CN1882689A - 产生嗅觉gpcr的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在细胞中产生嗅觉GPCR的方法。总的来说，所述方法包括：将表达盒引入例如许旺氏(Schwann)或寡突细胞的大胶质细胞中，所述表达盒含有可经由操作连接到编码嗅觉PCR的核酸的启动子；并在适于产生所述嗅觉GPCR的条件下维持所述细胞。本发明也提供一种含有编码嗅觉GPCR的重组核酸的大胶质细胞、筛选嗅觉GPCR活性的调节剂的方法和用于在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR的试剂盒。本发明主要用于调味剂和芳香剂的研究中，并且因此具有多种研究及工业应用。

Description

产生嗅觉GPCR的方法

本申请案主张如下于指定日期由美国专利商标局经美国快递提交的临时申请案的优先权：于2003年11月21日提交的美国临时申请案60/523,940。前述申请案的揭示内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及在细胞中产生GPCR蛋白、尤其是嗅觉GPCR蛋白的方法。

背景技术

所有的动物都具有“鼻子”，一种允许识别和辨别环境中的化学感应信息的嗅觉感觉器官。例如，人类相比其他动物具有较弱的感觉，但其仍可感知(意即闻到)超过10,000种通常为小于400Da的小有机分子的挥发性化学物质(“气味剂”)。这些化学物质在结构上显著不同，且包括多种不同的脂族酸、醇、醛、酮和酯；具有芳环、脂环、多环和杂环结构的化学物质；和无数经取代的每一所述类型的化学物质；以及其组合。值得注意的是，所述分子不仅由嗅觉系统检测，而且其也由嗅觉系统辨别。

由于某些气味合乎需要而其他气味令人厌恶，故极其需要产生新气味、模拟气味和操纵气味感知的能力。出于此目的，近年来已加强对于气味感知的研究。在人类及其他动物物种中，已于嗅毛(一种专门类型的嗅觉感觉神经元树突)上识别出大量的气味剂受体。所述气味剂受体显示出G蛋白偶合受体总科的七个跨膜结构域拓扑学特征，并且因此将其称为“嗅觉GPCR”。每一嗅觉感觉神经元仅表达一类嗅觉GPCR，并且据估计人类基因组编码大约500种活性嗅觉GPCR。

因此，可通过相对较少的受体检测并辨别相当大量的化学物质。此使用组合式受体编码流程来达成，其中每一嗅觉GPCR识别一种以上的气味剂，每一气味剂由一种以上的嗅觉GPCR识别。因此，可根据经活化GPCR的“指纹”表征气味剂。测定后，此“指纹”提供气味剂的特性以及识别显示出类似“指纹”且由此有气味的其他分子的依据。

虽然当使用腺病毒载体外源引入时可由嗅觉感觉神经元在体内高水平地有效表达重组嗅觉GPCR(例如Touhara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96：4040-4045，1999)，但嗅觉GPCR非常例外，因为其无法以提供其在细胞中功能的方式在异源培养的细胞系统中容易地表达(例如McClintock，Mol.Brain Res.48：270-278，1997)。尽管此问题之确切原因尚不明了，但一种理论为当在非内源性细胞中表达时，嗅觉GPCR并未输出到细胞的原生质膜，并在内质网中变得螯合。另一理论提出功能性表达可归因于适当膜定位所需的嗅觉特异性因子或与非嗅觉细胞中转导机构的无效偶合(Krieger等人，Eur.J.Biochem219：829-835，1994)。无论导致非内源性培养细胞中重组嗅觉GPCR的无效和/或基本上非功能性表达的机制如何，对所述问题的解决方案先前尚未可知。

截至本发明为止，嗅觉GPCR特别难以在体外哺乳动物细胞中表达，且即使这些方法极其合乎需要，也不存在用于产生并分析所述GPCR的稳固、可靠及有效的方法。气味剂感知和辨别的了解方面的发展也已由于不能产生嗅觉GPCR而受到严重牵制(Firestein Nature 413：211-218，2001)。

由前述内容可知存在对用于在哺乳动物细胞中产生嗅觉GPCR的稳固、可靠及有效的方法的强烈需求。本发明以不可预见的高成功水平满足此需求及其他需求。

文献

所关注的文献包括下列参考文献：Zozulya等人，(Genome Biology2：0018.1-0018.12，2001；Mombairts(Anna Rev.Neurosci 22：487-509，1999)；Raming等人，(Nature 361：353-356，1993)；Belluscio等人，(Neuron 20：69-81，1988)；Ronnet等人，(Annu.Rev.Physiol.64：189-222，2002)；Lu等人，(Traffic 4：416-533，2003)；Buck(Cell 100：611-618，2000)；Malnic等人，(Cell 96：713-723，1999)；Firestein(Nature 413：211-218，2001)；Zhao等人，(Science 279：237-242，1998)；Touhara等人，(Proc.Natl.Acad.Sci.96：4040-4045，1999)；Sklar等人，(J.Biol.Chem 261：15538-15543，1986)；Dryer等人，(TiPS 20：413-417，1999)；Ivic等人，(J Neurobiol.50：56-68，2002)；和Fuchs等人，(Hum.Genet 108：1-13，2001)；已公开的美国专利申请案20030143679和20030105285；和美国专利6,610,511、6,492,143和6,410,249。

发明内容

本发明提供一种在细胞中产生嗅觉GPCR的方法。总的来说，所述方法包括将表达盒引入例如许旺氏或寡突细胞的大胶质细胞中，所述表达盒含有可经由操作连接到编码嗅觉GPCR的核酸的启动子，并在适于产生嗅觉GPCR的条件下维持所述细胞。本发明也提供一种含有编码嗅觉GPCR的重组核酸的大胶质细胞、筛选嗅觉GPCR活性的调节剂的方法和用于在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR的试剂盒。本发明主要用于调味剂及芳香剂的研究中，且因此具有多种研究及工业应用。

定义

在进一步描述本发明之前，应了解本发明不受所述特定实施例限制，故其当然可有所变化。也应了解本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不意欲构成限制。除非另作定义，否则本文所使用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。

当提供值的范围时，应了解介于所述范围的上限与下限之间的每一居中值(除非上下文另外明确指示，否则精确到上限单位的十分之一)和所述范围内的任何其他所述值或居中值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于所述较小范围中，且也涵盖于本发明中，其从属于所述范围中的任何特定排除的界限。当所述范围包括两个界限的一或两者时，排除那些所包括界限的一或两者的范围也包括于本发明中。

本申请案通篇已引用多个公开案、专利和已公开的专利申请案。本申请案中所参考的所述公开案、专利和已公开的专利申请案的揭示内容以全文引用的方式并入本揭示案中。公开案、专利或公开专利申请案的申请者在本文中的引用并不由所述公开案、专利或公开专利申请案的申请者认可为先前技术。

必须注意，除非上下文另作明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所使用的单数形式“一”、“和”和“所述”包括多个指示物。因此，例如对“一药剂”的提及包括多个所述药剂，并且对“所述GPCR”的提及包括对一个或一个以上GPCR和所属领域技术人员已知的等效物的提及，等等。应进一步注意可制定所述权利要求书以排除任何可选择的要素。由此，本声明意欲充当使用与权利要求书要素的引用相关的诸如“单独”、“仅”等等的排他性术语或使用“负性”限制的先行基础。

“G蛋白偶合受体”或“GPCR”为共有共同结构基序的多肽，其具有形成七个α螺旋的七个介于22到24个疏水氨基酸的区域，每一螺旋都跨越膜[每一跨越都由序号识别，意即，跨膜-1(TM1)、跨膜-2(TM2)等]。跨膜螺旋由细胞膜的外部或“细胞外”侧上介于跨膜-2与跨膜-3之间、跨膜-4与跨膜-5之间和跨膜-6与跨膜-7之间的氨基酸区域连接[所述区域分别称为“细胞外”区域1、2和3(EC1、EC2和EC3)]。跨膜螺旋也由细胞膜内部或“细胞内”侧上介于跨膜-1与跨膜-2之间、跨膜-3与跨膜-4之间和跨膜-5与跨膜-6之间的氨基酸区域连接[所述区域分别称为“细胞内”区域1、2和3(IC1、IC2和IC3)]。受体的“羧基”(“C”)末端位于细胞内的胞内空间中，而受体的“氨基”(“N”)末端位于细胞外的胞外空间中。此项技术中一般熟知GPCR的结构和分类，并且关于GPCR的进一步讨论可发现于Probst，DNA Cell Biol.1992 11：1-20；Marchese等人，Genomics 23：609-618，1994；和下列书中：Jürgen Wess(编辑)Structure-FunctionAnalysis of G Protein-Coupled Receptors，Wiley-Liss出版(第一版；1999年10月5日)；Kevin R.Lynch(编辑)Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors，JohnWiley & Sons出版(1998年3月)和Tatsuya Haga(编辑)，G Protein-Coupled Receptors，CRCPress出版(1999年9月24日)；和Steve Watson(编辑)G-Protein Linked Receptor Factsbook，Academic Press出版(第一版，1994)。

“原生GPCR”是由动物(例如人类或小鼠的哺乳动物)所产生的GPCR。关于原生GPCR的详细描述可发现于在美国生物技术信息中心(NCBI)的国际互联网站上所建立的在线孟德尔人类遗传数据库(On-line Mendelian Inheritance in Man database)中。关于原生GPCR的额外描述可发现于国际互联网站primalinc.com中并且表1中描述本方法所使用的例示性GPCR的列表。

术语“配位体”意谓特异性结合到GPCR的分子。配位体例如可为多肽、脂质、小分子或抗体等。“原生配位体”是作为原生GPCR的内源性天然配位体的配位体。配位体可为GPCR“拮抗剂”、“促效剂”、“部分促效剂”或“反向促效剂”等等。

“调节剂”为当与在细胞中表达的GPCR接触(例如结合)时，增加或减少GPCR胞内反应的配位体。

术语“第二信使”应意谓作为受体活化作用的结果产生的胞内反应。第二信使例如可包括1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)和Ca2+。可测量第二信使反应以测定受体活化作用。此外，可测量第二信使反应以识别例如作为促效剂、部分促效剂、反向促效剂和拮抗剂的候选药剂。

“促效剂”为当结合到GPCR时活化GPCR胞内反应的配位体。

“部分促效剂”为当结合到GPCR时在低于促效剂的程度上活化GPCR胞内反应的配位体。

“拮抗剂”为竞争性地结合到GPCR上与促效剂相同的位点但并不活化由GPCR的活性形式所产生的胞内反应的配位体。拮抗剂通常抑制由促效剂或部分促效剂引起的胞内反应。在不存在促效剂或部分促效剂的情况下，拮抗剂通常并不减小基线胞内反应。

“反向促效剂”为结合到GPCR且在不存在促效剂或部分促效剂的情况下抑制观察到的GPCR基线(基础)胞内反应的配位体。在大多数实施例中，与不存在反向促效剂的基线反应相比，在反向促效剂的存在下基线胞内反应被抑制至少约30％、至少约50％或至少75％。

术语“气味剂”涵盖具有已知或未知结构、天然存在或化学合成的活化嗅觉GPCR的任何化合物。如上文的背景技术中所讨论，气味剂通常为小于400Da的挥发性小有机分子。风味、香气、香味、气味、芳香为气味剂的类型。“气味”是与特定气味剂关联的感觉。

如本文所使用的术语“与嗅觉GPCR活性关联的现象”是指与嗅觉GPCR活性关联的结构、分子或功能特征，尤其是在人类或动物模型中易于评估的特征。所述特征包括(但不限于)由GPCR活化作用所引起的下游分子事件，和由GPCR活化作用所引起的诸如嗅觉、味觉的感觉表型或其他行为事件或生理学事件。

“缺失”是定义为氨基酸或核苷酸序列的改变，其中与亲本GPCR多肽或核酸的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分别缺少一个或一个以上的氨基酸或核苷酸残基。在关于GPCR或其片段的上下文中，缺失可包括约2、约5、约10、多达约20、多达约30或多达约50个或50个以上氨基酸的缺失。GPCR或其片段可含有一个以上的缺失。

