CN87105215A

CN87105215A - 纯化的胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶

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Publication number: CN87105215A
Application number: CN198787105215A
Authority: CN
Inventors: 彼里·尼科拉斯·约安
Original assignee: Laboratoires Debat Fr Ste
Current assignee: Laboratoires Debat Fr Ste
Priority date: 1986-07-31
Filing date: 1987-07-30
Publication date: 1988-02-24
Also published as: IE61237B1; EP0255431B1; IE872064L; EP0255431A1; DK387387A; ATE68821T1; JPS6359886A; DK387387D0; JPH0438392B2; DE3774025D1; PT85406B; FR2602242B1; ZA875378B; ES2038681T3; GR3003416T3; NZ221246A; AU7607587A; AU594486B2; FR2602242A1; PT85406A

Abstract

本发明从一种新的工业产品的形式涉及纯化的胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(缩写为TK-F，简称胎儿胸苷激酶)。

本发明揭示了制备纯化的胎儿胸苷激酶的方法，包括将TK-F与胸苷偶联，再切开所得到的 TK-F/胸苷复合物。

根据本发明，所纯化的TK-F可应用于制备抗 TK-F抗体，该抗体可作为定量分析试剂和药物。

Description

纯化的胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶

本发明以一种新的工业产品的形式涉及纯化的胎儿类型的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，还涉及到制备此产品的方法，尤其是纯化该产品的方法。该产品可应用于（ⅰ）定量分析，尤其是含有抗原-抗体反应的免疫学分析;（ⅱ）制备用作药物的抗体。

胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK），负责胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化为5′-单磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷（d-TMP），在DNA合成并从而在细胞再生过程中起重要作用。在处于增殖和再生的组织中以及被病毒感染的细胞中TK活力高。在真核细胞中检测到TK的两种同功酶：胎儿类型的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（此后称为“胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶”或TK-F）和成熟型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（此后称为“成熟胸腺嘧啶脱氧核苷激酶”或TK-A）。

TK-F出现于胚性组织，并在依赖于激素的癌症的癌性组织，尤其是乳腺癌和前列腺癌中被检测到，参见J.L.Javre′et al.in Bull.Cancer（Paris）73（No.1），第8-16页（1986），题目是“Mise en evidence de la thymidine kinase de type foetal dans les cancers du sein”（即：乳腺癌中胎儿型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的检测）和J.L.Javre′ et al.的文章，已投送Cancer Research待发表，题目“胎儿型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶在人类乳腺癌中的存在”。

还已知各种性激素在它们的靶器官，即前列腺和子宫中大大激增体内TK-F的合成;参见M.Bourtourault et al，in J.Steroid Biochem.，21（No.5），第613-620页（1984），题目“大鼠子宫中17β-雌二醇对胸腺嘧啶脱氧核苷激酶活力的刺激。”以及G.Gayet et al.in The Prostate Ⅰ，第261-270页（1985），题目“大鼠前列腺中雄性激素诱导胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶。

TK-F从TK-A的分离采用电泳或阴离子交换树脂层析方法，例如丙烯酰胺凝胶电泳，或更倾向于采用DEAE-纤维素凝胶或DEAE-葡聚糖凝胶层析，上述凝胶由Pharmacia公司出售，胎儿型同功酶具有零或低迁移率，成熟型同功酶则迁移很快。

以这种方式分离的TK-F所具有的酶活力为每毫克2国际单位，不适于（ⅰ）进行更为准确的定量分析，尤其不适于（ⅱ）制备多克隆特别是单克隆抗TK-F抗体，后者用于诊断和治疗领域。

根据本发明第一个特点，以一种新的工业产品形式，提出一种纯化的TK-F，它比到目前为止文献所用方法分离得到的TK-F具有显著大的酶活力。

诊断特别需要纯化的TK-F，事实上，TK-F活力随癌症的类型而变。正如TK-F活力在处于Go期的细胞中很低，而在处于S期细胞中很高，有充分理由相信显示低TK-F活力的癌症处于静止状态，而显示高的TK-F活力的癌症处于增生状态。定量分析乳腺癌和前列腺癌中的TK-F对于确定癌症增生状态具有重要意义。此外，用抗纯化的TK-F的抗体定量分析TK-F成为估计癌变发展并确定治疗方向的一个因素。

根据本发明的第二个特点，推荐一种制备所述纯化的TK-F的方法，该方法包括将需纯化的TK-F与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，然后切开所得到的复合物（胸腺嘧啶脱氧核苷TK-F）以收集纯化的TK-F。

根据本发明的另一特点，推荐该纯化的TK-F应用于制备抗-TK-F抗体，这些抗体将用于诊断和治疗。出乎意料的是，确实发现将抗-TK-F抗体给患有激素依赖性癌症（特别是乳腺癌如前列腺癌）的病人服用，具有有益的治疗效果。

