CS211241B1

CS211241B1 - Method of preparation of the concentrated solutions of the serum gamaglobulines

Info

Publication number: CS211241B1
Application number: CS470180A
Authority: CS
Inventors: Ivan Stepanek
Original assignee: Ivan Stepanek
Priority date: 1980-07-02
Filing date: 1980-07-02
Publication date: 1982-02-26

Abstract

Příprava zakoncentrováných purifikovaných roztoků sérových gama globulinů se týká diagnostické a terapeutické imunologie a je založená na tom. že stacionárním zmrazení při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a stacionárním rozmražení při +5 °C až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin vzniká v roztoku gama globulinu koncentrační gradient v důsledku čeho ve spodní části nádoby se bude nacházet zakoncentrovaný roztok, který se vypouští a dále zpracovává sterilní filtraci. Proces zmrazení a rozmražení lze podle potřeby opakovat. Purifikovaný gama globulín se rozpouští v apyrogenní vodě na koncentraci bílkovin 8 - 2 % při hodnotě pH 5,0 až 8,0. Po odstranění nlzkomolekulárních sloučenin z gama globulinového roztoku pomocí průtokové dialýzy nebo gelové filtrace proti 0,1 až 1,0% roztoku chloridu sodného v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C, se provádí jeho sterilizace a naplnění kolony je možné do 75 % objemu.Preparation of Concentrated Purified serum gamma globulin solutions relates to diagnostic and therapeutic immunology and is based on it. that stationary freezing at -5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours and stationary thawing at +5 ° C to +20 ° C for 2 to 48 hours in the gamma globulin concentration solution gradient due to what at the bottom the container will be concentrated solution which is discharged and further processed sterile filtration. Freezing process and thawing can be repeated as needed. The purified gamma globulin dissolves in pyrogen-free water for protein concentration 8-2% at pH 5.0 to 8.0. After removal of the n-molecular compounds from the gamma globulin solution by flow dialysis or gel filtration against 0.1 to 1.0% sodium chloride solution distilled pyrogen-free water at 0 ° C up to + 6 ° C, sterilization is performed and filling the column up to 75% by volume.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy koncentrovaných purifikovaných roztoků sérových gama globulinů.The invention relates to a process for the preparation of concentrated purified solutions of serum gamma globulins.

Gama globulinové preparáty jsou v současnosti široce používány v laboratorní a klinické terapeutické praxi. Současná technologická praxe přípravy gama globulinových preparátů či už laboratorně diagnoatických anebo určeriých pro terapeutické účely se v převážné míře zakoncentrovává lyofilizací.Gamma globulin preparations are currently widely used in laboratory and clinical therapeutic practice. The current technological practice of the preparation of gamma globulin preparations, whether laboratory-diagnostic or intended for therapeutic purposes, is largely concentrated by lyophilization.

Metoda lyofilizace klade velké nároky na výrobní zařízení, je značně drahá a vyžaduje nepřetržitou servisní pozornost. Navíc je nutné konstantovat, že v přirozených podmínkách ekosféry naší planety se za fyziologických ba ani za patologických podmínek nevyskytuji tak nízké hodnoty vakua ve pojení s teplotami, které se používají běžně při lyofilizaci.The lyophilization method places high demands on production equipment, is expensive and requires continuous service attention. Moreover, it must be said that under the natural ecosphere of our planet, under both physiological and pathological conditions, there are no such low vacuum values associated with temperatures commonly used in freeze-drying.

Technologický postup může taktéž část některých nlzkomolekulárních sloučenin s biochemicko-fyziologickou aktivitou v roztoku gama globulínu koncentračně obohacovat vzhledem k jejich koncentraci ve výchozí surovině, z které byl gama globulin izolován a jednak zpravidla do gama globulinového roztoku zanáší nízkomolekulární anorganické anebo organické sloučeniny použité jako precipitans.The process may also concentrate some of the low molecular weight compounds with biochemical-physiological activity in gamma globulin solution with respect to their concentration in the starting material from which gamma globulin was isolated and, on the other hand, usually introduce low molecular inorganic or organic compounds used as precipitants into gamma globulin solution.

