CN1943569A - 一种中药活性成分组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药活性成分组合物及其制备方法和用途，该组合物中丹参酚酸A和丹参酚酸B的总含量大于50％，其中丹参酚酸A∶B的比例在1∶0.01～100，本发明还提供了该组合物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。

Description

一种中药活性成分组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种中药丹参的活性成分丹参酚酸A和丹参酚酸B组合而成的组合物及其制备工艺，含有该组合物的药物制剂及其在预防和治疗心脑血管疾病药物或保健品方面的应用。

背景技术

心血管疾病是全球卫生保健和卫生资源的巨大负担。根据2000年公布的最近的世界卫生报告，全世界每年有1700万人死于心血管疾病，到2020年心血管死亡将比该数字增加50％，高达2500万。心脑血管疾病已成为人类健康的头号杀手，发病率在中老年人群中最高，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一，是当今世界上威胁人类健康及生命的最严重的疾病之一，是全球医务界最关注的疾病。在我国随着传染病被控制，人民生活水平的提高，患心血管疾病的人群也日益庞大。

丹参是我国传统医学中常用药物之一，有活血祛瘀、通经活络等功效。其作为治疗心脑血管性疾病的药物，具有广泛的临床用药基础，且疗效显著，有悠久的临床应用历史。近三十年来，国内外学者通过研究发现丹参中水溶性酚酸类成分是其治疗心脑血管疾病的主要活性成分，并从中分离得到丹参酚酸A～G，紫草酸，迷迭香酸，丹参素，原儿茶醛等诸多酚酸类成分。药理实验结果证明这些酚酸类成分具有抗血栓、改善微循环、抗细胞脂质过氧化损伤等作用。其中丹参酚酸A活性最强，丹参酚酸B次之，原儿茶醛和丹参素活性最弱。其中丹参酚酸A和丹参酚酸B结构如下：

丹参酚酸A(Sal-A)                                                 丹参酚酸B(Sal-B)

而临床常用的丹参的各类制剂皆以脂溶性的丹参酮和/或水溶性的原儿茶醛/和或水溶性的丹参素为含量测定指标，存在提取工艺落后，提取物中有效成份含量低，成分不明确；制剂稳定性差，疗效不稳定等缺点。因此，提取丹参中活性最强组分丹参酚酸A及活性次强组分丹参酚酸B，使提取物化学成分明确，有效成分含量高，是提高丹参制剂的稳定性，保证药品质量，确保疗效的关键。目前，国内已有企业进行丹参总酚酸类制剂的研究开发。

中国专利，CN1247855A，2000年公开了采用水提后过树脂法提取丹参中酚酸的方法，因水提物杂质多，致使树脂再生率低，提取物酚酸含量低。在此基础上，中国专利，CN1384090A，2002年公开了改进的水提后醇沉再过树脂的提取方法，增加了醇沉工艺，提高了提取物中酚酸的含量，改善了树脂得再生率问题，但其提取物中占含量50％以上的成分为丹参酚酸B，活性最强的丹参酚酸A则含量极微。中国专利，CN1425659A，2003年公开了从丹参酚酸中提取丹酚酸B的方法，也存在上述的缺陷，丹参酚酸中活性最强的有效成分丹参酚酸A亦未能分离。中国专利，CN1513848A，2004年公开了采用水提、超滤、酸化后乙酸酯类萃取，再过反相柱的方法提取丹参中酚酸各组分的方法，所采用的提取及萃取方法文献中已有报道，过反相柱分离的方法在专利CN1425659A中已有提及，该方法没有说明如何具体分离到丹参中的酚酸各组分，对所分到的酚酸各组分的含量如何亦没有说明。

此外，需要说明的是上述各方法均以丹参药材所含的酚酸类成分中含量最高的丹参酚酸B为指标对酚酸类成分的提取及分离纯化工艺进行考察及说明，而未提及如何提取和保留丹参中活性最强，但相对含量较低的成分丹参酚酸A。我们通过研究发现，丹参酚酸A和丹参酚酸B虽然同属于酚酸类成分但其在理化性质方面却存在很大的不同。因此，仅以丹参酚酸B为指标来考察酚酸类成分的提取及分离纯化工艺，而不考虑活性最强的丹参酚酸A的提取效果，其研究方法存在很大的问题。

