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CN101067149A - Cyp3a检测芯片及其应用 - Google Patents

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CN101067149A CN 200610119553 CN200610119553A CN101067149A CN 101067149 A CN101067149 A CN 101067149A CN 200610119553 CN200610119553 CN 200610119553 CN 200610119553 A CN200610119553 A CN 200610119553A CN 101067149 A CN101067149 A CN 101067149A
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Abstract

本发明涉及药物基因检测芯片，公开了一种CYP3A检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明还公开了所述芯片用于检测CYP3A基因的方法。本发明的CYP3A检测芯片能有效检测分型CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7的遗传变异，对临床常用药物的治疗效应做出预测，以实现个性化医疗。

Description

CYP3A检测芯片及其应用
技术领域
本发明涉及药物基因检测芯片，尤其涉及一种CYP3A(cytochrome P450 3A，细胞色素P450 3A)检测芯片及其应用。
背景技术
CYP3A是人体肝脏和小肠中含量最丰富的CYP亚家族，包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。CYP3A43是最后一位被鉴定的CYP3A家族成员，被认为对肝脏CYP3A表达贡献不大，人体肝脏和小肠中绝大部分的CYP3A是CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7。CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7参与了大约50％常用药物在体内的代谢[Wojnowski L，Kamdem LK.Clinical implications of CYP3A polymorphisms.Expert Opin Drug Metab Toxicol.2006，2：171-182]，如免疫抑制剂、肿瘤化疗药、降脂药、钙离子通道阻断剂、镇定剂等药物。此外，还参与部分前致癌物的活化。因此CYP3A活性的个体差异对于大多数药物的代谢和药物动力学具有重大影响。虽然环境和药物也可引起CYP3A活性的个体差异，然而在更大程度上是受遗传因素的影响[Rodriguez-Antona C，Ingelman-Sundberg M.Cytochrome P450 pharmacogenetics and cancer.Oncogene.2006，25：1679-1691]。
许多遗传变异能改变CYP基因的表达水平或其编码的酶活性，导致这些酶底物的药物动力学的显著性改变，从而产生严重的毒副作用或导致治疗无效。根据P450的酶活性，可以将个体的表型分为慢代谢型(poor metabolizer，PM)、中间代谢型(intermediate metabolizer，IM)、快代谢型(extensive metabolizer，EM)或超快代谢型(ultrarapid metabolizer，UM)。EM被定义为野生型的纯合子个体，携带一个活性等位基因和一个无效等位基因的杂合子个体为IM，携带二个缺陷性等位基因的个体为PM，UM通常携带有多个拷贝的活性等位基因。PM使药物灭活较缓慢，导致血浆药物浓度过高，因此较容易产生毒副作用，而UM使药物快速灭活，引起血浆药物浓度过低而没有疗效。由于无法对大多数人进行基因分型，对于特定药物的治疗反应往往难以预测。例如，相比于EM个体，常规剂量服用文拉法新引发的心血管毒性和三环类抗抑郁剂产生的毒副作用[Bertilsson L，Dahl ML，Dalen P，Al-Shurbaji A.Molecular genetics of CYP2D6：clinical relevance with focus on psychotropicdrugs.Br J Clin Pharmacol，2002，53：111-122]在PM个体中更为常见。在使用质子泵抑制剂和阿莫西林治疗幽门螺杆菌感染时，其治愈率取决于患者CYP2C19的代谢表型。EM患者使用奥美拉唑的治愈率是28.6％，IM患者为60％，PM患者为100％，而这种疗效差异在使用三联药物(质子泵抑制剂，阿莫西林和克拉霉素或甲硝唑)治疗时较小[Wilkinson GR.Drug metabolism and variability among patients in drugresponse.N Engl J Med，2005，352：2211-2221]。标准治疗方案无效的患者可能是UM，通常需加大剂量才能治愈。显然，根据基因型-表型的分类调整药物剂量有助于提高药物的疗效和减少ADR(药物不良反应)，特别是那些治疗指数低、安全范围窄的药物。
CYP3A4是成人肝微粒体CYP中最重要的成分，约占CYP总量的30-40％，居第一位，并且CYP3A4对许多药物的特异性要高于CYP3A5和CYP3A7。至今大约有40个等位基因被鉴定。CYP3A4*1B在高加索人中的频率为3.6-9.6％，黑人中的频率为53-67％，不存在东方人中。CYP3A4*1B与一些肿瘤的易感性和进展等相关，但功能研究未发现有CYP3A4*1B与其底物药物动力学之间的相关性，因此推测认为CYP3A4*1B与肿瘤的易感性和进展等相关的多态紧密连锁。CYP3A4基因缺陷性等位基因有CYP3A4*8、CYP3A4*11、CYP3A4*13、CYP3A4*16和CYP3A4*17，无效等位基因有CYP3A4*20，而CYP3A4*18A编码的酶活性较CYP3A4.1高，但这些等位基因的频率均较低。由于大多数CYP3A4等位基因没有功能效应，或是非常罕见不足以造成CYP3A4基因表达的显著性个体差异，CYP3A4基因的多态性无法解释其表达的高度可变性。孕烷X受体(pregnane Xreceptor，PXR)基因调节CYP3A4基因的转录，其多态性可引起CYP3A4表达水平的改变，可能是CYP3A4表达个体差异的原因之一[Bosch TM，Meijerman I，Beijnen JH，Schellens JH.Genetic polymorphisms of drug-metabolising enzymes and drugtransporters in the chemotherapeutic treatment of cancer.Clin Pharmacokinet.2006，45：253-285]。另一个原因可能是CYP3A4和CYP3A5基因的遗传变异之间存在很强的连锁不平衡。
CYP3A5基因的表达是高度多态性的，约10-20％高加索人、33％日本人及55％美国非洲裔具有较容易检测的表达水平，这些人肝脏中的CYP3A5约占CYP3A总量的6-99％[Lamba JK，Lin YS，Schuetz EG，Thummel KE.Genetic contribution to variablehuman CYP3A-mediated metabolism.Adv Drug Deliv Rev，2002，54：1271-1294]。CYP3A5多态性表达主要是由于第3个内含子中的一个SNP 6986A＞G(CYP3A5*3)所致，该SNP虽然能引起异常剪切，但仍有少量的功能性蛋白被翻译，因此CYP3A5*3是低表达等位基因。CYP3A5*3在高加索人、亚洲人和非洲人中的发生率分别是88％，75％和35％。其它的缺陷性等位基因尚有CYP3A5*6、CYP3A5*8、CYP3A5*9、CYP3A5*10和CYP3A5*11等，其中CYP3A5*10和CYP3A5*11均与SNP 6986A＞G连锁，处于同一个单倍型(haplotype)中。由于CYP3A5*6和CYP3A5*7在非洲人和美国非洲裔中的频率较高(10-20％)，有必要通过单倍型分析确定这2个SNP是否与CYP3A5*3存在于同一个单倍型中。
