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CN113985033A - 一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的生物标记物及检测试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的生物标记物及检测试剂盒 Download PDF

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CN113985033A CN202111213982.9A CN202111213982A CN113985033A CN 113985033 A CN113985033 A CN 113985033A CN 202111213982 A CN202111213982 A CN 202111213982A CN 113985033 A CN113985033 A CN 113985033A
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Abstract

本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的生物标记物及检测试剂盒，本发明经研究发现骨质疏松患者血清中的NCOA4水平与肌肉萎缩症发生发展有一定程度的相关性，提示血清NCOA4可作为骨质疏松症发生肌少症的生物标记物。据此，本发明提供了一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，采用血清学检测的方法来预测肌少症能有效降低检测容许范围的下限，从而提高血清NCOA4的检测敏感度，并提高检测准确性。本发明通过检测血清中的NCOA4水平来预测肌少症的发生发展，使检测变得易于实现，可以成为肌少症的常规大规模筛查手段，便于早期发现肌少症的发生并给予干预。

Description

一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的生物标记物及检测试 剂盒
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的生物标记物及检测试剂盒。
背景技术
随着社会老龄化进程的加速，骨质疏松症的患病率迅猛增加，而且大多伴随着肌少症，共同引发多重并发症，导致老年人群的生活质量下降，并给社会带来沉重的经济负担。据推测，全球目前约有5千万人罹患肌少症，预计到2050年患此症的人数将高达5亿。肌少症与活动障碍、跌倒、低骨密度及代谢紊乱密切相关，是老年人生理功能逐渐减退的重要原因和表现之一。肌少症会增加老年人的住院率及医疗花费，严重影响老年人的生活质量，甚至缩短老年人的寿命。然而，肌少症是环境和遗传因素共同作用的复杂疾病，往往存在多种风险因素和发病机制，导致目前肌肉减少症的诊断和治疗手段局限性大、有效性低。随着疾病的进展，肌少症患者将逐渐丧失生活和劳动能力甚至危及生命，给患者带来了沉重的心理压力和经济负担，对社会的发展造成了巨大的影响和阻碍。因此，深入探讨肌少症的发病机制，开发新的且行之有效的诊断和治疗方法显得尤为重要。
骨质疏松伴肌肉减少症是老年人发生骨折的重要原因之一。肌少症会造成跌倒和骨折的风险增加，使患者的日常生活能力下降，并与心脏疾病、呼吸系统疾病和认知障碍相关；严重者会导致患者的运动功能失调、生活质量下降，丧失独立生活能力，或长期需要别人照料，死亡风险增加。随着疾病的进展，随之而来的是进行性发生骨骼肌纤维质量下降、肌肉力量减小、肌肉耐力及代谢能力下降、结缔组织和脂肪增多。肌少症缺乏特异的临床表现，患者可表现为虚弱、容易跌倒、行走困难、步态缓慢、四肢纤细和无力等，其诊断有赖于肌力、肌强度和肌量等方面评估。目前对肌少症的治疗主要在于预防疾病的发生，但现有的肌少症诊断手段比较滞后，主要是通过影像学检测肌量或评估肌肉功能，尚没有基于血清学的检测手段。由于现有的诊断手段缺乏特异性，并且缺少提前预测肌少症进展速度与严重程度的方法，给肌少症的预防带来极大的困难，导致肌少症的预防变得十分困难。因此，开发用于预测肌少症发生发展的试剂和方法变得极其重要。
NCOA4(nuclear receptor coactivator 4，核受体辅激活因子4)最初被认为是一种雄激素受体激活剂，参与下游基因的表达调控。后来发现NCOA4是自噬溶酶体通路的选择性cargo受体，可以特异性结合铁蛋白分子，从而降解铁蛋白释放铁离子供细胞利用。NCOA4调节的铁蛋白降解被称为铁自噬。目前，尚未有研究表明NCOA4与肌萎缩相关。