据本发明，以一种新的工业产品形式，推荐一种他人迄今尚未得到的纯化的TK-F，可用于定量分析和制备抗TK-F抗体，该纯化的TK-F具有酶比活力每毫克大于或等于5000单位，优选大于或等于8000单位，最佳为大于或等于10，000单位。

具有酶比活力11，800单位/毫克的纯化的TK-F，在非变性介质（例如下面所述A和B缓冲液）中电泳的Rf值（pH约8.6）为0.15。

按常规酶比活力表达为每毫克蛋白的酶单位。所谓TK-F的国际单位是每分钟每毫克蛋白合成1毫微摩尔核苷酸。换言之，酶活力可表达为nmol/mg蛋白/分钟。（nmol/mg of protein/min）

通过比较，从下面例1中可以看到：

-原始生物介质中活力为1.03nmol/mg蛋白/min;

-DEAE-葡聚糖层析后活力为2.08nmol/mg蛋白/min;

-纯化的TK-F活力为11，875nmol/mg蛋白/min;

据本发明推荐的制备纯化的TK-F的方法为：待纯化的TK-F与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，然后切开胸腺嘧啶/TK-F复合物，包括：

a）与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，即，将待纯化的TK-F与胸苷接触，胸苷已提前固定于适当的第一载体上。

b）用适当的含胸苷的洗脱液洗脱以这种方式结合于胸苷的TK-F;

c）切开以这种方式洗脱的胸苷/TK-F复合物，用区别于第一状态的第二载体从该复合物上选择性地吸收胸苷。

进行这种方法的最佳方式包括所谓竞争机制的亲和层析。因此，在步骤a），待纯化的TK-F通过适当的已予先与胸苷偶联的树脂。结合于该树脂上的胸苷固定了TK-F并且被保留，而污染或感染TK-F的蛋白质类型的杂质不会固定于胸苷，因而不会停留。

步骤b）中，通过予先偶联于载体的胸苷而固定在载体上的TK-F用含有游离胸苷的洗脱液洗脱。步骤b）包括所谓竞争机制，借此，结合于固定在载体上的胸苷的TK-F与洗脱液中的游离胸苷偶联。以此方式收集的洗脱液含有所得到的胸苷/TK-F复合物。

步骤c）中，该胸苷/TK-F复合物通过吸收在对于胸苷为选择性的第二载体上的胸苷而去稳。

实用中，步骤c）中的优选载体是一种Pharmacia公司出售的环氧-琼脂糖凝胶，称为环氧-琼脂糖6B，此胶按一已知方法首先与胸苷偶联，尤其是下文所述方法：P.Grobner et al.in J.Biol.Chem.，259，pages 8012-8014（1984），或一与之相似的方法。步骤c）优选的用于固定胸苷的载体是包括木炭，葡聚糖和明胶的组合物。分离纯化的TK-F，特别是采用离心的方法，离心含有TK-F和用于步骤c）中第二载体的洗脱液。

原始TK-F是一种蛋白质物质，源于动物（从胚胎动物组织中得到，特别是啮齿类如大鼠的胚胎的肝中得到）或源于人类（从癌症病人组织中得到）再者就是源于合成产品（特别是用基因工程得到）。

据本发明以这种方式纯化的TK-F，可应用于制备抗-TK-F抗体，这些抗体是单克隆优先于多克隆。它们均可用已知方法得到。例如，用该纯化的TK-F接种一只小鼠，从免疫动物体内移去脾脏，从中提取脾淋巴细胞，脾淋巴细胞与处于指数生长期的小鼠骨髓瘤细胞融合，比例为5～20，优选为10淋巴细胞/骨髓瘤细胞，筛选得到的分泌杂交瘤，以获得单克隆抗体，其选择性地与TK-F反应但不与TK-F反应，用筛选的克隆于小鼠体内生长腹水瘤，采集含有抗体的腹水，纯化所得到的单克隆抗体。

为进行分析TK-F在组织中是否存在或定量估计TK-F在该组织中的水平，将抗-TK-F抗体固定于适当载体（玻璃珠，聚苯乙烯珠，容器壁，等）给出下列物质：

（1）载体/抗-TK-F;

此物质与含有TK-F的介质接触，该TK-F的存在给出下列复合物：

（2）载体/抗-TK-F/TK-F

此复合物含有一“信号”，该信号用目前已知的一种方法“放大”，以用于被抗TK-F＊标记的一种结合物观察和/或检测。[例如EIA方法（特别是EIA-夹心或EIA-竞争方法），其中复合物2与一适当的酶结合物偶联;RIA方法，包括所述复合物2与一放射性同位素标记的结合物偶联;或荧光方法，复合物2与一标记了荧光素的结合物偶联。]该放大作用还可通过凝集作用或有细胞掺与的ERICA方法完成。