由于缺乏特异性抗体，CYP3A7一直被误认为仅存在胎儿肝脏中。与CYP3A5相似，CYP3A7的表达亦呈现为多态性，约10-20％高加索人为CYP3A7高表达者。在CYP3A7高表达者中，CYP3A7的量约占CYP3A总量的9-36％，可能与CYP3A5高表达者的CYP3A5酶量相当，甚或超过。主要的CYP3A7等位基因有CYP3A7*1C、CYP3A7*1B、CYP3A7*2和CYP3A7*3。CYP3A7*1C和CYP3A7*1B能提高CYP3A7基因的转录活性，两者大约与67％高加索人CYP3A7高表达者相关。CYP3A7*2不影响基因表达，但其编码的酶的催化活性明显高于CYP3A7.1，CYP3A7*2在白人、沙特阿拉伯人、中国人和坦桑尼亚人中的频率分别为8％、17％、28％和62％[Rodriguez-Antona C，Jande M，Rane A，Ingelman-Sundberg M.Identification and phenotype characterization of two CYP3A haplotypes causingdifferent enzymatic capacity in fetal livers.Clin Pharmacol Ther，2005，77：259-270]。CYP3A7*3等其他等位基因对基因表达和酶活力的影响尚不清楚。
CYP基因的多态性是造成个体对药物治疗反应的差异的主要原因之一，因此若能将药物遗传学的研究结果应用于疾病治疗，通过检测患者的CYP基因的遗传变异，使临床医生获得病人的遗传信息，以判断哪些药物治疗有效，有针对性地使用药物和剂量，有效地提高药物的疗效和降低药物的毒副作用，从而有望大幅降低医疗费用。而对于医药企业，根据药物遗传学和药物基因组学的信息，以及药物靶点和药物代谢的途径，选择合适的临床试验的人群，以提高药物对疾病治疗的疗效，缩短药物的研究与开发的周期，提高药物的临床批准率；根据本国人的遗传结构，进行药物衍生物或同类药物开发。
检测单个CYP基因的遗传变异，由于所能分型的基因型有限，临床检测诊断的实用性较低。只有集合CYP超基因家族中多个重要基因的遗传变异，尽可能分型所有功能相关基因型，方能对个体的代谢表型做出准确预测，达到临床检测诊断的目的。并且由于CYP基因的高度多态性，所涉及的遗传变异在几十至几百不等，显然传统的检测方法由于通量水平低，难以应用于个性化医疗中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种CYP3A检测芯片，能有效检测分型CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7的遗传变异，由此获取的个体代谢表型，能辅助医生及时找到正确的用药方案。为此，本发明还要提供应用该芯片检测CYP3A基因的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种CYP3A检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
所述待测CYP3A基因包括CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因。
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度是没有限制的，只要能完成特异性杂交的功能，与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。如果所述探针中可能还有一定程度的错配碱基，则所述探针可以加大长度来抵消错配碱基的不利影响，以提高杂交效率。
本发明检测芯片的探针为DNA，包括：(1)与待测CYP3A4基因杂交的(a)SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：30所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：30所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：30所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测CYP3A5基因杂交的(a)SEQ ID NO：31～SEQ ID NO：63所示序列，(b)SEQID NO：31～SEQ ID NO：63所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：31～SEQID NO：63所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测CYP3A7基因杂交的(a)SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示序列，(b)SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：109所示序列。
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
所述探针可用多种方法固定于载体上，如点样法(USA Patent No.5288514，USAPatent No.5556752)、光介导法(USA Patent No.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USA Patent No.5541061)等。所述探针可以通过化学或物理的方法，固定于载体上，如通过离子键、共价化合或其它已知的力吸附在载体上，如可用紫外交联仪将所述探针固定于载体上。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。
在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片检测CYP3A基因的方法，包括如下步骤：
(1)在固相载体表面点载与待测CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；
(2)抽提待测CYP3A基因的核酸；
(3)制备待测CYP3A基因的目的核苷酸序列；
(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述芯片检测CYP3A基因的方法，包括如下步骤：
(1)标记与待测CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；
(2)抽提待测CYP3A基因的核酸；
(3)制备待测CYP3A基因的目的核苷酸序列；
(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
本发明的方法中所述合适样品包括：来自于人类和动物的血液、唾液、毛发及其它任何含有核酸的组织、以及来自植物和环境产物(如泥土或水)的样品。
样本的核酸能用任何合适的方法从样品中被抽提出来。例如，样本核酸能用磁珠从样品中抽提出来，很多生物公司能提供核酸抽提的试剂盒，如Qiagen，Invitron等。
由于技术的进步，现在已可以不经核酸抽提，直接用靶样本中的含核酸的细胞进行扩增。靶样本的含核酸的细胞能用任何合适的方法从样品中被抽提出来。例如，靶样本中含核酸的细胞能用磁珠从样品中分离出来。
所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也于本发明所述芯片杂交。
目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chainreaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplifiication，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。
在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法，该方法所用引物含有SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：143所示序列的核苷酸链或其互补链。
只要用于杂交的目的核苷酸序列的长度足够以产生特异性杂交，所述目的核苷酸序列长度在上下游方向上并无限制。合适的目的核苷酸序列长度从30到200碱基对长度。杂交用的靶核苷酸序列过长或过短，会影响杂交效率，并使得杂交在探针上的靶核苷酸序列易于被洗脱下来，导致荧光信号过弱或丢失。较长的DNA片段，可用DNase I进行片段化处理，或者在反应体系中加入适当比例的脱氧尿嘧啶，然后PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，片段化DNA片段。至于RNA，处理方法较为简单，直接用高盐和高温处理即可。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可同源，也可非同源。
所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。
合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。
本发明方法的杂交可以在任何杂交液中进行，如含有SSPE和表面活性剂的杂交液。杂交液可以含有任何浓度的SSPE，例如1～10×SSPE。也可以使用任何适当的表面活性剂，如Triton-100，SDS，SLS(十二烷基肌氨酸钠)，CTAB(六烷基三甲基溴化铵)等。杂交液中也可有任何浓度的表面活性剂，如0.01～1％(w/w)。所述的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为2分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。