“插入”或“加入”是氨基酸或核苷酸序列的改变，与亲本GPCR的氨基酸序列或核苷酸序列相比，其已分别引起一个或一个以上氨基酸或核苷酸残基的加入。“插入”通常是指多肽的氨基酸序列内加入一个或一个以上的氨基酸残基，而“加入”可为插入或指在N末端或C末端或两个末端处所加入的氨基酸残基。在关于GPCR或其片段的上下文中，插入或加入通常为约1、约3、约5、约10、多达约20、多达约30或多达约50个或50个以上氨基酸。GPCR或其片段可含有一个以上的插入。

“取代”是当与亲本GPCR或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比时，由不同的氨基酸或核苷酸分别置换一个或一个以上的氨基酸或核苷酸所引起。应了解GPCR或其片段可具有对GPCR活性大体上无影响的保守氨基酸取代。保守取代意欲为诸如gly、ala；val、ile、leu asp、glu；asn、gin；ser、tht；lys、arg；和phe、tyr的组合。

术语“生物活性”GPCR是指具有天然存在的GPCR的结构功能和生物化学功能的GPCR。

如本文所使用的术语“测定”、“测量”、“评定”和“分析”可互换使用，且其包括定量及定性测定。除非另外特定指明，否则在所述上下文中对GPCR的“量”的提及并不意欲必需定量评定，且可为定性或定量的。

本文可互换使用的术语“多肽”和“蛋白”是指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可包括已编码及未经编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有经修饰的肽骨架的多肽。所述术语包括融合蛋白，其包括(但不限于)具有异源氨基酸序列的融合蛋白，即具有有或没有N末端甲硫氨酸残基的异源和同源前导序列的融合体；经免疫标记的蛋白；具有可检测的融合搭配物的融合蛋白，例如包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合搭配物的融合蛋白；等等。

术语“核酸分子”和“聚核苷酸”可互换使用，且其是指任何长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。聚核苷酸可具有任何三维结构，并可执行已知或未知的任何功能。聚核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组聚核苷酸、分枝聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、控制区域、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。所述核酸分子可为线形或圆形。

如本文所使用的术语“经分离”当用于关于经分离化合物的上下文中时，是指处于与化合物天然存在的环境不同的环境中的所关注化合物。“分离”意谓包括在大体上富含所关注化合物和/或其中所关注化合物经部分或大体上纯化的样本内的化合物。

如本文所使用的术语“大体上纯”是指自其天然环境中移除的且不含至少60％、优选为75％且最优选为90％的其天然关联的其他组份的化合物。

“编码序列”或“编码”所选多肽的序列为当放置于适当调节序列(或“控制元件”)的控制下时，例如在宿主细胞中可转录(在DNA的情况下)并转译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界通常通过5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的转译终止密码子测定。编码序列可包括(但不限于)病毒cDNA、原核或真核mRNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’处。其他“控制元件”也可与编码序列关联。可通过使用所选细胞的优选密码子使编码多肽的DNA序列在所选细胞中的表达作用最优化以表现所需多肽编码序列的DNA拷贝。

“由…编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有来自由核酸序列编码的多肽的至少3到5个氨基酸、更优选为至少8到10个氨基酸且甚至更优选为至少15到20个氨基酸的氨基酸序列。也涵盖可由序列所编码的多肽免疫识别的多肽序列。

“可经由操作连接”是指元件的排列，其中所述组份经配置以执行其常用功能。可经由操作连接到编码序列的启动子将影响编码序列的表达。启动子或其他控制元件无需与编码序列相邻，只要其起到指导其表达的作用即可。举例而言，未转译但已转录的序列的插入可存在于启动子序列与编码序列之间，且仍可认为启动子序列“可经由操作连接”到编码序列。

“核酸构筑体”意谓已经构筑以包含一个或一个以上自然界未发现在一起的功能单元的核酸序列。实例包括圆形、线形、双股、染色体外DNA分子(质粒)、粘质粒(cosmid)(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非原生核酸序列的病毒基因组等等。

“载体”能够将基因序列转运到宿主细胞。“载体构筑体”、“表达载体”和“基因转运载体”通常意谓能够指导所关注基因的表达并可将基因序列转运到宿主细胞的任何核酸构筑体，其可通过全部或部分载体的基因组整合或作为染色体外元件的载体的暂时性或可遗传性维持来实现。因此，所述术语包括克隆运载体和表达运载体以及整合载体。

“表达盒”包含能够指导所关注基因/编码序列的表达的任何核酸构筑体，其可经由操作连接到所述表达盒的启动子。所述表达盒可构筑入“载体”、“载体构筑体”、“表达载体”或“基因转运载体”中以便将表达盒转运到宿主细胞中。因此，所述术语包括克隆运载体和表达运载体以及病毒载体。

如果第一聚核苷酸与第二聚核苷酸、其cDNA、其互补序列具有相同或大体上相同的核苷酸序列，或者如果其显示如上文所述的序列一致性，那么其是“来源于”所述第二聚核苷酸或与所述第二聚核苷酸“相对应”。

如果第一多肽(i)是由来源于第二聚核苷酸的第一聚核苷酸编码，或(ii)显示如上文所述的与第二多肽的序列一致性，那么其是“来源于”所述第二多肽或与所述第二多肽“相对应”。

术语“投与”等等是指加入GPCR调节剂以获得所需的药理学和/或生理作用。在许多实施例中，本GPCR调节剂为挥发性的，且由此其通过加入到食物中或大气中而直接或间接地经口或经鼻内投与。所述作用可完全或部分地阻止气味的感知、可增加对气味剂的感知或可产生新的气味。

术语“非天然存在”或“重组”意谓人工的或另外在自然界未经发现。重组细胞通常含有通常在所述细胞中未发现的核酸，重组核酸通常含有两个或两个以上在自然界未发现的核酸的融合体，且重组多肽通常是由重组核酸产生。

“受检者”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用以指具有嗅觉GPCR的任何动物，例如人类或非人类哺乳动物。受检者一般为哺乳动物受检者。例示性受检者包括(但非必需地限于)人类、非人类的灵长类动物、小鼠、大鼠、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫和马，以人类尤其受到关注。

附图说明

图1是四幅展示在原代大鼠许旺氏细胞表面上重组人类嗅觉GPCR的表达的照片画面。画面OR1为具有基因库(Genbank)入藏登记号P47893的嗅觉GPCR。画面OR2为具有基因库入藏登记号NP_036505的嗅觉GPCR。画面OR3为具有基因库入藏登记号XP_166868的嗅觉GPCR。载体为空白表达载体阴性对照。由基于CMV启动子的表达载体将嗅觉GPCR表达为包含视紫质信号肽和血球凝集素(HA)附加表位的N末端融合蛋白。

具体实施方式

本发明提供一种在细胞中产生嗅觉GPCR的方法。总的来说，所述方法包括将表达盒引入例如许旺氏或寡突细胞的大胶质细胞中，所述表达盒含有可经由操作连接到编码嗅觉GPCR的核酸的启动子，并在适于产生所述嗅觉GPCR的条件下维持所述细胞。本发明也提供一种含有编码嗅觉GPCR的重组核酸的大胶质细胞、筛选嗅觉GPCR活性的调节剂的方法和用于在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR的试剂盒。本发明主要用于例如分析及辨别调味剂和芳香剂，且因此具有多种研究及工业应用。

在比发明内容中所提供者更详细地且如同上文所提供的背景技术和定义中所告知一样进行进一步描述时，首先描述产生嗅觉GPCR的方法，随后为对用于执行本方法的组合物和试剂盒的描述。最后，讨论筛选嗅觉GPCR活性的调节剂的方法和筛选气味剂模拟物的方法。

产生嗅觉GPCR的方法

一方面，本发明提供在细胞中产生嗅觉GPCR的方法。在描述所述方法时，将首先描述在所述方法中使用的组合物。

嗅觉G蛋白偶合受体

术语“嗅觉G蛋白偶合受体”(或其缩写词，例如“嗅觉GPCR”)是指在化学感应中涉及的GPCR总科的种系发生上不同、技术认可的亚家族的任何成员。嗅觉GPCR一般及特定地揭示于多个公开案和公用数据库中，其包括Zozulya等人，(Genome Biol.2：0018，2001)；Glusman等人，(Genome Res.11：685-702，2001)和Crasto等人，(NucleicAcids Res.30：354-60，2002)，其特定地以全文引用的方式并入本文中。详言之，在国际互联网站Senselab.med.yale.edu中所发现的嗅觉GPCR序列数据库中所述的嗅觉GPCR受到关注。适用于本方法的例示性嗅觉GPCR的非限制性列表提供于在权利要求书之前插入的表1中。表1为来自Swiss-Prot数据库的蛋白序列记录的入藏登记号列表，所述数据库是发现于欧洲生物信息协会(European Bioinformatics Institute)的国际互联网站上。表1中所列的这些数据库记录、详言之为这些记录中所述的氨基酸序列都特定地以全文引用的方式并入本文中。

特别预期嗅觉GPCR可为人类来源或非人类动物来源。在某些实施例中，非人类动物可为具有敏锐及有辨别力的嗅觉的小鼠、大鼠、狗或任何其他非人类动物。在某些实施例中，嗅觉GPCR可为昆虫来源(例如，蚊子、蚂蚁、蚜虫、甲虫、苍蝇、黄蜂、蜜蜂、蜘蛛或将疾病传播给人类或非人类动物或对农作物或观赏植物造成损害的任何昆虫)。在特定实施例中，嗅觉GPCR为人类的。

公认原生嗅觉GPCR和经改变的原生嗅觉GPCR都可用于本方法中。因此，术语“嗅觉G蛋白偶合受体”也意欲涵盖经改变的原生嗅觉GPCR(例如通过诸如报导子、取代、缺失和插入等的加入的加入所改变的原生嗅觉GPCR)从而使得其结合与对应的原生GPCR相同的配位体。

术语“嗅觉G蛋白偶合受体”因此包括表1中所述的GPCR多肽的变异体。换言之，任何嗅觉GPCR的变异体都可用于本方法中。因此，在某些实施例中，嗅觉GPCR可具有与原生序列相比经改变的序列(例如存放于NCBI’s Genbank数据库等等中的序列)。例如，嗅觉GPCR可为在多肽的任何位置处(例如C或N末端，或内部位置)具有任何数目的氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸加入的原生多肽。

在特定实施例中，嗅觉GPCR为融合蛋白，且其可含有例如亲和标记结构域或报导子结构域。合适的亲和标记包括可特定结合到另一部分(通常为另一多肽、最通常为抗体)的任何氨基酸序列。合适的亲和标记包括如此项技术中已知的附加表位，例如V5标记、FLAG标记、HA标记(来自血球凝集素流感病毒)、myc标记等等。合适的亲和标记也包括如此项技术中已知的其结合基质为已知(例如HIS、GST和MBP标记)的结构域，和来自可获得其特异性结合搭配物(例如抗体，尤其是单克隆抗体)的其他蛋白的结构域。合适的亲和标记也包括任何蛋白-蛋白相互作用结构域，诸如IgG Fc区，其可特异地结合并使用合适的结合搭配物(例如IgG Fc受体)检测。特别预期所述融合蛋白可含有与其N末端甲硫氨酸残基缺失或经替代氨基酸取代的GPCR在框内融合的异源N末端结构域(例如附加表位)。在某些实施例中，嗅觉GPCR融合蛋白可在其N末端处仅包含视紫质信号肽或包含视紫质信号肽与血球凝集素附加表位的组合。在特定实施例中，嗅觉GPCR融合蛋白可包含具有氨基酸序列MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVYPYDVPDYAKL的N末端，其中MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV为视紫质信号肽且YPYDVPDYAKL为血球凝集素附加表位。所属领域技术人员应了解构筑允许表达作为融合蛋白的嗅觉GPCR的表达盒(例如参看Krautwurst等人，Cell 95：917-926，1998)。应了解所关注多肽可首先由原生多肽产生并随后可经由操作连接到如上所述的合适报导子/标记。在其他实施例中，嗅觉GPCR可为GPCR片段，其中所述GPCR片段具有生物活性。

