CS211240B1

CS211240B1 - Method of preparation of concentrated purified solutions of the serum albumines

Info

Publication number: CS211240B1
Application number: CS470080A
Authority: CS
Inventors: Ivan Stepanek
Original assignee: Ivan Stepanek
Priority date: 1980-07-02
Filing date: 1980-07-02
Publication date: 1982-02-26

Abstract

Příprava koncentrovaných purifikovaných roztoků sérových albuminů se týká protišokové a nutritivní terapie a je založena na.tom, že při stacionárním zmrazení při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a stacionárním rozmraženi při +5 °C až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin vzniká v roztoku albuminu koncentrační gradient v důsledku čehož ve spodní části nádoby se bude nacházet zakoncentrevaný roztek, který se vypouští a dále zpracovává sterilní filtrací. Proces zmrazení a rozmražení lze podle potřeby opakovat. Purifikovaný albumin so rozpouští v destilované apyrogenni vodš na koncentraci bílkovin 8 + 2 % při hodnotě pH 5,0 až 7,0. Po odstranění nízkomolekulárních sloučenin z albuminového roztoku pomocí průtokové dialyzy anebo gelové filtrace proti destilované apyrogenni vodš o teplotě 0 °C až + 6 eC se provádí jeho sterilizace filtrací a naplnění koleny je mežné do 75 % objemu.Preparation of concentrated purified serum albumin solutions are concerned anti-shock and nutritive therapy and is based in the case of stationary freezing at -5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours and stationary thawing at +5 ° C to +20 ° C for 2 to 48 hours in solution albumin concentration gradient as a result which will be at the bottom of the container find a concentrated concentrate that it is discharged and further processed sterile filtration. The freezing and thawing process can be done repeat as necessary. Purified albumin dissolves in distilled pyrogen-free water to a concentration protein 8 + 2% at pH 5.0 to 7.0. After removal of low molecular weight of the compounds from the albumin solution by flow dialysis or gel filtration against distilled pyrogen-free water at room temperature 0 ° C to + 6 eC is sterilized filtration and filling the knee is modest 75% by volume.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy koncentrovaných purifikovaných sérových albuminů.The invention relates to a process for the preparation of concentrated purified serum albumins.

Albuminovó preparáty jsou v současnosti Široce používány v laboratorní a klinické terapeutické praxi. Současná technoligická praxe přípravy albuminových preparátů či už laboratorních anebo určených pro terapeutické účely se v převážné míře orientuje na zakoncentrování pomocí lyofilizace.Albumin preparations are currently widely used in laboratory and clinical therapeutic practice. The current technological practice of preparing albumin preparations, whether laboratory or therapeutic, is largely orientated to concentration by lyophilization.

Metoda lyofilizace klade velké nároky a náročné požadavky na výrobní zařízení, je značné drahé a vyžaduje nepřetržitou servisní pozornost. Navíc je potřeba konstatovat, že v přirozených podmínkách ekosféry naší planety se;za fyziologických ba ani za patologických podmínek nevyskytují tak nízké hodnoty vakua ve spojení s teplotami, které se běžně používají při lyofilizaci co může mít za důsledek změny v terciární anebo kvarterní struktuře u sloučenin bílkovinné povahy.The freeze-drying method places high demands and demanding requirements on production equipment, is expensive and requires continuous service attention. In addition, it should be noted that under the natural ecosphere conditions of our planet, under physiological or pathological conditions, such low vacuum values do not occur in conjunction with temperatures commonly used in lyophilization, which may result in changes in tertiary and / or quaternary structure of the compounds. of a proteinaceous nature.

Technologický postup může taktéž část některých nízkomolekulárních sloučenin s biochemicko-fyziologickou aktivitou v roztoku albuminu koncentračně obohacovat vzhledem k jejich koncentraci ve výchozí surovině, z které byl albumin izolován a jednak zpravidla do albuminového roztoku zanáší nizkomolekulární anorganické něho organické sloučeniny použité jako precipitans.The technological process can also concentrate some of the low molecular weight compounds with biochemical-physiological activity in the albumin solution with respect to their concentration in the starting material from which the albumin was isolated and, on the other hand, usually enters the low molecular weight inorganic organic compounds used as a precipitate.