据本发明，推荐分析药盒，它含有完成抗原-抗体反应必须的试剂，特别是下列反应：

（a）载体/抗-TK-F+TK-F-→载体/抗TK-F/TK-F

（b）载体/抗-TK-F/TK-F+抗-TK-F＊-→载体/抗TK-F/TK-F/抗-TK-F＊

据本发明推荐的治疗配方包括治疗有效剂量的抗TK-F，与一种生理可接受的赋形剂相连接。

本发明特别涉及到用抗-TK-F抗体制备抗癌药物，用于治疗乳腺癌和前列腺癌。

本发明更多的优点和特点将从下述实例中体现出来，这些实例并不意味一种局限，而只是本发明的具体说明。

例1

从大鼠胚胎肝脏中分离和纯化TK-F。

1）匀浆

大鼠胚胎肝脏组织于Polytron中匀浆，缓冲液如下：10mM Tris-HCl，10mM Mg Cl₂，5μM Na F和0.4mM pH7.5的β-巯基乙醇（缓冲液A）。

2）制备胞液

所得到的匀浆液在800xg然后在12，000xg下冷冻离心10min。12，000xg下得到的上清液在105，000xg+5℃下离心45min，采用L8-55Beckman超速离心机。105，000xg下得到的上清液（胞液）中即含有TK-F。定量分析等分试样胞液中TK-F酶的比活力;此活力为1.03nmol/mg/min。

3）分离TK-F

用DEAE-葡聚糖A50胶层析分离TK-F（Pharmacia公司出售）。该葡聚糖凝胶于缓冲液A中膨胀。通过沉淀移去凝胶精细颗粒后，将该凝胶装入7cm×1cm小柱子中。用800μl该胶装柱。凝胶柱制备好后，将胞液等分试样加入凝胶柱。连续通过4倍体积（4×500μl）缓冲液A洗脱TK-F。连续洗脱是用冷冻离心机在200xg下通过对层析柱离心完成。离心加速了洗脱过程并防止TK-F变性。对洗脱液等分试样定量分析TK-F酶活力，冰冻干燥所得洗脱液。这一步酶活力为2.08nmol/mg/min。

4）纯化TK-F

用偶联了胸苷的环氧-琼脂糖6B凝胶（Pharmacia公司出售）进行亲合层析可有效纯化TK-F。胸苷在pH12.0的碱性介质25℃下与琼脂糖偶联24小时，采用上面提到的P.Grober et.al.文中的技术。胸苷偶联程度为9μmol胸苷/ml凝胶。该凝胶用下列缓冲液洗脱：10mM Tris-HCl，10mM Mg Cl₂，5μM Na F，0.4mM β-巯基乙醇和1mM pH7.5的ATP，（缓冲液B）。3ml凝胶装入10.6cm高，直径0.6cm的柱中。含有TK-F的冻干产物用蒸馏水溶解，加入亲合柱。样品加入速度1.2ml/hour。

用缓冲液B冲洗亲合凝胶，以便去除不与凝胶亲合的蛋白质，洗脱速率为1.2ml/hour，然后4ml/hour。全部未与凝胶亲合的蛋白质用24ml缓冲液B洗脱。

将4.5ml下列缓冲液通过亲合胶以洗脱TK-F：10mM Tris，10mM Mg Cl₂，5μM Na F，0.4mM β-巯基乙醇，1mM ATP和10mM pH7.5的非放射性胸苷，洗脱速率0.5ml/hour。所得洗脱液含有胸苷/TK-F复合物。

5）除去非放射性胸苷

将酸的洗脱液通过木炭/葡聚糖/明胶填料去除非放射胸苷（1%重量木炭，0.1%重量葡聚糖T70和0.2%重量明胶，于10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5）。混合物于0℃在涡流器上振摇10min，然后于800xg下离心10分钟。上清液含有纯化的TK-F。分析上清液的等分试样。用这种方式纯化的TK-F酶活力为11，875nmol/mg/min。

