CZ122697A3 - Preparations and methods of treating disseminated sclerosis - Google Patents

Description

Tato přihláška je částečně pokračovací přihláškou (continuati on-ín-part.) přihlášky č. USSN 08/328224, podané 25.10.1994. Je rovněž částečně pokračovací přihláškou přihlášky č. USSN 08/300811, podané 1.9.1994, která jc částečně pokračovací přihláškou přihlášky č. USSN 08/116824, podané 3.9.1993. Tato přihláška je rovněž částečně pokračovací přihláškou přihlášky č. USSN 08/241246, podané 10.5.1994. Uvedené přihlášky jsou zde jako celek zahrnuty formou odkazu.

Dosavadní stav techniky

Autoimunitní choroby jsou významným zdravotním problémem člověka a jsou relativně málo prozkoumány. Protože neexistuje žádný zjevný přímo odpovědný mikrob nebo virus, musí být prevence, léčba a diagnostika těchto chorob založena na jejich etiologií. Ta vždy zahrnuje komplexní řadu reakcí endogenních metabolických meziproduktů, strukturních komponent, buněk atd. S charakterem, autoirounitni poruchy však vždy souvisí představa, že při vzniku sledu událostí, které vodou k příznakům, musí být přítomen alespoň jeden autoantigen. Autoimunitní demyelinizujícl onemocnění, jako je skleróza multiplex (MS), nejsou výjimkou.

MS se obvykle vyskytuje ve formě recidivujících záchvatů, odrážejících leze v centrálním nervovém systému (CNS). Záchvaty se vracejí, ustupují a opět vracejí po mnoho let zdánlivě náhodně. Frekvence vzplanutí choroby je největší během prvních 3 až 4 let, ale po prvním záchvatu, který může být tak mírný, že unikne pozornosti lékaře a stěží se na něj lze rozpomenout, nemusí další následovat po dobu 10 až 20 let.. Míra zotaveni no episodě se mezi pacienty výrazně liší. Remi.se může být úplná, zejména po časných záchvatech; často je vsak remise neúplná a protože následuje jeden záchvat za druhým, následuje stupňovitý postup směrem dolů se zvětšujícím se trvalým deficitem. Klinický obraz MS je určován umístěním ložisek demyelinizace v CNS. Klasické znaky zahrnují, zhoršené vidění, nystagmus, špatnou výslovnost, snížené vnímání vibrací a polohový smysl, ataxii a chvění končetiny před dotykem, slabost nebo paralýzu jedné nebo více končetin, spást i citu a problémy s močovým měchýřem. Kriteria diagnózy klinicky určité MS musejí zahrnovat spolehlivou historii alespoň dvou episod neurologického deficitu a objektivní klinické známky léze na více než jednom miste CNS. Není známa účinná léčba MS. Současné terapeutické úsilí je zaměřeno na zlepšení akutních episod a prevenci relapsů nebo postupu choroby (Harrison's Principles of interna 1 Medicíno, 12. vyd., sv. 2, str. 2038-2043, McGraw Hill, 1991).

Obvykle užívaným zvířecím modelem pro lidskou sklerózu multiplex je experimentální alergická encenfalomyelitis (EAE), demyelinizující onemocnění centrálního nervového systému, které může být vyvoláno u náchylných kmenů myší imunizací myelinovým bazickým proteinem (MBP), proteolipidovým proteinem (PLP), myelinovým oligodendrocytovým proteinem (MOG) nebo syntetickými peptidy založenými na sekvencích těchto proteinů spojených s myelinem. MBP je jedním z předpokládaných autoanf.i genů při skleróze multiplex (MS) a byl cpitopově mapován jak v lidském

ÍOl.a a d., Nátuře, 346:183-18'/ (1990)), tak v hlodavčím (Zamvil a d., Náturo, 324:258-260 (1986)) systému. Peptidy, o nichž se soudí, že obsahují alespoň jeden epitop T buněk MBP (myelinového bazického proteinu), byly identifikovány v WO 93/2.1222, EP 0 304 279, WO 91/15225, Ota a d., Letters to Natnre, 346:183-187 (1990), Wucherpfennig a d., J. Exp. Med.,

170:279-290 {1994} . Další peptidy obsahují.cí epitop T buněk MBP jsou identifikovány v přihláškách, které jsou zde jako celek zahrnuty odkazem na USSN 08/328224, podanou 25.1 0.1994, a (ISSN

08/241246, podanou 10.5.1994. Peptidy MOG s aktivitou T buněk jsou identifikovány v USSN 08/300811, zahrnuté zde jako odkaz.

Proteolipidový protein (PLP) a myelin-asociovaný glykoprotein (MAG) se rovněž považují za možné autoantigeny při skleróze multiplex. Studie popisující patogenesi autoimunitni odpovědi na PLP při skleróze multiplex byly publikovány v Trotter ad., J. Neuroimmunol. 33:55-62 (1991); epítopy T buněk PUP byly popsány v Pelfrey a d., -J. Nevroimmuno 1. 46:3342 (1 993) . Studie popisující MAG jako potenciální autoantigen při skleróze multiplex jsou publikovány v Johnson a d., J. Neuroimmunol. 13:99-108 (1986).

Experimentální autoimunitni oncefalomyelitis (EAE) je autoimunitni choroba zprostředkovaná CD4+ T buňkami, která se některými. svými klinickými a hisL ologickýroi znaky podobá skleróze multiplex a slouží jako experimentální model pro tuto a jiné autoimunitni choroby. EAE je zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému, které vede k paralýze a jiným neurologickým, abnormalitám. Typicky je vyvoláváno čištěnými myelinovými proteiny a peptidy. Model EAE se nicméně intenzivně používá ke zkoumání mechanismů autoimunity a výzkumu potenciálních terapeutik pro autoimunitni choroby.

Jl.ž v roce 1965 bylo učiněno pozorování, že EAE je možno léčit podáváním MBP v neencefalitogenní formě, pravděpodobně vyvoláním imunologické nereaktivity nebo tolerance (Alvord,

33, Levine, S.E. a . , 197 7 Cl .i n . Exp.

pozorování byla mnoha výzkumníky,

E.C. a d., Ann. NY Acad. Sci., 1965, 122:3: d., Science, 1368, 161:1155, Bernard, C.C.A Immunol., 1977, 29:100). Tato dřívější v posledních několika letech doplněna

novorozencům	nebo
1 9 7 7 Cl i n .	Exp.
. Exp. Med.,	1989,
Acad. Sci.,	1991 ,

ukazujícími, že podávání MBP a peptidů Mí dospělým zamezuje EAE (Bernard, C.C.A., 197

Immunol., 1971, 29:100, Clayton, J.P. a d., J. Ex 169:1681, Smi lek, P.E. a d., Proč. Nat:'1 88:9633, Guar, A. a cl., Science 1992, 258:1491, Metzlcr, B. a

d., Int. Immunol. 1993, 5:1159, Miller, A. a d., (J.

cience,

Neuroiinnwnol. 1993, 46:73, Critchfield, J.M, a d.,

94, 263:1139, Miller, A. a d., Proč. Naťl. Acad. Sci. USA,

1992, 89:421). Tyto studie navrhují různé cesty podávání, zahrnující subkutánní, intraperitoneální, í.ntranasální , aplikaci. Vyvolání imunologické :vířat intravenózní aplikací peptidů bylo demonstrováno v různých systémech antigenů. Z mnoha zde intravenózní a orální nereaktivily u dospělých popisovaných důvodu existují omezení klinické použitelnosti orální, enterální nebo aerosolové aplikace autoantigenů, jako je nemožnost charakterizovat účinnou složku terapeutického přípravku, jakmile byla zavedena do žaludku, v důsledku následné enzymatické degradace v žaludku. S použitím těchto metod lze proto obtížně dosáhnout předvídatelných a reprodukovatelných terapeutických účinků, nemluvě o možnosti nepříznivých vedlejších účinků v důsledku dalšího zpracování terapeutika organismem, které nemusí být předvídatelné.

Mechanismus prevence choroby nebo vyvolání tolerance byl ve většině těchto případů připsán klonální anergii (Gaur a d., viz výše), periferální de.leci {Crítchfield a d., viz výše) nebo jiným formám antigenově specifické tolerance. Zdá se však, že dalším mechanismem, kterým může orálně podávaný MBP a MBP peptidy inhibovat EAE, je suprese, zprostředkovaná TGE-β (Mnllcr a d., víz výše v Proč. Naťl Acad. Sci.}. MBP peptidy, stejně jako substituované analogy MBP peptidů, byly zkoumány jako alternativní terapeutika pro EAE u myší PLJ, B10.P1, a (PLJ x 3áL) Fl. Emunodom.i.nant.n.im encefalitogenním pept.idem pro každý z těchto kmenů je MBP Acl-11, který je rozpoznáván ve vazbě na

AobAfi (Wraith, D.C. a d., viz výše). MBP Acl-11 byl intenzivně studován .substituční analýzou a byly stanoveny jeho požadavky na rozpoznávání T buněk a na vazbu k hlavnímu komplexu histokompatibi lity (major histocompatibil i ty comp.lex, MHO. Postranní řetězce zbytků 3 a 6 přispívají hlavně k rozpoznávání T buněk a postranní řetězce zbytků 4 a 5 převážně k vazbě na

MHC. Vazba MBP Acl-11 na Αα^υΛβ^υ může být dramaticky zlepšena různými substitucemi aminokyselin na zbytku 4, zahrnujícími alanin (Acl-1.1 [4A] ) a tyrosin (Acl-11[4Y]) (Wraith, D.C. a d., viz výše, Fairchild, P.J. a d., int. Immunol., 1993, 5:1151).

Zdá se, že substituce zbytku 4, zejména tyrosinem, zlepšují stabilitu komplexů peptid-MHC vzniklých s těmito peptidy. Acl11 [4A]) a Acl-11[4Y] si uchováváj í kontaktní zbytky pro receptory T buněk (TCR), nutné pro antigen.i citu, a jsou účinnější než MBP Acl-11 pří stimulaci MBP-spccifi ckýcli T buněk in vitro. A.cl-11 [4Y] je enoe fal it.ogenní také in vivo (Acl11 [4A] je z neznámých důvodů málo oucofviltogenní). Ukázalo že jak Acl-11[4A], tak Acl-Π [4Y] zabraňují EAE, a má se za že působí antigenově specifickými mechanismy (Smilek a d., výše, Wraith, D.C. a d., viz výše).

viz

V předchozích studiích bránily MBP peptidy nebo peptidové analogy, podávané v nekompletním adjuvans těsně před nástupem choroby, následnému vývoji EAE (Smilek a d., víz výše, Gaur a d., víz výše). Ve zvláštní studii s použi.tím lymfocytů z MBPspecifické TCR transgenni myši bylo zabráněno adoptivně přenášené EAE časným a agresivním podáním intravenózního MBP před nástupem klinických znaků (Cri tchf ie.l d a d., viz výše).

Tyto studie naznačily, že by bylo možno zabraňovat EAE injekční aplikací MBP peptidů poté, co byly aktivovány enccfalitogenní T buňky, ale netýkaly se otázky, zda by s použitím tohoto přístupu bylo možno zvrátil postupující paralýzu (a pravděpodobně aktivní zánět centrálního nervového systému) nebo zabránit relapsům po remisi. Kromě toho v některých dalších dřívějších experimentech byly pro účinnou léčbu nutné extrémně vysoké dávky MBP nebo MBP peptidu. Původci tohoto vynálezu jako první ve své dřívější přihlášce USSN 08/328224, podané 25.10.1994, ve které tímto pokračují, popsali zvrat paralýzy a zabránění relapsům po remisi. Od podání předchozí, přihlášky původců tohoto vynálezu v oboru, že injekčním odvozených od MBP je paralýzu u EAE (Karin zjistili také mnozí další pracovníci podáním určitých peptidových analogů překvapivě možno zvrátit postupující Exp. Mod., 180:2227-2237 (orosinec 1 9 9 4) .

Vynález odstraňuje výše uvedené nevýhody a poskytuje nové peptidy, přípravky a způsoby pro léčení sklerózy multiplex s použitím preparátů obsahujících alespoň jeden peptid se sekvencí aminokyselinových zbytků, která zahrnuje aktivitu T buněk MBP. Dále se vynález zabývá dosud nevyřešeným problčmem, že má-li být obecně použitelná, musí být léčba sklerózy multiplex s použitím peptidů nebo peptidových analogů účinná i tehdy, je-li aplikována později v průběhu nemoci nebo v jejím pokročilém stadiu, buď během remisí nebo během relapsů za postupu nežádoucí imunitní odpovědi.

Účelem vynálezu tedy je nalézt peptidy a kombinace peptidů, vhodné jako terapeutika pro sklerózu multiplex včetně prevence nástupu choroby. Dále je účelem vynálezu identifikovat profytakticky a terapeuticky účinné režimy dávek a způsoby aplikace identifikovaných proteinů, peptidů a peptidových analogů pro účinnou léčbu MS. Dále je účelem vynálezu identifikovat úspěšnou léčbu pro pozdní stadium MS, pro zabránění relapsům, zastaveni choroby a/nebo zvrat postupu MS,

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou izolované peptidy a kombinace peptidů, odvozených od myel i nových autoantigenů, j a ku a e MBP, MOG, P3.P a MAG, vhodné pro léčbu sklerózy multiplex, včetně profylaktických a terapeutických přípravků a způsobů pro léčbu sklerózy multiplex. Výhodné přípravky podle vynálezu zahrnují alespoň jeden izolovaný čištěný peptid, v podstatě prostý všech jiných polypeptidů a nečistot, zahrnující aminokyselinovou sekvenci myelinového aut.oantigenu, která má aktivitu T buněk. Terapeutický přípravek podle vynálezu jo schopen tlumit autoantigenově specifickou imunitní odpověď na myelinový autoantiqen v populaci lidi trpící cti sklerózou multiplex nebo náchylných k ní tak, že příznaky choroby jsou potlačeny, odstraněny nebo zvráceny a/nebo je zamezen nebo zpomalen nástup nebo postup příznaků choroby. Přípravky a způsoby podle vynálezu, jsou-li aplikovány v pokročilém stadiu choroby, zvrátí postupující paralýzu nebo jiné znaky choroby, jsou-li aplikovány během akutní fáze, nebo brání relapsu, jsou-li aplikovány během remise.

Znalosti, dostupné odborníkovi v oboru, tvoří zde zmiňovaná patentová a odborná literatura. Zde citované udělené patenty US, publikované přihlášky PCT a další publikace jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Předmětem vynálezu jsou izolované peptidy a jejich kombinace odvozené od myelinových autoantigenů, použitelné pro léčení sklerózy multiplex, a rovněž terapeutické přípravky a způsoby pro léčbu sklerózy multiplex. Zde používaný výraz „léčení sklerózy multiplex nebo „léčba sklerózy multiplex zahrnuje profylaktické ošetření savců náchylných k MS, léčbu při počátečním nástupu MS a léčbu veškerých „pokročilých stadií MS včetně relapsující-remitující MS, chronické progresivní MS, primární progresivní MS a benigní MS. Terapeutické přípravky podle vynálezu zahrnují alespoň jeden čištěný peptid, v podstatě prostý všech ostatních proteinů nebo nečistot a zahrnující definovanou sekvenci aminokyselinových zbytků myelinového antigenu majícího stimulační aktivitu T buněk, kterýmžto peptidem může rovněž být izolovaný peptid. Zde používaný vvraz „izolovaný se vztahuje na pepcid, kujiy je prostý všedi ostatních polypeptidu, nečíst.ot, výchozích látek nebo dalších látek a který je nekonjugován se žádnou další molekulou.

Výraz „peptid se podle vynálezu vztahuje ne definovanou sekvenci aminokyselinových zbytků, kterých je méně než aminokyselin nativního bí. 1 Rovinného antigenu. Délka peptidu podle vynálezu přednostně činí alespoň přibližně sedm, výhodně alespoň as.i 12 až 40 a zejména alespoň 13 až 30 aminokyselinových zbytků, přičemž tento peptid, je-li odvozen od bílkovinného antigenu, obsahuje méně aminokyselin než celý bílkovinný antigen, výhodně ne více než 75 % aminokyselinových zbytků celeno bílkovinného antigenu. Peptidy používané podie vynálezu mají aktivitu T buněk. Peptid mající „aktivitu T buněk může mít jednu nebo několik těchto charakteristik: a) schopnost vyvolat odpověď T buněk, například stimulaci (tj. proliferaci nebo sekreci lymfokinu), b) schopnost vyvolat nereaktivitu nebo sníženou reaktivitu T buněk příslušných subpopulací T buněk, takže se tyto buňky neúčastní stimulace imunitní odpovědi na útočící autoantigen (například prostreón.Tctviiíl anergie, tolerance nebo apoptózyj , cí schoonost modifikovat profil sekrece lymfokinu v porovnání s vystavením přirozeně se vyskytujícímu autoantigenu, d) schopnost vyvolat indukci T supresorových buněk a e) je schopen vyvolat tlumení příznaků autoimunitní choroby jakýmkoli mechanismem nebo fl je odvozen od nezúčastněného antigenu a má schopnost zjistit supresorové T buňky v místě myelinového autoimunitního ataku, což pak vede k utlumení imunitních odpovědí v místě myelinového autoimunitního ataku.

Peptidy zahrnující alespoň jeden epitop T buněk mají aktivitu T buněk a jsou schopny vyvolat odpověď T buněk, jako je stimulace T buněk (tj . prolíferace T buněk nebo sekrece lymfokinu! a/nebo jsou schopny tlumit autoantτgenově specifickou odpověď T buněk, což může vést k autoantigenově specifické nereaktivitě T buněk nebo ke snížené hladině autoantú.genově specifické reaktivity T buněk, dpi top T buněk je základní prvek nebo nejmenší jednotka rozpoznání receptorem T buněk, kde epitop zahrnuje aminokyseliny nezbytné k rozpoznání receptorů. Má se za to, že epitopy T buněk se účastní zahájení a trvání imunitní, odpovědi na antigen nebo autoantí.gen. Soudí se, že tyto epitopy T buněk spouštějí časné případy imunitní odpovědi na úrovni T pomocné buňky vazbou na příslušnou molekulu HLA na povrchu buňky vykazující antigen a stimulací relevantní subpopulace T buněk. Tyto případy vedou k proliferaci T buněk, sekreci lymfokinu, místním zánětlivým reakcím, příchodu dalších imunitních buněk na místo a aktivaci kaskády K buněk vedoucí k produkci protilátek. V případě autoimunitní choroby jsou produkovanými protilátkami protilátky proti autoantigenu, jako je MBP, což vede ke klinickými příznakům autoimunitní choroby.

Peptidy s definovaným složením aminokyselin, zahrnující cpitopy T buněk, mohou být identifikovány pro kterýkoli myelinový autoantigen včetně MBP, Jeden způsob zahrnuje rozdělení bílkovinného antigenu na nepřekrývající nebo překrývající se peptidy o požadované délce a syntézu, čištění a testování těchto peptidů za účelem zjištěni, zda zahrnují alespoň jeden epitop T buněk, různými testy (například testy proliferace T buněk, testy sekrece lymfokinu a studie nereaktivity T buněk). Při jiné metodě se pomocí algoritmu odhadují ty peptidy, které pravděpodobně zahrnují epi.topy T buněk, a pak se peptidy, odhadnuté pomocí algoritmu, syntetizují, čistí a testují v testech T buněk nebo ve studiích in v.ivo za účelem zjištění, zda tyto odhadnuté peptidy vyvolávají proliferaci T buněk nebo sekrecí lymfokinu nebo nereaktivitu T buněk, a budou tedy pravděpodobně obsahovat epitopy T buněk. Jak je diskutováno v mnoha výše citovaných dokumentech, může být aktivita lidských T buněk testována kultivací buněk, získaných od jedince, citlivého na autoantigen, jako je MBP, s peptidem odvozeným od tohoto antigenu a stanovením, zda jako reakce na peptid probíhá proliferace T buněk, měřená například příjmem tritiovaného thymidinu buňkami. Stimulační indexy pro odpověď T buněk na peptidy je možno vypočítat jako maximální počet za minutu (CPM) v reakci na peptid, dělený kontrolním CPM. Stimulační index (S.l.) T buněk rovný nebo větší než dvojnásobek, přednostně trojnásobek úrovně pozadí se považuje za „pozitivní”. Pozitivní výsledky jsou použity v analýze potenciální terapeutické účinnosti peptidů, diskutované dále a v příkladu 1 . Výhodné peptidy, používané podle vynálezu, zahrnují alespoň jeden

PC p J., L· PJ p buněk.