所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有0～3％(w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如1～30分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42℃。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可以采用任何已知的方法进行检测。根据标记的不同，可以选用合适的检测方法，例如荧光标记的探针或目的核苷酸序列可以用激光扫描仪或荧光仪检测，放射性元素标记的探针或目的核苷酸序列可以用放射自显影检测。
总体杂交特异性可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定。
芯片的阳性信号可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定，或以杂交信号大于平均阴性对照探针与3倍标准差之和的方法来确定。
本发明也可用于目的基因的拷贝数检测。结合于芯片探针上的目的核苷酸序列的数量能够被检测，并且与目的基因的拷贝数相关。根据含有已知拷贝数的对照基因的核苷酸序列的数量可以对目的基因的拷贝数进行定量。荧光能用光电倍增管CCD或激光扫描探测。
本发明的CYP3A检测芯片及其应用，与传统检测方法相比，对CYP3A基因筛检具有高通量，平行性和微量化等优点，使医务人员及时掌握患者大量遗传信息，指导患者合理用药，实现个性化医疗。对于医药企业，本发明的CYP3A检测芯片可使其选择合适的临床试验人群，从而提高药物疗效，降低药物的无效率和毒副作用，缩短药物的研发周期。
附图说明
附图是本发明实施例1的CYP3A检测芯片的杂交结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1反向杂交
1.基因芯片的制备
(1)探针溶解
每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
(2)点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，探针点样的排布格式如表1所示，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
表1探针排布
3A4-15603C 3A4-15603G 3A4-15603T 3A4-13908G 3A4-13908A 3A4-13908T 3A4-l5615T 3A4-15615C 3A4-15615A
3A4-20070T 3A4-20070C 3A4-20070A 3A4-20230G 3A4-20230A 3A4-20230T 3A4-21867C 3A4-21867T 3A4-21867A
3A4-21896C 3A4-21896T 3A4-21896A 3A4-22026C 3A4-22026T 3A4-22026A 3A4-25890N 3A4-25890A 3A4-25890T
3A4/-392A 3A4/-392G 3A4/-392T 3A5-3775A 3A5-3775G 3A5-3775T 3A5-27289C 3A5-27289A 3A5-27289T
3A5-3699C 3A5-3699T 3A5-3699A 3A5-6986G 3A5-6986A 3A5-6986T 3A5-12952T 3A5-12952C 3A5-12952A
3A5-14665A 3A5-14665G 3A5-14665T 3A5-14690G 3A5-14690A 3A5-14690T 3A5-19386G 3A5-19386A 3A5-19386T
3A5-27132N 3A5-27132T 3A5-27132A 3A5-31611T 3A5-31611C 3A5-31611A 3A5-29753T 3A5-29753c 3A5-29753g
3A7/-314C 3A7/-314T 3A7/-314G 3A7-26041C 3A7-26041G 3A7-26041A 3A7/-232A 3A7/-232C 3A7/-232G
3A7/-91G 3A7/-91A 3A7/-91C 3A7/-49G 3A7/-49A 3A7/-49T 3A7/-262T 3A7/-262A 3A7/-262G
3A7-4011N 3A7-4011T 3A7-4011G 3A7/-291G 3A7/-291G*1C 3A7/-291T 3A7/-291T*1C 3A7/-291A 3A7/-284T
3A7/-284T*1C 3A7/-284A 3A7/-284A*1C 3A7/-284C 3A7/-282T 3A7/-282T*1C 3A7/-282C 3A7/-282C*1C 3A7/-282A
3A7/-281A 3A7/-281A*1C 3A7/-281T 3A7/-281T*1C 3A7/-281G 3A7/-270T 3A7/-270T*1C 3A7/-270G 3A7/-270G*1C
3A7/-270T 杂交阴性探针 杂交阴性探针 杂交阳性探针 杂交阳性探针 CY3 CY3 定位探针 定位探针
2.待测样品的处理和标记
(1)人基因组DNA抽提及目的基因的扩增
采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组DNA，具体步骤如下：
1)将ACD(枸橼酸8g/L，枸橼酸钠22g/L，葡萄糖24.5g/L)抗凝的外周全血混匀取1ml入15ml离心管，加入2.5ml缓冲液FG1，充分颠倒混匀；
2)2000g离心5分钟，弃去上清。静置2分钟；
3)加入500ul缓冲液FG2/QIAGEN蛋白酶混合试剂，立即混匀，直至原有的沉淀完全消失；
4)65℃水浴10分钟，40次/分匀速振荡；
5)加入500ul 100％异丙醇充分混匀，直至出现可见的DNA絮状沉淀；
6)3000g离心5分钟，弃去上清，倒置2分钟；
7)加入500ul 70％乙醇，振荡；
8)3000g离心5分钟，弃去上清，倒置约1小时，直至管内不再有水珠；
9)加入200ul缓冲液FG3溶解DNA，轻轻振荡，溶解过夜；
10)将抽提溶解好的DNA移入高压灭菌过的1.5ml离心管中，取1ul进行电泳(1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker(Lambda DNA/EcoRI+HindIII)进行定量。
用CYP3A4的引物(SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：121)、CYP3A5的引物(SEQ IDNO：122～SEQ ID NO：137)和CYP3A7的引物(SEQ ID NO：138～SEQ ID NO：143)进行目的核苷酸序列的扩增。PCR扩增用30μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCRto circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，19：4008]：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果。
当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：143所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(ClontechLaboratories Inc.，USA)。多重PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，66℃退火2.5min，68℃延伸4min，共40个循环；最后68℃延长10min。PCR扩增后，取3μl PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳。这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。
(2)PCR产物纯化和片段化
每个样品的所有PCR产物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化，具体步骤如下：
1)加入5倍PCR产物体积的缓冲液PB，混匀，无需去除石蜡油或煤油；
2)将QIAquick离心柱放置于试剂盒提供的2ml收集管子中；
3)将样本加入QIAquick离心柱中，离心30-60s，以结合DNA；
4)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中；