Odstraňování vody v průběhu lyofilizace má za následek zvyšování koncentrace gama globulinů a všech v roztoku přítomných nlzkomolekulárních látek. Poměrně zvýšená teplota na konci lyofilizace je zdrojem aktivační energie dostačující na vytvoření nežádoucích interakcí těchto látek s molekulami gama globulinů.Removal of water during lyophilization results in an increase in the concentration of gamma globulins and all low molecular weight substances present in the solution. The relatively elevated temperature at the end of lyophilization is a source of activation energy sufficient to create undesirable interactions of these substances with gamma globulin molecules.

Koncentrace bílkoviných roztoků pomocí lyofilizace se sice celosvětově hojně používá ale hledají se i jiné cesty zakoncentrovávání bílkovinnýh roztoků založené jednak na vakuovém oddestilování vody a prchavých součástí (Smith K. J.,, Watt J. G., Watson C. N., Mastenbroek G. G. A.: Vox Sang. 22, 120,1972) a jednak na oddělování vody a nízkomolekulárních látek pomocí membránových systémů. (Friendli H., Fournier E., Volk T., Kistler P.: Vox Sang. 33,93,1977).Concentration of protein solutions by freeze-drying is widely used worldwide, but other ways of concentrating protein solutions based on vacuum distillation of water and volatile components are sought (Smith KJ, Watt JG, Watson CN, Mastenbroek GGA: Vox Sang. 22, 120, 1972). ) and also for the separation of water and low molecular weight substances by means of membrane systems. (Friendli H., Fournier E., Volk T., Kistler P .: Vox Sang. 33,93, 1977).

Podstata zakoncentrování purifikovaných roztoků sérových gama globulinů spočívá podle předloženého vynálezu v tom, že bílkovinný materiál obsahující purifikovaný gama globulin se rozpouši v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8*2^8 hodnota pH mezi 5,0 až 8,0, odstranění nlzkomolekulárních sloučenin se z gama globulinového roztoku provede pomocí průtokové dialýzy anebo gelové filtrace proti 0,1 až 1,0% roztoku chloridu sodného v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C, gama globulinový roztok se sterilizuje zejména filtrací vyznačující se tím, že sterilizovaný roztok sérových gama globulinů se vnese do uzavřené sterilizované mrazově koncentrační kovové kolony, kterou zaplní až do 75 % objemu ve které se gama globulinový roztok stacionárně zmrazí například při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a opět stacionárně rozmrazí například při +5 °C až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin a potom se z kolony odebere zahuštěný gama globulinový roztok e stanovené koncentraci, anebo se proces zmrazování a rozmrazování opakuje, potom se gama globulinový roztok dále zpracovává například sterilní filtrací.The principle of concentrating the purified solutions of serum gamma globulins is according to the present invention in that the protein material containing the purified gamma globulin is dissolved in an amount of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration is in the range 8 * 2. PH 8 between 5.0 to 8.0, removal of low molecular weight compounds from gamma globulin solution by flow dialysis or gel filtration against 0.1 to 1.0% sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water at 0 ° C to +6 ° C, the gamma globulin solution is sterilized in particular by filtration, characterized in that the sterilized serum gamma globulin solution is introduced into a sealed sterilized freeze-concentration metal column, which is filled up to 75% by volume in which the gamma globulin solution is stationary frozen, for example 5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours and hundreds again thawed for example at +5 ° C to +20 ° C for 2 to 48 hours and then the concentrated gamma globulin solution is withdrawn from the column at a predetermined concentration, or the freezing and thawing process is repeated, after which the gamma globulin solution is further processed e.g. filtration.

Vynález je dále objasněn na příkladech provedení jimiž jeho rozsan není ani omezen ani vyčerpán.The invention is further elucidated by means of exemplary embodiments in which its widening is neither limited nor exhausted.

Příklady provedeníExamples

PřikladlHe did

Výchozí surovinou je frakce II izolovaná metodou podle Cohna a spol. (Cohn E. J.,The starting material is fraction II isolated by the method of Cohn et al. (Cohn E.J.,

Strong L. E., Hughes W. L., Mulford D. J., Ashworth J. N., Melin M., Taylor H. L.: J. Amer.Strong L. E., Hughes W. L., Mulford D. J., Ashworth J. N., Melin M., Taylor H. L., J. Amer.