; ui ιλ j Λ L li PJ ci ..i Pd i i .4tT *“l 1— r—. T T -Ί 1—1 ·—. V“· 1 4- Γ-. VS 1 '1 T vi v cl iipjíju v i Pdp .i. i. u. x

Jeden z algoritmů pro nacházení peptidů se stimulační aktivitou T buněk je popsán v Rothbard, l^st Fórum in Viroloay,

Annals of tne Pasteur Institute, str. 518-526 (prosinec 1986),

Rothbard a Taylor, bmbo, 7:93-100 (1988), a EP 0 304 279. Tyto dokumenty popisují definování obecného schématu (algoritmu) pro vazbu peptidů na MHC třídy II, její statistický význam a korelaci schématu se známými epitopy I buněk, stejně jako jeho úspěšné použití při nacházení dříve neidentifikovaných epitopu T buněk různých bílkovinných antigenů a autoantigenů. Zdá se, že obecné schéma pro peptid, o němž je známo, že se váže na MHC třídy II, jak je uvedeno ve výše zmíněných dokumentech, obsahuje lineární strukturu, tvořenou aminokyselinou s nábojem nebo glycinem, za nímž následují dva hydrofobní zbytky. Po určení, zda peptid odpovídá obecnému schématu, může být testován na reaktivitu T buněk. Mezi další algoritmy, ktere byly použity k nalézání epitopů T buněk v dříve nedefinovaných bílkovinách, patří algoritmus popsaný v Margalít a d., J.

Immunol. 138:2213-2229 (1987), kter amfipatické spirály.

je založen na modelu

Dále mohou být stanoveny peptidy zahrnující „kryptické epitopy T buněk, které jsou rovněž použitelné ve způsobech a přípravcích podle vynálezu. Kryptické epitopy T buněk jsou ty determinanty v bílkovinném antigenu, které v důsledku zpracování a dodání nativního bílkovinného antigenu do příslušné molekuly MHC nejsou normálně odhaleny imunitním +· ι·ι τη <-i m D nrib η rl o? -p Vn v-t-. n η τ <' ί L· π im ! ί L-: r -r-, < ^;Γ 1λπτ^'\ U Ί h ttc 5 1‘ y υ ι, , U p/ i„ _1_ <A ',1 i 1 1 x UA | J-. _> ,L. J _ J.. y l_ _l_ <.· J *. f '_· J>_' _i_ L. £- -i- ‘I i JJ '-A I schopen vyvolat nereakti vitu T buněk a je-li subjekt tímto peptidem primárně imunizován, T Punky získané ze subjektu proliferuií in vitro v reakci na peptid nebo bílkovinný antigen, od něhož je peptid odvozen. Peptidy, které zahrnují alespoň jeden kryptický epitop T buněk odvozený od bílkovinného antigenu, se zde označují jako „kryptické peptidy. K potvrzení přítomnosti kryptických epitopů T buněk musí být použit test proliferace T buněk, jak je v oboru znám, při němž se '1 buňky, sensibilícované antigenem, kultivují in vitro v přítomnosti každého· peptidů zvlášť pro identifikaci buněčných linií T buněk, reaktivní peptidem. Peptid se pokládá za obsahující alespoň jeden kryptický epitop T buněk, je-li možno s daným peptidem identifikovat buněčnou linii T buněk a T buňky jsou při expozici peptidu a bílkovinnému antigenu, od něhož je peptid odvozen, schopny proliferace.

Navíc není nutné, vynálezu, byl odvozen aby peptid, od sekvence používaný způsobem pod] e aminokyselin myelinovélio autoant i genu, jako je MBP. Způsobem podle vynálezu může být. použit kterýkoli peptid, obsahující definovanou sekvenci aminokyselinových zbytků, který je schopen tlumit, antigenově specifickou imunitní odpověď na myelinový autoanti gen. Například mohou byt syntetizovány peptidy, zahrnující definovanou sekvenci aminokyselin nezaloženou na sekvencí aminokyselin myelinového antigenu, které jsou přesto schopny tlumit antigenově specifickou imunitní odpověď, například peptid simuluje epitop T buněk myelinového autoantígenu a způsobuje tlumení imunitní odpovědi na myelinový autoantigen, nebo způsobuje tlumení imunitní odpovědi z jiných důvodů, například protože je odvozen od nezúčastněného antigenu. Bez vázání se na určitou teorii se má za to, že nezúčastněné anti geny, které jsou rovněž tkáňově spéci f.i.cké (ale nejsou cílem imunitního nebo autoimunitního ataku) mohou mít. schopnost iniciovat supresorové T buňky v místě imunitního ataku, což může vést ke tlumení imunitních odpovědí v místě imunitního ataku (například zasažené „vlastní” i.káně v případě autoimunitního onemocnění nebo nosní slizníce, kůže a plic v případě alergie). Nezúčastnění antigeny zahrnuji., aniž by se na ně omezovaly, části, antigenu nebo autoantígenu, které samy nemsou cílem imunitního ataku a které mají supresorovou aktivitu v místě imunitního ataku. Zde používaný výraz „myelinový antigen” nebo „myelinový autoantigen zahrnuje nezúčastněné antigeny, které mohou mít supresorovou aktivitu v místě myelinového autoimunitního ataku.

Dále může být podle vynálezu použita kterákoli si oučeni na, která simuluje peptid schopný tlumit antigenově imunitní odpověď na myelinový autoantigen specifickou (napřiklad peptidické vazby (NH-U_tó [-CO-NCH3-] C_t(1) peptidomimetikum). Takováto sloučenina nemusí být tvořena zcela podj ednotkam.i. spojenými peptidickými vazbami, ale může být spojena i jinými vazbami (například thioesterovými vazbami, redukovanými analogy vazeb, isosterasami amidických vazeb), pokud nepeptidická sloučenina simuluje peptid schopný tlumíi antigenově specifickou imunitní odpověď na příslušný antigen, jak ukazuje účinné terapeutickč/proíylaktické ošetření příznaků. Peptidomimetika mohou být založena na kterémkoli peptidu podle vynalezu, ale mohou zahrnovat například analouv (n a p ř í k 1 a d N - rr. e t h y 1 a ra i d i c k é v a z t y a redukované analogy vazby (NH-C_a2 [-CH.-NH-] C₍-n) peptidických vazeb.

místo jedné nebo několika normálních

Jakmile byly identifikovány peptidy obsahující epilop T buněk, je rovněž možno modifikovat strukturu těchto peptidů pro použití podle vynálezu pro tlakové účely, jako je zvýšeni rozpustnosti (žádoucí zejména, má-lí být přípravek aplikován injekčně), zvýšení terapeutické nebo preventivní účinnosti (viz dále diskusi peptidovýeh analogů se zvýšenou vazbou MHC) nebo stability (například životnost ex vivo a odolnost vůči proteolytické degradaci in vivo] nebo pro usnadnění syntézy peptidů. Může být získán modifikovaný peptid nebo peptidový analog, v němž byla sekvence aminokyselin změněna v porovnání se sekvenci nativní bílkoviny, od niž je odvozen, nebo ve srovnání s nemodifikovaným peptidem, od něhož se odvozuje modifikovaný peptid, například substituci, delecí nebo adicí aminokyselin, za účelem modifikace imunogcnicity, zlepšení rozpustnosti peptidu nebo zvýšení snadnosti syntézy peptidu (například automatizovaná syntéza peptidů).

Peptid může být například modifikován tak, že alespoň zachovává, pokud nezlepšuje, schopnost tlumil autoimunitní odpověď při MS (například vyvoláním nereaktivity T buněk nebo snížením reaktivity 1 buněk) a současně si uchovává schopnost vázat. MIIC proteiny. V tomto případě je možno známými metodami stanovit kritické vazebné zbytky pro receptor T buněk (například substitucí každého zbytku a stanovením přítomnosti nebe absence reaktivity T buněk). Zbytky, které se ukázaly jako nezbytné pro .interakci s receptorem T buněk, mohou být modifikovány náhradou nezbytné aminokyseliny jiným, přednostně podobným zbytkem aminokyseliny (konzervativní substituce), jehož přítomnost se projevila jako zvyšující, snižující, avšak neeliminující, nebo neovlivňující aktivitu T buněk. Dá] e mohou být ty zbytky aminokyselin, které nejsou nezbytné pro interakcí s receptory T buněk, modifikovány náhradou jinou aminokyselinou, její?, zabudování může zvýšin, snížit, avša): neeliminovat, nebo neovlivňovat aktivitu T buněk, avšak neeliminuje vazbu na relevantní MHC. Dále mohou být peptidy podle vynálezu modifikovány náhradou aminokyseliny, která se ukázala jako nezbytná pro interakci s MHC proteinovým komplexem, jiným, přednostně podobným zbytkem aminokyseliny (konzervativní substituce), jehož přítomnost se ukázala jako zvyšující, snižující, avšak neeliminující, nebo neovlivňující aktivitu T buněk. Dále mohou být zbytky aminokyselin, které nejsou nezbytné pro interakci s MHC proteinovým komplexem, modifikovány náhradou jinou aminokyselinou, její?, zabudování může zvýšit, neovlivnit nebo snížit, avšak neeliminovat reaktivitu T buněk. Jako neomezující příklady výhodných substituci aminokyselin za nikoli nezbytné aminokyseliny jo možno uvést náhrady alaninem, kyselinou yiut.amovou nebo metůiyiamínokvsel i.nou. Například spis WO 94/06628 popisuje substituované peptidy, v nichž může být v podstatě každý zbytek ji i u o k vs o lim/ substi1 nov a n kon z e r v a 11 v n i am i. ne? ky s e í i nu u, ammokyse 1 i nou nenacházející se v přírodě nebo alaninem, a substituovaný peptid je přesto schopen tlumit antigenově

specifickou imunitní odpověď. Jiným příkladem je práce Karin a
d., J. Exp.	Afed. 18C	):2227-2237 (1 994), která popisuje	s t.udí e
s použitím /	nnunodominantního krysího epitopu MBP sc £	ickvenci
aminokyselin	87-99,	uvedenou na obr. 14. Tyto	3 Π 3 1 0 Q 7
představuj i	řadu 12	substituovaných peptidů na bázi s	: Θ K V Γ i C Θ
8 7 - 9 9, k t e i	e se cd	původního peptidů 67-99 liší	j edinou
substitucí /	daninem \	’ každé poloze peotidu 87-99. Tvto	studíc'

byly prováděny za účelem zjištění předpokládaných míst interakce imunodominantního peptidu s MHC a TCR u Lewisovy krysy, stejně jako pro nalezení modifikovaných peptidů se zlepšenými požadovanými charakteristikami pro potenciální terapeutické použití. Tyto studie ukázaly, že náhradou lysinu (K) v poloze 91 peptidu 87-99 alaninem (A) (viz 87-99[K>A1 na obr. 14) došlo k zamezeni a zvratu ΕΆΕ u Lewisových krys. Na základě této informace by bylo možno očekávat, že záměnou lysinu (K) za aianin (At v místě jediného lysinu (K) přítomného v peptidech, které ve své sekvenci. aminokyselin obsahují sekvenci 87-99, tj . MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 a MBP-2.6, všech znázorněných na obr. 2, by došlo rovněž ke zvýšení aktivity T buněk substituovaných peptidů. Například MBP-2.1, substituovaný alaninem (A) za lysin (Ki v poloze 10 peptidu MBP-2.1 (tj . IÍENPVVHEFANIVTPRTPPPSQGKi , může mít zvýšenou aktivitu T buněk, vedoucí ke zlepšeným terapeutickým vlastnostem oproti „rodičovskému peptidu MBP2.1.

Za účelem zvýšení stability a/nebo reaktivity mohou být peptidy rovněž modifikovány tak, aby obsahovaly v sekvenci antigenu jeden ne.bo více : přirozených aleJických obměn.

aminokyselin bílkovinného ped ymorf ismů, vyplývá j i cí ch

K získání modifikované bílkoviny nebo peptidu v rozsahu muže oyz aminokyselinou,

NJ rovněž provedena záměna nebo ddi.ee Dnepřrrozenou aminokyselinou nebo nearoinokyselinovými analogy. Peptidy podle vynál.ezu mohou být dále modifikovány s použitím polyethylenglykolové (PEG) metody podle A. Sehona a spolupracovníků (Wic a d., viz výše) za vzniku proteinu nebo peptidu, konjugovaného s PEG. PEG může být dále přidáván během chemické syntézy proteinu nebo peptidu podle vynálezu. Modifikace peptidů nebo jejich částí mohou zahrnovat také redukci/aikyláci (Tarr v Methods of Protein í.ion, J.E. Sil ve r ed., Humana Press, Clifton, 194 (1986), acylaci (Tarr, viz výše), chemickou rcr notár st r .

kondenzaci s vhodným nosičem (Mishell a Shiigi, ed., Sclect.

MeLhodn in Cellular Immunology, WH rreeman, San Francisco, CA (1980), patent US 4,939.239, nebo mírné působení formalinem (Marsh, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 41:199-215 (1971)).

K usnadnění čištění a potenciálnímu zvýšení rozpustnosti proteinů nebo peptidů podle vynálezu je možné k řetězci peptidu přidat reportérové skupiny. Například může být k peptidu přidán polyhistidin pro čištění peptidu afinitní chromatografií na i nobi.l i zovaném kovovém lontu (Hochul.i, E. a d., Bi o/Technol oqy, 6:1321 -1325 (1988:). Kromě toho mohou být, je-li to žádoucí, mezi reportérovou skupinu a aminokyselinové sekvence peptidu zavedena specifická místa štěpení endoproteasami k usnadnění izolace peptidů prostých irelevantních sekvencí. Za účelem potenciálně napomoci, správnému antigenovému zpracování epitopů T buněk v peptidu mohou být mezi oblasti rekombi.načne nebo synteticky vložena kanonická místa citlivá k proteasám, obsahující vždy alespoň jeden epitop T buněk. Během rekombinační konstrukce peptidu mohou být například mezi oblasti v peptidu vloženy dvojice nabitých aminokyselin, jako je KK nebo RR. Vzniklý peptid pak může být citlivý vůči štěpeni kathepsinem a/nebo jinými enzymy typu trypsinu za vzniku částí peptidu obsahujících jeden nebo více epitopů T buněk.

Dalším příkladem modifikace peptidů je substituce cysteinových zbytků přednostně serinem, threoninem, lcucinem nebo kyselinou glutamovou za účelem minimalizace dimerizace přes disulfidic.ké vazby. Déle mohou být peptidy modifikovány za účelem zvýšení rozpustnosti peptidu pro použití v pufrovaných vodných roztocích, jako jsou farmaceuticky přijatelné nosiče nebo ředidla, přidáním funkčních skupin k peptidu, termi.nální ch částí peptidu nebo nezahrnutím hydrofobních oblastí do peptidu. Například pro zvýšení. rozpustnosti mohou být ke karboxyt ernri nálnímu nebo ami notermi náiní mu konci nebo k oběma přidány nabité aminokyseliny nebo dvojice nebo triplety nabitých aminokyselin. Jako příklady nabitých aminokyselin je možno uvést argi nin (R) , lysin (K) , histidin (Η) , kyselina glutamovou (E) a kyselinu asparagovou (D) . Pro snadnost peptidové syntézy, například pro automatizovanou syntézu peptidů, může být žádoucí vypustit nebo nahradit aminokyseliny, které činí syntézu peptidů obtížnější nebo nákladnější. Například je-li N-terminální nebo C-terminální aminokyselina peptidů schopna cyklizace nebo může podléhat degradaci buď během syntézy peptidů nebo po ní, je možno takovou aminokyselinu vypustit nebo nahradit, nebo alternativně lze přidat jednu nebo více dalších aminokyselin pro „blokování méně žádoucí amino- nebo karboxyterminální aminokyseliny. Tyto přidávané aminokyseliny mohou být odvozeny od nativní proteinové sekvence nebo se může jednat o nenativní aminokyselinové zbytky. Pro zvýšení výše definované aktivity T buněk peptidů mohou být přidávány buď na aminoterminální nebo· na karboxyterminální konec peptidů nebo na oba další aminokyseliny. Tyto další aminokyseliny mohou být odvozeny od nativní proteinové sekvence nebo se může jednat o nenativní aminokyselinové zbytky.

Peptidové přípravky, podávané podle vynálezu, přednostně zahrnují. dostatečný procentický podíl. epitopú T buněk myelinového autoantígenu (tj. alespoň asi 20, výhodně asi 30, přednostně asi 40 a zejména asi 60 % nebo více) z celkové reaktivity T buněk vůči myelínovému aut.oantigenu v populaci jedinců, kteří reagují na autoantigen a kteří mají skl«ró;'.u multiplex (například alespoň 10, výhodně alespoň 20 jedinců) a jsou v přípravku obsaženy tak, že terapeutický režim podávání přípravku jedinci s MS podle vynálezu vede k tlumení autoimunitní odpovědí MS. Pro určení, zda peptid (v úvahu připadající výhodný terapeutický peptid) nebo kombinace v úvahu připadajících peptidů bude obsahovat dostatečné procento celkové reaktivity T buněk myelinového autoantígenu ke tlumení autoimunitní odpovědi MS v podstatném procentu populace jedinců s MS, je možno použít několika analytických schémat.

Podle jednoho analytického schématu (s použitím MBP jako příkladu) se peptidy obsahující epitopy T buněk roztřídí poule?

počtu linií mikrotitrové kultury MBP reagujících na peptidy obsahující epitop a podle počtu pacientů reagujících na ně. Protože frekvence MBP-specifických T buněk v PBL pacientů s MS může být velmi nízká, není často možné testovat všechny MBP peptidy na každém pacientovi s MS. Proto je vhodný následující postup pro stanovení nej vhodnějších terapeutických peptidů, který je dále popsán v příkladu 1, PBL se izoluji z krve a kultury jsou iniciovány v 96 jamkových mi.krot it rových plotnách. PBL se čistí ze vzorků čerstvé periferní krve (přibližně 7b ml) od pacientů s jednoznačnou MS pomocí Pí.cellová gradientu hustoty. Mikrotitrové kultury se iniciují 2xl0⁵ PBL na jamku a 10 pg/ml čištěného lidského míšního MBP v kultivačním médiu RPMI 1640, doplněném 5 % lidského séra AB, penicilinem streptomycinem a L-glut.aminem. Počínaje dnem 6 až 7 se kultury doplní IL?. (20 jedn./ml) a IL4 (5 jedn./ml). Po 11 až 13 dnech se mikrotitrové kultury promyjí, resuspendují v čerstvém médii u a rozdělí do 12 čerstvých mikrotitrových jamek. Jako buráky obsahující antigen se přidají autologní zmrazené PBT, v množství 5.10⁴ PBL na jamku. Screeningové antigeny se přidají dvojmo ke 12 opakovaným jamkám z každé mikrotitrové kultury. Jako negativní kontrola je vždy použito médium a jako pozitivní kontrola čištěný lidský rekombinační MBP v množství 10 pg/ml. Každý pacient je rovněž testován na reaktivitu s maximálně 4 MBP peptidy, každým v koncentraci l υ μΜ. Po 48 h se provádí pulsacc 0,75 gCi ³H-thym±dinu a po 6 až 16 h pulsace se provede odběr. Kultury se označí jako pozitivní pro každý peptid podle těchto kriterií: stimulační index větší než 3,0, změna CI’M větší nebo rovná 500 a standardní odchylka od průměru menší než změna CPM. Pro účely analýzy se dále kultury označí jako „peptid-pozitivní pouze tehdy, reagovaly-li současně na MBP a na peptid, a jestliže nereagovaly na více než jeden nepřekrývající se peptid. S každým MBP peptidem se přednostně testují skupiny asi '10' až 50 pacientů a každá skupina pacientů se testuje s maximálně čtyřmi peptidy. Peptidy se pak roztřídí podle těchto kriterií: 11 procento MBP pozitivních míkrotítrových kultur v každé skupině pacientů (celková reaktivita MBP), které byly rovněž pozitivní na jeden z MBP peptidů, 2) procento jedinců reagujících na MBP v každé skupině s alespoň jednou mikrotitrovou kulturou, která byla pozitivní na jeden z MBP peptidů, kde jedinec reagující na MBP je definován jako pacient s alespoň jednou mikrotitrovou kulturou, která byla pozitivní na MBP. Jednotlivé v úvahu připadající peptidy se pak vyberou, pokud 1) obsahují alespoň 5, přednostně alespoň 10 a zejména alespoň 20 % celkové reaktivity MBP a 2} reaktivita na ně se nachází u alespoň 20, přednostně alespoň 30, výhodně alespoň 40, zvláště alespoň 50 a zejména alespoň 60 % jedinců reagujících na MBP. Popřípadě je možno uvažovat další kriteria pro hodnocení peptidů, jako je index pozitivity pro daný peptid. Index pozitivity reprezentuje jak intenzitu odpovědí T buněk na peptid (S.I.í, tak frekvenci odpovědi 1' buněk na peptid v populaci jedinců, kteří reagují, na myelinový autoant.i gen. Například jak je znázorněno na obr. 15, index pozitivity 141-165 (MBP-4) je přibližně 2500, vypočteno na základě dat uvedených v přikladu 1. Střední hodnota 2.1. peptidu MBP-4 na pacienta reagujícího na MBP byla násobena procentem jedinců reagujících na MBP-4 v populaci pacientů reagujících na MBP.

