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CN1977051A - 唾液mRNA分布型分析、生物标记及其相关方法和试剂盒 - Google Patents

唾液mRNA分布型分析、生物标记及其相关方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种检测唾液中的生物标记的方法，所述生物标记是胞外mRNA，所述方法包括检测无细胞唾液中的胞外mRNA；唾液的转录组分析，包括检测无细胞唾液中的转录组模式；一种通过分析唾液检测器官或器官基因中遗传改变的方法，所述方法包括检测无细胞唾液中的转录组模式和/或基因的mRNA分布型；一种诊断某对象口腔或全身性病理疾病或失调的方法，所述方法包括：检测无细胞唾液和/或血清中与病理疾病或失调相关的生物标记，具体是mRNA和/或蛋白质的分布型；试剂盒，其装有进行至少一种所述方法的至少一种生物标记的鉴定剂；以及采用唾液生物标记即唾液和/或血清mRNA作为口腔和/或全身性病理、疾病或失调的生物标记。

Description

唾液mRNA分布型分析、生物标记及其相关方法和试剂盒
本发明受到NIH的资助号U01-DE15018资助在政府支持下进行。政府对本发明享有一定权利。
                           发明领域
本发明涉及生物标记的分布型分析和使用所述生物标记的方法和试剂盒。具体说，本发明涉及用于检测癌症，具体是口腔和口咽鳞状细胞癌(OSCC)的生物标记。
                           发明背景
生物标记是特定生物学特性、生化特征或或可用于测定疾病进程或疗效方面的分子指示物。
蛋白质和核酸是示范性生物标记。具体说，已广泛接受的是，胞外检测到的基因组信使可用作疾病的生物标记[6]。具体说，已在大多数体液，包括血液、尿液和脑脊液中鉴定到核酸，已成功地将核酸用作疾病的诊断性生物标记[28，42，49]。
唾液不是血清的被动″超滤液″[41]，而含有独特的酶、激素、抗体和其它分子组成。在过去10年中，将唾液用作诊断性液体已成功应用于诊断和预测处于各种疾病风险中的群体[47]。
需要利用唾液中的特异性和信息性的生物标记来诊断疾病和监测人的健康[30，47，6]。例如，已在唾液中鉴定到可用于监测龋齿、牙周炎、口腔癌、唾液腺疾病和全身性疾病如肝炎和HIV的生物标记[35]。以前的研究也证明，可在唾液中鉴定到人DNA生物标记并用于口腔癌检测[30，36]。RNA比DNA更不稳定，认为它非常易于被RNA酶降解。而且，有报道称唾液中的RNA酶活性升高，唾液是便宜、非侵入性和可获得的体液，适合用作理想的诊断媒介。具体说，有报道称癌症患者唾液中的RNA酶活性升高[83]。因此，通常认为，人mRNA不能在唾液中胞外存活。OSCC是世界上第六大常见癌症，每年有50,000名美国人患上此病。世界上，口腔癌和口咽癌是重大的公共卫生问题。OSCC占印度所有新诊断的癌症病例的50％左右，在法国是死亡的主要原因[1]。
尽管局部控制有所改进，但发病率和死亡率在过去30年中改善不大[2]。因此，此疾病的早期检测或预防可能最有效。认为早期检测OSCC是减少该疾病引起的死亡和毁容的最有效方式。大多数头颈癌缺乏明确的早期警告迹象表明灵敏和特异性的生物标记可能对筛选高危患者很重要。
                           发明概述
公开的第一方面是检测包括细胞相和液相的体液中生物标记的方法，其中所述生物标记是胞外mRNA，体液是唾液，优选未受刺激的唾液。该方法包括：提供体液的无细胞液相部分；检测体液无细胞液相部分中的胞外mRNA。
具体说，检测胞外mRNA可包括：分离体液无细胞液相部分中的胞外mRNA，扩增该胞外mRNA。
公开的第二方面是包括细胞相和液相的体液的转录组分析，其中体液是唾液。该方法包括：提供体液的无细胞液相部分；检测体液无细胞液相部分中的转录组模式(transcriptome pattern)。体液优选未受刺激的唾液。
具体说，优选用微阵列试验，最优选用高密度寡核苷酸微阵列试验检测唾液上清中的转录组模式。也可用定量PCR分析或RT-PCR分析检测唾液上清中的转录组模式。
公开的第三方面是分析器官排出的含有细胞相和液相的体液，检测器官的遗传改变的方法。体液具体是唾液，优选未受刺激的唾液，所述方法包括：提供体液的无细胞液相部分；检测体液无细胞液相部分中的转录组模式；将该转录组模式与预先确定的模式作比较，预先确定的模式是正常体液无细胞液相部分的共有转录组模式。
公开的第四方面是分析器官排出的含有细胞相和液相的体液，检测器官中某基因的遗传改变的方法。体液具体是唾液，所述方法包括：提供体液的无细胞液相部分；检测体液无细胞液相部分中该基因的mRNA分布型(mRNA profile)；将该基因的mRNA分布型与该基因的预定mRNA分布型作比较，该基因的预定mRNA分布型是正常体液无细胞液相部分中该基因的mRNA分布型。
公开的第五个方面是诊断某对象口腔或全身性病理学疾病或失调的方法。该方法包括：提供该对象唾液的无细胞液相部分；检测提供的无细胞唾液液相部分中与病理、疾病或失调相关的某基因的mRNA分布型；和将该基因的RNA分布型与该基因的预定mRNA分布型作比较，检测到该基因的预定mRNA分布型表明该对象中存在所述病理、疾病或失调。
在第一个实施方式中，所述病理、疾病或失调是口腔癌和/或口咽癌，所述体液是唾液，所述基因选自编码IL8(白介素8)、IL1B(白介素1，β)、DUSP1(双特异性磷酸酶1)、H3F3A(H3组蛋白，3A家族)、OAZ1(鸟氨酸脱羧酶抗酶1)、S100P(S100钙结合蛋白P)和SAT(亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶)的基因。
在第二个实施方式中，所述病理、疾病或失调是口腔癌和/或口咽癌，所述体液是血清，所述基因选自IL6(白介素6)、H3F3A、TPT1(翻译控制的肿瘤蛋白1)，FTH1(铁蛋白重链多肽1)，NCOA4(核受体辅激活蛋白4)和ARCR(Ras同源性基因家族，成员A)。
可诊断的疾病包括口咽鳞状细胞癌，也可能是其它全身性疾病。
公开的第六个方面是在诊断某对象口腔或全身性病理、疾病或失调的方法。该方法包括：提供该对象唾液的无细胞液相部分；检测所提供无细胞液相部分中与病理、疾病或失调相关的转录组模式；将该转录组模式与预定模式相比较，在转录组模式中检测到预定模式的特征即可诊断该对象存在所述病理、疾病或失调。在一实施方式中，所述病理、疾病或失调是口腔癌和/或口咽癌，转录组包括选自唾液的IL8、L1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT的转录物。
公开的第七个方面是诊断某对象口腔或全身性病理、疾病或失调的方法，该方法包括：提供该对象的血清；检测所提供血清中与病理、疾病或失调相关的转录组模式；将该转录组模式与预定模式相比较，在转录组模式中检测到预定模式的特征即可诊断该对象存在所述病理、疾病或失调。
在一个实施方式中，所述病理、疾病或失调是口腔癌和/或口咽癌，所述转录组包括选自血清的IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR的转录物。
可诊断的疾病包括口咽鳞状细胞癌，也可能是其它全身性疾病。
公开的第八个方面是诊断某对象癌症的方法。该方法包括：提供该对象的体液；检测体液中的生物标记分布型，将该生物标记分布型与该生物标记的预定分布型作比较，在生物标记分布型中检测到生物标记的预定分布型特征即可诊断患有癌症。
可诊断的病理、疾病或失调包括口咽鳞状细胞癌，也可能是其它全身性疾病。生物标记包括IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR。
在第一种实施方式中，所述病理、疾病或失调是口咽鳞状细胞癌，所述生物标记选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT，所述体液是唾液，通过检测某生物标记的mRNA分布型来检测该生物标记分布型。
在第二种实施方式中，所述病理、疾病或失调是口咽鳞状细胞癌，所述生物标记选自IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR，所述体液是血清，通过检测生物标记的mRNA分布型检测生物标记分布型。
在第三种实施方式中，所述病理、疾病或失调是口咽鳞状细胞癌，所述生物标记是IL6，所述体液是血清，通过检测某生物标记的蛋白分布型检测该生物标记分布型。
公开的第八个方面是诊断口腔和/或全身性病理、疾病或失调的试剂盒，该试剂盒装有：体液中至少一种生物标记的鉴定剂，所述生物标记选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR；和该鉴定剂的检测试剂。
可诊断的病理、疾病或失调包括口咽鳞状细胞癌，也可能是其它全身性疾病。
根据本文所述方法用所述鉴定剂和检测试剂检测体液中的生物标记分布型。具体说，使所述鉴定剂与体液中的生物标记相结合，用所述检测试剂检测所述鉴定剂，因此，所述鉴定剂和检测试剂能够检测体液中的生物标记分布型。
公开的第九个方面是诊断口腔和/或全身性病理疾病或失调的方法。该方法包括：用唾液和/或血清mRNA作为口腔和/或全身性病理、疾病或失调的生物标记。
在优选实施方式中，mRNA编码选自下组的至少一种生物标记：IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR。
可诊断的疾病包括口咽鳞状细胞癌，也可能是其它全身性疾病。
公开的第十个方面是诊断口腔和/或全身性病理的方法。该方法包括：用唾液或血清中的蛋白质作为口腔和/或全身性病理、疾病或失调的生物标记，具体是血清中的IL6蛋白和唾液中的IL8蛋白。
附图辅助说明了本发明的方法和试剂盒。
                         附图说明
图1A显示了对分离自贮存1个月(泳道2)、3个月(泳道3)和6个月(泳道4)后的人类无细胞唾液上清中的RNA进行RT-PCR分型以检测ACTB的结果，图中有100bp梯状分子量标记(泳道1)和阴性对照(略去模板)(泳道5)。在图左侧用箭头标明分子大小标记。
图1B显示了对分离自人类无细胞唾液上清的RNA进行RT-PCR(泳道1)并分型GAPDH(B1)、RPS9(B2)和ACTB(B3)的结果，含有阳性对照(人总RNA，BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)(泳道2)和阴性对照(略去模板)(泳道3)。在图左侧用箭头标明分子大小标记。
图2A显示用毛细管电泳监测分离自人无细胞唾液上清的RNA进行RNA扩增的结果。泳道1-5显示了1kb的DNA梯(泳道1)、5μl分离RNA后的唾液(检测不到)(泳道2)、1μl两轮扩增的cRNA(范围是200bp-～4kb)(泳道3)、1μl片段化后的cRNA(约100bp)(泳道4)和Ambion RNA Century标记(泳道5)。在图左侧和右侧用箭头标明分子大小标记。
图2B显示了对分离自人无细胞唾液上清的RNA进行PCR的不同扩增阶段和ACTB分型的结果。泳道1-8显示100bp的DNA梯(泳道1)、分离自无细胞唾液的总RNA(泳道2)、第一轮cDNA(泳道3)、第一轮cRNA RT后(泳道4)、第二轮cDNA(泳道5)、第二轮cRNA RT后(泳道6)、阳性对照(人总RNA，BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)(泳道7)和阴性对照(略去模板)(泳道8)。在图左侧用箭头标明分子大小标记。
图2C显示了在微阵列上杂交之前用Agilent 2100生物分析仪分析靶cRNA的结果。x轴表示片段化cRNA参比标记RNA的分子量(bp)。y轴表示用生物分析仪测定的片段化cRNA(μg/ml)的量。
