CN1928118A - 无需核酸标记的基因芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无需核酸标记的基因芯片，它包括：固定在固相载体上的DNA－RNA－DNA探针。本发明还公开了应用上述基因芯片进行检测的方法以及该芯片在临床检测诊断中的应用。本发明的基因芯片具有高效的信号放大作用，不仅使基因组DNA易于直接进行芯片检测，而且大幅提高低表达基因的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种无需核酸标记的基因芯片；此外，本发明还涉及应用该基因芯片进行检测的方法。
背景技术
基因芯片是人类基因组计划带来的最具应用价值的科研成果，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。随着微加工技术的发展，高密度寡核苷酸芯片最高密度可达上百万个探针，因此基因芯片通量水平并不受芯片技术本身制约，而是受样本的处理和基因芯片设计方法的限制。在人类基因组，常见的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点超过1000万个，占总SNP位点的90％(The International HapMap Consortium.The International HapMap Project.Nature.2003；426：789-96)。虽然单倍型(haplotype)可经由少数几个标签(tag)SNPs来测定，但对个体间的常见变异进行基因定位大约需要几十万个标签SNPs，其数目随不同的群体而有所不同(Gabriel SB，Schaffner SF，Nguyen H，et al.The structure of haplotype blocks in the humangenome.Science.2002；296：2225-9；Stephens JC，Schneider JA，Tanguay DA，et al.Haplotype variation and linkage disequilibrium in 313 human genes.Science.2001；293：489-93)。因此通过连锁不平衡(linkage disequilibrium)定位致病变异，即使最保守估计，全面关联研究(association study)所需的SNP遗传标记的数量约在几十万个。尽管Affymetrix公司的SNP芯片单引物扩增技术由于受酶切位点所限，不能检测位于较长和较短的限制性酶切片段中的SNPs，但该技术单管反应的多重水平可达1～25万(Matsuzaki H，Loi H，Dong S，et al.Parallelgenotyping of over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-densityoligonucleotide array.Genome Res.2004；14：414-25；Matsuzaki H，Dong S，LoiH，et al.Genotyping over 100，000SNPs on a pair of oligonucleotide arrays.Nat Methods.2004；1：109-11)，因而SNP数量可在一定程度上弥补其信息量不足的缺陷，是当前唯一能基本达到全基因组关联研究的SNP分型技术。然而，单引物扩87yyu增技术不能特意地分析所选择的SNPs，不适用于定制芯片，难以应用于临床检测诊断。这也反应在其与罗氏公司合作开发的AmpliChip CYP450，该芯片仅含CYP2D6和CYP2C19两个基因一些常见的基因型，CYP3A4等其它重要的药物代谢酶基因均未包含在内，并采用多重PCR技术扩增目的DNA片段(Chou WH，Yan FX，Robbins-WeilertDK，et al.Compari son of two CYP2D6genotyping methods and assessment ofgenotype-phenotype relationships.Clin Chem.2003；49：542-51)。其它高通量的扩增技术有GoldenGate、分子倒置探针(molecular inversion probes)和多重PCR等，单管反应的多重水平约在2000左右，但由于受靶DNA对引物的竞争和引物之间的反应等问题，这些技术的多重水平的提升空间显然非常有限，DNA处理成为了SNP芯片的瓶颈所在。高通量SNP芯片在临床诊断中的应用，仍有赖于DNA处理、芯片设计等方面的发展。
直接用基因组DNA进行SNP分型显然可以避开DNA扩增这一问题，并能同时对几百万的SNPs进行分型。低等生物的基因组复杂性较低，已成功地利用芯片直接对基因组DNA进行了多态分析，这些生物包括酵母(基因组DNA约为12Mb)(Winzeler EA，Richards DR，Conway AR，et al.Direct allelic variation scanning of the yeastgenome.Science.1998；281：1194-7)和拟南芥(基因组DNA约为120Mb)(BorevitzJO，LiangD，PlouffeD，etal.Large-scale identification of single featurepolymorphisms in complex genomes.Genome Res.2003；13：513-23)。然而，人类基因组DNA虽已成功地应用于cDNA、BAC和寡核苷酸芯片比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)芯片(Ishkanian AS，Malloff CA，Watson SK，et al.A tiling resolution DNA microarray with complete coverageof the human genome.Nat Genet.2004；36：299-303)，但由于人类基因组DNA的高度复杂性，直接进行SNP分析的难度显然要高于低等生物，从约30亿碱基对序列中鉴别一个SNP仍是一项艰巨的挑战工作。通过近几年的研究，已有几种技术可以对人类基因组DNA进行SNP分型，包括胶体金检测技术、侵入切割(invasive cleavage)、侵入切割结合滚环扩增(rolling circle amplification)和等位基因特异性引物延伸法(allele-specific primer extension)结合信号级联放大等技术，但这些技术普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作复杂或低多重水平等缺点，它们在疾病基因组学和药物基因组学等领域和临床诊断方面的应用，尚有待于进一步的发展和完善。另一方面，人类基因组约有2-2.5万个基因，涵盖这些人类基因组所有的基因和表达序列标签对于目前的表达谱芯片技术虽然简单，但却往往无法检测出表达水平低下的基因，即使应用RNA线性扩增技术也无法解决。提高探针长度可在一定程度上提高检出率，然而探针长度增加的同时，探针局部序列的特异性也大为降低，从而造成假阳性率大为增高。低表达基因检出率低下的问题，是当前表达谱芯片急需解决的问题之一。