Vysoce čištěné peptidy, v podstatě prosté všech jiných poiypeptidů a nečistot, s definovanou sekvencí, aminokyselinových zbytků, zahrnu j ící cli alespoň jeden epitop T buněk, používané v terapeutických přípravcích podle vynálezu, mohou být získány synteticky chemickou syntézou s použitími standardních metod. V oboru jsou známy různé metody chemické syntézy peptidů, jako je syntéza v pevné fázi, kt.erá je plně nebo poloautomatizována v různých komerčně dostupných syntetízátorech peptidů. Synteticky vyrobené peptidy je pak možno čistit, přednostně do homogenity, zejména do alespoň 90, výhodně alespoň 95 a zvláště alespoň 97 % čistoty v podstatě bez veškerých jiných poiypeptidů a nečistot, kteroukoli z mnoha met.od, známých ?. literatury pro čištění bílkovin.

Zvláště žádoucí jsou synteticky získané peptidy podle vynálezu o délce až přibližně 45 a přednostně až přibližně 30 aminokyselinových zbytků, protože zvětšení délky může vést k obtížím při syntéze peptidu. Peptidy větších délek mohou být získávány dále diskutovanými metodami rekombinace DNA,

Peptidy, použitelné pro způsob podle vynálezu, mohou být získávány rovněž metodami rekombinace DNA v hostitelské buňce, transformované sekvencí nukleové kyseliny kódující příslušný peptid. Jsou-ii získány rekorabinačními metodami, kultivují se hostitelské buňky, transformované nuklcovou kyselinu kódující požadovaný peptid, v médiu vhodném pro buňky a izolované peptidy mohou být od kultivačního média nebo hostitelských buněk nebo obojího čištěny metodami, známými v oboru pro čištění peptidů a bílkovin, zahrnujícími iontovýměnnou chromatografii, ultrafiltrací, elektroforézu nebo imunopurifikaci s protilátkami specifickými pro požadovaný peptid. Peptidy získané rekombinačně mohou být izolovány a čištěny, přednostně do homogenity v podstatě bez buněčného materiálu, jiných polypeptidů nebo kultivačního média, pro použití způsoby výše popsanými pro synteticky získané peptidy.

Sa určitých omezených podmínek mohou být peptidy získávány rovněž chemickým nebo enzymatickým štěpením vysoce čištěného úplného nebo nativního proteinu, v němž byla předem stanovena místa chemického nebo enzymatického štěpení a vzniklý štěpný produkt je reprodukovatelný. Peptidy s definovanými sekvencemi aminokyselin mohou být vysoce čištěny a izolovány do čistoty v podstat.ě bez jiných polypeptidů nebo nečistot, přítomných v produktu enzymatického nebo chemického štěpení, kterýmkoli z postupů, výše popsaných pro vysoce Čištěné a Izolované synteticky nebo rekombinačně získané peptidy.

Dále mohou být peptidy podle vynálezu používány v konjugátech, jaké jsou popsány například v patentu JS í,130.297 ( prostředky s kde X předst harmn a d. ) , kde se připravují terapeuticko použit.ím vzorce X-MHC-peptid nebo MHC-pepl.id-X, vuje funkční skupinu vybranou z toxinů a značících skupin, MHC je účinná část MHC glykoproteinu, který je disociován z buněčného povrchu, na němž normálně spočívá, a „peptid představuje kterýkoli ze zde uvedených peptidů, zejména MBP nebo MOG a zvláště peptidy uvedené na obr. 2 a 14,

Dále zahrnují výhodné peptidy podle vynálezu alespoň jeden epitop T buněk úplného proteinu, zejména MBP nebo MOG. Peptidy mohou obsahovat tandemové repetice jednoho epitopu a/nebo více než jednoho epitopu.

V souladu se zde popsanými postupy pro identifikaci peptidů obsahujících aktivitu T buněk MBP (viz diskusi výše a dále v příkladu 1) jsou výhodnými peptidy peptidy odvozené od MBP, připadající v úvahu pro terapeutické použití, například peptidy MBP-1, MBP-2, MBP-3, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2, nebo kterákoli jejich část nebo modifikace. Tyto peptidy byly testovány na aktivitu T buněk způsobem popsaným v příkladu 1 a ukázalo se, že obsahují alespoň jeden epitop T buněk, jak ukazuje poměr MBP pozitivních mikrotítrových kultur, které byly rovněž pozitivní na jeden z MBP peptidů (obr. 4a), a dctekovatelná odpověď na každý z výhodných peptidů ve významném procentu testovaných MBP pacientů (obr. 4b). Nejreaktivnější z těchto čtyř peptidů je MBP-4 (1.41-165), na nějž připadá 21 % celkové odpovědi MBP a je detekovatelný v 64 % testovaných pacientů, reagujících na MBP. MBP-4 překvapivě vykazoval dramaticky větší reaktivitu než jsou spojené reaktivity MBP 141-160 a MBP 151-170, jak je znázorněno na obr. 3. Původci tohoto vynálezu jako první identifikovali tento imunodominantní peptid, který, jak se zdá, obsahuje vícenásobné epitopy T buněk. Tento nový peptid je zvlášť vhodný pro terapeutické použití.

Jako vhodné peptidy, připadající v úvahu pro terapeutické použití, se dále jeví MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6 a MBP-3.1, znázorněné na obr. 2. Tyto peptidy jsou modifikovanými verzemi MBP-1, MBP-2, resp. MBP-3, a očekává se, že budou mít podobnou aktivitu T buněk jako jejich příslušné „rodičovské peptidy. Tyto peptidy byly

2!

modifikovány vypuštěním a/nebo přidáním aminokyselin v souladu s výše popsanými metodami modifikace peptidů, zejména za účelem snadnosti syntézy.

Jiné peptidy, které se ukázaly jako imunodominantnl (tj. mají aktivitu T buněk MBP) nebo byly odvozeny od peptidů se známou aktivitou T buněk MBP, byly identifikovány původci tohoto vynálezu nebo jinými pracovníky v tomto oboru (viz například USSN 08/328224, datum podání 25.10.1994, USSK

05/241246, datum podání 10.5.1994, WO 93/2122

EP 0 304

91/1522Í

O:

Let tors ture

6: 1 8 3

Wuchterpfenning a d., J. Exp. Med., 170:279-290 (1994), Martin a d., J. Immunol.., (1990) 145:540-548), Karin a d., <J. Exp.

Med. 180:2227-2237 (1994)). Takovéto peptidy mohou být rovněž vhodné pro terapeutické použití v přípravcích a způsobech podle vynálezu, zejména v kombinaci s výše popsanými výhodnými peptidy. Takové peptidy zahrnují, avšak neomezují se na ně, tyto celé peptidy nebo jejich části, kde čísla zbytků odpovídají, aminokyselinovým zbytkům lidského MBP proteinu, znázorněného na obr. 1 a majícího jednotlivé sekvence aminokyselin, znázorněné na obr. 14: 13-25, 31-50, 61-80, 8292, 82-96, 82-97, 82-98, 82-100, 82-100[P>Y], 83-100, 83-101,

84-97, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 87-99[91K>A], 88-100, 8899, 111-1 35, 1.22-140, 139-1.70, 1 41-160, 142-1.66, 142-168, 1.461 6 0 a 15 3-17 výhodně 13-25, 87-99, 87-99[91K>A], 82-100, 82Vvh

1.0011 OOP>YJ , znázorněné na obr. 14. peptidů nebo výhodné modifikace mají výhodně podobnou nebo větší aktivitu T buněk ve stejném nebo větším procentu testovaných pacientů a/nebo mají podobnou nebo větší terapeutickou účinnost při způsobech podle vynálezu než „rodičovský peptid, z něhož byl modifikovaný peptid odvozen.

v 1 1 '--o '- j. i ne časti těchtc

Předmětem vynálezu jsou v jednom aspektu terapeuticko přípravky zahrnující alespoň jeden peptid odvozený od myeiinového antigenu s aktivitou T buněk nebo kombinaci peptidů odvozených od myeiinového antigenu, z nichž každý má aktivitu T buněk, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Výhodné terapeutické přípravky zahrnují dostatečné procento aktivity T buněk myelinového autoantigenu, takže jsou-li podány MS pacientovi v terapeutickém režimu, přednostně v neimunogenní formě, jsou schopny tlumit Imunitní odpověď specifickou pro myelinový autoantigen v populaci lidí náchylných k takovéto antigenově specifické imunitní odpovědi. Zde používaný výraz „tlumení” zahrnuje, avšak neomezuje se na ně, zamezení počátečnímu nástupu při znaků choroby, omezení příznaků sklerózy multiplex způsobených antigenově specifickou imunitní odpovědí na MBP nebo. jiný myelinový autoantigen, zejména snížení, obrat, nepostupování nebo zmírnění příznaků. Nepostupování může být charakterizováno, aniž by se však na ně omezovalo, jako (a) kratší období aktivní choroby nebo exacerbace, (b) méně vážné příznaky nebo postižení, (c) zdržení postupu nemoci, při němž se základní zdravotní stav nehorší tak rychle, (d) prodiouž.ení doby mezi obdobími aktivní choroby nebo exacerbace (například delší období remisí) (e) méně relapsů nebo exacerbací a/nebo (f) zpomalení nebo zastavení postupu zatížení lézemi, detekovaného MRI. Další způsoby hodnocení, používané odborníky v příslušném oboru, zahrnují bodovací systémy Expanded Disability Status Scale (ED5S>, Neurological Rating Scale a jiné metody. Zde používaný výraz „pokročilé stadium” označuje kterýkoli okamžik po jasných klinických znacích zjevné choroby, ať už se jedná o relapsujícl-remitujicí MS, chronickou progresivní MS, benigní MS nebo primární progresivní MS. Kromě této definice může „pokročilé stadium zahrnovat akutní fáze, remise a exacerbace. Zde používaný výraz „akutní fáze znamená nastupující záchvat, akutní chorobu, aktivní chorobu a exacerbací, kteréžto výrazy se používají vzájemně zaměnitelně. Tyto zde používané výrazy se obecně vztahují na stav, kdy subjekt trpící chorobou (ať diagnostikovanou či nikoli) vykazuje aktivní příznaky nebo znaky, obvykle považované odborníky za spojené se specifickou imunitní odpovědí charakteristickou pro sklerózu multiplex. „Relaps znamená akutní fázi, která následuje po remi.sí. Výraz exacerbace, je-li použit v příslušném kontextu, může být také interpretován jako nové a zhoršující se příznaky nebo znaky. „Příznaky jsou ty indicie choroby, na které si pacient stěžuje. „Znaky jsou indicie pozorované nebo naměřené diagnostikem. Výrazy příznaky a znaky se však zde používají vzájemně zaměnitelně, není-li uvedeno jinak.

Terapeutické přípravky podle vynálezu přednost.ně zahrnují alespoň jeden pept.id nebo modifikovaný peptid nebo analog peptidu, obsahující epitop T buněk, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlu. Tyto přípravky mohou přednostně obsahovat MBP peptid zvolený z této skupiny peptidů: MBP-1, MBP-1.1, ΜΗΡΙ. 2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, výhodně peptid zvolený ze skupiny zahrnující MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5 a zejména je MBP peptidem MBP-4.

Přípravky podle vynálezu mohou zahrnovat alespoň dva peptidy (například fyzikální směs alespoň dvou peptidů), z nichž každý má aktivu T buněk a přednostně zahrnuje alespoň jeden epitop T buněk myelinového autoantigenu, jako je MBP. Tyto přípravky mohou být podávány ve formě terapeutické kompozice farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Terapeuticky účinné množství jednoho nebo více těchto přípravků může být. jedinci trpícímu MS podáváno současně nebo postupně. Výhodné piíprnvky zahrnují alespoň jeden a přednostně alespoň dva peptidy vybrané ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-].l, MBPMB1

MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MRP-2,4, MBP-2.5, MBP2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2, výhodně ze skupiny zahrnující MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2.1, MBP2.2, MBP-2.2, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5 a zejména ze skupiny zahrnující MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP5. Dále mohou přípravky podle vynálezu navíc obsahovat peptidy odvozené od MBP, obsahující zbytky, jejichž čísla odpovídají aminokyselinovým zbytkům lidského MBP proteinu, znázorněného na obr. 1, a obsahující jednotlivé sekvence aminokyselin, uvedené na obr. 14: 13-2 5, 31-50, 61.-80, 82-92, 82-96, 82-97, 82-98,

32-100, 82-100[100Ρ>Υ], 83-100, 83-101, 84-97, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 87-99[91Κ>Α], 88-100, 88-99, 111-135, 122-140, 139-170, 141-160, 142-166, 142-168, 146-160 a 153-170, a výhodně obsahují tyto peptidy: 13-25, 87-99, 87-99[91K>A], 82100, 82-100[100P>Y]. Přednostně obsahují přípravky podle vynálezu alespoň dva peptidy, kde alespoň jeden peptid je MBP-4 a alespoň jeden peptid je zvolen z této skupiny peptidů: MBP-Í, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2,3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1 a MBP-5, znázorněných na obr. 2, a dále mohou zahrnovat alespoň jeden z následujících peptidů, odvozených od MBP, znázorněných na obr, 14: 13-25, 3150, 61-80, 82-92, 82-96, 82-97, 82-98, 82-100, 82-100[100P>YJ, 83-100, 83-101, 84-97, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 8799[91K>A], 88-100, 88-99, 111-135, 122-140, 139-170, 141-160, 142-168, 146-160 a 153-170, a zejména alespoň jeden z těchto peptidů: 13-25, 87-99, 87-99[91K>AJ, 82-100, 82-100[100P>Yl.

Výhodné přípravky podle vynálezu zahrnují tyto peptidy:

MBP-1, MBP-2, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.1 a MBP-4;

MBP-1, MBP-2.1 a MBp-4;

MBP-1.1, MBP-2 a MBP-4;

MBP-1.1, MBP-2.1 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.1 a MBP-3;

MBP-1 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

MBP-1.1 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-i nebo MBP1.1;

MBP-1.1, MBP-4 a peptid vyhraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[1OOP>Y1, 87-99 a 87-99[91K>AJ, znázorněné na obr. 14;

MBP-1.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2;

MBP-1.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>Y], 87-99 a 87-99[91K>A], znázorněné na obr. 14;

MBP-1.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2;

MBP-1.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>YJ, 87-99 a 87-99(91K>A], znázorněné na ob r. 14;

MBP-1.1, MBP-3, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2.

Vynález rovněž zahrnuje léčebný režim, zahrnující podávání kombinaci terapeuticky účinných peptidů jako jednorázovou léčebnou episodu. Tyto kombinace peptidů mohou být podávány současně nebo postupně jako terapeutické přípravky zahrnující pouze jeden peptid nebo několik peptidů. Tento léčebný režim nemusí nutně zahrnovat fyzikální směs více než jednoho peptidu, ale zahrnuje kombinací peptidů, podávaných současně nebo postupně jako jednorázová léčebná episoda. Přednostní, kombinace peptidů i ve formě jednoho nebo více přípravků, z nichž každý zahrnuje jeden nebo více peptidů), které mohou být podávány současně nebo postupně jako jednorázová léčebná episoda, zahrnují tyto kombinace peptidů:

MBP-1, MBP-2, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2.·;, MBP-4 a MBP-5;

MBP-1.1, MBP-2 a MBP-4;

MBP-1

MBP-1

MBP-1

MBP-1

MBP-1

MBP-2

MBP-1

MBP-2

MBP-2.1

1, MBP-2 i, MBP-2

1, MBP-2 a MBP-4;

a MBP-4;

i a MBP-5;

a MBP-3;

a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, 2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, 2, MBP-2.3, MBP-2,4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

MBP-2.1,

MBP-2.1,

MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1 nebo MBP1.1;

MBP-1.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>¥), 83-99 a 87-99[91K>A], znázorněné na obr. 14;

MBP-1.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2;

MBP-1.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>Y], 87-99 a 87-99[91K>A], znázorněné na obr. 14;

MBP-l.1,	MBP-5,	MBP-4 a	peptid vybraný	ze skupiny zahrnující
MBP-2.2,	MBP-2.3	, MBP-2.	4, MBP-2	.5 nebo	MBP-2.6, znázorněné na
obr. 2;
MBP-1.1,	MBP-5,	MBP-4 a	peptid	vybraný	ze skupiny zahrnující
82-100,	82-100[100P>Y],	87-99 ;	i 87-99[91K>A], znázorněné na
obr. 14;
MBP-l.1,	MBP-3,	MBP-4 a	peptid	vybraný	ze skupiny zahrnující
MBP-2.2,	MBP-2.3	, MBP-2.	4, MBP-2	.5 nebo	MBP-2.6, znázorněné na
obr. 2.

Dále mohou výhodné přípravky a výhodné kombinace MBP peptidů, které mohou být podávány současně a/nebo postupně, zahrnovat kterýkoli z výše uvedených přípravků a navíc mohou dále obsahovat peptid, obsahující alespoň jeden epitop T bunčk, odvozený od myelinového oligodendrocytového proteinu (MOG), což je další protein, považovaný ze jeden z autoantigenů účastnících se při skleróze multiplex

Immunol. (1976) 116:1439-1446, Lebar a (1986) 66:423-443, Linington a Lassman, J. Neuroiiniatinol. (1987:

17:61-69, Lassman a d., Aot.a Neuropathol. (Berl) (1988) 75:566576, a Sun a d., J. Immunol. (1991) 14 6:14 90-14 95). Peptidy, které mohou zahrnovat epitopy T buněk odvozené od MOG, jsou popsány v LSSN 08/116824 , datum podání 3.9.(1993, a 1.JS3N (viz Lebar a d., ,7.

d., J. Exp. Tmmunol.

08/3008.1 1, ouLuiti podání 1.9.1004 (zcle zahrnuty nich možno očekávat, že budou účinné při léčbě sklerózy multiplex, připravují a/nebo podávají-]i se ve spojení s výše uvedenými přípravky a kombinacemi peptidů obsahujících epitop buněk T MBP podle vynálezu, jsou:

lidský MOG 1-13	GQFRV1GPRHPIR
lidský MOG 103-115	HSYQEEAAMELKV
lidský MOG 1-121	GQFRV1G PRII Pí RALGDE V

RLPCRTSPGKNATGMEVGWY R Ρ P F S RW H LY R NGK DQ D G D Q A1Έ Y R GRT F, LL KDAIGE GK

VTLRIRNVRF5DEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

Další peptidy MOG s obsahem epitopů byly identifikovány původci tohoto vynálezu s použitím experimentální analýzy podobné, jaká je popsána výše a v příkladu 1 (data neuvedena) a

zahrnuj i
1]dský	MOG	1-20	GQFRVTGPRHPIRALVGDEV,
1ids ký	MOG	í 1-30	PÍPALVGDEVELPCRISPGK,
lidský	MOG	2.1 -JO	EL PG RI3 PGKNATGMEVGWY,
lidský	MOG	31-50	NATGMEVGWYRPPFSRWHL,
lidský	MOG	141-160	TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,
lidský	MOG	151-170	YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,
lidský	MOG	161-180	IENLHRTFDPHELRVPCWKI a
lidský	MOG	199-218	YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.

Vynález dále zahrnuje modifikace nebo analogy diskutované dříve) výše uvedených MOG peptidů obsahujících epitop T buněk, které si uchovávají podobnou nebo větší aktivitu T buněk než rodičovský peptid, z něhož je modifikace nebo analog odvozen.

Má se za to, že přípravky zahrnující jak peptidy MOG, tak MBP, obsahující epitopy T buněk, jejich modifikace, jejich analogy nebo poptidemi-meti ka na jejicn oazr a kombinace těchto peptidů, které mohou být podávány současně nebo postupně, mají výhodu maximalizace tlumícího účinku na T buňky, specifické jak pro MBP, tak MOG, účastnící se autoimunitni. odpovědi při MS. Tímto způsobem je možno zacílit na rozmezí T buněk, které se mohou účastnit autoimunitni odpovědi buď na MBP nebo MOG vedoucí ke klinické manifestaci MS (demyelíni.zaci) , pro utlumení, a tudíž zvýšení terapeutického účinku sloučenin a n u·, ř-ΐ Ί způsoby podle vynálezu vhodné peptidy, být pro přípravky a obsahující epitop '!’ buněk, odvozené od jiných myelmových antigenů, považovaných za autoantigeny při MS (například proteolípidový protein (PLP) a m y o 1 i n—a s o <1 aný glykoprotem (MAG) .

