CS752987A2 - Method of lipophilic proteins extraction - Google Patents

Description

Tento vynález se týká získáváníproteinu a jeho čištění. Podle jednoho aspektu sevynález týká oddělování rozpustného proteinu z roz-drcených buněk. Podle jiného aspektu se vynález tý-ká selektivní extrakce bílkwin.

Technologie používající rekombi-nantní DNA se rychle stává účinným nástrojem pro vý-robu pepiidů a proteinů, které jsou zajímavé při růz-ných diagnostických, therapeutických a chemickýchaplikacích apod. Jedenz problému , se kterým se všaktato technologie často střetává, spočívá v potřebězískat požadovaný protein v přečištěné formě bez zne- v čištujících proteinů, které rovněž vznikají v průběhuexprese požadovaného produktu. Tento vynález je zamě-řen na zlepšené způsoby získávání proteinů vyrobe-ných technologiemi s použitím rekombinantní DNA. Úkolem předloženého vynálezu jeproto vyvinout způsob účinné izolace požadovaných proteinů vyrobených geneticky modifikovanými kvasinkový-mi organismy.

Tento a další úkoly vynálezu jsouzřejmé z dalšího popisu a připojené definice předmětuvynálezu. 3

V souladu s vynálezem se Vže lipofilní proteiny vyrobené geneticky modifik kmeny Píchla je možno selektivně získávat za použitípufru pro lysí obsahujícího chaotropické soli. Při roz-bíjení buněk kmenů Píchla v přítomnosti takových pufrůpro lysí dochází ke snížení celkového množství extrahova-ného proteinu, přičemž účinek na extrakci požadovaných li-pofilní ch proteinů je jen malý. Rozpustný buněčný extraktzískaný při realizaci tohoto vynálezu obsahuje tedy zvýše-nou koncentraci lipofilního proteinu vzhledem ke všemostatním proteinům obsaženým v extraktu, čímž se zjedno-dušují další čisticí stupně, kterým se požadovaný lipofil- ní protein podrobuje. Předmětem je způsob extrakce lipofil-ních proteinů majících tendenci k asociaci s lipidovými mem-bránami nebo aglomerujících do struktur micellárního typuv přítomnosti ií lipidů nebo látek podobných lipidům, z hos-titelských buněk rodu Pichia, vyznačující se tím, že se a) buňky rozbijí zpracováním při teplotě od O do 10 °C vprůběhu 0,5 do 30 minut, přičemž rozbíjeni buněk se provádí v přítomnosti extřakčního media obsahujícího alespoňjednu chaotropickou sůl v jednomolární až osmimolárňíkoncentraci v prostředí tlumeném na hodnotu pH vhodnoupro udrženi lipofilního proteinu ve stabilní formě, vrozmezí od 6 do 8 a b) izoluje se rozpustná frakce získaná ze stupně a), c) načež se popřípadě rozpustná frakce získaná ze stupně b)zpracovává za účelem izolace koncentrovaného podílu li-pofilního proteinu.

Rozpustná frakce izolovaná způso-bem podle tohoto vynálezu se může dále zpracovávat tech-nologiemi známými v tomto oboru za účelem další koncentra-ce a čištění požadovaného proteinu. Protein v rozpustnéfrakci je tedy možno koncentrovat dialýzou, průchodem přespryskyřici a reversní fází a následující elucí minimálnímobjemem rozpouštědla, srážením, ultrafiltrací, lyofiliza-cí apod. Jako technologie, které jsou k dispozici pro dal-ší čištění požadovaného proteinu, je možno uvést použitípryskyřice s určitou vylučovací mezí velikosti, vysoceúčinnou kapalinovou chromátografii (HPLC), iontovou vý-měnu, hydrofobní chromatografii apod.

Označení "lipofilní protein” sev tomto popisu používá pro proteiny, které mají tendencik asociaci s lipidovými membránami nebo které se v pří-tomnosti lipidů nebo látek podobných lipidům organizujído struktur připomínajících micelly. Takové

O - 5 - proteiny obsahují obvykle vysoký podíl hydrofobníchaminokyselin, t j . isoleueinu, valinu, leucinu, fenyl-alaninu, tryptofanu a alaninu.

Jako příklady lipofilních protei-nů, na které se však tento termín neomezuje, je mož-no uvést všechny formy povrchového antigenu hepatitisB, včetně S-formy, preS^-formy, preS^-formy apod. fosfatidylserin dekarboxylázu ( z E. coli)$ lambda hakteriofágový D-protein;nízkohustotní lipoprotein (LDL);vysokohustotní lipoprotein (HDL) adihydroorotát dehydrogenázu.

Pod pojmem "chaotropická sůl” se k v tomto popisu rozumějí soli, jejichž anionty podpo-rují převádění apolárních skupin do vody. Tyto solizahrnují sloučeniny, které obsahují thiokyanatanovýion, halogenidové ionty, jako jodidové a bromidovéionty, halogennanové ionty jako chlornanové ionty ataké kationty, jako například lithium, vápník a ba-rium. - 6 -

Jako příklady chaotropických solí,které jsou užitečné při způsobu podle vynálezu, jemožno uvést thiokyanatan sodný, thiokyanatan draselný,jodid sodný, jodid draselný, chlornan sodný, chloridlithný, bromid lithný, guanidinium hydrochlorid, gua-nidinium thiokyanát, močovinu apod.

