CN1891687B

CN1891687B - 微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物及其应用

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Publication number: CN1891687B
Application number: CN200510082974XA
Authority: CN
Inventors: 李元; 朱凤昌; 吴剑波; 陈晶; 张洋; 郭连宏; 石莲英; 姜蓉
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2025-07-08
Also published as: CN1891687A

Abstract

本发明涉及微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物，特别是肿瘤坏死因子受体(TNFR)和白细胞介素-6受体(IL-6R)的拮抗活性化合物或其药学可接受的衍生物。本发明还涉及上述化合物用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体(TNFR)和白细胞介素-6受体(IL-6R)的配基过量相关的疾病的药物的用途。此外，本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物。

Description

微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物及其应用

发明领域

发明背景

炎症是机体对各种损伤的反应，细胞因子在炎症反应加重、修复和慢性化上均起重要作用。肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-6(IL-6)已知是炎症反应的重要介质。

肿瘤坏死因子通过与细胞表面的受体结合，由信号传导系统将信息传入细胞内而发挥其生物学活性。肿瘤坏死因子有两种受体，其基因已被分离纯化，阐明了结构。已知这两种受体蛋白质分子量分别为55Kd和75kD，分别称为P55R(TNFR I)和P75R(TNFR II)。细胞表面的TNFR经蛋白酶水解下来的受体片段，存在于人的各种体液中，即可溶性TNF受体，与膜表面相对应，来源于TNFR I的称为sTNFR I，来源于TNFR II的称为sTNFR II。sTNFR对TNF有高亲和力，一旦与TNF结合，阻断TNF与TNFR的结合，从而间接抑制TNF的活性。sTNFR的作用有两方面：在高浓度时sTNFR可拮抗TNF作用；在低浓度时对TNF的结构具有稳定作用。

白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，参与免疫调节、造血、急性期反应等生物学过程，并在内分泌、神经系统中发挥一定作用。IL-6的表达失调与许多人类疾病有关，如感染、肿瘤、自身免疫病、关节炎及衰老过程等。IL-6通过两个膜蛋白组成的双链受体系统作用于靶细胞，即配基结合链IL-6R和作为信号转导子的非配基结合链gp130。IL-6R由Ig样区、配基结合区、跨膜区以及胞内区组成。其为跨膜糖蛋白，有两种天然存在形式，即：膜结合受体gp80和可溶性受体sIL-6R，二者在IL-6的信号传递过程中起重要作用。

鉴于细胞因子的受体参与机体的多种生理和/或病理过程，是药物作用的重要靶点。近年来，随着分子生物学在药理学领域中的发展，尤其是人类基因组计划的开展，针对细胞因子的新的受体和亚型不断被发现，所述受体(亚型)的功能以及在疾病发展过程中的作用也逐渐被阐明。这驱使药物研究工作者能够从寻找相应的受体拮抗剂或激动剂出发，一方面通过所述受体的拮抗剂或激动剂研究这些信使物质的生物学功能，另一方面也能够从特异性受体的拮抗剂或激动剂中获得调节机体功能的新的药物。

已知人源sTNFR和sIL-6R可以作为天然TNFR和IL-6R的拮抗剂，用于治疗与其相应的配基过量有关的疾病，所述疾病包括类风湿关节炎、败血症休克、急慢性髓性败血病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反应等。因此，不同来源的TNFR和IL-6R的拮抗剂日益引起人们的广泛关注。

为克服现有技术中采用动物组织提取受体筛选药物所存在的缺陷，例如受体在组织细胞上含量极少(每个细胞有10-1000个结合位点)；直接利用动物组织或组织匀浆进行受体拮抗剂或激动剂的筛选专一性不高等，本发明人分别通过利用相应的重组受体建立的TNFR和IL-6R拮抗剂筛选模型，对微生物来源的样品进行筛选，获得了本发明所述化合物。

发明内容

为获得新的TNFR和IL-6R拮抗剂，本发明人通过利用相应的重组受体建立的TNFR和IL-6R拮抗剂筛选模型，对大量微生物来源的代谢产物进行筛选，通过进一步分离纯化，获得了新的微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物。

