CN1920001A - 一种薯蓣皂苷青霉菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种薯蓣皂苷青霉菌，薯蓣皂苷青霉菌Penicillumdioscin 051016.CCTCCNo：M206001，涉及能将薯蓣皂苷分解成薯蓣皂苷元的菌株。该菌可在常温与含薯蓣皂苷的植物原料发酵，直接将薯蓣皂苷酶解成薯蓣皂素，薯蓣皂素提取率达90％以上，不产生酸性有机废水污染物。本发明还公开了该菌的制备方法，该方法将薯蓣皂苷水解物纯化至目的菌能生长，而其它菌难以生长的环境，自然诱导薯蓣皂苷青霉菌的产生，是一种快速、简便、准确的分离、筛选能酶解薯蓣皂苷为薯蓣皂素的专一性很强的高活性菌株的方法。
Description
技术领域：
本发明涉及能将薯蓣皂苷分解成薯蓣皂素的菌株，更具体涉及薯蓣皂苷青霉菌(Penicillum dioscin 051016.CCTCCNo：M206001)，本发明还涉及该薯蓣皂苷青霉菌的制备方法。薯蓣皂苷青霉菌用于将含薯蓣皂苷的原料经发酵产生薯蓣皂素。
背景技术：
薯蓣皂素是从薯蓣属植物中提取的，黄姜属薯蓣属，是提取薯蓣皂素的主要资源。用薯蓣皂素为原料的合成药有200多种，其中有60％以上的甾体激素以薯蓣皂素为原料。
从薯蓣原料中提取薯蓣皂素的传统方法是采用酸解法。用酸解法的提取工艺会产生大量的酸性有机废水，污染产区环境和河流，进行污水处理将使生产成本大幅增加。因此，人们一直试图用其它方法来替代酸解法，以避免对环境的污染，并且取得了一定的进展。
现有从薯蓣原料中提取薯蓣皂素的方法有：a、直接酸水解；b、预发酵后再进行酸水解；c、分离后再进行酸水解；d、酶解后再进行酸水解；e、微生物发酵后再进行酸水解等。
a、直接酸水解是传统提取薯蓣皂素的方法：该方法先用硫酸或盐酸将薯蓣原料进行酸水解，水解物用碱性物质中和至中性，再用水洗涤，干燥后，再用溶剂提取薯蓣皂素，由于皂素在植物体内主要以薯蓣皂苷的形式与纤维素结合存在于细胞壁中，又因为植物细胞壁比较坚韧，因此直接酸水解法提取薯蓣皂素的提取率较低。
b、预发酵后再进行酸水解提取薯蓣皂素的方法为：先将薯蓣原料在酸水解前自然发酵，使材料中的淀粉分解，植物体疏松后再进行酸水解，然后提取薯蓣皂素，可使薯蓣皂素的收率高于直接酸水解法。现在我国多数厂家都采用这种工艺生产薯蓣皂素。但由于自然发酵过程中多种微生物参与发酵，发酵条件难以控制，杂质增多使薯蓣皂素质量下降。为了提高薯蓣皂素的产率，除了预发酵法以外，加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶等酶液先进行酶解，使薯蓣皂苷暴露出来，在酸水解时可提高薯蓣皂素的产率。
c、分离后再进行酸水解提取薯蓣皂素的方法为：将薯蓣原料加水磨碎过筛，先分离出纤维渣，过滤液经过沉淀排水后，上清液浓缩后用乙醇提取，乙醚沉淀得到水溶性皂苷，把分离得到的皂苷淀粉浆加入淀粉酶进行酶解，酶解后的糖渣再进行酸水解。
d、酶解后再进行酸水解提取薯蓣皂素的方法是华中工学院赵书申等人发明的，该方法采用纯种黑曲霉菌，用未经自然发酵的生产原料，经蒸煮破坏了自身存在的各种酶以后，直接用黑曲霉菌接种发酵，再经硫酸水解，提取薯蓣皂素，其产率较前面的提取方法提高许多。
e、微生物发酵后再进行酸水解的方法是西北植物研究所和陕两省卫东医药化工厂发明的，该方法将工艺路线分为三部分：第一步先分离出纤维素，第二步接种菌种降解淀粉生成酵母粉，并得到糖渣，第三步将得到的糖渣进行酸水解，再提取皂素。该方法也比传统工艺的提取率要高，并且减少了废水的排放量。
综上所述，虽然所有的工艺改进都比传统直接采用酸解法提高了薯蓣皂素的提取率，且减少了酸水污染物的排放量。但上述的所有工艺，无一例外地仍然需经过酸水解的步骤。因此，不可避免地会产生酸性有机废水污染物，且总量很大，而污水处理的成本很高，导致许多酸性有机废水污染物对产区的环境和河流造成了严重的污染。
发明内容：
本发明的目的是提供一种薯蓣皂苷青霉菌，该菌可在常温与含薯蓣皂苷的植物原料发酵，直接将薯蓣皂苷酶解成薯蓣皂素，薯蓣皂素得率达90％以上，不产生酸性有机废水污染物。本发明另一的目的是提供薯蓣皂苷青霉菌的制备方法，该方法是将薯蓣皂苷水解物纯化至目的菌可能生长，而其它菌难以生长的环境，自然诱导薯蓣皂苷青霉菌的产生，再经检测和纯化得到薯蓣皂苷青霉菌。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种薯蓣皂苷青霉菌051016，(Penicillum dioscin 051016)CCTCC No：M206001。
该薯蓣皂苷青霉菌的制备方法包含下列步骤：
(一)菌株的诱导、初筛方法按下列步骤进行：
a1、将含加入薯蓣皂苷原料洗净、晾干，其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成浆；
a2、加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a3、将滤渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a4、重复步骤3；