Terapeut ický/profylaktický režim podle vynálezu (který vede ke zvratu, prevenci nebo odložení nástupu příznaků choroby, vyvolaných útočícím auloantígenem, nebo ke snížení, nepostupování nebo zmírnění příznaků vyvolaných útočícím autoanligenem, t j . ke tlumení imunit.ní odpovědi, specifické pro autoantiger.) zahrnuje podávání terapeutického přípravku podle vynálezu, zahrnujícího alespoň jeden izolovaný peptid, odvozený od autoantigenu, odpovědného za ošetřovaný chorobný stav (například MBP, MOG, PLP, MAG), v neimunogenní formě. Bez úmyslu vázat se na nějakou teorii se má za to, že podávání terapeutického.' přípravku podle vynálezu může a) vyvolat nereaktivitu T buněk příslušných subpopulací T buněk, takže nereagují na útočící antigen a neúčastní se stimulace Imunitní odpovědi při expozici útočícímu bílkovinnému antigenu (prostřednictvím anergie nebo apoptózy), b) modifikovat profil sekrece lymfokinu v porovnáni s expozicí útočícímu autoantigenu, c) způsobit, že subpopuiace 1 buněk, které se normálně účastni odpovědi na útočící antigen, se stáhnou z míst normál.ní expozice k místům podání přípravku (tato redistribuce subpopulací T buněk může zlepšit nebo sní.žít schopnoso i.munitního systému jedince stimulovat obvyklou imunitní odpověď v místě normální expozice útočícímu antigenu, což vede ke snížení. nebo zvratu příznaků), d) způsobit indukci 1 supresorových buněk nebo e) způsobit indukci supresorových buněk pomocí nezúčastněného antigenu.

Vysoce čištěné a izolované peptidy, získané výše popsaným způsobem, mohou být formulovány do terapeutických přípravků podle vynálezu, vhodných pro humánní terapii. Má-li se terapeutický přípravek podle vynálezu podávat injekčně (napříkl ad subkutánně, intrzivenózně) , je výhodné, aby vysoce čištěný peptid byl rozpustný ve vodném roztoku pří farmaceuticky přijatelném pH (tj. rozmezí pH asi 4 až D) tak, aby byl přípravek tekutý a snadno aplikovatelný jehlou. Přípravek rovněž přednostně zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič. Zde používaný výraz „farmaceuticky přijatelný nosič” z uh i n u j e } a n a ko i i a v e s kc r a v eh i ku 1 a, r o ζρο u s L edi a, d i sper zni prostředí, povlaky, antibakteriální a protipiísnové prostředky, prostředky pro úpravu toxicity, pufrovací prostředky, prostředky zpožďující nebo posilující absorpci, povrchově aktivní látky a micelotvorné prostředky, lipidy, liposomy a prostředky pro tvorbu kapalných komplexů, stabilizátory apod. Použití těchto prostředí, a prostředků pro farmaceuticky účinné látky je v oboru známé. Pro použití v terapeutických přípravcích připadají v úvahu všechna běžná prostředí a prostředky, pokud nejsou inkompntíbilni s účinnou sloučeninou. V přípravcích mohou být zahrnuty daísí účinné sloučeniny.

Jak výše uvedeno, terapeutické přípravky podle vynálezu, vhodné pro injekční použi.tí, jsou přednostně sterilní vodné roztoky, připravené zabudováním účinné sloučeniny (tj. jednoho nebo více výše popsaných vysoce čištěných a izolovaných peptidů) v požadovaném množství. do příslušného vehikula s jednou nebo kombinací výše a dále uvedených složek podle potřeby s následnou sterilní filtraci. Mezi výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče patří alespoň jedno vehikulum, jako je sterilní voda, fosforečnan sodný, mannitol, sorbitol nebo chlorid sodný nebo jakákoli jejich kombinace. Mezi další vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče patří rozpouštědla nebo disperzní prostředí, obsahující například vodu, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol x VA O·' -J \ ‘i-· ·“· * i r ^u vhodné óniěsi a rostlinné oleje.

úpravnou

Prevence různými aktivních látek, možno dosáhnout tekutost je možno udržet například použitím povlaku, jako je lecithin, dodržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím povrchově působení mikroorganismů je antibakteríálními a protiplísňovými prostředky, jako jsou například parabeny, chlorbutanol, fenol, kyselina askorbová, thírmerosol apod. Prodloužené absorpce injekčních přípravků je možno dosáhnout zahrnutím prostředku, který zpožďuje absorpci., například aluminujmmonostearátu a želatiny.

Výhodné terapeut i.cké přípravky podle vynálezu by měly být sterilní, stabilní za podmínek výroby, skladování, distribuce a použití a měly by být chráněny před kontaminujícím působením mikroorganismů, jako jsou bakterie a plísně. Výhodný způsob přípravy terapeutického přípravku, který zachovává integritu přípravku (tj. brání kontaminaci, prodlužuje skladování atd.) spočívá v přípravě formulace peptidu a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo nosičů, takže přípravek může být ve formě lyofilizovaného prášku, který je těsně před použitím rekonstituován ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jako je sterilní voda. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků jsou výhodnými metodami přípravo vakuové sušení, vymrazovací sušení nebo spinové sušení, které poskytuje prášek účinné složky plus jakékoli další požadované složky z jejich předem sterilně přefiltrovaného roztoku.

terapeutický vhodnou pro

Jak je výše uvedeno, terapeutický přípravek podle vynálezu může zahrnovat více než jeden izolovaný peptid. Pro podávání několika aktivních peptidů může být žádoucí přípravek zahrnující multipeptidovou formulaci farmaceutické podávání lidem. Multipeptidové formulace zahrnuje alespoň dva nebo více izolovaných peptidů s definovanou sekvencí aminokyselin a je schopna tlumit antigenové specifickou imunitní odpověď. Jako multipeptídová formulace může být. vhodný kterýkoli z výše popsaných přípravků, které zahrnují alespoň dva peptidy. Jak výše uvedeno, vysoce výhodné peptidy, < no oř ie ρ i. o ρυ u z. ± o ± v illu i t r p ep l ido v é i o rmu i a o i , zahrnují alespoň dva z těchto peptidů: MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2,

MBPMBP

1, MBP-2.2, MBP-2.3,

MBP-2 .4,

MBOMBP-2.6,

MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5. Zvláštní úvahy při přípravě multipeptidové formulace zahrnují uchování rozpustnosti a stability všech peptidů ve formulaci ve vodném roztoku při fyziologicky přijatelném pH. To vyžaduje volbu jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných rozpouštědel a vehikul, která jsou kompatibilní se všemi peptidy v multipeptidové formulací. Vhodná vehikula například zahrnují sterilní vodu, foslorečnan sodný, mannitol nebo současně fosforečnan sodný a mannitol. Další úvaha v případě multipeptidové formulace zahrnuje prevenci di.mcrizace peptidů, je-li to nutné.

Podáváni výše popsaného terapeutického přípravku jedinci v neimunogenní formě je možno provádět s použitím známých postupů v dávkách a po dobu účinnou pro tlumení imunitní odpovědi jedince léčeného na MS, specifické pro antigen MBP. Tlumení antigenově specifické imunitní odpovědi na antigen související s chorobným stavem u lidí může být. stanoveno klinicky, je-li to možné, nebo subjektivně (tj. pacient cítí, jako by se zmírnily některé nebo všechny příznaky související s chorobným szavem)

Účinné množství terapeutických přípravků podle vynálezu se může lišit podle faktorů, jako je stupeň citlivosti jednice na antigen, věk, pohlaví a hmotnost jedince a schopnost peptidu vyvolávat tlumení antigenově specifické imunitní odpovědi u jedince. Terapeutický přípravek podle vynálezu může být podáván v neimunogenní formě vhodným způsobem, například injekčně (subkutánně, intravenózně apod.), orálně, subi.i ngválně, inhalačně, transdermálně, rektálně nebo kteroukoli kombinací aplikačních cest za účelem zvýšeni terapeutické účinnosti, nebo kteroukoli jinou aplikační cestou, známou pro podávání terapeutických přípravků. Může být žádoucí podávat jedinci současně nebo postupně terapeuticky účinné množství jednoho nebo více terapeutických přípravků podle vynálezu. Každý z těchto přípravků pro současné nebo postupné podávání může zahrnovat pouze jeden peptid nebo výše popsanou multipeptidúvuu formulaci .

E^Jro podávání peptidu nebo peptidového přípravku jinou než parenterální cestou může být nutné peptid za účelem zamezení jeho inaktivace povléci určitou látkou nebo jej s ní podávat současně. Peptidový přípravek může být například podáván současně s inhibitory enzymů nebo v liposomcch. Inhibitory enzymů zahrnují inhibitor pankreatického trypsinu, diisopropylfluorofosfát (DEP) a tiaaylol. Liposomy zahrnují emulze CGF voda v oleji ve vodě, stejně jako konvenční liposomy (Strejan a d. (1984), J. Neuroimmunol, 7:27). Je-li peptid vhodně chráněn, jak je popsáno výše, může být podáván orálně, například s inertním ředidlem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem, Peptidový přípravek a další složky mohou být rovněž uzavřeny v želatinové kapsli s tvrdým nebo měkkým obalem, lisovány na tablety nebo zabudovány přímo do jedincovy diety. Pro orální terapeutické podávání může být účinná sloučenina zabudována do vehikul a používána ve formě polykatelnýcn tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek apod. Tyto kompozice a přípravky by měly obsahovat alespoň 1 % hmotnostní účinné sloučeniny. Procentický podíl kompozice nebo přípravku se může samozřejmě měnit a výhodně může činit mezi asi 5 a 80 % hmotnosti jednotky. Množství účinné sloučeniny v těchto terapeuticky použitelných přípravcích je takové, aby bylo dosaženo vhodného dávkování. Výhodné kompozice nebo přípravky podle tohoto vynálezu se připravují tak, aby orální dávková jednotka obsahovala mezi asi 10 pg a asi 200 mg účinné sloučeniny. Tablety, pastilky, pilulky, kapsle apod. mohou rovněž obsahovat: pojivo, jako je tragant, arabská guma, kukuřičný škrob nebo želatina, vehikula, jako je fosforečnan divápenatý, desintegrační prostředek, jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová apod., mazivo, jako je stearát hořečnatý, a sladidlo, jako jo sacharóza, laktóza nebo sacharin, nebo ochucovadlo, jako je peprmint, salrcylan methylnatý nebo třešňová příchuť. Je-li dávkovou jednotkou kapsle, může kromě látek výše uvedeného typu obsahovat kapalný nosič. Různé další, látky mohou být přítomny jako povlaky nebo mohou jinak modifikovat fyzikální formu dávkové jednotky. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být povlečeny selakem, cukrem nebo obojím. Sirup nebo elixír může obsahovat účinnou sloučeninu, sacharózu jako sladidlo, methyl- a propylparabcny jako konzervační prostředek, barvivo a ochucovadlo, jako je třešňová nebo pomerančová příchuť. Každá látka, použitá při přípravě veškerých jednotkových dávkových forem, by samozřejmě měla být farmaceuticky čistá a v použitém množství v podstatě netoxická. Účinná sloučenina může být dále zabudována do přípravků a formulací s trvalým uvolňováním.

Při injekční aplikaci (subkutánní, i.v., i.m., intraperitoneální) jednoho nebo více přípravků podle vynálezu může být na jednotkovou dávku podáváno přednostně asi 1 gg až 3 mg, výhodně asi 20 gg až 1,5 mg, zejména asi 50 až 750 gg a zvláště asi 75 až asi 750 gg každé účinné sloučeniny (peptidu). V závislosti na dále popsaném režimu mohou být použity dávky až 1500 gg nebo více. Zvlášť výhodné je formulovat;, do dávkových jednotek parenterální přípravky pro snadnost podávání rovnoměrnost. dávkování. „Jednotková dávka zde označuje fyzikálně diskrétní jednotky, vhodné jako jednorázové dávky pro ošetřované lidské subjekty, přičemž každá jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné sloučeniny, vypočtené tak, aby poskytlo požadovaný terapeutický účinek, ve spojení s požadovaným farmaceutickým nosičem. Konkrétní požadavky na nové dávkové formy podle vynálezu jsou určovány a přímo závislé na (a) specifických charakteristikách účinné sloučeniny a na konkrétním dosahovaném terapeutickém účinku a (b) na omezeních vyplývajících z metody formulace této účinné ošetřování lidských subjektů.

sloučeniny pro

Dávkový režim může být upraven pro dosažení optimální profylaktickč nebo terapeutické odpovědí. Může být například v průběhu dní, týdnů, měsíců nebo roků podáváno několik dělených dávek nebo se dávky mohou s každou další injekcí úměrně zvyšovat nebo snižovat podle požadavků terapeutické situace. V jednom výhodném terapeutickém režimu se subkutánní injekce terapeutických přípravků podávají jednou denně během akutní fáze a jednou za dva dny během remise po dobu života jedince trpícího chorobou. Jako alternativy je možno injekce podávat po týdnech, měsících nebo po jiných dobách. Dávka může zůstávat při každé injekci konstantní nebo se může s každou další injekcí zvyšovat nebo snižovat. Optimální může být trvalý léčebný program pro celou dobu života. Jako alternativa je možno v Intervalech asi tří měsíců až asi jednoho roku no počáteční době léčby podávat posilovači injekcí, která může být jednorázová nebo může zahrnovat další řadu injekcí podobně jako při počáteční léčbě.

V důsledku vysoce individuální odpovědi imunitního systému jedinců trpících relapsující remitující MS, primární progresivní MS, benigní MS a chronickou progresivní MS je nutno vyvíjet důkladný a proměnlivý dávkový režim. Nejprve musí být dokončeno hodnocení příjmu pacientem. Provede se kompletní vyšetření za účelem zjištění mimo jiné zhoršeného ví.dění, nyslagmu, špatné výslovnosti, sníženého vnímání vibrací a polohového smyslu, ataxie a chvění končetiny před dotykem, slabosti, nebo paralýzy jedné nebo více končetin, spasit city a potíží močového měchýře. Odborník stanoví pomoci zavedených metod, jako je EDSS, Neurological Rating Scale nebo jiné podobné .známé prostředky, stejně jako výše diskutovaných indicií chorobného stavu základní hodnotu, vůči níž bude možno měřit jakoukoli změnu, zahrnující postup, ale přednostně tlumení invalidity. I když neexistuje, typická akutní nebo remitující fáze MS, objevila se určitá schémata, která mohou; být vodítkem zkušenému praktikovi. Jak výše uvedeno, frekvence recidiv nebe akutních stavů je největší během prvních o až 4 let choroby, ale po prvním záchvatu nemusí následovat další pozorovatelný záchvat po dobu 10 až 20 let (přestože zatížení lézemi detckovatelné pouze MRI může poskytovat jiný klinický obraz). Během typických episod se příznaky zhoršují po dobu několika dní až 2 až 3 týdnů a pak ustupují. Zotavení je obvykle rychlé během týdnů, i když občas se může protáhnout přes několik měsíců.

MS je chronické onemocnění a předpokládá trvalou léčbu. V jejím průběhu může být: k zastavení prostupu choroby a invalidity nejúčinnější dlouhodobá léčba. Vhodný může být dávkový režim obden, alespoň jednou týdně nebo jednou měsíčně. Přiměřené modifikace jsou v rozsahu možností zkušeného odborníka. Intervence při nástupu záchvatu se považuje za významnou součást účinné léčby.

terap.i e storoídy kombinována se a/nebo s jinými

U pacienta vykazujícího akutní stadium musí být zhodnocena síla záchvatu. Při. nástupu akutního stadia může být podána počáteční injekce. Zřejmým přínosem je zahájení léčby c.o nejdříve během akutní fáze. Je-li to žádoucí, může být tato současnou léčbou β-interferonem, terapiemi, zejména určenými ke snižování zánětů. Pacient by měl být po prvním ošetření, přednostně injekcí, denně pozorován. Během akutní, fáze se navrhuje aplikace další léčby denně nebo alespoň každý třetí den. Jako u každé medikace by měl ošetřující lékař dávkování modifikovat na základě klinických změn, které indikují, potřebu modifikace. Každá taková úvaha je v rámci zkušeností odborníka, řídícího se navrženým dávkovým rozvrhem a podávaným množstvím. Rozsah dávek od asi 75 do asi 750 μα na dávku poskytuje ošetřujícímu lékaři dostatečnou šíři (ale nikoli nepřiměřené množství). Možnosti, zahrnují, aniž by se však na ni omezovaly, denní léčbu během akutní fáze, po níž následuje výše popsaná léčba určená pro remisí. To však nijak nevylučuje možnost více nebo méně častého dávkování, stanoví,-li ošetřující lékař, že je indikována intervence.

Podle vynálezu se uvádí, že. skleróza multiplex v „pokročilém stadiu může být léčena přípravky a způsoby podle vynálezu. Pro léčbu pokročilého stadia MS jsou vhodné přípravky zahrnující, alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk, odvozený od myelinového autoantigenu. Pro léčbu pokročilého stadia MS jsou vhodné výše popsané přípravky MBP peptidů, MOG peptidů a jejich kombinace. Jak výše uvedeno, neomezuj í c.í .mi příklady těchto peptidů jsou: MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1,

MBP-4, MBP13-25, 31-50, 61-80, 82-92, 82-96, 82-97, 82-96, přednostně. MBP-1.1, MBP-2,1, MBP-4, MBP-5, 13-25

82-100, 82-100[100P>Y] , 83-100, 83-101, 84-97, 81-100, 85-100,

86-105, 87-99, 87-99 [91K>A] , 88-100, 88-99, 111-135, 122-110,

142.-168, 146-160 a 153-170 a

87-99, 8739-170, 141-160, 142-166,

99[91K>Aj, 82-100, 82-100[100P>Y], stejně jako peptidy odvozené od lidského MOG:

lidský MOG 1-13 lidský MOG 103-115 lidský MOG 1-121 lidský MOG 1-20 lidský MOG 11-30 lidský MOG 21-40 lidský MOG 31-50 lidský MOG 141-160 .lidský MOG 151-170 lidský MOG 161-180 lidský MOG 199-218

GQFRVIGPRHPIR

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRWHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTE.LLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDH SY QE EAAME LKVE D P FYW

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV,

P1RALVGDEVELPCRISPGK,

ELPCRISPGKNATGMEVGWY,

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL,

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,

IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a

YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.

Původci tohoto vynálezu jako první učinili překvapující objev, že intervence uprostřed nastupujícího záchvatu aktuálně zlepšuje stav subjektu, léčeného způsobem podle vynálezu. Přinejmenším taková intervence nezhoršuje stav subjektu. Původci dále prokázali, že intervence během remise tiumí imunitní odpověď a v důsledku takové intervence nedochází k aktivaci stavu. Intervence tedy může nejen způsobit zlepšení, alo zdá se, že je-li aplikována způsobem podle vynálezu, jo zcela bezpečná. Na použití výše popsaného modelu EAE původci demonstrovali, že opakované intravenózní podávání imunodomínantního MBP peptidů Acl-11 úspěšně léčí EAE, vyvolanou úplným MBP proteinem. Jedna úspěšná léčba (indikující reaktivitu T buněk) se prokázala u „nativního peptidů (nesubstituovaný peptid odvozený od nativní sekvence postupem zde popsaným pro identifikaci peptidů obsahujících epitop T buněk, odvozených od bílkovinného autoantigenů); vhodné modifikované peptidy mohou být identifikovány porovnáním vazebných afinit modifikovaného peptidu s nativním peptidem. Modifikovaný peptid, který má vazebnou afinitu nižší než nativní peptid, bude vhodným kandidátem jako peptid pro terapeutický přípravek podle tohoto vynálezu. Testy pro stanovení vazebné afinity mohou být identiti kovány z údajů v USSN 03/300811 s datem podání i. .9.1994, zahrnutém zde jako odkaz. Například terapie Acl-11 se ukázala jako úspěšná. Terapie Ac.1-11 pak byla porovnána s terapií pomocí Acl-11[4Y1, což je analog Acl-11, který se váže na Aa^uAp^u s vyšší afinitou a věiší stabilitou (Wraith, D.C. a d., viz výše, a Faírchi.ld, P.J. a d., viz výše). Zajímavé je zjištění původců, že Acl11 Γ4Y] je účinný při lOOnásobně nižší dávce než Acl-11 a jeho terapeutický účinek je dlouhodobější, což naznačuje, že pro terapeuticky přípravek jsou vhodné i vybrané módifikované peptidy. Přihlašovatel dále prokazuje, že konkrétní testovaný peptid Acl-11[4Y1 tvoří u ošetřované myši. in vivo stabilní komplex peptid-MHC. Z toho vyplývá, že modifikované peptidy, které tvoří ín vivo stabilní komplexy peptid-MHC, budou vysoce pravděpodobně vhodné pro léčbu lidí, protože jejich účinek se může velmi zvýšit při konzervativních substitucích aminokyselin (viz také Karin a ch, J. Exp. Med., 180:2227-2237 (1994)).