Produkce lipofilních proteinů po-mocí Piíchia se může provádět genetickou modifikacívhodných hostitelských kmenů Pichia pomocí sekvencíDNA, které kódují požadovaný protein. Vhodné sekvenceDITA, které kódují požadovaný lipofilní protein jsoupro odborníky snadno dostupné, například izolací zpřírodních zdrojů, konstrukcí syntetické sekvence DNAapod. Specifické technologie manipulace DNA v kmenechPichia jsou zveřejněny v článcích ve svazku 5 časopisuMolecular and Cellular Biology, str. 1111 a 3376 (1985)

Způsob extrakce podle vynálezu se v provádí tak, že se buňky podrobí působení podmínekzpůsobujících jejich rozbití po dobu postačující prorozbití v podstatě všech buněk, přičemž toto rozbíje-ní se provádí v přítomnosti extrakčního media obsahu-jícího alespoň jednu chaotropickou sul v asi jednomo-lární až asi osmimilární koncentraci v prostředí tlu- - 7 - meném na hodnotu pH vhodnou peo udržení požadovanéhoproteinu ve stabilní formě, obvykle na pH v rozmezíod asi 6 do asi 8. Aby se minimalizovala degradaceproteinu během extrakčního postupu mohou se k pufrupro lysi popřípadě přidávat antiproteázová činidla,jako fenylmethylsulfonylfluorid.

Pro rozbíjení buněk se při prak-tickém provádění způsobu podle vynálezu obvykle po-užívá homogenizace v kulovém mlýmu nebo podobném za-řízení. Doba potřebná pro rozdrcení buněk je závislána citlivosti buněčných stěn k rozlomení, ostrostihomogenizačních podmínek, přítomnosti a koncentracipřídavných složek v pujífru pro lysi apod. Obvykle se v buňky podrobují působení podmínek způsobujících jejichrozbití po dobu v rozmezí od asi 0,5 do asi 30 minut,přednostně po dobu v rozmezí od asi 1 do asi 5 minut.

Teplota použitá pro rozbíjení bu-něk se obvykle reguluje, aby se minimalizovalo půso-bení enzymů degradujících enzymy. Rozbíjení buněk seproto obvykle provádí při teplotě v rozmezí od asi 0do asi 10 °C, přednostně asi 0 °C. Tím se minimalizujerozsah degradace požadovaného proteinu během stupněŠtěpení buněk a zvyšuje se výtěžek požadovaného pro-teinu izolovaného z rozdrcených buněk.

Po rozdrcení buněk se rozpust/náfrakce izoluje oddělením rozbitých buněk technologie-mi známými v tomto oboru, například odstředěním nebotangenciální filtrací. Výsledná kapalina prostá buněkje bohatší na požadovaný lipofilní protein ve srovná-ní s kapalinou získanou pouhým rozdrcením buněk a izolácí rozpustné frakce.

Je-li to žádoucí, může se taktozískaná kapalina podrobovat dalšímu zpracování zaúčelem získání koncentrovaného podílu požadovaného lipofilního proteinu pomocí různých technologií, kteréjsou známé v tomto oboru, jako je například sraženíkyselinou, filtrace, chromatografie, odpařování roz-pouštědla apod.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech praktického provedení. Příkladymají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezuv žádném ohledu neomezují. - 9 -

Příklad I

Extrakce povrchového antigenuhepatitis B (HBsAg) ve formě 22 nm částic z buněkPichia transformovaných vektorem pBSAGI5I (dostup-ným v hostiteli E. coli ve výzkumném ustavu minister-stva zemědělství USA (jíorthern Regional Research Cen-ter of the US Department of Agriculture, Peoria,Illinois) pod registračním číslem NNRL B-18021 se pro-vádí takto:

Kultury P. Pastoris se nechajínarůst do hustoty buněk v rozmezí od 10 do 100 jedno-tek optické hustoty (600 nm) na milimetr. Alikvotnívzorek 100 jednotek optické hustoty se přenese do bo-rosilikátové kultivační zkumavky o rozměrech 13 x 100 mma dvakrát promyje 20 objemy pufru pro lysi (o složeníuvedeném dále). v K peletizovéným buňkám (pomocíklinické centrifugy IEC) se přidá 0,5 g skleněnýchkuliček opraných kyselinou o průměru 0,5 mm a pak v 0,35 ml pufru pro lysi. Pufr pro lysi obsahuje bud0,5 M NaCl a 0,1 fy Triton X-100 (hmotnost/objem) , v pří-padě kontrolního pufru nebo 2M nebo 3M koncentraci chao- - 10

