EA022408B1 - Производные санглиферина и способы их получения - Google Patents

Abstract

Предложены, среди прочих, соединения формул (I) и (II)и их применение в терапии, в частности, при лечении вирусной инфекции.

Description

Настоящее изобретение относится к аналогам санглиферина, которые могут использоваться в качестве ингибиторов циклофилина, например, при лечении вирусной инфекции, в особенности ДНКвирусной инфекции, такой как вирус гепатита С (НСУ) и ВИЧ, и/или в качестве иммуносупрессантов, например, для применения при профилактике отторжения трансплантата, и в качестве противовоспалительных агентов, например, для применения при воспалительных заболеваниях. Настоящее изобретение также обеспечивает способы их применения в медицине, в частности, при лечении НСУ инфекции и для применения в качестве иммуносупрессанта или противовоспалительного агента, или в качестве промежуточных соединений для следующего поколения используемых в медицине соединений.

Предпосылки создания изобретения

Гепатит С.

Вирус гепатита С (НСУ) представляет собой положительную цепь ДНК-вируса, и инфекция является основной причиной посттрансфузионного гепатита. НСУ представляет собой наиболее распространенную хроническую передающуюся через кровь инфекцию и является основной причиной смерти от заболеваний печени в США. Согласно оценке Всемирной организации здравоохранения имеется более 170 млн хронических носителей НСУ инфекции, что составляет около 3% населения мира. Из не подвергнутых лечению НСУ-инфицированных пациентов у около 70-85% развивается хроническая инфекция НСУ, и поэтому они относятся к группам высокого риска развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В развитых странах 50-76% случаев рака печени и две трети всех трансплантатов печени вызваны хронической инфекцией НСУ (Маппк е! а1., 2007).

Помимо заболеваний печени, у хронически инфицированных пациентов могут также развиваться другие НСУ хронические заболевания, и они служат в качестве источника передачи другим людям. НСУ инфекция вызывает осложнения не только в печени, такие как артралгия (боль в суставах), кожная сыпь и внутренние повреждения органов, преимущественно, почек. НСУ инфекция представляет собой тяжелую проблему для мирового здравоохранения, и в настоящее время не существует вакцины, пригодной для гепатита С (31гайег е! а1., 2004; 1асоЬкоп е! а1. 2007; Маппк е! а1., 2007 Ра^1о15ку. 2005; Ζοιιζαη & Негшаии, 2002).

Лечение НСУ.

В настоящее время стандартом для лечения (ЗоС) являются подкожные инъекции пегилированного интерферона-α (ρΙΡΝα) и пероральное дозирование противовирусным препаратом рибавирином в течение 24-48 недель. Успех в лечении определяется устойчивым вирусологическим ответом (ЗУК), который определяется отсутствием НСУ РНК в сыворотке крови в конце периода лечения и через 6 месяцев. Общая частота ответа на ЗоС зависит в основном от генотипа и уровней предварительной обработки НСУ РНК. Пациенты с генотипами 2 и 3 более вероятно реагируют на ЗоС, чем пациенты, инфицированные генотипом 1 (Ме1п1коуа, 2008; НсоЬкоп е! а1., 2007).

Значительное число НСУ пациентов неадекватно реагирует на лечение ЗоС или не могут переносить лечения из-за побочных эффектов, что приводит к частым проблемам с завершением полного курса. Показатель общего клинического ЗУК ЗоС составляет всего только около 50% (Ме1шкоуа, 2008). Развитие резистентности является другим основным фактором неэффективности лечения ЦасоЬкоп е! а1., 2007). ЗоС также противопоказан некоторым пациентам, которые не считаются кандидатами для лечения, такие как пациенты с прошлыми значительными эпизодами депрессии или сердечными заболеваниями. Побочные эффекты ЗоС, которые часто приводят к прекращению лечения, включают схожее с гриппом заболевание, лихорадку, усталость, гематологические заболевания, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, алопецию и депрессию (Маппк е! а1., 2007).

Учитывая побочные эффекты, связанные с длительным лечением с использованием ЗоС, развитие резистентности и субоптимальный общий уровень успеха, крайне необходимыми являются более эффективные и безопасные новые методы лечения НСУ инфекции. Задачи новых методов лечения включают повышенную эффективность, улучшенный профиль токсичности, улучшенный профиль резистентности, улучшение качества жизни и в результате соответствующее улучшение у пациента. НСУ имеет короткий жизненный цикл и, следовательно, развитие лекарственной резистентности в процессе лекарственной терапии является распространенным явлением.

В настоящее время разрабатываются новые препараты, в особенности, для целей противовирусной терапии гепатита С (ЗТАТ-С), также известные как препараты прямого противовирусного действия (ΌΑΑ), мишенью которых являются вирусные белки, такие как вирусная РНК-полимераза Ν35Β или вирусная протеаза N33 ЦасоЬкоп е! а1., 2007; Рагйеишк е! а1., 2007). Кроме того, в настоящее время разрабатываются новые соединения, мишенью которых являются белки человека (например, циклофилины), а не вирусные мишени, что, как можно было бы ожидать, приведет к уменьшению случаев резистентности в процессе лекарственной терапии (Маппк е! а1., 2007; Роскгок, 2008; Ра\\1о15ку к-М., 2005).

Ингибиторы циклофилина.

Циклофилины (СуР) представляют собой семейство клеточных белков, которые проявляют пептидилпролил цис-транс изомеразную активность, способствующую изменению конформации и свертыванию белка. СуР вовлечены в клеточные процессы, такие как регуляция транскрипции, иммунный ответ,

- 1 022408 секреция белка и функции митохондрий. Вирус НСУ набирает СуР для своего жизненного цикла в процессе инфицирования человека. Первоначально полагали, что СуР стимулируют связывающую РНК активность НСУ неструктурного белка Ν85Β РНК полимеразы, который промотирует репликацию РНК, хотя предлагались некоторые альтернативные гипотезы, включающие требования активности СуР РР1аке. Как полагают, в жизненный цикл НСУ вовлечены различные изоформы СуР, включая А и В (Уапд ек ак., 2008; Аррек ек ак., 2006; СЬаПегЦ ек ак., 2009; Са1ккег ек ак., 2010). Способность генерировать генетический нокаут в Т клетках мышей (Со1дап ек а1., 2000) и человека (Вгаакеи и ЬиЬаи, 2001) указывает, что СурА является обязательным для роста клеток и выживания. Подобные результаты наблюдались при разрушении гомологов СуРА у бактерий (Негг1ег ек а1., 1994), №игокрога (Тгоркскид ек а1., 1989) и 8асскагошусек ссгсуыас (Оокпкк! ек а1., 1997). Таким образом, ингибирование СуР представляет собой новую и привлекательную главную мишень при лечении инфекции НСУ, и новое возможное дополнение к существующим 8оС или 8ТАТ-С/ЭАА лекарственным средствам, с целью повышения ЗУК, предотвращения возникновения резистентности и снижения побочных эффектов при лечении.

Известно, что циклоспорин А (1иоие ек а1., 2003) (СкА) и его ближайшие структурно связанные не подавляющие иммунитет клинические аналоги ΌΕΒΙΘ-025 (Раекиуке ек а1., 2006; Ркаак ек а1., 2008), ΝΙΜ811 (Макку ек а1., 2008) и 8СУ-635 (Норк1И8 ек а1., 2009) связываются с циклофилинами, и в качестве ингибиторов циклофилина проявляют ίη У1кго и клиническую эффективность при лечении инфекции НСУ (СгаЬЬе ек а1., 2009; Ркк1ак ек а1. 2008; Макку ек а1., 2008; 1поие ек а1., 2007; 1ккк ек а1., 2006; Раекиуке ек а1., 2006). Хотя более ранние исследования резистентности на СкА показали мутации в НСУ Ν85Β РНК полимеразе, и было высказано предположение, что только циклофилин В может быть вовлечен в процесс репликации НСУ (РоЫйа ек а1., 2007), недавние исследования позволили предположить существенную роль циклофилина А в репликации НСУ (СкаОсгр ек а1., 2009; Уапд ек а1., 2008). Учитывая, что мутации в белках вируса Ν85Λ также связаны с резистентностью СкА, и что Ν85Λ взаимодействует как с СурА, так и с СурВ, из-за его специфической активности пептидилпролил цис/транс изомеразы (РР1аке), далее было высказано предположение о роли обоих циклофилинов в жизненном цикле вируса (НаиоиНе ек а1., 2009).

Анти-НСУ действие аналогов циклоспорина является независимым от подавляющего иммунитет свойства, которое зависит от кальциневрина. Это указывает на то, что основным требованием для НСУ активности является связывание СуР, и связывание кальциневрина не требуется. ΌΕΒΙΘ-025, наиболее клинически успешный ингибитор циклофилина для лечения НСУ, показал ш У1кго и ш у1уо эффективность в отношении четырех наиболее распространенных генотипов НСУ (генотипы 1, 2, 3 и 4). Исследования резистентности показали, что мутации, присущие резистентности к ΌΕΒΙΘ-025, отличались от му- 2 022408 таций, установленных для ингибиторов полимеразы и протеазы, и что не было какой-либо перекрестной резистентности с ЗТАТ-С/ЭЛА резистентными вирусными репликонами. Что более важно, ΌΕΒΙΟ-025 также предотвращал развитие ответвления мутации, что придает устойчивость ингибиторам как протеазы, так и полимеразы (СгаЬЬе с1 а1., 2009).

Однако основанные на СТА ингибиторы циклофилина в клинической разработке имеют ряд проблем, которые, как полагают, связаны с их общим структурным классом, включая некоторые неблагоприятные результаты, которые могут привести к отказу от терапии и имеют ограничения в уровнях клинических доз; неустойчивые фармакокинетические свойства, что может привести к неустойчивой эффективности; и повышенный риск взаимодействий лекарство-лекарство, что может привести к проблемам при дозировании.

Наиболее часто встречающиеся побочные эффекты (ПЭ) у больных, получавших ΌΕΒΙΟ-025, включали желтуху, боли в животе, рвоту, усталость и гипертермию. Наиболее клинически важными ПЭ были гипербилирубинемия и снижение количества тромбоцитов (тромбоцитопения). Ред-ΙΕΝ может вызвать глубокую тромбоцитопению, и сочетание с ΌΕΒΙΟ-025 сможет представлять значительную клиническую проблему. Как увеличение билирубина, так и уменьшение тромбоцитов также были описаны в ранних клинических исследованиях с ΝΙΜ-811 (Ке с1 а1., 2009). Хотя гипербилирубинемия, наблюдаемая в процессе клинических исследований ΌΕΒΙΟ-025, реверсировала после прекращения лечения, это было причиной для прекращения лечения у 4 из 16 пациентов, и снижения дозировок в последующих испытаниях. Так как противовирусное действие ингибиторов циклофилина в НСУ связано с дозировкой, снижение дозировки приводило к уменьшению противовирусного эффекта, и многие более поздние исследования ингибиторов циклофилина на основе С8А показали отсутствие или слабое уменьшение противовирусного эффекта на НСУ вирусную нагрузку при дозировании в виде монотерапии (Ъа\\Ц/ с1 а1., 2009; Норкш8 с1 а1., 2009; №коп с1 а1., 2009). ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А известны в качестве ингибиторов транспортеров желчи, таких как насосы экспорта солей желчных кислот и другие печеночные транспортеры (в особенности, ΜΚР2/сΜΟΛТ/ΛΒСС2) (СгаЬЬе с1 а1., 2009). Было высказано предположение, что взаимодействие с транспортерами желчи, в частности МРР2, может быть причиной гипербилирубинемии, наблюдаемой при высоких уровнях доз ΌΕΒΙΟ-025 (Νείδοη с1 а1., 2009, Агшд с1 а1., 2010). Связанное с С8А классом взаимодействие лекарство-лекарство (ΌΌΙ) посредством ингибирования других лекарственных траспортеров, таких как ОАТ1В1 и ОАТ1ВЗ (Кошд с1 а1., 2010), также может быть явлением, возможно ограничивающим некоторые комбинации и применение у некоторых пациентов, проходящих лечение соинфекций, таких как ВИЧ (8ебеи с1 а1., 2010).

Кроме того, ΌΕΒΙΟ-025 и циклоспорин А представляют собой субстраты для метаболизма путем цитохрома Р450 (в особенности, СУРЗА4) и, как известно, являются субстратами и ингибиторами Ргликобелка человека (ΜΌΚΤ) (СгаЬЬе с1 а1., 2009). Также было показано, что циклоспорин А является ингибитором СУРЗА4 ш νίΐΓΟ (Νι\\α εΐ а1., 2007). Это означает, что может существовать повышенный риск взаимодействия лекарство-лекарство с другими препаратами, которые являются субстратами, индукторами или ингибиторами СУРЗА4, такими как, например, кетоконазол, циметидин и рифампицин. Кроме того, ожидается также взаимодействие с лекарственными средствами, которые являются объектом для транспортировки с помощью Р-гликобелка (например, дигоксин), что сможет вызвать сильное взаимодействие лекарство-лекарство у пациентов с НСУ, получающих медицинское лечение других сопутствующих заболеваний (СгаЬЬе с1 а1., 2009). Известно также, что С§А обладает сильно изменяющимися фармакокинетическими свойствами с ранними препаратами, проявляющими пероральную биодоступность в интервале 1-89% (КариП/ак с1 а1., 2004). Без дорогостоящего мониторинга уровней крови пациента, это может привести к увеличению распространенности побочных эффектов из-за увеличения уровней плазмы или уменьшения клинической реакции вследствие пониженных уровней плазмы.

Учитывая, что ингибирование циклофилинов представляет собой новый перспективный подход при лечении НСУ, существует необходимость в обнаружении и разработке более сильных и безопасных ингибиторов СуР для применения в комбинационной терапии против инфекции НСУ.

Санглиферины.

Санглиферин (8РА) и его природные представители относятся к классу смешанных нерибосомальных пептидов/поликетидов, производимых 81гср1отуес8 8р. А92-З08110 (известный также как Ό8Μ 9954) (см. ΑΟ 97/02285), которые первоначально были обнаружены на основе их высокой аффинности в отношении циклофилина (СурА). 8ГА является наиболее распространенным компонентом при ферментации бульонов и проявляет приблизительно в 20 раз более высокую аффинность в отношении СурА по сравнению с С8А. Это привело к предположению, что санглиферины могут быть полезны при лечении НСУ (ΑΟ 2006/138507). Также было показано, что санглиферины обладают более низкой подавляющий иммунитет активностью, чем С8А при ш уПго исследовании (8аидЬег с1 а1., 1999; РеЬг с1 а1., 1999). 8ГА связывается с высокой аффинностью в отношении С8А с сайтом связывания СурА (Ка11еп с1 а1., 2005).

- З 022408

Санглиферины биосинтезировали с помощью смешанной поликетид синтазы (РК8)/нерибосомальный пептид синтетаза (ΝΡΡδ) (см. \УО 2010/034243, Ои с1 а1., 2011). 22-членный скелет макролида состоит из поликетидной углеродной цепи и трипептидной цепи. Пептидная цепь состоит из одной природный аминокислоты, валина и двух неприродных аминокислот: (8)-метатирозина и (δ)пиперазиновой кислоты, соединенных амидной связью. Гидроксилирование фенилаланина (либо ίη χίΐιι на ΝΡΡδ, либо перед биосинтезом), чтобы генерировать (8)-метатирозин, как полагают, происходит через генный продукт χί;·ιΑ.

Подавляющее иммунитет действие санглиферинов.

Подавляющий иммунитет механизм действия δίΑ отличается от других известных иммунофилинсвязывающих подавляющих иммунитет препаратов, таких как СхА. РК506 и рапамицин. δίΑ не ингибирует активность фосфотазы кальциневрина, мишени СхА (ΖοηΚο с1 а1., 2001), вместо его подавляющий иммунитет активности ему было приписано ингибирование интерлейкина-6 (Наг1е1 с1 а1., 2005), интерлейкина-12 (81етхсйи11е с1 а1., 2003) и ингибирование интерлейкин-2-зависимой пролиферации Т-клеток (Ζΐΐίΐπβ & Ыи, 2001). Однако молекулярная мишень и механизм, посредством которого δίΑ оказывает свое подавляющий иммунитет действие, до сих пор не известны.

Молекулярная структура δίΑ является сложной, и его взаимодействие с СурА, как полагают, опосредовано в основном с помощью макроциклической части молекулы. Действительно, макроциклическое соединение (гидроксимакроцикл), полученное при окислительном расщеплении δίΑ, показало сильную аффинность в отношении СурА (8ейгат с1 а1., 2003). Данные рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры показали, что гидроксимакроцикл связывается с тем же активным сайтом СурА в виде СхА. Ранее также было показано, что у аналогов на основе макроциклической части δίΑ отсутствуют подавляющие иммунитет свойства (8ейгат с1 а1., 2003), обеспечивая возможность для разработки не подавляющих иммунитет ингибиторов СуР для предполагаемого использования в терапии НСУ.

В противоположность этому, также имеется возможность разработать подавляющие иммунитет средства с низкой токсичностью для применения в таких областях, как профилактика отторжения трансплантата, аутоиммунные, воспалительные и дыхательные заболевания, включая, но, не ограничиваясь ими, болезнь Крона, синдром Бехчета, увеит, псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит, нефротический синдром, апластическую анемию, билиарный цирроз печени, астму, легочный фиброз, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) и целиакию. Было показано, что санглиферины обладают новым механизмом активности подавления иммунитета (ΖοηΚο с1 а1., 2001), возможно действуя через хемокины дендритных клеток 1ттеске с1 а1., 2011), и поэтому существует возможность разработать средства с механизмом действия, которые отличаются от имеющихся в настоящее время клинических средств, таких как циклоспорин, рапамицин и РК 506.

Другое терапевтическое применение ингибиторов циклофилина.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Также было показано, что ингибиторы циклофилина, такие как СхΑ и ΌΕΒΙΟ-025, возможно могут быть использованы при ингибировании репликации ВИЧ. Как полагают, ингибиторы циклофилина мешают функции СурА в процессе прогрессия/завершение обратной транскрипции ВИЧ (Р1ак. с1 а1., 2008).

- 4 022408

Однако при клинических исследованиях ЭЕВ1О-025 только понизил уровни РНК ВИЧ-1 на >0,5 и >1 1од10 копий/мл у девяти и двух пациентов, соответственно, в то время как у 27 пациентов, проходящих лечение, не было показано понижение уровней РНК ВИЧ-1 (§Теуи с1 а1., 2006). После этого, ΌΕΒΙΘ-025 был опробован на НСУ/ВИЧ инфицированных пациентах, и он показал лучшую эффективность против НСУ, и ВИЧ клинические испытания были прекращены (см. ХУаЮкЫ с1 а1., 2010).