中国专利，CN200610012615.1，2006年公开了将丹参药材用水或醇提取，提取浓缩液后，采用高温高压反应，过柱色谱纯化丹酚酸A，再经调pH值，用有机溶剂萃取，浓缩干燥，制备含量大于80％丹酚酸A提取物的方法。丹参酚酸类成分易氧化、易聚合，不稳定，该方法所采用的高温高压条件，使提取物中的丹参酚酸A和丹参酚酸B的大部分遭到了破坏，因此，该方法存在较大缺陷。

目前，关于丹参水溶性成分的药理活性报道很多，关于其中主要活性成分丹参酚酸A和丹参酚酸B的药理研究也很多，但尚未有关于二者协同作用方面的药理研究，而中药成分复杂，其药效多为各种化学成分协同作用的结果，我们通过研究发现丹参药材、不同的丹参制剂中丹参酚酸A和丹参酚酸B的含量及二者比例相差很大，本发明发现丹参酚酸A和丹参酚酸B在心脑血管药理作用方面具有协同作用，因此制备一种建立在药效学基础上的最合理的丹参酚酸A和丹参酚酸B组合物。

发明内容

本发明提供一种含有丹参酚酸A或其盐和丹参酚酸B或其盐组成的中药活性成分组合物以及它们的制备方法。其中所述盐是指丹参酚酸A和丹参酚酸B与某些碱或金属盐形成的金属盐类衍生物。

本发明提供一种中药活性成分组合物，可以将丹参酚酸A和丹参酚酸B混合在一起制得。也可以是从丹参等植物中提取出来的，其中丹参酚酸A∶丹参酚酸B的重量比例为：1∶0.01～100，优选为1∶0.05～20，更优选为1∶1～10。

丹参酚酸A和丹参酚酸B可以是盐的形式，丹参酚酸A和B，可以与某些碱或钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐等金属盐，如氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸氢二钠、醋酸钠等，形成金属盐衍生物。这些衍生物具有与上述丹参酚酸A加B相同或相近的药理活性和用途。可以通过丹参酚酸A和B与0.01～5N的碱或盐溶液混合制备。

本发明的组合物，包括从丹参等植物中提取出来的，为此本发明还提供本发明组合物的制备方法，所用原料可以是中药丹参及其同科属植物南丹参、白花丹参、滇丹参、黄花鼠尾草、戟叶鼠尾草、华鼠尾草、新疆鼠尾草等，本发明提取的组合物主要成分为丹参酚酸A和丹参酚酸B，两者合计的总含量在50％以上，最优达80％以上。

本发明的制备方法，具体包括以下几个步骤：

步骤一、总丹参酚酸提取物的制备

1、提取

将丹参药材粉碎成粗粉，加入0～80％乙醇，采用加热回流、煎煮、浸渍、渗漉、超声提取、微波提取或高压提取，分离提取液，过滤、自然沉降或离心除去提取液中的固体杂质。

2、沉淀：

(1)水沉：将提取液常压或减压浓缩，冷却后加入2～8倍药材量的去离子水，冷藏，静置，过滤得滤液。

(2)醇沉：将滤液常压或减压浓缩，冷却后加入2～8倍药材量的无水乙醇，调解醇浓度为50～85％进行醇沉，静置，取上清液，减压浓缩。

步骤二、丹参酚酸A和丹参酚酸B组合物的分离、精制

丹参酚酸A和丹参酚酸B是分别或者同时从总丹参酚酸提取物中分离精制获得的，其分离精制方法采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合：(1)溶剂萃取法，(2)大孔吸附树脂柱色谱法，(3)聚酰胺吸附柱色谱法，(4)反相硅胶柱色谱法，(5)葡聚糖凝胶柱色谱法。

上述方法(1)溶剂萃取法，具体操作为取提取步骤中得到的提取液、沉淀步骤中得到水沉滤液、醇沉浓缩液中的一种，适当浓缩后用适量水分散，加酸碱调节pH＝1～8，接着用乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、氯仿，或这些溶剂的组合物萃取，有机部分回收溶剂，即得萃取物。可以采用一步或多步萃取的方法，其中有机溶媒优选的是乙酸乙酯，或乙酸乙酯-乙醇适当比例混合溶剂。