5)将0.75ml缓冲液PE加入到QIAquick离心柱中进行洗涤，离心30-60s；
6)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中，离心1min；
7)将QIAquick离心柱放置于高压灭菌的1.5ml的离心管子中；
8)在9IAquick膜中央加入50μl缓冲液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脱DNA，离心1min，为了提高DNA的浓度，可在QIAquick膜中央只加入30μl洗脱缓冲液，静置1min，然后离心。
纯化的PCR经测定浓度后，用DNaseI进行片段化。片段化的反应体系包括：30μl纯化PCR产物(10μg)，4μl的10×DNaseI缓冲液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃15min。片段化后的产物跑4％琼脂糖凝胶，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对。
(3)荧光素标记
利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40μl反应体系包括：25μl片段化PCR产物，8μl的5×脱氧核苷酸转移酶缓冲液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脱氧核苷酸转移酶(20U/μl)，3μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。
3.杂交、洗涤和结果检测
荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20μl体系包括：荧光素标记的PCR产物15μl，20×SSPE1.2μl，1％Triton0.2μl，  10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH2O 2.2μl。反应条件为48℃温浴120min，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH20洗涤0.5min。
洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如附图所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到目的基因的基因型，分型结果是CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7。
实施例2正向杂交
1.CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因扩增和芯片制备
用CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7引物(SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：143)扩增基因。PCR扩增用100μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mMKCl，2mM MgCl2，20％Q solution(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因组DNA，3 U Ex Taq酶(Takara)。循环参数：94℃变性5min；94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。将纯化的PCR产物浓度调整至400ng/μl。
将浓度为400ng/μl的PCR产物与100％的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将200ng/μl的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。
2.芯片杂交
杂交反应体系包括：2nM荧光标记的寡核苷酸探针，1.2μl 20×SSPE，0.2μl1％Triton，0.9μl 10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤10秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。
                     序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>CYP3A检测芯片及其应用
<130>NP-11108
<160>143
<170>PatentIn version 3.3
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<400>76
agcagcacgc tgctgaaa                                            18
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
cagcagcaca ctgctgaa                                            18
<210>78
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
cagcagcact ctgctgaa                                            18
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
agtactggac agagcctga                                           19
<210>80
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
agtactggag agagcctga                                           19
<210>81
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
agtactggaa agagcctga                                           19
<210>82
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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ctgccttttt tgggaaatgc t                                        21
<210>83
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
ctgccttttt ttgggaaatg ct                                       22
<210>84
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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tgcctttttt ggggaaatgc t                                        21
<210>85
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tgattgagtt gtgtatgatt ctac                                     24
<210>86
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
tgattgagtt gtttatgata cctc                                     24
<210>89
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>90
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>91
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>92
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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agttgtgtat gatactacat agaatat                                  27
<210>93