Odstraňování vody mrazovou sublimací má za následek zvyšování koncentrace albuminu a všech v roztoku přítomných nízkomolekulárních látek a poměrně zvýšená teplota na konci mrazové sublimace je zdrojem aktivační energie dostačující na vytvoření nežádoucích interakcí těchto látek s molekulemi albuminu.Water removal by freeze-sublimation results in an increase in the concentration of albumin and all low molecular weight substances present in the solution, and a relatively elevated temperature at the end of the freeze-sublimation is a source of activation energy sufficient to create undesirable interactions of these substances with albumin molecules.

Zakoncentrování bílkovinných roztoků pomocí lyofilizace se sice celosvětově hojně používá, ale hledají se i jiné metody zakoncentrovávání bílkovinných roztoků založené jednak na vakuovém oddestilování vody a prchavých součástí (Smith K. J., Watt J. G.,Concentration of protein solutions by freeze-drying is widely used worldwide, but other methods for concentrating protein solutions based on vacuum distillation of water and volatile components are also sought (Smith K. J., Watt J. G.,

Watson C. N., Mastenbroek G. G. A.: Vox Sang. 22, 120, 1972) a jednak na oddělování vody a nízkomolekulárních látek pomocí membránových systémů (Friendli Η., Fournier Ε., Volk T., Kistler P.: Vox Sang. 33, 93, 1977).Watson, C.N., Mastenbroek, G.G., Vox Sang. 22, 120, 1972) and on the other hand, for the separation of water and low molecular weight substances by membrane systems (Friendli et al., Fournier et al., Volk T., Kistler P .: Vox Sang. 33, 93, 1977).

Podstata přípravy koncentrovaných purifikovaných roztoků sérových albuminů spočivá podle předloženého vynálezu v tom, že bílkovinný materiál obsahující purifikovaný albumin se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby se hodnota koncentrace bílkovin nacházela v rozmezí 8 + 2 % a hodnota pH mezi 4,0 až 7,0, odstranění nízkomolekulárních sloučenin se z albuminového roztoku provede zejména pomocí průtokové dialýzy anebo gelové filtrace proti destilované vodě o teplotě 0 °C až +6 °C, albuminový roztok se sterilizuje zejména filtrací, vyznačující se tím, že sterilizovaný roztok albuminu se vnese do uzavřené vystérilizováné mrazově koncentrační kolony, která ae zaplní do 75 % jejího objemu, ve které se albuminový roztok stacionárně zmrazí například při -5 °C až -50 °C po dobu 2 až 24 hodin a opět rozmrazí při +5 °G až +20 °C po dobu 2 až 48 hodin a potom se z kolony odebere zahuštěný roztok albuminu o stanovené koncentraci, anebo se proces zmrazování a rozmrazování opakuje, potom se albuminový roztok zpracuje ¹například sterilní filtrací a pasteurizací.According to the present invention, the preparation of concentrated purified serum albumin solutions is characterized in that the protein material containing the purified albumin is dissolved in an amount of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration is in the range 8 + 2. % and pH value between 4.0 and 7.0, removal of low molecular weight compounds from the albumin solution is performed mainly by flow dialysis or gel filtration against distilled water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C, the albumin solution being sterilized mainly by filtration, characterized by characterized in that the sterilized albumin solution is introduced into a closed sterilized freeze-thaw concentration column which is filled to 75% of its volume, in which the albumin solution is stationary frozen at, for example, -5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours; thaw again at + 5 ° C to + 20 ° C for 2 to 48 hours and then s e is removed from the column concentrated albumin solution with a given concentration, or with the process of repeated freezing and thawing, and the albumin solution treated ^one example, sterile filtration and pasteurization.

Vynález je dále objasněn na příkladech provedení jimiž jeho rozsah není ani omezen ani vyčerpán.The invention is further elucidated by means of examples, the scope of which is neither limited nor exhaustive.