合适的报导子结构域包括可报导多肽存在的任何结构域。尽管公认亲和标记可使用例如特异地结合到标记的经标记抗体来报导多肽的存在，但是更通常使用发光的报导子结构域。合适的发光报导子结构域包括荧光素酶(例如来自萤火虫、Vargula、海肾(Renillareniformis)或穆拉雷海肾(Renilla muelleri)及其发光变异体。其他合适的报导子结构域包括荧光蛋白(例如来自水母、珊瑚虫和诸如来自水母(Aequoria)、海肾(Renilla)、ptilosarcus、Stylatula种的其他腔肠动物)，或其发光变异体。所述报导蛋白的发光变异体为此项技术中所熟知，且其与原生报导蛋白相比可较亮、较暗或具有不同的激发和/或发射光谱。例如，如此项技术中已知，某些变异体经改变从而使得其不再呈现绿色，且其可呈现蓝色、青色、黄色、增强的黄红色(分别称为BFP、CFP、YFP e YFP和RFP)或具有其他的发射光谱。其他合适的报导子结构域包括可通过生化或颜色改变来报导多肽存在的结构域，诸如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、氯霉素(chloramphenicol)乙酰转移酶和所分泌的胚胎碱性磷酸酶。在某些优选实施例中，报导子结构域为海肾(Renilla)荧光素酶(例如pRLCMV；Promega，目录号E2661)。

如此项技术中已知，亲和标记或报导子结构域也可存在于嗅觉GPCR中的任何位置。然而，在大多数实施例中，其存在于嗅觉GPCR的C或N末端处。

在许多实施例中，嗅觉GPCR为嗅觉GPCR库的成员。库通常含有多个成员，其中多个可为2个或2个以上、5个或5个以上、约10个或10个以上、约20个或20个以上、约50个或50个以上、约100个或100个以上、约200个或200个以上、约300个或300个以上、约500个或500个以上、约1000个或1000个以上或甚至多达约10,000个或10,000个以上。所述库因此可含有约5个、约10个、约20个、约30个或30个以上、约50个或50个以上、约100个或100个以上、约200个或200个以上、通常多达500个或500个以上、通常多达约1000个或1000个以上嗅觉GPCR多肽。所述库的成员可具有已知特性或未知特性或其混合。所述库的成员可完全来源于一个物种或可来源于多个物种。

编码嗅觉G蛋白偶合受体的核酸

由于已知用于操纵核酸的遗传密码和重组技术，且上文已描述嗅觉GPCR多肽的氨基酸序列，所以编码嗅觉GPCR多肽的核酸的设计和产生完全处于所属领域技术人员的能力范围内。在某些实施例中，使用标准重组DNA技术(Ausubel，等人，Short Protocolsin Molecular Biology，第三版，Wiley & Sons，1995；Sambrook，等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)方法。例如，嗅觉GPCR编码序列可使用无需在本文中进行任何详细描述的多种重组方法的任一或其组合自嗅觉GPCR编码序列库中分离。随后的编码蛋白的核酸序列中的核苷酸取代、缺失和/或加入也可使用标准重组DNA技术进行。

举例而言，定点突变诱发和亚克隆可用以引入/缺失/取代编码所关注多肽的聚核苷酸中的核酸残基。在其他实施例中，可使用PCR。编码所关注多肽的核酸也可通过化学合成而完全自寡核苷酸产生(例如Cello等人，Science(2002)297：1016-8)。

在某些实施例中，对于特定物种、尤其是哺乳动物(例如人类或小鼠种)细胞中的表达而言，优化编码所关注多肽的核酸的密码子。

本发明进一步提供包含本发明核酸的载体(也称为“构筑体”)。在本发明的许多实施例中，本发明核酸序列将于所述序列已可经由操作连接到包括例如启动子的表达控制序列之后在宿主中表达以形成表达盒。本发明表达盒通常放置于可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分而在宿主细胞中复制的表达载体中。表达载体通常将含有例如四环素或新霉素的选择标记物以允许检测经所需DNA序列转化的那些细胞(例如参看美国专利第4,704,362号，其以引用的方式并入本文)。包括单和双表达盒载体的载体已为此项技术中所熟知(Ausubel，等人，Short Protocols in Molecular Biology，第三版，Wiley & Sons，1995；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。合适的载体包括病毒载体、质粒、粘质粒、人工染色体(人类人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等)、微型染色体等等。也可使用逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。

多种表达载体可用于此项技术中那些为了在细胞中产生所关注多肽的技术中。一种合适的载体为某些实施例中所使用的pCMV。出于专利程序的目的，此载体依据微生物存放的国际公认的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定于1998年10月13日存放于美国典型菌种保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209USA)。DNA是由ATCC测试且经确定为可行的。ATCC已将下列存放号指派给pCMV：ATCC#203351。

本发明表达盒通常包含编码嗅觉GPCR的单一开放式阅读框，然而，在某些实施例中，由于用于表达嗅觉GPCR的宿主细胞可为真核细胞(例如哺乳动物细胞，诸如人类细胞)，所以开放式阅读框可由内含子中断。本发明表达盒通常为除含有可引导RNA稳定性、转译效率等的本发明核酸3’和5’未转译区(UTR)之外还可含有其他部分的转录单元的一部分。表达盒也可为除本发明核酸外还含有转录终止子的核酸的一部分。

本发明表达盒可包含允许表达作为融合蛋白的嗅觉GPCR的核酸序列。在某些实施例中，嗅觉GPCR融合蛋白可在其N末端包含视紫质信号肽和/或血球凝集素附加表位。在特定实施例中，嗅觉GPCR融合蛋白可包含具有氨基酸序列MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVYPYDVPDYAKL的N末端，其中MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV为视紫质信号肽且YPYDVPDYAKL为血球凝集素附加表位。构筑允许表达作为融合蛋白的嗅觉GPCR的表达盒完全处于所属领域技术人员的能力范围内(例如参看Krautwurst等人，Cell 95：917-926，1998)。

真核启动子(意即在真核细胞中起作用的启动子)可为在大胶质细胞中起作用的任何启动子，包括病毒启动子和来源于真核基因的启动子。例示性真核启动子包括(但不限于)下列各物：小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288，1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355-365，1982)；SV40早期启动子(Benoist等人，Nature(London)290：304-310，1981)；酵母gall基因序列启动子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971-6975，1982；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951-59SS，1984)；CMV启动子；EF-1启动子；蜕皮激素反应性启动子(Ecdysone-responsive promoter)；四环素反应性启动子等等。由于病毒启动子一般为特别强的启动子，所以其可尤其受到关注。在某些实施例中，使用为病毒启动子的启动子。选择用于本发明中的启动子从而使得其在其引入其中的大胶质细胞(和/或动物)中起作用。在某些实施例中，启动子为CMV启动子。

在某些实施例中，本发明载体也可提供可选择标记物的表达。合适的载体和可选择标记物已为此项技术中所熟知，且讨论于Ausubel等人(Short Protocols in MolecularBiology，第三版，Wiley & Sons，1995)和Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratoryManual，第三版，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.)中。已将多种不同的基因用作可选择标记物，且主要为方便起见，选择在本发明载体中用作可选择标记物的特定基因。已知的可选择标记物基因包括：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因、CAD、腺苷脱氨酶基因、天冬酰胺合成酶基因、抗生素抗性基因(例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷磷酸转移酶基因))、潮霉素B磷酸转移酶基因等等。

如上文所述，嗅觉GPCR可为含有亲和结构域和/或报导子结构域的融合蛋白。使得在报导子或标记与GPCR之间、例如在GPCR的C或N末端处融合的方法完全处于所属领域技术人员的能力范围内(例如McLean等人，Mol.Pharma.Mol Pharmacol.199956：1182-91；Ramsay等人，Br.J.Pharmacology，2001，315-323)，并且将不再作任何进一步的描述。特别预期所述融合蛋白可含有与其N末端甲硫氨酸残基缺失或经替代氨基酸取代的GPCR在框内融合的异源N末端结构域(例如附加表位)。应了解所关注多肽首先可由原生多肽产生，且随后可经由操作连接到如上所述的合适报导子/标记。

本发明核酸也可含有限制性位点、多克隆位点、引物结合位点、可接合端、重组位点等，通常用以有利于构筑编码嗅觉GPCR的核酸。

由于嗅觉GPCR可为所关注多肽库的成员，所以编码所述所关注多肽的核酸也可为类似大小的编码嗅觉GPCR的核酸库。

宿主细胞

本文所述的方法一般包括在经培养的大胶质细胞(意即体外培养的原代或永生大胶质细胞)中产生嗅觉GPCR。“大胶质细胞”意谓多个神经元相关细胞类型的任何细胞，其包括：许旺氏细胞、寡突细胞和星形细胞及其衍生物。在许多实施例中，合适的宿主细胞可为产生髓磷脂(形成神经轴突鞘的材料)的“髓磷脂产生”细胞。产生髓磷脂的大胶质细胞包括许旺氏细胞、寡突细胞以及产生髓磷脂的某些类型的星形细胞(例如嗅鞘细胞)。髓磷脂产生细胞通常可通过为髓磷脂组份的半乳糖脑苷脂gal C的合成来识别。

术语“大胶质细胞”也涵盖大胶质细胞的经修饰型式，包括癌性大胶质细胞，例如许旺氏瘤(Schwanoma)、纤维神经瘤、星形细胞瘤细胞和寡突细胞瘤细胞；永生大胶质细胞，例如经由引入例如HPV E6-E7、T抗原等等的合适致癌基因而永生化的细胞；由细胞融合所产生的杂交细胞，其中大胶质细胞与不同(非大胶质)或类似(大胶质)类型的细胞融合；和重组大胶质细胞，例如含有外源核酸或在内源基因(例如髓磷脂合成所需的或抑制髓磷脂合成的基因)中含有“基因剔除”的细胞。大胶质细胞通常是来自哺乳动物物种，诸如啮齿动物(例如小鼠)或人类。例示性且非限制性细胞系包括RN2和EJ(Coulter-Mackie，Virus Research 1：477-487，1984)、RN22(Kreider，Brain Research397：238-244，1986)和HOG与MO3.13(Buntinx，Journal of Neurocytology 32：25-38，2003)。特别预期嗅觉GPCR的大胶质细胞重组体涵盖于术语“大胶质细胞”中。

因此，由于培养大胶质细胞的方法已为此项技术中所熟知(例如参看Mosahebi Glia，34：8-17，2001；Shen，Microsurgeryl9：356-63，1999；Acta Neuropathol(Berl)，78：317-24，1989；Barnett，Developmental Biology，155：337-350，1993；和Hung等人，International Journal ofOncology 20：475-482，2002)，所以多种合适的宿主细胞可用于产生嗅觉GPCR，包括永生化HEIl93细胞等等。

详言之，许旺氏细胞可使用下述方法培养：Hung(Int J.Oncol.20：475-82，2002)；Hung(Int.J.Oncol.199914：409-15)；Wood(Brain Res.115：361-75，1976)；Wood(Ann.N.Y.Acad.Sci.605：1-14，1990)；和Brockes(J.Exp.Biol.Dec；95：215-30，1981)。

额外的细胞系对于所属领域技术人员将变得显而易见，且可自美国典型菌种保藏中心(american type culture collection)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209获得。

方法

总的来说，根据本方法在体外将嗅觉GPCR表达盒引入大胶质细胞中，细胞经受适于表达嗅觉GPCR的条件，在细胞中表达GPCR并将其输出到细胞表面。

因此，在大多数实施例中，可使用多种方法将表达盒引入宿主细胞中，包括病毒感染法、转染法、接合法(conjugation)、原生质体融合法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法、直接显微注射法等等。方法的选择一般视待转化的细胞类型和转化发生的环境(例如体外等)而定。对于这些方法的一般讨论可发现于Ausubel，等人，Short Protocols in MolecularBiology，第三版，Wiley & Sons，1995中。