图3显示了对分离自人无细胞唾液上清(唾液)的RNA进行RT-PCR的结果以及梯(标记)、阳性对照(对照(+))和阴性对照(对照(-))，对IL6(IL6)、IL8(IL8)和β-肌动蛋白(β-Actin)的分型。
图4显示了对全唾液、血清样品中持家性β-肌动蛋白进行PCR的结果，样品经0xg(0xg)、1,000xg(1,000xg)、2,600xg(2,600xg)、5,000xg(5,000xg)和10,000xg(10,000xg)离心，用基因组DNA作细胞裂解和胞内化合物溢出的标记(标记)。
图5A显示了在qRT-PCR OSCC患者(癌症)和正常对象(对照)的重复唾液样品中检测到的IL8 mRNA平均浓度图。x轴表示各样品组。y轴表示检测到的拷贝数。
图5B显示了用ELISA在OSCC患者(癌症)和正常对象(对照)的重复唾液样品中检测到的IL8平均浓度图。x轴表示各样品组。y轴表示表达的浓度(pg/ml)。
图6A显示了在qRT-PCR OSCC患者(癌症)和正常对象(对照)的重复血清样品中检测到的IL6 mRNA平均浓度图。x轴表示各样品组。y轴表示检测到的拷贝数。
图6B显示了用ELISA在OSCC患者(癌症)和正常对象(对照)的重复血清样品中检测到的IL6平均浓度图。x轴表示各样品组。y轴表示表达的浓度(pg/ml)。
图7A显示了计算唾液中IL8的接受者操作特征(Receiver Operating Characteric，ROC)曲线图。x轴表示1-特异性。y轴表示灵敏度。
图7B显示了计算血清中IL6的ROC曲线图。x轴表示1-特异性。y轴表示灵敏度。
图7C显示了计算唾液中IL8和血清中IL6的组合的ROC曲线图。x轴代表1-特异性。y轴代表灵敏度。
图8显示了用PCR反应对唾液mRNA进行血清人mRNA RPS9(泳道2、3和4)；GAPDH(泳道5、6和7)；B2M(泳道8、9和10)和ACTB(泳道11、12和13)表型测定的结果；以及作为对照的DNA梯(泳道1)。
图9显示了血清中循环性mRNA的对数回归模式的ROC曲线图。x轴代表1-特异性。y轴代表灵敏度。
图10显示了评价OSCC的血清mRNA预测物的分类和回归树(CART)模式图。
图11显示了混合的唾液mRNA生物标记预测能力的对数回归模式的ROC曲线图。x轴代表1-特异性。y轴代表灵敏度。
图12显示了评价OSCC的唾液mRNA预测物的分类和回归树(CART)模式图。
                        优选实施方式详述
本文公开了检测体液中胞外mRNA的方法，其中所述体液是唾液，检测唾液无细胞液相部分中的胞外mRNA。在实施例中广泛描述的方法中证实唾液无细胞液相部分中存在RNA，检测到的mRNA量能满足用例如PCR、qPCR和微阵列等技术检测的需要。
在该方法中，对于检测体液唾液中胞外mRNA以及本文的信息性mRNA而言，唾液符合于便宜、非侵入性方法所需要的可得到的体液，是研究分析的理想媒介。
具体是检测唾液一部分(无细胞液相)中的信息性mRNA时，应最大程度降低其中存在的微生物和外来物质如食物残渣，使得能够以简单和准确的方式分析各分子。此无细胞液相部分优选得自未受刺激的唾液。
在该方法中，可根据本领域已知方法收集唾液，然后(例如)离心收集的唾液将其加工成其无细胞液相，产生唾液的细胞沉淀相和唾液的无细胞液相上清。(参见在实施例1、5和13中广泛描述的方法)
根据本公开，优化了分离唾液的细胞相和液相条件，以避免对细胞组分产生机械破坏而使无细胞液相中检测到的RNA增加。
在通过离心进行分离的实施方式中，可通过检测不同速度离心样品和全唾液样品的持家基因而进行优化，用DNA作为细胞裂解和溢出的标记，以获得最优离心速度。(参见实施例5所述方法)。
然后，可用本领域已知技术，如RT-PCR、Q-PCR和微阵列对mRNA进行定性和/或定量分析来检测无细胞唾液液相部分中的胞外mRNA(唾液mRNA)。具体可根据包括分离和扩增唾液mRNA的方法和实施例中示范的方法进行检测。
在本方法中检测唾液mRNA的目的是对唾液mRNA进行分布型分析。
在第一系列的实施方式中，可测定唾液无细胞液相部分中预定基因的表达的分布型。在那些实施方式中，可用RT-PCR或鉴定预定的靶mRNA的技术检测mRNA的分布型。可采用诸如定量PCR(Q-PCR)等技术进行定量分析，以确证RT-PCR鉴定的mRNA的存在。然后，可根据如此获得的mRNA分布型产生参比数据库。实施例1、4和9中详述了进行这种唾液mRNA的定性和定量分析的示范性方法。
在第二系列的实施方式中，可通过检测唾液无细胞液相部分中的转录组模式进行唾液的转录组分析。可通过分离和线性扩增唾液mRNA来检测转录组模式，然后可用例如高密度寡核苷酸微阵列等技术进行分布型分析。然后可用例如Q-PCR等技术进行定量分析，以确证微阵列所鉴定的模式(pattern)中存在的mRNA。然后，可根据如此获得的mRNA分布型产生参比数据库。实施例2-3、9-10和14-15中详述了进行唾液mRNA的定性和定量分析的示范性方法。
可对唾液RNA进行分布型分析，以检测和/或监测人体健康和疾病，或研究生物学问题，例如唾液中mRNA的来源、释放和清除。唾液mRNA为鉴定处于发生口腔和全身性病理、疾病或失调风险中的人群和患者提供了实际或可能的生物标记。
表征唾液的无细胞液相部分或正常对象的唾液mRNA分布型和转录组模式的改变可表明各种来源的病理、疾病或失调。这些病理、疾病或失调的例子是口腔炎性疾病，OSCC或其它疾病如糖尿病、乳腺癌和HIV。
对患有确定的病理、疾病或失调的对象的mRNA分布型和转录组模式之间的比较，可鉴定该确定的病理、疾病或失调的信息性生物标记。具体说，唾液mRNA可用作在口腔和全身性病理、疾病或失调时可能出现在口腔中的诊断性生物标记。
具体说，唾液mRNA可用作可出现在口腔和/或影响口腔的癌症的诊断性生物标记。唾液的mRNA试验具有可靠诊断所必需的特异性和灵敏度。
在患各种形式癌症的情况下，正常唾液mRNA和转录组模式的改变也可能反映口腔一部分或多个部分的遗传改变，这与肿瘤的存在有关。对于口腔癌患者，检测到的癌症相关RNA标记可能来源于匹配的肿瘤和/或全身性反应(局部或远端)，进一步反映了完全唾液中的该RNA标记本身是来自三种主要来源(唾液腺、龈缝液体和口腔粘膜细胞)。可以想像，可发现与疾病相关的RNA通过唾液腺或循环血液经龈缝液进入口腔的方式。乳腺癌患者唾液中HER-2蛋白升高是一个很好的例子[87]。
正常无细胞唾液的常见转录组包括约185种不同的人mRNA，也定义为正常唾液核心转录组(NSCT)，是对正常对象唾液的无细胞液相进行转录组分析的结果而鉴定到的(参见实施例2，表2)。
由于在HG U133A微阵列上用探针组鉴定到的NSCT仅代表～19,000个人基因，而人基因组由超过30,000个基因组成[48]，预计用其它方法将在唾液中鉴定到更多的人mRNA，可用本文所述方法鉴定其它唾液模式(pattern)。
正常人群无细胞唾液中的NSCT和/或其它唾液转录组模式可用于唾液转录组诊断(SlvTD)，可应用于疾病诊断以及正常的健康监护。
因此，在SlvTD的第一种实施方式中，公开了诊断某对象口腔或全身性病理、疾病或失调的方法。该方法包括：提供该对象唾液的无细胞液相部分；检测所提供的无细胞唾液液相部分中与疾病相关基因的mRNA分布型；将该基因的RNA分布型与该基因的预定mRNA分布型相比较，检测到该基因的预定mRNA分布型表明该对象患有该疾病。
在SlvTD的第二种实施方式中，公开了诊断某对象口腔或全身性病理疾病或失调的方法。该方法包括：提供该对象的无细胞唾液上清；检测无细胞唾液上清中与病理、疾病或失调相关的转录组模式；将该转录组模式与预定模式作比较，在转录组模式中检测到预定的模式特征即可诊断该对象存在该病理疾病或失调。
在SlvTD的第三种实施方式中，公开了鉴定与预定病理疾病或失调相关的生物标记的方法。该方法包括：检测患有病理疾病或失调者的唾液无细胞液相部分中的预定基因的第一种mRNA分布型；检测正常对象唾液无细胞液相部分中的预定基因的第二种mRNA分布型；将第一种mRNA分布型与第二种mRNA分布型作比较，检测到第一种mRNA分布型与第二种mRNA分布型之间存在差异后，用统计学分析验证该差异，表明该预定基因的鉴定可作为预定病理疾病或失调的生物标记。
具体说，用微阵列统计学方法分析一种疾病分类与一种健康分类RNA分布型之间的差异。所用算法包括MAS 5.0，DNA-芯片分析仪1.3和RMA 3.0。优选联用这些方法进行分析，以提供更有力的和更准确的测试标记。然后，用常规技术如Q-PCR测定微阵列所鉴定的标记。
在SlvTD的第四种实施方式中，可实施的诊断方法中使无细胞唾液与某鉴定剂接触，以测定生物标记的存在或表达，优选用检测器工具检测是否存在与生物标记的存在或表达相关的该鉴定剂。
SlvTD可以检测出足够早期的疾病如肿瘤而使治疗可能成功，筛选工具具有高灵敏度和高特异性的组合特征。而且，筛选工具的非侵入性和价格便宜足以使其得到广泛应用。
可将上述SlvTD方法的结果与对mRNA和/或蛋白质水平和/或其它体液如血清的相应分析整合。
血清中检测到的生物标记，如蛋白质或转录组模式也可用于血清转录组诊断(SrmTD)，可能应用于疾病诊断以及正常的健康监护。SrmTD的实施方式包括与上面报道的SlvTD方法对应的方法，但其中分析的体液是血清，而不是无细胞唾液。
具体说，按照SlvTD获得的结果可与用SrmTD获得的结果相组合，成为组合的唾液和血清转录组方法(SSTD)。
可进行按照SSTD的诊断方法，该方法中使体液、血清和/或唾液与某鉴定剂相接触，以测定生物标记的存在或表达，所述生物标记可以是蛋白质或mRNA，优选用检测器工具检测是否存在与生物标记的存在或表达相关的该鉴定剂。
本文提供了参照OSCC的SlvTD、SrmTD和SSTD的例子。阅读本文公开的内容后，本领域技术人员可对本文的STD进行合适的修饰，以适应于不同于OSCC的疾病。
检测了OSCC患者的唾液无细胞液相部分和血清中的两种特定细胞因子IL6和IL8的分布型。在OSCC患者唾液中检测到IL8浓度较高(P＜0.01)，在OSCC患者血清中检测到IL6浓度较高(P＜0.01)。在mRNA和蛋白质水平确认了这些结果，并且结果一致。唾液中的IL8浓度和血清中的IL6浓度看来与性别、年龄或者酒精或烟草的使用不相关(P＞0.75)。对数据进行统计学分析，具体是ROC分析，能够确定检测OSCC的各生物标记的阈值、灵敏度和特异性(参见实施例8，表3)。因而，本发明者得以测定唾液标本中的mRNA。
对从OSCC患者和正常对象收集的未受刺激唾液进行转录组分析，如实施例9-12和实施例13-16所述。
分离唾液上清中的RNA，然后用T7RNA聚合酶进行两轮线性扩增。采用人基因组U133A微阵列分析人唾液转录组的分布型。通过联用t检验比较和倍数改变分析，分析了10位匹配的癌症患者和对照者的不同基因表达模式。采用可定量的聚合酶链反应(qPCR)验证了微阵列所显示的具有显著性差异(P＜0.01)的所选基因。用接受者操作特征曲线和分类模型分析了这些唾液mRNA生物标记的预测能力。
第一组微阵列分析的结果显示，在癌症患者和对照者的唾液中显示有1,679个基因表达水平显著不同(P＜0.05)。7种癌症相关的mRNA生物标记在OSCC唾液中升高至少3.5倍(P＜0.05)，qPCR证实这与OSCC患者(n＝32)和对照(n＝32)的唾液样品相一致。这些唾液RNA生物标记是IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT的转录物。这些生物标记的组合在鉴别OSCC与对照时具有灵敏度(91％)和特异性(91％)。(参见实施例13-16)