Chem. Soc. 68, 459, 1946; Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. KChem. Soc. 68, 459 (1946); Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K

21^41^21 ^ 41 ^

Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt, F. W., Lewer W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R, F., Schmid K , Uroma E.: J. Amer. Chem. Soc. 72, 465, 1950) a podle Oneleyho a spol. (Qncley J. L., Malin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M,: J. Amer. Chem. Soc,Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt, F. W., Lewer W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R, F., Schmid K, Uroma E., J. Amer. Chem. Soc. 72, 465 (1950)) and Oneley et al. (Qncley J L, Malin M, Rickert D A, Cameron J W, Gross P M, J. Amer. Chem. Soc,

71, 541 , 1949).71, 541 (1949).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství apyrogenní destilované vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8*2%. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se gama globulinový roztok vyěeří například filtrací.The protein material dissolves in an amount of pyrogen-free distilled water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration value is in the range of 8 * 2%. Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the gamma globulin solution is clarified, for example, by filtration.

V technologických poměrech jsou výše uvedené podmínky zpravidla zachovány tehdy když rozpouštíme 1 kg gama globulinové pasty ve 2 000 ml destilované apyrogenní vodě o těplotě 0' ?C 'až +6 °C. Hodnota pH takto vzniklého gama globulinového roztoku bývá zpravidla mezi pH 5,0 až 8,0 a koncentrace bílkovin bývá v rozmezí 8 i 2 í6. Takto připravený roztok pufirikovaného gama globulinu se vyěeří například filtrací a nízkomolekulámí sloučeniny se z gama globulinového roztoku odstraní například gelovou filtrací nebo dialýzou proti 0,1 až 1,0% roztoku chloridu sodného v destilovaná apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C. Gama globulinový roztok se po odstranění nízkomolekulámích látek podrobí sterilizaci například filtraci a umístí se do vysterilizované koncentrační aparatury.In technological conditions, the above conditions are generally maintained when 1 kg of gamma globulin paste is dissolved in 2000 ml of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C. The pH of the resulting gamma globulin solution is generally between pH 5.0 and 8.0 and the protein concentration is between 8 and 2-6. The buffered gamma globulin solution thus prepared is clarified, for example, by filtration, and the low molecular weight compounds are removed from the gamma globulin solution by, for example, gel filtration or dialysis against 0.1 to 1.0% sodium chloride solution in distilled pyrogen-free water at 0 ° C to + 6 ° C. . The gamma globulin solution, after removal of the low molecular weight substances, is subjected to sterilization, for example, by filtration, and placed in a sterilized concentration apparatus.

Za optimální rozměry technologických mrazově koncentračních kolon se považují takové kde průměr kruhové nebo úhlopříčka čtvercové nebo obdélníkové základní plochy kolony k. výěce kolony se pohybují v poměru 1:5 až 1:10.The optimum dimensions of the technological frost concentration columns are those where the diameter of the circular or diagonal square or rectangular base area of the column to the column height ranges from 1: 5 to 1:10.

Množství gama globulinového roztoku vsazeného do kolony nemá překročit 75 % objemu mrazově koncentrační kolony. Přístup chladu má být hlavně orientován vertikálním směrem ze spodu ku vrchu a až potom směrem horizontálním směrem od vnějšku k vnitřku. Vrchní část kolony má zamrzat poslední a umožnit kapalině vytlačované v důsledku zvětšování objemu, aby mohla vystoupit nezemřelým středem.The amount of gamma globulin solution loaded into the column should not exceed 75% by volume of the freeze-column. The cold approach should mainly be oriented vertically from the bottom to the top and only then horizontally from the outside to the inside. The top of the column should freeze last and allow the liquid to be extruded as a result of volume expansion so that it can exit through the non-deceased center.

Zmrazování se provádí například při -50 °C až -5 °C po dobu 2 až 24 hodin a rozmrazováni při +5 °C až +20 °C po dobu 48 hodin až 2 hodin. Namrazování a rozmrazování má být pomalé a plynulé přičemž kapalina zejména po, rozmražení se nesmí pohybovat nebo mechanicky míchat. Dobu potřebnou na zmrazení a rozmražení je nutno pro každý konkrétní typ aparatury stanovit empiricky.Freezing is carried out, for example, at -50 ° C to -5 ° C for 2 to 24 hours and thawing at + 5 ° C to + 20 ° C for 48 hours to 2 hours. The thawing and thawing should be slow and continuous, with the liquid in particular not moving or mechanically agitating after thawing. The time required for freezing and thawing should be empirically determined for each particular type of apparatus.