上述方法(2)～(5)为柱色谱方法，具体操作均包含以下步骤：

a、色谱柱的制备；

b、色谱柱的活化；

c、样品上柱、洗脱除杂：将样品溶液加至色谱柱，用水、醇或水与醇类、丙酮、乙腈的适当比例的混合溶剂洗脱除杂；

d、样品的洗脱：除杂后的色谱柱用醇类、丙酮、乙腈或水与醇类、丙酮、乙腈的适当比例的混合溶剂洗脱样品，收集洗脱液；

e、浓缩、干燥。

上述方法(2)～(5)步骤b、色谱柱的活化，方法为采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等任意一种溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂进行活化。

上述方法(2)～(5)步骤c中，洗脱用水中可含微量的酸或无机盐。

上述方法(2)～(5)步骤c中，可以单用水洗脱除杂质，或单用稀醇水溶液或低浓度的丙酮-水的混合溶剂洗脱除杂质；也可先用水洗脱然后再用稀醇水溶液或低浓度的丙酮-水的混合溶剂洗脱除杂质。

上述方法(2)～(5)步骤c中，醇-水的混合溶剂的浓度一般在70％以下，常用为5％～50％，最好用10～30％的浓度，丙酮-水的混合溶剂常用丙酮含量一般在30％以下，常用为5～25％，最好用5～15％的浓度，乙腈-水的混合溶剂常用乙腈含量一般在30％以下，常用为5～25％，最好用10～20％的浓度。

上述方法(2)～(5)步骤d中，适当浓度的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有机相所占比例一般大于10％，常用为20％～100％，最好用40％～100％的浓度。

洗脱过程为，先用低浓度醇或低浓度的丙酮-水溶液洗脱得到丹参酚酸B(含量大于50％，最优为大于80％)，然后再用较高浓度的醇或丙酮溶液等溶剂洗脱得到丹参酚酸A(含量大于50％，最优为大于80％)

洗脱过程也可以为，直接用适当浓度的醇或适当浓度的丙酮-水溶液洗脱得到组合物--丹参酚酸A加B(二者总含量大于50％，最优为大于80％)。

上述方法(2)～(5)步骤e中，由于丹参酚酸类成分对热不稳定，且容易氧化，因此采用低温减压浓缩，喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。

本发明中药活性成分组合物---丹参酚酸A加B的制备方法，以丹参酚酸A和丹参酚酸B两种成分为指标，对提取、除杂、分离纯化等工艺过程进行了比较及研究，提出了优选的0～80％乙醇加热回流提取、两步沉淀除杂。然后通过柱色谱的手段，结合TLC检测手段，分别分离得到含量较高的丹参酚酸B和丹参酚酸A(二者含量均大于50％，最优为大于80％)，再将二者按适当比例混合在一起制得组合物--丹参酚酸A加B，或直接洗脱出活性成分组合物--丹参酚酸A加B(二者总含量大于50％，最优为大于80％)。

本发明优选的制备方法如下：

1)、提取：取丹参饮片，加去离子水或0～20％乙醇10倍量，室温浸泡3小时，然后加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第一次提取液，再加去离子水或0～50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1小时，分离第二次提取液；合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质；

2)、沉淀：将提取液减压浓缩至相对密度1.05～1.35，冷却后，加入2～8倍药材量的去离子水或无水乙醇沉淀，静置，取上清液，减压浓缩得浓缩液；

3)、分离、纯化：浓缩液上预先处理好的非极性至中等极性大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱或反相键合相色谱柱或葡聚糖凝胶柱，上柱样品与树脂量之比为1∶5～200，洗脱方式可采用下面任一种方式：

方式一：先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约10～50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液；

方式二：先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约40～85％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A，在洗脱过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待二者完全洗脱下来，分段收集洗脱液；

4)、浓缩、干燥：按上述方式一得到丹参酚酸A洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物；按上述方式二分段收集洗脱液，分别浓缩、干燥，得到不同比例的丹参酚酸A加B组合物；

5)、取上述丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物适量，混合制成含有丹参酚酸A和丹参酚酸B的组合物，其中二者比例为1∶0.05～20。