第二组微阵列分析结果显示，根据其报道选出的10种上调基因中有5种是癌症相关基因，在OSCC患者血清中它们的转录物水平显著升高。这些RNA生物标记是H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR转录物。qPCR验证证实了该结果，这五个基因的转录物在OSCC患者血清中显著升高(Wilcoxon Signed秩次检验，P＜0.05)。
(参见实施例9-12)
用所述收集和加工方法，用RT-PCR证实在所有的血清(患者和对照)中存在ACTB、B2W、GAPDH和RPS9 mRNA(对照mRNA)。
因此，本文公开了诊断某对象癌症，具体是OSCC的方法。该方法包括：提供该对象的体液；检测体液中生物标记的分布型，所述生物标记选自IL8 IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR，将检测到的生物标记的分布型与该生物标记的预定分布型作比较，在生物标记的分布型中检测到生物标记的预定分布型即可诊断患有癌症。
也公开了诊断口腔和/或全身性病理、疾病或失调，尤其是OSCC的方法。该方法包括用唾液mRNA作为口腔和/或全身性疾病的生物标记，具体说，唾液mRNA选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT。
还公开了诊断口腔和/或全身性病理、疾病或失调，尤其是OSCC的方法。该方法包括：用血清mRNA和/或蛋白质作为口腔和/或全身性疾病的生物标记，具体说，血清mRNA选自IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR，以及血清IL6蛋白。
鉴于癌症发生的多因素特性和癌基因通路中的异质性，优选联用唾液和/或血清生物标记(可保证较高的特异性和灵敏度)来检测该疾病。可利用报道的多种统计学方法和实施例所述的风险模型来鉴定可鉴定OSCC患者样品的生物标记组合，而有助于为患者特定癌症风险的诊断确定合适的血清转录组。
监测唾液的无细胞液相部分和/或其它体液如血清中唾液mRNA的分布型，可用于OSCC患者的手术后处理。可用于监测疗效，或治疗完成之后疾病复发。唾液mRNA，具体是IL8，也可用作预后性指标，来指导口腔癌患者的治疗。可展望对高风险患者进行更为积极的治疗方案或辅佐治疗方案。
采用这些生物标记也可改进对肿瘤的分期。用传统技术，常常不能识别远处显微病灶的存在。近年来，对推测患有局部疾病的患者治疗，已从局部失败转到远部治疗失效。[18]这部分反映了开始治疗之前即存在亚临床的远处病灶。测定生物标记的存在可以检测到正常组织背景中存在的少量肿瘤细胞。唾液mRNA作为头颈肿瘤的特异性生物标记或一组这样的生物标记可检测出远处显微病灶。对于口腔癌，在这个方面STD方法的最重要应用之一是检测口腔前癌病灶的癌转化。
唾液mRNA的分布型分析也可用于研究基因在癌症发展中的作用，具体说，这些基因的异常表达是否在功能上促进了人OSCC的发展。应该测定这些基因在头颈癌/口腔癌中差异性表达的生物学意义。鉴定出在癌症患者中发生一致改变的癌相关基因不仅为我们提供了诊断标记，也使我们能够认识到头颈癌发生中涉及的分子特征。知道了某具体癌症中分子改变的特征将极其有用，因为可将该癌症所致表型与分子变化关联起来。
也包括与本文所述方法相关的试剂盒部分。在示范性实施方式中，试剂盒包括：体液中生物标记，如唾液mRNA或蛋白以及血清mRNA或蛋白的鉴定剂，所述生物标记选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR；所述鉴定剂的检测试剂，所述鉴定剂和所述检测试剂用于检测本文所述方法之一的生物标记的体液特征，其中所述鉴定剂可与体液中的生物标记相结合，用所述检测试剂检测所述鉴定剂，因此能够通过所述鉴定剂和所述检测试剂检测生物标记的体液特征。
体液可以是唾液，检测其无细胞液相部分，或另一种体液如血清。
本领域技术人员知道所述鉴定剂和能够检测该鉴定剂的检测试剂。本领域技术人员也知道可在试剂盒中合适地包括其它组合物和/或组分。
所述鉴定剂和所述试剂可包括在一种或多种组合物中，该组合物中所述鉴定剂和/或试剂与合适的运载体、载体和辅助剂混合。
在本文所述诊断试剂盒中，该试剂盒可提供所述试剂和鉴定剂，以及合适的说明书和其它必需试剂，以进行本文所述方法。所述试剂盒通常包括装在不同容器中的组合物。试剂盒中通常包括实施试验的说明书，例如写出的说明书或音频说明书(在纸上或电子设备如磁带或CD-ROM中)。该试剂盒也可包括其它封装试剂和材料(即洗涤缓冲液等)，这取决于所用的具体方法。
本领域技术人员通过阅读本文所述内容可获得所述组合物的合适运载体和辅助试剂，以及一般的制备和包装该试剂盒的有关详情。
本文所述的试剂盒部分具体可用于诊断目的。结果是，公开了非侵入性地检测诊断对象的病理、疾病或失调，特别是口腔癌和口咽癌。
采用唾液液相比采用脱落细胞具有独特的优点。根据肿瘤位置，可能不易触及和拭抹瘤床(tumor bed)。虽然唾液生物标记不能鉴定肿瘤的起源位置，但它们可鉴定处于风险中的患者。这种唾液试验可可由非专业人员在远处进行，作为筛选工具可选择用于仔细评价患上部气道消化道(upper aerodigestive tract)疾病的患者。如果能在早期发现以前不能检测的疾病，可能最终会拯救生命。而且，采用容易得到的生物标记可能对大人群或化学药物预防试验大有益处。可考虑应用于常规牙科就诊或有目的地筛选处于发生疾病高风险中的个体。也考虑可家用的试剂盒。
也考虑可用于血液检测，具体是癌症的早期检测。可从癌症患者血清中回收到代表肿瘤遗传改变特征的无细胞循环血液mRNA或蛋白质生物标记，如诊断OSCC的IL6 mRNA和蛋白、H3F3A mRNA、TPT1 mRNA、FTH1 mRNA、NCOA4 mRNA和ARCR mRNA，可考虑在常规医生就诊或有目的地筛选处于发生口腔癌高风险个体时的筛选检测是否存在潜伏的OSCC。也考虑包括优选的可家用的试剂盒。
具体说，可用常规临床方法获得对象的外周血，优选用本文所述优化步骤分离mRNA和蛋白质。进行各细胞因子的实时定量PCR和ELISA，以测定一种或多种生物标记，如IL6。
本文所述方法的一个展望性实施方式涉及最终建立微米-/纳米-电子机械系统(MEMS/NEMS)，以超灵敏地检测口腔液体中的分子生物标记。将确证的OSCC生物标记RNA和蛋白质表达选作癌症检测的靶点。这些检测系统的组合能同时检测多种OSCC生物标记的mRNA和蛋白质，从而对口腔液体的癌症诊断产生一种有效、自动化、价格合理的系统。
本领域技术人员通过阅读本文公开内容而了解可用于本文所述方法和试剂盒的试剂、条件、组成、技术等更多的详细内容。
本领域技术人员也可通过阅读本文所述内容合适地修改本文所述和示范的与OSCC和/或HSNCC相关的STD方法和试剂盒，以进行与研究和诊断其它病理、疾病和失调相关的mRNA分布型分析和转录组分析。
提供以下实施例是为了进一步详细描述本发明。这些实施例提出了当前考虑的可用于实施本发明的优选方式，它们旨在说明而非限制本发明。
                           实施例
实施例1：正常供者的无细胞唾液的RNA分离、扩增和基因表达分布型分析正常对象
按照UCLA伦理委员会批准的方法获得加州大学洛杉矶分校(UCLA)医学中心，耳鼻喉科、头颈外科十位正常供者的唾液样品。采用以下准入标准：年龄30岁；无恶性肿瘤史、免疫缺陷史、自身免疫病史、肝炎史、HIV感染史或吸烟史。研究群体由6名男性和4名女性组成，平均年龄42岁(范围是32-55岁)。
收集唾液并加工获得相关液相
按发表方法在上午9-10点收集未受刺激的唾液[38]。唾液收集前至少一小时禁止对象饮食、吸烟或进行口腔卫生操作。2,600xg 4℃离心唾液样品15分钟。将唾液上清与细胞相分开。然后将RNA酶抑制剂(Superase-In，Ambion Inc.，Austin，TX，USA)和蛋白酶抑制剂(抑肽酶，Sigma，St.Louis，MO，USA)加入无细胞唾液上清。
分离无细胞唾液中的RNA
用厂商的改良方法(QIAamp病毒RNA试剂盒，Qiagen，Valencia，CA，USA)分离无细胞唾液上清中的RNA。将唾液(560μL)与AVL缓冲液(2,240μL)充分混合，室温孵育10分钟。加入无水乙醇(2,240μL)，6,000xg离心1分钟使溶液通过二氧化硅柱。然后洗涤该柱两次，20,000xg离心2分钟，用30μL无RNA酶的水9,000xg洗脱2分钟。根据厂商说明书用无RNA酶的DNA酶(DNA酶I-无DNA，Ambion Inc.，Austin，TX，USA)处理RNA各等份。
储存1、3和6个月后，通过RT-PCR测定分离的肌动蛋白-β(ACTB)RNA的稳定性。图1A报告的结果显示分离的mRNA可在-80℃下保存6个月以上，而没有显著降解。
通过RT-PCR测定三种持家基因转录物：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，肌动蛋白-β(ACTB)和核糖体蛋白S9(RPS9)来检测分离RNA的质量。用PRIMER3软件(http://www.genome.wi.mit.edu)设计引物，由公司合成(Fisher Scientific，Tustin，CA，USA)，如下所述：所附序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是GAPDH的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是ACTB的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是RPS9的引物序列。用RibogreenRNA定量试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)估计RNA的量。结果见图1B，其中在所有10例测试病例中一致地检测到GAPDH(B1)、RPS9(B2)和ACTB(B3)，证明所有10个唾液样品都含有编码持家基因：GAPDH、ACTB和RPS9的mRNA。
可将这些基因的mRNA在-80℃下保存6个月以上，而没有显著降解，(参见图1A报告的ACTB结果)。
靶cRNA制备
然后根据我们实验室发表的方法对分离的RNA进行线性扩增(Ohyama等，2000)。简要说，用T7-寡核苷酸-(dT)24作引物进行逆转录以合成cDNA第一条链。用T7RNA聚合酶(Ambion Inc.，Austin，TX，USA)进行第一轮体外转录(IVT)。用BioArrayTM高产率RNA转录物标记系统(Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY，USA)进行第二轮IVT，以使cRNA产物生物素化；用GeneChip样品清理模块(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)纯化标记的cRNA。
用分光光度法和凝胶电泳测定cRNA的量和质量。图2A报告了琼脂糖凝胶电泳检测的示范性结果，显示在RNA扩增的不同阶段扩增的cRNA量不同。
也用RT-PCR评价各分离和扩增步骤获得的小等份的质量。图2B报告了示范性结果，显示在RNA扩增的各个阶段用PCR测定的ACTB，其中在唾液RNA扩增过程每个主要步骤中都能检测到预计的单一条带(153bp)。
也用2100生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)通过毛细管电泳评价片段化cRNA(如Kelly，2002所述制备)的质量。图2C报告了示范性结果，显示一个狭窄的单峰(50-200bp)，证明已合适片段化。
在靶向cRNA制备中的基因表达分布型分析
对获自10位正常供者的无细胞唾液进行基因表达分布型分析，从560μL无细胞唾液样品中平均获得60.5±13.1ng(n＝10)总RNA。结果见表1。
                                表1.