Лечение ВИЧ.

Более 30 млн человек по всему миру заражены ВИЧ-1, с 3 млн новых случаев каждый год. Варианты лечения значительно улучшились с внедрением высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) (ЗсЬортаи с1 а1., 2010), к 2008 году почти 25 антиретровирусных препаратов были лицензированы для лечения ВИЧ-1, включая девять нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ΝΚΤΙ), четыре ненуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы (ΝΝΚΤΙ), девять ингибиторов протеазы (Р1), один ингибитор слияния, один ингибитор ССК5 и один ингибитор интегразы (8Ьа£ет и §сЬарио, 2008). Однако ни одна из этих схем в настоящее время не приводит к полной элиминации вируса, они могут привести к серьезным побочным эффектам, и противовирусная резистентность все еще вызывает серьезную озабоченность. Таким образом, до сих пор существует потребность в новых противовирусных терапевтических средствах, в особенности, по классам механизмов действия, где не существует одобренных лекарственных средств, таких как в случае ингибиторов циклофилина.

Вирус гепатита В.

Гепатит В представляет собой ДНК вирус семейства гепаднавирусов и является средством, вызывающим гепатит В. В отличие от случаев с НСУ и ВИЧ, опубликовано очень мало отчетов об активности ингибиторов циклофилина против вируса гепатита В. Р1ак с1 а1. 2008 описали слабую активность ΌεΒίο025 против НВУ (1С₅₀ 4,1 мкМ), в то время как Χίε с1 а1., 2007 описали некоторую активность СкА против НВУ (1С₅₀ >1,3 мкг/мл). Это отличается от ВИЧ и НСУ, относительно которых имеются многочисленные сообщения о наномолярной противовирусной активности ингибиторов циклофилина.

Лечение НВУ.

НВУ заражено до 400 млн человек во всем мире, и это является одной из основных причин хронического вирусного гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы. В 2008 году было известно шесть лицензированных препаратов для лечения НВУ; интерферон-альфа и пегилированный интерферон-альфа, три аналога нуклеозидов (ламивудин, энтекавир и телбивудин) и один аналог нуклеотида (адефовир дипивоксил). Однако в связи с высокими показателями резистентности, плохой переносимостью и возможными побочными эффектами существует потребность в новых терапевтических средствах (Репт с1 а1., 2008).

Ингибирование митохондриальных пор с транзиторной проницаемостью (тРТР).

Открытие высокопроводимых пор с транзиторной проницаемостью в митохондриях инициирует начало митохондриальной транзиторной проницаемости (МРТ). Это причинное событие, которое приводит к некрозу и апоптозу гепатоцитов после окислительного стресса, токсичности Са²' и ишемии/реперфузии. Было показано, что ингибирование циклофилина Ό (известного также как циклофилин Р) с помощью ингибиторов циклофилина блокируют открытие пор с транзиторной проницаемостью и предотвращает смерть клеток после этих стрессов. Поэтому ингибиторы циклофилина Ό могут быть использованы при симптомах, в которых вовлечено открытие тРТР, таких как дистрофия мышц, в частности врожденная дистрофия мышц Ульриха и миопатия Бетлема (МШау с1 а1., 2008, \УО 2008/084368, Ра1та с1 а1., 2009), рассеянный склероз (Ройе с1 а1., 2009), сахарный диабет (РиртоТо с1 а1., 2010), боковой амиотрофический склероз (Майи 2009), биполярное заболевание (КиЪоТа с1 а1., 2010), болезнь Альцгеймера (Эи и Уаи, 2010), болезнь Хантингтона (Ретту с1 а1., 2010), восстановление после инфаркта миокарда (Соте/ с1 а1., 2007) и хронический алкоголизм (Κίη§ с1 а1., 2010).

Дополнительное терапевтическое применение.

Ингибиторы циклофилина обладают потенциальной активностью при лечении инфекций другими вирусами, такими как вирус ветряной оспы (Р1ак с1 а1., 2008), вирус гриппа А (Ьш с1 а1., 2009), коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром и другие коронавирусы человека и домашних кошек (СЬеи с1 а1., 2005, РТак с1 а1., 2008), вирус Денге (Каи1 с1 а1., 2009), вирус желтой лихорадки (Цшд с1 а1., 2009), вирус западного Нила (Цшд с1 а1., 2009), западный лошадиный вирус энцефалита (Оищ с1 а1., 2009), цитомегаловирус (КатакаИ с1 а1., 2007) и вирус коровьей оспы (СакТто с1 а1., 2003).

Есть также сообщения о возможности использования ингибиторов циклофилина и об ингибировании циклофилина в других областях терапии, таких как при злокачественной опухоли (Нап с1 а1., 2009).

Общие замечания по санглиферинам

Одной из проблем, возникающих при лекарственной разработке соединений, таких как санглиферины, является быстрый метаболизм и глюкуронидация, что приводит к низкой пероральный биодоступности. Это может привести к повышенному риску пищевого действия, более частым случаям неполного высвобождения из лекарственной формы и более высокой вариабельности в зависимости от пациента.

Поэтому остается потребность в определении новых ингибиторов циклофилина и противовоспалительных средств, которые могут быть использованы, в частности, при лечении инфекции НСУ и противовоспалительных состояниях, а также при лечении заболеваний в других областях, при которых может

- 5 022408 быть полезным ингибирование циклофилинов, таких как ВИЧ инфекция, мышечная дистрофия, или для ускорения выздоровления после инфаркта миокарда, или когда полезной является иммуносупрессия. Предпочтительно, такие ингибиторы циклофилина обладают улучшенными свойствами по сравнению с доступными в настоящее время ингибиторами циклофилина, включая одно или более следующих свойств: более длительное время полужизни или повышенная пероральная биодоступность, возможно посредством сниженного метаболизма Р450 и/или уменьшенной глюкуронидации, улучшенная растворимость в воде, улучшенная эффективность в отношении НСУ, уменьшенная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как высокое воздействие на органымишени (например, печень, в случае НСУ), и/или длительное время полужизни (что позволяет избежать частого дозирования), уменьшение взаимодействий лекарство-лекарство, такое как посредством понижения уровня метаболизма СУРЗА4 и ингибирование и пониженное ингибирование (РСР) (что позволяет облегчить комбинирование мультилекарственных средств), и улучшенный профиль побочных эффектов, такой как низкое связывание с МКР2, что ведет к уменьшенному шансу гипербилирубинемии, пониженное иммуносупрессивное действие, улучшенная активность против резистентных видов вируса, в частности, СвА, и резистентных видов вируса аналога СвЛ (например, ΌΕΒΙΘ-025), и повышенный терапевтический индекс (и/или селективность). В настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые могут обладать одним или несколькими из указанных выше свойств. В частности, в настоящем изобретении описаны новые аналоги мутасинтетического санглиферина, которые, по меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления изобретения сокращали метаболизм посредством Р450 или глюкуронидации, например, как показано увеличением времени полужизни микросом, и/или повышенной эффективностью против НСУ, например, как показано низким репликоном ЕС₅₀ и/или повышенным индексом селективности.

Существует также потребность в разработке новых средств, подавляющих иммунитет, которые могут использоваться для профилактики отторжения трансплантата или при лечении аутоиммунных, воспалительных и респираторных заболеваний. Предпочтительно такие иммуносупрессанты должны обладать улучшенными свойствами по сравнению с известными природными санглиферинами, включая одно или более следующих свойств: более длительное время полужизни или улучшенная пероральная биодоступность, возможно посредством уменьшения метаболизма Р450 и/или пониженной глюкуронидации, улучшенная растворимость в воде, повышенная сила подавляющей иммунитет активности, такая как можно видеть в анализах Т-клеточной пролиферации, уменьшенная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как высокое воздействие на органы-мишени, и/или длительное время полужизни (что позволяет избежать частого дозирования), уменьшение взаимодействий лекарство-лекарство, такое как посредством снижения уровня метаболизма СУРЗА4, и ингибирование и пониженное ингибирование (РСР) (что позволяет облегчить комбинирование мультилекарственных средств), и улучшенный профиль побочных эффектов. В настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые могут иметь одно или более указанных выше свойств. В частности, в настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые, по меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления уменьшали метаболизм посредством Р450 или глюкуронидацию, например, как показано повышением полужизни микросом, и могут обладать улучшенной подавляющий иммунитет силой, например, как показано низким 1С₅₀ пролиферации 1-клеток.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым аналогам санглиферина, которые были получены путем мутасинтеза. Указанные аналоги могут быть получены с помощью подпитки аналогами метатирозина продуцирующего санглиферин организма, такого как 81гср1отуссв βρ. А92-З08110 (известный также как Ό8Μ 9954), или более предпочтительно с помощью подпитки аналогами метатирозина генетически разработанного производного продуцирующего санглиферин организма, в котором в£аА или гомолог в£аА инактивирован или удален. Таким образом, настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина, способам получения указанных соединений и способам применения указанных соединений в медицине или в качестве промежуточных соединений при получении следующих соединений.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина и их производным, соответствующим формуле (Ι) или формуле (ΙΙ), далее, или их фармацевтически приемлемым солям

- 6 022408

где К.!, К₂, К_з, Кд и К₅ независимо представляют собой Η, Р, С1, Вг, С₂_₆алкенил или Сыоалкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на гетероатом, выбранный из О, N и 8(О)_Р, в котором р равен 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на карбонил, и где алкильная группа необязательно замещена одним или более атомами галогена;

Х₁, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ независимо представляют собой С или Ν, и в случае, когда любая из указанных групп представлена Ν, присоединенный заместитель отсутствует;

при условии, что когда К₁, К₃, К₄ и К₅ все представляют собой Н и Х₁, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ все представляют собой С, тогда К₂ не может представлять собой ОН;

включая его таутомер; или его изомер, в котором С=С связь в положении С26, 27 С=С (со ссылкой на структуру санглиферина А), показанная как транс, является цис; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-53 кето и С-15 гидроксильной группы и метанола.

Указанная выше структура показывает характерный таутомер, и изобретение охватывает все таутомеры соединений формулы (I), например кетосоединения, где проиллюстрированы енольные соединения, и наоборот.

Конкретными таутомерами, которые включены в определение формулы (I), являются такие, в которых (ΐ) С-53 кетогруппа образует полукеталь С-15 гидроксилом, или (ϋ) С-15 и С-17 гидроксилы могут быть объединены с С-53 кето с образованием кеталя. При нумерации используется система первоначальной структуры санглиферин А.

Определения.

Форма единственного числа, используемая в данном описании, относится к одному или более чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту описания. В качестве примера, аналог подразумевает один аналог или более чем один аналог.

Как используется в данном описании, термин аналог(и) относится к химическим соединениям, которые структурно подобны другому соединению, но немного отличаются по строению (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы).

Как используется в данном описании, термин воспалительные заболевания относится к перечню заболеваний, вызванных воспалением, включая, но, не ограничиваясь ими, юношеские угри, атеросклероз, астму, аутоиммунные заболевания (такие как острый рассеянный энцефаломиелит (ΑΌΕΜ), болезнь Аддисона, очаговую алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром (АФС), аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунные заболевания внутреннего уха, буллезный пемфигоид, целиакию, болезнь Шагаса, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), болезнь Крона, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гнойный гидраденит, болезнь Кавасаки, 1§А нефропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит, красную волчанку, смешанные заболевания соединительной ткани, кольцевидную склеродерму, рассеянный склероз (РС), миастению, нарколепсию, нейромиотонию, обыкновенную пузырчатку, пагубную анемию, псориаз, псориатический артрит, полимиозит, первичный билиарный цирроз печени, ревматоидный артрит, шизофрению, склеродермию, синдром Шегрена, синдром ригидного человека, временный артериит, язвенный колит, васкулит, витилиго, гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника, воспалительные заболевания органов малого таза, ревматоидный артрит и отторжение трансплантата.

- 7 022408

Как используется в данном описании, термин санглиферин(ы) относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, но немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности, образуемые путем ферментации §1гер1ошусе8 8р. А92-308110. Примеры включают подобные санглиферину соединения, обсуждаемые в \УО 97/02285 и \УО 98/07743, такие как санглиферин В.

Как используется в данном описании, термин мутасинтетический(ие) санглиферин(ы) или аналог(и) мутасинтетического санглиферина относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, В, С или И, но которые немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности, образуемые путем ферментации 5>1гср1отусс8 8р. А92-308110 или его мутанта, когда культура подкормлена аналогом метатирозина.

Как используется в данном описании, термин аналог(и) метатирозина относится к химическим соединениям, которые структурно подобны метатирозину, но немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности, такие, которые описаны формулой (III).

Как используется в данном описании, термин НСУ относится к вирусу гепатита С, оболочечному вирусу с одноцепочечной РНК вирусного семейства Р1ау1ушйае.

Как используется в данном описании, термин ВИЧ относится к вирусу иммунодефицита человека, возбудителю синдрома приобретенного иммунодефицита у человека.

Как используется в данном описании, термин биодоступность относится к степени, с которой, или скорости, при которой препарат или иное вещество поглощается или становится доступным на участке биологической активности после введения. Это свойство зависит от ряда факторов, включая растворимость соединения, скорость абсорбции в кишечнике, степень связывания белка и метаболизма т.д. В данном описании описаны различные тесты на биодоступность, которые известны специалисту в данной области техники (см. также Едопп с1 а1., 2002).

Термин растворимость в воде, как используется в настоящем описании, относится к растворимости в водной среде, например, в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8) при рН 7,4, или в 5%-ном растворе глюкозы. Исследования по растворимости в воде представлены ниже в примерах в качестве анализ на растворимость в воде.

Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению, такие как соединений формулы (I), включают общеизвестные соли, образованные фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими кислотами или основаниями, а также четвертичные аммониевые соли кислот. Более конкретные примеры подходящих солей кислот включают соли хлористо-водородной, бромистоводородной, серной, фосфорной, азотной, перхлорной, фумаровой, уксусной, пропионовой, янтарной, гликолевой, муравьиной, молочной, малеиновой, винной, лимонной, пальмовой, малоновой, гидроксималеиновой, фенилуксусной, глутамовой, бензойной, салициловой, фумаровой, толуолсульфоновой, метансульфоновой, нафталин-2-сульфоновой, бензолсульфоновой гидроксинафтоевой, йодистоводородной, яблочной, стеариновой кислот, таннина и т.п. Особый интерес представляют соли хлористо-водородной кислоты. Хотя другие кислоты, такие как щавелевая, не являются сами по себе фармацевтически приемлемыми, они могут быть полезны при получении солей, используемых в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные примеры подходящих солей оснований включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, Ν-метилгюкамина и прокаина. Ссылки в данном описании на соединение согласно изобретению включают как соединения формулы (I), так и их фармацевтически приемлемые соли.

Как используется в данном описании, термин алкил означает прямую или разветвленную цепь алкильной группы. Примером алкила является С^алкил, например С1_-4алкил.

Алкенил относится к алкильной группе, содержащей два или более атомов углерода, которые являются ненасыщенными с одной или несколькими двойными связями.

Примеры алкильных групп включают С1_-4алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил и н-бутил. Примеры алкенильных групп включают С_2-4алкенильные группы, такие как -СН=СН₂ и -СН₂СН=СН₂.

Термин лечение включает профилактическое, а также терапевтическое лечение.

Описание фигур

На фиг. 1 представлены структуры соединений и система нумерации санглиферина А.

На фиг. 2 представлен 'Н ЯМР соединения 14.

На фиг. 3 представлен 'Н ЯМР соединения 15.

На фиг. 4 представлен 'Н ЯМР соединения 16.

На фиг. 5 представлен 'Н ЯМР соединения 17.

На фиг. 6 представлен 'Н ЯМР соединения 18.

На фиг. 7 представлен 'Н ЯМР соединения 19.

На фиг. 8 представлен 'Н ЯМР соединения 20.

- 8 022408

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина, как указано выше, способам получения указанных соединений и способам применения указанных соединений в медицине.

В одном варианте осуществления изобретения соединение представляет собой его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-53 кето и С-15 гидроксильных групп и метанола. В другом варианте осуществления изобретения этого нет.

В некоторых вариантах осуществления изобретения атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-балкильной группы), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, может быть заменен гетероатомом.

Если -СН₃ заменен на Ν, полученная группа представляет собой -ΝΗ₂. Если -СН₂- заменен на Ν, полученная группа представляет собой -ΝΗ-. Если -СНК- заменен на Ν, полученная группа представляет собой -ΝΚ-. Следовательно, атомы азота в К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота.

Если -СН₃ заменен на О, полученная группа представляет собой -ОН.

Когда атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-6алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, может быть заменен гетероатомом, подходящим является замена на О, δ или Ν, в особенности, N или О, в частности О.

Когда любой из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ содержит группу δ(Ο)_ρ, переменная р соответствующим образом представляет собой 0 или 1. В одном варианте осуществления изобретения р равен 0. В другом варианте осуществления изобретения р равен 1. В другом варианте осуществления изобретения р равен 2.

Когда С_1-10алкильная группа (например, С_1-6алкильная группа), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, содержит более одного гетероатома, они обычно разделены двумя или более атомами углерода.

Подходящим является, когда атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С_1-6алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, не заменен каким-либо гетероатомом или еще представляет собой ОН или ΝΗ₂.

Когда атом углерода С_1-10алкильной группы (например, С₁-₆алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, может быть заменен на карбонил, подходящим является, когда карбонил расположен по соседству с другим атомом углерода или атомом азота. Подходящим является, когда карбонильные группы не расположены по соседству с атомами серы или кислорода.

Например, один или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ могут представлять собой -СОС_1-Залкил, например -СОМе.

Подходящим является, когда атом углерода С_1-10алкильной (например, С_1-6алкильной) группы, которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, не заменен на карбонил.

С_1-10алкильная группа (например, С_1-6алкильная группа), которая может быть представлена одним или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅, может быть замещена одним или более атомами галогена. Например, один или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ могут представлять собой -СР₃. Альтернативно, один или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ могут представлять собой С_1-10алкил (например, С_1-6алкил), замещенный одним или более (например, одним) атомами С1 или Р (например, -СН₂СН₂С1).

Подходящим является, когда С_1-10алкильная группа (например, С_1-6алкильная группа) из К₁, К₂, К₃, К₄ или К₅ не замещена галогеном.

