CN1970752A

CN1970752A - 用磁性纳米复合材料回收dna的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN1970752A
Application number: CN 200610131676
Authority: CN
Inventors: 杨百全; 王刚; 杨文胜
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-05-30

Abstract

本发明的用磁性纳米复合材料回收DNA的方法及试剂盒涉及生物技术领域。在含DNA的凝胶样本等回收样品中回收DNA，步骤包括：(a)将磁性纳米复合材料与回收样品混合，形成固液均相分散悬浊液；(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料从固液均相分散悬浊液中分离开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料；(c)用洗涤液将杂质洗去后，用洗脱液将DNA从磁性纳米复合材料中解析出来。用磁性纳米复合材料回收DNA的试剂盒中含有：磁性纳米复合材料溶液、溶解液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液。本发明能够一步实现DNA的回收纯化；总提取效率在80％以上；方法简单快速；能够估算DNA的提取数量。

Description

用磁性纳米复合材料回收DNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种用磁性纳米粒子回收DNA的方法及用于回收DNA的试剂盒。

背景技术

DNA的回收有广泛的应用，例如从DNA聚合酶链反应(PCR)扩增产物、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、消化后的生物样本中回收高纯度DNA用于基因指纹鉴定、基因测序、构建文库、PCR检验等。DNA回收技术是分子生物学实验中的一项关键技术，回收DNA的效率和纯度将直接关系到后续实验的成功与否，因此开发快速、高效、简易、低成本的DNA回收方法一直是分子生物学工作者的目标之一。

目前主要的DNA回收方法是化学法、玻璃珠法和柱分离法，步骤较为烦琐，回收的DNA纯度不高。

国外一些公司生产的试剂盒，如Promega公司、Qiagen公司、Gene公司等生产的试剂盒，价格昂贵，无法有效推广。

随着纳米技术的日趋完善和进步，磁性纳米复合材料合成技术及其在生物领域中的应用前景日益受到了人们的关注。尤其是其具有分离方法操作简便、所需设备廉价，分离速度快等优点，使其逐渐成为分子生物学研究必不可少的实验手段，应用日益广泛。

用于生物技术中的磁性复合材料一般要求具有如下的特性：(1)具备顺磁性，易于吸附和洗脱。(2)具有较大的磁化强度，以保证分离效率和提高灵敏度。(3)复合材料表面要易于进行化学修饰，以和不同的生物和药物分子进行连接。(4)用于体内时要求有较好的生物相容性。基于此目的设计的复合材料通常为三明治结构，内核一般为超顺磁性的磁性纳米粒子，中间为包覆层，目前已有的产品大多采用高分子材料作为包覆层，最外层则修饰与生物组织有特异性作用的功能基团，以满足生物分离的要求。

商品化的磁性复合材料多采用乳液聚合得到的高分子微球，其中包覆了纳米尺寸的磁性颗粒。然而，高分子球的结构通常比较疏松，其中包含的磁性粒子在长时间保存过程中容易脱离微球，从而影响产品的性能。一般乳液聚合所得的高分子微球尺寸较大，多在微米范围，不能满足一些需要更小尺寸粒子的应用领域的要求。另一类通常采用的磁性粒子包覆材料是多糖类分子，如葡聚糖、壳聚糖等，但此类分子形成的包覆层更不稳定，其与磁性粒子的作用较弱，同样存在磁性粒子易脱落导致产品失效的缺点。因此，本领域迫切需要开发新的简便有效地回收DNA的技术。

与本发明相近的现有技术是中国专利ZL03111351.6，发明名称为“具有强磁场相应能力的磁性核壳微粒及其制备方法”，公开了以二氧化硅为包覆层的磁性纳米复合材料的合成方法，所合成的磁性纳米复合材料适合于生物材料和医药制品的分离和纯化，可做为生物分子和药物分子磁控定向输送载体。

目前，尚没有利用磁性纳米复合材料回收DNA的技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，使用以二氧化硅为包覆层的磁性纳米复合材料回收DNA，达到简便、快捷、高效、低成本的目的。

本发明的发明人在制备了以二氧化硅为包覆层的磁性纳米复合材料的基础上，发现该磁性纳米复合材料与DNA分子具有高度的亲和力，可以作为回收DNA的有效介质。本发明的一个目的就是公开一种利用磁性纳米复合材料简便高效地回收DNA的方法。