将嗅觉GPCR的表达盒引入细胞中之后，细胞通常经培养以提供多肽表达。为实现此目的，可将细胞于合适培养基中培养12-24小时、24-48小时或48-96小时或更长时间。多肽的短暂表达可以此方式进行。然而，特别预期多肽的表达可另外稳定。在稳定转染中，表达盒含有可选择的标记基因，且表达多肽的稳定细胞系的建立包括对可选择的标记基因的选择。如果将两个表达盒引入细胞中，那么所述两个表达盒通常含有两个不同的可选择的标记基因(例如新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因)。短暂转染和稳定转染的方法已为所属领域技术人员所熟知。

在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR且通常将其输出到细胞表面从而使得GPCR存在于原生质膜中。

组合物

另一方面，本发明提供一种产生生物活性的嗅觉GPCR的大胶质细胞。所述细胞通常含有编码嗅觉GPCR的重组核酸，且其可产生通常不在那种细胞中(意即无重组核酸存在的大胶质细胞)产生的嗅觉GPCR。

如上所述，本发明提供一种含有嗅觉GPCR的大胶质细胞，所述嗅觉GPCR存在(意即可检测地存在)于大胶质细胞的表面，通常以GPCR特有的方式跨越细胞的原生质膜。因此，本发明细胞含有“活性”嗅觉GPCR，因为“活性”嗅觉GPCR能够结合配位体并经由合适的G蛋白(如果存在)传输信号。本发明细胞因此用于例如筛选分析的活性分析中，所述筛选分析将在下文中详细描述。

本发明细胞通常以显著高于其中已产生相同表达盒的诸如非大胶质细胞(例如NIH-3T3细胞、COS细胞或类似细胞)的控制细胞的水平产生嗅觉GPCR。在大多数实施例中，本发明细胞以摩尔计产生高于控制细胞至少5×(“5倍”)、至少10×、至少50×、至少100×、通常高达至少1000×的嗅觉GPCR。在特定实施例中，本发明细胞以摩尔计在细胞表面产生高于控制细胞至少5×(“5倍”)、至少10×、至少50×、至少100×、通常高达至少1000×的嗅觉GPCR(例如，如通过免疫细胞化学或流式细胞测量术测定)。当使本发明细胞在液体培养物中生长时，其通常产生显著量的嗅觉GPCR，例如高于10μg/l、高于100μg/l、高于1mg/l、高于10mg/l或高于约50mg/l或更高。详言之，当使本发明细胞在液体培养物中生长时，其通常产生显著量的细胞表面嗅觉GPCR，例如高于10μg/l、高于100μg/l、高于1mg/l、高于10mg/l或高于约50mg/l或更高。

由于存在大量不同的嗅觉GPCR，所以本发明也提供含有相应多种编码不同嗅觉GPCR的重组核酸的多种大胶质细胞(意即大胶质细胞库)。在这些实施例中，所述多种中的每一大胶质细胞通常都含有用于单一嗅觉GPCR的重组核酸，且每一细胞都含有不同的核酸。因此，本发明提供大胶质细胞库，所述细胞含有编码2个或2个以上、5个或5个以上、约10个或10个以上、约20个或20个以上、约50个或50个以上、约100个或100个以上、约200个或200个以上、约300个或300个以上、约500个或500个以上、约1000个或1000个以上不同嗅觉GPCR的重组核酸。嗅觉GPCR可具有已知的特性或未知的特性或其混合。嗅觉GPCR可来源于单一物种或者来源于2种、高达约5种、高达约10种、高达约50种、高达约100种或高达约1000种动物。在某些实施例中，嗅觉GPCR为人类的。

试剂盒

本发明也提供用于实施如上所述的本发明方法的试剂盒。本发明试剂盒至少包括以下物质中的一种或一种以上：大胶质细胞、编码嗅觉GPCR的核酸和含有嗅觉GPCR的大胶质细胞。试剂盒的核酸也可具有限制性位点、多克隆位点、引物位点等以有利于其接合到其他质粒中。试剂盒的其他可选组份包括：培养基、用于测试GPCR活性的组份和编码G蛋白的核酸等以执行本发明分析。试剂盒的多种组份可存在于独立容器中，或某些可相容的组份可视需要预组合于单一的容器中。

除上述的组份之外，本发明试剂盒通常进一步包括使用试剂盒的组份以实施本发明方法(例如产生嗅觉GPCR的方法等)的说明。实施本发明方法的说明一般记录于合适的记录媒体上。例如，说明可印刷于诸如纸张或塑料等的基质上。同样，说明可作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组份的容器的标签(意即与包装或分装关联)等中。在其他实施例中，说明是作为存在于合适的计算机可读储存媒体(例如CD-ROM、磁盘等)上的电子储存数据文档存在。在其他实施例中，实际的说明并非存在于试剂盒中，而是提供例如经由互联网自远程来源获得说明的方式。此实施例的实例为包括其中可观看说明和/或可自其下载说明的网址的试剂盒。如同说明的情况一样，将此获得说明的方式记录于合适基质上。

识别嗅觉GPCR活性的调节剂的方法

本发明提供筛选嗅觉GPCR调节剂(意即增加或降低所关注嗅觉GPCR的活性的化合物)的方法。在某些实施例中，嗅觉GPCR调节剂是选自由促效剂、部分促效剂、反向促效剂和拮抗剂组成的群组。总的来说，所述方法包括根据上文所述的方法在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR以提供产生生物活性嗅觉GPCR的大胶质细胞(本文中称为“本发明大胶质细胞”)，使所述细胞与候选药剂相接触，并评定所述候选药剂对嗅觉GPCR活性的作用。

在其他实施例中，可使嗅觉GPCR的调节剂(例如所述GPCR的天然或合成的配位体)与产生所述GPCR的大胶质细胞接触，并可评定所述调节剂对嗅觉GPCR活性的作用。也预期使用两种嗅觉GPCR调节剂(例如嗅觉GPCR的活化剂(例如所述GPCR的配位体)和阻断所述活化剂的调节活性的药剂)进行分析。

如此项技术中已知，可使用多种方法执行本发明分析，诸如使用³⁵S GTPγS的膜结合分析、腺苷酰环化酶分析(例如使用来自New England Nuclear的FLASH PLATE^TM腺苷酰环化酶试剂盒；目录号SMP004A)、基于细胞的cAMP分析、基于报导子的分析、AP1报导子分析、SRF-LUC报导子分析、胞内IP3积累分析、用于测量胞内钙浓度的荧光成像平板读取器(FLIPR)分析等等。

在调节剂增加嗅觉GPCR活性的实施例中，在所述调节剂的存在下，嗅觉GPCR的活性与无所述药剂存在的合适对照物相比增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约80％、至少约100％、至少约500％或至少约10倍或10倍以上。合适的对照物可处于存在或不存在GPCR的原生配位体的情况下。

在调节剂降低嗅觉GPCR活性的实施例中，在所述调节剂的存在下，嗅觉GPCR的活性与无所述药剂存在的合适对照物相比降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％或95％以上。合适的对照物可处于存在或不存在GPCR的原生配位体的情况下。

在某些实施例中，这些方法也包括在存在或不存在例如候选药剂的测试化合物的情况下测量GPCR活性。这些分析可包括使经分离的本发明大胶质细胞(例如经培养细胞)、自本发明大胶质细胞分离的膜、本发明大胶质细胞的提取物与可有效调节GPCR活性的一定量的GPCR调节剂接触。

因此，本发明提供用以在存在或不存在GPCR的配位体(例如天然配位体)的情况下降低嗅觉GPCR的活性的嗅觉GPCR活性抑制剂和GPCR活性诱导剂，其中所述GPCR是通过为GPCR的天然配位体或非其天然配位体的化合物诱导。

在某些实施例中，GPCR活性可通过评定报导子信号来测量。在这些实施例中，可以适于高处理量分析的格式(例如96或384孔格式)执行所述分析，且可使用合适的自动机械(例如自动移液机械)和检测仪表(用于测定报导子活性的96或384孔格式的光度计或荧光读取器)。作为说明且并非限制，可使用Wallac 1450 Microbeta计数器(Perkin-Elmer)或基于CCD照相机的照明器测定报导子活性。

在相关实施例中，所述分析可为其中评定候选药剂与嗅觉GPCR的结合的结合分析。在这些实施例中，通常将所述候选药剂首先标记，与本发明大胶质细胞接触，并评定所述药剂与大胶质细胞的结合。

候选药剂

可通过上述方法筛选多种不同的测试化合物。尽管测试化合物通常为有机分子、优选为小有机化合物(意即具有大于50且小于约2,500道尔顿(例如100-1000Da，通常小于约500Da)的分子量的化合物)，但其涵盖大量的化学物质种类。测试化合物包含与蛋白质的结构相互作用(尤其为氢键合)所必需的官能基，且通常至少包括胺基、羰基、羟基或羧基，优选为所述化学官能基中的至少两个。测试化合物通常包含经上述官能基中的一个或一个以上取代的环碳或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。例示性及非限制性测试化合物包括脂族酸、醇、酮和酯；具有芳环、脂环、多环和杂环结构的化学物质；和无数经取代的每一所述类型的化学物质；以及其组合。测试化合物也发现于包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合的生物分子中。其他测试化合物包括GCPR的原生配位体的变异体。

测试化合物可自包括合成或天然化合物库的广泛多种来源获得。例如，许多方式可用于广泛多种有机化合物和生物分子的随机和引导合成，其包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可获得或易于产生呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。库可优选地包含天然或合成产生的与嗅觉关联的化合物。此外，天然或合成产生的库和化合物易于经由常规化学、物理和生化方式修饰，且其可用于产生组合库。已知的药理学药剂可经受诸如酰化、烷基化、酯化、氨化等的引导或随机化学修饰以产生结构类似物。

所关注的测试化合物为例如蛋白质药剂的多肽药剂。特定类型的所关注的多肽测试化合物为GPCR的抗体或其GPCR结合片断。抗体可为单克隆或多克隆，且可根据此项技术中已知的方法产生。对于具有已知的原生配位体的GPCR而言，其他测试化合物包括GCPR的原生配位体的变异体，例如通过至少一个氨基酸的取代、缺失或加入而改变或经化学修饰的原生配位体。在某些实施例中，测试化合物包括未知为GPCR配位体的内源性多肽。

测试化合物的上述表征意欲为说明且并非限制。

识别作为嗅觉GPCR配位体的候选药剂的方法

嗅觉GPCR的配位体可通过使候选药剂与所述嗅觉GPCR接触并测定所述候选药剂是否与所述嗅觉GPCR结合来识别，其中所述结合表明候选药剂是嗅觉GPCR的一配位体。在某些实施例中，候选药剂可经标记。在特定实施例中，候选药剂可经放射性标记。

可并入本发明候选药剂中的合适放射性核素包括(但不限于)²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、⁸²Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。并入³H、¹⁴C、⁸²Br、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S一般可能最为有用。

将放射性同位素并入有机化合物的合成方法可应用于本发明候选药剂，且已在此项技术中众所熟知。例如将活性含量的氚并入靶分子的这些合成方法如下：

A.用氚气催化还原—此程序通常得到高比活性产物且需要卤化或不饱和的前体。

B.用硼氢化钠[³H]还原—此程序相当廉价，且需要含有诸如醛、酮、内酯、酯等可还原官能基的前体。

C.用氢化铝锂[³H]还原—此程序提供几乎具有理论比活性的产物。其也需要含有诸如醛、酮、内酯、酯等可还原官能基的前体。

D.氚气暴露标记—此程序包括在合适催化剂的存在下将含有可交换质子的前体暴露在氚气中。

E.使用碘甲烷[³H]的N-甲基化—此程序通常用以通过以高比活性的碘甲烷(³H)处理适当前体来制备O-甲基或N-甲基(³H)产物。此方法总的来说允许有较高的比活性，诸如约70-90Ci/mmol。