Příklady provedeníExamples

Příklad ě. 1Example. 1

Výchozí surovinou je pasta frakce V, izolovaná metodou podle Cohna a spol. (Cohn E. J.,The starting material is a paste of fraction V, isolated by the method of Cohn et al. (Cohn E.J.,

Strong L. Ε., Hughes W. L., Mulford D. J., Ashworth J. N., Melin Μ., Taylor H. L.:Strong L.,, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin,, Taylor H.L .:

J. Amer. Chem. Soc. 68, 459, 1946).J. Amer. Chem. Soc. 68, 459 (1946).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody o teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 + 2 %. Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se albuminový roztok vyčeří například filtrací.The protein material dissolves in an amount of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration value is in the range of 8 + 2%. Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the albumin solution is clarified, for example, by filtration.

V technologických poměrech jsou výše uvedené podmínky zpravidla zachovány tehdy když rozpustíme 1 kg albumínové pasty ve 2 000 ml destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +6 °C. Hodnota pH takto vzniklého albuminového roztoku bývá zpravidla mezi pH 4,0 až 7,0 a koncentrace bílkovin bývá v rozmezí 8 + 2 %. Takto připravený roztok purifikovaného albuminu se vyšeřl filtrací a nízkomolekulární sloučeniny se z albuminového roztoku odstraní gelovou filtrací anebo dialyzou.In technological conditions, the above conditions are generally maintained when 1 kg of albumin paste is dissolved in 2000 ml of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C. The pH of the resulting albumin solution is generally between pH 4.0 and 7.0 and the protein concentration is in the range of 8 + 2%. The purified albumin solution thus prepared was clarified by filtration and the low molecular weight compounds were removed from the albumin solution by gel filtration or dialysis.

Albuminový roztok se po odstranění nlzkomolekulárních látek podrobí sterilizaci například filtrací a vysterilizovanou hadičkou se přesaje do vysterilizované koncentrační aparatury.After removal of the low molecular weight substances, the albumin solution is subjected to sterilization, for example by filtration, and transferred through a sterilized tube into a sterilized concentration apparatus.

Za optimální rozměry technologických mrazově koncentračních kolon se považují takové kde průměr kruhové anebo úhlopříčka čtvercové nebo obdélníkové základní plochy kolony ku výšce kolony se pohybují v poměru 1:2 až 1:10.The optimum dimensions of technological frost concentration columns are those where the diameter of the circular or diagonal square or rectangular base area of the column to the height of the column ranges from 1: 2 to 1:10.

Množství albuminového roztoku vsazeného do kolony nemá překročit 75 % objemu mrazově koncentrační kolony. Přístup chladu je orientován vertikálním směrem ze spodu k vrchu a až potom má být orientován směrem od vnějšku k vnitřku. Vrchní část kolony má zamrzat poslední a umožnit kapalině vytlačované v důsledku zvětšování objemu, aby mohla vystoupit nezamrzlým středem.The amount of albumin solution introduced into the column should not exceed 75% by volume of the freeze-column. The cold approach is oriented vertically from the bottom to the top and only then should it be oriented from the outside to the inside. The top of the column is supposed to freeze last and allow the liquid to be extruded as a result of volume expansion so that it can exit through the frozen center.

Zmrazování se provádí například při -50 °C až -5 °C po dobu 2 až 24 hodin a rozmrazování při +5 °C až +20 °C po dobu 48 až 2 hodin. Namrazování a rozmrazování má být pomalé a,,plynulé přičemž kapalina zejména po rozmražení se nesmí pohybovat nebo mechanicky míchat. Dobu potřebnou na zmrazení a rozmražení je nutno pro každý konkrétní typ aparatury stanovit empiricky.Freezing is carried out, for example, at -50 ° C to -5 ° C for 2 to 24 hours and thawing at + 5 ° C to + 20 ° C for 48 to 2 hours. The thawing and thawing should be slow and continuous and the liquid must not be moved or mechanically stirred especially after thawing. The time required for freezing and thawing should be empirically determined for each particular type of apparatus.

Pokud se nejedná o velmi objemné kolony lze zmrazení realizovat vložením kolony do mrazicího pultu a rozmrazování realizovat vyjmutím z mrazicího pultu a umístěním kolony do pokojové teploty. Velkoobjemůvé mrazově koncentrační kolony musí mít chladicí jakož i ohřívací potrubí stočeno hadovi tě okolo kolony od spodu směrem k vrchu kolony.If the columns are not very bulky, freezing can be performed by placing the column in the freezer and defrosting by removing it from the freezer and placing the column at room temperature. Large-volume frost-concentration columns must have the cooling and heating pipes coiled around the column from the bottom towards the top of the column.