对象  性别  年龄  RNA(ng)a  cRNA(～tg)′～  出现探针  探针～％″
1  F  53  60.4  44.3  3172  14.24
2  M  42  51.6  40.8  2591  11.62
3  M  55  43.2  34.8  2385  10.70
4  M  42  48.2  38.0  2701  12.12
5  M  46  60.6  42.7  3644  16.35
6  M  48  64.8  41.8  2972  13.34
7  F  40  75.0  44.3  2815  12.63
8  M  33  77.8  49.3  4159  18.66
9  F  32  48.8  41.4  2711  12.17
10  F  32  79.8  44.4  4282  19.22
平均值±SD  42±8.3  60.5±13.12  42.2±3.94  3143±665.0  14.11±2.98
总RNA量是560p.L无细胞唾液上清中的RNA量；cRNA量是经过两轮T7扩增的量。在HG U133A微阵列上显示出现访问(present call)的探针数(检测p＜0.04)。出现百分数(P％)＝指定为出现访问的探针数/总探针数(对于HG U133A微阵列总探针数是22,283)。
两轮T7RNA线性扩增后，生物素化cRNA的平均产量是42.2±3.9μg，A260/280＝2.067±0.082(表1)。片段化之前cRNA的长度为200bp-4kb；片段化后集中于约100bp。杂交之前用毛细管电泳证实了cRNA探针的质量。用PCR/RT-PCR检测到原始样品和各扩增步骤产物第一条cDNA、第一次体外转录(IVT)、第二条cDNA和第二次IVT都有ACTB mRNA，得到的琼脂糖电泳图案与图2B所示图像相当。
实施例2：正常供者无细胞唾液的mRNA的微阵列分布型分析
收集并加工唾液，如实施例1所述分离RNA。如实施例1所述评价RNA的稳定性、质量和量。
HG-U1331A微阵列分析
Affymetrix人基因组U133A阵列含有22,215种人基因cDNA探针组，代表-19,000基因(即每个基因可由一种以上的探针组代表)，用该阵列进行基因表达分布型分析。标准化阵列数据，并用Microarray Suite(MAS)软件(Affymetrix)进行分析。获得各探针组的检测p-值。将p＜0.04的任何探针组指定为″出现″，表明可靠地检测到匹配的基因转录物(Affymetrix，2001)。获得各阵列上出现的探针组总数，计算出现基因的出现百分数(P％)。用Gene Ontology Mining Tool(www.netaffx.com)对所选出基因(在所有十个阵列上出现，p＜0.01)进行功能分类。
用含有22,283种cDNA探针的HG U133A阵列获得10位正常对象的唾液mRNA分布型。在各阵列(n＝10)上发现平均有3,143±665.0个探针组(p＜0.04)被指定为出现访问。这些探针组代表约3,000种不同的mRNA。平均出现访问百分数是14.11±2.98％(n＝10)。产生包括10个阵列的数据的一个参比数据库。代表GAPDH、ACTB和RPS9的探针组在所有10个阵列上指定为出现访问。共有代表185个基因的207个探针组在所有10个阵列上指定为出现访问(检测p＜0.01)。根据这10个基因所参与的生物过程和分子功能中的已知作用对它们进行分类。表2报告了10位正常供者的无细胞唾液中185种基因所参与的生物过程和分子功能(用Gene OntologyMining Tool获得数据)。
                                                         表2.
 生物过程a  基因，nb  分子功能a  基因，nb
 细胞生长和/或维持  119  结合  118
 代谢  93  核酸结合  89
 生物合成  70  RNA结合  73
 蛋白质代谢  76  钙离子结合  12
 核苷酸代谢  10  其它结合  23
 其它代谢  18  结构分子  95
 细胞组织和生源(biogenesis)  2  核糖体组分  73
 体内平衡  3  细胞骨架组分  17
 细胞周期  5  肌肉组分  2
 细胞增殖  11  退化  15
 运输  5  转运物  4
 细胞运动  8  酶  20
 细胞间通讯  34  信号转导  10
 对外部刺激的反应  19  转录调节物  7
 细胞粘附  3  翻译调节物  5
 细胞-细胞信号转导  5  酶调节剂  9
 信号转导  17  细胞粘附分子  1
 退化  8  未知分子功能  6
 发育  18
 死亡  2
 未知生物过程  11
一种基因可能具有多种分子功能或参与不同生物过程。将基因分类为某些组/亚组。185种基因的主要功能涉及细胞生长/维持(119种基因)、分子结合(118种基因)和细胞结构组成(95种基因)。我们将这185种基因称为″正常唾液核心转录组(NSCT)″。
实施例3：用Q-PCR证实和定量分析正常供者无细胞唾液的微阵列分布型
通过Q-PCR进行定量基因表达分析证实了实施例2的微阵列分析结果
用Q-PCR作定量基因表达分析
通过定量用实施例2报告的微阵列分布型分析检测了从185种“正常唾液核心转录组”基因中选出的基因，用实时定量PCR(Q-PCR)证实唾液中存在人mRNA。随机选择在所有10个阵列上指定为出现访问的基因IL1B、SFN和K-α-1，进行验证。
用iCyclerTM热循环仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行Q-PCR。用MuLV逆转录酶(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)将2μL分离的唾液RNA等份(未扩增)逆转录到cDNA中。用得到的cDNA(3μL)进行iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)的PCR扩增。由Sigma-Genosys(Woodlands，TX，USA)合成引物，如下所述：所附序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8是白介素1β(IL1B)的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10是stratifin(SFN)的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12是遍在的微管蛋白α(K-α-1)的引物序列。所有反应重复进行三次，为特定PCR产物定制反应条件。用LightCycler软件3.0(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)从标准曲线外推获得具体模板的cDNA起始量。用标准曲线进行定量的详细方法已有描述(Ginzinger，2002)。
Q-PCR结果显示，在所有10例初始未扩增的无细胞唾液中都可检测到IL1B、SFN和K-α-1的mRNA。这些转录物的相对量(以拷贝数表示)(n＝10)是：IL1B：8.68×103±4.15×103；SFN：1.29×105±1.08×105；K-α-1：4.71×106±8.37×105。Q-PCR测定的这些基因的相对RNA表达水平与微阵列测定的类似(数据未显示)。
实施例4：OSCC患者无细胞唾液中的IL6和IL8 mRNA的分离扩增和表达分析
患者选择
从加州大学洛杉矶分校(UCLA)医学中心，Los Angels，CA；南加州大学(USC)医学中心，Los Angels，CA和加州大学旧金山分校(UCSF)医学中心，San Francisco，CA的头颈外科征集患者进行6个月研究。
本研究中包括证明患有口腔(OC)或口咽(OP)原发性T1或T2鳞状细胞癌的32位患者。所有患者最近诊断患有该原发性疾病，先前未接受诸如化疗、放疗、手术或其它药物等形式的治疗。相同数量的年龄和性别匹配的具有相当吸烟史的对象选作比较对照组。
这两组对象中，以下方面没有显著性差异：平均年龄(标准差，SD)：OSCC患者49.3(7.5)岁；正常对象48.8(5.7)岁(斯氏t检验P＞0.80)；性别(斯氏t检验P＞0.90)；或吸烟史(斯氏t检验P＞0.75)。对象以前都没有恶性肿瘤史、免疫缺陷史、自身免疫病史、肝炎史或HIV感染史。由头颈外科医生对对照组中的个体进行体检保证不存在可疑的粘膜损伤。
唾液收集和处理
将知情同意书给予所有患者。唾液和血清的获取方法经各学院(加州大学洛杉矶分校(UCLA)；南加州大学(USC)和加州大学旧金山分校(UCSF))的伦理委员会批准。
获得患有OC或OP SCCA的32位患者和未患病年龄和性别匹配的32位对照对象的唾液，进行细胞因子浓度的预期比较。
在唾液收集之前至少一小时禁止对象饮食、吸烟或使用口腔卫生产品。用Navazesh和Christensen的″排出(淌口水)″法收集唾液[7]，总共捐献5cc唾液。用Sorvall RT6000D离心机(DuPont，Wilmington，DE)4℃ 3500rpm(2600xg)离心唾液样品15分钟。然后取出液相，在冰上迅速加入RNA酶抑制剂(Superase-In，RNA酶抑制剂，Ambion Inc.，Austin，TX)和蛋白酶抑制剂(抑肽酶，Sigma，St.Louis，MO；苯基甲磺酰氟，Sigma，St.Louis，MO；原钒酸钠，Sigma，St.Louis，MO)。优化分离唾液的细胞相和液相的条件，以保证不会机械损伤细胞组分(这会增加液相中检测到的mRNA)。然后用DNA酶(DNA酶I-无DNA；Ambion Inc.，Austin，TX)处理所有样品。保留细胞沉淀并储存于-80℃。
分离无细胞唾液中的RNA
然后用QIAamp病毒RNA小抽试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)处理560μL唾液上清。根据厂商说明书抽提RNA。空气干燥样品，重悬于用焦碳酸二乙酯处理的水中，放在冰上立即使用或储存于-80℃。根据厂商说明书用无RNA酶的DNA酶(DNA酶I-无DNA，Ambion Inc.，Austin，TX)处理RNA等份。用分光光度法测定RNA浓度，用含有甲醛的琼脂糖凝胶作电泳检查完整性。
逆转录酶-聚合酶链反应
用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定唾液液相中是否存在IL6和IL8 mRNA转录物。
在含有2.5U Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(Applied Biosystems Inc.(ABI，Foster City，CA)和50pmol随机六核苷酸(ABI，Foster City，CA)的40μL反应混合物中42℃对各样品的RNA进行逆转录45分钟。根据发表的序列，由公司(FisherScientific(Tustin，CA))合成以下PCR寡核苷酸引物：所附序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14是β-肌动蛋白的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：15和SEQID NO：16是IL8的引物序列；所附序列表中SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18是IL6的引物序列。
扩增互补DNA(cDNA)的步骤如下：50个循环(95℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒)；最后一轮后延伸：72℃ 7分钟。通过预计大小和限制性酶切证实PCR产物的特异性。为确定该反应的特异性，采用的阴性对照中删去输入的RNA或使用RNA但删去逆转录酶。作为阳性对照的是从总唾液腺RNA(人唾液腺总RNA，Clontech，PaloAlto，CA)抽提的mRNA。为保证RNA质量，对所有制剂进行表达分析。
如此进行的RT-PCR研究证明，唾液和血清含有编码IL6和IL8的mRNA。图3报告的示范性结果显示，存在根据所选引物预计大小的PCR产物(IL6：95bp；IL8：88bp)。阳性对照中表达了相同大小的产物。
为了保证所分析的RNA和蛋白质仅来自唾液液相，并且为了保证不被细胞内组分污染，优化了唾液样品的离心速度。用PCR分析整个唾液样品和经各种速度离心的样品中持家基因β-肌动蛋白和泛素，用DNA作为细胞裂解和细胞内组分溢出的标记。结果支持唾液样品的最佳离心速度为2,600±52xg，优选速度为2,600xg(参见图4报告的示范性结果)。
实施例5：分离、扩增和表达分析OSCC患者血清中的IL6和IL8 mRNA
如实施例4所述征集患者，分析其血清中存在的IL6和IL8 mRNA。
血清收集和处理
获得19位OC或OP SCCA患者和未患病的年龄和性别匹配的32位对照对象的血清，进行细胞因子浓度的预期比较。此二组中，年龄、性别、酒精消费或吸烟史没有显著性差异(P＞0.75)。
在处理前抽取对照对象和患者的血。用Sorvall RT6000D离心机(DuPont，Wilmington，DE)以3000rpm(1000xg)15℃离心全血10分钟，收集血清。然后分离血清，在冰上迅速加入RNA酶抑制剂(Superase-In，RNA酶抑制剂，Ambion Inc.，Austin，TX)和蛋白酶抑制剂(抑肽酶，Sigma，St.Louis，MO；苯基甲磺酰氟，Sigma，St.Louis，MO；原钒酸钠，Sigma，St.Louis，MO)。然后用DNA酶处理所有样品(DNA酶I-无DNA，Ambion Inc.，Austin，TX)。将样品等份储存于-80℃待用。
逆转录酶-聚合酶链反应
如上述实施例4所述用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定血清中是否存在IL6和IL8 mRNA转录物。
如此进行的RT-PCR研究证明，血清含有编码IL6和IL8的mRNA，其电泳凝胶图案与图3中显示的凝胶图案相当。
为了保证所分析的RNA和蛋白质仅来自血清液相，和保证没有被细胞内组分污染，按照实施例4所述关于唾液样品的相同方法优化了血清样品的离心速度。结果支持唾液样品的最佳离心速度为1,000±20xg，优选速度为1,000xg。
实施例6：分析OSCC患者唾液中的IL6和IL8细胞因子水平
证明唾液液相中存在IL6和IL8mRNA转录物后，我们用定量实时PCR(qRT-PCR)和ELISA预测性检测和比较了未患病对象和OSCC患者唾液中的IL6和IL8水平。
获得32位OSCC患者和32位年龄和性别匹配的对照对象的唾液。此二组中，年龄、性别、酒精消费或吸烟史没有显著性差异(P＞0.75)。
定量测定患者和正常对象唾液中IL6和IL8 mRNA浓度的实时PCR
为了定量分析RT-PCR结果，采用定量实时PCR(Bio-Rad iCycler，热循环仪，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。各样品重复测定三次。用iQ SYBR GreenSupermix(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)在20μL混合物中进行扩增反应。一开始在95℃变性3分钟后，进行50个PCR循环(60℃ 20秒，然后72℃ 20秒，然后83℃ 20秒，然后95℃ 1分钟)，最后在55℃延伸1分钟。从各孔中取出等份，用琼脂糖凝胶电泳核查，以保证产物的特异性。