a5、合并三次提取液，于70℃减压回收溶剂后得到提取物，加入原料量20倍的蒸馏水溶解提取物，再加入薯蓣皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重复萃取两次，合并三次正丁醇萃取液，70℃减压回收正丁醇至粉末状，即为薯蓣皂苷；
a6、将薯蓣皂苷用2Mol/L盐酸95℃回流水解6小时，减压蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液调整PH值在4-7，85℃干燥成薯蓣皂苷水解物；
a7、加入薯蓣皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，残渣与蒸馏水按重量1∶2的比例搅匀后作为培养基，置于20℃～28℃、相对湿度65％～80％的环境下，放置8～12天；
a8、取培养基上不同形态的菌落作进一步地筛选；
(二)按下列步骤，用高效液相检测色谱仪检测每种菌落与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素的含量，并根据薯蓣皂素含量的高低取舍菌落：
b1、将2～4克的含薯蓣皂苷原料洗净，加入其重量5-10倍的自来水，磨碎成浆，100℃蒸煮30分钟，冷至室温；
b2、取5mm2的菌落拌入含薯蓣皂苷原料的浆中，30℃发酵20～30小时，5000rmp离心10分钟，弃上清液，取沉降物；
b3、将沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；
b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蓣皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作为待测样品；
b5、用高效液相检测色谱仪检测薯蓣皂素，条件为：安捷伦1100型仪器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色谱柱，柱温25℃，流动相为3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，检测波长206nm；薯蓣皂素标准品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制备成1mg/ml的溶液，进样量2μl，分析过程15分钟；另取待测样品同法进行高效液相色谱分析；
b6、比较待测样品中各种菌落所得产物的检测结果，选取与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素含量最高的菌落；
(三)菌株的纯化按下列步骤进行：
c1、培养基由下列成分按重量的百分比组成：蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO4 0.1、Fe2(SO4)3 0.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蓣皂苷水解物2、琼脂1.5、余者为水；
c2、将培养基加热至100℃，保温30分钟，制成平板，冷却至20℃～30℃；
c3、将步骤(二)得到的菌落用涂布法接种于培养基制成的平板上，25℃～30℃培养3-4天；
c4、取培养基上不同形态的菌落；
c5、再按步骤(二)得到菌落，从该菌落中取到的菌株即为本发明所述的薯蓣皂苷青霉菌。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、与传统采样方法相比，本发明根据化学环境限制法或曰底物纯化法的思路，将底物纯化至目的菌可能生长的环境，除去了可能滋生其它菌类的底物，从而限制了其它菌类生长的条件，因此，本发明可简便、快速地完成目的菌株的诱导筛选；
2、本发明所得薯蓣皂苷青霉菌具有高度的专一性，即底物即便是两种或两种以上的薯蓣皂苷，所得产物均为薯蓣皂素；
3、本发明所得薯蓣皂苷青霉菌具有很高的活性，使得用其发酵后的薯蓣皂素得率达90％以上；
4、本发明所得薯蓣皂苷青霉菌可在常温与含薯蓣皂苷原料发酵，取代酸水解，可降低能耗、减少环境污染。
附图说明：
图1为薯蓣原料经薯蓣皂苷青霉菌发酵得到的产物与酸水解后得到的产物的高效液相色谱分析结果的比较图。
图2为薯蓣原料经自然发酵得到的产物，经高效液相色谱分析之结果图。
具体实施方案：
以下对薯蓣皂苷青霉菌及其制备方法作进一步的说明。
薯蓣皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNo：M206001。
薯蓣皂苷青霉菌的制备方法包含下列步骤：
(一)菌株的诱导、初筛方法按下列步骤进行：
a1、将含薯蓣皂苷原料洗净、晾干，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成浆；
a2、加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a3、将滤渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a4、重复步骤3；