Roztok albuminu se po stacionárním rozmražení vypouští po malých objemech, například po 100 ml až 500 ml, a vyhodnocuje se na obsah bílkovin, například spektrofotometricky anebo refraktometricky a oddělí se ty frakce kde koncentace poklesla pod hranici našeho zájmu například po 70 g albuminu na litr.After stationary thawing, the albumin solution is discharged in small volumes, for example 100 ml to 500 ml, and evaluated for protein content, for example spectrophotometrically or refractometrically, and those fractions where the concentration has fallen below the level of interest, for example 70 g albumin per liter, are collected.

Zekoncentrovaný roztok albuminu se podrobí dalšímu zpracování jako například sterilní filtraci a pasteurizaci. V případě potřeby lze proces zakoncentrovéní opakovat.The concentrated albumin solution is subjected to further processing such as sterile filtration and pasteurization. If necessary, the concentration process can be repeated.

Přiklad č. 2Example 2

Výchozí surovinou může být bílkovinná pasta albuminu nebo roztok albuminu izolované i pomocí jiných precipitačnlch sloučenin.The starting material may be an albumin protein paste or an albumin solution isolated using other precipitating compounds.

Na precipitaci albuminu ze směsi plasmatických anebo sérových krevních bílkovin může být použit síran amonný (Schultze H., Schónenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952; Dietzel E., Geiger H.: Behringwerke Mitt. 43, 129, 1964), metafosfát (Nitschman H. S., Rickli E., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1960), trichloroctové kyselina (Michael S. E.: Biochem. J. 82, 212, 1962), kaprylát (Hoch H., Chanutin A.: Arch. Biochem. Biophys 51, 271, 1954), aceton (Schwert G. W.: J. Amer. Chem. Soc. 79, 139, 1957), eter (Kekwick R. A., MacKay Μ. E., Nance M. ti., Record B. R.: Biochem. J. 60, 671, 1955), etanol (Taylor H. L., Bloom F. C., McCall Κ. B., Hyndmen L. A.: J. Amer. Chem. Soc. 78, 1 353, 1956), etanol spolu s Zn⁺⁺ a Ba⁺⁺ (Cohn E. J., Gurd F. N. R. Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lewer W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton E. F., Schmid K., Uroma E.: J. Amer. Chem. Soc. 72, 465, 1950) a ionty Zn⁺⁺Cohn E. J., Tullis J. L., Surgenor D. M , D:'Hont M.: Science 114, 479, 1951).Ammonium sulfate may be used to precipitate albumin from a mixture of plasma or serum blood proteins (Schultze H., Schonenberger M., Matheka HD: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952; Dietzel E., Geiger H .: Behringwerke Mitt. 43, 129 1964), metaphosphate (Nitschman HS, Rickli E., Kistler P .: Vox Sang. 5, 232 (1960)), trichloroacetic acid (Michael SE: Biochem. J. 82, 212, 1962), caprylate (Hoch H., Chanutin A .: Arch. Biochem. Biophys 51, 271 (1954), acetone (Schwert GW: J. Amer. Chem. Soc. 79, 139, 1957), eter (Kekwick RA, MacKay, E., Nance M. et al., Record BR: Biochem. J. 60, 671 (1955), ethanol (Taylor HL, Bloom FC, McCall, B., Hyndmen LA: J. Amer. Chem. Soc. 78, 1353, 1956), ethanol with Zn ⁺⁺ and Ba ⁺⁺ (Cohn EJ, Gurd FNR Surgenor DM, Barnes BA, Brown RK, Derounaux G., Gillespie JM, Kahnt FW, Lewer WF, Liu CH, Mittelman D., Mouton EF, Schmid K Uroma, E., J. Amer. Chem., Soc., 72, 465, 1950) and Zn ⁺⁺ ions (Cohn EJ, Tullis JL, Surgenor D. M, D: Hont M .: Science 114, 479 (1951).

Bílkovinný materiál se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenní vody O teplotě 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 8 + 2 Rozpouštění se urychluje mícháním. Po rozpuštění se albuminový roztok vyčeří filtrací. Bílkovinný materiál se zpracovává v dalším postupu jako v příkladě č. 1.The protein material is dissolved in an amount of distilled pyrogen-free water at 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration is in the range of 8 + 2. Dissolution is accelerated by stirring. After dissolution, the albumin solution is clarified by filtration. The proteinaceous material is processed in a further procedure as in Example 1.