图5A说明了RT-PCR结果。这些结果证明，与对照对象相比，在OSCC患者唾液中检测到的IL8mRNA和蛋白水平浓度较高(t检验，P＜0.01)。OSCC患者和无疾病对照唾液中的IL8 mRNA表达量显著不同。OSCC组中平均拷贝数是1.1×103，对照组中平均拷贝数是2.6×101。这两组之间的差异具有高度统计学意义(P＜0.0008)。
发现在mRNA水平上IL6的唾液浓度无显著差异。在样本大小研究中，本发明者也未能检测到吸烟者和不吸烟者之间的差异。
定量测定患者和正常对象唾液中IL6和IL8蛋白浓度的ELISA
根据厂商说明书使用IL6和IL8的ELISA试剂盒(Pierce Endogen，Rockford，IL)。在两次重复试验中，每次试验时各样品重复测试两次。比色反应显色后，用8通道分光光度计(EL800通用微型板阅读仪，BIO-TEK Instruments Inc.，Winooski，VT)定量450nm处的吸光度，根据各次试验中重组细胞因子获得的标准曲线将这些吸光度读数转变为pg/ml。如果吸光度读数超过标准曲线的线性范围，连续稀释上清后再重复ELISA试验。至少在两次ELISA试验中测试各样品，从各样品测定的平均值计算数据。
图5B表明了ELISA结果。OSCC患者唾液中的IL8浓度(720pg/dL)显著高于对照组唾液中的浓度(250pg/dL)(P＜0.0001)。为保证唾液中IL8蛋白水平升高不是由OSCC患者唾液中总蛋白水平升高造成，我们比较了两组唾液的总蛋白浓度。发现无显著性差异(P＞0.05)。
发现在蛋白水平上IL6的唾液浓度无显著性差异。在ELISA分析中，样本大小研究没有检测到吸烟者和不吸烟者之间的差异。
实施例7：OSCC患者血清中IL6和IL8细胞因子水平的分析
我们也用qRT-PCR和ELISA检测和比较了未患病者和OSCC患者的血清中IL6和IL8的水平。如实施例4所述选择患者，如实施例5所述处理血清。
定量测定患者和正常对象血清中IL6和IL8 mRNA浓度的实时PCR
为了定量分析RT-PCR结果，如实施例6所述进行定量实时PCR。
图6A表明了RT-PCR结果。这些结果显示，与对照相比，检测到OSCC患者血清中IL6mRNA水平浓度较高(t检验，P＜0.001)。我们注意到，OSCC患者和无疾病对照的血清之间IL6 mRNA表达量显著不同。OSCC组平均拷贝数是5.2×104，对照组平均拷贝数是3.3×103。这两组之间的差异具有高度统计学显著性(P＜0.0004)。
发现IL8 mRNA水平血清浓度无显著性差异。在样本大小研究中，本发明者也未能检测到吸烟者和非吸烟者之间的差异。
定量检测患者和正常对象血清中IL6和IL8蛋白浓度的ELISA
如实施例6所述进行了定量血清中IL6和IL8蛋白浓度的ELISA测定。
图6B表明了相关的ELISA结果。OSCC患者血清IL6的平均水平(87pg/dL)显著高于对照组血清的平均水平(0pg/dL)(P＜0.0001)。
发现IL8蛋白水平血清浓度无显著性差异。在ELISA分析中，样本大小研究也没有检测到吸烟者和不吸烟者的差异。
实施例8：ROC和灵敏度/特异性分析
对上述实施例1-7报告的试验结果收集的数据作统计学分析证明，这些生物标记及其预测值对HNSCC具有特异性和灵敏度。
统计学分析
整体和分别计算OSCC病例和对照的患者人口统计分布，用连续测定的斯氏t检验或分类测定的2×2 X2表在双臂之间进行比较。计算唾液和血清中IL6和IL8水平的分布，并用两个独立组t检验在OSCC病例和对照之间作比较。当P值小于0.01时认为有显著性差异。由于IL6和IL8水平的范围，分析中也采用了这些值的对数转化值。数据表示为平均值±SD。在实验设计中，在分组水平上控制年龄、性别和吸烟史；当通过回归模型比较IL6和IL8时，也在分析中调整这些患者因素。
用疾病(OSCC病例)和无疾病(对照)的二元结果作为独立变量，拟合对数回归模型，以估计发生OSCC的概率，作为各潜在生物标记(IL6或IL8)，控制患者年龄、性别和吸烟史的函数。用该拟合的对数模型，分析接受者操作特征(ROC)曲线，以评价各生物标记的预测能力[8][9][10]。ROC分析中，我们通过改变最低(概率为0)至最严谨(概率为1)的肯定性标准计算出灵敏度和特异性。确定了各生物标记的最优灵敏度和特异性，鉴定了各生物标记的相应截止值/阈值。将ROC曲线下面积最大的生物标记鉴定为检测OSCC预测能力最强的标记。
临床数据
OSCC患者的平均(SD)年龄是49.3(7.5)岁(范围是42-67岁)，对照组的平均(SD)年龄是48.8(5.7)岁(范围是40-65岁)；(斯氏t检验P＞0.80)。这两组在年龄(平均年龄)：OSCC患者49.3岁；正常人48.8岁(斯氏t检验P＞0.80)；性别(斯氏t检验P＞0.90)；或吸烟史(斯氏t检验P＞0.75)方面无显著性差异。
制作各潜在生物标记的灵敏度与1-特异性ROC(接受者操作特征)曲线图。如上所述控制年龄、性别和吸烟史。计算ROC曲线下面积，作为各生物标记检测OSCC的实用性的衡量。
图7A和图7B分别显示了唾液IL8和血清IL6的ROC曲线。计算的ROC值(用于预测OSCC)是：唾液IL8为0.978；血清IL6是0.824。根据灵敏度和特异性分布，选择检测OSCC的生物标记阈值。根据我们的数据，唾液IL8的阈值为600pg/dL时产生的灵敏度为86％，特异性为97％。相似地，血清IL6的阈值大于0pg/dL时产生的灵敏度为64％，特异性为81％。
生物标记唾液IL-8和血清IL-6的组合很可能用于OSCC诊断，因为ROC分析产生的灵敏度为99％，特异性为90％，如图7C所示。
唾液和血清中各潜在生物标记的ROC曲线下面积、阈值和相应灵敏度和特异性的详细统计列于表3。
唾液和血清中各潜在生物标记的ROC曲线下面积、阈值和相应灵敏度和特异性的详细统计列于下表3。
                            表3
 生物标记  ROC曲线下面积  阈值/截止值  灵敏度  特异性
 IL8唾液蛋白  0.978  600pg/mL  86％  97％
 IL6血清蛋白  0.824  ＞0pg/mL  57％  100％
 IL8唾液蛋白和IL6血清蛋白  0.994  ＞600pg/ml＞0pg/mL  99％  90％
实施例9：分离OSCC患者血清中的RNA、扩增和基因表达分布型分析
对象选择
从加州洛杉矶市的加州大学洛杉矶分校(UCLA)医学中心和南加州大学(USC)医学中心征集32位OSCC患者。所有患者最近均诊断患有原发性T1/T2 OSCC，且先前未接受诸如化疗、放疗、手术或其它药物等形式的任何治疗。从UCLA牙医学院普通人群中征集35位正常供者作为对照。没人以前有恶性肿瘤史、免疫缺陷史、自身免疫病史、肝炎史或HIV感染史。所有人都签署了伦理委员会批准的知情同意书，同意作为此项研究的血液提供者。
共征集了67人，包括32位OSCC患者和35位正常人。这两组人中，平均年龄(标准差，SD)：OSCC患者49.3(7.5)岁；正常人47.8(6.4)岁(斯氏t检验P＝0.84)方面无显著性差异。OSCC组的性别分布是10∶22(女性人数/男性人数)，对照组性别分布是14∶21(X2检验P≈1)。我们通过如下测定匹配这两组的吸烟史。询问所有人：(1)吸烟多少年？(2)每天吸烟几包？(3)已戒烟多少年(如果他们真的戒烟)？(4)仅吸香烟么？还是也使用雪茄、烟斗、咀嚼烟草或大麻？然后，我们根据上述项目在患者和对照之间进行以下优化匹配：(1)年吸烟包数相似(2)已戒烟时间相似(3)仅使用香烟。两组在吸烟史上无显著性差异(斯氏t检验P＝0.77)。
血液收集和处理
UCLA和USC的伦理委员会批准了血液获取方法。抽取对照者和患者的血然后处理。用Sorvall RT6000D离心机(DuPont，Wilmington，DE)以1,000xg 15℃离心全血10分钟。然后分离血清，迅速在血清中加入100U/mL RNA酶抑制剂(Superase-In，Ambion Inc.，Austin，TX)。将样品等份储存于-80℃待用。
分离血清RNA
用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离560μl血清中的RNA。根据厂商说明书用无RNA酶的DNA酶(DNA酶I-无DNA，Ambion Inc.，Austin，TX)处理分离RNA的等份。用RT-PCR检测4种持家基因转录物：β-肌动蛋白(ACTB)、β-2-微球蛋白(B2M)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和核糖体蛋白S9(RPS9)的分离RNA的量。根据发表的序列，设计并合成用于PCR的寡核苷酸引物(Sigma Genosis，Woodlands，TX)。用共同的上游引物和三种不同的下游引物进行RT-PCR来扩增3区段的表型mRNA编码区，扩增对象是选自表4所示用于RT-PCR的4种持家基因转录物。
                                  表4
  名称   登录号(NCBI)   全长(bp)   引物序列   扩增子(bP)
ACTB X00351 1761   F：SEQ ID NO：19R1：SEQ ID NO：20R2：SEQ ID NO：21R3：SEQ ID NO：22 1957051000
B2M NM_004048 987   F：SEQ ID NO：23R1：SEQ ID NO：24R2：SEQ ID NO：25R3：SEQ ID NO：26 216591848
GAPDH M33197 1268   F：SEQ ID NO：27R1：SEQ ID NO：28R2：SEQ ID NO：29R3：SEQ ID NO：30 1407551184
RPS9 NM_001013 692   F：SEQ ID NO：31R1：SEQ ID NO：32R2：SEQ ID NO：33R3：SEQ ID NO：34 188426614
具体说，选择了四种血清人mRNA，用共同的上游引物和三种不同的下游引物(扩增)3区段的表型编码区将该编码区约分为三部分。在2％琼脂糖凝胶上电泳10μl各PCR反应物，用EtBr染色。
通过与阳性对照(人唾液腺总RNA，Clontech，Palo Alto，CA)的预计大小比较证实所有PCR产物的特异性。阴性对照中省去输入RNA或使用RNA但省去逆转录酶。
用RT-PCR和电泳评价人mRNA产物的血清表型。图8报告了示范性结果，证明可检测到4种持家基因(ACTB、B2M、GAPDH和RPS9)的转录物。具体说，检测到大小为188、426和614bp的RPS9复制子(分别参见图8泳道2、3和4)；检测到大小为140、755和1,184bp的GAPDH复制子(分别参见图8泳道5、6和7)；检测到大小为216、591和848bp的B2M复制子(分别参见图8泳道8、9和10)；检测到大小为195、705和1,000bp的ACTB复制子(分别参见图8泳道11、12和13)。即使图中没有对照数据，也进行了对照。
根据NCBI GenBank数据库，我们扩增的最长PCR产物覆盖了相应mRNA全长的56.8％(ACTB)、85.9％(B2M)、93.4％(GAPDH)和88.9％(RPS9)。本结果也表明，可能有完整的人mRNA以无细胞形式在血液中循环。
实施例10：OSCC患者血清mRNA的微阵列分布型分析
收集10位OSCC患者(8位男性，2位女性，年龄＝51±9.0)以及性别和年龄匹配的10位正常人(年龄＝49±5.6)的血清，如实施例9所述进行处理，以用于微阵列分析。
微阵列分析
用RiboAmpTMRNA扩增试剂盒(Arcturus，Mountain View，CA)线性扩增从血清中分离的RNA。按照以前报道的方法[55]，Affymetrix人基因组U133A阵列含有代表19,000种基因的22,215种人基因cDNA探针组(即各基因可由一种以上的探针组代表)，将该阵列用于基因表达分布型分析。
将原始数据输入DNA-芯片分析器1.3(dChip)软件进行标准化和根据模式分析[60]。dChip(芯片)产生表达的指数代表mRNA/基因表达量和另一参数(称为出现访问)，表示mRNA转录物是否是样品中实际存在的(14)。S-plus 6.0(Insightful，Seattle，WA)用于所有统计学检验。
用三个标准来确定OSCC和对照之间的基因表达差别。首先，排除在所有样品中指定为″无″访问的基因。第二，用双尾斯氏t检验比较OSCC(n＝10)和对照(n＝10)之间的平均基因表达水平。将临界α水平0.05定义为有统计学显著性(标准)。第三，计算显示有统计学显著性差异(P＜0.05)的基因的倍数比。只对至少改变2倍的那些基因进行进一步分析。
用HG U133A微阵列鉴定到癌症患者和匹配正常人之间唾液RNA分布型的差异。在上述标准所包括的14,268个基因中，我们鉴定到335个基因的P值小于0.05且倍数改变≥2。在这些基因中，OSCC组中有223个上调基因和112个下调基因。根据Affymetrix，当某基因被指定为出现访问时表明能在原始样品中可靠地检测到该基因。被指定为出现访问的基因数和各阵列上出现的百分数见表5，表5报告了血清中人mRNA表达的分布型分析。
                               表5
 对象  正常  OSCC
性别 年龄  出现探针数a  探针P％b  性别 年龄  出现探针数a  探针P％b
 1  F  53  1564  7.02  F  55  1990  8.93
 2  M  55  1600  7.18  M  61  2924  13.12
 3  M  42  1600  7.18  M  42  2126  9.54
 4  M  46  1716  7.7  M  46  3316  14.88
 5  M  42  1845  8.28  M  42  2937  13.18
 6  M  54  1854  8.32  M  52  1794  8.05
 7  F  51  1903  8.54  F  67  2119  9.51
 8  M  48  2032  9.12  M  46  2019  9.06
 9  M  56  1823  8.18  M  61  4646  20.85
 10  M  42  1979  8.88  M  44  2362  10.6
 平均值±SD  49±5.6  1792±165  8.04±0.74  51±9.0  2623±868*  11.8±3.90
(a)HG U133A微阵列上显示出现访问的探针数(检测P＜0.04)。
(b)出现百分数(P％)＝指定出现访问的探针数/总探针数(HG U133A微阵列上总探针数为22,283)。
*OSCC阵列上认定出现访问的探针显著多于对照组(P≤0.002，Wilcoxon检验)。
平均来看，OSCC阵列中有2623±868个探针，对照阵列中有1792±165个探针被认定为出现访问。OSCC组出现访问的探针显著多于对照组(P≤0.002，Wilcoxon检验)。