鉴于核酸扩增技术不足以解决基因表达谱和SNP芯片存在的问题，如何放大荧光信号将是提高芯片检测能力的关键所在。级联放大由于放大倍数有限，显然不如侵入切割，这也反应在基于这两种技术的基因组DNA直接进行SNP分型所用的DNA量(Gunderson KL，Steemers FJ，Lee G，et al.A genome-wide scalable SNPgenotyping assay using microarray technology.Nat Genet.2005；37：549-54)。侵入切割对靶DNA序列的检测是通过荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)来实现。所谓的FRET是供体荧光基团受激发光照射后将能量非反射性转移到邻近的另一受体荧光基团或淬灭基团，使后者以其自身特有的发射光波长将能量释放出去或转变成热能散发出来，其转递效率与两荧光是否处于最大的发射-吸收光谱范围内和两者间的距离有关(Ozaki H，McLaughlin LW.The estimationof distances between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescenceresonance energy transfer.Nucleic Acids Res.1992；20：5205-14)。侵入切割是依据副翼核酸内切酶(flap endonucleases，FEN)的酶切特性来设计一条侵入探针和两条SNP等位基因特异性探针，将多态性位点置于侵入探针和等位基因特异性探针之间的重叠处(Olivier M.The Invader assay for SNP genotyping.Mutat Res.2005；573：103-10)。这样等位基因特异性探针的5’端就如同在侵入探针的侵入下而呈翼状探出，进而被FEN切下，导致5’端的荧光基团和内部的淬灭基团分离，从而产生荧光信号。一旦杂交的等位基因特异性探针被FEN切割后，残留的探针片段脱落离开后，新的未切割的等位基因特异性探针又可结合到同一位点上，从而达到信号放大的目的。这种设计在90分钟内，每个靶DNA序列的切割率大约在3000个探针分子(Lyamichev V，Mast AL，Hall JG，et al.Polymorphism identification andquantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotideprobes.Nat Biotechnol.1999；17：292-6)，高效的信号放大作用使得基因组DNA不经扩增可直接进行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，并且探针设计较为复杂，其在SNP芯片中的最终应用尚有待于进一步发展和完善。
循环探针技术(cycling probe technology，CPT)是另一种对靶DNA信号进行放大的技术(Duck P，Alvarado-Urbina G，Burdick B，et al.Probe ampl ifier system basedon chimeric cycling oligonucleotides.Biotechniques.1990；9：142-8)。CPT探针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体，长约25-30个碱基，内含4-6个连续的嘌呤核苷酸。其原理是在等温反应中，探针与单链靶DNA序列杂交后，在核糖核酸酶H(RNase H)的作用下，DNA-RNA-DNA探针中的RNA部分被特异性切割。RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，该酶不能消化单链RNA、单链或双链DNA。由于酶切后的探针片段的退火温度远低于反应温度，切割后的CPT探针的两端DNA部分也随之从靶DNA序列上脱落下来，使得靶DNA序列又可以与完整的探针结合，从而提高了靶DNA序列的使用率。因此，每条靶DNA序列能与许多条完整探针杂交结合，从而产生很多切割的探针片段，其量随着时间而堆积，呈线性扩增。通过结合凝胶电泳或免疫学检测分析，CPT已被成功地应用于细菌及耐药检测。由于CPT具有线性扩增的特性，在探针的两端DNA序列分别标记上荧光基团和淬灭基团，就可对荧光信号进行放大，达到实时定量检测的目的。并且RNase H对DNA-RNA-DNA探针的切割存在着序列依赖性，只有RNA部分与靶DNA序列完全匹配的探针才能被切割，因此CPT也可用于SNP检测。
与侵入切割一样，CPT最大的特点就是不需要这种链式的扩增反应，它们是对DNA或者RNA的信号进行扩增。并且由于不需要链式扩增过程，整个反应过程只要控制在探针的退火温度，不需要像PCR那样反复升温、降温，因此可以节省很多时间。并且CPT与PCR不同，它们不是放大的靶DNA序列被检测，因此可减少由于PCR自身污染造成的假阳性。只有当特异的DNA存在时，这种方法才能使信号分析累积，并可用多种仪器检测。相比于侵入切割，CPT仅设计一条序列特异性探针或两条等位基因特异性探针，设计较为简单，所能检测的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切后的探针片段中能与靶DNA序列互补的序列长度仅比完整的探针少一个碱基，探针片段和完整的探针与靶DNA序列的退火与分离的动力学基本一致，两者与靶DNA序列的结合存在着竞争。而CPT探针与靶DNA序列结合后，是被RNase H从中间部分切开，酶切后的探针片段的退火温度远低于反应温度，脱落的探针片段不太可能再结合到靶DNA序列上，这使得CPT的信号放大效应远高于侵入切割。因此，若将CPT应用于基因芯片中，产生的信噪比将明显优于侵入切割，能大幅提高低表达基因的检出率，并降低基因组DNA直接进行SNP分型的难度，更加适用于高通量、大规模的核酸检测。
当前SNP芯片和表达谱芯片的技术已较为完善，但远不能满足生物医学研究和临床检测诊断所需。在不影响准确率的情况下，如何提高表达水平低下的基因的表达谱芯片检出率，如何将基因组DNA以最少的量直接应用于SNP芯片检测，一直是当今基因芯片技术的难点所在。虽然核酸扩增或级联放大能在一定程度上提高荧光信号，但这些技术不能根本性解决这些问题，并且操作相对较为复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种无需核酸标记的基因芯片，该芯片改变传统的每个靶DNA序列只与一条探针杂交的策略，通过将基因芯片技术与CPT结合，从增加每条靶DNA序列所能杂交的探针数目来提高每条靶DNA序列的使用率，以有效放大荧光信号。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用上述基因芯片进行检测的方法。
本发明要解决的技术问题之三是提供上述基因芯片在临床检测诊断中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种无需核酸标记的基因芯片，它包括：固定在固相载体上的DNA-RNA-DNA探针。
本发明中所述固相基质可选用领域周知的基质，只要所述基质与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相基质选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
所述探针两端的DNA序列分别标记上荧光基团和淬灭基团，且在标记上荧光基团的DNA序列端通过连接分子固定探针于固相载体上。