Původci také zjistili, že analog MBP peptidu Acl-11[4Y] zvrátil nastupující paralýzu, byl-li podáván během akutní fáze EAE a bránil relapsům, byl-ii podáván během remise. To ukazuje, že vybrané modifikované peptidy a vybrané analogy peptidů mohou zvrátit aktivní, příznaky a zabránit relapsům u ii.dí trpících M3.

V dalším modelu průběhu lidské choroby zahájili původci jntravenózní poptidovou terapii po nástupu EAE a během akutní fáze. Zcela překvapivě tato terapie, aplikovaná během akutní fáze, zvrátila nastupující chorobu. Toto zjištěni, je první svého druhu. V dřívějších experimentech, prováděných i ' jinvmi pracovníky, byla peptidová terapie zahájena v době, kdy většina myší v ošetřované skupině ještě nevykazovala známky EAE, nejpozději před imunizaci nebo v blízkosti nástupu choroby. Například v práci Gaura a d., víz výše, byla skupina 13 myší vystavena režimu MBP provokujícímu chorobu. Jakmile vykazovala pouze jedna ze 13 myší minimální známky choroby, tj jedna myš měla klinický záznam 1 (diskuse klinického hodnoceni myší viz příklad 2), byla sedmi myším intrapcritoneálně injekčnč aplikována směs MBP peptidů. Zbylých šest myší, jednou z nichž byla myš vykazující známky choroby, nedostalo žádn Cl ci Σ 8 í ošetření. V tomto případě nejsou Gaur a d. schopni pro myši bez klinických příznaků choroby vyvodit z těchto údajů smysluplný závěr. Přítomnost nízkého klinického záznamu 1 u jedné myší nemůže být interpretována Lak, že indikuje aktivní, chorobu u kterékoli z ostatních myší. Proto Gaur a d. popisují léčbu před nástupem choroby a rozhodně před klinickými známkami, choroby. Naproti tomu, aby byla použitelná při klinickém nasazení při léčbě lidí s MS, musela by terapie být účinná, i kdyby byla zahájena až po nástupu chorobného procesu. Jako model příslušné lidské terapie podávali původci peptídovou terapií, myším, přičemž zahajovali 250 nmol Acl-11(4Y1 po nástupu akutní fáze EAE. Účinek této terapie je znázorněn na obr. 5. Terapie byla zahájena individuálně u každé myši, jakmile vykazovala počáteční známky EAE. Jakmile myši vyvinuly EAE, byly zařazeny do skupiny terapie peptidem Acl-11[4Y] a do každé ze tří kontrolních skupin (bez ošetření, PBS nebo peptid OVA 323-337 vážící se na AahAfiÚ . Obr. 9 ukazuje, že terapie A.c í -11 [ 4 Y ] při nástupu EAE vede k dramatickému zlepšení charakteristik choroby, zjevnému do 48 h po počáteční injekci peptidu. U těchto ošetřovaných myší EAE téměř zmizela do čtvrtého dne po nástupu a účinek 18denního běhu peptidové terapie byl prodloužen.

Během dalšího překvapivého vývoje původci zjisti.li, že intravenozní peptidová terapie zahájená během remisní fáze EAE zabraňuje reiapsům. Při. použití EAE jako modelu pro lidské onemocnění, jak výše uvedeno, si opět myši (PLJ x SJL)F1 vyvíjejí po imunizaci MBP relapsující EAE (Fritz, R.B. a d. , J. Immunol., 1953, 130:1024). EAE se vyvine obvykle mezi 9 a 16 dny po imunizaci a akutní fáze choroby v tomto modelu trvá přibližně 3 až 20 dní. Během akutní fáze může 20 % nebo více myší uhynou’, nebo se stát moribundními v závislosti na síle choroby při experimentu. Většina zvířat přeživších akutní fázi pak vstupuje do krátké remisní fáze, vykazující po několik dní mírné nebo žádné klinicko známky choroby. V některých experimentech mohou myši vstoupit do remisní fáze všechny přibiižně ve stejnou dobu (znázorněno na obr. 5), ale ve většině případů je délka akutní fáze proměnlivější. Po remisní fázi následuje první relapsová fáze, která má obecně stejnou sílu jako akutní fáze choroby. Následně si přežívající myši vyvíjejí rosí duál ní chronickou paraiýzu, která přetrvává do ukončení experimentu.

V myším modelu představuje peptid Acl-11[4Y] pozoruhodně účinnou terapii, je-li zahájena během remisní fáze EAE. Za účelem vyšetření schopnosti Acl-11[4Y] zabraňovat relapsům EAE byly myši sledovány během počátečních episod paraiýzy, které trvaly 3 až 19 dní. Protože přežívající myši vstupovaly do remisní periody jednotlivě (definováno jako snížení klinického záznamu na i nebo 0 po dobu alespoň dvou dní), byly střídavě zařazovány do dvou skupin a byla zahájena intravenózní terapie s 25 nmol Acl-11[4Y] nebo s kontrolním PBS. Myší byly léčeny individuálně počínaje druhým dnem remise. Obr. 10 ukazuje, že intravenózní aplikace Acl-11 [4Y], zahájená během remisní fáze EAE, dramaticky snížila výskyt a sílu relapsů, a naznačuje, že intravenózní pcpt.idová terapie může být účinná, i když se zahajuje později, v průběhu choroby.

Mechanismus intravenózní peptidové terapie do.sud nebyl plně vysvětlen, i když již bylo u různých jiných anticjenových systémů naznačováno, ze podávání antigenního peptidu intravenózně před imunizací vyvolává anti genově specifickou nereaktivitu imunitního systému. Jako další důkaz účinnosti

4] terapeutika podávaného pacientům MS podávali původci i. v. encef ali togermí peptid nebo analog peptidu a zjistili, že snižuje in vitro proliferaci lyinfatických uzlin a produkci IL2. Myším bylo deset a pět dní před imunizací MBP proteinem intravenózně aplikováno 250 nmol MBP Acl-11. Obr. 11a ukazuje proli ferativni odpověď lyinfatických uzlin těchto ošetřených myší, měřenou v don 10 po imunizaci. Předběžné intravenózní ošetření i munodom.i nantním MBP peptidem Acl-11 bez vehikula před imunizací snižuje následnou proliferativní odpověď T buněk in nitro na MBP Acl-11. Podobné výsledky byly získány, když byly myši předem ošetřeny int ravenózn.ími injekcemi analogem MBP peptidu Acl-11[4Y] (údaje neznázorněný). Navíc bylo intravenózním předběžným ošetřením Acl-11[4Y] zabráněno produkcí IL2 lymf ati ckými uzlinami v reakci na MBP Acl-11 (obr. 11b). Tyto výsledky potvrzují, že intravenózní předběžné ošetření pomocí MBP Acl-1.1 nebo Acl-1 1[4Y1 íncuikuje nereakti.vitu T buněk na MBP Acl-11.

Původci tak zkoumali účinnost intravenózní terapie pomocí MBP peptidů a peptidových analogů při léčbě rclapsující EAE a učinili řadu jedinečných pozorování. První a pravděpodobně nejvýznamnější spočívá v tom, že léčba autoimunitního onemocnění jedním autoantigenním peptidem může být účinná i. tehdy, je-li zahájena po nástupu znaků onemocnění. Specifické znaky onemocnění, používané pro hodnocení myší, jsou diskutovány v příkladech provedení. Hodnocení bodem 2 nebo více na stupnici Mean Clinical Score bylo definováno jako pokročilé stadium EAE. Výsledky naznačují, že intravenózní MBP popti.dy interferují s encefalitogenní aktivitou autoagresivních imunizovaných buněk i poté, co byla přerušena mozková krevní, bariéra a došlo k lymfocytické infiltraci centrálního nervového systému. V žádném časovém Intervalu nebylo pozorováno, že by peptidy alespoň dočasně aktivovaly, zhoršovaly nebo oxaceibovaly nastupující chorobu. EAE, ošetřená po nástupu akutní fáze, byla zvrácena do několika dni po zahájení terapie, i když byly ošetřované myši původně silně napadeny.

Histologické vyšetření potvrdilo, že klinická odpověď na peptidovou terapii korelovala s výrazným snížením lymfocytíckých infiltrátů do mozku a míchy. Jak je zde diskutováno, byla tedy i.v. aplikace MBP Acl-11[4Y] účinná i při zahájení až 30 dní po imunizaci MBP, v remisní fází EAE.

Zahájeni léčby během zdánlivě klidové fáze choroby tedy opět nevedlo k exacerbacím a navíc úplně zamezilo všem kromě nejmírnějších relapsů. Tento výsledek je zvlášť zajímavý, protože existuje důkaz, že rozpoznávání různých MBP epitopú probíhá později během imunitní odpovědi na MBP, a byte· naznačeno, že tyto epitopy mohou přispívat k chorobě (Lehmann, P.V. a d., Nátuře, 1992, 358:155). Tento vynález naznačuje, že podávání peptidu velmi, časně v průběhu choroby by mořilo zabraňovat vývoji pozdější imunitní odpovědi na tyto epitopy. Je však pozoruhodné, že jeden analog MBP peptidu účinně zabraňoval relapsům, byl-lí podáván po rozptýlení silné akutní fáze EAE, kdy imunitní odpověď na MBP a popřípadě na jinJ ravelmové antigeny jíž mohla pokročit.

Při praktickém provádění tohoto vynálezu se preferuje volba účinného terapeutika, která je popsána výše. Původci vynálezu dále odvodili, že jedním kriteriem pro optimální peptidické kandidáty by byly peptidy s reaktivitou T buněk a vyšší vazebnou afinitou MBP než u nativního peptidu, které tvoří stabilní komplexy s MHC třídy II in vivo. Původci konkrétně zjistili, že peptidický analog MBP, který tvoří in vivo stabilní komplexy s MHC třídy II, je účinnější při léčbě EAE než Acl-11. Již dříve se prokázalo, že peptidický analog MBP Ac1.-11[4YJ se váže na Αα“Αβ^υ s vyšší afinitou a že komplexy, tvořené in vitro mezi Ac1-11(4Y) a Αα“Αβ^Μ, jsou stabilnější než komplexy, vytvořené mezi Acl-11 a Αα“Αβ^π. Ukázalo se také, že Acl-11[4Y] zabraňuje EAE, je-li inhalována velká dávka před imunizací (Mctzler, B. ad., viz výše). Tento vynález uvádí, že modifikovaný MBJ? peptidový analog Acl-11 L4Y] je alespoň lOOnásobně účinnější jako terapeutický prostředek než MBP Acl-11 a vyžaduje aplikační schéma s menší frekvencí dávek. Důsledkem této zvýšené účinnosti je terapeutikum, které je jednak praktičtější a jednak účinnější. Původci pozorovali, že intravenózní aplikace Acl-11[4YJ (ale nikoli Acl-11) vede ke tvorbě stabilních komplexů peptíd-MHC in vivo. Má se za to, že zlepšená účinnost Acl-11[4Y] souvisí s touto tvorbou stabilních komplexů peptid-MHC. Tyto komplexy jsou detekovatelné na slezinných buňkách pomocí hybridomů specifického pro MBP Acl-11 po dobu až 10 h po injekci . Má se proto za to, že tvorba stabilních komplexů peptíd-MHC může být jedním z charakteristických znaků takového terapeuticky účinného peptidu. Terapeutický účinek Acl-11[4Y] in vivo byl překvapivě přítomen dlouho potom, co se komplexy pcptid-MHC staly nedetekovatelnými na slezinných buňkách (viz obr. 6a a 9) . Je pravděpodobné, že komplexy peptid-MHC tvoří antigenově specifické funkční terapeutické jednotky, které vykazují dlouhodobý účinek na encefalitogenní T buňky, přetrvávající i poté, co komplexy již nejsou detekovatelné in vivo. Není známo, zda tyto komplexy vykazují. svůj účinek periferně nebo v centrálním nervovém systému. Jestliže operují v centrálním nervovém systému, mohou zde komplexy vznikat nebo mohou buňky, nesoucí tyto komplexy, migrovat skrze bariéru krev-mozek.

Vynález dále poskytuje způsob léčení sklerózy multiplex, spočívající v podávání terapeuticky účinného množství alespoň jednoho peptidu MBP majícího aktivitu T buněk v léčebném režimu, který zahrnuje terapeuticky účinné množství IFN-β.

Jako výsledek popsané práce bylo objeveno, že kombinace alespoň jednoho peptidu majícího aktivitu T buněk, odvozeného od myelinových antigenů (například MBP), a IFN-β, podává-li se. v terapeutickém režimu, má synergický účinek (obr. 12c), který překvapivě snižuje klinické příznaky EAE u myší v daleko větším rozsahu než je účinek každé ze složek na zmírnění příznaků EAE, jsou-Ji. podávány samostatně (obr. 12a až b) , a který je větší, než by bylo možno očekávat pro pouze aditivní účinek peptidu pius IFN-β.

Protože FAE slouží jako myší model lidské MS a je indukována různými myelinovými antigeny (například PLP, MBP, MOG), očekává se, že podobný účinek bude pozorován i u lidí. Vynález proto poskytuje způsob léčení jedinců, kteří mají sklerózu multiplex nebo jsou náchylní k vyvinutí sklerózy multiplex, spočívající v podávání účinného množství přípravku podle vynálezu, zahrnujícího alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk, odvozený od myelinového antigenu, přednostně v neimunogenní formo, v terapeutickém režimu, který zahrnuje rovněž podávání IFN-β. Výhodné přípravky jsou výše popsané přípravky podle vynálezu, zahrnující MBP peptidy, stejně jako MBP peptidy kombinované s MOG peptidy, ve spojení se současně nebo následně podávaným IFN-β.

Podávání přípravku podle vynálezu, Zcuhrnu j í cíiao alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk myelinového antigenu v terapeutickém režimu, který zahrnuje podávání IFN-β, může být. prováděno známými postupy při dávkách a po dobu dostatečnou k účinné redukci, eliminaci nebo prevenci příznaků spojených se sklerózou multiplex. Účinné množství jak peptidu, tak IFN-β, podávaných společně v terapeutickém režimu, se měni v závislosti na výše popsaných faktorech. Účinné sloučeniny (například MBP peptid nebo kompozice obsahující jej spolu s IFN-β) mohou být podávány vhodným výše uvedeným způsobem, například injekčně (subkutánně, intravenózně atd.), orálně, inhalačně, transdermálně nebo rektálně.

Injekčně může být například podáváno asi 1 pg až 3 mg a výhodně asi 20 až 500 pg peptidu, odvozeného od myelinovélio antigenu, na dávkovou jednotku. Přednostně se injekčně může podávat dávková jednotka 100 až 10000 jednotek IFN-β. Dávkový režim těchto· dvou sloučenin může být upraven, aby poskytoval optimální l.erapeutíckou odpověď. Například může být podáván současně IFN-β a přípravek podle vynálezu nebo přednostně mohou být podávány s alespoň Shodl novým odstupem, výhodně alespoň í žhodinovým. odstupem nebo zejména alespoň s 24hodinovým odstupem. Terapeutický režim podávání antigenního peptidů a lFN-β může trvat po dobu několika dní nebo týdnů a může být. zkracován nebo prodlužován podle požadavků terapeutické situace, jak popsáno výše.

Vynález rovněž poskytuje nový přípravek, zahrnujíc! fyzikální směs peptidů s aktivitou T buněk, odvozeného od myelinového antigenu, jako je MBP nebo MOG, a 1ΈΝ-β ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidlo. Tento přípravek může být používán jako součást terapeutického režimu pro léčbu nebo prevenci sklerózy multiplex u jedince.

Obecně se uznává, že výsledkem specifické odpovědi na určitý autoantigen, zprostředkované T buňkami, jsou i jiná autoimunitní onemocnění, jako je diabetes typu I a revmatoidni arthritis. Různé přístupy k léčbě autoimunitních onemocněné, zprostředkovaných T buňkami, zahrnující podávání celých autoantigenů nebo od nich odvozených peptidů obsahujících epitopy T buněk pacientovi za účelem tlumení odpovědi zprostředkované T buňkami, odpovědné za nepříznivé příznaky autoimunitního onemocnění.

Kromě myelinových autoantigenů, které hrají určitou roli pří MS, byla nalezena řada antigenů (tj. autoantigenů), které vyvolávají chorobné příznaky u jiných autoimunitních onemocnění, jako je diabetes, Gravesova choroba, myasthenia gravis, syndrom good pasture, psoriáza, thyreoidítis a revmatoidni arthritis (tj. autoantigeny, jako je insulin, rh faktor, acetvlcholinové receptory, receptory buněk štítné žlázy, proteiny základní membrány, bílkoviny štítné žlázy, ICA69 (PM-1), dekarboxylasa kyseliny glutamové (61K nebo 65 K) , proteolipíd, kolagen (typ II), protein teplotního šoku a karboxypeptidasa H) . Má se. za to, že podobné přípravky a způsoby, jaké jsou zde popisovány, je možno používat při léčbě autoimunitních onemocnění, jako je revmatoidni arthritis, diabetes, myasthenia gravis, Gravesova choroba, syndrom good pasture, psoriáza a thyreoíditis, kde antigenem odpovědným za onemocnění je bílkovinný autoantigen.

Peptidy zahrnující definované sekvence aminokyselinových zbytků, mající aktivitu T buněk a přednostně zahrnující alespoň jeden epitop T buněk a/nebo které indukují nereaktivitu T buněk nebo sníženou reaktivitu T buněk, byly identifikovány a izolovány pro mnohé z výše uvedených autoantigenů. Například ve WO 94/07520 jsou identifikovány peptidy, které jsou údajně schopny tlumit; antigenově specifickou odpověď na rozpustný kolagen typu II, což je bílkovinný antigen, o němž se soudí, žc je aut.oant igenem při revmatoidní arthritis. WO 92/06704 popisuje způsoby identifikace peptidů insulinu, které údajně zahrnují epitopy Ί buněk a které mohou být vhodné pro přípravky a způsoby, analogické tomuto vynálezu, pro léčbu diabetů typu I. Dále mohou být kterýmkoli z výše uvedených a v příkladech definovaných způsobů identifikace peptidů bílkovinného autoantiqenu, obsahujících epitop 1 buněk, identifikovány vhodné peptidy s obsahem epitopů T buněk pro antigen nebo autoantiyen, o němž se předpokládá, že je odpovědný za kterékoli z výše uvedených onemocnění. Jakmile jsou takové peptidy obsahující epitop T buněk identifikovány pro cílový autoanti.gen, mohou být tyto peptidy používány v přípravcích a způsobech analogických těm, jaké zde byly popsány pro léčbu sklerózy multiplex.

Přehled obrázků na výkrešech

Obr. i znázorňuje úplnou délku sekvence aminokyselin lidského MBP s označením čísel aminokyselinových zbytků, na něž se zde odkazuje.

Obr. 2 znázorňuje aminokyselinové sekvence výhodných peptidů, odvozených od MBP.

Obr. 3 znázorňuje aminokyselinové sekvence překrývajících se peptidů a delších peptidů, použitých v příkladu 1.

Obr. 4a představuje grafické znázornění procentického podílu celkové odpovědi. MBP pro každý peptid uvedený na obr. 3.

Reaktivita MBP byla vypočtena na základě procenta MBP pozitivních m.i krotitrových kultur v každé skupině individuálních pacientů, která rovněž reagovala pozitivně na jeden z MBP peptidů. Celkové MBP pozitivní mikrotitrové kultury činily 89 až 184 v každé skupině 19 až 43 pacientů, testovaných na každý peptid.