Pokud se nejedná o velmi objemné kolony lze zmrazení realizovat vložením kolony do mrazicího pultu a rozmrazování realizovat vyjmutím z mrazicího pultu a umístěním kolony do pokojová teploty. Velkoobjemové mrazově koncentrační kolony musí mít chladicí jakož i ohřívací potrubí stočeno hadovitě okolo kolony od spodu směrem k vrchu kolony.If the columns are not very bulky, freezing can be performed by placing the column in the freezer and defrosting by removing it from the freezer and placing the column at room temperature. Large-volume frost-concentration columns must have coolant and heating pipes coiled serpentine around the column from the bottom towards the top of the column.

Roztok gama globulinu se po rozmraženi vypouští po malých objemech, například po 100 ml až 500 ml, a vyhodnocuje se obsah bílkovin, například spektrofotometricky anebo refraktometričky a oddělí se ty frakce kde koncentrace poklesla pod hranici našeho zájmu, tj. například pod 50 g gama globulinu na litr. Zakoncentrovaný roztok gama globulinu se podrobí dalšímu zpracování například sterilní filtraci. V případě potřeby lze proces zakoncentrování opakovat.After thawing, the gamma globulin solution is discharged in small volumes, for example 100 ml to 500 ml, and the protein content is evaluated, for example spectrophotometrically or refractometrically, and those fractions where the concentration has fallen below our interest, i.e. below 50 g gamma globulin, are collected. per liter. The concentrated gamma globulin solution is subjected to further processing, for example by sterile filtration. If necessary, the concentration process can be repeated.

Příklad 2Example 2

Výchozí surovinou může být bílkovinná pasta gama globulinu izolovaná i pomocí jiných precipitačních sloučenin.The starting material can be a gamma globulin protein paste isolated by other precipitation compounds.

Na precipitaci gama globulinu ze směsi plazmatických nebo sérových krevních bílkovin může být použit síran amonný a hydroxid hlinitý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 28,9, 1954; Schulzte Η. E. Schonenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt,Ammonium sulfate and aluminum hydroxide may be used to precipitate gamma globulin from a mixture of plasma or serum blood proteins (Schultze, E., Matheka HD: Behringwerke Mitt. 28.9, 1954; Schulzte, E. E. Schonenberger M., Matheka HD: Behringwerke Mitt,

26, 21, 1952), rivanol (Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K., Leikhim E.J.: J. Imunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Lewin J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Proč. 17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.: J. Amer. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L., Herbett A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, 1959; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, 1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D'etud. Clin. Biol. 14, 1 054, 1969), ionty Zn⁺⁺ a Al⁺⁺⁺(Rejnek J., Škvařil F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1 489, 1957; Rejnek J., škvařil F.: Coli. Czechoslov. Chem. Commun 23, 773, 1958; Krauze R., Naimski K., Zakrewski K.: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961) a polymetafosfét (Nitsehman H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960).26, 21, 1952), rivanol (Horejsi J., Smetana R .: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), sodium sulfate (Amiraian K., Leikhim EJ: J. Imunol. 87, 301, 1961), aluminum chloride (Lewin J .: Therapie 9, 523, 1954), DEAE cellulose (Sober HA, Peterson EA: Fed. Proc. 17, 1116, 1958; Peterson EA, Sober HA: J. Amer. Chem. Soc. 78 756, 1956; Fahey JL, Herbett AP: J. Biol. Chem. 234, 2645, 1959; Stanworth DH: Nature 188, 156, 1960), caprylic acid (Steinbuch M., Audran R .: Rev. Franc. D'etud Clin. Biol. 14, 1054 (1969), Zn ⁺⁺ and Al ⁺⁺⁺ ions (Rejnek J., Skvaril F .: Coli. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1 489, 1957; Rejnek J., Škvařil F .: Coli Czechoslov Chem Chem Commun 23, 773 (1958), Krauze R., Naimski K., Zakrewski K .: Acta Biochim. Pol. R., Kistler, P .: Vox Sang., 5, 232 (1960).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství apyrogenní destilované vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 - 2 %. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se gama globulinový roztok vyěeří například filtrací.The protein material dissolves in an amount of pyrogen-free distilled water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration value is in the range of 8 - 2%. Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the gamma globulin solution is clarified, for example, by filtration.

Bílkovinný materiál anebo roztok se zpracovává v dalším postupu jako v příkladě č. 1.The proteinaceous material or solution is processed in a further procedure as in Example 1.