所述探针的序列与靶DNA序列互补，优选所述RNA序列与靶DNA序列完全互补，该RNA序列不与探针的DNA序列互补。
所述探针的退火温度为37～75℃，所述探针两端的DNA序列的退火温度比探针的退火温度至少低10℃。
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。
本发明基因芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针和固定化对照探针。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
在本发明的另一方面，提供了一种应用权利要求1所述的基因芯片进行检测的方法，包括如下步骤：1)抽提待测样品核酸；2)选取权利要求1所述的基因芯片；3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入样品核酸和含RNase H酶的杂交液，并使其反应足够时间；4)洗涤后检测杂交反应的结果。
本发明中的RNase H酶包括耐高温和不耐高温RNase H酶，耐高温RNase H酶在变性前后均可加入，而不耐高温RNase H酶在变性冷却后加入。
所述的杂交温度为25℃～72℃，所述杂交时间为5分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。
所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有0～3％(w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如1～30分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42℃。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。
在本发明的另一方面，还提供了本发明的基因芯片在临床检测诊断中的应用。
本发明的基因芯片具有高效的信号放大作用，使核酸样本不需任何荧光标记即可用于芯片杂交检测，使基因芯片的检测能力达到新的高度，不仅降低基因组DNA直接进行SNP等方面的芯片检测难度，而且大幅提高表达谱芯片中表达水平低下的基因的检出率，此外，由于不用进行繁琐的核酸处理，操作更简单，通量水平更高，费用也更低廉。
附图说明
图1是本发明的芯片杂交与信号放大的原理图；
图2是本发明实施例2的芯片杂交结果图；
图3是本发明实施例4的芯片杂交结果图；
图4是本发明实施例5的芯片杂交结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1探针设计和基因芯片的制备
1.探针设计：探针的设计标准如下：1)所选择的基因或SNP位点侧翼的序列经Blast，排除序列特异性差的基因序列或SNPs，以免造成非特异性杂交；2)SNP位点处于RNA序列中，并位于探针的中间部分；3)探针退火温度48-60℃之间，两端DNA部分的退火温度比整条探针至少低15℃，使酶切后的探针片段与靶DNA序列分离；4)探针自身互补序列不超过3个碱基对，并且探针之间不得形成二聚体，特别是RNA序列，以免产生高荧光背景；5)进行SNP Blast，确保探针序列在目的SNP位点外，无其他多态位点，以免影响杂交效率。
2.芯片的制备：
(1)探针溶解
探针合成，先在探针的5’端加上一段连接臂，再将每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
(2)点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上，同时设立阳性和阴性对照。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样的格式为1×3，每个矩阵为8×18，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
实施例2
1.目的基因扩增
(1)引物序列：
引物1F 5’-gtcgcaacctggtgcctataa-3’(SEQ ID NO：1)；
引物1R 5’-tgctataagccagctgagagattt-3’(SEQ ID NO：2)；
引物2F 5’-aagccaaggctatgacattct-3’(SEQ ID NO：3)；
引物2R 5’-aattcccggagaacttgtgct-3’(SEQ ID NO：4)。
(2)探针序列：CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为RNA序列
rs13431727-A
5’-NH2-C18-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3’(SEQ ID NO：5)；
rs13431727-T
5’-NH2-C18-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3’(SEQ ID NO：6)；
rs13431727-C
5’-NH2--C18-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3’(SEQ ID NO：7)；
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5’-NH2-C18-ggaaatgt(Cy3)(TATC)a(ECLIPSE)aattatctg-3’(SEQ ID NO：8)；
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5’-NH2--C18-ggaaatgt(Cy3)(TCTC)a(ECLIPSE)aattatct-3’(SEQ ID NO：9)；
rs1146808-C
5’-NH2--C18-ggaaatgt(Cy3)(TGTC)a(ECLIPSE)aattatct-3’(SEQ ID NO：10)。
用SEQ ID NO：1～4所示序列的引物进行PCR扩增，在60μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tri s-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 60ng，Taq酶1.2U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，MattickJS.’Touchdown’PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，19：4008]：94℃变性5mins；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸30s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5mins。
2.PCR产物单链化处理
取上述PCR产物5μl，进行扩增，反应体系含0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、下游引物的浓度0.16μM和Taq酶0.6U(Takara)。PCR循环参数：94℃变性5min；然后94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，共35个循环。
PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化：
1)加入5倍PCR产物体积的缓冲液PB，混匀，无需去除石蜡油或煤油。
2)将QIAquick离心柱放置于试剂盒提供的2ml收集管子中。
3)将样本加入QIAquick离心柱中，离心30-60s，以结合DNA。
4)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中。
5)将0.75ml缓冲液PE加入到QIAquick离心柱中进行洗涤，离心30-60s。
6)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中，离心1min。
7)将QIAquick离心柱放置于高压灭菌的1.5ml的离心管子中。
8)在QIAquick膜中央加入50μl缓冲液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脱DNA，离心1min。另外，为了提高DNA的浓度，也可在QIAquick膜中央加入30μl洗脱缓冲液，静置1min，然后离心。
3.杂交和洗涤
PCR产物95℃变性10分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于杂交。杂交体系：275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，15U RNase H，200ng纯化PCR产物。60℃温浴240分钟。芯片杂交与信号放大的原理如图1所示。然后用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH2O洗涤15秒。
洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图2所示，再用6enePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断目的序列。
实施例3
1.不对称PCR
利用实施例2的引物和探针序列进行不对称PCR扩增，在60μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上游引物的浓度0.16μM、上游引物的浓度0.008μM、基因组DNA 60ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH，Cox PT，WainwrightBJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCR to circumvent spurious priming duringgene amplification.Nucleic Acids Res.1991，19：4008]：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用QIAquick PCR PurificationKit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化，操作按实施例2所述的步骤。
2.杂交和洗涤
PCR产物95℃变性10分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于杂交。杂交体系：275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，15U RNase H，200ng纯化PCR产物。60℃温浴240分钟。然后用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH2O洗涤15秒。
洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果图，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断目的序列。
实施例4
1.总RNA抽提(TRIzol法)
(1)100mg甲状腺组织可以加入1ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。
(2)加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。
(3)4℃，12,000rpm离心15分钟后小心将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟。
(4)4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15分钟。
(5)去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定A260和A280值。
2.cDNA探针的制备
(1)从-70冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液。
总RNA 5μg
随机引物6聚体(5μg/μl) 1μl
10mM dNTP mix 1μl
无核酸酶的水 Xμl(补充水至12μl)
总体积 12μl
(2)70℃预变性10min，立即置于冰上冷却2min，随后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系
5×first-strand buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNA抑制剂 1μl
总体积 19μl
42℃保温2min后加入1μl Superscript II(200U/μl)(Invitrogen，USA)。
(3)42℃保温2小时，70℃变性10min。
3.杂交和洗涤
探针序列：CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为RNA序列
rs13431727-A
5’-NH2-C18-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3’(SEQ ID NO：5)；
rs13431727-T
5’-NH2-C18-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3’(SEQ ID NO：6)；
rs13431727-C
5’-NH2--C18-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3’(SEQ ID NO：7)；
cDNA于95℃变性10分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于杂交。杂交体系：275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，20U RNase H，15μg cDNA。60℃温浴360分钟。然后用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH2O洗涤15秒。
洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断目的序列。
实施例5DNA直接杂交