本发明另一目的是提供一种利用磁性纳米复合材料简便有效地回收DNA的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种利用磁性纳米复合材料回收DNA的方法，所说的回收DNA，是从已经与溶解液混合的PCR扩增产物、用溶解液使DNA从凝胶样本释放出来的吸附液样品或与溶解液混合的DNA已经释放出来的生物样本等回收样品中回收DNA；回收步骤包括：

(a)将磁性纳米复合材料与回收样品混合，形成固液均相分散悬浊液，其中所述的磁性纳米复合材料的直径为0.2～10μm；

(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料从固液均相分散悬浊液中分离开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料；

(c)用洗涤液将杂质洗去后，用洗脱液将DNA从磁性纳米复合材料中解析出来，从而获得纯的DNA溶液；所说的洗涤液，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，pH＝6.7，5～50mmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)或为0～2mol/l的乙酸钠；所说的洗脱液为去离子水或10±2mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0。

本发明方法可简便高效地从凝胶等含DNA的样品中回收DNA。

在另一优选例中，所述的凝胶样本为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等以及其他需要进行DNA回收的样本。

在另一优选例中，用溶解液使DNA从凝胶样本释放出来得到含DNA的吸附液样品中，其溶解液的组分为1～8mol/l的盐溶液、0.5mol/l的pH＝6.7的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、5～50mmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5～5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)。

在另一优选例中，所述的吸附液样品是通过以下步骤制备的：将含有DNA的凝胶样本与溶解液混合，35℃～80℃温浴10～40分钟。

在另一优选例中，所述的磁性纳米复合材料的内核为磁性铁氧体纳米粒子，包括Fe₃O₄纳米粒子、γ-Fe₂O₃纳米粒子或掺过渡金属元素及其化合物的具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，其外壳为二氧化硅。

在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括步骤：分先后使用洗涤液I或洗涤液II洗涤；洗涤次数分别为1～5次，较佳地为2～3次。洗涤液I的组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA；洗涤液II的组分为0～2mol/l的乙酸钠。

由本发明的方法步骤(b)得到的吸附了DNA的磁性纳米复合材料，可以直接应用，例如作为模板用于PCR反应。当然，还可以将DNA从磁性纳米复合材料上解吸下来，形成DNA溶液。较佳地，再进行步骤(c)，加入含Tris-HCl的洗脱液，从磁性纳米复合材料上溶出DNA，从而获得DNA溶液。

在本发明的第二方面，通过了一种DNA回收试剂盒，它含有磁性纳米复合材料，所述的磁性纳米复合材料具有磁性内核和硅氧结构包覆层，其直径为0.2～10μm。

所述的试剂盒还含有：

溶解液，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA，0.5～5％Triton；

洗涤液I，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA；

洗涤液II，其组分为0～2mol/l的乙酸钠(可以是水)；

洗脱液为10±2mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0或去离子水。

在另一优选例中，在溶解液中，所述的盐溶液是NaCl或NaClO₄溶液或NaI溶液，且盐溶液浓度为5±1mol/l；所述的EDTA的浓度为15±5mmol/l；

在洗涤液I中，所述的盐溶液是NaCl或NaClO₄溶液或NaI溶液，且盐溶液的浓度为4±1mol/l；所述的EDTA浓度为20±5mmol/l；

在洗涤液II中，所述乙酸钠的浓度为1.5±0.5mol/l。

用于本发明的溶解液、洗涤液、洗脱液没有特别限制，可以采用本领域采用的各种溶解液、洗涤液、洗脱液。此外，试剂盒中的溶解液、洗涤液、洗脱液可以是浓缩液或稀释液。

用本发明方法制备的新型的复合磁性材料，其尺寸在0.2-10μm之间可调，磁性内核被致密的硅氧结构层包覆，可以完全避免磁性粒子的脱落。同时可以减缓内核被氧化的速度，延长其使用寿命。外层包覆的硅氧结构层有良好的生物相容性。利用不同硅烷化试剂进行表面修饰后，复合磁性材料可以与不同药物或生物分子结合，从而满足体外生物样品的分离提纯、检测、体内药物或其它生物分子的定向输运等特殊用途。