a5、合并三次提取液，于70℃减压回收溶剂后得到提取物，加入原料量20倍的蒸馏水溶解提取物，再加入薯蓣皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重复萃取两次，合并三次正丁醇萃取液，70℃减压回收正丁醇至粉末状，即为薯蓣皂苷；
a6、将薯蓣皂苷用2Mol/L盐酸95℃回流水解6小时，减压蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液调整PH值在4-7，85℃干燥成薯蓣皂苷水解物；
a7、加入薯蓣皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，残渣与蒸馏水按重量1∶2的比例搅匀后作为培养基，置于20℃～28℃、相对湿度65％～80％的环境下，放置8～12天；
a8、取培养基上不同形态的菌落作进一步地筛选；
(二)按下列步骤，用高效液相检测色谱仪检测每种菌落与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素的含量，并根据薯蓣皂素含量的高低取舍菌落：
b1、将2～4克的含薯蓣皂苷原料洗净，加入其重量5-10倍的自来水，磨碎成浆，100℃蒸煮30分钟，冷至室温；
b2、取5mm2的菌落拌入含薯蓣皂苷原料的浆中，30℃发酵20～30小时，5000rmp离心10分钟，弃上清液，取沉降物；
b3、将沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；
b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蓣皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作为待测样品；
b5、用高效液相检测色谱仪检测薯蓣皂素，条件为：安捷伦1100型仪器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色谱柱，柱温25℃，流动相为3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，检测波长206nm；薯蓣皂素标准品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制备成1mg/ml的溶液，进样量2μl，分析过程15分钟；另取待测样品同法进行高效液相色谱分析；
b6、比较待测样品中各种菌落所得产物的检测结果，选取与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素含量最高的菌落；
(三)菌株的纯化按下列步骤进行：
c1、培养基由下列成分按重量的百分比组成：蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO4 0.1、Fe2(SO4)3 0.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蓣皂苷水解物2、琼脂1.5、余者为水；
c2、将培养基加热至100℃，保温30分钟，制成平板，冷却至20℃～30℃；
c3、将步骤(二)得到的菌落用涂布法接种于培养基制成的平板上，25℃～30℃培养3-4天；
c4、取培养基上不同形态的菌落；
c5、再按步骤(二)得到菌落，从该菌落中取到的菌株即为本发明所述的薯蓣皂苷青霉菌。
图1为薯蓣原料经薯蓣皂苷青霉菌发酵得到的产物与酸水解后得到的产物的高效液相色谱分析结果的比较图。
其横坐标为保留时间，纵坐标为吸收强度。经高效液相色谱分析保留时间在11分钟左右为薯蓣皂素，上图0017.D为经薯蓣皂苷青霉菌发酵得到的产物，其保留时间为11.1分钟，下图0016.D为经酸水解得到的产物，其保留时间为11.08分钟，两者的误差为0.02分钟，因此，两者可视为同一种产物。
用薄层色谱(TLC)分析及熔点测定均表明所得到的产物与皂素对照品一致。
图2为薯蓣原料经自然发酵得到的产物，经高效液相色谱分析之结果图。
该结果说明，薯蓣原料经自然发酵得到的产物不一定相同，其薯蓣皂素的产率甚微。
实施列：
用薯蓣皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNo：M206001制备薯蓣皂素的方法按下列步骤进行。
1、取薯蓣原料100公斤，清洗至无泥沙和其它杂质，经高效液相色谱分析，该薯蓣原料含薯蓣皂素2.3％；
2、加入500公斤的水，将薯蓣原料破碎至5毫米以下；
3、将已破碎的物料装入发酵罐中，加入500克的氨水，拌匀，26℃密闭放置1小时；
4、25℃接入100克的薯蓣皂苷青霉菌Penicillum dioscin051016，CCTCC No：M206001，搅拌均匀，在PH4～7条件下，26℃发酵30小时；
5、过滤，将滤渣在65℃干燥，再加入300升80℃沸程的石油醚；
7、60℃回流提取2～3次，合并提取液；
8、60℃回收石油醚至薯蓣皂素结晶析出；
9、过滤，取薯蓣皂素结晶；
10、用薯蓣皂素结晶两倍重量的80℃沸程的石油醚60℃溶解，再缓慢加入乙醇至溶液浑浊，放置过夜，重结晶；
11、滤取结晶，60℃干燥4小时，称重得2.08公斤薯蓣皂素，经高效液相色谱分析薯蓣皂素含量98.07％。
Claims (2)