探针序列：CY3是荧光基团，ECLIPSE是淬灭基团，中间括号内大写碱基序列为RNA序列
bla2 5’-NH2-C18-cttgtcga(Cy3)(TTCTT)C(ECLIPSE)ttgggat(SEQ ID NO：11)
blaZ 5’-NH2-C18-gccaagag(Cy3)(GTAAT)G(ECLIPSE)aaggaa(SEQ ID NO：12)
EH10 5’-NH2-C18-ccatctcg(Cy3)(AAAAA)A(ECLIPSE)cggtgaa(SEQ ID NO：13)
EH1 5’-NH2-C18-tcagtaccta(Cy3)(AAAGA)T(ECLIPSE)attcagct(SEQ ID NO：14)
抽提的DNA用DNase I进行片段化，反应体系包括：
37℃温浴5min，然后95℃15min。
片段化产物95℃变性10分钟，立即置于冰上，加入RNase H混匀，用于杂交。
杂交体系：275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3@25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，10U RNase H。50℃温浴120分钟。然后用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗涤5分钟，最后用ddH2O洗涤15秒。
洗涤后的芯片，经甩干后，即可用激光扫描仪进行扫描(这里用的是GenePix4000B共聚焦激光扫描仪，也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图4所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以判断目的序列。
序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>无需核酸标记的基因芯片及其应用
<130>NP-10707
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>引物
<400>1
gtcgcaacct ggtgcctata a 21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>2
tgctataagc cagctgagag attt 24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
aagccaaggc tatgacattc t 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
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<210>6
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<222>(7)..(7)
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<220>
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<222>(16)..(16)
<400>14
tcagtaccta aaagatattc agct 24
Claims (10)
1.一种无需核酸标记的基因芯片，其特征在于，它包括：固定在固相载体上的DNA-RNA-DNA探针。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述探针两端的DNA序列分别标记上荧光基团和淬灭基团，且在标记上荧光基团的DNA序列端通过连接分子固定探针于固相载体上。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述探针的退火温度为37～75℃，所述探针两端的DNA序列的退火温度比探针的退火温度至少低10℃。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
5.一种应用权利要求1所述的基因芯片进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)抽提待测样品核酸；2)选取权利要求1所述的基因芯片；3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入样品核酸和含RNase H酶的杂交液，并使其反应足够时间；4)洗涤后检测杂交反应的结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的待测样品核酸为单链或双链的DNA或RNA。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的样品核酸为单链或双链的DNA，优选单链DNA。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中杂交温度为25℃～72℃，杂交时间为5分钟～18小时。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的RNase H酶包括耐高温和不耐高温RNase H酶。
10.权利要求1所述的基因芯片在临床检测诊断中的应用。
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| CN 200610029663 CN1928118A (zh) | 2006-08-02 | 2006-08-02 | 无需核酸标记的基因芯片及其应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181519A (zh) * | 2011-02-16 | 2011-09-14 | 上海交通大学 | 利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法 |
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| CN113073152A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-06 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种用于检测乙型流感病毒的lamp引物、探针、试剂盒 |
| CN113106089A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-13 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种用于检测甲型流感的引物探针组合的恒温扩增试剂盒 |
| CN114196746A (zh) * | 2016-02-10 | 2022-03-18 | 密歇根大学董事会 | 核酸的检测 |
-
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- 2006-08-02 CN CN 200610029663 patent/CN1928118A/zh active Pending
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20070314 |