目前，已有多种商品化的NCOA4检测试剂盒用于检测细胞培养上清、血清中的NCOA4水平，如SignalwayAntibody、Abebio、Abbkine等。然而这些试剂盒虽然能检测细胞培养上清中的NCOA4水平，但对于血清却难以检测得到，究其原因是血清中的NCOA4水平较低，难以达到试剂盒的最低检测需求。因此，有必要开发高灵敏度的血清NCOA4检测方法。目前，尚未有通过检测血清NCOA4来预测骨质疏松患者发生肌少症的相关试剂或试剂盒。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明通过检测血清中的NCOA4水平来预测骨质疏松患者肌少症的发生，操作性更强，更适用于普遍筛查，其对肌少症的检测也更灵敏。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种骨质疏松症发生肌少症的生物标记物，所述生物标记物为NCOA4。
优选地，所述NCOA4为血清NCOA4。
优选地，所述NCOA4可用于早期预测肌少症的发生。
本发明通过构建铁缺乏小鼠模型进行研究发现，NCOA4可能在骨骼肌萎缩过程中发挥一定的作用。进一步通过检测骨质疏松症患者血清中的NCOA4水平，并随访患者2年通过DXA等手段评估患者骨骼肌水平的变化情况。发现骨质疏松患者血清中的NCOA4水平与肌肉萎缩症发生发展有一定程度的相关性，说明NCOA4有望成为预测肌肉萎缩症发生发展的生物标记物。
本发明还提供了上述的生物标记物在制备检测骨质疏松症发生肌少症的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，该试剂盒包括预包被有抗人NCOA4抗体的96孔板、96孔板覆膜、NCOA4蛋白标准品、辣根过氧化物酶标记抗体、TMB底物显色液、终止液、洗涤液和NCOA4检测数值对应的分数指数表。
优选地，所述检测试剂盒还包括标准品稀释液和辣根过氧化物酶标记抗体稀释液。
进一步地，所述标准品稀释液和辣根过氧化物酶标记抗体稀释液的配置方法为：按0.1g/100mL的料液比往PBS缓冲液中加入BSA，充分混匀即得。
优选地，所述检测试剂盒的检测范围为0.1-100pg/mL。
优选地，所述预包被有抗人NCOA4抗体的96孔板的配置方法为：先用PH＝9.6的PBS缓冲液将抗人NCOA4抗体稀释至5ug/mL，然后往96孔板中每孔加入0.2mL，于4℃孵育过夜，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
优选地，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
优选地，所述洗涤液的配置方法为：往1000LPBS缓冲液中加入1mL Tween溶液，充分混匀即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明经研究发现NCOA4介导的铁自噬激活是发生骨骼肌萎缩的重要原因。铁自噬激活后，NCOA4与RNF20相互作用，一起被自噬溶酶体途径降解，从而引起成肌转录因子MyoD、MyoG的组蛋白泛素化水平下降，导致肌肉萎缩发生。提示骨质疏松患者血清中的NCOA4水平与肌肉萎缩症发生发展有一定程度的相关性，检测血清NCOA4水平有望成为一种预测肌少症发生的崭新方法，可作为骨质疏松症发生肌少症的生物标记物。本发明主要具有以下优点：
(1)本发明第一个采用血清学检测的方法来预测肌少症的发生发展。
(2)铁离子过多或过少都会对人体造成极大的危害，所以铁自噬的发生受机体精密的调控。而NCOA4作为铁自噬的核心cargo受体将会是一个比较灵敏的指标，作为骨质疏松症发生肌少症的生物标记物，可以用于早期预测肌少症的发生。
(3)检测血清中的NCOA4水平来预测肌少症的发生发展，使检测变得易于实现，可以成为常规肌少症的大规模筛查手段，便于早期发现肌少症的发生并给予干预。
(4)制备的肌少症检测试剂盒，能有效降低检测容许范围的下限，从而提高血清NCOA4的检测敏感度，并提高检测准确性。
(5)本发明是针对NCOA4的检测而非抗NCOA4自身抗体的检测。由于抗NCOA4自身抗体的产生与B细胞等多种体内因素有关，且与肌少症的发生关系不密切。因此，直接检测NCOA4的水平更为准确。
附图说明
图1为Westernblot检测铁自噬相关分子表达；
图2为Westernblot以及免疫荧光实验检测成肌相关分子表达；
图3为Westernblot检测抑制铁自噬后成肌相关分子表达；
