení se měří v automatické ELISA čtečce.

PŘÍKLAD 17: Neglykosylovaný lidsky IL-18BP je biologicky aktivní.

U purifikovaného rekombinantního IL-18BPa se zkoušela schopnost inhibovat biologickou aktivitu IL-18. IL-18BPa inhiboval

IFN-y-indukující aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách, přičemž míra této inhibice závisela na dávce (Obr. 9).

Purifikovaný IL-18BPa obsahující His₆ přívěsek na C-konci (1,5 μg, 50 μΙ) byl upraven na pH 7,5 a smíchán s N-glykosidasou F (3 μΙ, 500,000 U ml, PNGasa F, New England Biolabs). Směs byla inkubována 24 hod při 37°C za nedenaturujících podmínek. Alikvoty ze vzorku a z kontrolního neštěpeného IL-18BP-His₆ byly analyzovány pomocí SDS-PAGE za neredukujících podmínek a následně imunoblotovány s protilátkami proti IL-18BP. Bylo zjištěno, že ve frakci ascitické • 4 ·« • 4 4 4 » ·4 4 » 4 4 « ► · · 4 ·· 44

- 61 ΦΦ φ

φ φ

ΦΦ .:··· • ··· • · • φ • ΦΦ

ΦΦ φ

φ φ

φ • Φ φ φ φ • φ φ • φφφφ • φ

ΦΦ

ΦΦ • φ φ • φ · • · · • φ φ • Φ podrobené účinku PNGasy zmizel ~40 kDa pruh odpovídající IL18BP-His₆ a objevil se nový ~20 kDa pruh. Molekulová hmotnost produktu a specifita štěpení PNGasou nasvědčují, že IL-18BP-His₆ byl plně deglykosylován.

Frakce podrobená účinku PNGasy, neštěpený IL-18BP-His₆ a kontrolní vzorek obsahující pouze PNGasu v pufru byly samostatně adsorbovány na kuličky Talonu, promyty fosfátovým pufrem a eluovány imidazolem (100 mM). S eluovanými frakcemi bylo provedeno stanovení biologické aktivity s použitím lidského IL-18 (20 io ng/ml), LPS (2 pg/ml) a myších splenocytů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Vzorek	IFN-γ (ng/ml)
Kontrola	7,5
Neštěpený IL-18BP-His6	0
PNGasou štěpený IL-18BP-His6	0

Z pokusu lze tedy vyvodit, že deglykosylovaný IL-18BP je 15 biologicky aktivní modulátor aktivity IL-18.

Předcházející popis konkrétních provedení osvětluje obecnou povahu vynálezu, takže při aplikaci současných vědomostí mohou jiní tato konkrétní provedení snadno modifikovat a/nebo adaptovat pro

2o různá využití, aniž by se odchýlili od obecného principu, a proto takovéto adaptace a modifikace budou spadat smyslem a rozsahem mezi ekvivalenty zde zveřejněných provedení. Rozumí se, že zde použitá frazeologie a terminologie je pro účely popisu a nijak neomezuje.

Claims (9)

1. IL-18-vazebný protein (IL-I8BP) zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, její muteiny, fúzované proteiny, funkční deriváty, aktivní frakce, cirkulárně permutované deriváty a jejich

5 směsi.

2. IL-18BP podle nároku 1, schopný alespoň jedné z následujících aktivit:

(i) vazba k IL-18, io (ii) modulace aktivity IL-18, (iii) blokování aktivity IL-18.

3. IL-18BP vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) polypeptidů obsahujících kteroukoli z aminokyselinových 15 sekvencí SEQ ID NO:2, 4, 6, nebo 8;

(b) polypeptidů definovaných v (a) bez zaváděcí sekvence;

(c) muteinů, fúzovaných proteinů, funkčních derivátů, aktivních frakcí a cirkulárně permutovaných derivátů polypeptidů definovaných v (a) nebo (b) a jejich směsí; a

20 (d) virových homologů polypeptidů definovaných v (a) nebo (b).

4. IL-18BP podle nároku 3, který má alespoň jednu z následujících biologických vlastností:

(i) vazba k IL-18,

25 (ii) modulace aktivity IL-18, • « *· ·· (iii) blokování aktivity IL-18.

5. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1-4, přičemž tento IL-BP18 je nevirový protein.

6. IL-18BP podle nároku 5, přičemž tento IL-18BP je lidský protein.

7. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1-6, přičemž jeho io molekulová hmotnost je přibližně 40 kDa.

8. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, přičemž tento IL-18BP je fúzovaný protein.

15 9. Protein obsahující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1-8.

10. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 v solubilní formě.

11. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, přičemž tento 20 IL-18BP je neglykosylovaný.

12. DNA schopná hybridizovat za stringentních podmínek, nebo která by hybridizace za stringentních podmínek byla schopná nebýt degenerace genetického kódu, alespoň k jedné z DNA sekvencí

25 uvedených v SEQ ID NO:1, 3, 5, nebo 7, přičemž řečená DNA je schopná kódovat IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11.

-76 13. DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, včetně aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:10.

5 14. DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, včetně aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 10 opatřené na 3'konci stop kodonem.

15. DNA, která hybridizuje k DNA podle nároku 13 za stringentních io podmínek, nebo která by hybridizace za stringentních podmínek byla schopná nebýt degenerace genetického kódu, a která je schopná kódovat IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1-11.

16. DNA podle kteréhokoli z nároků 12 až 15 funkčně připojená

15 k jiným DNA sekvencím umožňujícím expresi, například promotorům, enhancerům a podobně.

17. DNA podle kteréhokoli z nároků 12 až 16, přičemž tato DNA je genomová.

18. DNA podle kteréhokoli z nároků 12 až 17, přičemž tato DNA je cDNA.

19. cDNA podle nároku 18 obsahující cDNA sekvenci vybranou ze

25 skupiny DNA sekvencí SEQ ID NO:1, 3, 5 a 7.

- 77 »9 9·9 ·

9 9 9

9 9 9 99 • · 9 · ·· ♦ · ·

9999« ·· • · · • 9W« ·

9 9

20. cDNA podle nároků 18 nebo 19, přičemž tato cDNA je přizpůsobena pro expresi v bakteriálním hostiteli.

21. Replikovatelný expresní vektor obsahující DNA podle 5 kteréhokoli z nároků 12 až 20.

22. Transformovaná hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 21.

io 23. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 22, přičemž tato buňka je eukaryotická.

24. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 22, přičemž tato buňka je prokaryotická.

25. Způsob produkce IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím,že zahrnuje pěstování hostitelských buněk podle kteréhokoli z nároků 21 až 23, za podmínek vhodných pro expresi řečeného IL-18BP, a izolaci tohoto IL-18BP.

26. Protilátka proti IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11.

27. Protilátka podle nároku 26, přičemž tato protilátka je polyklonální.

- 78 28. Protilátka podle nároku 26, přičemž tato protilátka je monoklonální.

29. Protilátka podle nároku 26, přičemž tato protilátka je anti5 idiotypová.

30. Protilátka podle nároku 26, přičemž tato protilátka je chimérní.

31. Protilátka podle nároku 26, přičemž tato protilátka je io humanizovaná.

32. Způsob izolace IL-18BP podle nároku 3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) průchod lidské tekutiny chromatografickou kolonou, ke které je 15 navázán IL-18, (b) eluci proteinu schopného vazby k IL-18, a (c) purifikaci řečeného proteinu.

33. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, 20 že obsahuje IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11.

34. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje virem kódovaný homolog IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11.

- 79 » * 9

999 • · ♦ · ♦ ♦ • · » 9 9 9 ♦ ·»····· *· · • ♦ 9 9 · 9 • 99 99

35. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1-11.

36. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 pro výrobu 5 farmaceutického prostředku, pro léčbu stavů vyžadujících aplikaci IL18BP.

37. Použití virem kódovaného homologu IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu io stavů vyžadujících aplikaci IL-18BP.

38. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 pro purifikaci IL-18.

15 39. Použití protilátek podle kteréhokoli z nároků 26 až 31 v testech pro detekci IL-18BP.

40. Použití DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 nebo virový homolog řečeného IL-18BP v genové terapii.

41. Použití DNA podle kteréhokoli z nároků 12 až 20 při výrobě IL18BP podle kteréhokoli z nároků 1-11.