总活力产率为7.4%。纯化系数约为11，530，在非变性介质中确定的纯化TK-F电泳Rf值为0.15，pH8.6下。

例2

确定TK-F的技术：

在20μl含有TK-F的提取物中加入5μl 200mM Tris-HCl缓冲液（pH7.8），其中含有76mM Mg Cl₂，160mM磷酸甘油酯，40mM pATP和40～50μM[2-C¹⁴]-胸苷（比活力：54-58m Ci/mmol，即，约2×10⁸～2.15×10⁸Bq/mmol）。反应介质于37℃温浴25分钟，然后加入10μl 2.1M HCl O₄并在2，400xg下离心10分钟中止反应。离心后，10μl上清液用来通过高压电泳分离合成的核苷酸。在Whatman3MM层析纸上，pH4.1柠檬酸缓冲液，每cm层析纸长度47伏高压下，温度3℃电泳30分钟，可有效分离d-TMP，d-TDP和d-TTP（单磷酸胸苷，二磷酸胸苷，三磷酸胸苷）。干燥电泳图谱，并于紫外下定出标准核苷酸位置后，层析纸剪成2.5cm宽0.5cm高的纸条，转移至含有10ml液态闪烁体（Ready-solv EP，Beckman）的放射性计数瓶中。

例3

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测TK-F纯度

垂直板状线性梯度10～15%聚丙烯酰胺凝胶-十二烷基磺酸钠（SDS）电泳，在下述缓冲液中蛋白质移动，得到有效分离：12g%。Tris，28.8g‰甘氨酸，pH8.7的0.1g% SDS，70伏电压下，12小时。用库马斯亮蓝R250溶液（0.5g溶于250ml 90%甲醇）染色来自胞液的蛋白质和来自DEAE-葡聚糖凝胶洗脱液的蛋白质。亲合层析后得到的蛋白质用银染法染色，技术采用P.Tunon and K.E.Johansson，J.Biol.Chem.and Biophys，Methods，9，第171-179页（1984）。

例4和例5

采用例1中叙述过的程序，但用乳腺癌和前列腺癌患者的癌变组织代替大鼠胚胎肝脏组织，可得到纯化的TK-F，其与从大鼠胚胎肝脏组织中得到的纯化TK-F相似，具有基本一致的特性（酶活力，Rf值）。

观察到，特别是例1，4和5的所有产物，与TK-A活力相反，TK-F的活力不受d-CTP抑制，聚丙烯酰胺凝胶电泳（pH8.6）中TK-F电泳迁移率是零或很低，而TK-A显示高迁移率。在DEAE-葡聚糖柱或DEAE-纤维素柱上这两种同功酶表现也不同。TK-F不停留在这种树脂表面，被低离子强度的溶液所洗脱。TK-A停留于这种树脂表面，只能被高离子强度溶液所洗脱。因此电泳和层析行为表面TK-F具有碱性特征，TK-A具有酸性特征。根据目前的知识，TK-F的pH为9.0～9.7，TK-A pH为5.0～5.7。

据本发明，以新工业产品的形式推荐由本发明生产的纯化的TK-F（从任何来源得到，特别是从动物或人体得到的纯化的TK-F）引起的抗-TK-F抗体。

如上所述，由纯化的TK-F引起的抗TK-F抗体，特别是抗-TK-F单克隆抗体，特别适用于定量分析。优选地，用来制备该单克隆抗体的纯化TK-F来源于动物（特别是大鼠胚胎肝组织）或源于人类（特别是来自人类癌变组织。）

Claims

1、一种制备纯化的胎儿胸苷激酶(TK-F)方法，该TK-F具有大于或等于每毫克5000单位的酶活力，该方法包括将待纯化TK-F与胸苷偶联，再切开得到的胸苷/TK-F复合物，该方法的特征在于：

a)把待纯化的TK-F与予先固定于适当的第一载体上的胸苷相接触将TK-F与胸苷偶联，

b)以这种方式结合的TK-F用含有胸苷的适当溶剂洗脱。

c)以这种方式洗脱的胸苷/TK-F用第二载体切开，第二载体不同于第一载体并从该胸苷/TK-F复合物上选择性吸收胸苷。

2、根据权项1的方法，其中第一载体是环氧-琼脂糖。

3、根据权项1的方法，其中未停留在已偶联了胸苷的第一载体上的蛋白质类型的杂质，用下述缓冲液洗脱：10mM Tris，10mM Mg Cl₂，5μM Na F，0.4mM pH7.5的β-巯基乙醇和10mMATP。

4、根据权项1的方法，其中固定在载体偶联的胸苷上的TK-F被下述缓冲液洗脱：10mM Tris，10mM Mg Cl₂，5μM NaF，0.4mM β-巯基乙醇，1mM ATP和10mM pH7.5的胸苷。

5、根据权项1的方法，其中第二载体是包括1%重量木炭，0.1%重量葡聚糖和0.2%重量明胶溶于10mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液的组合物。

6、根据权项1的方法，得到纯化的TK-F的酶活力大于或等于8000单位/mg。

7、根据权项2-5的方法，得到一纯化的TK-F的酶活力大于或等于每毫克10，000单位。

8、根据权项7的方法，得到纯化的TK-F具有：（ⅰ）酶活力约11，800单位/mg;（ⅱ）pH值在8.6时，电泳Rf值约为0.15。