Когда одна или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ представляют собой С_1-10алкильную группу (например, С_1-6алкильную группу), подходящим является, когда группа(ы) представляет(ют) собой С_1-4алкил (например, С_1-2алкил, такой как метил).

В варианте осуществления изобретения один или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ представляют собой С_1-6алкил (такой как С_1-2алкил) или С_2-Залкенил, например, один или более из К₁, К₂, К₃, К₄ и К₅ представляют собой метил.

Подходящим является, когда К₁ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-6алкил (например, метил). Наиболее подходящим является, когда К₁ представляет собой Н или Р, в особенности Н.

Подходящим является, когда К₂ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН, ΝΗ₂ или С_1-6алкил (например, метил). Более подходящим является, когда К₂ представляет собой Н, Р, ОН или ΝΗ₂, в особенности, ОН.

Подходящим является, когда К₃ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-6алкил (например, метил). Более подходящим является, когда К₃ представляет собой Н, Ме или Р. К₃ также может представлять собой этил.

Подходящим является, когда К₄ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-6алкил (например, метил). Более подходящим является, когда К₄ представляет собой Н или Р.

Подходящим является, когда К₅ представляет собой Н, Р, С1, СР₃, ОН или С_1-6алкил (например, метил). Более подходящим является, когда К₅ представляет собой Н или Р.

Подходящим является, когда один или несколько, более подходящим является, когда два или более (например, три или более) из К₁, К₂, К₃, К₄ или К₅ не представляют собой Н.

Подходящим является, когда один или более, например, два или более из К₁, К₂, К₃, К₄ или К₅ пред- 9 022408 ставляют собой Р.

Подходящим является, когда К₃, или Кд, или К₃ и К₄ представляют собой Р. В другом варианте осуществления изобретения К! и К₃ представляют собой Р.

В одном варианте осуществления изобретения X! представляет собой N (следовательно, К! отсутствует). В другом, более предпочтительном варианте осуществления изобретения X! представляет собой С.

Подходящим является, когда Х₂ представляет собой С.

Подходящим является, когда Х₃ представляет собой С.

Подходящим является, когда Х4 представляет собой С.

Подходящим является, когда Х₅ представляет собой С.

В одном варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (I). В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (ΙΙ).

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Н, Кд представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, и Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К! представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Р, Кд представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К₁ представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Р, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К₁ представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Ме, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

- 10 022408

В приемлемом варианте осуществления изобретения К представляет собой Н, К₂ представляет собой Н, К₃ представляет собой Н, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ΝΗ₂, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К₁ представляет собой Н, К₂ представляет собой Р, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К₁ представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Н, Кд представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, Х₁ представляет собой Ν и Х2, Х3, Х4 и Х5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

- 11 022408

которая также может быть представлена как

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К! представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Р, К₄ представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, X!, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Р, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_ь Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

- 12 022408

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Ме, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой Η, Χι, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой Н, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, X!, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К! представляет собой Н, К₂ представляет собой ΝΗ₂, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, X!, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К_! представляет собой Н, К₂ представляет собой Р, К₃ представляет собой Н, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Н, Х_!, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

- 13 022408

В приемлемом варианте осуществления изобретения К; представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Εΐ, Кд представляет собой Н, К₅ представляет собой Η, Χι, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения К! представляет собой Р, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Р, К₄ представляет собой Н, К₅ представляет собой Η, X!, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

В приемлемом варианте осуществления изобретения Κι представляет собой Н, К₂ представляет собой ОН, К₃ представляет собой Н, Кд представляет собой Р, К₅ представляет собой Н, Χι представляет собой Ν, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой:

которая также может быть представлена как

- 14 022408

В некоторых вариантах осуществления изобретения двойная связь в положении С26, 27 (со ссылкой на структуру санглиферина А) может быть в виде цис вместо транс.

Как правило, соединения по изобретению получают мутасинтезом.

Обычно, способ получения некоторых соединений формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемой соли включает затравку бактериологического ферментативного бульона культурой производителя санглиферина (такого как §1тер1ошусек кр. А92-308110 (известный также как Ό8Μ 9954)) или более предпочтительно производителя санглиферина с инактивированным или удаленным геном кГаА или гомологом гена к£аА;

подпитку бактериологического ферментативного бульона аналогом метатирозина (как показано в формуле (III));

проведение ферментации до получения аналога санглиферина; экстракцию и выделение аналога санглиферина .X

СО₂К₇

Р-^Хзх''^ХэР ^{ΝΗ2 к}3 ^а4 ^к5

В₄

Формула {III) где Н- представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, такую как алкильная группа, например С_1-6алкил, такой как Ме.

Подходящие Х₁, Х₂, Х₃, Х₄, Х₅, Н₁, Н₂, Н₃, Н₄ и Н₅ группы в формуле (III) являются такими, как определено для соединений формулы (I) и (II).

Подпиткой может быть рацемическая или Ь-форма соединения формулы (III).

Соединения формулы (III) являются либо коммерчески доступными, либо получены обычными способами синтеза органической химии. Один общий путь получения соединений формулы (III) такой, как показано на следующей схеме 1:

ιν Ι

Схема 1:

а) сочетание альдегида формулы (IV) с подходящим фрагментом, например, (Н О);Р(О)СН(\НРС>)СС);Н .

В) гидрирование и удаление защитных групп, если необходимо. РО=защитная группа.

Альдегиды формулы (IV) могут быть коммерчески доступными или легко могут быть синтезированы специалистом в данной области. При получении соединений формулы (III) из соединений формулы (IV) может быть необходимым использовать приемы введения и удаления защитных групп. Эти методы известны специалисту в данной области, и подходящие защитные группы описаны в обзоре Отееие’к Рто1есбуе Отоирк ш Отдашс δγηΐΒεκίκ (^и1к апб Отеепе, 4* Ебйюп, 2007).

В дополнение к конкретным способам и ссылкам, предложенным в настоящем описании, специалист в данной области может также обратиться к ссылкам на способы синтеза в обычных учебниках, включая, но, не ограничиваясь ими, νο^εΐ'κ Тех!Воок о£ Ртасбса1 Отдашс СВеш151ту (Ритшкк с1 а1., 1989) и МатсВ'к Абуаисеб Отдашс СВеш151ту (§шйВ и МатсВ, 2001).

Мутасинтетический аналог санглиферина согласно изобретению может быть введен самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими агентам. Совместное введение двух (или более) средств может позволить уменьшить дозу каждого из используемых, снижая, таким образом, побочный эффект, что может привести к улучшению эффективности и, следовательно, повышенной δνκ, и уменьшить резистентность.

- 15 022408

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или несколькими терапевтическим(ими) средством(ами) при лечении инфекции НСУ, согласно стандартам проведения лечения. Таким средством может быть интерферон (например, ρΙΡΝα и/или рибавирин).

В альтернативном варианте осуществления изобретения мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или нескольким другими противовирусными средствами, такими как 8ТАТС/ΌΆΆ (в частности, средство-мишень для лечения НСУ), которое может представлять собой одно или более из следующих: ненуклиозидные ингибиторы полимеразы (например, ΙΌΧ375, УСН-222, ΒΙ 207127, ΑΝΑ598, УСН-916), нуклеозидные или нуклеотизные ингибиторы полимеразы (например, 2'-Сметилцитидин, 2'-С-метиладенозин, К1479, Ρ8Ι-6130, К7128, К1626), ингибиторы протеазы (например, ΒΙΕΝ-2061, УХ-950 (телапревир), 8СН503034 (боцепревир), ТМС435350, МК-7009, К7227/ПТМ4-191, ЕА-058, ЕА-063) или ингибиторы проникновения вирусов (например, РКО 206).

Препараты удобным образом могут быть представлены в виде единичной дозированной формы и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармации. Такие способы включают стадию приведения в контакт активного ингредиента (соединение по изобретению) с носителем, который представляет собой один или более ингредиентов состава. Обычно препараты получают путем равномерного и тщательного перемешивания активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с обоими, и затем, если необходимо, формования продукта.

Соединения по изобретению обычно вводят перорально в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент, необязательно, в виде нетоксичной аддитивной соли органической или неорганической кислоты или основания, в фармацевтически приемлемой дозированной форме. В зависимости от заболевания и получающего лечение пациента, а также от пути введения, композиции могут быть введены в различных дозах.

Например, соединения по изобретению могут быть введены перорально, буккально или подъязычно в виде таблеток, капсул, овул, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизирующие или окрашивающие агенты, для применения с немедленным, замедленным или контролируемым высвобождением.

Такие таблетки могут содержать инертные эксципиенты, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, дезинтегранты, такие как крахмал (предпочтительно, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки), натрийкрахмалгликолят, натрийкроскармеллоза и некоторые сложные силикаты, и гранулирующие связующие агенты, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и камедь. Дополнительно могут быть включены агенты, такие как агенты, придающие скольжение, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерина бегенат и тальк.

Твердые составы подобного типа также могут быть использованы в виде наполнителей в желатиновых капсулах. В этом отношении предпочтительные инертные эксципиенты включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и/или эликсиров соединения по изобретению могут быть объединены с различными подслащивающими или ароматизирующими агентами, красящим веществом или красками, с эмульгирующим и/или суспендирующим агентами и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, и их комбинациями.

Таблетка может быть изготовлена прессованием или формованием, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены путем прессования в соответствующей машине активного ингредиента в свободной текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим агентом (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), лубрикантом, инертным разбавителем, консервантом, дезинтегрантом (например, натрийкрахмалгликолятом, поперечно-связанным повидоном, поперечно-связанной натрийкарбоксиметилцеллюлозой), поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формовкой в соответствующей машине смеси порошкообразного соединения с инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты или на них могут быть нанесены пометки, и они могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в различных пропорциях для обеспечения желаемого режима высвобождения.

Препараты согласно настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или в неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле. Активный ингредиент может быть также представлен в виде болюса, электуария или пасты.

Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, конкретно указанным выше, препараты по данному изобретению могут включать другие агенты, общеизвестные в данной области, относящиеся к

- 16 022408 виду рассматриваемого препарата, например, подходящие для перорального введения препараты могут включать ароматизирующие агенты.

Агенты, такие как консерванты и буферирующие агенты, могут быть успешно растворены в наполнителе. Для повышения стабильности, после помещения в пузырек композиция может быть заморожена, и вода удалена в вакууме. Затем пузырек с сухим лиофилизованным порошком может быть снабжен пузырьком с водой для инъекций для восстановления жидкого препарата перед использованием.

Доза вводимого соединения по изобретению будет меняться в соответствии с конкретным соединением, со страдающим заболеванием субъекта и природой и серьезностью заболевания и физического состояния субъекта, и выбранного пути введения. Соответствующая доза может быть легко определена специалистом в данной области.

Композиции могут содержать 0,1% по массе, предпочтительно 5-60%, более предпочтительно 1030% по массе, соединения по изобретению, в зависимости от способа введения.

Специалисту в данной области понятно, что оптимальное количество и интервал индивидуальных дозировок соединения по изобретению будут определяться природой и пределами возможности подвергаемого лечению состояния, формой, путем и участком введения, а также возрастом и состоянием конкретного, находящегося на лечении субъекта, и что лечащий врач окончательно устанавливает подходящие дозы, которые должны быть использованы. Указанное дозирование можно повторять так часто, как это необходимо. В случае развития побочных эффектов количество и/или частоту дозировок можно изменить или снизить в соответствии с обычной клинической практикой.

Следующие аспекты изобретения включают соединение согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического препарата; соединение согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического препарата при лечении вирусных инфекций (в особенности, ДНК-вирусных инфекций), таких как НСУ или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов;

фармацевтическую композицию, содержащую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем;

фармацевтическую композицию, содержащую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, содержащую дополнительно второй или последующий активный ингредиент, в особенности, активный ингредиент, показанный при лечении вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов;

способ лечения вирусных инфекций (в особенности, ДНК-вирусных инфекций), таких как НСУ или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно изобретению;

применение соединения согласно изобретению при получении лекарственного средства для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов;

способ получения мутасинтетического санглиферина (такого как соединение формулы (I) или (II)), который включает подпитку продуцирующих санглиферин бактерий, таких как δΙίΌρΙοιηγΌΟΧ хр (например, А92-308110), соединением формулы (III) или его солью, и культивирование таких бактерий, которые вырабатывают мутасинтетический санглиферин;

способ в соответствии с предыдущим абзацем, где бактерией, вырабатывающей санглиферин, является δΐ^ерΐοшусех хр, в котором ген хίаΑ или гомолог гена хίаΑ инактивирован или удален;

способ в соответствии с предыдущими двумя абзацами, дополнительно включающий стадию выделения мутасинтетического санглиферина.

Новые соединения формулы (III) (такие как перечислено в табл. 1, и кислоты и сложные эфиры соединений формулы (III), как перечислено в табл. 1) и формулы (ГУ), включая их соли и сложные эфиры, также образуют аспект изобретения.

Общие способы.

Вещества и способы.

Штаммы бактерий и условия роста.

Производитель санглиферина δΐ^ерΐοшусех хр. Α92-308110 (ΌδΜ по 9954, приобретен у фирмы ΌδΜΖ, Вгаипхсй№е1§, Оетшаиу), также называемый ВЮТ-4253 и ВЮТ-4370 или его производные, такие как ВЮТ-4585, поддерживаемый на среде овсяного агара, МАМ, ШР4 или ШР2 (см. далее) при температуре 28°С.

рКС1139, стандартную δΐ^ерΐοшусех-Ε.сο1^ челночную плазмиду, получали от фирмы ЛоНп Фпсх Сейте, ИК, и она описана у В1етшап с1 а1., 1992 и Клсхсг с1 а1., 2000.

ВЮТ-4585 выращивали на овсяном агаре при температуре 28°С в течение 7-10 дней. Споры с поверхности агарного планшета собирали в раствор 20% мас./об. стерильного глицерина в дистиллированной воде и хранили по 0,5 мл аликвот при температуре -80°С. Штамм замороженных спор использовали

- 17 022408 для затравки посевной среды 303 или 3М25-3. Посевную среду с затравкой инкубировали при встряхивании в интервале 200 и 300 об/мин при 5,0 или 2,5 см амплитуде качания при температуре 27°С в течение 24 ч. В ферментативную среду ЗОР-2 или ВТ6 вносили затравку 2,5-10% семян культуры и инкубировали при встряхивании в интервале 200 и 300 об/мин при 5 или 2,5 см амплитуде качания при температуре 24°С в течение 4-5 дней. Затем культуру собирали для экстракции.

Аналоги метатирозина.

Метил (23)-2-амино-3-(6-гидрокси(2-пиридил))пропаноат, метиловый эфир Ь-3аминофенилаланина, метиловый эфир Ь-4-метилметатирозина, метиловый эфир Ь-4-фторметатирозина и метиловый эфир Ь-4,5-дифторметатирозина получали от фирмы №1сНст (ИЗА).

ΌΕ-3-фторфенилаланин и Ь-фенилаланин были получены от фирмы Зщта (ИК).

ОЬ-метатирозин был получен от фирмы ИиогосЬет (ИК).

Ь-метатирозин был получен от фирмы А1Га Аекаг (ИК).

ΌΕ-4-фторметатирозин (8), ΌΕ-5-фторметатирозин (9), метил 2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропаноат (10), метил 2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11), метил 2амино-3-(2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12) и метил 2-амино-3-(2,6-дифтор-3гидроксифенил)пропаноат (13) синтезировали следующим образом:

ОЬ-4-фтор метатирозин (8)

К раствору 8-1 (3 г, 19,5 ммоль) в сухом ЭСМ (150 мл) добавляли по каплям ВВг₃ (4 М в ЭСМ, 14,6 мл, 58,5 ммоль) при температуре -70°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли ледяную воду и экстрагировали ЭСМ. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂ЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 8-2.

К раствору 8-2 (0,9 г, 6,4 ммоль) в ацетоне (40 мл) при комнатной температуре добавляли К₂СО₃ (2,2 г, 16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли воду и ацетон удаляли в вакууме, затем экстрагировали ЕЮАс, органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂ЗО₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 8-3.

Смесь 8-3 (1 г, 4,34 ммоль), гиппуровой кислоты (860 мг, 4,80 ммоль), №ОАс (400 мг) и Ас₂О (2,2 мл) перемешивали при температуре 80°С в течение 2 ч. Реакционную смесь желтого цвета охлаждали и добавляли холодный ЕЮН (10 мл), смесь охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин и затем выливали в 30 мл ледяной воды, охлаждали, и продукт собирали фильтрованием. Твердое вещество сушили в вакууме, с получением соединения 8-4.

Раствор соединения 8-4 (300 мг, 0,8 ммоль) и №ЮАс (71 мг, 0,87 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли роторным упариванием, и остаток растворяли в 50 мл ЕЮАс, ЕЮАс раствор промывали два раза водой и концентрировали, с получением соединения 8-5.

Раствор соединения 8-5 (360 мг, 0,89 ммоль) в МеОН (50 мл) подвергали гидрированию над 10% Ρά/С (77 мг) при нормальном давлении в течение 20 час. После удаления катализатора фильтрованием, растворитель упаривали, с получением продукта 8-6.

Раствор соединения 8-6 (210 мг) в 3н. НС1 (10 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч, раствор упаривали досуха и остаток очищали флэш-хроматографией с обращенной фазой (геуегкесотЫЛакН), с получением целевого продукта 8.

- 18 022408

ОЬ-5-фтор метатирозин (9) и метил 2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (10)

К раствору соединения 9-1 (20 г, 97,55 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) при температуре -78°С добавляли по каплям н-бутиллитий (43 мл, 2,5 М, 107,3 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин и при этой температуре добавляли Ν,Ν-диметилформамид (15,1 мл, 195,1 ммоль). Смесь перемешивали в течение еще 30 мин и удаляли охлаждающую баню. Спустя 1 час реакцию гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, с получением соединения 9-2.

К раствору соединения 9-2 (6 г, 38,9 ммоль) в сухом ЭСМ (200 мл) при температуре -70°С добавляли по каплям ΒΒπ, (4 М в ЭСМ, 30 мл, 116,8 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли ледяную воду и экстрагировали ЭСМ. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 9-3.

К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (4,64 г, 14 ммоль) в ЭСМ (150 мл) при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (4,26 г, 28 ммоль). Спустя 10 мин добавляли соединение 9-3 (1,95 г, 14 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор разбавляли ЕкОАс (150 мл), разделяли и органический слой промывали 1н. НС1, сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением соединения 9-4.