Obr. 4b představuje grafické znázornění procenta jedinců reagujících na MBP, kteří rozpoznávají každý peptid uvedený na obr. 3. Pacienti se považují za reagující na MBP, jestliže alespoň jedna z jejich mikrotitrových kultur reaguje pozitivně na MBP. V každé skupině 19 až 43 pacientů, testovaných na každý peptid, bylo 12 až 31 pacientů reagujících na MBP. Reaktivita na peptid byla vypočtena na základě procenta reagujících pacientů v každé skupině s alespoň jednou mikrotrtrovou kulturou pozitivní na jeden z MBP peptidů.

Obr. 5a představuje graf středních klinických hodnot za dobu 0 až 40 dní po vyvolání choroby u myší i.v. injekcí MBP Acl-11 samotného v porovnání s kontrolou.

Obr. 5b představuje graf středních klinických hodnot za dobu 0 až 4 0 dní po vyvolání choroby u myší i. v. injekcí 1101¹ Acl-11 v kombinaci s MBP 31-47 v porovnání s kontrolou.

Obr. 5c představuje graf středních klinických hodno! za dobu 0 až 4 0 dní po vyvolání choroby u myší. i. v. injekcí DVA 323-339 v porovnání s kontrolou.

Obr. 6a představuje graf středních klinických hodnot, za dobu 0 až alespoň 30 dní po vyvolání choroby u subjektů injekcí buď 250 nmol Acl-11 [4Y] nebo Acl-11 v porovnání s kontrolou.

Obr. 6b představuje graf středních klinických hodnot za dobu 0 až alespoň 30 dní po vyvolání choroby u myší. ošetřených 2,5 nmol Ac.l-11[4YJ v porovnání s kontrolou.

Obr. 6c představuje graf středních klinických hodnot za dobu 0 až alespoň 30 dní po vyvolání choroby u myší ošetřených

2,5 nmol Acl-11 v porovnání s kontrolou.

Obr. 7 představuje úsečkový diagram znázorňující střední histologické hodnoty u myší ošetřovaných peptidem oproti kontrolním myším, kde nižší hodnota znamená snížený počet a vážnost zánětlivých infiltrátů CNS.

Obr. 8 je úsečkový diagram představující relativní aktivaci T buněk v době 0 až 10 h po injekci 250 nmol Acl11Γ4Υ] myším.

Obr. 9 představuje graf, ukazující porovnání ošetření myší 250 nmol Acl-11[4Y] oproti kontrole, PBS a OVA 323-337.

Obr. 10 představuje graf, ukazující porovnání ošetření zahájeného během remise s 25 nmol Acl-11[4Y] oproti kontrole.

Obr. 11a představuje graf, znázorňující. proliferací lymfatické uzliny in vitro (indikovanou zabudováním 311thymidinu) u myší, předem ošetřených i,v. 250 nmol MBP Acl-11, v porovnání s kontrolou.

Obr. 11b je úsečkový diagram, znázorňující relativní produkci lymfatické uzliny 1L2 v reakci na MBP Acl-11 u myší, předem ošetřených Aci-11[4Y], v porovnání s kontrolou.

Obr. 12a představuje grafické znázornění experimentu ukazujícího účinek IFN-β na EAE u dvou skupin po 10 dospělých myších samicích (SJL x TLP)F1, u nichž byla v den 0 vyvolána EAE morčecím MBP v kompletním adjuvans s přídavkem toxinu dávivého kašle a kterým bylo buď podáno pouze nekompletní Breundovo adjuvans (kontrola) nebo které byly v den 9, 12, 16 a 20 (znázorněno šipkami na ose x) ošetřovány interperitoneálně (í.p.i 2000 jednotkami IFN-β, přičemž osa y představuje střední klinickou hodnotu (MCS) pro každou skupinu (0 - žádné klinické znaky EAE, 1 - ochablý nereagující ocas, 2 - částečná paralyza zadních končetin, 3 - úplná paralyza zadních končetin, 4 částečná až úplná paralyza předních končetin, 5 moribununí stav) .

Obr. 12b představuje grafické znázornění experimentu ukazujícího účinek MBP peptidů Ac 1-11 u dvou skupin oo 10 dospělých myších samicích (SJL x TLP)F1, u nichž byla v den 0 vyvolána EAE morčecím MBP v kompletním adjuvans s přídavkem toxinu dávivého kašle a kterými bylo buď podáno PBS (kontrola) nebo které byly v den 10, 13, 17 a 21 (znázorněno šipkami na ose x) ošetřovány intravenózně 250 nmol Ac 1-11, přičemž osa y představuje střední klinickou hodnotu pro každou skupinu, jak uvedeno u obr. 12a,

Obr. 12c představuje grafické znázornění experimentu ukazujícího účinek MBP peptidu Ac 1-11, podávaného v kombinaci S IFN-β na EAE u dvou skupin po 10 dospělých myších samicích (SJL x TLPiEl, u nichž byla v den 0 vyvolána EAE v kompletním adjuvans s přídavkem toxinu dávivého kašle a kterým bylo buď

podáno PBS (	kontrola) nebo které byly v den 10, 13, 17 a 2')
(znázorněno	otevřenými šipkami	na	ose x)	ošetřovány
intravenózně	250 nmol Ac 1-11	a v	den 9, 12,	16 a 2 0
(znázorněno	uzavřenými šipkami	na	ose x)	ošetřovány

interperitoneálně 2000 jednotkami IFN-β, přičemž osa y představuje střední klinickou hodnotu pro každou skupinu, jak uvedeno u obr. 12a.

Obr. 13 představuje grafické znázornění experimentu, ukazujícího účinek různých dávek IFN-β (10000, resp. 2000 jednotek) na vyvolanou EAE u dvou skupin po 10 dospělých myších samicích (SJL x TLPýFl, u nichž byla v den 0 vyvolána EAE pomocí morčecího MBP s přídavkem toxinu dávivého kašle a kterým bylo buď podáno PBS (kontrola) nebo které byly v den 9, 13 a (16 (znázorněno uzavřenými. šipkami na ose xi ošetřovány interpritoneálně (í.p.) 10000, resp. 2000 jednotkami IFN-β, přičemž osa y představuje střední klinickou hodnotu pro každou skupinu, jak uvedeno u obr. 12a.

Obr, 14 znázorňuje různé peptidy, odvozené od MBP, které mohou být vhodné pro přípravky a způsoby podle vynálezu.

Obr. 15 graficky znázorňuje index požit.ivi ty (osa yj (průměrný S, í./pacienti reagující na MBP) násobený procentem jedinců reagujících na každý peptid (osa xi, který je odvozen ze stejných experimentálních údajů, které jsou uvedeny na obr. 4a a 4b a popsány v příkladu 1.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je osvětlen na dále uvedených neomezuj ící. ch příkladech.

Příklad 1

Studie sklerózy multiplex jako imunitní odpovědi na myelinový bazický protein v lidské populaci a peptidy a volba MBP peptidů vhodných pro terapeutické použití

Syntéza peptidů:

Peptidy byly syntetizovány s použitím standardní chemie Fmoc/Boc a či.stěny pomocí HPLC s reverzními fázemi. Obr. 3 znázorňuje peptidy MBP použité v těchto studiích. Názvy peptidů nebo zbytky aminokyselin jsou v celém textu příkladů shodné.

Protokol: Analýza lidského PBL na reaktivitu s MBP a MBP peptidy:

PBL byly čištěny z čerstvých vzorků periferní krve (přibližně 75 mi) od 222 pacientů s jistou MS s použitím Picollových gradientů hustoty. Mikrotitrové kultury byly iniciovány 2 x 10⁵ PBL na jamku a 10 pg/ml čištěného lidského míšního MBP v kultivačním médiu RPMT 1640 doplněném 5 í lidského séra AB, pěnicílinem-streptomycinem a L-glutarainem. Kultury byly počínaje dnem 6 až 7 doplněny 1L2 (20 jedn./mi) a IL4 (5 jedn./ml), Po 11 až 13 dnech byly mikrotitrové kultury promyty, resuspendovány v čerstvém médiu a rozděleny do 12 čerstvých mikrotitrových jamek. Jako buňky obsahující antigen byly přidány autologní zmrazené PBL v množství 5 x 10⁴ PBL na jamku.

Screeningové antigeny byly dvojmo přidány do 12 zdvojených jamek z každé mikrotitrové kultury. Jako negativní kontrola bylo vždy použito médium a jako pozitivní kontrola čištěný lidský rekombinačni MBP v množství 10 ng/ml. Každý pacient byl testován také na reaktivitu s maximálně 4 MBP peptidy, každým v koncentraci 10 μΜ. Po 48 h byly vzorky podrobeny pulsaoi s 0,75 nCi ³H-thymidinu a získávány po 6 až 16h pulsací.

Kultury byly označeny jako pozitivní pro každý peptid podle těchto kriterií: stimulační index větší než 3,0, změna cpm větší nebo rovná 500 a standardní odchylka od průměru menší než změna cpm. Pro účely analýzy byly kultury dále označeny jako „peptid-pozitivní, pouze pokud reagovaly současně na MBP a peptid a pokud nereagovaly na více než jeden nepřekrývající so peptid. Reaktivita s každým z peptidů byla testována s použitím minimálně 19 a maximálně 43 pacientů.

Výsledky:

Průměrně 6 % mikrotitrových kultur bylo zjištěno jako pozitivních na MBP reaktivitu pro každého z pacientů (rozmezí 0 až 37 MBP pozitivních kultur na pacienta). Alespoň jedna mikrotitrové kultura byla pozitivní na MBP reaktivitu u 77 % pacientů a tito jedinci bylí považováni za „reacjujicí na MBP. Status reaguj i čího jedince nekoreloval s pohlavím, kategorií MS (RR vs. CP), typem HLA-DR, věkem nebo skutečností, zda pacient bral. nebo nebral Betaseron.

Testované MBP peptidy zahrnovaly panel. 16 ROmerů (obr, 3), překrývajících se o 10 aminokyselin a pokrývajících celou sekvenci lidského MBP (isoforma 18,5 kD). Byly testovány ještě dva delší peptidy (sekvence MBP (MBP 83-105 a MBP '141-165, obr. 3). Reaktivita na MBP pe.ptidy pak byla vypočtena na základě podílu MBP pozitivních mikrotitrových kultur, které byly pozitivní rovněž na jeden z MBP peptidů. Čtyři z peptidů odpovídaly každý za alespoň 10 % celkové reaktivity vůči MBP (MBP 11-30, MBP 81-100, MBP 83-105 a MBP 141-165). Kromě toho byla reaktivita vůči každému z těchto peptidů detekována u alespoň třetiny jednotlivých pacientů MS reagujících na MBP, u nichž byly testovány. Navíc vykazuje 77 % pacientů reagujících na MBP reaktivitu vůči buď MBP 83-10 nebo MBP 141-165 nebo vůči oběma těmto peptidům.

Z těchto čtyř peptrdů byl nejreaktivnější MBP 141-165, odpovídající za 21 % celkové reaktivity vůči MBP, který byl detekovatelný u 64 % testovaných reagujících pacientů. MBP 141165 patrně obsahuje cp-itopy T buněk jak z MBP 141-1.60, tak MBP 151-170 a překvapivě vykazoval dramaticky větší reaktivitu než dva ŽOmerové peptidy. MBP 81-100 a MBP 83-105 mají velmi podobnou sekvenci a pravděpodobně zahrnují podobné, pokud nc identické epitopy T buněk. Odpovídají oblasti, o niž se dříve soudilo, že je spojena s haplotypem HLA-DR2. Naše výsledky naznačují, že pacienti MS jak s DR2, tak bez 13R2 na tyto peptidy příznivě reagují. MBP 11-30 je oblast reaktivity peptidu, o níž se původně soudilo, že není u pacientů MS často¹ rozpoznávána.

Každému z ostatních MBP peptidů příslušelo méně než 5 % celkové reaktivity MBP a byl detekován u 20 % nebo méně testovaných reagujících pacientů (viz obr. 4a a 4b). Největší reaktivita v této skupině peptidů byla zjištěna u MBP 111-130, kterému příslušelo 4,5 % reaktivity MBP a byl nalezen u 10 % testovaných reagujících pacientů.

Volba výhodných MBP peptidů

Výhodné MBP peptidy byly vybírány na základě dvou k r i t e r i i :

i. Počet pacientů MS, reagujících na v úvahu připadající peptidy (alespoň 75 % testovaných pacientů, kteří reagují na bílkovinný antigen, rozpoznává alespoň jeden z peptudů).

2. Intenzita odpovědi T buněk na v úvahu připadající peptid u pacientů MS (odpověď na v úvahu připadající peptidy se rovná 40 % celkové odpovědi na antigen).

První kriterium splňuje MBP 83-105 (MBP-2) a MBP 141-165 (MBP-4) (77 % reagujících pacientů rozpoznává jeden z nich nebo oba, viz déle tabulka 1). Společně těmto peptidům přísluší 32 % reaktivity vůči MBP (viz dále tabulka 2).

Tabulka 1. Reaktivita na MBP-2 a MBP-4: Analýza podle jedinců

i jedinců reagujících na	MBP-2	MBP-4	MBP-2 a/nebo MBP-4
me z. i
reagujícími na
MBP	11/31 [35,5 %]	20/31 [64,5 %)	24/31 [77,4 %J

Tabulka 2, Reaktivita na MBP-2 a MBP-4: Analýza podle T buněčných linií

% MBP			MBP pozitivní
pozitivních	MBP pozitivní a	MBP pozitivní a	MBP-2 nebo MBP
líni i	MBP-2	MBP-4	4
mezi. MBP
pozitivními
i iniemi	20/184 [10,95%]	39/184 [21,1 %1	59/184 [32,1 % _

Přídavek MBP 11-30 (MBP-1) tak splňuje druhé kriterium, protože těmto třem peptidům společně přísluší 42 % reaktivity vůči MBP. Jako výhodný peptid pro terapeutické použití by byl i MBP ί 1.1 — 13 0 (MBP-3), zejména v kombinaci s MBP-1, MBP-2 a MBP4. MBP 81 100 se zdá být ekvivalentní MBP 83-105 a můžo být rovněž používán ve spojení s ostatními vybranými výhodnými pept idy.

Příklad 2

Podávání peptidů savcům pro léčbu EAE jako modelu pro sklerózu multiplex

Syntéza peptidů:

Peptidy byly připraveny automatizovanou syntézou peptidů (ABI 430A, Applied Biosciences, Foster City, CA) s použitím standardní 9-fluorenylmethoxykarbonylové chemie. Peptidy byiy čištěny vysokotlakou kapalinovou chromatografii a bylo· potvrzeno složení aminokyselin. Zvolené peptidické sekvence byly MBP Acl-11 ASQKRPSQRHG, MBP Acl-11 [4A] ASQARPSQRHG, MBP Acl-11 [4Y] ASQYP.PSQRHG, MBÍ^J 31-47 RHRDTGILDSIGRFFSG, Ova 323339 ISQAVHAAIIAEINEAGR a Ova 323-337 ISQAVHAAHAEINEA.

Čištění MBP

MBP byl připraven z morcecích mích (Keystone Biologicals, Cleveland, 0Π) s použitím modifikace metody popsané v Smith, M.E., J. Neurochem., 1969, 16:83. Stručně řečeno byl MBP extrahován z izolovaných myelinových membrán pomoci chloroformu a methanoiu, vysrážen citrátem draselným, extrahován kyselinou a lyofilizován. SDS-PAGE analýza tohoto materiálu ukázala hlavní pás při očekávané molekulové hmotnosti 18,5 kD.

Indukce EAE, hodnoceni a pcptidová terapie

EAE byla indukována u myší (PJL x SJL) Fl, získaných od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Když myši dosáhly věku 3 až 14 týdnů, byla indukována EAE imunizací 50 až 100 pg MBP, emulgovaného v kompletním Freundovč adjuvans (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), doplněném dalšími 400 pg na myš M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). V době imunizace a po 4 8 h bylo intravenózně podáno 200 ng toxinu dávivého kašle (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Myši byiy hodnoceny na základě klinických znaků podle léto stupnice: 1 paralýza ocasu, 2 - částečná paralýza zadních končetin, úplná paralýza zadních končetin, 4 - paralýza předních končetin, 5 moribundn.í nebo mrtvá. Myši s hodnotou 5 byly usmrceny. Po smrti byly myši vyřazeny z dalších výpočtů středního klinického hodnocení. Peptidy byly podávány intravenózně, jak je popsáno dále v jednotlivých příkladech.

Pro testy proliferace lymfatickýoh uzlin a produkce 1112 byly z myší , imunizovaných výše popsaným způsobem, při.praveny z.a účelem indukce EAE lymfocytové suspenze slabinové a paraaortální lvmfatické uzliny (pro proliforační experimenty nebyl obsažen toxin dávivého kašle). Lymfocyty byly kultivovány na raikrotitrových plotnách s kulatým dnem v množství 5.10⁵ na jamku s peptidy MBP a RPMI 1640 doplněným 0,5 % čerstvého normálního myšího séra, penicilinem-streptomycinem, Lglutaminem a 5.10'⁵ M 2-merkaptoethanolu. Kultury pro testy proliferace byly podrobeny pulsům po dobu 16 h ³H-thymidinem s následující inkubací po dobu 72 h. Pro testy T.L2 byly získány po 24 h supernatanty kultur a byly testovány na schopnost podporovat růst buněčné linie HT2, závislé na IL2. K rozlišeni produkce IL2 od produkce IL4 byly provedeny biologické zkoušky HT2 v přítomnosti supernatantu 10¾ kultury monoklonální protilátky íl.B.ll (0'Hara, J. a d., Nátuře, 1985, 315:333), která inhibuae IL4-i.ndukovanou proliferaci buněk HT2 .

Výsledky jsou uvedeny na obr. 9, který ukazuje, že Acl11 [4Y] zvrací průběh EAE, je-li podáván po nástupu paralýzy. EAE byla indukována ve skupinách po 14 myších pomocí MBP. Terapie byla zahájena u každé myší jednotlivě, poté, co se u ní vyvinuly klinické znaky EAE. Data jsou vynesena ve vztahu k zahájení terapie pro každého jedince (den 1 = nástup klinických znaků pro každou jednotlivou myš). Myši byly ošetřovány intravenózně v den 1, 4, 11 a 18 choroby pomocí PBS (prázdný kroužek), 250 nmol Acl-11[4Y] (plné čtverečky) nebo 250 nmol Ova 323-337 (plné kroužky). Další kontrolní skupina nedostávala žádné ošetření (prázdné čtverečky). Křížky označují.

jednotlivé myša, které uhynuly nebo byly usmrceny ve stupni 5 EAE. Hodnotu MMS pro neošetřenou skupinu byla 4,6 a mortalita byla 64 %, Hodnota MMS pro skupinu ošetřenou PBS byla 4,4 a mortalita 35 %. Hodnota MMS pro skupinu ošetřenou Ova 323-337 byla 4,2 a mortalita 21 %, Hodnota MMS pro skupinu ošetřenou Acl-11[4Y] byla 3,2 a mortalita 7 %.

Obr. 10 ukazuje, Že Acl-11f4Yj zabraňuje relapsům EAE, podává-li se během rem.isní fáze choroby. EAE byla indukována pomocí. MBP. Terapie byla zahájena u každé myši individuálně druhý den remi.se po počáteční episodě EAE. Pata jsou vynesena ve vztahu k zahájení terapie pro každého jedince (den 1 = druhý den remise). Skupiny 6 až 7 přežívajících myší byly ošetřovány int.ra venózně v den 1, 4, 7 a i 8 po začátku remise buď pomoci PBS (prázdné kroužky) nebo 25 nmol Acl-11[4Y] (plné čtverečky). Křížky označují jednotlivé myši, které uhynuly nebo byly usmrceny ve stupni 5 EAE. Počáteční episody choroby před remisí trvaly 3 až 18 dní (průměr 9 dní pro obě skupiny). Hodnota MMS během počáteční episody byla podobná pro obě skupiny myší. (3,0 ρ-ro skupinu ošetřenou PBS a 3,9 pro skupinu ošetřenou Acl11 [4Y1). Hodnota MMS po ošetření pro skupinu PBS byla 4,1 a mortalita 33 %. Hodnota MMS po ošetření pro skupinu ošetřovanou peptidem byla 0,3 a mortalita 0 %.

Obr. 11 znázorňuje, že intravenózní podávání Ad-11 nebo Acl-11[4Y1 vyvolává nereaktivitu T buněk.

a) Skupiny po 3 až 4 myších byly 5 a 10 dní před imunizací pomocí 150 pg MBP intravenózně ošetřeny buď PBS (plné kroužky) nebo 250 nmol Acl-11 (plné trojúhelníky). Testy proliferace lymfatických uzlin s MBP Acl-11 byly provedeny v den 9. Kontroly: Předběžné ošetření PBS PPD 108277/médium 1855 a předběžné ošetření Acl-11 PPD 88499/médium 1335.

b) Skupiny po 4 myších byly _LiLLUn± íůúid _L μα MBP i.ritravenózně ošetřeny buď PRS nebo 250 nmol Ad-11[4Y],

Testy produkce i 52 lymfatickými uzlinami se 150 μΜ Acl-11 nebo μΜ Acl-11(4YJ byly prováděny v den 10.