V případě, že by spodní výtokový otvor na vypouštění zakoncentrovaného gama globulinu nemohl být otevřen lze zakonoentrovaný gama globulinový roztok odsávat vrchem kolony. Odsávání se provádí pomooí tenké skleněné trubice, která se opatrně ponoří až na dno nádoby, na kterou je napojená například gumová hadice s možností připojení na vakuum.In the event that the bottom outlet opening for discharging the concentrated gamma globulin could not be opened, the encapsulated gamma globulin solution can be aspirated through the top of the column. The suction is carried out using a thin glass tube, which is carefully dipped to the bottom of the container to which, for example, a vacuum hose is connected.

Účinnost zakoncentrování lze demonstrovat na tomto případě. Při zakoneentrování 3 litrů gama globulínu o výchozí koncentraci 50 g na litr byl po prvním zmrazení a rozmražení získaný roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 50 ml vykazoval tento koncentrační gradient.Concentration efficiency can be demonstrated in this case. When the concentration of 3 liters of gamma globulin at an initial concentration of 50 g per liter was concentrated, a solution was obtained after first freezing and thawing, which showed a concentration gradient after single fractionation and 50 ml.

Ve frakci č. 1 bylo stanoveno 201 g IgG na litrIn fraction 1, 201 g IgG per liter was determined

Ve frakci č. 5 bylo stanoveno 150 g IgG na litrIn fraction 5, 150 g IgG per liter was determined

Ve frakci č. 10 bylo stanoveno 106 g IgG na litrIn fraction 10, 106 g IgG per liter was determined

Ve frakci č. 20 bylo stanoveno 50 g IgG na litrIn fraction 20, 50 g IgG per liter was determined

Ve frakci č. 15 bylo stanoveno 74 g IgG na litrFraction No. 15 was determined to be 74 g IgG per liter

Koncentrace ve frakcích 21 až 60 byla pod 50 g na litr tj. pod hranici našeho zájmu.The concentration in fractions 21 to 60 was below 50 g per liter, ie below the threshold of interest.

Při zakoneentrování 3 litrů gama globulínu o výchozí koncentraci 50 g gama globulínu na litr byl po dvojnásobném zmrazení a rozmražení získám roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 50 ml vykazoval tento koncentrační gradient.By concentrating 3 liters of gamma globulin at a starting concentration of 50 g gamma globulin per liter, after freezing and thawing twice, a solution was obtained which, after being discharged in single fractions and 50 ml, exhibited this concentration gradient.

Ve frakci ě. Ve frakci č. Ve frakci č. Ve frakci č. Ve frakci č.In fraction í. In fraction No. In fraction No. In fraction No. Ve frakci č.

bylo stanoveno 360 g IgG na litr 5 bylo stanoveno 196 g IgG na litr 10 bylo stanoveno 110 g IgG na litr 15 bylo stanoveno 55 g IgG na litr 20 bylo stanoveno 39 g IgG na litr.360 g IgG per liter was determined 5 was determined 196 g IgG per liter 10 was determined 110 g IgG per liter 15 was determined 55 g IgG per liter 20 was determined 39 g IgG per liter.

Koncentrace ve frakcích 21 až 60 byla pod 39 g IgG na litr tj. mnohem níže než je hranice našeho zájmu.The concentration in fractions 21 to 60 was below 39 g IgG per liter, ie well below the level of interest.

Claims

Process for the preparation of concentrated purified solutions of serum gamma globulins by dissolving the protein material containing purified gamma globulin in an amount of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration value is in the range of 8 ± 2% and pH between 5.0 and 8.0, removal of low molecular weight compounds from gamma globulin solution is accomplished by flow dialysis or gel filtration against 0.1 to 1.0% sodium chloride solution in distilled water at 0 ° C to +6 ° C, the gamma globulin solution is sterilized in particular by filtration, characterized in that the sterilized solution of serum gamma globulins is introduced into a sealed sterilized freeze-thaw concentration column, typically metallic, which fills up to 75% of the volume in which the gamma globulin solution is stationary frozen, e.g. -5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours and again enough thawed for example at * 5 ° C to + 20 ° C for 2 to 48 hours and then the concentrated gamma globulin solution at a specified concentration is removed from the column, or the freezing and thawing process is repeated, then the gamma globulin solution is further processed, for example, sterile filtration.