Раствор соединения 9-4 (1 г) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 200 мг 10% Рй/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением соединения 10.

К раствору соединения 10 (300 мг, 1,4 ммоль) в ЕкОН (30 мл) добавляли водн. №ГОН (2н., 4 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли и остаток нейтрализовали до рН 6 с помощью 2н. НС1, образовавшиеся кристаллы белого цвета собирали фильтрованием, с получением целевого соединения 9.

Метил 2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11)

РДС, Н; НО^л^х,СО_гМе мн_г и

К раствору соединения 11-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл ЭСМ при температуре -78°С добавляли по каплям ΒΒπ, (4 М в ЭСМ, 3,6 мл, 13,5 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20°С в течение 4 ч. Затем медленно добавляли смесь лед/вода, слои разделяли, органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂8О₄ и упаривали досуха. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

- 19 022408

К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил) ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ИСМ при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (2,8 г, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 11-2 (неочищенное соединение с последней стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли ИСМ (50 мл), промывали 1н. НС1 (20 мл), сушили над №-ь8О₄ и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1), с получением соединения 11-3.

Смесь соединения 11-3 (500 мг, 1,5 ммоль) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 50 мг 10% Ρά/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования, растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэшхроматографией с обращенной фазой (геуеше-сотЪШакЬ), с получением соединения 11 в виде белого твердого вещества.

Метил 2-амино-3-(2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12)

К раствору соединения 12-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл ИСМ при температуре -78°С добавляли по каплям ВВг₃ (4 М в ИСМ, 3,6 мл, 13,5 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20°С в течение 4 ч. После медленного добавления смеси лед/вода, слои разделяли, органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над №₂8О₄ и упаривали досуха. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил) ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ИСМ при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (2,7 мл, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 12-2 (неочищенное соединение с последней стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли ИСМ (100 мл), промывали 1н. НС1 (30 мл), сушили над №-ь8О₄ и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1), с получением соединения 12-3.

Смесь соединения 12-3 (500 мг, 1,44 ммоль) в МеОН (10 мл) подвергали гидрированию над 100 мг 10% Ρά/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэшхроматографией с обращенной фазой (геуеше-сотЫйакЬ), с получением желаемого соединения 12 в виде белого твердого вещества.

Метил 2-амино-3-(2,6-дифтор-3-гидроксифенил)пропаноат (13)

К раствору 2,4-дифторфенола (2 г, 15,4 ммоль) в 50 мл ДМФ при температуре 0°С добавляли К₂СО₃ (3,2 г, 23,1 ммоль) и ВпВг (2,2 мл, 18,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли воду (100 мл) и ЕА (200 мл), органические слои промывали водой (50 мл) и насыщенным раствором соли (50 мл), сушили над №₂8О₄ и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=10/1), с получением неочищенного соединения 13-1.

К раствору соединения 13-1 (2 г, 9 ммоль) в 10 мл ТГФ при температуре -78°С добавляли по каплям Н-ВиЫ (4 мл, 2,5 М) и перемешивали в течение 30 мин. Добавляли ДМФ (1,3 г, 0,018 ммоль) и вновь перемешивали в течение 30 мин. Затем охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешива- 20 022408 ли при комнатной температуре в течение 1 ч, затем гасили водой. Смесь экстрагировали этилацетатом (20 млх3), сушили над Να₂8Ο₄ и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=10/1), с получением соединения 13-2 в виде желтого твердого вещества.

К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (728 мг, 2,2 ммоль) в 20 мл Όί'Μ при комнатной температуре добавляли ΌΒυ (319 мг, 2,1 ммоль). Спустя 10 мин добавляли соединение 13-2 (500 мг, 2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли Όί'Μ (50 мл), промывали 1н. НС1 (20 мл), сушили над Να₂8Ο₄ и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1) с получением 13-3 в виде масла желтого цвета.

Соединение 13-3 (600 мг, 1,32 ммоль) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 60 мг 10% Ρά/С при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией с обращенной фазой (геуегее-сошЫйакЬ), с получением желаемого соединения 13 в виде твердого вещества белого цвета.

Составы сред.

Воду, используемую для приготовления питательной среды, получали, используя систему для очистки воды МППрогс Εΐιχ Апа1уйса1 Огайе.

Питательная среда для посева 808

Ингредиент (и поставщик) Содержание

глюкоза (Зьдта, С7021)	7,50	г
глицерин (ПдЬег зсьепРИПс, С/0650/25)	7,50	г
дрожжевой экстракт (Весбоп Ωίοΐίίηδοη, 212770)	1,35	г
солодовый экстракт (ВесДоп Шскьпзоп, 218630)	3, 75	г
картофельный крахмал (растворимый) (Зьдпша,
22004)	7,50	г
ΝΖ-амин А (51дша, С0626)	2,50	г
подсушенная соевая мука, ЦцДгьсоу (ΑϋΜ, 063-160)	2,50	г
Ь-аспарагин (31дта, А0884)	1,00	г
СаСОз (Са1с1бес, У/405)	0, 05	г
ЫаС1 (РьзЬег есьепПГ ί с, 2/3160/65)	0,05	г
КН2РО4 (81дта, Р3786)	0,25	г
К2НРО4 (Зхдта, Р5379)	0,50	г
МдЗО4,7Н2О (51дта, М7774)	0, 10	г
раствор микроэлементов В	1,00	мл
агар	1,00	г
противовспениватель ЗАС471 (СЕ ЗШсопеа,
ЗАС471)	*0,20	мл
КО Н2О до окончательного объема в	**1,00	л

рН для предварительной стерилизации доводили до рН 7,0 с помощью 10 Μ ΝαΟΗ/10 М Н₂8О₄, стерилизовали путем нагревания при температуре 121°С, 20-30 мин (автоклавирование). Внимание:

* противовспениватель использовали только в биореакторах для посева, не в колбах для посева, ** окончательный объем устанавливали в соответствии с учетом объема посева.

- 21 022408

Общий способ ферментации.

Раствор микроэлементов В

Ингредиент Содержание

ГеЗО4. 7Н2О	(31дша, Р8633)	5, 00	Г
Ζη3Ο4.7Н2О	(Зйдта, Ζ0251)	4, 00	г
МпС12.4Н2О	(51дта, М8530)	2, 00	г
СиЗО4.5Н2О	(АЫггсЬ, 20,919-8)	0, 20	г
(ΝΗ4) 6Мо7024	(НзЬег зсХепПбю, А/5720/48)	0,20	г
СоС12.6Н20	(Зхдта, С2644)	0,10	г
Н3ВОз (Згдша, В6768)	0,10	г
ΚΙ (А1£а Аезаг, А12704)	0, 05	г
Н2ЗО4 (95%)	(Пика, 84720)	1, 00	мл
КО Н2О	до окончательного объема в	1,00	л

Производственная питательная 8СР2

Ингредиент Содержание подсушенная соевая мука (ЫиГггсоу) (ΑϋΜ,

063-160) глицерин (ПзЬег зстпг.Шс, С/0650/25) буфер МЕЗ (Асгоз, 172595000) противовспениватель ЗАС471 (СЕ ЗШсопез, 5АО471)

КО Н₂О до окончательного объема в

20,00 г 40,00 г 19,52 г * 0,2 0 мл **1,00 л или его соли, рН для предварительной стерилизации доводили до рН 6,8 с помощью 10 Μ ΝαΟΗ, стерилизовали путем нагревания при температуре 121°С, 20-30 мин (автоклавирование). Внимание:

* окончательный объем устанавливали в соответствии с учетом объема посева, ** противовспениватель использовали только в биореакторах, не в колбах.

Среда 8М25-3

Ингредиент

Глицерин (ПзЬег βοίβηΐίίίο, С/0650/25) 40 г

Соевый пептон АЗ ЗС (ОгдапобесЬп1е) Ю г

Солодовый экстракт (БьГсо) 21 г до окончательного объема в 1л рН для предварительной стерилизации не доводили (то есть, рН 7,0)

СредаΙ8Ρ4

Ингредиент

Растворимый крахмал (ϋί£οο)

К₂НРО₄ МдЗО₄. 7Н₂О ЦаС1 (ΝΗ₄) ₂ЗО₄ СаСО₃

Раствор солей микроэлементов Ι3Ρ Агар до окончательного объема в г

г г

г г

г мл г

л

Делали пасту с крахмалом в небольшом количестве холодной воды и доводили до объема 500 мл. Добавляли другие ингредиенты в раствор II в 500 мл воды, рН должно быть в пределах от рН 7,0 до рН 7,4 (рН 7,3). Смешивали два раствора вместе и добавляли агар.

- 22 022408

Соли микроэлементов 1§Р

Ингредиент

ГеЗО₄.7Н₂О 1 г

МпС1₂.4Н₂О 1 г

Ζη5Ο₄.7Η₂Ο 1 г до окончательного объема в 1л

Хранится при температуре 4®с

Криоконсервированные штаммы спор ΒΙΟΤ-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали путем перенесения 4,0 мл штаммов спор в 400 мл среды δΜ25 в 2-л колбу Эрленмейера с пробкой из пены. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (5,0 см амплитуда качания). Из культуры семян 25 мл переносили в 250 мл производственной среды §СР2+5% НР20 2 л в колбу Эрленмейера с пробкой из пены. После 24 ч культивирования при 24°С и 250 об/мин (2,5 см амплитуда качания) добавляли 2 мл 250 мМ рацемического или 125 мМ энантиомерно чистого раствора нужного предшественника в 1 М хлористо-водородной кислоте и 2 мл 250 мМ метанольного раствора БЬ-пиперазиновой кислоты в каждую производственную колбу до конечной концентрации 1 мМ отдельных энантиомеров предшественников. Культивирование продолжали еще в течение четырех дней при 24°С и 250 об/мин (2,5 см амплитуда качания).

Анализ культуральных бульонов с помощью ЖХ-УФ и ЖХ-УФ-МС.

Культуральный бульон (1 мл) и этилацетат (1 мл) добавляли и перемешивали в течение 15-30 мин, затем центрифугировали в течение 10 мин. Собирали 0,4 мл органического слоя, упаривали досуха и затем повторно растворяли в 0,20 мл ацетонитрила.

Условия ВЭЖХ:

С18 Нерегс1опе ВБ§ С18 Колонка 3 мкм, 4,6 ммх150 мм

Снабженная системой защиты для ВЭЖХ колонок РЬеиотеиех Аиа1уЬса1 С18, держатели картриджа КГО-4282

Температура колонки при 50°С

Скорость потока 1 мл/мин

Монитор УФ при 240 нм

Инжектируемая аликвота 20 мкл

Градиент растворителей:

мин: 55% В

1,0 мин: 55% В

6,5 мин: 100% В

10,0 мин: 100% В

10,05 мин: 55% В

13,0 мин: 55% В

Растворитель А представляет собой смесь вода+0,1% муравьиная кислота

Растворитель В представляет собой смесь ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота

В этих условиях §£А элюируется на 5,5 мин

В этих условиях δίΒ элюируется на 6,5 мин

ЖХ-МС осуществляли на интегрированной системе ВЭЖХ АдПеи! НР1100 в сочетании с Вгикег БаЬотсв Евсцигс 3000+масс-спектрометр с электрораспылением, работающий в режиме положительных ионов, используя хроматографию и растворители, описанные выше.

ОС ЖХ-МС способ.

Условия ВЭЖХ:

С18 Нурегс1оие ВБ§ С18, Колонка 3 мк, 4,6 ммх150 мм

Снабженная системой защиты для ВЭЖХ колонок РЬеиотеиех Апа1уЬса1 С18, держатели картриджа КГО-4282

Температура колонки 50°С

Скорость потока 1 мл/мин

Монитор УФ при 210, 240 и 254 нм

Градиент растворителей:

мин: 10% В

2,0 мин: 10% В мин: 100% В мин: 100% В

17,05 мин: 10% В мин: 10% В

Растворитель А представляет собой смесь вода+0,1% муравьиная кислота

Растворитель В представляет собой смесь ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота

- 23 022408

Условия МС:

МС работает в режиме коммутации (переключение между положительным и отрицательным), сканируя от 150 до 1500 а.е.м.

ЖХ-МС метод ίη νίΐτο анализа (например, для оценки микросомальной стабильности)

Используемые приборы ΑΡΙ-2000, ΑΡΙ-4000 или ИРЬС Условия ВЭЖХ:

для соединения 15: АСЦИГТУ ИРЬС ВЕН С18 (2,1x50 мм, 1,7 мкм) для соединений 5, 14, 16, 17, 18, 19 ИШтаТе ХВ-С18 (2,1x50 мм, 5 мкм).

Температура колонки при 50°С

Скорость потока 0,6 мл/мин

Градиент растворителей А1 (например, для соединения 15):

0,2 мин: 20% В 0,6 мин: 95% В 1,1 мин: 95% В 1,15 мин: 20% В

1.5 мин: стоп

Растворитель А представляет собой смесь Н₂0-0,025% РА-1 мМ ИН₄ОАС Растворитель В представляет собой смесь АСИ-0,025% РА-1 мМ ИН₄ОАС Градиент растворителей А2 (например, для соединений 5, 14, 16, 17, 18, 19):

0,3 мин: 10% В

0,8 мин: 95% В

2,3 мин: 95% В 2,31 мин: 10% В

3.5 мин: стоп

Растворитель А представляет собой смесь Н₂О-0,1% РА Растворитель В представляет собой смесь МеОН-0,1% РА отрицательный режим сканирования:

установка МЕМ:

переходы [Ба]

1089,7—>504, 2 положительный режим сканирования:

установка МЕМ:	переходы [Ба)
5	1090,6—>1054, 6
14	1108,$-»1072,5
15	1126,7—>1090,0
16	1108,8—>1072, 3
17	1104,5—>1068,5
18	1074,6—>1038,8

Ιη νίΐτο анализ репликонов для оценки противовирусной НСУ активности.

Противовирусная эффективность против НСУ генотипа 1 может быть исследована следующим образом.

За день до добавления исследуемого вещества, клетки Ηιι1ι5.2. содержащие репликон НСУ генотипа 13891ис-иЫ-псо/Ж3-375.1 (Уто1ук е! а1., 2003) и субкультивированные в среде для роста клеток [ΌΜΕΜ (Са1 № 41965039) с добавлением 10% РС8, 1% заменимых аминокислот (11140035), 1% пенициллина/стрептомицина (15140148) и 2% генетицина (10131027); 1п\Цгодсп| в соотношении 1,3-1,4 и выращенные в течение 3-4 дней в 75 мл колбах для культур ткани (ТесЬпо Р1а8Йс РгобисЮ), собирали и высевали в аналитическую среду (ΌΜΕΜ, 10% РС8, 1% заменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина) при плотности 6500 клеток/лунка (100 мкл/лунка) в микротитровальные 96-луночные планшеты для культуры тканей (Ра1соп, ВсскЮп Эюкиъоп для оценки антиметаболический эффект и Си11итР1а1е, Реткш Е1тет для оценки противовирусного эффекта). Микротитровальные планшеты инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО₂, 95-99% относительной влажности), с получением несливающегося монослоя клеток.

Г отовили серийные разведения; каждые серии разведения осуществляли, по меньшей мере, дважды. Следуя установке анализа, микротитровальные планшеты инкубировали в течение 72 ч (37°С, 5% СО₂, 95-99% относительной влажности).

Для оценки антиметаболических эффектов, аналитическую среду отсасывали, заменяя на 75 мкл 5%-ного раствора ΜΤδ (Ртотеда) в среде без фенола красного, и инкубировали в течение 1,5 ч (37°С, 5% СО₂, 95-99% относительной влажности). Оптическую плотность измеряли при длине волны 498 нм (§айте², Тесал) и оптические плотности (оптическую плотность) преобразовывали в процент от необрабо- 24 022408 танного контроля.

Для оценки противовирусных эффектов аналитическую среду отсасывали и клеточные монослои промывали ΡΒ8. Промывочный буфер отсасывали, добавляли 25 мкл лизирующего буфера О1о (Сак №. Е2661, Рготеда), после чего в течение 5 мин при комнатной температуре клетки оставляли лизироваться. Затем добавляли 50 мкл системы для анализа люциферазы (Са!. № Е1501, Рготеда) и сразу считали сигнал люминесценции люциферазы (1000 мс время интегрирования/лунка, 8айге², Тесап). Относительные единицы люминесценции преобразовывали в процент от необработанного контроля.

ЕС₅₀ и ЕС₉₀ (значения, полученные с помощью кривой доза-ответ) представляют собой концентрации, при которых соответственно наблюдалось 50 и 90% ингибирование репликации вируса. СС₅₀ (значение, полученное с помощью кривой доза-ответ) представляет собой концентрацию, при которой метаболическая активность клеток будет снижена до 50% относительно метаболической активности необработанных клеток. Индекс селективности (81), показатель терапевтического окна соединения, рассчитывается как СС₅₀/ЕС₅₀.

Концентрация соединения считается вызывающей подлинное противовирусное действие в системе репликона НСУ, если при этой конкретной концентрации наблюдается антирепликоновое действие выше 70% предельного значения и не более чем З0% уменьшение в метаболической активности.

Результаты см. в примере 12.

Ιη νίϋΌ анализ репликонов для оценки противовирусной НСУ активности в генотипах 1а и 2а.

Клетки с репликонами (субгеномные репликоны генотипа 1а (Н77) и 2а (ЛЕН-1)) выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), 10% фетальной бычьей сыворотки (ΕΒ8), 1% пенициллина-стрептомицина, 1% глутамина, 1% заменимых аминокислот, 250 мкг/мл 0418 в 5% СО₂ инкубаторе при температуре З7°С. Все реагенты клеточных культур могут быть приобретены в ΜοΌιαΙοΜι (Негибои, УА).