1、一种薯蓣皂苷青霉菌，其特征在于，薯蓣皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCC No：M206001。
2、制备权利要求1所述的一种薯蓣皂苷青霉菌的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：
(一)菌株的诱导、初筛方法按下列步骤进行：
a1、将含薯蓣皂苷原料洗净、晾干，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成浆；
a2、加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a3、将滤渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加温至60℃，保温2小时，过滤，取提取液；
a4、重复步骤3；
a5、合并三次提取液，于70℃减压回收溶剂后得到提取物，加入原料量20倍的蒸馏水溶解提取物，再加入薯蓣皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重复萃取两次，合并三次正丁醇萃取液，70℃减压回收正丁醇至粉末状，即为薯蓣皂苷；
a6、将薯蓣皂苷用2Mol/L盐酸95℃回流水解6小时，减压蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液调整PH值在4-7，85℃干燥成薯蓣皂苷水解物；
a7、加入薯蓣皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，残渣与蒸馏水按重量1∶2的比例搅匀后作为培养基，置于20℃～28℃、相对湿度65％～80％的环境下，放置8～12天；
a8、取培养基上不同形态的菌落作进一步地筛选；
(二)按下列步骤，用高效液相检测色谱仪检测每种菌落与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素的含量，并根据薯蓣皂素含量的高低取舍菌落：
b1、将2～4克的含薯蓣皂苷原料洗净，加入其重量5-10倍的自来水，磨碎成浆，100℃蒸煮30分钟，冷至室温；
b2、取5mm2的菌落拌入含薯蓣皂苷原料的浆中，30℃发酵20～30小时，5000rmp离心10分钟，弃上清液，取沉降物；
b3、将沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；
b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蓣皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作为待测样品；
b5、用高效液相检测色谱仪检测薯蓣皂素，条件为：安捷伦1100型仪器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色谱柱，柱温25℃，流动相为3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，检测波长206nm；薯蓣皂素标准品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制备成1mg/ml的溶液，进样量2μl，分析过程15分钟；另取待测样品同法进行高效液相色谱分析；
b6、比较待测样品中各种菌落所得产物的检测结果，选取与含薯蓣皂苷原料发酵后得到薯蓣皂素含量最高的菌落；
(三)菌株的纯化按下列步骤进行：
c1、培养基由下列成分按重量的百分比组成：蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO4 0.1、Fe2(SO4)3 0.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蓣皂苷水解物2、琼脂1.5、余者为水；
c2、将培养基加热至100℃，保温30分钟，制成平板，冷却至20℃～30℃；
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|---|---|---|---|---|
| CN101709269B (zh) * | 2009-11-27 | 2011-07-20 | 三峡大学 | 一种青霉菌菌种的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用 |
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| AU2003903909A0 (en) * | 2003-07-25 | 2003-08-07 | Albright & Wilson (Australia) Limited | Production methods |
| CN1673385A (zh) * | 2004-03-25 | 2005-09-28 | 刘华祥 | 利用生物技术由薯芋类植物生产柠檬酸和皂素的方法 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090128 Termination date: 20091014 |