本发明主要优点在于：

1、利用具有超顺磁性的磁性纳米复合材料，一步实现DNA的回收纯化。

2、方法简单，提取快速，通常操作可在1个小时内完成。

3、能够有效去除抑制剂和污染物，适用于分子生物学实验室。

4、根据试剂盒的设计，能够估算DNA的提取数量，对以后的操作起到指示作用。

5、采用生物纳米技术进行产品研制，大幅提高DNA提取效率，总提取效率在80％以上。

6、可以与多种生物技术配套使用，如PCR技术、酶切技术、克隆技术等。

7、能够实现DNA回收操作的自动化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

磁性纳米复合材料的制备

称取54.90g的FeCl₃·6H₂O和20.20g的FeCl₂·4H₂O，用200ml经过通氮除氧的水溶解得到混合溶液。取800ml水在1L的圆底烧瓶中通氮除氧，加入50ml的质量百分比浓度为25～28％的浓氨水，在剧烈搅拌下迅速向其中倒入上述的铁盐混合溶液，在80℃下反应1h。反应完毕后，用0.1T的永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体，所得固体用高纯水清洗3～5次得到粒径为6～10nm的Fe₃O₄纳米粒子。

称取5.0g Na₂SiO₃(SiO₂含量为45％)溶在1000ml水中，用阳离子树脂调节溶液的pH为9.6，向其中加入2g上述合成的Fe₃O₄纳米粒子。在室温下，以150rpm搅拌速度在1L圆底烧瓶中反应12h。反应完毕后，用0.1T的永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体，所得固体用高纯水清洗3～5次即得粒径为7～12nm的二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子。

向2L圆底烧瓶中依次加入900ml乙醇、100ml水、40ml质量百分比浓度为25～28％的浓氨水、0.10g经第一次二氧化硅包覆合成的Fe₃O₄纳米粒子。在室温下，以200rpm搅拌速度滴加0.6ml正硅酸乙酯，反应3h后再滴加0.6ml正硅酸乙酯，继续反应12h。用0.1T的永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体，所得固体用高纯水清洗3～5次即得平均尺寸为0.4μm的多核Fe₃O₄-SiO₂核壳微粒。

实施例2

DNA回收试剂盒

制备利用磁性复合材料的DNA回收试剂盒，其内包括：

0.5ml浓度为20mg/ml的实施例1中所制备的磁性纳米复合材料溶液

100ml溶解液，其组分为6mol/LNaI溶液，0.5ml的Tris-HCl，pH＝6.4，25mmol/l的EDTA；

100ml洗涤液II，其组分为1.5mol/l乙酸钠；

10ml洗脱液，为去离子水。

实施例3

DNA回收试剂盒

制备利用磁性复合材料的DNA回收试剂盒，其内的磁性纳米复合材料溶液、洗涤液II同实施例2，还包括：

100ml溶解液，其组分为4mol/LNaCl溶液，0.5ml的Tris-HCl，pH＝6.4，45mmol/l的EDTA，2.5％Triton；

100ml洗涤液I，其组分为4mol/l的NaClO₄溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，25mmol/l的EDTA；

10ml洗脱液，其组分为10mmol/l的Tris-HCl。

实施例4

用磁性纳米复合材料回收琼脂糖凝胶DNA

1、切取含DNA片段的琼脂糖凝胶(100mg～500mg)捣碎按重量比1∶2至1∶4(凝胶片段：溶液体积重量比)加入溶解液中，溶解液组分同实施例2。

2、50℃溶解，直至凝胶完全溶化。

3、加入磁性纳米复合材料，室温吸附20min。

4、旋涡振荡混匀后立即放到试剂盒所带的磁架上，静止30s至磁性复合纳米材料吸附到管壁。

5、吸弃溶液后，用实施例2中的洗涤液II洗涤3次。

6、室温干燥10min后，加入洗脱液，65℃温浴15min。

7、立即将离心管放到磁架上，静止30s至磁性纳米复合材料吸附到管壁，吸出洗脱液至另一离心管中待用。

实施例5

用磁性纳米复合材料回收溶液中DNA

1、在DNA溶液中加入3倍体积溶解液，混匀。

其余步骤接实施例4步骤3～7。

实施例6

用磁性纳米复合材料回收聚丙烯酰胺凝胶中DNA

1、切取含DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶捣碎，用2倍体积的实施例2的溶解液浸泡，37℃温浴2h。