Клетки с репликонами обрабатывали трипсином и высевали в количестве 5х10^З клеток на лунку в 96-луночные планшеты с указанной выше средой без 0418. На следующий день, культуральную среду заменяли содержащими ΌΜΕΜ соединениями, серийно разведенными в присутствии 5% ΕΒ8. В противовирусном анализе репликонов изучали эффекты соединений в серийных разведениях. Кратко, клетки, содержащие репликон НСУ, высевали на 96-луночные планшеты. Испытуемое вещество серийно разводили ΌΜΕΜ плюс 5% ΕΒ8. Разведенное соединение наносили в соответствующие лунки на планшете. После 72 ч инкубации при З7°С, клетки обрабатывали. Внутриклеточные РНК из каждый лунки экстрагировали с использованием набора инструментов К№а8у 96 (01адсп). Уровень РНК НСУ определяли с помощью ПЦР-анализа обратной транскриптазы в реальном времени, используя мастер смесь реагентов ΤπςΜπη® Οηε-8ΐερ КТ-РСК (АррНеб Б|о8у81ст8. Ро81сг Сбу, СА) и систему определения последовательностей АБ1 Рг18ш 7900 (АррНеб Β^Ο8у8ΐеш8), как описано ранее (Уго1ук с1 а1., 200З). Цитотоксические эффекты измеряли с использованием контрольных реагентов Τа^Μаη® К1Ъо8оша1 РНК (АррНеб Β^Ο8у81С1Н8) в качестве показателя количества клеток. Количество НСУ РНК и рибосомальной РНК затем использовали для получения соответствующих значений 1С₅₀ (концентрация, ингибирующая репликацию репликонов на 50%).

Оценка метаболизма микросом (анализ стабильности микросом).

Скорость метаболизма в микросомах может быть испытана следующим образом.

Микросомы печени мыши или человека разводили буфером С (0,1 М калийфосфатный буфер, 1,0 мМ БИТА, рН 7,4) до концентрации 2,5 мг/мл. Затем готовили образцы для изучения стабильности микросом путем добавления 50 мкл 5 мкМ сток раствора (0,5 мкл 10 мМ ДМСО исходного раствора в 9,5 мкл АСН добавленный в 990 мкл буфера С) в 50 мкл раствора микросом (2,5 мг/мл), 110 мкл буфера С, и тщательно смешивая. Все образцы были предварительно инкубированы в течение приблизительно 15 мин при температуре З7°С. Затем реакцию инициировали добавлением 40 мкл раствора НАОРН (12,5 мМ) при осторожном перемешивании. Отбирали аликвоты (40 мкл) на 0, 15, З0, 45 и 60 мин и гасили АСИ содержащей внутренний стандарт (120 мкл). Белок удаляли центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) и планшет с образцами анализировали на концентрацию соединений с использованием ЖХМС/МС. Затем обычными способами рассчитывали время полужизни, сравнивая концентрацию анализируемого продукта с первоначально имеющимся количеством.

Результаты см. в примере 1З.

Оценка стабильности гепатоцитов.

Криоконсервированные гепатоциты, предварительно хранящиеся в жидком азоте, помещали при З7±1°С на встряхиваемую водяную баню в течение 2 мин±15 с. Затем гепатоциты добавляли в 10кратный по объему предварительно нагретый бикарбонатный буфер Кребса-Хенселейта (КНВ) (2000 мг/л глюкозы, без карбоната кальция и бикарбоната натрия, 81дша), осторожно смешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение З мин. После центрифугирования супернатант осторожно удаляли и к вновь суспендированному остатку клеток добавляли 10-кратный объем предварительно нагретого буфера КНВ. Смесь осторожно смешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение З мин. Супернатант затем удаляли и отбрасывали. Затем определяли жизнеспособность клеток и выход подсчетом клеток, и

- 25 022408 эти значения использовали при получении суспензии гепатоцитов человека для соответствующей плотности посева (плотность жизнеспособных клеток=2х106 клетки/мл). Раствор 2Х дозированный готовят в предварительно нагретом КНВ (1% ДМСО) (200 мкМ сток раствор: 20 мкл субстрата исходного раствора (10 мМ) в 980 мкл ДМСО, раствор 2Х дозированный: 10 мкл 200 мкМ сток раствора в 990 мкл КНВ (2 мкМ после разбавления).

мкл предварительно нагретого раствора 2Х дозированного помещали в лунки и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х10⁶ клетки/мл) и начинали отсчет времени. Планшет затем инкубировали при температуре 37°С. По окончании инкубационного времени (0, 15, 30, 60 и 120 мин) в каждую лунку добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, осторожно смешивали, и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х10⁶ клетки/мл). В конце инкубирования определяли жизнеспособность клеток. Образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С, супернатанты разводили 2 раза ультрачистой водой, и содержание соединений анализировали с использованием ЖХ-МС/МС.

Оценка растворимости в воде.

Растворимость в воде может быть исследована следующим образом.

мМ сток раствора аналога санглиферина готовили в 100% ДМСО при комнатной температуре. Делали трехкратные 0,01 мл аликвоты 0,5 мл либо с раствором 0,1 М РВ§, рН 7,3, либо со 100% ДМСО во флаконах из янтарного стекла. Полученные 0,2 мМ растворы встряхивали при комнатной температуре на шейкере ΙΚΑ® \0Ьга\ УХК в течение 6 ч, затем переносили полученные растворы или суспензии в 2мл пробирки Эппендорфа и центрифугировали в течение 30 мин при 13200 об/мин. Затем анализировали аликвоты супернатантной жидкости методом ЖХ-МС, как описано выше.

Альтернативно, растворимость в РВ§ при рН 7,4 может быть исследована следующим образом.

Выстраивали калибровочную кривую путем разбавления исследуемых соединений и контрольных соединений до 40 мкМ, 16 мкМ, 4 мкМ, 1,6 мкМ, 0,4 мкМ, 0,16 мкМ, 0,04 мкМ и 0,002 мкМ с помощью 50% МеОН в Н₂О. Стандартные точки затем еще разбавляли 1:20 с помощью МеОН:РВ§ 1:1. Конечные концентрации после разбавления 1:20 составляли 2000 нМ, 800 нМ, 200 нМ, 80 нМ, 20 нМ, 8 нМ, 2 нМ и 1 нМ. Стандарты затем смешивали с таким же объемом (1:1) АС^ содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6). Образцы центрифугировали (5 мин, 12000 об/мин), далее анализировали ЖХ/МС.

	1 § (в №	МеОН/ НгО (1:1) (мкл)		Рабочий раствор (мкМ)	ί £ н & δ ь	МеОН/ буфер (1:1) (мкл)		Конечный раствор (им)
10 мМ	10	240	-4	400
400 мкМ	50	450		40	20	380		2000
20	480	—>	16	20	380		800
40 мкМ	50	450		4	20	380		200
16 мкМ	50	450	—>	1,6	20	380	->	80
4 мкМ	50	450	-»	0,4	20	380		20
1, 6 мкМ	50	450	—»	0,16	20	380	—»	8
0,4 мкМ	50	450	->	0,04	20	380		2
0,04 мкМ	50	950	->	0, 002	20	380	—>	1

Исследуемые соединения готовили в виде сток растворов в ДМСО при концентрации 10 мМ. Сток растворы разводили дважды в РВ§, рН 7,4, в 1,5 мл-ых пробирках Эппендорфа до целевой концентрации 100 мкМ с конечной концентрацией ДМСО в 1% (например, 4 мкл 10 мМ ДМСО сток раствора в 396 мкл 100 мМ фосфатного буфера). Пробирки с образцами затем осторожно встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре.

Образцы центрифугировали (10 мин, 15000 об/мин) для высаживания нерастворенных частиц. Супернатанты переносили в новые пробирки и разводили РВ§ (коэффициент разбавления для отдельного тестируемого вещества подтверждали сигнальным уровнем соединения на используемом аналитическом инструменте). Разведенные образцы затем смешивали с таким же объемом (1:1) МеОН. В заключение образцы смешивали с таким же объемом (1:1) АС^ содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6) для ЖХ-МС/МС анализа.

Оценка проницаемости клеток.

Проницаемость клеток может быть исследована следующим образом.

Исследуемое соединение разводили до 10 мМ в ДМСО и затем разводили в буфере с получением конечной концентрации дозы 10 мкМ. Также для контроля целостности мембран был включен флуоресцентный маркер люциферин желтый. Исследуемое соединение затем наносили на апикальную поверх- 26 022408 ность монослоев клеток Сасо-2 и измеряли проникновение соединений в базолатеральный отсек. Это осуществляли в обратном направлении (от базолатеральной к апикальной) для исследования активного транспорта. Для количественного определения содержания использовали ЖХ-МС/МС как для исследуемых, так и для стандартных контрольных соединений (например, пропанолол и ацебутолол).

Оценка фармакокинетики ш νίνο.

Исследования ш νίνο также могут быть использованы для измерения биодоступности соединения. Обычно, соединение вводят исследуемому животному (например, мыши или крысе) как внутривенно (IV), так и перорально (РО), и с регулярными интервалами отбирают образцы крови для определения того, как изменяется концентрация препарата в плазме с течением времени. Период нахождения концентрации в плазме крови с течением времени может быть использован для расчета абсолютной биодоступности соединения в виде процента с использованием стандартных моделей. Пример обычного протокола описан ниже.

Мышам дозировали 1, 10, или 100 мг/кг соединения по изобретению или исходное соединение ΐ.ν. или р.о. Образцы крови брали на 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 и 2880 мин и определяли концентрацию соединения по изобретению или исходного соединения в образце с использованием ВЭЖХ. Период нахождения концентрации в плазме крови затем может быть использован для получения ключевых параметров, таких как площадь под кривой концентрация-время (АиС - которая прямо пропорциональна общему количеству неизмененного препарата, который попадает в большой круг кровообращения), максимум (пик) концентрации лекарственного препарата в плазме, время, за которое достигается максимум концентрации лекарственного препарата в плазме (временной пик), дополнительные факторы, которые используются для точного определения биодоступности, включают: конечное время полужизни соединений, общая очистка организма, статистическая оценка параметров распределения и Р%. Указанные параметры затем анализировали способами без компартментализации или с компартментализацией с получением рассчитанного процента биодоступности, в качестве примера данного вида способа см. Едопп с1 а1. 2002, и имеющиеся в работе ссылки.

Ιη νίνο оценка пероральной и внутривенной фармакокинетики (конкретный способ).

Для аналогов санглиферина полностью анализировали кровь. Соединения готовили в растворе 5% этанол/5% кремофор ЕЬ/90% физиологический раствор как для р.о., так и ΐ.ν. введения. Группам по 3 самца мышей СИ1 вводили либо по 1 мг/кг ΐ.ν., либо по 10 мг/кг р.о. Образцы крови (40 мкл) отбирали из подкожной вены, перед дозированием и на 0,25, 0,5, 2, 8 и 24 ч, и разбавляли равным количеством ЙН₂О и сразу помещали на сухой лед. Образцы до анализа хранили при температуре -70°С. Концентрацию соединения по изобретению или исходного соединения в образце определяли с использованием ЖХ-МС следующим образом: в образец 20 мкл крови:Н₂О (1:1, об./об.)/РК добавляли 20 мкл внутреннего стандарта (гидроксил макроцикл, 6) при 100 нг/мл, 20 мкл рабочего раствора/МеОН и 150 мкл ΑΟΝ, встряхивали в течение 1 мин при 1500 об/мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант впрыскивали в ЖХ-МС/МС. Строили кривую пребывания в крови концентраций и использовали для определения площади под кривой общая концентрация в крови-время (АиС - которая прямо пропорциональна общему количеству неизмененного препарата, который попадает в большой круг кровообращения). Указанные значения использовали для определения пероральной биодоступности (Р%) и других параметров РК, которые возможны.

Ιη νίΐΓο оценка цитотоксичности.

Клетки НиН-7 и НерО2, полученные от АТСС, выращивали в модифицированной среде Дульбекко Игла (ИМЕМ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ§), 1% пенициллин-стрептомицин и 1% глутамин; тогда как СЕМ клетки (Т-клетки лейкемии человека, полученные от АТСС) выращивали в среде КРМ1 1640 с 10% РВ§, 1% пенициллин-стрептомицина и 1% глутамина. Свежие РВМС человека выделяли из цельной крови, полученной по меньшей мере от двух нормальных защищенных доноров. Кратко, клетки периферальной крови осаждали центрифугированием/промыванием 2-3 раза при центрифугировании с низкой скоростью и вновь суспендировали в РВ§ для удаления загрязняющих тромбоцитов. Промытые клетки крови затем разводили 1:1 в среде Дульбекко в забуференном фосфатом физиологическом растворе (И-РВ8) и наносили слоем на 14 мл среды для фракционирования лимфоцитов (Ь§М; клетки выращены МсШаЮсН. 1пс.; плотность 1,078±0,002 г/мл; Кат.# 85-072-СЬ) в 50 мл пробирку для центрифугирования и центрифугировали в течение 30 мин при 600хд. Связанные РВМС осторожно отсасывали с полученной границы раздела двух фаз и далее промывали 2х РВ§ при низкой скорости центрифугирования. После конечной промывки клетки подсчитывали путем исключения при окрашивании трипановым синим и вновь суспендировали при 1 х 10⁷ клеток/мл в КРМ1 1640, дополненный 15% фетальной бычьей сывороткой (РВ§), 2 мМ Ь-глутамина, 4 мкг/мл РНА-Р. Клетки оставляли инкубироваться в течение 48-72 ч при температуре 37°С. После инкубирования РВМС центрифугировали и вновь суспендировали в КРМ1 1640 с 15% РВ§, 2 мМ Ь-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 20 Ед/мл рекомбинантного 1Ь-2 человека.

Цитотоксичность соединений оценивали, исследуя полулогарифм концентраций каждого соединения в трех повторах против клеток, описанных выше. Среда, содержащая одни клетки, служила в качест- 27 022408 ве клеточного контроля (СС). Клетки НиН-7 и НерО2 высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 5х10³ клеток на лунку. На следующий день среду отсасывали, и добавляли 100 мкл соответствующей среды, содержащей 5% РΒ8. Разведения исследуемых лекарственных средств готовили в 2х концентрации в пробирках для микротитрования и 100 мкл каждой концентрации помещали в соответствующие лунки стандартного формата. Через 72 ч клетки обрабатывали для оценки цитотоксичности.

РВМС разбавляли в свежей среде и высевали во внутренние клетки 96 луночного микропланшета с круглым дном при 5х10⁴ клеток/лунка с объемом 100 л. Подобным образом, клетки СЕМ высевали при 1 х 10⁴ клеток/лунка. Затем добавляли 100 мкл 2х препаратов исследуемых лекарственных средств в соответствующие лунки в стандартном формате. Культуры выдерживали в течение шести-семи дней и затем обрабатывали для определения цитотоксичности.

Цитотоксичность определяли, используя набор для анализа однородной целостности мембран Су1оТох-он™ (Рготеда). Анализ определял высвобождение лактата дегидрогиназы (ЬЭН) из клеток с поврежденными мембранами в флуорометрическом, гомогенном формате. Высвобожденную в культуральную среду ЬЭН определяли анализом ферментативного связывания, который приводит к конверсии резазурина во флуоресцентном резоруфиновом продукте. Количество флюоресценции пропорционально числу лизированных клеток. Шестисерийные разведенные концентрации каждого соединения наносили на клетки для определения значений для получения, где это применимо ТС₅₀ (токсичная концентрация лекарственного средства, снижающая жизнеспособность клеток на 50%) и ТС₉₀ (токсичная концентрация лекарственного средства, снижающая жизнеспособность клеток на 90%).

Ιη уйго оценка ингибирования траспортеров МЭК1 и МКР2.

Для оценки ингибирования и активации МЭК1 (Р-гликобелок 1) и траспортеров МКР2, может быть использован анализ АТРазы ιη уйго от 8о1уо Β^оΐесйηо1оду 1пс. (О1аутак е! а1., 2003). Соединения (при 0,1, 1, 10 и 100 мкм) инкубировали с мембранными везикулами МЭК1 или МКР2 как в отсутствие, так и в присутствии ванадата для изучения возможной активации АТРазы. Кроме того, подобную инкубацию проводили в присутствии верапамила/сульфасалазина с целью выявления возможного ингибирования активности траспортера. Активность АТРазы количественно измеряли спектрофотометрически с помощью неорганического фосфата. Активацию рассчитывали из ванадат чувствительной увеличению активности АТРазы. Ингибирование определяли по снижению верапамил/сульфасалазин опосредованной активности АТРазы.

Примеры

Пример 1. Конструирование мутанта 8йер1отусек кр. А92-308110 с делецией к£аА (Э8М9954).

1.1. Построение конструкции с делецией к£аА.

Фрагмент ЕсоКУ-81и1 космиды ТЙ3006 (8ЕР ΙΌ NО:3), размером приблизительно 7 кВ, охватывающий к£аА (положение нуклеотида 14396-21362, NСΒI инвентарный номер последовательности РЙ809786) отрезали расщеплением ЕсоКУ и 81и1, и полученный выделенный фрагмент лигировали напрямую в рКС1139, которые ранее расщепляли с помощью ЕсоКУ и обрабатывали щелочной фосфатазой креветок (Косйе). Полученную плазмиду обозначали как Р8ОК268.

Мутацию в рамке считывания гена к£аА, содержащегося в этом клоне, осуществляли, используя комплект для рекомбинации Кей/ЕТ, поставляемый Оеие Β^^йдек (номер по каталогу К006):

(3Εζ) Ю N0:1) 3£аА17161£ 5'СССТСТСТССССССТССТТТССААСССССТСССССАСССССАСССССАСАТССАТААТТААСС

СТСАСТАААССССС-3 ' (ЗЕО Ю N0:2) 5£аА17825г 5'ТССАТСТАТССТСССАССАСССССАСААТТСАССТСССАССТССТССАСАТССАТТААТАССА

СТСАСТАТАССССТС-3’

Два олигонуклеотида, 8£аА17161£ и 8£аА17825г, использовали для амплификации неомицинового маркера из РКТ-РОК-дЪ2-иео-РКТ матрицы ДНК, из набора, используя ДНК-полимеразу КОЭ. Полученный продукт амплификации приблизительно 1,7 т.п.н. выделяли с использованием гель электрофореза и очищали от геля на смоле р1аЕХ.

Плазмиду р8ОК268 трансформировали в Е.соП ^Н10Β, используя стандартные методики и отбирая в чашки, содержащие апрамицин (50 мкг/мл). Введение конструкции с делецией проводили по существу в соответствии с протоколом Оеие Βη^ε^ Единичную колонию выращивали в течение ночи в 2ТУ апрамицине (50 мкг/мл) и трансформировали с плазмидой рКейЕТ (£е£) и отбирали на апрамицин (50 мкг/мл) и тетрациклин (3 мкг/мл) при температуре 30°С. Единичную колонию использовали для получения ночной культуры этого штамма в 3 мл 2ТУ апрамицина (50 мкг/мл) и тетрациклина (3 мкг/мл) при температуре 30°С. 0,5 мл полученной культуры использовали для посева 10 мл 2ТУ апрамицина (50 мкг/мл) и тетрациклина (3 мкг/мл) при температуре 30°С и выращивали до ОЭбоопт приблизительно 0,5.