用更严谨标准，即某基因被认定在所有癌症患者(n＝10)或所有对照(n＝10)的所有阵列均出现访问，我们鉴定到62个候选基因进行进一步分析。我们注意到在OSCC血清中这62个基因上调，而用相同的过滤标准没有发现这些基因下调。
实施例11：Q-PCR确认和定量分析OSCC患者无细胞唾液的微阵列分布型
对包括32位OSCC患者和35位对照者的唾液的扩大样本进行qPCR以定量在唾液中差别表达的转录物亚组并验证实施例10的微阵列结果。
定量PCR(qPCR)试验。
用PRIMER3软件设计引物组(表2)。用MuLV逆转录酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)和随机六聚体引物(ABI，Foster City，CA)，从原始未扩增血清RNA合成cDNA。在iCyclerTMiQ实时PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中，用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad，Hercules，CA)进行qPCR反应。用特定产物的专用条件将所有反应重复三次。用LightCycler软件3.0(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)从标准曲线外推得到具体模板的cDNA/RNA相对量。用双尾斯氏t检验进行统计学分析。
根据报道的癌症相关性选择了10种显著上调的基因：H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4、ARCR、THSMB(胸腺素β10)、PRKCB1(蛋白激酶C，β1)、FTL1(铁蛋白轻链多肽)、COX4I1(细胞色素c氧化酶亚基IV同种型1)和SERP1(应激相关性内质网蛋白1；核糖体相关膜蛋白4)，如表6所示，该表报告了qPCR验证选出的10种基因。
                                   表6
 探针组ID(HG U133A) 基因名称 符号  登录号(NCBI)  qPCR P(t检验)
 211940_x_at211943_x_at200748_s_at210774_s_at200059_s_at217733_s_at209685_s_at208755_x_at200086_s_at200971_s_at  H3组蛋白，家族3A肿瘤蛋白，翻译控制1铁蛋白，重链多肽1核受体辅激活物4Ras同源基因家族，成员A胸腺素，β10蛋白激酶C，β1铁蛋白，轻链多肽细胞色素c氧化酶亚基IV同种型1应激相关性内质网蛋白1；核糖体相关膜蛋白4  H3F3ATPT1FTH1NCOA4ARCRTHSMBPRKCB1FTL1COX4I1SERP1  BE869922AL565449NM_002032AL162047BC001360NM021103M13975BF312331AA854966NM014445  0.0030.0050.0080.0210.0480.3180.6150.6510.6880.868
表6表明了在OSCC患者血清中上述基因的定量变化(qPCR测定)。结果证实，H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR的转录物在OSCC患者唾液中显著升高(Wilcoxon Signed秩次检验，P＜0.05)。我们用qPCR没有检测到另外五种转录物的量有统计学显著性差异。
实施例12：ROC和灵敏度/特异性分析
对上述实施例9-11报告试验结果收集的数据进行统计学分析，表明这些生物标记对HNSCC及其预计值具有特异性和灵敏度。
接受者操作特征曲线分析和预测模型。
利用qPCR结果，构建多变量分类模型以确定选择用于预测癌症的血清转录物的最佳组合。首先，用疾病(OSCC)和无疾病(正常)的二元结果作为独立变量，构建对数回归模型[61]。在数据收集步骤中控制年龄、性别和吸烟史。
用舍去一个交叉验证(Leave-one out cross validation)来验证对数回归模型。该交叉确认方案首先去除一个观察结果，然后用所有标记从剩余病例拟合对数回归模型。这些模型的每一个都采用逐步选择模式，以去除不能改善该模型的变量。然后，用舍去的该病例观察值计算该观察结果的预计分类。交叉确认误差率是预计不正确的样本数除以样本总数。
然后，用该模型的拟合概率作为计算灵敏度和特异性的可能截止点，用计算机对最佳最终对数模型进行接受者操作特征(ROC)曲线分析(S-plus 6.0)。通过ROC曲线的数值积分计算曲线下面积。
为证明对于OSCC区分血清中循环性mRNA的实用性，观察了两种分类/预测模型。采用qPCR数据，建立的对数回归模型由先前检测的六种血清转录物ARHA、FTH1、H3F3A、TPT1、COX4I1和FTL1组成。这六种转录组合起来提供了最佳预测，这然后通过舍去一个确认得到证实。67个舍去一个试验中，发现54个(81％)最佳对数模型与全部数据的模型相同，确认误差率是31.3％(21/67)。
结果见图9，其中显示计算的该对数回归模型的ROC曲线。
用截止概率44％获得的灵敏度为84％，特异性为83％。该最终模型在67个对象中正确预测了56个(83.5％)对象，灵敏度为0.84(27/32)，特异性为0.83(29/35)，该模型错误分类了6位对照，5位OSCC。该对数回归模型计算的ROC曲线下面积是0.88。
树状分类模型、分类和回归树(CART)
第二，用树状分类方法建立了利用qPCR结果的另一种预测模型。由S-plus 6.0利用血清转录物作为qPCR结果的预测指标构建分类和回归树(CART)。CART通过二元递归划分拟合该分类模型，其中各步骤包括搜索能最佳地区分癌症组与正常组的预测变量[62]。CART采用熵函数以及用S-plus默认设置确定的区分标准。用此方法，将含有全部样品(n＝67)的母组再分为癌症组和正常组。我们的初始树倾向于去除所有不产生具有不同分类的亚分支的分支。
根据图10所示产生第二个模型，即″分类和回归树(CART)模型″。
我们的拟合CART模型采用THSMB和FTH1的血清mRNA浓度作为OSCC的预测变量。选作初始区分标准的THSMB(阈值为4.59E-17M)从共包括67个样品的母组产生两个子组。将THSMB浓度＜4.59E-17M的47个样品认定为″正常-1″，而将THSMB浓度≥4.59E-17M的20个样品认定为″癌症-1″。用FTH1(阈值8.44E-16M)进一步区分正常-1组。得到的亚组″正常-2″包括FTH1浓度＜8.44E-16M的28个样品，″癌症-2″包括FTH1浓度≥8.44E-16M的19个样品。因此，用CART分析将我们研究中涉及的67个血清样品分为″正常″组和″癌症″组。
″正常″组由″正常-2″的样品组成，共包括28个样品，25个来自正常者，3个来自癌症患者。因此，用THSMB和FTH1组合来预测OSCC，总特异性为78％(25/35)。″癌症″组由″癌症-1″和″癌症-2″的样品组成。共有39个样品认定属于最终的″癌症″组，29个来自癌症患者，10个来自正常人。因此，用这两种血清mRNA组合来预测OSCC时，总灵敏度为91％(29/32，癌症组)，特异性为78％(25/35，正常组)。
实施例13：分离OSCC患者唾液中的RNA、扩增和基因表达分布型分析
患者选择
从加州大学洛杉矶分校(UCLA)；南加州大学(USC)，Los Angeles，CA和加州大学旧金山分校，San Francisco，CA的医学中心征集OSCC患者。
本研究包括记录患有原发性T1或T2OSCC的32位患者。所有患者最近被诊断患有原发性疾病，且以前未接受诸如化疗、放疗、手术或其它药物等形式的任何治疗。
相同数量的年龄和性别匹配的具有相当吸烟史的对象选作对照组。这两组中，在以下方面没有显著性差异：平均年龄(标准差，SD)：OSCC患者，49.8±7.6岁；正常对象，49.1±5.9岁(斯氏t检验P＞0.80)；性别(P＞0.90)；或吸烟史(P＞0.75)。以前都没有恶性肿瘤史、免疫缺陷史、自身免疫病史、肝炎史或HIV感染史。所有人都签署了伦理委员会批准的知情同意书，表示同意作为本实验的唾液提供者。
唾液收集和RNA分离
用以前建立的方法在上午9-10点收集未受刺激的唾液样品[38]。在收集之前至少一小时禁止对象饮食、吸烟或口腔卫生。将唾液样品2,600xg 4℃离心15分钟。
将唾液上清与沉淀分开，用RNA酶抑制剂(Superase-In，Ambion Inc.，Austin，TX)处理上清。用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从560μL唾液上清中分离RNA。根据厂商说明书用无RNA酶的DNA酶(DNA酶I-无DNA，AmbionInc.)处理分离的RNA等份。通过RT-PCR测定三种细胞维持基因转录物：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白-β(ACTB)和核糖体蛋白S9(RPS9)来检测分离的RNA量。仅将显示有这三种mRNA的PCR产物的样品用于后续分析。
从560μL唾液上清中平均获得54.2±20.1ng(n＝64)总RNA。OSCC和匹配对照之间的总RNA量没有显著性差异(t检验，P＝0.29，n＝64)。
RT-PCR结果证明，所有唾液样品(n＝64)都含有三种基因(GAPDH、ACTB和RPS9)的转录物，可用于人唾液RNA的质量控制[55]。两轮RNA扩增后可获得一致的扩增量(658±47.2，n＝5)。生物素化cRNA的产量平均为39.3±6.0μg(n＝20)。OSCC和对照产生的cRNA量没有显著性差异(t检验，P＝0.31，n＝20)。
实施例14：OSCC患者唾液mRNA的微阵列分布型分析
用10位OSCC患者(7男3女；年龄：52±9.0岁)以及性别和年龄匹配的10位正常人(年龄，49±5.6岁)的唾液进行微阵列研究。用RiboAmp RNA扩增试剂盒(Arcturus，Mountain View，CA)线性扩增从唾液中分离的RNA。在五次独立实验中用20个样品与已知量(0.1μg)的对照RNA平行测定RNA扩增效率。
微阵列分析。
按照以前报道的方法[55]，用人基因组U133A阵列(HG U133A，Affymetrix，SantaClara，CA)进行基因表达分析。扫描该阵列，用Microarray Suit 5.0软件(Affymetrix，Santa Ciara，CA)测定荧光强度；然后将该阵列输入DNA芯片分析软件(http：www.dchp.org)进行标准化和模式分析[60]。用S-plus 6.0(Insightful，Settle，WA)进行所有统计学检验。
用三个标准来确定差异性表达的基因转录物。首先，排除阵列上在所有样品中认定为″无″访问的探针组。第二，用双尾斯氏t检验比较OSCC(n＝10)和对照(n＝10)的基因表达的平均信号强度。将临界水平0.05定义为有统计学显著性(标准)。第三，计算显示统计学显著性差异(P＜0.05)的基因转录物的倍数比。只对至少改变2倍的那些基因转录物进行进一步分析。
用HG U133A微阵列鉴定癌症患者和匹配正常人之间唾液RNA分布型的差异。在上述标准包括的10,316个转录物中，我们鉴定到1,679个转录物的P值小于0.05。在这些转录物中，OSCC组中有836个上调、843个下调。观察到的这些转录物不大可能归因于单独偶然发生(t检验，P＜0.0001)，认为假阳性的P＜0.05。对所有10个OSCC唾液样品将所用预定标准调节到改变＞3倍、截止为P值＜0.01时，鉴定到OSCC唾液中有17种mRNA显著上调。所有10个OSCC唾液样品中17种转录物显示调节改变＞3倍和更严谨的截止P值＜0.01。应注意，这17种唾液mRNA在OSCC唾液中都上调，而用相同的过滤标准没有发现mRNA下调。这些基因及其产物的生物功能见表7，表7显示微阵列鉴定的OSCC唾液中上调的mRNA(＞3倍，P＜0.01)。
                                      表7
基因代号 基因名称   GenBank登录号 基因座 基因功能
  B2M   β-2-微球蛋白   NM_04048   15q21-q22.2   抗凋亡；抗原递呈
DUSP1   双特异性磷酸酶1 NM_04417 5q34   蛋白质修饰；信号转导氧化应激
FTH1   铁蛋白，重链多肽1 NM_02032 11q13 铁离子转运；细胞增殖
G0S2   推定的淋巴细胞G0-G1开关基因 NM_015714 1q32.2-q41   细胞生长和/或维持；细胞周期调节
GADD45B   生长阻滞和DNA损伤-诱导性β NM_015675 19p13.3 激酶级联反应；凋亡
H3F3A   H3组蛋白，家族3A BE869922 1q41 DNA结合活性
HSPC016   假拟蛋白HSPC016 BG167522 3p21.31 未知
IER3 立即早期反应3 NM_003897 6p21.3   胚胎发生；形态发生；凋亡；细胞生长和维持
IL1B 白介素1β M15330 2q14   信号转导；增殖；炎症；凋亡
IL8 白介素8 NM000584 4q13-q21   新生血管发生；复制；钙介导的信号传导途径；细胞粘附；趋化性细胞周期阻滞；免疫应答
MAP2K3   促分裂原活化的蛋白激酶激酶3 AA780381 17q11.2 信号转导；蛋白修饰
OAZ1   鸟氨酸脱羧酶抗酶1 D87914 19p13.3 聚胺生物合成
PRG1   蛋白聚糖1，分泌颗粒 NM_002727 10q22.1 蛋白聚糖
RGS2   G-蛋白信号转导调节物2，24kda NM_002923 1q31 癌发生；G-蛋白信号转导
S100P   S100钙结合蛋白P NM_005980 4p16 蛋白结合；钙离子结合
SAT   亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶 NM_002970 Xp22.1 酶，转移酶活性
EST   高度相似的铁蛋白轻链 BG537190   铁离子体内稳态，铁蛋白复合物
用人基因组U133A微阵列鉴定10位癌症患者和10位匹配正常人唾液中RNA表达模式的差异。采用在所有10个OSCC唾液样品中调节改变＞3倍和截止P值＜0.01的标准，我们鉴定到17种mRNA在OSCC唾液中显著性上调。
实施例15：Q-PCR验证和定量分析OSCC患者无细胞唾液的微阵列分布型
进行定量聚合酶链反应(qPCR)来证实实施例14的微阵列分析所鉴定到的差别表达的转录物亚组。
定量聚合酶链反应验证
4用MuLV逆转录酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)和随机六聚体引物(Applied Biosystems)合成原始未扩增的唾液RNA的cDNA。在iCycler PCR系统中用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad，Hercules，CA)进行qPCR反应。用PRIMER3软件设计引物组(http：//www.genome.wi.mit.edu)。
用特定产物的专用条件将所有反应重复三次。如前所述从标准曲线外推得到具体模板的cDNA/RNA起始量[32]。通过测试包括之前用于微阵列研究的20个样品在内的所有样品(n＝64)完成此验证。用Wilcoxon Signed-Rank检验进行统计学分析。