图4为IP实验结果；
图5为ChIP实验结果(anti-H2Bub1、anti-RNF20分别指H2Bub1和RNF20的抗体，用这两个抗体做ChIP实验；NC代表正常对照组；DFO代表DFO处理组)；
图6为正常组鼠与处理组鼠的肌束横截面积以及NCOA4表达水平的免疫荧光染色结果(DAPI即DNA染料，染细胞核；laminin即染肌纤维中肌束膜，用来指示肌束的大小)以及Western blot检测NCOA4与MyHC的表达水平；
图7为男性骨质疏松患者相关性散点图与曲线；
图8为女性骨质疏松患者相关性散点图与曲线；
图9为通过检测NCOA4筛查肌少症的ROC曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1NCOA4与肌肉萎缩的关联性研究
体外培养C2C12成肌肉细胞(购买自中科院细胞库)，C2C12是鼠来源的成肌分化细胞系，在DMEM高糖培养基加10％胎牛血清的条件下可进行快速增殖，在DMEM高糖培养基加2％的马血清条件下C2C12细胞会相互分化融合为多核肌纤维。增殖培养基条件下在六孔板中进行种板，细胞密度为2.5×105细胞/孔。第二天更换分化培养基，同时给予0、10、15、20、25、30umol的DFO(铁螯合剂)来螯合铁离子。并通过Western blot检测铁自噬核心分子NCOA4以及LC3B的表达情况(LC3B-I和LC3B-II为自噬标志分子，LC3B-I向LC3B-II转化，则表明自噬被激活)，发现NCOA4表达下降，LC3B-II与LC3B-I的比例明显升高(如图1所示)，证实铁自噬被激活。相应地，肌球蛋白重链MyHC以及成肌转录因子MyoD(成肌分化抗原)、MyoG(肌细胞生成素)的表达明显下降(如图2所示)，说明成肌分化逐渐减弱。
然后回补铁离子(柠檬酸铁胺，AFC)，给予铁自噬抑制剂DC661、3MA或敲除NCOA4来抑制铁自噬的激活。发现抑制铁自噬后可以逆转DFO对肌肉分化的抑制作用(如图3所示)。因为NCOA4是铁自噬过程中的关键cargo分子，可以与铁蛋白相互作用经自噬溶酶体途径降解。
进一步对DFO处理的C2C12细胞进行NCOA4的蛋白质谱以及免疫共沉淀实验【具体操作参照文献“Li,J.et al.,TRAF4 positively regulates the osteogenicdifferentiation of mesenchymal stem cells by acting as an E3 ubiquitin ligaseto degrade Smurf2.Cell Death&Differentiation 262652(2019)”】，发现铁自噬激活后组蛋白泛素化酶RNF20也会与NCOA4相互作用而降解，说明RNF20可能是潜在的下游分子(如图4所示)。RNF20通过调控组蛋白H2B泛素化水平来调控基因的表达。
对DFO处理和未处理的C2C12细胞进行ChIP实验【具体操作参照文献“Yu,W.etal.,SNP-adjacent super enhancer network mediates enhanced osteogenicdifferentiation of MSCs in ankylosing spondylitis.HUMMOL GENET30277(2021).”】，发现铁自噬激活后，组蛋白H2B单泛素化水平在成肌转录因子MyoG、MyoD的启动子位置明显下降，导致MyoG、MyoD表达减少，从而引起肌肉分化减少(如图5所示)。
最后通过缺铁饮食喂养来构建铁自噬激活的小鼠模型。3-5周大小的C57BL/6小鼠(中山大学中山医学院实验动物中心)30只随机分为2组，分别进行对照饲料喂养(Dyets,AIN93G)和缺铁饲料(Dyets,D115109)喂养。8周后，通过检测血清铁离子水平，发现缺铁喂养小鼠血清铁水平明显下降。然后对小鼠腓肠肌标本进行Western blot以及免疫荧光染色实验来检测铁自噬相关分子(NCOA4、MyHC)以及骨骼肌水平(肌束横截面积)。与体外实验相一致，NCOA4水平下降导致肌肉萎缩的发生(如图6所示)。这提示铁自噬可能在骨骼肌萎缩过程中发挥一定的作用，而NCOA4是铁自噬的关键分子，检测NCOA4的水平可能对肌少症有一定的诊断意义。
实施例2 NCOA4水平与肌肉减少量的相关性研究