本发明一个方面，通过TNFR受体拮抗剂筛选模型，获得了一种微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物，或其药学可接受的衍生物，其具有式I所示的结构：

所述化合物的名称为N-(3-乙酰硫基-2-甲基-1-羰基丙基)-脯氨酸，以下也简称为1487B，其具有TNFR受体拮抗活性。

在本发明中，所述化合物的药学可接受的衍生物包括上述化合物的盐、酯或盐的酯。

本发明又一方面，还涉及一种产生所述化合物1487B的微生物。具体的，为满足专利审查要求，本发明人将所述真菌(Fungus)1487于2005年3月14日保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京，海淀区中关村北一条13号，100080)，保藏号CGMCC 1327。

本发明又一方面还涉及一种制备所述化合物1487B的方法，包括如下步骤：在适合所述化合物1487B产生的条件下培养所述的微生物CGMCC1327，以及从培养液中回收化合物1487B。

本发明另一方面，通过IL-6R受体拮抗剂筛选模型，获得了一种微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物，或其药学可接受的衍生物，其具有式II所示的结构：

Figure 89500DEST_PATH_RE-GA20172071200510082974X01D00012

所述化合物的名称为2-(N-正庚基)亚氨基-3-氧代-4a-甲基-5-氧代-7-(2-羟乙基)-8-(E-异丙烯基)-2，3，-二氢萘并[2，3-b]1，4-二氧六环，以下也简称为2460A，具有IL-6R受体拮抗活性。

本发明又一方面，还涉及一种产生所述化合物2460A的微生物。具体的，为满足专利审查要求，本发明人将所述真菌(Fungus)2460于2005年3月14日保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京，海淀区中关村北一条13号，100080)，保藏号CGMCC1328。

本发明又一方面还涉及一种制备所述化合物2460A的方法，包括如下步骤：在适合所述化合物2460A产生的条件下培养所述的微生物CGMCC1328，以及从培养液中回收化合物2460A。

本发明又一方面涉及一种药物组合物，其含有上述式I和/或式II2所述化合物或其药学可接受的衍生物，以及药学可接受的载体。

本发明的再一方面，涉及上述式I和/或式II的化合物用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体(TNFR)和白细胞介素-6受体(IL-6R)的配基过量相关的疾病的药物的用途。在本发明中，所述疾病包括但不限于类风湿关节炎、败血症休克、急慢性髓性败血病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反应。

附图说明

图1：图1a-c分别为化合物2460A的H-谱结果。

图2：化合物2460A的C-谱结果。

图3：化合物2460A ESI质谱结果。

图4：化合物2460的红外IR谱结果。

图5：化合物2460的高分辨FAB质谱结果。

图6：图6a-d分别为化合物2460的HMBC核磁二维谱结果。

图7：图7a-b分别为化合物2460的HSQC核磁二维谱结果。

图8：图8a-c分别为化合物2460的H-H COSY核磁二维谱结果。

图9：图9a-b分别为化合物2460的DEPT C-谱结果。

图10：图10a-c分别为化合物2460的C-谱结果。

图11：化合物2460的紫外UV谱结果。

以下结合实施例，对本发明所述化合物及其用途进一步加以阐述。

实施例1微生物来源的拮抗活性化合物2460的制备和纯化

真菌2460接种后，于26℃摇床上培养96小时。将所得发酵液过滤，滤液过X-5大孔吸附树脂，30％丙酮洗脱后，80％丙酮洗脱并收集，常温挥干至固体。干品溶于50％甲醇，过Sephadex LH-20柱，50％甲醇洗脱，用本发明人建立的针对IL-6R拮抗剂筛选模型检测，并收集活性组分，挥干。干品溶于80％甲醇，过ODS柱，50％甲醇洗脱，收集活性组分。