tropické soli v přítomnosti nebo nepřítomnosti 0,1 %látky Triton X-100. Všechny roztoky se tlumí na pH 7,5 pomocí 10 mM fosforečnanu sodného. Směs se mícháosmkrát vždy po dobu jedné minuty při maximální rych-losti za použití vířivého mixeru. Mezi míchacími in- v tervaly se směs chladí na ledu po dobu alespoň jednéminuty. Během vířivého míchání se zkumavky přednostněudržují pod uhlem 20 až 40°, aby se dosáhlo maximálního učinku rozbíjení buněk. Po dokončení lyse se roz-tok rozdrcených buněk oddělí, skleněné kuličky se pramyjí 0,35 ml pufru pro lysi a oba roztoky se spojí a v podrobí patnáctiminutovému odstředování při 13000 x gSupernatanty se oddělí a zkouší na immunoreaktivníHBsAg částice (stanovení Ausria) a na celkový protein(Bradford). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I (a).

Příklad II

Pro další ilustraci způsobu podlevynálezu se 80 ml suspenze (jeden objemový díl aglo-merovaných buněk na dva objemyvé díly pufru pro lysi)podrobí působení zařízení pro štěpení buněk (Impandex lne.) za použití 64 mm míchacího kotouče při frek- -1 *věnci otáčení 4500 min . Pufr pro lysi obsahuje bud 11 - 0,5M NaCl a 0,1 Tritonu (hmotnost/objem) nebo 3MKSCN. Supernatanty se zkouší na HBsAg (Ausria) a nacelkový obsah proteinu (Bradford). Výsledky jsou uve-deny v tabulce I(b).

Tabulka I

I II III

Podmínky lyse HBsAg částice veškerý HBsAg/protein (yug/ml) protein (mg/ml) (c/o hmotnostní). (a) sůl (konc). NaCl (0,5M) + Triton 230 10,1 2,3 KI(2M) + Triton 14 1,4 1,0 KI(2M) - Triton 169 2,4 7,0 KSCN (3M) + Triton < 10 1,9 <0,5 KSCN (3M) - Triton 222 3,5 6,3 (b) zařízení pro štěpení bunšk

NaCl (0,5M) + Triton 600 32,5 !,8 KSCN(3M) 803 10,6 7,6 - 12

Zatímco Žádné z podmínek v pří-padě použití chaotropickó soli (KI nebo KSCN) nevedouk podstatně vyšším hodnotám HBsAg částice ve srovnánís kontrolním pokusem (sloupec I), je zřejmé, že chao- v tropické soli inhibují uvolňování veškerého proteinu(sloupec II) a tím zvyšují specifickou aktivitu HBsAgčástice dvoj- až pětinásobně (sloupec III). v

Claims (4)

1. 7523-^ 13 PATENTOVÉ NAROK

   1. Způsob extrakce lipoflíních pro-teinů majících tendenci k asociaci s lipidovými membránaminebo aglomerujících do struktur micellárního typu v přítom-nosti lipidů nebo látek podobných lipidům, z hostitelskýchbuněk rodu Pichia, vyznačujúící se tím, že se a) buňky rozbijí zpracováváním při teplotě od O do 10 °Cv průběhu 0,5 do 30 minut, přičemž rozbíjení buněk seprovádí v přítomnosti extrakčního media obsahujícíhoalespoň jednu chaotropickou sůl v jednomolární až osmi-molární koncentraci v prostředí tlumeném na hodnotu pHvhodnou pro udržení lipofilního proteinu ve stabilní for-mě, v rozmezí od 6 do 8 a b) izoluje se rozpustná frakce získaná ze stupně a), c) načež se popřípadě rozpustná frakce získaná ze stupně b)zpracovává za účelem izolace koncentrovaného podílulipofilního proteinu·
2. 2, Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že lipofilní protein je zvolen ze souboru zahrnu-jícího

   - 14 - S-formu povrchového antigenu hepatitis B,preS^-formu povrchového antigenu hepatitis B,preSg^formu povrchového antigenu hepatitis B,fosfatidylserin dekarboxylázu (z E. coli),lambda bakteriofágový D-protein, nízkohustotní lipoprotein (LDL),vysokohustotní lip&amp;rotein (HDL) adihydroorotót dehydrogenázu.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, 2e chaotropická sůl je zvolena ze souboruzahrnujícího: thiokyanatan sodný,thiokyanatan draselný,jodid sodný,jodid draselný,chlornan sodný,chlorid lithný,bromid lithný,guanidinium hydrochlorid,guanidinium thiokyanát,močovinu a směsi kterýchkoliv dvou nebo více těchto látek. - 15 - 4« Způsob podle bodu 1, vyznačují- cí se tím, že stupeň b), spočívající v izolaci roz-pustné frakce, se provádí odstřelováním roztoku ob-sahujícího rozštěpené buňky.
4. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačují-cí se tím, že se navíc c) rozpustná frakce získaná zestupně b) zpracovává za účelem izolace koncentrova-ného podílu lipofilního proteinu.

   MP-540-87-Ho