招募骨质疏松但不伴肌少症的患者男性20名，女性30名(如表1所示)。采用ELISA法对患者血清的NCOA4水平进行分析，不同浓度区间以对应分数表示(如表2所示)。采用双能量X射线吸收法(DXA)对抽血者的四肢骨骼肌肌肉量水平进行测量，记录为肌量1；2年后再采用双能量X射线吸收法(DXA)测量同一批患者的肌肉量水平，记录为肌量2。肌肉量1减去肌肉量2即为肌少症的发生与进展情况(2年)。最后，采用SPSS统计软件对NCOA4水平与肌肉减少量进行Pearson相关性分析。检测结果见表3和表4以及图5和图6。
表3和表4的试验结果表明，骨松患者2年随访后，60％男性四肢骨骼肌肌量小于7kg/m2，67％女性四肢骨骼肌肌量小于6.5kg/m2，指示肌少症的发生。而且NCOA4检测指数与2年肌肉减少量明显相关(Pearson系数分别为-0.8630、-0.8929，p<0001)(如图7、图8所示)，提示NCOA4水平与骨松患者的肌肉丢失有很强的相关性，具有早期预测骨质疏松患者发生肌少症的风险。
表1骨松患者基本情况
Figure BDA0003309921570000051
Figure BDA0003309921570000061
备注：所有骨松患者均符合中国老年学会骨质疏松委员会制定的标准
表2 NCOA4检测数值对应的分数指数
Figure BDA0003309921570000062
表3男性骨质疏松患者的对应分数与四肢骨骼肌肌量(kg/m2)
Figure BDA0003309921570000063
Figure BDA0003309921570000071
表4女性骨质疏松患者的对应分数与四肢骨骼肌肌量(kg/m2)
Figure BDA0003309921570000072
Figure BDA0003309921570000081
实施例3一种用于检测骨质疏松症发生肌少症的试剂盒
(1)试剂盒的组成：
预包被有抗人NCOA4抗体(H00008031-A01，abnova)的96孔板、96孔板覆膜、NCOA4蛋白标准品(1000pg/支)、标准品稀释液、辣根过氧化物酶标记抗体、辣根过氧化物酶标记抗体稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、NCOA4检测数值对应的分数指数表。
(2)试剂盒的制备：
1)洗涤液配置：往1000LPBS缓冲液中加入1mLTween溶液，充分混匀即得。
1)96孔板抗体包被：配置PH＝9.6的磷酸盐缓冲液(PBS)，稀释抗人NCOA4至5ug/mL，然后往96孔板中每孔加入0.2mL，于4℃孵育过夜，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
3)标准品稀释液、辣根过氧化物酶标记抗体稀释液配置：往100mL PBS缓冲液中加入0.1g BSA，充分混匀即得。
4)终止液配置：配置2mol/L的硫酸溶液，室温静置备用。
5)96孔板覆膜购自RayBiotech公司；NCOA4蛋白标准品购自abnova公司；辣根过氧化物酶标记抗体购自santa cruz公司；TMB底物显色液购自Sigma公司；检测数值对应指数表由本单位制作，如下表所示：
Figure BDA0003309921570000082
(3)使用试剂盒检测NCOA4的方法
1)抽取骨质疏松患者的外周血，室温静置1小时，吸取上层清液1000×g离心5min，留取上层血清，弃去沉淀。
2)对NCOA4蛋白标准品以10000rpm的转速离心1min，然后用1mL标准品稀释液溶解标准品，通过倍比稀释法稀释7次(稀释倍数分别为：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625)，稀释后样品的浓度分布在15.6-1000pg之间。
3)往预包被有抗人NCOA4抗体的96孔板中每孔加入稀释后的标准品或检测样品100uL，贴上覆膜，于摇床室温孵育2h。
4)弃去液体，每孔加入洗涤液200uL，洗涤3次，每次1min。
5)按1:100的料液比用辣根过氧化物酶标记抗体稀释液溶解稀释辣根过氧化物酶标记抗体，稀释后往上述96孔板中每孔加入100uL，置于摇床室温孵育1h。
6)加入200uL终止液终止反应；
7)往上述96孔板中每孔加入TMB底物显色液100uL，室温避光孵育30min。
8)往上述96孔板中每孔加入终止液50uL。
9)通过酶标仪在450nm波长处检测各孔的光密度，通过拟合标准曲线计算出实际数值(即NCOA4检测数值)。
实施例4试剂盒的检测范围、特异性、回收率以及准确性
(1)检测范围：NCOA4蛋白标准品稀释不同浓度(分别稀释200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.2，0.1，0.05倍)，然后按照实施例3中的NCOA4检测方法测量得出试剂盒的检测范围为0.1-100pg/mL(现有检测方法的检测范围为10-100pg/mL)。