本发明的组合物，可以作为药物活性成分，单独或与其它任何中西药物或食品配伍，尤其是与某些具有活血化瘀和/或治疗心脑血管疾病的中药配伍，用于制备药物制剂和功能性保健食品。单独由本发明的组合物制备的药物和功能性保健食品，或由该组合物与其它中西药物或食品配伍组成的复方药物和功能性保健食品，均具有抗动脉粥样硬化、增加冠脉流量、提高心脑组织对缺氧缺血的耐受性、抗血小板凝集、抗血栓等药理活性，可用于预防和治疗心脑血管疾病，如脑梗塞、脑缺血、冠心病、心绞痛、心肌缺血、心肌梗死等。

本发明所述组合物或包含该组合物的药物和食物组合，用于上述医疗和保健目的时，可以按中药制剂常规方法和技术，直接添加必要的辅料，制成：(1)片剂：普通片(素片)、包衣片、口腔崩解片、泡腾片、分散片和缓释片等；(2)胶囊剂：硬胶囊和软胶囊；(3)丸剂：滴丸；(4)注射剂：水针和粉针剂；(5)颗粒剂；(6)口服液等多种制剂成品。

本发明在该组合物及其制剂中添加适当的辅料，如加入抗氧化剂，可以防止丹参酚酸A和B分解变化，抗氧化剂包括各种水溶性的抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂及其混合使用。水溶性的抗氧化剂如Vc、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸盐、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甲醛合亚硫酸氢钠、半胱氨酸、蛋氨酸、硫脲、硫代乙酸、硫代甘油等。脂溶性抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、培酸丙酯(PG)、二丁甲苯酚(BHT)、卵磷脂、生育酚(Ve)等。抗氧化剂的加入量为制剂总量的0.01％-95％。

本发明提供的药物组合物在用于心脑血管疾病时，其注射使用剂量范围是5～1000mg，优选为10～300mg。其口服使用剂量范围是100～6000mg，优选为300～3000mg。

本发明的优点在于提供了可期待用于治疗和预防心脑血管疾病的中药活性成分组合物——丹参酚酸A加B，其化学成分明确，有效成分含量高(主要成分为丹参酚酸A和丹参酚酸B，二者总含量在50.0％以上(最优可达到80％以上)，药效显著。本发明组合物--丹参酚酸A加B的制备方法，工艺成熟、产品质量稳定，可以大规模生产。应用本发明制备方法得到的中药活性成分组合物或包含该组合物的药物和食物组合，加入抗氧化剂，采用常规制剂方法和技术制成各种剂型的制剂成品，质量稳定。对于提高丹参类制剂疗效具有重要的意义。

本发明人进行了下列试验来证实由丹参酚酸A和丹参酚酸B组成的中药活性成分组合物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用，并证实具有协同作用。

试验例1：不同剂量丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物对大鼠心肌缺血损伤的影响

(1)材料：

丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物：按实施例1制备。

复方丹参注射液：贵州神奇制药有限公司。

氯化硝基四氮唑蓝(NBT)。

实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g。

(2)方法与结果：

动物随机分为假手术组(生理盐水)，模型对照组(生理盐水)，复方丹参注射液组(10mg/kg)，丹参酚酸A小剂量组(1.5mg/kg)，丹参酚酸A中剂量组(5mg/kg)，丹参酚酸A大剂量组(15mg/kg)，丹参酚酸B小剂量组(5mg/kg)，丹参酚酸B中剂量组(15mg/kg)，丹参酚酸B大剂量组(45mg/kg)，组合物小剂量组[丹参酚酸A(1.5mg/kg)+丹参酚酸B(5mg/kg)]，组合物大剂量组[丹参酚酸A(15mg/kg)+丹参酚酸B(45mg/kg)]，每组10只。禁食12小时后，ip乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，测肢体II导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及两条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。术后各组动物静脉注射相应药物。记录给药前及给药后1.5h、3h心电图，6h后取出心脏，以冷生理盐水洗净后，-20冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜配制的0.5％NBT磷酸缓冲液(pH 7.4)中。37水浴振摇10～15分钟。用滤纸吸干切片表面的染色液，分离染色部分和未染色部分，称重，计算面积。梗死面积(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。结果如下：