1,4 мл данной культуры переносили в каждую из 2 пробирок Эппендорфа и в одну пробирку добавляли 50 мкл 10% арабинозы для индукции экспрессии рекомбинантных белков Кей/ЕТ. Пробирки встряхивали

- 28 022408 в течение приблизительно 1 ч при температуре 37°С. Индуцированные и неиндуцированные клетки осаждали на настольной центрифуге и промывали два раза охлажденной стерильной водой; ресуспендировали и центрифугировали каждый раз для осаждения клеток. Полученные осадки суспендировали в приблизительно 30-40 мкл воды и выдерживали на льду. Выделяли 1,7 т.п.н. разрушенного фрагмента, сначала добавляли в индуцированные и неиндуцированные пробирки и переносили в 1 мм электрокюветы ВюгаН на льду. Образцы подвергали электропорации (ВюгаН Мюгорикег при 1,8 кВ, полученная константа времени приблизительно 4 мс), добавляли 1 мл 2ΤΥ (без антибиотиков) и смешивали для удаления клеток из кюветы. Клетки инкубировали в течение приблизительно 3 ч при температуре 37°С при встряхивании (1100 об/мин, компактный термомиксер Эппендорфа), затем высевали на чашки 2ΤΥ, содержащие апрамицин (50 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при температуре 37°С. Делали посевы штрихом колоний из чашек с индуцированными образцами на чашки 2ΤΥ, содержащие канамицин, при 50 мкг/мл для очистки и подтверждения введения кассеты резистентности к канамицину. РСК на отдельных колониях бактерий использовали для подтверждения введения кассеты. Плазмиды получали из указанных культур и обрабатывали для подтверждения ожидаемой плазмиды рЗОК270. Плазмиды затем обрабатывали ΝκιΙ для удаления фрагмента маркера, и остальное повторно легировали с получением конструкции рЗОК271 в рамке удаления к£аА.

1.2 Конъюгирование З1гср1отусск кр. А92-308110 (ОЗМ9954) и введение делеции к£аА.

Плазмиду рЗОК271 трансформировали в Е.соН ЕТ12567 ρυΖ8002, используя стандартные методики, и отбирали в чашки 2ΤΥ, содержащие апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл). Полученный штамм инокулировали в 3 мл жидкости 2ΤΥ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при температуре 37°С, 250 об. /мин. 0,8 мл данной культуры использовали для посева 10 мл жидкости 2ΤΥ, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл) в 50 мл пробирке Ра1сои и инкубировали при температуре 37°С и 250 об/мин до достижения О0_60О|||1| приблизительно 0,5. Полученную культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин при температуре 4°С, промывали два раза 10 мл среды 2ΤΥ, используя центрифугирование для осаждения клеток после каждой промывки. Полученный осадок вновь суспендировали в 0,5 мл 2ΤΥ и перед использованием держали на льду. Полученный процесс согласовывали по времени с завершением получения спор З1гср1отусск, описанного ниже.

Споры З1гср1отусск кр. А92-308110 (ОЗМ9954) (В|о1-4370) собирали из 1-2 недельного конфлюэнтного планшета путем повторного суспендирования в приблизительно 3 мл 20% глицерина. Споры центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин, комнатная температура) и промывали два раза 50 мМ буфера ΤЕ3, затем вновь суспендировали в 1 мл 50 мМ буфера ΤЕ3 и распределяли в 2 пробирки Эппендорфа. Эти пробирки нагревали при встряхивании при температуре 50°С в течение 10 мин на водной бане, затем добавляли 0,5 мл 2ΤΥ и инкубировали в компактном термомиксере Эппендорфа при температуре 37°С в течение 4-5 ч.

Полученные Е.соН ΗΤ12567 р^8002 рЗОК271 и Вю1-4370 смешивали при соотношении 1:1 (250 мкл каждый штамм) и 1:3 (100 мкл Е. соН) и сразу распределяли на плашки К6 и переносили в инкубатор при 37°С. Приблизительно через 2 ч инкубирования указанные планшеты покрывали 2 мл стерильной воды, содержащей налидиксовую кислоту, с получением конечной концентрации на пластине в 25 мкг/л. Пластины возвращали в инкубатор при 37°С на всю ночь, затем покрывали 2 мл стерильной воды, содержащей апрамицин, с получением конечной концентрации на пластине в 20-25 мкг/л. Эксконъюгатные колонии, появляющиеся через приблизительно 4-7 дней помещали пятнами на среду 1ЗР4, содержащую апрамицин (25 мкг/л) и налидиксовую кислоту (25 мкг/л) и инкубировали при температуре 37°С. После наблюдаемого адекватного роста мицелия штаммы вновь наносили пятнами на среду 1ЗР4, содержащую апрамицин (25 мкг/л) при температуре 37°С и оставляли спорулировать. Затем штаммы три раза субкультивировали (для ускорения удаления чувствительной к температуре плазмиды) путем нанесения пятнами на 1ЗР4 (без антибиотика) и инкубирования при температуре 37°С в течение 3-4 дней. Штаммы в конце наносили пятнами на 1ЗР4 и инкубировали при температуре 28°С для полного спорулирования (5-7 дней). Споры собирали и серийно разводили в планшетах 1ЗР4 при температуре 28°С для выбора отдельных колоний. Спорулированные отдельные колонии двукратно наносили пятнами на планшеты 1ЗР4 вместе с апрамицином или без него (25 мкг/л) для подтверждения потери плазмиды и оставляли расти приблизительно 7 дней перед исследованием для продуцирования санглиферинов.

1.3 Скрининговые штаммы для получения санглиферинов в пробирках Ра1сои.

Единичный приблизительно 7 мм агаровый слой спорулированного в лунках штамма использовали для посева 7 мл стерильной среды ЗМ25-3 и инкубировали при 27°С 200 об/мин в шейкере с амплитудой 2. Через 48 ч роста 0,7 мл данную культуру переносили в стерилизованную пробирку фалькона, содержащую 7 мл среды ЗОР2 с 5% смолы НР20. Культуры выращивали при температуре 24°С 300 об/мин. Во встряхиваемом с амплитудой 1 дюйм инкубаторе в течение 5 дней, затем харвестировали. 0,8 мл бактериальной культуры удаляли и помещали аликвотами в 2 мл пробирку Эппендорфа, обеспечивая адекватный разгон смолы в культуре перед тем, как помещать аликвотами. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 15 мкл муравьиной кислоты, и пробирку перемешивали в течение приблизительно 30 мин. Смесь делали

- 29 022408 прозрачной при центрифугировании, 170 мкл экстракта удаляли в сосуд для ВЭЖХ и анализировали с использованием ВЭЖХ.

1.4 Анализ штаммов на восстановление дикого типа или §£аА фенотипа.

Экстракты штаммов анализировали с использованием ВЭЖХ. Штаммы, которые продуцируют санглиферин А и В, далее не анализировали, так как они возвращались к дикому типу. Штаммы без продукции санглиферина А и В показывали небольшие уровни (приблизительно 1-2 мг/л) пикового времени удерживания 6,5 мин, что отображало санглиферин подобно хромофору. Анализ ЖХ-МС показал, что пик имел т/ζ 1073, -16 единиц от ожидаемого т/ζ санглиферина. Было сделано предположение, что этот пик был связан с включением фенилаланина в отсутствии метагидрокситирозина.

Восемь штаммов, показывающие отсутствие продукции санглиферина, впоследствии были вновь выращены, чтобы оценить, насколько возможная мутация §£аА может быть дополнена химически, допуская мутасинтетический процесс до новых санглиферинов. Штаммы выращивали в семенной среде 8М25-3 в течение 48 ч, затем переносили в производственную среду 8СР2 с 5% смолы. Через 24 дополнительных часа роста штаммы подпитывали троекратно 2 мМ ОЕ метагидрокситирозина (добавление 100 мкл 0,16 М раствора в 1 М НС1) или 2 мМ Е-фенилаланина с использованием неподпитанного штамма в качестве контроля. Штаммы также подпитывали пипеколиновой кислотой (2 мМ) в метаноле) для повышения выхода продукта. Штаммы собирали через 4 дополнительных дня роста и экстрагировали и анализировали ВЭЖХ. Метагидрокситирозин показывал полное дополнение мутации §£аА, и добавление Ь-фенилаланина повышало уровни -16 а.е.м. соединения. Штамм Βΐοί-4585 был выбран для дальнейшего изучения в качестве мутанта с удаленным §£аА.

Пример 2. Другие способы конструирования конструкции с делецией §£аА.

Для получения мутантов с делецией §£аА могут быть использованы другие способы. Примеры включают §£аА инсерционные мутанты инактивации (такие как пример 12 в \\'О 2010/034243 (содержание которого включено в данное описание во всей своей полноте)). Данный штамм был получен, как описано в \\'О 2010/034243, и данному штамму дано обозначение ΒΙΟΤ-4452.

В альтернативном способе осуществления для делеции §£аА использовали два олигонуклеотида 15209Е 5^Г- САСАСААТТССССОТАССССССССАССАСААССТСТС-З' (5Е<2 ΙΟ N0:4) и

17219К 5 '-ССССАТССАТСТСССССТСССССТСССССАСССССТТСС-3' (5Е0 Ю N0:5) для амплификации гомологичной области в направлении 3'-5', используя космиду ТБ3006 (8ЕР ГО N0:3) в качестве матрицы и ДНК-полимеразу КОС. Усиленный продукт обрабатывали Т4 полинуклеотид киназой (ΝΕΒ) и клонировали в риС18, которая была дефосфорилирована путем обработки креветочной щелочной фосфотазой (КосНе). Полученную конструкцию проверяли с помощью рестрикционного переваривания, и последовательность секвинировали для уверенности в том, что выстроена желаемая последовательность и что в процесс усиления полимеразы не были внедрены ошибки. Данную конструкцию обрабатывали ЕсоК1 и ΝδΐΙ, и продукты анализировали путем гелевого электрофореза. Желаемую последовательность-содержащую связь (т.е. верхняя гомология приблизительно 2 т.п.н.) вырезали из геля и очищали, используя стандартные способы (смола СЯаЕХ). Вторую серию олигонуклеотидов (ЗЕО Ю N0:6) 17766Е 5' - ССТСАТССАТСТССАССАССТСССАССТСААТТСТССС.СС-З' и

19763К

5'-ССССААССТТСТССТСССТСАССТТСААСАТСС-3 ' (ЗЕ<2 Ю N0:7) использовали для амплификации области гомологии в направлении 5'-3', используя космиду ТЬ3006 (8ЕР ГО ΝΟ:3) в качестве матрицы и ДНК полимеразу КОС. Продукт амплификации обрабатывали Т4 полинуклеотид киназой (ΝΕΒ) и клонировали в риС18, которая была дефосфорилирована обработкой креветочной щелочной фосфатазой (КосНе). Полученную конструкцию проверяли с помощью рестрикционного переваривания, и последовательность секвинировали для уверенности в том, что получена желаемая последовательность и что в процесс амплификации полимеразой не были внедрены ошибки. Данную конструкцию обрабатывали ΗΐηάΙΙΙ и ΝδΐΙ, и продукты анализировали путем гелевого электрофореза. Желаемую последовательность-содержащую связь (то есть нижняя гомология приблизительно 2 т.п.н.) отрезали от геля и очищали, используя стандартные способы (смола Р1аЕХ). Вектор рКС1139 переваривали ЕсоК1 и ΗΐηάΙΙΙ, и большой фрагмент вектора отделяли с помощью гелевого электрофореза и очищали стандартными способами (смола Е)1аЕХ). Выделенные верхний и нижний гомологические фрагменты затем клонировали в указанный фрагмент рКС1139 при трехкратном лигировании, с получением желаемой конструкции с удаленным δΙΑ.Ά

В другом альтернативном способе получения желаемой конструкции с удаленным δΙΑ.λ использовали коммерческий синтез гена (т.е. от фирмы Ссл^спр! или другого поставщика) для получения конструкции, содержащей желаемую последовательность (КЕЕ) 10 NΟ:8). Данную приобретенную конструкцию обрабатывали 13ат1 II и ХЬа1, вырезали представляющую интерес последовательность и продукты анализировали путем гелевого электрофореза. Желаемую последовательность-содержащую связь (приблизительно 4 т.п.н.) отрезали от геля и очищали, используя стандартные способы. Вектор рКС1139 переваривали с помощью 13ат1 II и ХЬа1, и большой фрагмент вектора отделяли с помощью гелевого электрофореза и очищали стандартными способами. Два выделенных фрагмента затем вместе лигировали с получением желаемой конструкции с удаленным δΙΑ.Ά

- 30 022408

Указанные альтернативные конструкции с делецией в£аА вводили в §1гер!отусев ер. А92-308110 (Б8М9954) путем конъюгирования, используя способы, описанные в разделе пример 1.2.

Пример 3. Данные подпитки мутанта с делецией в£аА.

Запасы спор мутанта с нарушенным в£аА (ΒΙΟΤ-4452 или ΒΙΟΤ-4585) получали после выращивания в среде МАМ, 1§Р4, 1§Р3 или 1§Р2 мкМ, и пропитывали 20% масс./об. глицерина в дистиллированной воде и хранили при температуре -80°С. Растительные культуры (культуры для посева) готовили путем инокулирования запаса спор (1% об./об.) в 7 мл среды для посева (среда δΜ25) в 50 мл пробирках для центрифугирования с пенными затычками. Пробирки с культурами инкубировали при 27°С, 250 об/мин (амплитуда 5 см) в течение 48 ч. Из семенной культуры 10% (об./об.) переносили в 7 мл производственной среды 8СР-2 в 50 мл пробирки для центрифугирования с пенными затычками. Культивирование продолжали при 24°С и 300 об/мин (амплитуда 2,5 см). Для получения аналогов мутасинтетического санглиферина, 0,05 мл 0,32 М раствора (в 1н. НС1) питательного соединения (мутасинтона) добавляли в каждую пробирку в течение 24 ч после инокуляции, с получением конечной концентрации в 2 мМ. Кроме того, в каждую пробирку добавляли 0,05 мл 0,32 М раствора пиперазиновой кислоты (в метаноле) в течение 24 ч, с получением конечной концентрации в 2 мМ. Культивирование продолжали еще в течение четырех дней после подпитки.

Образцы экстрагировали путем перенесения 0,8 мл всего бульона в 2 мл закрытую пробирку Эппендорфа. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила, а также 0,015 мл муравьиной кислоты. Смесь затем встряхивали в течение 30 мин на \зЬгах. Затем пробирку центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин и 0,15 мл супернатанта удаляли для анализа. Экстракты анализировали, как описано, обычными способами.

В табл. 1 представлены мутасинтоны, которые питали таким же образом, наряду с аддуктами ЖХМС Н+ и Να', ожидаемой молекулярной массой и наблюдаемым временем удерживания мутасинтетических продуктов санглиферина. Показаны основные пики, связанные с аналогами санглиферина А. Во всех случаях также видны ЖХ-МС пики аналогов санглиферина В (масса - 18).

Таблица1

Мутасинтоновая подпитка	Название мутасинтона	Наблюдаемый [М-Н]- (ш/ζ)	Наблюдаемый [М+Ыа]+ (т/х)	Молекулярная масса (а .в .м.)	Время удержив ания (минуты)
	2-амино-З-{4-фтор-Згидроксифенил)пропановая кислота	НОЙ, 4	ИЗО, 4	1107,4	5,5
и ™, Р	2-амино-З-{З-фтор-5гидроксифенил)пропановая кислота	1106,4	ИЗО, 4	1107,4	5, 7
•и к Р	метил 2-амино-3-(3-фтор-5гидроксифенил)пропанокат	1106,4	ИЗО, 4	1107,4	5,7
,..ди	(5)-метил 2-амино-З-(3гидрокси-4метилфенил)пропаноат	1102,5	1126,7	1103,5	6, 0
	2-амино-З-(3- фторфенил)пропановая кислота	1090,4	1114,5	1091	δ, 1
н Ν -^>\х-СО1Ме ЭХ	метил {23)-2-амино-З-{3гидрокси(2пиридил))пропаноат	1089,5	1113,7	1090,5	4, 4
ян.	метил 2-амино-З-(2-фтор-5гидроксифенил)пропаноат	1106,5	ИЗО, 6	1107,5	5, 5
Р тхх,	метил 2-амино-З-(2-фтор-Згидроксифенил)пропаноат	1106,5	ИЗО, 6	1107,5	5,1
НО^Ах^СОгМе ХХрХ*	метил 2-амино-З-(2,6-дифтор3-гидроксифенил)пропаноат	1124,4	1148,5	1125,5	5,1
δ γΥ'γΧ’1··	метил 2-амино-З-<4-этил-Згидроксифенил,пропаноат	1116,7	1141,0	1117,7	7,2
£	метил 2-амино-З-(2,4-дифтор3-гидроксифенил)пропаноат	1124,7	1148,8	1125,7	6, 0

Пример 4. Выделение 63-фторсанглиферина А, соединение 14.

Ферментацию проводили как описано в общих способах с использованием метил 2-амино-3-(3фтор-5-гидроксифенил)пропаноата и БЬ-пиперазиновой кислоты в качестве предшественников, оба были добавлены на 26 ч.

После харвестирования культуральные бульоны объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя магнитную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли либо центрифугированием, либо давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее

- 31 022408 дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением неочищенного конечного продукта (1,3 г).

Неочищенный экстракт (1,3 г) растворяли в этилацетате (2 мл) и помещали на колонку с силикагелем (10x2 см), доведенную до кондиционного состояния этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (278 мг) растворяли в метаноле (1,8 мл) и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг ХТетта Μδί'.Ί8 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в течение 30 мин. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (20 мг).

Пример 5. Выделение 62,63-фторсанглиферина А, соединение 15.

Ферментацию проводили как описано в общих способах с использованием метил (Ъ)-2-амино-3(3,4-дифтор-5-гидроксифенил)пропаноата и БЬ-пиперазиновой кислоты в качестве предшественников, оба были добавлены на 26 ч.

После харвестирования культуральные бульоны объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя магнитную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли либо центрифугированием, либо давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением неочищенного конечного продукта (1,6 г).

Неочищенный экстракт (1,6 г) растворяли в 2 мл этилацетата и помещали на колонку с силикагелем (10x2 см), доведенную до кондиционного состояния 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (188 мг) растворяли в 1,8 мл метанола и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг ХТетта Μδί'.Ί8 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в течение 30 мин. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (15 мг).