Příklad 3

Podávání peptidu v pokročilém stadiu

Po imunizaci MBP se vyvíjí u myší (P JL x SJL) Fl relapsující EAE (Fritz, R.B., a d., J. Immunol., 1983, 130:1024), což tento model EAE činí ideálním pro zkoumání terapeutické intervence. Přestože imunodomínantním encefal.i togenem u myš: (PJL x SJL) Fl je MBP Acl-11, je u roboto kmene encefalitogenní také subdominantní epitop MBP 3147. Za účelem zjištění, zda pro léčbu EAE, indukované MBP, je nutný jeden z těchto peptidů nebo oba, byly opakovány jednotlivé kroky příkladu 2, avšak s tou výjimkou, že skupiny myši byly ošetřeny v pokročilém stadiu choroby intravenózními injekcemi současně MBP Acl-11 a MBP 31-47 nebo samotným Acl-1'1. Skupiny kontrolních myší byly ošetřovány intravenózními injekcemi PBS nebo kontrolním peptidem Ova 323-339, což je peptid vážící se na Aď^lAp^u, nepříbuzný MBP a neimunogenní pro myši (PJL x SJL) Fl.

Obr. 5 znázorňuje, že opakované intravenózní injekce MBP Acl-11 buď samotného (obr. 5a) nebo v kombinací s MBP 31-47 (obr. 5b) snižují výskyt, intenzitu a mortalitu EAE. Ošetření oběma peptidy se konzistentně s výše popsanými pozorováními jiných pracovníků jeví jako poněkud účinnější než ošetřen: MBP Acl-11 samotným. Myši byly ošetřeny šesti intravenózními injekcemi peptidu během akutní a první relapsové fáze. Pak byly myší sledovány až do dne 125 v průběhu chronické remitujíc: fáze se žádnými známkami pozdního onemocnění ve skupinách ošetřených MBP peptidem (data neznázorněna). Kontrolní peptid Ova 323-339, podávaný intravenózně, neměl na onemocnění žádný vliv (obr. 5c), Ve zvláštním experimentu nebylo intravenózní podávání MBP 31-47 samotného účinné při léčbě EAE (data neznázorněna). Obr. 5a, bac ukazují účinnost intravenózního ošetření myší s EAE, indikovanou MBP. EAE byla indukována výše popsaným způsobem pomocí MBP ve skupinách po 11 až 16 myších. Myši byly ošetřovány intravenózní injekcí 250 nmol každého peptidu počínaje dnem 9, 12, 15, 21, 29 a 37. Křížky, používané na všech obrázcích, označují jednotlivé myši, které uhynuly nebo byly usmrceny ve stupni 5 EAE. Kontrolní skupina, ošetřovaná PBS, je označena plnými kroužky. Výsledky naznačuji, že imunodomiriantni encef autogenní peptid MBP je jednak nezbytný a jednak dostačující k léčbě EAE indukované MBP u myší (POL x SJL) Pl, jak ukazuje snížení intenzity a mortality EAE u ošetřených myší.

Příklad 4

Vícenásobné i.v. injekce Acl-11

Po přípravných krocích v příkladu 2 byly připraveny vícenásobné injekce Acl-11. Jedna injekce peptidu v den 9 zpozdila onemocnění o dva dny a snížila mortalitu ze 100 % na 63 %, ale u všech ošetřených myší se nakonec vyvinula silná EAE (data neznázorněná). Tři injekce peptidu během akutní fáze EAE zpočátku léčily onemocnění účinně, avšak během relapsové fáze si ošetřovaná skupina myší vyvinula onemocnění s pozdním nástupem (data neznázorněná). Tyto výsledky, uvažované společně, naznačuji, že pro léčbu MBP-indukovaného onemocnění u myší (PJh x SJL) Fl jsou potřebné vícenásobné Intravenózní injekce MBP peptidů během akutní a první relapsové fáze EAE. Pro dlouhodobé snížení intenzity onemocnění jsou tedy vyžadovány vícenásobné injekce Acl-11. Obr. 6 ukazuje, že Acl11 [41] léčí EAE v nižší dávce než Ac'1-11 a má na chorobu déletrvajícl účinek. EAE byla indukována pomocí MBP u skupin po 8 až 10 myších. Obr. 6a znázorňuje myši ošetřované i.v. ve dnech 12 a 15 pomocí PBS (fosfátem pufrovaný sáli nicky roztok; prázdné kroužky), 250 nmol Acl-11 (plné čtverečky) nebo 250 nmol Acl-llf4Y] (prázdné trojúhelníčky). Hodnota MMS pro myši ošetřované PBS byla 4,4 a mortalita 60 %. Hodnota MMS pro myši ošetřované Acl-il byla 3,9 a mortalita 37,5 %. Hodnota MMS pro myši ošetřované Acl-11[4Y] byla 2,1 a mortalita 0 %. Obr. 6b ukazuje myši ošetřované i,v. ve dnech 12, 15, 18, 21, 24 a 2?

buď PBS (prázdné kroužky) nebo 2,5 nmol Acl-11 (plné kroužky). Hodnota MMS pro myši ošetřované PBS byla 2,9 a mortalita 20 %. Hodnota MMS pro myši ošetřované peptidem byla 4,3 a mortalita 50 %.

Příklad 5

Ošetřeni analogem MBP peptidů, který tvoří in vivo stabilní komplexy s MHC třídy II

Protože komplexy peptid-MHC jsou funkční terapeutické jednotky, léč.icí EAE, původci odvodili, že Ac-1'1 [4Y] by měl být účinnější při léčbě EAE, indukované aktivním MBP, než Ací-11. K otestování této hypotézy byly provedeny stupně příkladu 2 s výjimkou injekčního schématu a bylo změněno dávkování. Obr, 6a ukazuje, že pouze dvě injekce Acl-11[4Y] časně v průběhu choroby vyvcdaly dlouhodobější účinek než dvě injekce Acl-11. Obr. 6b dále ukazuje, že opakované intravenózní injekce Acl11L4Y] jsou vysoce účinné při léčbě EAE v dávce 2,5 nmol (obr. 6c). Poté byly provedeny histologické zkoušky. Byly připraveny histologické řezy F.AE z mozku a míchy a barveny iiematoxylinem a eosinem (CVP, West Sac.ramento, CA). V řezech byly pozorovatelem naslepo hodnoceny zánětlivé infiltráty na stupnici 1 až Účinnost. Acl-11 [4Y] byla potvrzena histolog! ckými zkouškami mozkových a míšních řezů z myší, ošetřovaných peptidem a PBS, které vykazují výrazně snížený počet a intenzitu zánětlivých infiltrátů centrálního nervového systému u myši ošetřených peptidem (obr. 7). Obr. 7 demonstruje, že zánětlivé infiltráty jsou redukovány u myší, ošetřených Acl-11[4Y] . Zlepšená účinnost Acl-11[4Y] byla evidentní.

Ve výše uvedeném příkladu byla evidentní, zlepšená účinnost Acl-11[4Y], Původci odvodili, že in vivo vznikají stabilní komplexy peptid-MHC mezi Aa^uA3^u a Acl-1114Y], který byl intravenózně injikován, a tak způsobil pozorovanou zlepšenou účinnost.. Tyr o komplexy, vznikající in vivo, jsou detekovatelné pomocí hybndomu 1934, který byl odvozen z. encefalitogenního MBP-specifického klonu T buněk. Bylo postupováno podle stupňů pří.kladu 2 s výjimkou dob a množství injekcí a množství bvía

upravena, jak je	uvedeno dále. Hybridom T buněk 1934 ie
specifický pro MBP	Acl-11 postupem podi e Wraitha, U.C., a d. ,
Cell 1989, 59:24'·'	Stručně řečeno byly hybridomové buftkv

inkubovány v množství 5.10⁴ na jamku v mikrotitrových plotnách s plochým dnem s MBP peptidy nebo pcptidovými analogy. Jako buňky obsahující antigen bylo přidáno 5.10⁵ slezl.nnýc.h buněk (PJT. x SJL) F’l, ozářených 3000 rad. Médium bylo stejná jako při testech proliferace 1vmfatických uzlin s výjimkou toho, že doplněk séra tvořilo 10 % fetálního telecího séra místo normálního myšího séra. Po 24 h byly odebrány supernatanty a byla zkoumána jejich schopnost podporovat růst buněk HT2. Poté byl z injikovaných myší v různých dobách po injekci 250 nmol Acl-11[4Y] odebrány sleziny a splenočyty byly použity jako buráky obsahující antigen pro Acl-11-specifický hybridom 1931. Ke kul túrám nebyl přidáván žádný další peptid. Obr. 8 ukazuje, že slezinné buňky, které byly ín vivo podrobeny „pulsaci. s Acl-11 [4Y1, jsou vysoce účinné pří aktivaci hvbridomu 1934. Schopnost aktivovat hybridom trvá maximálně 2 h po injekci, pak začíná klesat do čtyř až šesti h po injekci. Po 10 h po injekci Acl-11[4Y] je aktivace minimální a po 20 h není přítomna (data neznázorněna; . Jak je patrné z obr. 8, experimenty s Acl-11 aktivaci hvbridomu slozinnými buňkami. z injikovaných myší nevykazují ani 1 h po injekci {data neznázorněna) . Jak je podrobněji znázorněno na obr. 8, komplexy popt.i d-MHC, vzniklé in vivo, jsou detekovatelné u myší injikovaných Acl-1114Y], Skupinám po 2 myších bylo v různých časových okamžicích před vynětím slezin (1 až 10 h) intravenózně i.njikováno 250 nmol Aoi-1'![4Y]. Splenočyty z injikovaných myší byly vyšetřovány na schopnost aktivovat buňky hvbridomu 1934 k produkci TL2. Vvsledkv isou vyiádřeny laku proliferace HT2. Tylo výsledky podporují hypotézu, že vznik stabilních komplexů peptid-MHC in vivo přispívá k účinnosti terapeutického analogu MBP peptidů.

Příklad 6

Syntéza myšího MBP peptidů Acl-11

Myší MBP peptid Acl-11 byl syntetizován standardní syntézou Fmoc/tBoc a čištěn pomocí HPLC. Sekvence aminokyselin peptidů Acl-11 je následující:

Indukce EAE

EAE byla indukována υ myších samic (SJL x PL) Fl (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) o stáří 6 až 8 týdnů Imunizací myší 100 pg čištěného' morčecího MBP v CFA (G1BCO Lab., Grand Island, NY) , obsahujícího 400 pg kmene M. Lubercu.1 osís H37RA (DIFCO Lab., Detroit, MI), subkutánně u kořene ocasu, V den imunizace a po 48 n bylo intravenózně dvakrát podáno 200 ng toxinu dávivého kašle (JIIL BIOSCIENCE, Lenexa, Kansas). Myši byly denně monitorovány na příznaky choroby a hodnoceny podle stupnice: 0 - žádné klinické známky EAE, 1 - ochablý nereagující ocas, 2 - částečná paralýza zadních končetin, 3 úplná paralýza zadních končetin, 4 - částečná až úplná paralýza předních končetin, 5 - moribundní. Data jsou vyjadřována jako průměr z hodnocení, intenzity choroby za každý den zahrnující, všechna zvířata ve skupině. Myši byly sledovány po dobu 26 dní. Jakmile myš uhynula na EAE, bylo do výpočtů pro všechny následující dny zahrnuto hodnocení. 5.

Účinek iFN-β na EAL

Byl proveden titrační. experiment, pro účely stanovení účinků různého dávkování IFN-β na EAE (obr. 13). Jedna skupina myší byla oo indukci EAE v den 9, intraperitoneálně PBS (kontrola), jedna skupina myší byla v den 9, 13 a 16 ošetřována 10000 jedn. IFN-β (prázdný kroužek) a jedna skupina myší byla v den 9, 13 a 16 ošetřována 2000 jedn. IFN-β (plný kroužek). Jak je patrné z obr. 13, příznaky EAE jsou v každém časovém bodě pro obě dávky IFN-β podobné, což. naznačuje, že pro experimenty s IFN-β by byla vhodná nižší dávka, která jo preferována, protože možnost toxicity v důsledku vyšší, dávky IFN-β je méně pravděpodobná. Ve zbylých experimentech, znázorněných na obr. 12a až 12c, bylo použito 2000 jedn. IFN-β, protože tato dávka vykázala zlepšení klinického hodnocení.

Jak je patrné z obr, 12a, byla ošetřována v den 9, 12, 16 a 20 kontrolní skupina myší PBS a jiná skupina myší 2000 jedn. ΙΕΜ-β. Jak je patrné z obr. 12a, skupina ošetřovaná IFN-β měla v průběhu času pouze mírně slabší příznaky než kontrolní skupina.

Účinek myšího MBB peptidu Acd-ll· na EAE

By] zjišťován účinek myšího MBP peptidu Acl-11 a výsledky jsou zobrazeny na obr. 12b. Jedna skupina myší byla v den 10, 13, 17 a 21 po indukci EAE ošetřována i.p. PBS (kontrola) a druhá skupina myší byla v den 10, 13, 1'/ a 21 ošetřována i. v. 250 nmol peptidu Acl-11. Myši. byly monitorovány výše uvedeným způsobem. Jak je znázorněno na obr. 12b, myši. ošetřované Ac1.-ll měly slabší příznaky než kontrolní skupina.

Účinek ošetření kombinací peptidu Acl-11 a iFN-β na EAE

Účinky ošetření kombinací peptidu Acl-11 a IFN-β jsou znázorněny na obr. 12c. Jedna skupina myší byla po indukci. EAE ošetřována PBS (kontrola) a jedna skupina myší byla v den 10, 13, 17 a 21 ošetřována í.v. 250 nmol peptidu Acl-11 (otevřené šipky) a v den 9, 12, 16 a 20 i.p. 2000 jedn, ΙΕΝ-β. Jak je znázorněno na obr. 12c, skupina myší ošetřovaná kombinací peptidů a 1 ΕΝ-β vykazovala výrazný pokles síly příznaků ve srovnání s kontrolní skupinou i ve srovnání s ošetřováním samotným IFN-β nebo samotným peptidem, znázorněným na obr. 12a a 12b, což ukazuje na svnergický účinek této kombinace. Léčebný režim, zahrnující kombinaci peptidů a ΙΕΝ-β, tedy poskytuje zvýšený účinek, vedoucí ke snížení síly příznaků EAE.

Ekv ivaie rity

Zkušený odborník zná nebo múze pouze rutinními experimenty nalézt různé ekvivalenty zde popsaných konkrétních postupů. Tyto ekvivalenty se považují za spadající do rozsahu vynálezu a pokryté následujícími patentovými nároky.

Příklad 7

Podávání peptidů savcům pro léčbu EAE vyvolané míšním homogenizátem (SCH) jako modelu sklerózy multiplex

Syntéza peptidů

Peptidy byly připraveny automatizovanou syntézou peptidů (ABI 430A, Applied Biosciences, Foster City, CA) s použitím standardní 9-fIuorenylmethoxykarbonylové chemie. Peptidy byly čištěny vysokotlakou kapalinovou chromatografií a bylo potvrzeno složení aminokyselin. Zvolené sekvence peptidů byly MBP Acl-11 ASQKRPSQRHG, MBP Acl-11 [4Yj ASQARPSQRHG, MBP Acl11 [4 Y] ASQYRPSQRHG, MBP 31-47 RHRDTGILDS1GRFESG, Ova 323-339 ISQAVHAAHAElNEAGR a Ova 323-337 ISQAVHAAHAElNEA.

Čištěni MBP

SCH byl připraven z morčecích mích (Keystone Biologicals, Cleveland, OH) s použitím modifikace metody podle Smitha, M.E.,

J. Neurochem., 1969, 16:83. Směs proteinů SCH byla lyofilizována a použita podle sušiny.

Indukce EAE, hodnoceni a peptidová terapie

EAE byla indukována u myší (PJL x SJL) El, získaných od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Když myši dosáhly veku 8 až 14 týdnů, byla indukována EAE imunizací 500 až 1000 pg SCK, emulgovaného v kompletním Ereundově adjuvaňs (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), doplněném dalšími 400 pg na myš M. tubercul osis H37Ra (Diíco Laboratories, Detroit, MI). V době imunizace a o 48 h později bylo podáno 200 ng toxlnu dávivého kasie (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Myši byly hodnoceny na základě klinických znaků podle stupnice: 1. paralýza ocasu, 2. částečná paralýza zadních končetin, 3. úplná paralýza zadních končetin, 4. paralýza předních končetin, 5. moribundní nebo mrtvá. Myši s hodnocením 5 byly usmrceny. Po smrti byly myši vyřazeny z dalších výpočtů průměrného klinického hodnocení. Intravenózně byly podávány peptidy, jak je uvedeno dále v jednotlivých příkladech.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 16, který ukazuje, že Acl-11[4Y] zvrací průběh EAE, je-li podán po nástupu paralýzy. EAE byla Indukována u skupin po 14 myších pomocí SCH. Terapie byla zahájena u každé myši individuálně poté, co se u ní vyvinuly klinické znaky EAE. Data jsou vynesena ve vztahu k zahájení terapie u každého jedince (den 1 - nástup klinických znaků pro každou jednotlivou myš). Myši byly ošetřovány v den 1, 3, 6 a 9 choroby PBS (plné čtverečky), i.v. 250 nmol Acl11 [4Y] (prázdné trojúhelníky) nebo 250 nmol AcI[4Yj (prázdné kroužky). Hvězdička označuje jednotlivé myši, které uhynuly nebo byly usmrceny v důsledku stupně 5 EAE.

Obr. 17 ukazuje, že Acl-11[4Y] zabraňuje nástupu EAE, je1 i podán předtím, než se projeví příznaky choroby. EAE byla indukována pomocí SCH. Terapie byla zahájena u každé myši individuálně osmý den po indukci choroby pomoci gpSCH. Data jsou vynesena ve vztahu k zahájení terapie pro každého jedince. Skupiny přeživších myší byly v den 8, 10, 13 a 17 ošetřovány

i.v. 25 nmol Acl-11[4Y] (prázdné trojúhelníky) nebo s.c. 25 nmol Acl-11[4Y] (plné kroužky). Jedna skupina nedostávala žádné ošetření (prázdné čtverečky).

Výsledky na obr. 16 a 17 ukazují, žc oba způsoby podávání jsou účinné při prevenci nástupu příznaků.

Příklad 8

Bylo postupováno stejně jako v příkladu 2, avšak nebyly prováděny testy praliferacc lymfatických uzli n a produkce IL2. EAE byla indukována v den 0 pomocí gpMBP a pak byl 3 skupinám myší v den S, 10, 13 a graficky znázorněny na (prázdné trojúhelníky), podáván Acl-11[4Y). Výsledky jsou obr. 18 jako intravenózní aplikace subkutánní injekce (plné kroužky) a kontrola (prázdné kroužky) . Předběžné ošei.ření (například ošetření před projevem příznaků) pomocí Acl-11[4Y] může zamezit vzniku EAE indukované pomocí gpMBP.

Příklad 9 cDNA kódující lidský MOG protein

V počátečním pokusu získat lidskou DNA kódující MOG protein byla knihovna lidské cDNA podrobena polymerasové reakci (PCR) s použitím primerů 3' a 5', konstruovaných na základě publikované sekvence kódující, krysí MOG podle Gardiniera a d. (viz výše). Sekvence lidského MOG nemohla být tímto způsobem získána, pravděpodobně v důsledku nedostatku homologie na konci 5' a/nebo 3' lidské a krysí sekvence.

Proto byly konstruovány čtyři vnitřní krysí ol igonukleotidy. I)va z nich byly homologní k hornímu řetězci.

genu (primery 94-111 a 166-183) (SEQ ID NO: 34), báze 1 počínaje ATG) a dva byly homologní se spodním řetězcem genu (primery 538-555 (SEQ ID NO: 35) a 685-702). Kombinace primerů 166-183 (SEQ ID NO: 34) a 538-555 (SEQ ID NO: 35) byla úspěšná pří uskutečňování amplifikace fragmentu o očekávané velikosti přibližně 400 bp z knihovny cDNA lidského mozku. Sekvence těchto primerů byla:

a) 16 6-183: CAGAATCCG GGAAGAATGOCACGGGC (SEQ ID NO: 34) a

b) 538-555: CAGC GGC C GCAC GGAG T T T T CC T C T CAG (SEQ ID NO: 35)

V primerů 166—383 (SEQ ID NO: 34) je přítomno místo EcoRI v primerů (SEQ ID NO: 35) se nachází místo Notl.