表2不同剂量丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物对大鼠心肌缺血损伤的影响

组别	剂量(mg/kg)	梗死面积(％)	J点升高(10×mv)
						正常	1.5h	3h
			假手术组模型对照组复方丹参注射液组丹参酚酸A小剂量组丹参酚酸A中剂量组丹参酚酸A大剂量组丹参酚酸B小剂量组丹参酚酸B中剂量组丹参酚酸B大剂量组组合物小剂量组组合物大剂量组	生理盐水生理盐水101.5515515451.5+515+45	025.6±4.317.5±6.221.3±7.818.50±3.2*12.50±5.2**23.50±6.319.50±4.1*12.80±4.5**13.7±6.6**#△10.50±2.1***				00.8±0.60.8±0.60.7±0.60.7±0.70.7±0.60.8±0.60.7±0.70.8±0.50.7±0.50.7±0.6	06.5±2.66.1±1.2*6.5±1.35.8±2.0*4.9±1.7**6.4±1.55.9±2.3*5.1±2.5**5.4±1.4*4.2±1.5***	06.3±1.85.6±1.4*5.8±1.65.0±1.7*4.1±1.9**6.0±2.35.6±1.6*4.6±1.7**5.0±1.5*3.5±1.8***

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；组合物小剂量组与丹参酚酸A中剂量组比较^#P＜0.05；组合物小剂量组与丹参酚酸B中剂量组比较^△P＜0.05；n＝10

试验例2：不同剂量丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物对大鼠局部脑缺血损伤的影响

(1)材料：

丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物：按实施例1制备。

红四氮唑：临用前用生理盐水配成4％溶液。

实验动物：普通级SD大鼠，雄性，体重280g-350g。

(2)方法与结果：

以电灼法阻断大鼠大脑中动脉(MCAO)，造成局灶性脑缺血模型，给药后进行神经行为评分、脑片染色观察不同剂量丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物对脑缺血的保护作用，结果如下。

表3不同剂量丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物对大鼠局部脑缺血损伤的影响

组别	剂量(mg/kg)	行为障碍(症状评分)	缺血面积(％)
				假手术组模型对照组尼莫地平组丹参酚酸A小剂量组丹参酚酸A中剂量组	生理盐水生理盐水101.55	011.6±1.57.1±2.6**10.7±3.29.4±1.3*	025.8±4.117.5±5.6**22.5±8.519.5±2.4*

丹参酚酸A大剂量组丹参酚酸B小剂量组丹参酚酸B中剂量组丹参酚酸B大剂量组组合物小剂量组组合物大剂量组

15515451.5+515±45

6.5±2.5**11.2±1.210.5±1.18.5±1.9*8.4±1.31*#△5.5±1.6***

12.2±3.8**21.5±7.220.1±6.4*13.50±4.3**19.50±1.31*10.50±1.31***

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；组合物小剂量组与丹参酚酸A中剂量组比较^#P＜0.05；组合物小剂量组与丹参酚酸B中剂量组比较^△P＜0.05；n＝10

试验例3：丹参酚酸A(DA)和丹参酚酸B(DB)不同配比的组合物对大鼠局部脑缺血损伤的影响

(1)材料：

丹参酚酸A、丹参酚酸B、组合物A～I：按实施例1制备。

组合物J：按实施例2制备的其中1个部分(DA∶DB比例实测为1∶7.5，DA+DB总含量分别为81.4％)。

组合物K：按实施例2制备的其中1个部分(DA∶DB比例实测为1∶20.7，DA+DB总含量分别为85.9％)。

红四氮唑：临用前用生理盐水配成4％溶液。

实验动物：普通级SD大鼠，雄性，体重280g-350g。

(2)方法与结果：

按试验例2所示方法制作大鼠局部脑缺血模型，给药后进行神经行为评分、脑片染色观察丹参酚酸A和丹参酚酸B不同配比的组合物对脑缺血的保护作用，结果如下。

表4丹参酚酸A和丹参酚酸B不同配比的组合物对大鼠局部脑缺血损伤的影响

组别	剂量(mg/kg)	DA∶DB	行为障碍	缺血面积(％)
					假手术组模型对照组组合物A组合物B组合物C组合物D组合物E组合物F	生理盐水生理盐水(DA)10(DA+DB)9.5+0.5(DA+DB)9+1(DA+DB)8+2(DA+DB)5+5(DA+DB)2+8	-------------19∶19∶14∶11∶11∶4	010.6±1.18.2±1.3**7.5±0.9**△7.1±0.8**△7.6±1.3**△7.7±0.6**△8.0±0.5**△	025.4±4.318.4±1.9**17.8±1.5**△17.3±1.1**△18.7±1.7**△18.9±1.5**△19.5±1.7**△