V případě, že by spodní výtokový otvor na vypouštění zakonoentrovaného albuminu by nemohl být otevřen lze zakoncentrovaný albumin odsávat vrchem kolony. Odsávání se provádí pomoci tenké skleněné trubice, která se opatrně ponoří až na dno nádoby, na kterou je napojená například gumová hadice s možnosti připojení na vakuum.In the event that the lower outlet opening for discharging the encapsulated albumin could not be opened, the concentrated albumin can be aspirated through the top of the column. The suction is carried out by means of a thin glass tube, which is carefully dipped to the bottom of the container, to which is connected, for example, a rubber hose with the possibility of connecting to a vacuum.

Účinnost zakoncentrování lze demonstrovat na tomto případě. Při zakoncentrování 5 litrů albuminu o výchozí koncentraci 70 g na litr byl po prvním zmrazení a rozmražení získaný roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 100 ml vykazoval tento koncentrační gradient.Concentration efficiency can be demonstrated in this case. At a concentration of 5 liters of albumin with an initial concentration of 70 g per liter, after the first freezing and thawing, a solution was obtained which showed a concentration gradient after single fraction and 100 ml.

Ve Ve frakci fraction č. 1 no. 1 bylo was stanoveno determined 230 230 e E albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 5 No 5 bylo was stanoveno determined 200 200 g G albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 10 No. 10 bylo was stanoveno determined 160 160 g G albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 15 No 15 bylo was stanoveno determined 125 125 e E albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 20 No 20 bylo was stanoveno determined 70 70 s with albuminu albumin na on litr. liter.

Koncentrace ve frakcích 21 našeho zájmu.Concentration in fractions 21 of our interest.

až 50 byla pod 70 g albuminu na litr tj. pod hraniciup to 50 was below 70 g albumin per liter i.e. below the limit

Při zakoncentrování 5 litrů albuminu o výchozí koncentraci 70 g alubmínu na litr byl po dvojnásobném zmrazení a rozmražení získán roztok, který po vypuštění po jednotlivých frakcích a 100 ml vykazoval tento koncentrační gradient.Concentrating 5 liters of albumin with an initial concentration of 70 g of alubmin per liter yielded a solution which, after freeze-thawing twice, had a concentration gradient after single fractionation and 100 ml.

Ve Ve frakci fraction č. 1 no. 1 bylo was stanoveno determined 300 300 e E albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 5 No 5 bylo was stanoveno determined 260 260 g G albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 10 No. 10 bylo was stanoveno determined 170 170 g G albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 15 No 15 bylo was stanoveno determined 80 80 g G albuminu albumin na on litr. liter. Ve Ve frakci fraction č. 20 No 20 bylo was stanoveno determined 20 20 May e E albuminu albumin na on litr. liter.

Koncentrace ve frakcích 21 je hranice našeho zájmu.Concentration in fractions 21 is the limit of our interest.

až 50 byla pod 20 g albuminu ha litr tj. mnohem níže nežto 50 was below 20 g of albumin per liter, i.e. much lower than

Claims

A method for preparing concentrated purified serum albumin solutions, wherein the protein material containing the purified albumin is dissolved in an amount of distilled pyrogen-free water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C such that the protein concentration is between 8 + 2% and pH value between 4.0 and 7.0, removal of low molecular weight compounds from the albumin sample is performed mainly by flow dialysis or gel filtration against distilled water at a temperature of 0 ° C to + 6 ° C, the albumin solution being sterilized mainly by filtration, characterized by that the sterilized albumin solution is introduced into a sealed, sterilized freeze-thaw concentration column, which is packed to 75% of its volume, in which the albumin solution is freeze-dried at -5 ° C to -50 ° C for 2 to 24 hours, for example; thaw again at + 5 ° C to + 20 ° C for 2 to 48 hours and then concentrated from the column the albumin solution at a specified concentration, or the freezing and thawing process is repeated, then the albumin solution is treated, for example, by sterile filtration and pasteurization.