将活性含量的¹²⁵I并入靶分子的合成方法包括：

A.圣马亚反应(Sandmeyer)和类似反应—此程序将芳基或杂芳基胺转化为诸如四氟硼酸盐的重氮盐，且随后使用Na¹²⁵I将其转化为经¹²⁵I标记的化合物。代表性程序由Zhu，D.-G.和合作者报导于J.Org.Chem.2002，67，943-948中。

B.酚的邻¹²⁵I碘化—如Collier，T.L.和合作者在J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中所报导，此程序允许在酚的邻位处并入¹²⁵I。

C.芳基溴和杂芳基溴与¹²⁵I的交换—此方法一般为两步骤方法。第一个步骤为在三烷基锡卤化物或六烷基二锡[例如(CH₃)₃SnSn(CH₃)₃]的存在下，使用例如Pd催化型反应[意即Pd(Ph₃P)₄]或经由芳基锂或杂芳基锂，将芳基溴或杂芳基溴转换为相应的三烷基锡中间体。代表性程序由Bas，M.-D.和同伴报导于J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中。

或者，嗅觉GPCR的配位体可通过在经标记的已知嗅觉GPCR配位体的存在下，使候选药剂与嗅觉GPCR接触来识别，其中在所述候选药剂的存在下，经标记的已知配位体结合的降低为所述候选药剂是嗅觉GPCR的配位体的指示。

识别气味剂模拟物的方法

本发明也提供识别气味剂模拟物的方法，其中模拟物为合成或天然的化学化合物，其具有与特定气味剂相似、大体上相同或完全相同的功能特征，但具有与所述气味剂不同的化学结构。换言之，本发明提供识别气味剂模拟物的方法，所述模拟物“闻起来”与所关注的气味剂相同，但并不具有与所关注的气味剂相同的化学结构。总的来说，这些方法包括使用上文所述的方法产生嗅觉GPCR库，识别由所关注的气味剂所活化的嗅觉GPCR组，并使所述嗅觉GPCR库与候选药剂接触以识别活化相同的嗅觉GPCR组的药剂。在大多数实施例中，活化与所关注的气味剂相同的嗅觉GPCR组的药剂为所关注的气味剂的模拟物，意即其应具有与所关注的气味剂相似的气味。

因此，这些方法通常包括使用上文所述的方法产生(例如100个或100个以上、200个或200个以上、300个或300个以上、400个或400个以上、500个或500个以上、600个或600个以上、通常多达约1000个或1000个以上)不同嗅觉GPCR的库，并评定所述GPCR以测定其是否由所关注的气味剂(例如具有所需气味或味道的已知或未知化学结构的化合物)活化。在许多实施例中，所关注的气味剂将活化嗅觉GPCR组，其中一组通常含有2-50、2-20或3-10个成员。由单一气味剂活化的嗅觉GPCR组提供“GPCR指纹”，其中单一气味剂是由其所活化的嗅觉GPCR组界定。所关注的气味剂的模拟物可通过筛选候选药剂库以识别与所关注的气味剂具有相同或接近相同的GPCR指纹的药剂来识别。

举例而言，气味剂模拟物可经识别从而使其与所关注的气味剂具有相似的经活化GPCR的“指纹”，例如所述模拟物所活化的GPCR或GPCR活性为所述气味剂所活化者的约60％、约75％、约80％、约90％、约95％。

因此，可对所关注的气味剂的模拟物加以识别。

生物感测方法

本发明也提供一种生物传感器，其中所述生物传感器通常为产生多个不同嗅觉GPCR的多个大胶质细胞。在许多实施例中，所述细胞以可寻址的格式排列，其中每一阵列位址都含有产生单一重组嗅觉GPCR的大胶质细胞。所述多个通常可为2个或2个以上、5个或5个以上、约10个或10个以上、约20个或20个以上、约50个或50个以上、约100个或100个以上、约200个或200个以上、约300个或300个以上、约500个或500个以上、约1000个或1000个以上或甚至多达约10,000个或10,000个以上。因此，生物传感器可含有约5个、约10个、约20个、约30个或30个以上、约50个或50个以上、约100个或100个以上、约200个或200个以上、通常多达500个或500个以上、通常多达约1000个或1000个以上重组嗅觉GPCR。嗅觉GPCR可具有已知特征或未知特征或其混合。嗅觉GPCR可来源于单一物种或者来源于2种、多达约5种、多达约10种、多达约50种、多达约100种或多达约1000种动物。在某些实施例中，嗅觉GPCR为人类的。

本文所述的方法包括所述产生单一重组嗅觉GPCR的大胶质细胞与“亲和基质”结合。在某些实施例中，所述亲和基质为可寻址的。在特定实施例中，所述可寻址亲和基质为空间上可寻址的。亲和基质含有固体、半固体或不可溶支持体且其是由适于结合所述重组大胶质细胞且并不妨碍所使用的检测方法的任何材料制得。如所属领域技术人员将了解的，可能的亲和基质的数目相当大。可能的基质包括(但不限于)玻璃和经修饰或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、特氟龙(Teflon)等)、多糖类、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和经修饰的硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷和各种其他聚合物。在一优选实施例中，基质允许光学检测且其本身并不可观地发荧光或发光。此外，如此项技术中所已知，基质可涂布有任何数量的材料，包括诸如葡聚糖的聚合物、丙烯酰胺、明胶、琼脂、诸如蛋白质(包括牛及其他哺乳动物的血清白蛋白)的生物可相容物质。

“空间上可寻址”的亲和基质具有多个离散区域(例如多个所关注多肽的结合区域)以便每一区域都处于特别预定的位置(“位址”)。多孔微量滴定板为可寻址的(每一孔具有一位址)，毛细管柱的阵列为可寻址的，沉积于固体支持体(例如尼龙或硝化纤维素膜)上的样本阵列为可寻址的。用于本文所述的方法中的亲和基质通常具有至少4个或4个以上、至少约12个、至少约24个、至少约48个、至少约96个或至少约384个可寻址区域。在特定实施例中，亲和基质是呈适于高处理量阵列的可寻址格式，例如24、48、96或384孔格式。

所述多孔格式适于由自动机械(例如自动移液机械)及其他检测仪表(用于测定报导子活性的96或384孔格式的光度计或荧光读取器)使用。作为说明且并非限制，可使用基于CCD照相机的照明器测量报导子活性。

在使用中，所述生物传感器通常与样本接触，并评定每一重组嗅觉GPCR的活化作用。所关注的气味剂的存在是通过预定嗅觉GPCR亚组的活化作用来检测，其中所述的预定嗅觉GPCR亚组与所述气味剂的先前经测定的“GPCR指纹”相对应。因此，如果所关注的气味剂的预定GPCR亚组由样本活化，那么所关注的气味剂存在于所述样本中。

在替代使用中，所述生物传感器通常与气味剂接触，并评定每一重组GPCR的活化作用。所述气味剂的“指纹”的识别是基于经活化的嗅觉GPCR亚组来指派。在所述替代使用的变体中，所述接触可在生物传感器的嗅觉GPCR的一种或一种以上促效剂的存在下进行，其中在所述一种或一种以上促效剂的存在下由气味剂活化的GPCR亚组代表将“指纹”指派给气味剂的另一方式。预期在促效剂、反向促效剂或拮抗剂的存在下，一种或一种以上嗅觉GPCR的活性可并入气味剂的“指纹”中。

在某些实施例中，GPCR活化作用可使用GPCR活化作用的发光报导子检测。例如，可使用任何发光报导子(例如荧光报导子等)分析，诸如下文所述的基于荧光素酶/GFP的分析或其变体可用于这些分析。

在某些实施例中，将所述嗅觉GPCR中的一种或一种以上活化为气味剂可记为特定水平，诸如例示性及非限制性地为预定最大反应的0-10％、11-25％、26-50％、51-75％或76-100％。预期气味剂的“指纹”可至少部分地通过所述嗅觉GPCR中的一种或一种以上的活化水平来测定。

因此，本发明提供一种发光生物传感器，其含有含嗅觉GPCR的可寻址大胶质细胞阵列，其中所关注的气味剂可通过来自所述生物传感器的光线的特定发射图案来检测。

在某些实施例中，待测试的样本为环境测试样本，例如气体(诸如可呼吸的大气或未知来源或组成的气体的样本)、液体(诸如水或未知来源或组成的液体的样本)或任何固体的样本。

上文所述的生物传感器方法特定用于例如：犯罪现场，其中例如对气味的认识可导致捕获犯罪嫌疑人；战区(例如战场)，其中可检测某些化学物质，例如生物/化学战剂；食物，其中可检测例如某些污染物或合乎需要或不合需要的气味；和将特定的嗅觉GPCR或特定的嗅觉GPCR亚组合理地指派给合乎需要或不合需要的嗅觉感觉；和需要监测有毒化学物质的实验室中；和总的来说，需要监测或检测所关注的气味剂的任何情形中。

所关注的气味剂一般包括可由人类嗅觉系统的嗅觉GPCR所检测的任何化合物，例如可通过闻来检测的任何化合物。气味剂可为经纯化的化合物或可未经纯化(例如复杂组合物)。所述气味剂包括(但不限于)脂族酸、醇、酮和酯；具有芳族、脂环、多环和杂环结构的化学物质；和无数经取代的每一所述类型的化学物质；以及其组合。

效用

产生嗅觉GPCR的本发明方法用于多种研究及商业应用、尤其是那些与食品和芳香剂相关的应用中。

在许多应用中，例如食品或芳香剂的物品可通过加入使用上文所述的方法所识别的嗅觉GPCR调节剂加以改良，意即视需要而使其或多或少地合乎需要。总的来说，通常将所述调节剂与物品(例如食品或诸如香水的芳香剂)混合以改良物品的味道或气味。在许多实施例中，调节剂可为嗅觉GPCR活性的抑制剂，且因此“掩蔽”令人不悦的味道或气味。在其他实施例中，调节剂可为某些嗅觉GPCR的活化剂，且可用以改良其加入其中的物质或向所述物质中加入新的风味或香味。在其他实施例中，调节剂可为某些嗅觉GPCR的活化剂，且可用以改良杀虫剂的功效。在某些实施例中，其有益之处在于使诸如毒药和药品的某些物品的气味较不合乎需要，从而使得其不会被误食。在此情况下，提供令人不悦气味的药剂可通过上文所述的方法发现并加入那些物品中。

在其他应用中，提供合乎需要的气味剂(例如获自某些稀有花朵并用作现在的许多香水的起始材料的气味剂)的花费可通过使用上文所述的方法识别所述气味剂的模拟物而得以降低。在所述实施例中，这些模拟物可以比合乎需要的气味剂的价格大体上更低的价格制造，且其可用以补充或替代物品(例如香水等)中合乎需要的气味剂。

在其他应用中，对由个体产生的特定气味剂的检测可具有与疾病或病症相关的诊断或预测价值，其中所述特定气味剂的上升或下降已与所述疾病或病症关联。

当然，可向多个个体投与使用上文所述的方法获得的嗅觉GPCR调节剂。所述个体一般为哺乳动物，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物纲内的生物体，包括肉食动物目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)以及商业上所关注的哺乳动物，诸如奶牛、绵羊、猪和马。预期也可向非哺乳类动物投与使用上文所述的方法获得的嗅觉GPCR调节剂。例示性及非限制性的非哺乳类动物包括鸟类(例如鸡)、爬行动物类、鱼类、节肢动物类和昆虫类(例如，蚊子、蚂蚁、蚜虫、甲虫、苍蝇、黄蜂、蜜蜂、蜘蛛或将疾病传播给人类或非人类动物或对农作物或观赏植物造成损害的任何昆虫)。在许多实施例中，所述个体将为人类。

实例

提出下列实例以向所属领域技术人员提供对如何产生和使用本发明的完整揭示和描述，且所述实例不意欲限制发明者视作其发明的范畴也不意欲表示下文的实验为所执行的全部或唯一的实验。