组合物G组合物H组合物I组合物J组合物K

(DA+DB)1+9(DA+DB)0.5+9.5(DB)101010

1∶91∶191∶7.51∶20.7

8.1±0.8**△8.6±1.1*9.1±1.5*8.1±1.0**△8.7±1.3*

19.9±1.8**△21.4±2.1*22.6±3.2*19.4±1.9**△21.5±2.2*

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

与组合物A组比较^#P＜0.05

与组合物I组比较^△P＜0.05

具体实施方式

以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。

实施例1：丹参酚酸A和丹参酚酸B及其组合物的制备方法(分别提取再混合法)

具体工艺步骤如下

1、提取：取丹参饮片，加20％乙醇10倍量，室温浸泡3小时，然后加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第一次提取液，再加50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。

2、沉淀：将提取液减压浓缩至相对密度1.05～1.10，冷却后加入8倍药材量的去离子水，冷藏，静置，取上清液，减压浓缩得浓缩液。

3、分离、纯化：浓缩液上预先处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，上柱样品与树脂量之比为1∶8(W∶W)，先用去离子水洗脱20个柱床体积除杂，继以10％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用85％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液。

4、浓缩、干燥：上述丹参酚酸A洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到丹参酚酸A提取物(收率不少于0.04％，其中丹参酚酸A含量为82.3％)、丹参酚酸B提取物(收率不少于1.5％，其中丹参酚酸B含量为84.5％)。

5、取上述丹参酚酸A提取物(丹参酚酸A含量为82.3％)、丹参酚酸B提取物(丹参酚酸B含量为84.5％)适量，混合制成含有丹参酚酸A和丹参酚酸B的组合物，其中二者比例为1∶0.05～20。

丹参酚酸A和丹参酚酸B的含量测定方法

按照《中国药典》2005年版一部高效液相色谱法(附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59，V/V)，检测波长为286nm。柱温30℃，流速为1.0ml/min。理论板数按丹参酚酸A和丹参酚酸B计算，均应不低于2000。丹参酚酸A和丹参酚酸B与相邻峰分离度均大于1.5。

丹参酚酸A对照品溶液制备  精密称取丹参酚酸A对照品10mg置100ml容量瓶中，加甲醇定容。

丹参酚酸B对照品溶液制备  精密称取丹参酚酸B对照品25mg置50ml容量瓶中，加甲醇定容。

供试品溶液制备  精密称取丹参酚酸A加B粉末约30mg置50ml容量瓶中，加甲醇30ml，超声30min使溶解，甲醇定容，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

测定法  在上述色谱条件下分别取对照品与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪。测定，计算，即得。

实施例2：丹参酚酸A和丹参酚酸B及其组合物的制备方法，(同时提取法)

该方法的其他部分与实施例1相同，柱色谱分离纯化过程不同，柱色谱分离纯化方法如下：

浓缩液上预先处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，上柱样品与树脂量之比为1∶8(W∶W)，先用去离子水洗脱20个柱床体积除杂，继以20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约70％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A，在洗脱过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待二者完全洗脱下来，分段收集洗脱液。分别浓缩、干燥，得到不同比例的丹参酚酸A加B组合物。

实施例3：钠盐衍生物的制备工艺中pH的选择

取上述实施例1所得的丹参酚酸A加B原料100g，溶于500ml水中，加0.01～0.5N的碳酸氢钠溶液分别调节pH至6、7、8、9、10、12、14，充分搅拌后离心，除去不溶物，溶液经减压浓缩、加乙醇至醇浓度80％，静置，滤取沉淀，减压真空干燥即得丹参酚酸A加B的钠盐，计算重量，测定丹参酚酸A钠盐和丹参酚酸B钠盐含量，如表1所示。