Produkt PCR 400 bp byl klonován do expresního vektoru pVl.1393 štěpením pVL1393 (Pharmigen CA) pomocí EcoRI a Notl, štěpením amplifikováného produktu stejnými enzymy a ligaci vzniklých fragmentů. Insert byl ověřen štěpením několika klonů odvozených z lícovaných plasmidu pomocí EcoRI a Notl a sekvenovánim vzniklého 400 bp fragmentu lidského MOG. Předpokládá se, že vzniklý insert postrádá 184 bp sekvence 5' a 201 bp sekvence 3' , vztaženo na krysí otevřený čtecí rámec o velikostí 738 bp.

Z horního a spodního řetězce insertu 400 bp poloh 346-363 byly konstruovány dva primery:

5' -CAGAATTCTCAGGTTCTCAGATGAAGGA-ď (SEQ ID NO: 36) a

5'-AAGCGGCCGCTATCCTTCATCTGAGAACCT-3' (SEQ ID NO: 37) kde je v prvním řetězci přítomno místo EcoRI a ve druhém místo Notl. Podtržené oblasti odpovídají sekvenci MOG.

Horní, resp. spodní primer lidského MOG 346-363 (SEQ ID NO: 36 a 37) byl použit v kombinaci s výše uvedeným krysím primerem 5', resp. 3' k amplifikaci chybějících konců 5' a 3' genu z téže knihovny cDNA lidského mozku, jaká byla použita dříve. Byl získán produkt PCR, odpovídající 3'-konci genu, ale odpovídající 5'-konec nevznikl.

Získaný 3'-fragment měl očekávanou velikost 400 bp a tento fragment byl klonován do pVL1393 a sekvenován.

K získání 5'-části genu byla knihovna lidské mozkové dřeně kgtlO, získaná od Cloteoh, která byla předem amplifikována a měla Litr 8.1Ο¹⁰ pfu/ml, podrobena screeningu postupem předepsaným výrobcem. Knihovna byla nanesena na 12 velkých ploten v množství 30000 plaků/plotnu a plaky byly přeneseny na nitrocelulózové filtry (2 opakované fIltry/plotnu). Dvanáct filtrů, získaných z 12 různých ploten, pak bylo hybridizováno s ^Í2P značenou sondou, odpovídajíc! původně klonovanému vnitřní.mu 400 bp fragmentu lidského MOG (polohy 184-534). Bylo získáno 22 silně pozitivních. Pro každý pozitivní byla z. původních ploten vyzvednuta zátka a inkubována přes noc pufrem s ředěním λ za účelem vymytí fága z agaru. Zkumavka pal·: byla odstředěna a supernatant přenesen.

Z každého poolu byla amplifikována DNA s použitím buď přímého primeru kgLIO s místem SstlI:

5^ř-CTTTTGAGCáxAGTTCAGCCTGGTTAAG-3' (SEQ ID NO: 38) nebo reverzního primeru kgtlO s místem Xhol:

5'-ACCTCGAGGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA-3' (SEQ ID NO: 39) stejně jako horního nebo spodního řetězce vnitřní.ho přímenu lidského MOG:

5'-G GT GC GGG A AAGGTGAC1¹C TCAGGATC CGGAAT-3' (SEQ ID NO: 40) nebo

5EQ ID

Poslední dva primery (SEQ ID NO: 40 a 41'

NO: 41) zahrnují místo

BamHI (v sekvencích podtržené), přirozeně přítomné v sekvencí lidského MOG.

Primery byly použity ve čtyřech různých kombinacích: i) přímý horní/spodní interního MOG, 2) reverzní spodní/spodní interního MOG, 3) horní interního MOG/reverzní spodní a 4) horní interního MOG/přímý horní.

První dvě kombinace poskytly 5'-konec genu (až po místo BamHI) a poslední dvě 3'-konec genu. Obě části 5' a 3' obsahují nepřeložené oblasti. Který z obou členů každé kombinace skutečně vede k požadovanému fragmentu, závisí na orientací cDNA, klonovaných do XgtlO.

Velikost získaných fragmentů se v jednotlivých poetech lišila. Pět největších fragmentů 5' nebo 3' bylo subklonováno do míst SstlI a BamHI nebo BamHI a Xhol polylinkeru SK. Tři. klony z každého poolu pak byly sekvenovány, aby se vyloučí.la přítomnost chyb PCR. Tím se získala úplná sekvence oblasti kódující gen, stejně jako 174 bp nepřeložené sekvence 5' .

Úplná získaná sekvence DNA (SEQ ID NO: 1) a odvozená sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 2) jsou zobrazeny na obr. 1.

Lidský gen MOG kóduje preprotein o 248 aminokyselinách, který má 87% homologii s 246 aminokyselinami v krysím proteinu. Maturovaný protein obsahuje 218 aminokyselin, číslovaných na obr, 1 1 až 218 (SEQ ID NO: 2) . Maturovaný protein začíná glycinem, znázorněným v poloze 1, a je odvozen od preproteinu o 248 aminokyselinách Štěpením z presekvence sahající od startovacího kodonu MET k alaninovému zbytku těsně předcházejícímu glycinu v poloze 1.

Příklad PA

Exprese zkráceného lidského MOG ve hmyzích buňkách SF-9 a E. coli

Exprese SF-9

Přenosový vektor PVL1393, obsahující cDNA zkráceného lidského MOG kódující aminokyseliny 1-121 lidského MOG (prvních 121 aminokyselin SEQ ID NO: 2) byl kotransfikován do buněk SF-9 spolu s 1rnearizevanou DNA Baculoviru Baculogold (Pharmmgen, San Di.ego, CA) . Po 4 dnech byl odebrán supernatant kultury, obsahující rekombinační víry. Rekombinační virus byi vyčištěn od plaků a podroben třem cyklům amplifikace k získání zásobního viru o vyšším titru. Buňky AF-9 pak byly infikovány zásobním vírem v množství MOI 2,0. Supernatant z infikovaných buněk byl odebrán po 48 h po infekci a nanesen na sloupec agarosv NiNTA. Rekombinační protein MOG byl eluován za nedenaturujících podmínek s použitím 250 mM ímidazolu, dialyzován proti 5% kyselině propionové a H₂0 a následně lyofilizován. Koncentrace proteinu byla odhadnuta pomocí BCA. Čištěný protein MOG byl visualizován na 12,5% polyakrylamidovém gelu, barveném Coomassie blue.

Příklad 10

Podle příkladů 9 a 9A byl připraven zkrácený lidský MOG (huMOG). MBP (morče) byl připraven popsaným způsobem. Bylo postupováno podle příkladu 2, avšak EAE byla indukována ve třech oddělených skupinách myší s použitím 75 pg gpMBP a 100 pg huMOG (prázdné trojúhelníky) a kombinace 75 pg gp MBP a 100 pg huMOG (plné čtverečky). Graf na obr. 19 ukazuje průběh onemocnění pro každý případ v tomto příkladu. Onemocnění vyvolané současně MOG a MBP je silnější než v případě každého z nich samotného. Výsledky naznačují, že k onemocnění přispívá MOG i MBP.

I' r i kl a cl i. 1

Onemocnění bylo vyvoláno stejně jako v příkladu 10 pomocí huMOG + gpMBP (den 0 - vyvoláni onemocnění). Myši byly ošetřovány před nástupem příznaků 250 nmol Acl-11 [4YJ a kontrolou (PBS) v den 6, 8, 1, 13, 1.7, 22 a 27 (šipky označují ošetření). Jak ukazuje graf na obr. 20, ošetření Ac1-11[4YJ (prázdné, čtverečky) významně snížilo průměrný klinický záznam v porovnání s kontrolami (plné čtverečky).

Claims (41)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden peptid, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5,

   MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2, nebo jejich modifikace nebo analogy nebo pepti domimcceí ka.
2. 2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený peptid je vybrán ze skupiny zahrnující

   MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2.
3. 3. Přípravek podle nároku 1, vyznačující tím, že uvedeným peptidem je MBP-4.
4. 4. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex savce,

   2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden peptid odvozený od MBP, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBPnm rnn MBP~4 a MB>P ’ znázorněné na obr. 2, přičemž tento přípravek zahrnuje alespoň 40 % celkové reaktivity T buněk vůči MBP v populaci jedinců majících T buňky reagující na MBP.

   MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2.
5. 5. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň dva peptidy MBP, vybrané ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3,

   109
6. 6. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující

   MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2.
7. 7. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že jeden z uvedených peptidů zahrnuje MBP-4.
8. 8. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden peptid, vybraný ze skupiny zahrnující sekvence aminokyselin 13-25, 31-50, 61-80,

   82- 92, 82-96, 82-97, 82-98, 82-100, 82-100 [100P>Y], 83-100, 83101, 84-97, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 87-99[91K>A], 88100, 88-99, 411-135, 122-140, 139-170, 141-160, 142-166, 142168, 146-160 a 153-170, znázorněné na obr. 14.
9. 9. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden peptid, vybraný ze skupiny zahrnující sekvence aminokyselin 13-25, 87-99, 8799[91K>A], 82-100, 82-100[100P>Y], znázorněné na obr. 14.
10. 10. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň dva peptidy odvozené od MBP, přičemž alespoň jedním peptidem je MBP-4 a alespoň jeden peptid je vybrán ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-5, 13-25, 31-50, 6180, 82-92, 82-96, 82-97, 82-98, 82-100, 82-100 [1.00P>Y], 83*100,

    83- 101, 84-97, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 87-99[91K>A], 88100, 88-99, 11 1 -135, 122-140, 139-1.70, 141-160, 142-1 66, 142168, .146-160 a 153-170, znázorněné na obr. 2 a 14.

    110
11. 11. Přípravek podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že alespoň jedním peptidem je MBP-4 a alespoň jeden peptid je vybrán ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP· 2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5,

    MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-5, 13-25, 87-99, 87-99[91K>A], 82100, 82-100[100P>Y].
12. 12. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex u savec, v y z n a č u j i c i se t í m , že zahrnuje alespoň dva peptidy MBP, vybrané ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2, přičemž tento přípravek zahrnuje alespoň 40 % celkové reaktivity T buněk vůči MBP v populaci 'jedinců majících T buňky reagující na MBP.
13. 13. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že zahrnuje procentický podíl. celkové reaktivity T buněk vůči. MBP, dostatečný k tomu, aby podávání přípravku jedinci s MS vedlo k tlumení autoimunitní odpovědi MS.
14. 14. Přípravek pro léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň dva peptidy MBP, obsahující epitopy T buněk, přičemž tento přípravek je vybrán ze skupiny zahrnující přípravky sestávající

    MBP-1, MBP-2, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1.1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

    111

    MBP-l.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-l.1, MBP-2.1 a MBP-4;

    MBP-l, MBP-2.1 a MBP-4;

    MBP-l.1, MBP-2 a MBP-4;

    MBP-l.1, MBP-2.1 a MBP-5;

    MBP-l.1, MBP-2.] a MBP-3;

    MBP-l a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MRP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-l.1 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1., MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-l nebo MBP1.1;

    MBP-l.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100 [100P>Y] , 87-99 a 87-99[91K>A], znázorněné na obr. 14;

    MBP-l.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2;

    MBP-l.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100 [100P>Y], 87-99 a 87-99[91K>A], znázorněné na ob r. 14 ;

    MBP-l.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBp-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2;

    MBP-l.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>Y], 87-99 a 87 - 99[9lK>A], znázorněné na obr. 14;

    MBP-l.1, MBP-3, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující

    MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2 .

    112
15. 15. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk, odvozený od lidského myelinového oligodendrocytového proteinu (MOG).
16. 16. Přípravek podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že uvedený peptid odvozený od MOG je vybrán ze skupiny zahrnující

    lidský MOG 1-13 GQFRVIGPRHPIR lidský MOG 103-135 HSYQEEAAMELKV lidský MOG 1-121 GQFRVIGPRHPIRALGDEV ELPCRTSPGKNATGMEVGWY RPPFSRWHLYRNGKDQDGD QAPEYRGRTELLKDAIGEGK VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW lidský MOG 1-20 GQFRVIGPRHPIRALVGDEV, lidský MOG 11-30 PIRALVGDEVELPCRISPGK, lidský MOG 21-40 ELPCRISPGKNATGMEVGWY, lidský MOG 31-50 NATGMEVGWYRPPFSRWHL, lidský MOG 141-160 TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE, 11 d s k ý MO G '151-17 0 YRDRGKLRAEIENLHRTFDP, lidský MOG 161-180 IENLHRTFDPHFLRVPCWKT lidský MOG 199-218 YNWLHRRLAGQFLEELRNPE.
17. 17. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk, odvozený od MOG.

    113
18. 18. Izolovaný peptid, odvozený od MBP, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1,1, MBP-1.2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, znázorněné na obr. 2, nebo jejích modifikace nebo analogy.
19. 19. 'Izolovaný peptid podle nároku 18, kterým je MBP-4 nebo jeho modifikace nebo analog.
20. 20. Analog peptidu podle nároku 18, kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek je nahrazen alaninem, kyselinou glutamovou nebo methylaminokyselinou.
21. 21. Peptid, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, znázorněné na obr. 2, kde lysin (K) je nahrazen alaninem (A).
22. 22. Peptidický analog MBP-2.1, kde lysin (K) v poloze 10 je nahrazen alaninem (A), přičemž tento peptidický analog má sekvenci aminokyselin DENPWIIFFANIVTPRTPPPSQGK.

    vybraného ze skupiny MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a nidická vazba je nahrazena peptidické vazby nebo
23. 23. Peptidomimetikum peptidu zahrnující MBP-1, MBP-i.l, MBP-i.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6,

    MBP-5, kde alespoň jedna normální pept nepeptidickou vazbou, analogem redukovaným analogem vazby.
24. 24. Peptid, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.6, MBP-3, adicí alespoň vybraný

    MBP-2.1, ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1,

    MD n_o

    11UJ. L_.

    ΜΒΓ 'Ί

    MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, který byl modifikován jednoho nabitého aminokyselinového zbytku na

    114 aminoterminální konec, karboxyterminální konec nebo oba konce pro zvýšená rozpustnosti peptidů ve vodném roztoku.
25. 25. Peptid, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1,

    MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5,

    MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a MBP-5, který byl modifikován adicí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku na aminoterminální konec, karboxyterminální konce nebo oba konce pro zvýšení aktivity T buněk, přičemž uvedený aminokyselinový zbytek je odvozen od sekvence nativního MBP proteinu.
26. 26. Způsob léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se savci podává přípravek podle nároku í v množství dostačujícím k tlumení autoimunitní odpovědi při skleróze multiplex.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že podávání je vybráno ze skupiny zahrnující i. v.

    injekci v neimunogenní formě, subkutánní injekci v neimunogenní formě, orální aplikaci, ínhalační aplikací, sublingváiní aplikaci, transdermální. aplikaci, rektální aplikaci nebo jakoukoli jejich kombinaci,

    22. Způsob podle nároku 26, v yznačující se tím, že podávání se provádí subkutánně v neimunogenní formě.

    19. Způsob prevence nástupu sklerózy multiplex u savce, náchylného k skleróze multiplex, tím, v množství multiplex.

    ze se savci podává vyznačující se přípravek podle nároku 1 dostačujícím k prevenci nástupu příznaků sklerózy

    115
28. 30. Způsob léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se savci podává přípravek podle nároku 5 v množství dostačujícím k tlumení příznaků sklerózy multiplex.
29. 31. Způsob léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se savci, podává přípravek podle nároku 10 v množství dostačujícím k tlumení příznaků sklerózy multiplex.
30. 32. Způsob léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se savci podává přípravek podle nároku 14 v množství dostačujícím k tlumení příznaků sklerózy multiplex.

    multiplex u že se savci
31. 33. Způsob léčení sklerózy vyznačující se tím, přípravek podle nároku 15 v množství dostačujícím k tlumení příznaků sklerózy multiplex.

    savce,

    Dodává

    J Z| '/ i η |~I . 1-»

    ·. > 1 . Zj P L.l O IJ vyznačují c i sklerózy multiplex u savce, se ti m , že se současně nebo postupně podávají alespoň dva různé přípravky podle nároku 1 v množství dostačujícím k tlumení příznaků sklerózy multiplex.
32. 35. Léčebný režim pro léčení sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se současně nebo postuoně oodává iako iednorázová léčebná spisodri konibinscG peptidů odvozených od MBP, vybraných ze skupiny kombinací peptidů zahrnující

    MBP-1, MBP-2, MBP-3, MBP-4 a MBP-5;

    116

    MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-3, MBP-4 a MBP-5

    MBP-1.1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1, MBP-2, MBP-4 a MBP-5;

    MBP-1.1, MBP-2.1, MBP-4 a MBP-5; MBP-1.1, MBP-2.1 a MBP-4; MBP-1, MBP-2.1 a MBP-4; MBP-1.1, MBP-2 a MBP-4;

    MBP-1.1, MBP-2.1 a MBP-5;

    MBP-1.1,

    MBP-2.1 a MBP-3;

    MBP-1 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-1.1 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2,3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6;

    MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1 nebo MBP1.1 ;

    MBP-1.1, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100 [100P>Y], 87-99 a 87-99 [ 91K>AJ, znázorněné na obr. 14;

    MBP-1.1, MBP-2.3,

    MBP-1.1, 82-100, obr. 14;

    MBP-1.1,

    MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.4/ MBP-2.5 nebo MBP-?, 6, znázorněné na obr. 2;

    MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující

    82-100[100P>Y], 87-99 a 87-99 [91.K>A] , znázorněné na

    MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující

    MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.5, znázorněné na

    117

    MBP-1.1, MBP-5, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující 82-100, 82-100[100P>Y] , 87-99 a 87-99 [ 91K>A], znázorněné na Obr. 14;

    MBP-1.1, MBP-3, MBP-4 a peptid vybraný ze skupiny zahrnující MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5 nebo MBP-2.6, znázorněné na obr. 2.
33. 36. Multipeptídová formulace pro farmaceutické podávání jedincům s MS, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň dva peptidy MBP, přičemž každý tento peptid je rozpustný a stabilní při předem stanoveném fyziologicky

    přijatelném pH a tyto peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a

    MBP-5.
34. 37. Způsob léčení pokročilého stadia sklerózy multiplex u savce, vyznačují, cí se tím, že se savci podává terapeutický přípravek zahrnující alespoň jeden peptid s aktivitou T buněk, odvozený od myelinového antigenu, nebo analog tohoto peptidu v množství účinném při regulaci příznaků sklerózy multiplex.
35. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedený myeiínový antigen je vybrán ze skupiny zahrnující myelinový bazický protein (MBP), myelinový oligodendrocytový protein (MOG), proteolip.idový protein (PLP) a myel.in-asociovaný glykoprotein (MAG) .
36. 39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedené podávání probíhá během akutní fáze sklerózy multiplex.

    118
37. 40. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedené podávání probíhá během remise příznaků onemocnění sklerózou multiplex,
38. 41. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedený peptid zahrnuje peptidový analog s vazebnou afinitou MHC, která je vyšší než vazebná afinita MHC peptidu, od něhož je analog odvozen.
39. 42. Způsob léčení pokročilého stadia sklerózy multiplex u savce, vyznačující se tím, že se savci podává terapeutický přípravek, zahrnující alespoň jeden MBP peptid, vybraný ze skupiny zahrnující MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP-2.5, MBP-2.6,

    MBP-3, MBP-3.1, MBP-4, MBP-5, 13-25, 31-50, 61-80, 82-92, 8296, 82-97, 82-98, 82-100, 82-100[100P>Y], 83-100, 83-101, 8497, 84-100, 85-100, 86-105, 87-99, 87-99[91K>A], 88-100, 88-99, 111-135, 122-140, 139-170, 141-160, 142-166, 142-168, 146-160 a 153-170, znázorněné na obr. 2 a 14, nebo analog tohoto peptidu v množství účinném při tlumení příznaků sklerózy multiplex.
40. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že uvedený peptid je vybrán ze skupiny zahrnující

    MBP-i, MBP-1.1, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBP2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4, MBP-5, 13-25, 87-99, 8799[91K>A], 82-100, 82-100[100P>Y] nebo jejich analogy.
41. 44. Způsob podle nároku 37, vyznačuj i c í s e tím, že uvedený peptid je odvozen od lidského MOG a je vybrán ze skupiny zahrnující