挥干后，将样品溶于有机溶剂后冷冻干燥，得红色固体，即本发明所述化合物2046A。经过对该化合物的UV，IR，NMR和MS分析，得到其理化性质如下：

分子量：425

溶解性：难溶于水，易溶于甲醇，氯仿。

熔点：84-87℃

颜色：固体为红色，甲醇溶液为鲜红。

pH值：5.3(饱和水溶液中)。

稳定性：酸碱均不稳定(pH约2或12)，溶液颜色均为黄色，可以提高其水溶解度。

UV最大值：500nm。

实施例2微生物来源的拮抗活性化合物1487B的制备和纯化

真菌1487接种后，于26℃摇床上培养96小时。将所得发酵液过滤，滤液过X-5大孔吸附树脂，30％丙酮洗脱后，80％丙酮洗脱并收集，常温挥干至固体。干品溶于50％甲醇，过Sephadex LH-20柱，50％甲醇洗脱，用本发明人建立的针对TNFR拮抗剂筛选模型检测，并收集活性组分，挥干。干品溶于80％甲醇，过ODS柱，50％甲醇洗脱，收集活性组分。

挥干后，将样品溶于有机溶剂后冷冻干燥，得本发明所述化合物1487B。

实施例3通过Caco-2细胞建立的模型体外预测2460A的肠道吸收情况

在Transwell corning板的半透膜上培养Caco-2细胞，3天后，细胞贴满半透膜。在半透膜上部加2460A溶液(浓度为100μmol/l，含乙醇20％的HBSS缓冲液)0.5ml，半透膜下部加1.5ml含乙醇20％的HBSS缓冲液，在第0、30、60、90、120分钟分别从下部取溶液200μl，每次取完后及时补充200μl含乙醇20％的HBSS缓冲液。

HPLC检测取出液中含2460A的浓度，分别标记为A0、A30、A60、A90、A120，AT为残留液浓度。

在半透膜下部加1.5ml2460A溶液，在半透膜上部加0.5ml含乙醇20％的HBSS缓冲液，半透膜下部加1.5ml含乙醇20％的HBSS缓冲液，在第0、30、60、90、120分钟分别从下部取溶液400μl，每次取完后及时补充400μl含乙醇20％的HBSS缓冲液。

HPLC检测取出液中含2460A的浓度，分别标记为B0、B30、B60、B90、B120，BT为残留液浓度。

检测结果见表1

表1

	A0	A30	A60	A90	A120	AT	B0	B30	B60	B90	B120	BT
													浓度 μmol/l	0	0	0	1.4	1.3	23.4	0	2.9	5.1	3.7	3.8	42.7

由表1可知，在90分钟后化合物2460A能够从腔内(半透膜上部)透过到血液(半透膜下部)。30分钟后，化合物2460A能从血液(半透膜下部)透过到腔内(半透膜上部)。并且，后者的透过能力强于前者。

实施例4化合物2460A体外对人骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制作用

采用人骨髓瘤RPMI8226细胞，在添加10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Hyclone公司产品)中培养于37℃，5％CO₂孵箱内，3-4天传代一次，生长至对数期。

以少量100％乙醇溶解本发明所述化合物2460A，乙醇终浓度不超过0.1％。确保彻底溶解。分别以完全培养基稀释所述药物至如下浓度：25、10、5、1、0.5、0.1、0.01*10^-6Mol/L。

收集如上述培养至对数生长期的细胞，制成5.6*10⁵/ml浓度的细胞悬液。取两块96孔细胞培养板，每孔分别加50μl细胞悬液。设不加药物的对照组。加药组按照不同浓度设平行6孔；分别培养48、72小时。培养结束前4小时，每孔加入MTT20μl；4小时后离心去除每孔液体，每孔加入二甲基亚砜200μl；30分钟后用自动酶标仪测630nm各孔的OD值。实验重复三次。

结果：在24小时和72小时的情形中，化合物2460A对人骨髓瘤细胞RPMI8226在浓度大于1*10^-6Mol/L时，有明显的抑制作用，最高可达63％。

Claims

1.一种微生物来源的炎症因子受体拮抗活性化合物，其具有式II所示的结构：

其为白细胞介素-6受体的拮抗活性化合物。

2.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物，以及药学可接受的载体。

3.权利要求1的化合物用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体TNFR和白细胞介素-6受体IL-6R的配基过量相关的疾病的药物的用途。

4.权利要求3的用途，其中所述疾病包括败血症休克、急慢性髓性败血病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病。

5.权利要求4的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿关节炎、移植排斥反应。