进行定量PCR在包括32位OSCC患者和32位匹配对照者的唾液的扩大样品上验证微阵列结果。根据报道的癌症相关性选择了9种唾液mRNA生物标记候选物：DUSP1、GADD45B、H3F3A、ILIB、ILS、OAZ1、RGS2、S100P和SAT，如表7所示。表8提供了OSCC患者唾液中上述9个候选物的定量变化(qPCR测定)。
                          表8
  基因代号   引物序列(5′-3′)   验证*   p值   平均增加倍数
DUSP1   F：SEQ ID NO：35 是 0.039 2.60
  R：SEQ ID NO：36
H3F3A   F：SEQ ID NO：37 是 0.011 5.61
  R：SEQ ID NO：38
IL1B   F：SEQ ID NO：39 是 0.005 5.48
  R：SEQ ID NO：40
IL8   F：SEQ ID NO：41 是 0.000 24.3
  R：SEQ ID NO：42
OAZ1   F：SEQ ID NO：43 是 0.009 2.82
  R：SEQ ID NO：44
S100P   F：SEQ ID NO：45 是 0.003 4.88
  R：SEQ ID NO：46
SAT   F：SEQ ID NO：47 是 0.005 2.98
  R：SEQ ID NO：48
GADD45B   F：SEQ ID NO：49 否 0.116
  R：SEQ ID NO：50
RGS2   F：SEQ ID NO：51 否 0.149
  R：SEQ ID NO：52
9种潜在候选物中的7种得到qPCR确认(P＜0.05)。*Wilcoxon′s Signed秩次检验：如果P＜0.05，确认(是)；如果P≥0.05，不确认(否)
结果证实，OSCC患者唾液中，9种候选mRNA中7种的转录物(78％)：DUSP1、H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1、S100P和SAT显著升高(Wilcoxon Signed-秩次检验，P＜0.05)。我们用qPCR没有检测到RGS2(P＝0.149)和GADD45B(P＝0.116)量有统计学显著性差异。利用量的增加两可将经确认的7种基因分为三个等级：高度上调的mRNA包括IL8(24.3倍)；中等上调的mRNA包括H3F3A(5.61倍)、IL1B(5.48倍)和S100P(4.88倍)；低上调的mRNA包括DUSP1(2.60倍)、OAZ1(2.82倍)和SAT(2.98倍)。
实施例16：ROC和灵敏度/特异性分析
采用qPCR结果，用S-plus 6.0进行接受者操作特征(ROC)曲线分析[82]，以评价实施例15所鉴定的各生物标记的预测能力。
接受者操作特征曲线分析和预测模型
通过检索能产生最大相应灵敏度和特异性值来确定各生物标记的最优截止点。然后根据设置的最优灵敏度和特异性值制作ROC曲线。通过ROC曲线的数值积分计算曲线下面积。将ROC曲线下面积最大的生物标记鉴定为检测OSCC的预测能力最强。
下一步，构建多变量分类模型以确定用于预测癌症的唾液标记最佳组合。首先，用疾病(OSCC)和无疾病(正常)的二元结果作为独立变量，构建对数回归模型，控制患者的年龄、性别和吸烟史。用反向逐步回归[61]找到最佳的最终模型。
用舍去一个交叉确认来验证该对数回归模型。交叉确认方案首先去除一个观察结果，然后拟合具有所有标记的剩余病例的对数回归模型。用逐步模型来选择这些模型的每一个，以去除不能改善该模型的变量。然后，用舍去病例的标记值经计算机处理对该观察结果作预计分类。交叉确认误差率是预计不正确样品数除以样本总数。
然后，用相似方法以计算机制作该对数模型的ROC曲线，如图11所示，用该模型的拟合概率作为计算灵敏度和特异性的可能截止点。
对OSCC的7种潜在唾液mRNA生物标记各自进行接受者操作特征(ROC)曲线下面积、阈值以及相应灵敏度和特异性的详细统计学分析，见表9，表中显示了OSCC相关的唾液mRNA生物标记的ROC曲线分析。
                               表9
 生物标记  ROC曲线下面积  阈值/截止值(M)  灵敏度(％)  特异性(％)
 DUSP1  0.65  8.35E-17  59  75
 H3F3A  0.68  1.58E-15  53  81
 IL1B  0.70  4.34E-16  63  72
 IL8  0.85  3.19E-18  88  81
 OAZ1  0.69  7.42E-17  100  38
 S100P  0.71  2.11E-15  72  63
 SAT  0.70  1.56E-15  81  56
利用该qPCR结果，我们进行ROC曲线分析，以评价各生物标记的预测能力。确定能产生最大相应灵敏度和特异性的值为最优截止点。ROC曲线下面积最大的生物标记鉴定为检测OSCC的预测能力最强。
数据显示，在7种潜在生物标记中IL8 mRNA预测OSCC存在的性能最好。对IL8计算的ROC曲线下面积是0.85。阈值为3.19E-18mol/L，唾液IL8 mRNA区分OSCC与正常人的灵敏度为88％，特异性为81％。
为证明唾液mRNA在区分疾病中的实用性，检测了两种分类/预测模型。根据7种已证实的生物标记中的四种：IL1B、OAZ1、SAT和IL8建立对数回归模型，它们组合起来提供了最佳预测(表10)。表10显示了对数回归模型所选择的OSCC唾液(生物标记)。
                           表10
  生物标记   系数值   SE   P值
  截距   -4.79   1.51   0.001
  IL1B   5.10E+19   2.68E+19   0.062
  OAZ1   2.18E+20   1.08E+20   0.048
  SAT   2.63E+19   1.10E+19   0.020
  IL8   1.36E+17   4.75E+16   0.006
根据7种已确认的生物标记中的四种(IL1B、OAZ1、SAT和IL8)建立对数回归模型，它们组合起来提供了最佳预测。这4种标记的系数值为正，表明其唾液浓度的同步增加提高了获自OSCC对象样品的(预测)概率。
这4种标记的系数值为正，表明其唾液浓度的同步增加提高了获自OSCC对象样品的(预测)概率。根据对数回归模型舍去一个交叉确认误差率是19％(12/64)。在舍去一个分析所产生的64种模型中，除了1种以外，都采用在表10列举的完全数据模型中具有显著性的同一组4种标记。
用计算机绘制对数回归模型的ROC曲线。截止值概率50％，我们获得的灵敏度为91％，特异性为91％。该对数回归模型计算出的ROC曲线下面积是0.95(图11)。
树状分类模型、分类和回归树(CART)
产生了第二种模型，即树状分类模型、分类和回归树(CART)模型。用S-plus 6.0和经确认的mRNA生物标记作为预测物构建了CART模型。CART通过二元递归划分拟合该分类模型，其中各步骤包括检索能最佳地区分癌症组与正常组的预测变量[62]。CART采用熵函数以及用S-plus的默认设置确定的区分标准。用此方法，将含有全部样品(n＝64)的母组再分为癌症组和正常组。我们的初始树倾向于去除所有不产生分类不同的亚分支的分支。
结果见图12。我们的拟合CART模型采用IL8、H3F3A和SAT的唾液mRNA浓度作为OSCC的预测变量。选作初始区分标记的IL8(阈值为3.14E-18mol/L)从共包括64个样品的母组产生两个子组。IL8浓度＜3.14E-18mol/L的30个样品认定为″正常-1″，而IL8浓度≥3.14E-18的34个样品认定为″癌症-1″。用SAT(阈值1.13E-14mol/L)进一步区分″正常-1″组。
得到的亚组″正常-2″包括SAT浓度＜1.13E-14mol/L的25个样品，″癌症-2″包括SAT浓度≥1.13E-14mol/L的5个样品。相似地，用H3F3A(阈值2.07E-16mol/L)进一步区分″癌症-1″组。得到的亚组″癌症-3″包括H3F3A浓度≥2.07E-16mol/L的27个样品，″正常-3″组包括H3F3A浓度＜2.07E-16mol/L的7个样品。
因此，用CART分析将我们研究中涉及的64个唾液样品分为″癌症″组和″正常″组。″正常″组由″正常-2″和″正常-3″的样品组成。共有32个样品认定为″正常″组，其中29个来自正常人，3个来自癌症患者。
因此，采用IL8、SAT和H3F3A组合进行OSCC预测时，总灵敏度是90.6％(29/32)。″癌症″组由″癌症-2″和″癌症-3″的样品组成。共有32个样品最终认定为最终的″癌症″组，其中29个来自癌症患者，3个来自正常人。因此，采用这三种唾液mRNA生物标记的组合进行OSCC预测时，总特异性为90.6％(29/32)。
总之，本文公开了涉及检测唾液中的生物标记的方法，所述生物标记是胞外mRNA，所述方法包括检测无细胞唾液中的胞外mRNA；唾液的转录组分析，包括检测无细胞唾液中的转录组模式；通过分析唾液检测器官或器官基因中遗传改变的方法，所述方法包括检测转录组模式和/或无细胞唾液中基因的mRNA分布型；诊断某对象口腔或全身性病理疾病或失调的方法，所述方法包括：检测无细胞唾液和/或血清中与病理疾病或失调相关的生物标记，具体是mRNA和/或蛋白质的分布型；试剂盒，其包含进行至少一种所述方法的至少一种生物标记的鉴定剂；以及采用唾液生物标记唾液和/或血清mRNA作为口腔和/或全身性病理、疾病或失调的生物标记。
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参照特定实施方式解释本公开。本领域普通技术人员根据上述说明书能够明显看出其它实施方式。本公开的保护范围由所附权利要求书限定。
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[107]Sudbo J，Kildal W，Risberg B，Koppang HS，Danielsen HE，Reith A.DNA含量用作口腔白斑患者中的预后标记(DNA content as a prognostic marker in patientswith oral leukoplakia).N Engl J Med 2001；344：1270-1278。
[108]Berta GN，Ghezzo F，D′Avolio A等，钙周期蛋白基因RNA在口腔粘膜的鳞状细胞癌中表达增强，但在良性肿瘤中表达不增强(Enhancement of calcyclin geneRNA expression in squamous cell carcinoma of the oral mucosa，but not in benign lesions).J Oral Pathol Med 1997；26：206-210。
[109]Watanabe H，Iwase M，Ohashi M，Nagumo M.人口腔鳞状细胞癌细胞系分泌的白介素-8的作用(Role of Interleukin-8 secreted from human oral squamous cellcarcinoma cell lines).Oral Oncol 2002；38：670-679。
                                  序列表
<110>加利福尼亚大学董事会(The Regents of the University of Galifornia)
     D.T.W·王(Wong，Davod T.W)
     Y.李(Li，Yang)
     M.A.R.圣约翰(St.John，Maie A.R)
<120>唾液mRNA分布型分析、生物标记及其相关方法和试剂盒
<130>58027-014800/pct
<140>待指定
<141>2005-02-15
<150>US60/546,507
<151>2004-02-20
<150>US60/546,521
<151>2004-02-21
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>GAPDH的引物
<400>1
tcaccagggc tgcttttaac tc
22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>GAPDH的引物
<400>2
atgacaagct tcccgttctg ag
22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>ACTB的引物
<400>3
aggatgcaga aggagatcac tg
22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>ACTB的引物
<400>4
atactcctgc ttgctgatcc ac
22
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>RPS9的引物
<400>5
gacccttcga gaaatctcgt ctc
23
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>RPS9的引物
<400>6
tctcatcaag cgtcagcagt tc
22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL1B的引物
<400>7
gtgctgaatg tggactcaat cc
22
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(19)
<223>IL1B的引物
<400>8
accctaaggc aggcagttg
19
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>SFN的引物
<400>9
cctgcgaaga gcgaaacctg
20
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>SFN的引物
<400>10
tcaatactgg acagcaccct cc
22
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(19)
<223>K-α-1的引物
<400>11
agcgtgcctt tgttcactg
19
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>K-α-1的引物
<400>12
cacaccaacc tcctcataat cc
22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>ACTB的引物
<400>13
aggatgcaga aggagatcac tg
22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>ACTB的引物
<400>14
atactcctgc ttgctgatcc ac
22
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL-8的引物
<400>15
gagggttgtg gagaagtttt tg
22
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL-8的引物