尽管已参考本发明的特定实施例来描述本发明，但所属领域的技术人员应了解，在不偏离本发明的真实精神和范畴的情况下，可进行多种改变并可替代等效物。此外，可进行许多修改以使特定的情形、材料、物质的组成、方法、方法步骤适应于本发明的目的、精神和范畴。预期所有这些修改处于本发明的范畴内。

实例1

在许旺氏细胞中的表达嗅觉GPCR

原代大鼠许旺氏细胞的分离：

许旺氏细胞的制备是根据先前所述完成的(例如Hung，Int.J.Oncol.20：475-82，2002；Hung，Int.J.Oncol.199914：409-15；Wood，Brain Res.115：361-75，1976；Wood，Ann.N.Y.Acad.Sci.605：1-14，1990；和Brockes，J.Exp.Biol.Dec；95：215-30，1981等)。简言之，收集来自P1新生大鼠的坐骨神经，并将细胞维持于补充有10％热灭活胎牛血清的杜贝卡氏经修饰依格培养基(Dulbecco’s modified Eagle media)中。用2μM毛喉素(forskolin)和牛垂体提取物(Sigma)使许旺氏细胞繁殖。使所述细胞生长三代，并将其冷冻储存。

短暂转染嗅觉GPCR：

将第5代许旺氏细胞以每孔8×10⁴个细胞涂板于经聚D-赖氨酸涂布的8孔小室载玻片(Falcon)上。用0.5μg嗅觉GPCR表达质粒与Fugene6试剂(Roche)和Optimem无血清培养基(Invitrogen)转染许旺氏细胞。在37℃下将经转染的细胞保持在经5％CO₂湿润的培养器中达4小时。用PBS洗涤细胞并更换新鲜的生长培养基。24小时后，分析所述细胞的表达。

对由HA染色测定的嗅觉GPCR的表达分析：

用PBSCM(PBS+0.5mM Ca²⁺+1mM MgCl₂)洗涤经转染的细胞，并用4％的福尔马林(Formalin)将其固定。用50mM NH₄Cl/PBSCM淬灭细胞，并洗涤两次。在阻断缓冲液(溶于无曲通(triton)的PBSCM中的2％BSA)中按1∶1000稀释原代抗体抗小鼠HA(Roche)，并留在细胞上历时1小时。用PBSCM洗涤三次后，使次级抗体(与Alex 488接合的驴抗小鼠IgG)1∶2000和DAPI 1∶2000在黑暗中留在细胞上历时三十分钟。用PBSCM洗涤细胞3次，并用由适当的紫外滤光片分析的荧光保存(Calbiochem)细胞盖片。

观察在细胞表面上产生嗅觉GPCR的细胞(参看图1)。

实例2

GPCR活化作用的分析

报导子表达：可如原代大鼠许旺氏细胞的实例1中所述进行大胶质细胞的短暂转染。大胶质细胞系的合适转染可如此处所述进行。

将大约12×10⁶个大胶质细胞涂板于15cm组织培养板上，并使其在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培养基中生长。涂板大胶质细胞后经24小时(或直到约80％融合)，使用12μg DNA转染所述细胞。所述12μg DNA与60μl脂质体转染剂(lipofectamine)和2mL DME高葡萄糖无血清培养基组合。将培养基自板中吸出，并用无血清培养基洗涤细胞1次。将DNA、脂质体转染剂和培养基的混合物连同10ml无血清培养基加入板中。在37摄氏度下培养四到五小时之后，吸出培养基，并加入25ml含有血清的培养基。转染后经24小时，再次吸出培养基，并加入新鲜的含血清培养基。转染后经48小时，吸出培养基，并加入含有遗传霉素(geneticin)(G418药物)的含血清培养基直到500μg/ml的最终浓度。经转染细胞此刻经受对含有G418抗性基因的经阳性转染细胞的选择。当选择进行时，每四到五天更换培养基。选择期间，使细胞生长以建立合适的库，或分裂以用于稳定克隆选择。

膜结合分析：[³⁵S]GTPγS分析：当G蛋白偶合受体处于其活性状态时，由于配位体的结合或组成型活化，受体偶合到G蛋白并刺激GDP的释放，且随后使GTP与G蛋白结合。G蛋白受体复合物的α亚单位充当GTP酶，并使GTP缓慢水解成GDP，此时受体通常已失活。经活化的受体继续将GDP换成GTP。不可水解的GTP类似物[³⁵S]GTPγS可用于表明[³⁵S]GTPγS与表达经活化受体的膜的结合增强。使用[³⁵S]GTPγS结合测量活化的优势在于：(a)其一般可应用于所有的G蛋白偶合受体；(b)其最接近膜表面使得其不太可能获得影响胞内级联的分子。

所述分析利用G蛋白偶合受体刺激[³⁵S]GTPγS与表达相关受体的膜的结合的能力。因此，所述分析可用于筛选内源GPCR和非内源、组成型活化的GPCR的候选化合物的直接识别方法中。所述分析是一般性的并应用于所有G蛋白偶合受体的药物发现中。

[³⁵S]GTPγS分析是于20mM HEPES和介于1与约20mM之间的MgCl₂(尽管20mM是优选的，但此剂量可经调节以使结果优化)pH7.4、具有介于约0.3与约1.2nM之间的[³⁵S]GTPγS(尽管是1.2优选的，但此剂量可经调节以使结果优化)的结合缓冲液和12.5到75μg的膜蛋白(此剂量可经调节以优化)和10μM GDP(此剂量可经改变以优化)中培养1小时。随后加入麦芽凝集素珠粒(25μl；Amersham)并在室温下培养混合物另外30分钟。接着在室温下以1500×g使管离心，且随后在闪烁计数器中对其计数。

腺苷酰环化酶：可对经设计以用于基于细胞的分析的Flash Plate^TM腺苷酰环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)进行改进以用于粗原生质膜。Flash Plate孔可含有闪烁涂料，所述涂料也含有辨别cAMP的特异性抗体。可通过直接竞争放射活性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合来对孔中所产生的cAMP进行定量。下文作为测量表达受体的全部细胞中cAMP含量改变的简要方案。

短暂转染后大约24小时收集经转染的细胞。小心地吸出培养基并将其丢弃。将10mlPBS缓慢地加入每一个细胞盘中，随后小心地吸出。将1ml Sigma细胞解离液和3ml PBS加入每一板中。将细胞自所述板中移出并将细胞悬浮液收集到50ml圆锥形离心管中。随后在室温下以1,100rpm使细胞离心5分钟。小心地使细胞小球再悬浮于适当体积的PBS(约3毫升/板)中。接着，使用血球计计数细胞，并加入额外的PBS以得到适当数量的细胞(具有约50微升/孔的最终体积)。

制备cAMP标准和检测缓冲液(包含1μCi的示踪剂[¹²⁵I cAMP(50μl)]与11ml检测缓冲液)并根据制造商的说明加以维持。新鲜制备用于筛选的分析缓冲液，且其含有50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM的最终分析浓度)和50μl细胞。将分析缓冲液储存于冰上直到利用时为止。通过将50μl cAMP标准加入适当的孔中，随后将50μl PBSA加入孔H11和H12中来开始分析。将50μl刺激缓冲液加入所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针点工具将DMSO(或所选候选化合物)加入适当的孔中，使其具有12μM测试化合物的最终分析浓度和100μl的总分析体积。随后将细胞加入孔中，并在室温下培养60分钟。接着将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合液加入孔中。随后将板额外培养2小时，接着在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。接着由标准cAMP曲线推断每一分析板内所含的每孔的cAMP的值。

用于Gi偶合靶GPCR的基于细胞的cAMP：TSHR为活化后引起cAMP积累的Gs偶合GPCR。TSHR将通过使氨基酸残基623突变(意即，丙氨酸残基变为异亮氨酸残基)而组成型活化。预期Gi偶合受体抑制腺苷酰环化酶，且因此降低可对cAMP激发水平进行评定的cAMP的产生水平。作为对Gi偶合受体组成型活化的指示，用于测量cAMP产生降低的有效技术可通过共转染、最优选为作为“信号增强子”的非内源性、组成型活化的TSHR(TSHR-A623I)(或内源性、组成型活性Gs偶合受体)与连接Gi的靶GPCR共转染以建立基线含量的cAMP来实现。建立非内源型式的Gi偶合受体之后，接着使此非内源型式的靶GPCR与信号增强子共转染，且此即为可用于筛选的材料。我们将利用这一方法在使用cAMP分析时有效地产生信号，此方法优选用于直接识别对抗Gi偶合受体的候选化合物。应注意对于Gi偶合GPCR而言，当使用此方法时，靶GPCR的反向促效剂将增加cAMP信号且促效剂将降低cAMP信号。

第一天时，每孔将析出2×10⁴个大胶质细胞。第二天时，将制备两个反应管(每一管遵循的比例为每板的比例)：管A将通过在1.2ml无血清DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中混合转染到哺乳动物细胞中的每一受体的2μg DNA、总共4μg DNA(例如pCMV载体、具有经突变THSR(TSHR-A623I)、TSHR-A623I和GPCR等的pCMV载体)来制备；管B将通过在1.2ml无血清DMEM中混合120μl脂质体转染剂(GibcoBRL)来制备。接着，将通过倒位(数次)且随后在室温下培养30-45分钟而使管A和B混合。所述混合物被称为“转染混合物”。将用1×PBS洗涤已析出的大胶质细胞，随后加入10ml无血清DMEM。接着，将2.4ml转染混合物加入细胞中，随后在37℃/5％CO₂下培养4小时。接着，转染混合物将通过抽吸移除，随后加入25ml DMEM/10％胎牛血清。接着，将在37℃/5％CO₂下培养细胞。培养24小时之后，接着将收集细胞并用于分析。

Flash Plate^TM腺苷酰环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)经设计以用于基于细胞的分析，然而，其可视所属领域技术人员的需要而经改进以用于粗原生质膜。Flash Plate孔将含有闪烁涂料，所述闪烁涂料也含有识别cAMP的特异性抗体。可通过放射活性cAMP示踪剂与cAMP抗体结合的直接竞争来量化孔中所产生的cAMP。下文为测量表达受体的全部细胞中cAMP含量改变的简要方案。

短暂转染后大约24小时收集经转染的细胞。将小心地吸出培养基并将其丢弃。将10ml PBS缓慢地加入每一个细胞盘中，随后小心地吸出，将1ml Sigma细胞解离液和3ml PBS加入每一板中。将细胞自所述板中移出并将细胞悬浮液收集到50ml圆锥形离心管中。随后在室温下以1,100rpm使细胞离心5分钟。将小心地使细胞小球再悬浮于适当体积的PBS(约3毫升/板)中。接着，使用血球计计数细胞，并加入额外的PBS以得到适当数量的细胞(具有约50微升/孔的最终体积)。

将制备cAMP标准和检测缓冲液(包含1μCi的示踪剂[¹²⁵I cAMP(50μl)]与11ml检测缓冲液)并根据制造商的说明加以维持。应新鲜制备用于筛选的分析缓冲液，且其含有50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM的最终分析浓度)和50μl细胞。分析缓冲液可储存于冰上直到利用时为止。通过将50μl cAMP标准加入适当的孔中，随后将50μl PBSA加入孔H11和H12中来开始分析。将50μl刺激缓冲液加入所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针点工具将所选化合物(例如TSH)加入适当的孔中，使其具有12μM测试化合物的最终分析浓度和100μl的总分析体积。随后将细胞加入孔中，并在室温下培养60分钟。接着将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合液加入孔中。随后将板额外培养2小时，接着在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。接着由标准cAMP曲线推断每一分析板内所含的每孔的cAMP的值。