          表1钠盐衍生物的制备工艺中pH的考察结果

pH	6	7	8	9	10	12	14
								丹参酚酸A(％)丹参酚酸B(％)A∶B比例A+B总含量(％)A+B总收率	6771∶13833	6761∶138289	7751∶118395	7761∶118394	7741∶118194	2651∶336756	05505537

表1数据显示，丹参酚酸A+B钠盐衍生物的制备工艺中pH的影响很重要：pH＜7，丹参酚酸A加B的钠盐含量和比例没有影响，但是收率很低，应该是有部分丹参酚酸A加B没有成为钠盐；7＜pH＜10，丹参酚酸A加B的钠盐含量和比例没有影响，但是收率很高，说明是丹参酚酸A加B成为钠盐的最佳条件；pH＞10，丹参酚酸A加B的钠盐含量和比例下降明显，而且收率明显下降，说明是丹参酚酸A加B在该条件下发生了分解变化。

实施例4：钠盐衍生物的制备工艺

取上述实施例1或2所得的丹参酚酸A加B原料100g，溶于500ml水中，加0.01～0.5N的碳酸氢钠溶液至pH～8，充分搅拌后离心，除去不溶物，溶液经减压浓缩、加乙醇至醇浓度80％，静置，滤取沉淀，减压真空干燥即得丹参酚酸A加B的钠盐，计99g，丹参酚酸A钠盐和丹参酚酸B钠盐总含量、比例保持不变。

实施例5：丹参酚酸A加B片的制备

丹参酚酸A加B        10g

Vc                  0.2g

淀粉                46g

糊精                44g

硬脂酸镁            3g

上述组分过筛，混匀，制成颗粒，干燥，压制成1000片，包薄膜衣，即得。

实施例6：丹参酚酸A加B复方制剂的制备

丹参酚酸A加B        10g

三七总皂苷          10g

冰片                40g

Vc                  0.2g

可压性淀粉          140g

上述组分混合均匀、装入硬明胶胶囊中，共1000粒。

实施例7：丹参酚酸A加B冻干粉针的制备

取丹参酚酸A加B原料10g，加入3倍量注射用水溶解，加入葡萄糖50g或甘露糖50g或甘氨酸50g，Vc 0.2g或亚硫酸钠0.2g或亚硫酸氢钠0.2g，依地酸钙钠5g或依地酸钠5g，搅拌使完全溶解后，添加注射用水至2000ml，用10％(g/ml)NaOH调整pH值在4-7.5范围，活性炭脱色，0.2μ孔径微孔滤膜滤过或超滤除菌脱热源。在无菌操作下，灌装于3ml灭菌小瓶(每瓶装2ml)内，置冷冻干燥机内冻干，封口，即得。

实施例8：丹参酚酸A加B复方注射液的制备

丹参酚酸A加B钠盐        10g

降香挥发油              1.0g

Vc                      0.2g

上述组分混合均匀注射用水至2000ml，共制成1000支。

实施例9：丹参酚酸A加B钠盐注射液的制备

取上述实施例3所得的丹参酚酸A加B钠盐原料10g，加入3倍量注射用水溶解，Vc 0.2g，搅拌使完全溶解后，添加注射用水至2000ml，用10％(g/ml)NaOH调整pH值在4-7.5范围，活性炭脱色，0.2μ孔径微孔滤膜滤过或超滤除菌脱热源。灌装于3ml灭菌小瓶(每瓶装2ml)内，封口，高压湿热灭菌，即得。

Claims (11)

1、一种含有丹参酚酸A或其盐和丹参酚酸B或其盐的中药活性组合物，两者的重量比例为1∶0.01～100，二者总含量占组合物的比例≥50％。

2、按照权利要求1所述的组合物，其特征在于，丹参酚酸A和丹参酚酸B二者总含量占组合物的比例≥80％。

3、按照权利要求1所述的组合物，其特征在于，两者的重量比例为1∶0.05～20。

4、按照权利要求1所述的组合物，其特征在于，两者的重量比例为1∶1～10。

5、按照权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述盐是丹参酚酸A和丹参酚酸B与钠、钾、镁、钙、锌等形成的金属盐衍生物。