<400>16
ctggcatctt cactgattct tg
22
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>IL-6的引物
<400>17
ctggcagaaa acaacctgaa c
21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>IL-6的引物
<400>18
atgattttca ccaggcaagt c
21
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(18)
<223>ACTB的引物
<400>19
cgtcttcccc tccatcgt
18
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>ACTB的引物
<400>20
agctcattgt agaaggtgtg gtg
23
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>ACTB的引物
<400>21
atactcctgc ttgctgatcc ac
22
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>ACTB的引物
<400>22
ggtgtgcact tttattcaac tgg
23
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>B2M的引物
<400>23
 gtgctcgcgc tactctctct
 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>B2M的引物
<400>24
ccagtccttg ctgaaagaca
20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>B2M的引物
<400>25
ttctctgctc cccacctcta
20
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>B2M的引物
<400>26
ccagattaac cacaaccatg c
21
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>GAPDH的引物
<400>27
gagtcaacgg atttggtcgt at
22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>GAPDH的引物
<400>28
atgggtggaa tcatattgga ac
22
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>GAPDH的引物
<400>29
gatgtcatca tatttggcag gtt
23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>GAPDH的引物
<400>30
agcacagggt actttattga tgg
23
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>RPS9的引物
<400>31
ctgggtttgt cgcaaaactt
20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>RPS9的引物
<400>32
gtgggtcctt ctcatcaagc
20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>RPS9的引物
<400>33
atgaaggacg ggatgttcac
20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>RPS9的引物
<400>34
ggcaggaaaa cgagacaatc
20
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>DUSP1的引物
<400>35
cctaccagta ttattcccga cg
22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>DUSP1的引物
<400>36
ttgtgaaggc agacacctac ac
22
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(19)
<223>H3F3A的引物
<400>37
aaagcaccca ggaagcaac
19
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>H3F3A的引物
<400>38
gcgaatcaga agttcagtgg ac
22
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL1B的引物
<400>39
gtgctgaatg tggactcaat cc
22
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(19)
<223>IL1B的引物
<400>40
accctaaggc aggcagttg
19
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL-8的引物
<400>41
gagggttgtg gagaagtttt tg
22
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>IL-8的引物
<400>42
ctggcatctt cactgattct tg
22
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>OAZ1的引物
<400>43
agagagagtc ttcgggagag g
21
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>OA21的引物
<400>44
agatgagcga gtctacggtt c
21
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>S100P的引物
<400>45
gagttcatcg tgttcgtggc tg
22
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>S100P的引物
<400>46
ctccagggca tcatttgagt cc
22
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>SAT的引物
<400>47
ccagtgaaga gggttggaga c
21
<210>48
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>SAT的引物
<400>48
tggaggttgt catctacagc ag
22
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(20)
<223>GADD45B的引物
<400>49
tgatgaatgt ggacccagac
20
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(19)
<223>GADD45B的引物
<400>50
gagcgtgaag tggatttgc
19
<210>51
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>RGS2的引物
<400>51
cctgccataa agactgacct tg
22
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>RGS2的引物
<400>52
gcttcctgat tcactaccca ac
22

Claims (27)

1.一种检测体液中胞外mRNA的方法，所述体液包括细胞相和液相，所述方法包括：
提供体液的无细胞液相部分；和
检测体液的无细胞液相部分中的胞外mRNA，
其中所述体液是唾液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体液是未受刺激的唾液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测胞外mRNA包括分离体液无细胞液相部分中的胞外mRNA和扩增该胞外mRNA。
4.一种进行体液的转录组分析的方法，所述体液包括细胞相和液相，所述方法包括：
提供体液的无细胞液相部分；和
检测体液无细胞液相部分中的转录组模式，
其中所述体液是唾液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用微阵列试验检测转录组模式。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用高密度寡核苷酸微阵列试验检测转录组模式。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用定量PCR分析或RT-PCR分析检测转录组模式。
8.一种通过分析从某器官流出的体液检测该器官中遗传改变的方法，所述体液包括细胞相和液相，所述方法包括：
提供所述体液的无细胞液相部分；
检测所述体液无细胞液相部分中的转录组模式；和
将所述转录组模式与预定模式作比较，所述预定模式是正常的体液无细胞液相部分的普通转录组模式，
所述体液是唾液。
9.一种通过分析从某器官流出的体液检测该器官中某基因的遗传改变的方法，所述体液包括细胞相和液相，所述方法包括：
提供所述体液的无细胞液相部分；
检测所述基因在所述体液无细胞液相部分中的mRNA分布型；和
将所述基因的mRNA分布型与所述基因的预定mRNA分布型作比较，所述基因的预定mRNA分布型是正常体液无细胞液相部分中所述基因的mRNA分布型，
所述体液是唾液。
10.一种诊断某对象口腔或全身性病理、疾病或失调的方法，所述方法包括：
提供该对象唾液的无细胞液相部分；
检测所提供的无细胞唾液液相部分中与所述病理、疾病或失调相关的基因的mRNA分布型；
将所述基因的RNA分布型与所述基因的预定mRNA分布型作比较，检测到所述基因的预定mRNA分布型表明该对象存在所述病理、疾病或失调。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述疾病是口腔癌和/或口咽癌，所述基因选自编码IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT的基因。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述疾病是口腔癌和/或口咽癌，所述基因是编码IL8的基因。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是口咽鳞状细胞癌或头颈鳞状细胞癌。
14.一种诊断某对象口腔或全身性病理、疾病或失调的方法，所述方法包括：
提供该对象的唾液的无细胞液相部分；
检测所提供的无细胞液相部分中与所述病理、疾病或失调相关的转录组模式；和
将所述转录组模式与预定模式作比较，
在转录组模式中检测到预定模式特征即可诊断该对象存在所述病理疾病或失调。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述疾病是口腔癌和/或口咽癌，所述转录组包括选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT转录物的转录物。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述疾病是口咽鳞状细胞癌或头颈鳞状细胞癌。
17.一种诊断某对象癌症的方法，所述方法包括：
提供该对象的体液；
检测体液中的生物标记分布型，所述生物标记选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR，
将所述生物标记的分布型与所述生物标记的预定分布型作比较，
在生物标记分布型中检测到所述生物标记预定的分布型特征即可诊断患有癌症。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述癌症是口咽鳞状细胞癌或头颈鳞状细胞癌，所述生物标记选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT，所述体液是唾液，通过检测生物标记的mRNA分布型检测该生物标记分布型。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述癌症是口咽鳞状细胞癌或头颈鳞状细胞癌，所述生物标记选自IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR，所述体液是血清，通过检测生物标记的mRNA分布型检测该生物标记分布型。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述癌症是口咽鳞状细胞癌或头颈鳞状细胞癌，所述生物标记是IL6，所述体液是血清，通过检测某生物标记的蛋白质分布型来检测该生物标记的分布型。
21.一种诊断口腔和/或全身性病理、疾病或失调的试剂盒，所述试剂盒装有：
体液中生物标记的鉴定剂，所述生物标记用于病理、疾病或失调的诊断，选自IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P、SAT、IL6、H3F3A、TPT1、FTH1、NCOA4和ARCR；和
所述鉴定剂的检测试剂，
用于根据权利要求14-16或17-21中任一项所述方法检测所述生物标记的体液分布型的鉴定剂和测试剂，其中
所述鉴定剂与体液中的该生物标记相关，所述检测试剂用于检测所述鉴定剂，因此，所述鉴定剂和检测试剂能够检测该生物标记的体液分布型。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述疾病是口腔和口咽鳞状细胞癌。
23.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述疾病是头颈鳞状细胞癌。
24.一种诊断口腔和/或全身性病理、疾病或失调的方法，所述方法包括：用唾液mRNA作为口腔和/或全身性病理、疾病或失调的生物标记。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述mRNA编码IL8、IL1B、DUSP1、H3F3A、OAZ1、S100P和SAT。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述疾病是口腔和口咽鳞状细胞癌。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述疾病是头颈鳞状细胞癌。
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