(2)特异性：用与NCOA4相似的cargo蛋白P62、Nbr1、Optn、Ccolco2以及肌萎缩中经常出现的分泌蛋白Myostatin、FGF21、IL33、Irisin、IL6、LIF、TNFα检测试剂盒的特异性。即以上述蛋白的标准品按照实施例3中的NCOA4检测方法进行特异性检测。检测结果发现，NCOA4与P62、Nbr1、Optn、Ccolco2、Myostatin、FGF21、IL33、Irisin、IL6、LIF、TNFα等无交叉反应。
(3)回收率：
抽取志愿者的外周血，室温静置1小时，吸取上层清液1000×g离心5min，留取上层血清，弃去沉淀。将收集的血清分为两份，其中一份加入定量的NCOA4标准品；两份同时按实施例3步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。
表5试剂盒的检测回收率
样本 回收率范围(％) 平均回收率(％)
血清(n＝50) 97-105 99
血浆(n＝50) 85-91 87
细胞培养上清(n＝50) 89-94 92
(4)准确性：按照实施例3中试剂盒的组成配置5个批次的试剂盒，然后按照实施例3中的NCOA4检测方法进行检测。检测结果发现，批内差CV<5.7％，批间差CV<4.3％。说明本发明的试剂盒检测准确性高。
实施例5本发明的试剂盒在检测骨质疏松症发生肌少症中的应用
分别招募正常人22人，肌少症患者22人。按照实施例3中的NCOA4检测方法分别检测血清NCOA4水平，然后根据NCOA4分数将受试者分为正常人和患者(如表6所示)，并根据NCOA4分数构建ROC曲线。
如图9所示，曲线的下面积为0.8378，灵敏度为86.36％，特异性为68.18％。说明本发明的检测试剂盒具有较好的临床应用效果。
表6 NCOA4分数统计表
Figure BDA0003309921570000101
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种骨质疏松症发生肌少症的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物为NCOA4。
2.根据权利要求1所述的一种骨质疏松症发生肌少症的生物标记物，其特征在于，所述NCOA4为血清NCOA4。
3.权利要求1所述的生物标记物在制备检测骨质疏松症发生肌少症的产品中的应用。
4.一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预包被有抗人NCOA4抗体的96孔板、96孔板覆膜、NCOA4蛋白标准品、辣根过氧化物酶标记抗体、TMB底物显色液、终止液、洗涤液和NCOA4检测数值对应的分数指数表。
5.根据权利要求4所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括标准品稀释液和辣根过氧化物标记抗体稀释液。
6.根据权利要求5所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液和辣根过氧化物酶标记抗体稀释液的配置方法为：按0.1g/100mL的料液比往PBS缓冲液中加入BSA，充分混匀即得。
7.根据权利要求4所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测范围为0.1-100pg/mL。
8.根据权利要求4所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述预包被有抗人NCOA4抗体的96孔板的配置方法为：先用PH＝9.6的PBS缓冲液将抗人NCOA4抗体稀释至5ug/mL，然后往96孔板中每孔加入0.2mL，于4℃孵育过夜，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
9.根据权利要求4所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
10.根据权利要求4所述的一种用于诊断骨质疏松症发生肌少症的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的配置方法为：往1000LPBS缓冲液中加入1mLTween溶液，充分混匀即得。
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