6、根据权利要求1的组合物，其特征在于，所述组合物是将从市场上购买的将丹参酚酸A和丹参酚酸B混合在一起制得的，或从中药丹参及其同科属植物中提取制得的；其中提取制得，经过如下步骤：A、提取，B、水沉和/或醇沉，C、丹参酚酸A和丹参酚酸B组合物的分离、精制；其中所述分离、精制方法选自：(1)溶剂萃取法，(2)大孔吸附树脂柱色谱法，(3)聚酰胺吸附柱色谱法，(4)反相硅胶柱色谱法，(5)葡聚糖凝胶柱色谱法。

7、根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，

其中所述的提取是将丹参药材粉碎成粗粉，加入0～80％乙醇，采用加热回流、煎煮、浸渍、渗漉、超声提取、微波提取或高压提取，分离提取液，过滤、自然沉降或离心除去提取液中的固体杂质；

其中所述的水沉是将合并后提取液减压浓缩，浓缩液冷却后加入2～8倍药材量的去离子水，冷藏，静置，过滤得滤液；

其中所述的醇沉是滤液减压浓缩，冷却后加入2～8倍药材量的无水乙醇，调解醇浓度为50～85％进行醇沉，静置，取上清液，减压浓缩、干燥，即得总丹参酚酸提取物；

其中所述的分离、精制方法，其中方法(2)～(5)为柱色谱法，均包含以下步骤：

a、色谱柱的制备；

b、色谱柱的活化，方法为采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等任意一种溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂进行活化；

c、样品上柱、洗脱除杂：将样品溶液加至色谱柱，用水、醇或水与醇类、丙酮、乙腈的适当比例的混合溶剂洗脱除杂；

d、样品的洗脱：除杂后的色谱柱用醇类、丙酮、乙腈或水与醇类、丙酮、乙腈的适当比例的混合溶剂洗脱样品，收集洗脱液；

e、浓缩、干燥：低温减压浓缩，喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。

8、根据要求7所述的组合物，其特征在于，其中所述的d、样品的洗脱过程采用梯度的方法，先用低浓度醇或低浓度的丙酮-水溶液洗脱得到丹参酚酸B，然后再用较高浓度的醇或丙酮溶液等溶剂洗脱得到丹参酚酸A；或直接用适当浓度的醇或适当浓度的丙酮-水溶液洗脱得到组合物--丹参酚酸A加B。

9、根据要求7所述的组合物，其特征在于，其中所述的步骤c中，醇-水的混合溶剂的醇含量在70％以下，丙酮-水的混合溶剂常用丙酮含量在30％以下，乙腈-水的混合溶剂常用乙腈含量在30％以下，所述的步骤d中，适当比例的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有机相所占比例为20％～100％。

10、根据要求6所述的组合物，其特征在于，其中所述的提取制得，经过如下步骤

1)、提取：取丹参饮片，加去离子水或0～20％乙醇10倍量，室温浸泡3小时，然后加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第一次提取液，再加去离子水或0～50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1小时，分离第二次提取液；合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质；

2)、沉淀：将提取液减压浓缩至相对密度1.05～1.35，冷却后，加入2～8倍药材量的去离子水或无水乙醇沉淀，静置，取上清液，减压浓缩得浓缩液；

3)、分离、纯化：浓缩液上预先处理好的非极性至中等极性大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱或反相键合相色谱柱或葡聚糖凝胶柱，上柱样品与树脂量之比为1∶5～200，洗脱方式可采用下面任一种方式：

方式一：先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约10～50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液；

方式二：先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约40～85％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A，在洗脱过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待二者完全洗脱下来，分段收集洗脱液；

4)、浓缩、干燥：按上述方式一得到丹参酚酸A洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物；按上述方式二分段收集洗脱液，分别浓缩、干燥，得到不同比例的丹参酚酸A加B组合物；

5)、取上述丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物适量，混合制成含有丹参酚酸A和丹参酚酸B的组合物，其中二者比例为1∶0.05～20。

11、权力要求1所述的组合物在制备治疗或预防心脑血管疾病、脑损伤或心肌缺血的药物中的应用。