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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agttgtttat gatacctcat agaatat                                  27
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
gttgtgtatg atcctacata gaat                                     24
<210>95
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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gttgtgtatg attctacata gaatatt                                  27
<210>96
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>97
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>98
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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ttgtttatga taccacatag aatatga                                  27
<210>99
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>100
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>104
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>105
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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ctcatagaat attaactcaa aggag                                    25
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tcatagaata tgaactcaaa ggag                                     24
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<220>
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<223>引物
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<210>111
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<212>DNA
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<220>
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<223>引物
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<220>
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<223>引物
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<210>113
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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<223>引物
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<211>22
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<220>
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<223>引物
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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<210>117
<211>25
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<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<211>23
<212>DNA
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<220>
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<223>引物
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<213>人工序列
<220>
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<211>22
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<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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ggctctgtct gtctgggttt gg                                       22
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>121
gggctatgtg catggagctt tc                                       22
<210>122
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<210>125
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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actgcaccca gtcccaccat ttct                                     24
<210>126
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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tattgctggc cctggttcac ctgt                                     24
<210>128
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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ccagcatagg gccagctcca tca                                      23
<210>129
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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gcagtggggt ttgtggtggg gtgtt                                    25
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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cccgccccac atacactcag aaga                                     24
<210>131
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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tcccgcctca agtttctcac caat                                     24
<210>132
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>132
gtttggtgag agcagtggat gaggt                                    25
<210>133
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>133
caagagtctc acacaggagc cacc                                     24
<210>134
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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agcttctgca ggttctggtg atgga                                    25
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gtccctgggg tgaggatggt cttg                                     24
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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ttgtgctggg actgtggatg gatgt                                    25
<210>138
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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ggctctgtct ggctgggtat ga                                       22
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gaacagttac tcacagatag aggagtatc                                29
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gggttagagc cttcccgaat gt                                       22
<210>141
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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ggggcctcct acctttcag                                           19
<210>142
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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atgagggaat gaagtgcctg ga                                       22
<210>143
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>143
ctgggtgatg cctacacgct at                                       22

Claims (15)

1.一种CYP3A检测芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
2.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述待测CYP3A基因包括CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因。
3.如权利要求1或2所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。
4.如权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA，包括：
(1)与待测CYP3A4基因杂交的(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：30所示序列，(b)SEQID NO：1～SEQ ID NO：30所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：30所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测CYP3A5基因杂交的(a)SEQ ID NO：31～SEQ ID NO：63所示序列，(b)SEQID NO：31～SEQ ID NO：63所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：31～SEQID NO：63所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测CYP3A7基因杂交的(a)SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示序列，(b)SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：64～SEQ ID NO：109所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
5.如权利要求4所述的检测芯片，其特征在于，所述探针选自：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：109所示序列。
6.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述探针可设有连接臂，且所述探针可被修饰。
7.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
8.一种应用权利要求1所述芯片检测CYP3A基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在固相载体表面点载权利要求1所述的探针；
(2)抽提待测CYP3A基因的核酸；
(3)制备待测CYP3A基因的目的核苷酸序列；
(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述目的核苷酸序列的制备包括PCR扩增反应，该反应所用引物含有SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：143所示序列的核苷酸链或其互补链。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述目的核苷酸序列的标记采用包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记或酶标记。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的杂交温度为25℃～65℃，杂交时间为2分钟～18小时。
12.一种应用权利要求1所述芯片检测CYP3A基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标记权利要求1所述的探针；
(2)抽提待测CYP3A基因的核酸；
(3)制备待测CYP3A基因的目的核苷酸序列；
(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的探针标记采用包括荧光素标记、生物素标记、荧光共振能量转移标记、放射性元素标记或酶标记。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述目的核苷酸序列的制备包括PCR扩增反应，该反应所用引物含有SEQ ID NO：110～SEQ ID NO：143所示序列的核苷酸链或其互补链。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的杂交温度为25℃～65℃，杂交时间为2分钟～18小时。
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