Пример 6. Выделение 62-фторсанглиферина А, соединение 16.

Использовали предшественники метил ^)-2-амино-3-(4-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат и БЬпиперазиновую кислоту. Проводили в соответствии с общим способом, за исключением того, что предшественники были добавлены на 26 ч.

После харвестирования культуральные бульоны объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя магнитную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли либо центрифугированием, либо давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы.

Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Затем два раза экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением конечного маслообразного неочищенного продукта (4,2 г). Неочищенный экстракт (4,2 г) растворяли в 4 мл этилацетата и помещали на колонку с силикагелем (15x2 см), доведенную до кондиционного состояния 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (390 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг Х(етта Μδί'.Ί8 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в

- 32 022408 течение 30 мин. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (38 мг).

Пример 7. Выделение 62-метилсанглиферина А, соединение 17.

Криоконсервированный штамм спор В1ОТ-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали перенесением 0,4 мл штамма спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Культивирование осуществляли в течение 48 ч при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см). Из культуры семян 20 мл переносили в 400 мл производственной среды 8СР2+5%НР20 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Спустя 24 ч культивирования при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см), в каждую производственную колбу добавляли 2 мл 200 мМ раствора метил (8)-2-амино-3-(3-гидрокси-4-метилфенил)пропаноата в 1 М хлористоводородной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора ОЬ-пиперазиновой кислоты, с получением конечной концентрации 1 мМ отдельных энантиомеров предшественников. Культивирование продолжали в течение еще 4 дней при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см).

Культуральные бульоны объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения.

Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя лопастную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли, давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением экстракта неочищенного конечного продукта (7,6 г).

Неочищенный экстракт (7,6 г) растворяли в 5 мл этилацетата и помещали на колонку с силикагелем (15x2 см), доведенную до кондиционного состояния 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (319 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1ст ХТетта М8С18 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в течение 30 мин. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (14,9 мг).

Пример 8. Выделение 61-дезгидроксисанглиферина А, соединение 18.

Криоконсервированный штамм спор В1ОТ-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали перенесением 0,4 мл штамма спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Культивирование осуществляли в течение 48 ч при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см). Из культуры семян 500 мл переносили в 4,5 л производственной среды 8СР2+5%НР20 в 7 л биореактор АррПкоп и культивировали при температуре 24°С, 400 об/мин (каскадное регулирование ΌΟΤ), поток воздуха 2,5 л/мин и 30% ΌΟΤ (каскадное регулирование смешивания). Спустя 24 ч культивирования, в биореактор добавляли 7,5 мл 667 мМ раствора (8)-2амино-3-фенилпропановой кислоты в 1 М хлористо-водородной кислоте, с получением конечной концентрации предшественника 1 мМ. Культивирование продолжали в течение еще 4 дней при температуре 24°С, 400 об/мин (каскадное регулирование ΌΟΤ), поток воздуха 2,5 л/мин и 30% ΌΟΤ (каскадное регулирование смешивания).

Культуральные бульоны объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя лопастную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли, давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы, но второй экстракт выделяли центрифугированием. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением неочищенного конечного продукта (55 г).

Неочищенный экстракт (55 г) суспендировали в 80% метаноле в воде и два раза экстрагировали 300 мл гексана. Целевое соединение обнаруживалось во фракции метанол/вода, которую упаривали досуха. Полученный высушенный экстракт (48 г) растворяли в 30 мл этилацетата и помещали на колонку с сили- 33 022408 кагелем (20x5 см), доведенную до кондиционного состояния 1 л этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (813 мг) растворяли в метаноле и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг ХТетта М8С18 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в течение 30 мин. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (34 мг).

Пример 9. Выделение 58-дез(3-гидроксифенил)-58-(3-гидрокси(2-пиридил))санглиферина А, соединение 19.

Использовали предшественники метил (2§)-2-амино-3-(3-гидрокси(2-пиридил))пропаноат и ИЬпиперазиновую кислоту. Осуществляли в соответствии с общим способом, за исключением того, что амплитуда культиватора в процессе растительного (семенного) культивирования составляла 2,5 см.

Бульоны культур объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3, и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя лопастную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли, давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением экстракта неочищенного конечного продукта (7 г).

Неочищенный экстракт (7 г) растворяли в 4 мл этилацетата и помещали на колонку с силикагелем (15x2 см), доведенную до кондиционного состояния 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом, и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30%, и т.д. в этилацетате до 100% ацетона, затем от 1% метанола до постепенно 5% метанола в ацетоне). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (204 мг) растворяли в метаноле и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг ХТетта М8С18 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 50% В в течение 6 мин с последующей инжекцией последующего градиента до 100% В в течение 30 мин. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (4 мг).

Пример 10. Выделение 61-дезгидрокси-61-фторсанглиферина А, соединение 20.

Криоконсервированный штамм спор В1ОТ-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали перенесением 0,4 мл штамма спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Культивирование осуществляли в течение 48 ч при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см). Из культуры семян 20 мл переносили в 400 мл производственной среды §ОР2+5%НР20 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Спустя 24 ч культивирования при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см), добавляли 2 мл 400 мМ раствора 2-амино-3(3-фторфенил)пропановой кислоты в 1 М хлористо-водородной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора ИЬ-пиперазиновой кислоты в каждую производственную колбу, с получением конечной концентрации 1 мМ отдельных энантиомеров предшественников. Культивирование продолжали в течение еще 4 дней при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см).

Бульоны культур объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3, и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя лопастную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли, давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Третий экстракт получали путем центрифугирования оставшейся смеси клеток и смолы. Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением экстракта неочищенного конечного продукта (10,5 г).

Неочищенный экстракт (10,5 г) растворяли в 7 мл этилацетата и помещали на колонку с силикагелем (15x2 см), доведенную до кондиционного состояния 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этил- 34 022408 ацетатом и затем постепенно увеличивали содержание ацетона (10%, 20%, 30%, и т.д. в этилацетате). Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт (342 мг) растворяли в метаноле и очищали препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку \Уа1сг ХТегга М8С18 (10 мкм, 19 смх250 мм) с нагнетанием растворителя со скоростью 21 мл/мин. Растворитель А представлял собой воду, и растворитель В представлял собой ацетонитрил. Колонку прогоняли изократически при 53% В в течение 30 мин, затем делали инжекцию. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Указанные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества (6 мг).

Пример 11. Выделение 61-дезгидрокси-61-аминосанглиферина А, соединение 21.

Криоконсервированный штамм спор ΒΙΟΤ-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали перенесением 0,4 мл штамма спор в 400 мл среды 8М25 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Культивирование осуществляли в течение 48 ч при температуре 27°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см). Из культуры семян 20 мл переносили в 400 мл производственной среды 8СР2+5%НР20 в 2 л колбах Эрленмейера с пробками из пены. Спустя 24 ч культивирования при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см), в каждую производственную колбу добавляли 2 мл 200мМ раствора метил (8)-2-амино-3-(3-аминофенил)пропаноата в 1 М хлористо-водородной кислоте с получением окончательной концентрации предшественников 1 мМ. Культивирование продолжали в течение еще 4 дней при температуре 24°С и 250 об/мин (амплитуда 2,5 см).

Бульоны культур объединяли, муравьиной кислотой рН доводили приблизительно до 3 и центрифугировали (3300 §) в течение 25 мин для отделения клеток и смол от прозрачного бульона. Прозрачный бульон отбрасывали, после того, как анализ подтверждал, что присутствует менее 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч, используя лопастную мешалку. Ацетонитрильный экстракт выделяли, давая ему осадиться под действием силы тяжести. Затем в тех же самых условиях осуществляли вторую ацетонитрильную экстракцию клеток и смолы. Третий экстракт получали путем центрифугирования оставшейся смеси клеток и смолы.

Объединенные ацетонитрильные экстракты концентрировали до остаточного водного объема при пониженном давлении, и рН доводили до 6. Далее дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением неочищенного конечного продукта.

Неочищенный экстракт растворяли в этилацетате и помещали на колонку с силикагелем, доведенную до кондиционного состояния этилацетатом. Колонку элюировали органическим растворителем с повышенной полярностью. Собирали приблизительно 250 мл фракций, и целевое соединение идентифицировали аналитической ЖХ, объединяли и упаривали досуха. Полученный продукт растворяли в метаноле и очищали препаративной ВЭЖХ. Чистые фракции идентифицировали ВЭЖХ-УФ и объединяли. Данные фракции упаривали досуха при пониженном давлении, с получением целевого соединения в виде аморфного не совсем белого твердого вещества.

Пример 12. Биологические данные - ш νΐΐΓο оценка НСУ противовирусной активности в системе репликонов.

Соединения были проанализированы в анализе репликонов, используя клетки Ηιι1ι5.2. как описано в общем способе. Для сравнения были включены циклоспорин А.1, санглиферин А.5 и гидроксимакроцикл, 6.

Название	ЕСбо (мкМ)	СС50 (мкМ)	Индекс избирательности {СС50/ЕС50,
Циклоспорин А.1	0,2	4,3	21,5
Санглиферин А.5	0,318	9,1	28, 7
Гидроксимакроцикл, 6	8,4	83,6	9,9
14	0,135	12, 8	121
15	0,195	16,6	88
16	0,89	29,7	32
17	0,083	11,6	143
18	3,4	11,7	3, 5
19	24, 3	48, 1	3, 5

Как можно видеть, соединения 14, 15, 16 и 17 являются все очень сильными в анализе репликона НиН5.2 (как показывает низкий ЕС₅₀), с хорошей избирательностью в отношении клеточной линии (как показывает высокий индекс избирательности). Ранее описанный санглиферин А.5 менее эффективен, чем соединения 14, 15 и 17 при ингибировании НСУ, и циклоспорин А.1 менее активен, и как 1, так и 5 имеют более слабые показатели избирательности.

Пример 13. Микросомная стабильность.

Стабильность соединений в микросомах печени человека и мыши анализировали, как описано в общих методах. Санглиферин А, 5 был включен для сравнения.

- 35 022408

Название	Время полужиЗни микроооы печени человека(мин)	Время полужиЗни микросом печени мыши(мин)
Санглиферин А, 5	6,38	6, 15
14	9,32	9, 78
15	10, 81	9,22
16	6,61	5, 48
17	9,50	9, 67
18	7, 64	3, 46
19	10,37	4,71

Как можно видеть, соединения по изобретению, 14, 15, 16, 17, 18 и 19, все обладают повышенной стабильностью в микросомах печени человека по сравнению с санглиферином А (5) и соединения 14, 15 и 17 также все являются более стабильными в микросомах печени мышей.

Ссылки

Арре1, Ν., Т. 8сЬа11ег, εΐ а1. (2006). Ргот 8йисТиге ίο ГппсТкп: пс\у ш81дЬТ8 ΐηίο ΗορΑΐίΐίδ С У1ги8 ΚΝΑ герЬсаТкп. ΐ. Вк1 СЬет 281(15): 9833-6.

ВапТеЬ, К., ΐ. ^адпег, εί а1. (2001). 8уп1Ьс818 оГ άεπνηΐίνεδ оГ 1Нс иоуе1 сус1орЬйт-Ъшйшд 1ттиио8иррге88апТ 8апдЬГеЬгш Α уЬЬ гсйиссй иитЬегк оГ ро1аг ГиисЬоик. Вюогд Мей СЬет ЬсП 11(12): 1609-12.

В1егтап, М., Ьодаи, К., О'Впеп, К., 8епо, Е.Т., Шдаиуа Као, К., апй 8сЬоиег, В.Е. (1992) Р1а8т1Й с1отпд уссЮг8 Гог 1Ьс сои)ида1 Тгап8Гег оГ ΌΝΑ Ггот ЕксЬепсЫа соЬ То 8йерТотусе8 8рр. Оепе 116: 43-49.

СЬаПсгр, и., М. ВоЬагйТ, с1 а1. (2009). ТЬе котсгахс асЬус 81Те оГ сус1орЫ1ш а 18 сг|Пса1 Гог НСУ герЬсаЬои. ΐ. Вю1 СЬет.

Со1дап, ΐ., М. А8та1, с1 а1. (2000). 18о1аТюп, сЬагас1сп/аЬоп апй 1агдс1сй ФкгирЬои оГ тоике рр1а: сус1орЬйш Α ΐδ поТ С88СпЬа1 Гог таттаЪаи се11 У1аЫ1Ьу. Оепотк8 68(2): 167-78.

СгаЬЬе, К., О. Уиадтаих, с1 а1. (2009). Ап смйиаПоп оГ 1Нс сус1орЬйш 1пН|Ь11ог ЭсЫо 025 апй Ьз ро1сп11а1 а8 а 1гса1тсп1 Гог сЬготс ЬсраЬ08 С. Ехрей Орш 1п\'С80д Эгид8 18(2): 211-20.

ЭоЬп8к1, К., 8. Мшг, с1 а1. (1997). А11 сус1орЬШп8 апй РК506 Ъшйшд рго1сп18 аге, шЙ1У1Йиа11у апй со11есЬуе1у, Й18реп8аЫе Гог у1аЫ1Ьу ш 8ассЬаготусе8 сегеу181ае. Ргос №И1 Асай 8с1 и8А 94(24): 13093-8.

Е. Ь-а\\Ь/, К. К., Т. Νдиуеη, М. Ниапд, ΐ. Ке, ΐ. Ргае8Тдаагй, Ό. 8егга, М. Ко/к1, Т. Еуап8 (2009). 8аГеТу Апй Ληΐίνίηιΐ ЕГПсасу ОГ 14 Эау8 ОГ ТЬе СусорЫЬп 1пН|Ь11ог Νίιη811 Ιη СошЫпаТюп \νίΐ1ι Реду1аТей 1пТегГегоп.2а 1п Ке1ар8ей ОепоТуре 1 Нсу 1пГсс1сй РаПспй. 1оита1 оГ НераТо1оду 50(81): 8379.

Едопп, М.1, Т.Р. ЬадаТТиТа, еТ а1. (2002). РЬагшасокшеТк8, Й88ие П|81г|Ьи11оп, апй тсШЬоЫт оГ 17(Й1те1Ьу1аттоеТЬу1атшо)-17-йетеТЬохуде1йапатуст (№С 707545) ш СЭ2Р1 тке апй р18сЬег 344 гаТ8. Сапсег СЬетоТЬег РЬагтасо1 49(1): 7-19.

РеЬг, Τ., ΐ. КаИеп, еТ а1. (1999). 8апдЬГеЫш8 А, В, С апй Ό, поуе1 сус1орЫ1ш-Ъшйшд сотроипЙ8 18о1аТей Ггот 81герТотусе8 8р. А92-308110. II. 8ТгисТиге еЫскаТюп, 8ТегеосЬеш18Тгу апй рЬу8ко-сЬешка1 ргорейк8. ΐ. АпйЪкТ (Токуо) 52(5): 474-9.

РЬ81ак, К., А. НогЬап, еТ а1. (2008). ТЬе сус1орЫ1ш 1пЫЫТог ОсЬк-025 81ю\У8 роТепТ апй-ЬераЬЙ8 С еГГесТ ίη раПспй сошкесТей уЬЬ ЬерайЙ8 С апй Ьитап ЬптипойсГккпсу уни8. НераТо1оду 47(3): 817-26.

Ригп188, В. 8., Ригп188, А.1., Уоде1, А.1., Ей. (1989). Уоде1'8 ТеХЪоок оГ Ргасйса1 Огдатс СЬет18йу, Ргепйсе На11.

ОаЪЬег, Ь. А., Вога\У8кГ ΐ., Апйегеоп, Ь. ΐ., Ва1аЪат8, К. А. еТ а1., (2010). Ми1йр1е сус1орЫЬп8 шуо1уей ίη ййГсгсШ се11и1аг раТЬуау8 шеЫаТе НСУ герЬсайоп Уйокду 397: 43-55.

О1ау1па8, Н., Кга.)с81, Р., С8егере8, ΐ., 8агкаЙ1, В. (2004). ТЬе го1е оГ АВС 1гап8рог1сг8 ш йгид ге818Тапсе, шеТаЬоЬ8ш апй Тохкйу. Сигг. Эгид. Όεΐΐν. 1(1): 27-42.

Оотс/, Ь., Н. ТЫЪаиЬ, еТ а1. (2007). 1пЫЪЬюп оГ шЬосЬопййа1 рсгтсаЬПЬу Тгап8Йюп Ппрго\'С8 ГипсПопа1 гссоусгу апй гейисе8 тойаЬТу ГоПоушд асиТе туосагЙ1а1 1пГагсТюп ш тке. Ат ΐ. РЬу8к1 Неай Сагс РЬу8к1 293(3): Н1654-61.

ОоТо, К., ХУаНМи, К., 1поие, Ό., НукаТа, М., 8ЫшоТоЬпо, К. (2009) ИепТШсаТюп оГ се11и1аг апй У1га1 ГасТог8 ге1аТей То апП-ЬсраНП8 С νίπΐ8 ас11У11у оГ сус1орЫЬп шЫЪЬог Сапсег 8скпсе 100(10): 1943-1950.

Напои11е, X., ВайЫо А., \Укги8/С81й !М., Уегйедет Ό., Ьапйгки I., Вайеп8сЫадег К., Ретп Р., Прреп8 О. (2009). Нсра1к18 С νίπΐ8 №5А ргоТеш 18 а 8иЬ8ТгаТе Гог ТЬе Рерййу1-Рго1у1 с18/1гап8 18отега8е аску|1у оГ Сус1орЫЬп8 А апй В. ΐ. Вк1 СЬет.

Найе1, С., Р. 1ЫЬег, еТ а1. (2006). 1ттипо8ирргс881ус ас11У11у оГ ТЬе штипорЬШп-Ътйтд йгид 8апдЬГеЬгш А ш Ьитап уЬо1е Ыоой: роТепТ шЫЪЫоп оГ тТегкикш-6 ргойисей Ьу 1утрЬосуТе8 апй топосуТе8. 8сапй ΐ. 1ттипо1 63(1): 26-34.

Негг1ег, М., Н. Вапд, еТ а1. (1994). С1отпд апй сЬагас1сп/аПоп оГ рр1В, а ВасЫи8 8иЬТЙ18 депе уЫсЬ епсойе8 а сус1о8ропп А-8СП8Ыус рерййу1-рго1у1 с18-Тгап8 18отега8е. Мо1 МкгоЪю1 11(6): 1073-83.