2、10000rpm离心3min，吸取上清溶液至一新的离心管。

3、其余步骤同实施例4的3～7。

实施例7

用磁性纳米复合材料回收聚丙烯酰胺凝胶中DNA

1、切取含DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶捣碎，用2倍体积TNE浸泡，37℃温浴2h。

2、10000rpm离心3min，吸取上清溶液至一新的离心管。

3、加入3倍体积溶解液，得到回收样品。

4、将磁性纳米复合材料与回收样品混合，再用磁铁将吸附了DNA的磁性纳米复合材料从悬浊液中分离开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料。

5、将吸附有DNA的磁性纳米复合材料用洗涤液I洗涤两次，再用洗涤液II洗涤两次，最后用洗脱液将DNA从磁性纳米复合材料中解析出来，从而获得纯的DNA溶液。

实施例8

用磁性纳米复合材料回收PCR产物中DNA

在PCR扩增产物溶液中加入3倍体积溶解液，混匀。

其余步骤按实施例4步骤3～7。

实施例9

回收DNA的质量鉴定

对实施例4、7、8中回收的DNA直接进行电泳。其中的一个泳道为L为DNA标准物ψ×174/HaeIII(PCR扩增片段的等位基因Ladder)，以便比较回收样品的DNA回收效果。

结果表明，所有样本均获得了理想的回收结果。但在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA回收效率稍低于从PCR扩增产物中回收的DNA片段。

Claims

1、一种用磁性纳米复合材料回收DNA的方法，其特征在于，所说的回收DNA，是从已经与溶解液混合的PCR扩增产物、用溶解液使DNA从凝胶样本释放出来的吸附液样品或与溶解液混合的DNA已经释放出来的生物样本等回收样品中回收DNA；回收步骤包括：

(c)用洗涤液将杂质洗去后，用洗脱液将DNA从磁性纳米复合材料中解析出来，从而获得纯的DNA溶液；所说的洗涤液，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH＝6.7，5～50mmol/l的乙二胺四乙酸或为0～2mol/l的乙酸钠；所说的洗脱液为去离子水或10±2mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0。

2、按照权利要求1所述的用磁性纳米复合材料回收DNA的方法，其特征在于，所说的吸附液样品是通过以下步骤制备的：将含有DNA的凝胶样本与溶解液混合，35℃～80℃温浴10～40分钟；所说的凝胶样本为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。

3、按照权利要求1或2所述的用磁性纳米复合材料回收DNA的方法，其特征在于，在(c)步骤中，所说的洗涤，分先后使用洗涤液I、洗涤液II洗涤；洗涤次数分别为1～5次；洗涤液I的组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH＝6.7，5～50mmol/l的乙二胺四乙酸；洗涤液II的组分为0～2mol/l的乙酸钠。

4、按照权利要求1或2所述的用磁性纳米复合材料回收DNA的方法，其特征在于，所说的磁性纳米复合材料的内核为磁性铁氧体纳米粒子，包括Fe₃O₄纳米粒子、γ-Fe₂O₃纳米粒子或掺过渡金属元素及其化合物的具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，其外壳为二氧化硅。

5、一种用磁性纳米复合材料回收DNA的方法的试剂盒，其特征在于，试剂盒中含有：

磁性纳米复合材料，所说的磁性纳米复合材料具有磁性内核和硅氧结构包覆层，其直径为0.2～10μm；

溶解液，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH＝6.7，5～50mmol/l的乙二胺四乙酸，0.5～5％聚乙二醇辛基苯基醚；

洗涤液I，其组分为1～8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH＝6.7，5～50mmol/l的乙二胺四乙酸；

洗涤液II，其组分为0～2mol/l的乙酸钠；

洗脱液为10±2 mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0或去离子水。

6、按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所说的盐溶液是NaCl或NaClO₄溶液或NaI溶液，且盐溶液浓度为5±1mol/l；所洗的乙二胺四乙酸的浓度为15±5mmol/l；在洗涤液I中，所说的盐溶液是NaCl或NaClO₄溶液或NaI溶液，且盐溶液的浓度为4±1mol/l；所说的乙二胺四乙酸浓度为20±5mmol/l；在洗涤液II中，所说的乙酸钠的浓度为1.5±0.5mol/l。