基于报导子的分析：Cre-Luc报导子分析(Gs关联受体)：使大胶质细胞以每孔2×10⁴个细胞的密度在96孔板上析出，且次日根据制造商的说明使用脂质体转染试剂(BRL)将其转染。用于每一6孔转染的DNA/脂质混合物制备如下：缓慢地使100μlDMEM中的260ng质粒DNA与100μl DMEM中的2μl脂质混合(所述260ng质粒DNA是由200ng 8×CRE-Luc报导子质粒、50ng包含内源报导子或非内源报导子的pCMV或单独pCMV和10ng GPRS表达质粒(pcDNA3中的GPRS(Invitrogen))组成)。所述8×CRE-Luc报导子质粒制备如下：通过克隆在pβgal-Basic载体(Clontech)中的BglV-HindIII位点处的大鼠生长激素抑制素启动子(-71/+51)来获得载体SRIF-β-gal。通过PCR由腺病毒模板AdpCF126CCRE8获得cAMP反应元件的八(8)个拷贝(参看7Human Gene Therapy 1883(1996))，并将其克隆到Kpn-BgIV位点处的SRIF-β-gal载体中，由此产生8×CRE-β-gal报导子载体。8×CRE-Luc报导子质粒是通过将8×CRE-β-gal报导子载体中的β-半乳糖苷酶基因在HindIII-BamHI位点处以获自pGL3-基本载体(Promega)的荧光素酶基因替换而产生。在室温下培养30分钟后，用400μl DMEM稀释DNA/脂质混合物，并将100μl经稀释的混合物加入每一孔中。在细胞培养器中培养4小时之后，将100μl具有10％FCS的DMEM加入每一孔中。次日，用200微升/孔的具有10％FCS的DMEM交换经转染的细胞。八(8)小时后，经PBS洗涤一次之后，在无酚红的情况下将所述孔变为100微升/孔的DMEM。次日，使用LucLite^TM报导子基因分析试剂盒(Packard)遵循制造商的说明测量荧光素酶活性，并于1450MicroBeta^TM闪烁及发光计数器(Wallac)上读出。

AP1报导子分析(Gq关联受体)：检测Gq刺激的方法视用以在启动子中引起含有AP1元件的基因活化的Gq依赖性磷脂酶C的已知特性而定。可遵循上文关于CREB报导子分析所述的方案利用Pathdetect^TM AP-1顺式报导系统(Stratagene，Catalogue #219073)，其例外为磷酸钙沉淀的组份为410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-报导子表达质粒和20ng CMV-SEAP。

SRF-LUC报导子分析(Gq关联受体)：一种检测Gq刺激的方法视用以引起启动子中含有血清反应因子的基因活化的Gq依赖性磷脂酶C的已知特性而定。可利用Pathdetect^TM SRF-Luc-报导系统(Stratagene)分析例如COS7细胞中的Gq偶合活性。使用Mammalian Transfection^TM试剂盒(Stratagene，目录号200285)依据制造商的说明，用所述系统的质粒组份和编码内源或非内源GPCR的指定表达质粒使细胞转染。简言之，按照制造商的说明，在磷酸钙沉淀中组合410ng SRF-Luc、80ng pCMV-报导子表达质粒和20ng CMV-SEAP(已分泌的碱性磷酸酶表达质粒；碱性磷酸酶活性是在经转染细胞的培养基中测量以控制样本之间转染效率的变化)。将所述沉淀的一半均等地分布于96孔板的3个孔中，在无血清培养基中保持细胞24小时。最后5小时时，一起培养细胞与所选化合物。随后使细胞溶解，并使用Luclite^TM试剂盒(Packard，目录号6016911)和“Trilux 1450Microbeta”液体闪烁及发光计数器(Wallac)按照制造商的说明分析荧光素酶活性。可使用GraphPad Prism^TM 2.0a(GraphPad Software Inc.)分析数据。

细胞内1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)积累分析(G_q关联受体)：第1天时，可将包含受体(内源和/或非内源)的细胞涂板于24孔板上，通常为1×10⁵个细胞/孔(尽管此数量可优化)。第2天时，可通过首先混合50μl无血清DMEM/孔中的0.25μg DNA和50μl无血清DMEM/孔中的2μl脂质体转染剂使细胞转染。缓慢地将溶液混合，并在室温下培养15-30分钟。用0.5ml PBS洗涤细胞，并将400μl无血清培养基与转染培养基混合，并将其加入到所述细胞中。随后，在37℃/5％CO₂下培养所述细胞3-4小时，且接着移除所述转染培养基并替换为1毫升/孔的常规生长培养基。

第3天时，用³H-肌醇标记所述细胞。简言之，移除培养基，并用0.5ml PBS洗涤细胞。随后以每孔0.25μCi ³H-肌醇向每孔中加入0.5ml无肌醇/无血清培养基(GIBCOBRL)，并于37℃/5％CO₂下培养细胞16-18小时。第4天时，用0.5ml PBS洗涤细胞，并加入0.45ml含有无肌醇/无血清培养基、10μM巴吉林(pargyline)、10mM氯化锂的分析培养基或0.4ml分析培养基和50μl 10×酮舍林(ketanserin)(ket)直到10μM的最终浓度。接着，在37℃下培养细胞30分钟。随后，用0.5ml PBS洗涤细胞，并于每孔加入200μl新鲜/冰冷的终止溶液(1M KOH；18mM硼酸钠；3.8mM EDTA)。使所述溶液在冰上保持5-10分钟或直到溶解细胞时为止，且接着由200μl新鲜/冰冷的中和溶液(7.5％HCl)将其中和。

然后，将溶胞产物转移到1.5ml eppendorf管中，并于每管中加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。将溶液涡旋15秒，并将上部相应用于Biorad AG1-X8^TM阴离子交换树脂(100-200目)。首先，以1∶1.25W/V的比例用水洗涤树脂，并将0.9ml上部相装载于管柱上。用10ml的5mM肌醇和10ml的5mM硼酸钠/60mM甲酸钠洗涤管柱。将三磷酸肌醇洗脱到含有10ml具有2ml 0.1M甲酸/1M甲酸铵的闪烁混合液的闪烁瓶中。通过用10ml0.1M甲酸/3M甲酸铵洗涤使管柱再生，并用去离子水冲洗两次，且于4℃储存于水中。

用于测量细胞内钙浓度的荧光成像平板读取器(FLIPR)：将来自个别无性繁殖系的经稳定转染细胞的靶受体(实验性)和pCMV(阴性对照)以5.5×10⁴个细胞/孔接种于经聚D-赖氨酸预处理的具有完全培养基(具有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的DMEM)的96孔板(Becton-Dickinson，#356640)中用于次日分析。为制备Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培养缓冲液储备液，将1mg Fluo4-AM溶解于467μl DMSO和467μl泊洛尼克酸(Pluoronic acid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到可在-20℃下储存一个月的1mM储备溶液。Fluo4-AM是一种钙荧光指示剂染料。

候选化合物是在洗涤缓冲液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES，pH7.4)中制备。

分析时，自孔中移除培养基，并使细胞装载有100μl 4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPBS/完全培养基，pH为7.4。使培养在37℃/5％CO₂下进行60分钟。

培养1小时后，移除Fluo4-AM培养缓冲液，并用100μl洗涤缓冲液将细胞洗涤2次。在每一孔中留下100μl洗涤缓冲液。将板放回37℃/5％CO₂的培养器中历时60分钟。

FLIPR(荧光成像平板读取器，Molecular Device)经设计以于第30秒时加入50μl候选化合物，并记录由所述候选化合物所引起的细胞内钙浓度([Ca²⁺])的短暂改变历时另外150秒。使用FLIPR软件，使用荧光改变总数测定促效剂活性。工具软件将荧光读数标准化以给出零点的对等初始读数。

在某些实施例中，包含靶受体的细胞进一步包含混杂的Qα15/16或嵌合的Gq/Giα单元。

尽管前文使用经稳定转染的细胞提供促效剂活性的FLIPR分析，但所属领域技术人员将能够容易地改变所述分析以便表征拮抗剂活性。所属领域的技术人员也将容易地了解可替代性地使用经短暂转染的细胞。

由上述结果和讨论显而易见，本发明提供用于产生嗅觉GPCR的重要的新方式。详言之，本发明提供用于筛选化学药剂库以寻找嗅觉GPCR调节剂的系统。由此，本方法和系统可用于各种不同的应用中，包括研究、食品和芳香剂改良及其他应用。因此，本发明代表着对此项技术的杰出贡献。