НЬе, М., Титег, 8., Рейегкр С. (2003). Рай 1: Ога1 йсПусгу оГ роойу 8о1иЫе йгид8. РЬагтасеи!ка1 МапиГасТигшд апй Расктд 8оигсег. 8иттег 20 03 188ие.

1ттеске, 8.Ν., Ваа1., Ν, еТ а1. (2011). ТЬе Сус1орЫЬп-Втйтд АдепТ 8апдЬГеЫш А 18 а ОспйгПк Се11 СЬетокте апй М1дгаТюп 1пЫЪЬог. РЬО8 опе 6(3):е18406.

1поие, К., К. 8ек1уаша, еТ а1. (2003). СотЪшей тТегГегоп а!рЬа2Ь апй сус1о8ройп А ш ТЬе ТгеаТтепТ оГ

- 36 022408 сЛотс НераЛк С: сойгоИей 1па1. 1. Сак1гоейего1 38(6): 567-72.

1поие, К., Т. ИтеНага, с1 а1. (2007). Еуа1иайоп оГ а сус1орЫ1т шЛЬког т НерайЙ8 С упик-тГсс1сй сЛтепс тке ш у1уо. Нера!о1оду 45(4): 921-8.

1кНл, Ν., К. Аа1акЛ, е! а1. (2006). 'тауегке еГГес1к оГ сусккрогте оп НерайЙ8 С упик к1гат герИсайоп.

1. Упо1 80(9): 4510-20.

1. Ке, Е. Ь., К. Ео/1сг. Т. МагЬигу, Ν. Νβΐινοη. Ό. δεηη, К. Эок. 1. Ргаейдаагй, М. Ниапд, Т. Еуапк (2009). δαΚίν, Апй То1егаЫЛу ОГ ΝΛι811, А №ус1 СусЛрНЛп 1пЛЫ1ог Рог Нс\', Ео11о\\Лд δ^ηд1е Апй МиЛр1е Аксепйшд Эокск 1п НеаНЬу Уо1ийеегк Апй Нс\'-1пГсс1сй Райейк. 1оигпа1 оГ Нера1о1оду 50(δ1): δ229.

1асоЬкоп, I., МсНйсЫкоп, Ю, δώ^ν^, М. (2007). Сак1гоейего1 & Нера1о1 3(δ34): 1-10.

1Шпд, О.Т., ШгтапксП, Ι.Ό. апй РеЬегйу ЕР. (1989) Рго1ор1ак1 1ко1айоп апй Кедепегайоп ш δΐгеρΐотусек с1ауиИдегик. 1. Оеп. М1сгоЫо1 135, 2289-2297.

Ка11еп, 1., К. δοΛΑΐή е! а1. (2005). ’^йисЛге оГ Нитап сус1орЫ1ш А т сотр1ех \уНН (Нс поус1 1ттипокирргеккай капдЛеЛЛ А а! 1.6 А гекоЛйоп. 1. Вю1 СНст 280(23): 21965-71.

Ка\уакакк Η., Е. δ. Мосагккд е! а1. (2007). СусЛкроппе тЫЬНк тоике суЛтедаЛупик ЛГесйоп νια а сусЛрНШп-йерепйей ра1Н\уау кресШсаПу т пеига1 к1ет/ргодетЛг се11к. 1. У1го1 81(17): 9013-23.

К1екег, Т., ВЛЬ, М.Е, Вийпег, М.Е, СНа1ег, К.Р., апй ^ртеоой, Э.А. (2000) Ргасйса1 δΐгеρΐотусек Сепейск, 1оНп 1ппек Роипйайоп, №г\\кН.

Котд, 1. Η., С1аекег, М. Кекег, К. Мапйегу, и. К1о1/ апй М. Р. Рготт (2010), Эгид Ме1аЬ Окрок, 39, 1097-1102.Маппк, М. Р., С. К. Рок1ег, е! а1. (2007). ТНе теау Гопуагй т ΗСУ 1геа1тей-йпйтд 1Не пдЫ раЛ. ΝαΙ Кеу Эгид Эксоу 6(12): 991-1000.

Магйп СаЬге)ак, Ь. М., δ. КоНгЬасН, е! а1. (1999). МасгоНйе Апа1одиек оГ 1Не №ус1 1ттипокирргеккап! δα^ΛεΛΛ: Νεν Аррйсайоп оГ Ле КЛд-С1окЛд МсНИНскк Кеасйоп. Апцщу СНст Ιηΐ Ей Епд1 38(16): 2443-2446.

МаЛу, 1. Е., δ. Ма, е! а1. (2008). СотЫпайопк оГ сусЛрНШп 1пЫЫ1ог ММ811 νίΛ Нераййк С Уник Ж3-4А Рго1еаке ог Νδ5Β ро1утегаке 1пЫЫ1огк епНапсе апйупа1 асйуйу апй кирргекк Ле етегдепсе оГ гекк1апсе. АпйтЛгоЪ Адепк СНсто(Нсг 52(9): 3267-75.

МсНйкоуа, I. (2008). ЖсраЛк С Легар1ек. №йигс Κεν Эгид Экс 7: 799-800.

МеИегтсН, К., Όεηηί, Ό., ТНа1, В, δοΛΑΐή К. (1999). То\уагй а То1а1 δγώ^^ оГ Ле 1ттипокирргеккап! δα^ΛεΛΛ А. Ргерагайоп оГ Т\уо Ке1ау Сотроипйк Ьу Оедгайайоп апй ТНсп Ике Л 1Ье КеаккетЫу оГ 1Ье ΝαΗηαΙ Ргойис!. 1. Огд. СНет. 64: 9632-9639.

МИ1ау, Ό. Р., М. А. δα^εηΐ, е! а1. (2008). Сепейс апй рНагтасоЛдк НййЬПюп оГ тйосНопйпаЕ йерепйей песгокк а11епиа1ек тикси1аг йук1горНу. Να! Мей 14(4): 442-7.

№1коп, Ό. К., СНаНЬ, ΚΗ., 8и1ко№8к1, М., ЗсНГЕГ, Е., Кик1д1, У., Роскгок, Р.1., Аапд, С, Эссок1сгй Кег1шс1, Ό., апй Р. Сгокдигш, РогсНсН Η., СгаЬЬе, К. (2009). ЕГйсасу Апй δαΛίν ОГ ТНе Сус1орЫ1ш 1пЫЫ1ог ЭсЬ|о 025 1п СотЫпайоп АПН Реду1а1ей 1п1егГегоп А1рНа-2а Апй КЬаутп Ιη РгеуЛик1у Νυΐΐ-Кекропйег Сепо1уре 1 Ηον Райейк. 1оита1 оГ ИсраЮкду 50(δ1): δ40.

Νινα, Т., Уатато1о, δ, δΑίΦ, М, δН^гада. Т, Такадк А. (2007). ЕГГес! оГ СусЛкроппе апй Тасгойтик оп Су1осНготе Р450 АсПуЛск т Иитап Ыуег МЛгокотек. Уакидаки 2аккЫ 127(1): 209-216.

РаекНиуке, 1., А. Каи1, е! а1. (2006). ТНе поппттипокирргекыуе сусЛкропп ЭЕВ1О-025 к а ро!еп! шЛЫЛг оГ НераЛк С уник герИсайоп Л уНго. ИсраЮкду 43(4): 761-70.

Рагйетик, А., 1. 1агок/с\\к/, е! а1. (2007). ’^реайсаПу 1агде1ей апйупа1 Легару Гог НераЛк С уник. Аог1й 1 Сак1гоеп1его1 13(43): 5673-81.

Ра\\1о1кку, 1. М. (2000). 'Ήеρаййк С уник гсккПтсс 1о апйупа1 Легару. ИсраЮкду 32(5): 889-96.

Ра\\1о1кку, 1. М. (2005). Сиггеп! апй ГиЛге сопсерк т НераЛк С Легару. δαηίη Ыуег Эк 25(1): 7283.

Ра\\1о1кку, 1. М. (2006). УпоЛду оГ НераЛк В апй С У1гикек апй апйуна1 1агдек. 1. Ηеρаΐо1 44(1 δиρρ1): δ10-3.

РетНегЛп, Т. 1. апй 1. Е. Кау (2003). СусЛрНЛп кепкЛуку 1о капдЛеНпп А сап Ье согге1а1ей 1о Ле кате крескйс 1гур1орНап гекЛие ак сусЛкропп А. РЕΒδ Ьей 555(2): 335-40.

Роскгок, Р. (2008). ЕтегдЛд ТНегар1ек Гог СЛотс ВсраЛк С Уник. Сак1гоеп1его1 апй ИсраЮкду 4(10): 729-734.

Р1ак, К. С., Р. А. СаПау, е1 а1. (2008). 1пЛЬЛоп оГ Нитап 1ттипойейскпсу У1гик 1уре 1 герИсайоп Л Нитаи се11к Ьу ПеЫо-025, а поуе1 сус1орЛ1Л НЛйтд адей. АпйтЛгоЪ Адепк СНетоЛег 52(4): 1302-17.

Си, X., Напд, Ν. е1 а1., (2011). С1отпд, кссщспстд апй сНагас1сп/айоп оГ Ле ЫокупЛейс депе с1ик1ег оГ капдЛеНпп А, а ро1еп1 сус1орЛ1т ЛЛЬНог. Мо1. ВюкукГ 7:852-861.

КоЫйа, ЕМ., И.В. №1коп, е1 а1. (2007). СНагас1сп/айоп оГ НераЛк С У1гик киЪдепотк герйсоп гек1к1апсе 1о сусЛкроппе Л уйго. 1. Уно1 81(11): 5829-40.

ИоркЕк, δ. Ό. Η., Е. Саук, 1. Е-а1с/ап, Е. СкН/сг, В. ОНМакктю, Р. Кикпак, δ. Аппд, С. δΜΐΙΙον, Υ. апй КЬеШ (2009). '^аГе1у, р1акта ркагтасокЛейск, апй апй-уиа1 асйуНу оГ δСΥ-635 т айи11 райепк νίΛ сНготс НераЛк С упик ЛГесйоп. 1оита1 оГ ^раШ^ду 50(δ1): δ36.

ЗапдЬег, ЕЕ, У. Оисктаих, е1 а1. (1999). '^апдЛеНппк А, В, С апй Ό, поуе1 сус1орЛ1Л-ЫпйЛд сот- 37 022408 роииЙ8 18о1аТей йот §йер1отусе8 8р. А92-308110. I. Тахопоту, ГеттеШайоп, 18о1айоп апй Ъю1одюа1 асйуйу. 1. АпйЪюТ (Токуо) 52(5): 466-73.

§сЬпе1Дет, Μ.Ό. (2005). Сус1орЫ1ш Ό: кпоскшд оп йеаТЬк йоот. δα δΤΚΕ 2005(287): ре26. δοάαηί, К., 1. Ка11еп, с1 а1. (2003). '^апдЬГеЬпп-сус1орЫЬп шТетасйоп: йедтайайоп уотк, 8уп1кейс тастосусЬс апа1одие8, Х-тау сту81а1 8йисТите, апй Ыпйшд йа!а. 1. Ат СЬет δοс 125(13): 3849-59. δεάεη, Κ.Ό. Васк апй δ. КНоо (2010), 1. Апйт1стоЬ СЬетоТЬет, 65, 1079-1085. διηΜι, Μ. В. а. Μ., 1., Ей. (2001). Μαπ:1ι'8 айуапссй отдатс сЬет18йу, 1оЬп \УПсу апй δοη8 1пс., ИК. δΐείη8Λη1ΐε, С., Т. Тапет, с1 а1. (2003). СиТйпд ейде: 8апдЬГеЬпп А, а поус1 сус1орЫ1т-Ътйшд 1ттипо8ирргс88ап1 Ыоск8 Ъюасйуе 1Й-12 ртойисйоп Ьу Ьитап йепйййс се118. 1. 1ттипо1 171(2): 542-6.

δύ^ερ Ό. В., Т. ХУпдЫ, с1 а1. (2004). О1адпо818, тападетепТ, апй 1гса1тсп1 ой ЬераЬЙ8 С. НераТо1оду

39(4): 1147-71.

Ттор8сЬид, Μ., I. В. ВайЬе1те88, с1 а1. (1989). δεη8ΐίίνίίγ То сус1о8ройп А 18 теФаТей Ьу сус1орЫ1т ш №ито8рота ста88а апй δассЬаτοтусе8 сетеу181ае. ЫаТите 342(6252): 953-5.

Уто1ук, 1. Μ., А. Каи1, с1 а1. (2003). А терйсоп-Ъа8ей Ъюа88ау йот 1Ьс теа8итетепТ ой тТетГетоп8 ш райепТ8 уйЬ сЬтотс ЬераЬЙ8 С. 1. Уйо1 ΜеΤЬοЙ8 110(2): 201-9.

\Уппд, δ., С. ХУШс, С. Кс\уст18, К. Капйо1рЬ, А. δсτ^Ьηеτ апй δ. Норкш8 (2010), 1оитпа1 оГ НераТо1оду,

52, δ263.

Уапд, Р., 1. Μ. КоЬоТЬат, с1 а1. (2008). Сус1орЫ1ш А 18 ап С88сп11а1 соГасЮг Гот ЬерайЙ8 С νίπΐ8 1пГесйоп апй 1Ьс рйпара1 теФаТот оГ сус1о8ройпе те818Тапсе ш уйто. 1. У1то1 82(11): 5269-78.

2епке, С., и. δΤτ^йтайеτ, еТ а1. (2001). 'ЪапдЬГсЬпп А, а поус1 сус1орЫЬп-Ъшйтд сотроипй 8Ьоутд пптшк^иррп^!!!; асйуйу уйЬ а пеу тесЬат8т оГ асйоп. 1. 1ттипо1 166(12): 7165-71.

Ζαι/αη, δ. апй Е. Нетттапп (2002). Пупатю8 оГ ЬерайЙ8 С У1ти8 1п£есйоп. Апп НераТо1 1(2): 56-63. ΖΙίΑΠβ, Ь. Н. апй 1. О. Ын (2001). 'ЪапдЬГсЬпп А, а поуе1 сус1орЫ1ш-Ътйшд 1ттипо8иррте88апТ, шЫЪΪΤ8 1Ь-2-йерепйепТ Т се11 ртоЬГетайоп аТ ТЬе С1 рЬа8е оГ ТЬе се11 сус1е. 1. 1ттипо1 166(9): 5611-8.

Все ссылки, включая патенты и патентные заявки, приведенные в настоящем описании, включены в данное описание посредством ссылки в максимально возможной их полноте.

Во всем описании и в следующей далее формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово включать и вариации, такие как включает и включающий, следует понимать как включение указанного целого или стадии, или группы целого, но не исключение любого другого целого или стадии, или группы целого, или стадий.

Claims (19)

1. Соединение формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемая соль где Κι, К₃, К4 и К₅ независимо представляют собой Н, Р, С1, Вт, С_2-6алкенил или С_1-1оалкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на гетероатом, выбранный из О, N и δ^)^ в котором р равен 0, 1 или 2, и где алкильная группа может быть необязательно замещена одним или более атомами галогена;

К₂ выбран из Н, Р, С1, СР₃, ОН, Ν4₂ и С1_-6алкила;

Χι, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ независимо представляют собой С или Ν, и в случае, когда любая из указанных

- 38 022408 групп представлена Ν, присоединенный заместитель отсутствует;

при условии, что когда Κι, К_З, К₄ и К₅ все представляют собой Н и Х_ь Х₂, Х_З, Х₄ и Х₅ все представляют собой С, тогда К₂ не может представлять собой ОН;

включая его таутомер; или его изомер, в котором С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-5З кето и С-15 гидроксильной группы и метанола.

2. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х₁ представляет собой С.

3. Соединение формулы (I) или (II) по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х₂ представляет собой С.

4. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х_З представляет собой С.

5. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х₄ представляет собой С.

6. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где Х₅ представляет собой С.

7. Соединение формулы (I) или (II) по пп.1-6 или его фармацевтически приемлемая соль, где К!, К_З, К₄ и К₅ независимо выбраны из Н, Р, С1, СР_З, ОН и С1_-6алкила.

8. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где К₂ представляет собой ОН.

9. Соединение формулы (I) или (II) по п.1, выбранное из

- З9 022408

- 40 022408 которые также могут быть представлены как

- 41 022408 которое также может быть представлено как

- 42 022408 включая его таутомер; или его изомер, в котором С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-5З кето и С-15 гидроксильной группы и метанола;

или его фармацевтически приемлемая соль.

10. Соединение формулы (I) или (II) по п.1, выбранное из включая его таутомер; или его изомер, в котором С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-5З кето и С-15 гидроксильной группы и метанола;

или его фармацевтически приемлемая соль.

11. Применение соединения по любому из пп.1-10 в качестве фармацевтического препарата.

12. Применение соединения по любому из пп.1-10 в качестве фармацевтического препарата при лечении вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекция, или дистрофии мышц.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-10 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, для лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекция, или дистрофии мышц.

14. Способ лечения вирусных инфекций, таких как НСУ или ВИЧ инфекция, или дистрофии мышц, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-10.

15. Способ лечения воспалительных заболеваний, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-10.

16. Применение соединения по любому из пп.1-10 в качестве фармацевтического препарата при лечении воспалительных заболеваний.

17. Способ получения мутасинтетического санглиферина, который включает питание бактерий, вырабатывающих санглиферин, таких как 81гсрЮтусс8 8р, соединением формулы (III)

- 4З 022408 где Х_ь Х₂, Х₃, Х₄, Х₅, В₂, В₃, В₄ и В₅ определены как К._ь В₂, В₃, В₄ и В₅, независимо представляющие собой Η, Р, С1, Вг, С_2-6алкенил или С_1-10алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на гетероатом, выбранный из О, N и δ(Θ)_ρ, в котором р равен О, 1 или 2, и где алкильная группа может быть необязательно замещена одним или более атомами галогена;

Х₁, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ независимо представляют собой С или Ν, и в случае, когда любая из указанных групп представлена Ν, присоединенный заместитель отсутствует;

при условии, что когда К.₁, В₃. В₄ и В₅ все представляют собой Н и Х₁, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ все представляют собой С, тогда В₂ не может представлять собой ОН,

В- представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, или его солью, и культивирование такой бактерии, которая продуцирует мутасинтетический санглиферин.

18. Способ по п.17, где бактерия, вырабатывающая санглиферин, представляет собой ЫгерТотусев ер, где зГаА ген или гомолог зГаЛ гена инактивирован или удален.

19. Способ по п.17 или 18, дополнительно включающий стадию выделения мутасинтетического санглиферина.