表1

OR51B2  P47884  Q8VGE1  Q8VG94  Q8VG21  Q8VEZ0  Q8VGS5  Q8VGU6

Q9Y5P0  P58170  Q8VGJ1  Q8VG95  Q8VG34  Q8VEZ9  Q8VGS6  Q8VGU7

Q9H255  P30953  Q8VGJ6  Q8VGA0  Q8VG41  Q8VF01  Q8VGS7  Q8VGU8

Q88628  P47887  Q8VGP8  Q8VGA9  Q8VG47  Q8VF12  Q8VGS8  Q8VGX1

Q9H343  O43749  Q8VGT6  Q8VGB1  Q8VG57  Q8VF13  Q8VGS9  Q8VGX5

Q9H344  P47890  Q8VGT7  Q8VGB2  Q8VG58  Q8VF14  Q8VGT8  Q9JHB2

Q9H341  O60431  Q8VGT9  Q8VGB6  Q8VG59  Q8VF15  Q8VGU3  Q9JHW3

Q9UKL2  Q15612  Q920G5  Q8VGB7  Q8VG60  Q8VF19  Q8VGY2  Q9JM16

Q96RD2  P23269  Q9EPG3  Q8VGC8  Q8VG61  Q8VF22  Q8VH07  O35184

Q9H346  P23274  Q9EPG4  Q8VGD6  Q8VG62  Q8VF25  Q8VH08  W96RD0

Q96RD3  P23273  Q9JKA6  Q8VGD7  Q8VG63  Q8VF34  Q8VH10  Q96RC9

Q8NGF0  P23266  Q9GZK7  Q8VGD8  Q8VG73  Q8VF36  Q920P1  Q15620

Q8NGF1  P23271  Q8NG94  Q8VGD9  Q8VG74  Q8VF50  Q920P2  Q8WZ84

Q8NGF3  P23272  Q8NGC1  Q8VGI0  Q8VG82  Q8VF51  Q923Q6  Q9GZM6

Q8NGH5  P30955  Q8NGC7  Q8VGJ5  Q8VG86  Q8VF52  Q923Q8  Q63395

Q8NGH6  P70526  Q8NGC9  Q8VGL6  Q8VGE4  Q8VF53  Q9EQ84  Q8N0Y1

Q8NGH7  Q62942  Q8NH07  Q8VGL7  Q8VGE5  Q8VF54  Q9EQ85  Q8NG78

Q8NGH8  Q8NGA1  Q8VEV3  Q8VGP4  Q8VGE6  Q8VF59  Q9EQ86  Q8NG88

Q8NGH9  Q8NGQ3  Q8VEV4  Q8VGP5  Q8VGE7  Q8VF60  Q9EQ87  Q8NGG6

Q8NGI0  Q8NGR2  Q8VF70  Q8VGP6  Q8VGE8  Q8VF61  Q9EQ88  Q8NGG7

Q8NGI1  Q8NGR5  Q8VFC3  Q8VGT5  Q8VGE9  Q8VF65  Q9QY00  Q8NGG8

Q8NGI2  Q8NGR7  Q8VFD8  Q8VGU0  Q8VGF1  Q8VF66  Q9WU91  Q8NGG9

Q8NGI3  Q8NGR8  Q8VFE3  Q8VGW6  Q8VGF2  Q8VF67  O13036  Q8NGH0

Q8NGJ2  Q8NGR9  Q8VFT6  Q8VGW9  Q8VGF3  Q8VF68  O57597  Q8NGH1

Q8NGJ3  Q8NGS0  Q8VFT7  Q8VGX0  Q8VGF4  Q8VF71  O95222  Q8NGH2

Q8NGJ4  Q8NGS1  Q8VFT8  Q8VGX2  Q8VGF5  Q8VF72  O95007  Q8NGM9

Q8NGJ5  Q8NGS2  Q8VFT9  Q92022  Q8VGF6  Q8VF73  O70269  Q8VEY0

Q8NGJ6  Q8NGS3  Q9WU86  Q9D3U9  Q8VGF7  Q8VF74  O70270  Q8VF23

Q8NGJ7  Q8NGZ1  P58182  Q9D4F9  Q8VGF8  Q8VF75  O70271  Q8VF62

Q8NGJ8  Q8NH92  Q9UFF7  Q9EP55  Q8VGF9  Q8VF76  P23267  Q8VF63

Q8NGJ9  Q8NH93  Q8NHA7  Q9EP67  Q8VGG0  Q8VF77  P23270  Q8VF64

Q8NGK0  Q8NH94  Q8VG96  Q9EPF5  Q8VGG1  Q8VFC4  Q8C0U2  Q8VF78

Q8NGK1  Q8NHA8  Q920Y8  Q9EPF6  Q8VGG2  Q8VFC5  Q8K4Z9  Q8VFB3

Q8NGK2  Q8VET9  Q920Y9  Q9EPF7  Q8VGG7  Q8VFC9  Q8K501  Q8VFB4

Q8NGK3  Q8VEU7  Q920Z0  Q9EPF8  Q8VGG8  Q8VFD0  Q8NGC5  Q8VFB5

Q8NGK4  Q8VEY8  Q95047  Q9EPF9  Q8VGG7  Q8VFD1  Q8NGD9  Q8VFB6

Q8NGK5  Q8VEZ6  Q9GZK3  Q9EPH0  Q8VGH8  Q8VFD2  Q8NGE1  Q8VFD7

Q8NGK6  Q8VEZ7  O76000  Q9EPG5  Q8VGH9  Q8VFD3  Q8NGE2  Q8VFN2

Q8NGM7  Q8VF79  P58173  Q9EPG6  Q8VGM3  Q8VFG0  Q8NGM8  Q8VFN3

Q8NH53  Q8VFA1  O95371  Q9EPV1  Q8VGM4  Q8VFG1  Q8NGN1  Q8VFN4

Q8NH55  Q8VFD9  Q9H210  Q9GZK1  Q8VGM5  Q8VFG5  Q8NGQ2  Q8VFN5

Q8NH56  Q8VFE0  Q13607  Q9GZK6  Q8VGM6  Q8VFG6  Q8NGT5  Q8VG15

Q8NH57  Q8VFE1  O95006  Q9QW34  Q8VGM7  Q8VFJ7  Q8NGU2  Q8VG16

Q8NH60  Q8VFE4  Q9H205  Q9QW38  Q8VGM8  Q8VFJ8  Q8NGW0  Q8VG17

Q8NH61  Q8VFE5  Q9GZK4  Q9QZ17  Q8VGM9  Q8VFJ9  Q8NGW1  Q8VG50

Q8NH63  Q8VFE6  O95918  Q9QZI8  Q8VGN0  Q8VFK0  Q8NGW6  Q8VG51

表1

Q8NH64  Q8VFM9  Q15062  Q9QZ19  Q8VGN1  Q8VFK1  Q8NGX0  Q8VG52

Q8NH67  Q8VFP4  O76002  Q9QZ20  Q8VGN2  Q8VFK2  Q8NGX8  Q8VG53

Q8NH68  Q8VFP5  O76001  Q9QZ21  Q8VGN3  Q8VFK3  Q8NGX9  Q8VG54

Q8NH76  Q8VFP6  Q9NQN1  Q9QZ22  Q8VGN4  Q8VFK4  Q8NGY2  Q8VG55

Q8NH78  Q8VFP7  O43869  Q9R0Z2  Q8VGN5  Q8VFK5  Q8NGY3  Q8VG56

Q8TCB6  Q8VFP8  Q9Y3N9  P47881  Q8VGN6  Q8VFK6  Q8NGY4  Q8VG67

Q8VBV9  Q8VFP9  O35434  P47893  Q8VGN7  Q8VFK7  Q8NGY5  Q8VG68

Q8VEW7  Q8VFT2  O95499  P47888  Q8VGN8  Q8VFK8  Q8NGY6  Q8VG69

Q8VEW8  Q8VFY1  P23275  P47883  Q8VGN9  Q8VFK9  Q8NHZ6  Q8VG70

Q8VEX9  Q8VGB9  Q95156  Q8VFX6  Q8VGP0  Q8VFL0  Q8NH40  Q8VG71

Q8VF02  Q8VGG9  Q63394  Q8VFX7  Q8VGP1  Q8VFL1  Q8NH79  Q8VG75

Q8VF03  Q8VGH0  Q8N349  Q8VFX8  Q8VGP2  Q8VFL2  Q8VEU0  Q8VG76

Q8VF06  Q8VGH1  Q8N628  Q8VFX9  Q8VGP3  Q8VFL4  Q8VEU1  Q8VG80

Q8VF07  Q8VGI1  Q8NG76  Q8VGR1  Q9QW37  Q8VFL5  Q8VEW0  Q8VG89

Q8VF08  Q8VGI2  Q8NG77  Q8VGR2  Q9R0K1  Q8VFL6  Q8VEX2  Q8VG90

Q8VF09  Q8VGI3  Q8NG80  QT9SM7  Q9R0K2  Q8VFL7  Q8VEX8  Q8VG92

Q8VF27  Q8VGJ7  Q8NG81  Q9TSM8  Q9R0K3  Q8VFL8  Q8VF24  Q8VG93

Q8VF28  Q8VGJ8  Q8NG82  Q9TU88  Q9R0K4  Q8VFL9  Q8VF26  Q8VGB4

Q8VFZ7  Q8VGJ9  Q8NG83  Q9TU89  Q9R0K5  Q8VFM0  Q8VF30  Q8VGC9

Q8VG01  Q8VGK0  Q8NG84  Q9TU97  Q96R09  Q8VFM1  Q8VF31  Q8VGD0

Q8VG18  Q8VGK1  Q8NG85  Q9TUA0  Q96R08  Q8VFN7  Q8VF33  Q8VGD1

Q8VG19  Q8VGK2  Q8NG86  Q9TUA4  O95221  Q8VFN8  Q8VF82  Q8VGD2

Q8VG22  Q8VGK3  Q8NG97  Q15615  Q13606  Q8VFN9  Q8VFB7  Q8VGD3

Q8VG23  Q8VGK4  Q8NGH3  P58180  Q8WZ92  Q8VFP1  Q8VFE7  Q8VGD4

Q8VG24  Q8VGK5  Q8NGH4  O95013  Q8WZ94  Q8VFQ3  Q8VFH3  Q8VGD5

Q8VG25  Q8VGK6  Q8NGS4  Q8IXE1  Q9UGF5  Q8VFQ4  Q8VFH4  Q8VGE2

Q8VG26  Q8VGK7  Q8NGS5  Q8K4Z8  Q9UGF6  Q8VFQ5  Q8VFH5  Q8VGE3

Q8VG28  Q8VGK8  Q8NGS6  Q8K500  O77756  Q8VFQ6  Q8VFH6  Q8VH09

Q8VG77  Q8VGK9  Q8NGS7  Q8N0Y3  O77757  Q8VFQ7  Q8VFH7  Q9EQ89

Q8VG78  Q8VGL0  Q8NGS8  Q8NGA8  O77758  Q8VFQ8  Q8VFH8  Q9EQ90

Q8VG79  Q8VGP7  Q8NGS9  Q8NGB1  Q95154  Q8VFQ9  Q8VFH9  Q9EQ91

Q8VG84  Q8VGR3  Q8NGT0  Q8NGB2  P37067  Q8VFR0  Q8VFI0  Q9EQ92

Q8VG85  Q8VGR4  Q8NGT1  Q8NGB4  Q95155  Q8VFR1  Q8VFI1  Q9EQ93

Q8VGA1  Q8VGR5  Q8NGT2  Q8NGB6  P37068  Q8VFR2  Q8VFI2  Q9EQ94

Q8VGU9  Q8VGR6  Q8NGT6  Q8NGB8  P37069  Q8VFR3  Q8VFI3  Q9EQ95

Q8VGV0  Q8VGR7  Q8NGT7  Q8NGB9  P37070  Q8VFR4  Q8VFI4  Q9EQ96

Q8VGV1  Q8VGT0  Q8NGT8  Q8NGC2  P37071  Q8VFR5  Q8VFI5  Q9EQ97

Q8VGV2  Q8VGT1  Q8NGT9  Q8NGC6  P37072  Q8VFR6  Q8VFN6  Q9EQ98

Q8VGV3  Q8VGT2  Q8NGU4  Q8NGD0  Q62943  Q8VFR7  Q8VFP0  Q9EQ99

Q8VGV4  Q8VGT3  Q8NGV0  Q8NGD1  Q62944  Q8VFR8  Q8VFP2  Q9EQA0

Q8VGV5  Q920Y6  Q8NGV1  Q8NGD2  Q8C0S2  Q8VFR9  Q8VFU0  Q9EQA1

Q8VGV6  Q920Y7  Q8NGV4  Q8NGD3  Q8IVL3  Q8VFS0  Q8VFU1  Q9EQA2

Q8VGV8  Q9JHE2  Q8NGV5  Q8NGD4  Q8IXE7  Q8VFS7  Q8VFU2  Q9EQA3

Q8VGV9  Q9QW35  Q8NGW7  Q8NGD5  Q8N0Y5  Q8VFS8  Q8VFU5  Q9EQA4

Q8VGW0  Q9TQX4  Q8NGX1  Q8NGD6  Q8N127  Q8VFS9  Q8VFY9  Q9EQA5

Q8VGW1  Q9TSN0  Q8NGX2  Q8NGE8  Q8N146  Q8VFT0  Q8VFZ0  Q9EQA6

表1

Q8VGW2  Q9TU84  Q8NGY9  Q8NGF8  Q8N162  Q8VFU3  Q8VFZ1  Q9EQA7

Q8VGW3  Q9TU86  Q8NGZ0  Q8NGF9  Q8NG75  Q8VFU4  Q8VFZ2  Q9EQA8

Q8VGW4  Q9TU90  Q8NGZ4  Q8NGI4  Q8NGC0  Q8VFU6  Q8VFZ8  Q9EQA9

Q8VGW5  Q9TU92  Q8NGZ5  Q8NGI6  Q8NGC3  Q8VFU7  Q8VFZ9  Q9EQB0

Q8VGX3  Q9TU93  Q8NGZ9  Q8NGJ1  Q8NGC4  Q8VFV2  Q8VG27  Q9EQB1

Q8VGX4  Q9TU94  Q8NH00  Q8NGL6  Q8NGE7  Q8VFV3  Q8VG29  Q9EQB2

Q8VGX6  Q9TU95  Q8NH01  Q8NGL7  Q8NGE9  Q8VFV4  Q8VG33  Q9EQB3

Q8VGX7  Q9TU99  Q8NH02  Q8NGL8  Q8NGF4  Q8VFV5  Q8VG45  Q9EQB4

Q8VGX8  Q9TUA1  Q8NH04  Q8NGL9  Q8NGF5  Q8VFV6  Q8VG46  Q9EQB5

Q8VGX9  Q9TUA2  Q8NH16  Q8NGM0  Q8NGF7  Q8VFV7  Q8VG64  Q9EQB6

Q8VGY0  Q9TUA3  Q8NH95  Q8NGN0  Q8NGG0  Q8VFV8  Q8VGC2  Q9EQB7

Q8VGY1  Q9TUA6  Q8NHA4  Q8NGN8  Q8NGG2  Q8VFV9  Q8VGC4  Q9EQB8

Q8VGY3  Q9TUA7  Q8NHA6  Q8NGN9  Q8NGG3  Q8VFW0  Q8VGC5  Q9EQG1

Q8VGY4  Q9TUA8  Q8NHC8  Q8NGP0  Q8NGG4  Q8VFW1  Q8VGH3  Q9ERU6

Q8VGY5  Q9TUA9  Q8VES9  Q8NH05  Q8NGG5  Q8VFW2  Q8VGH4  Q9QW36

Q8VGY6  Q9UDD9  Q8VET2  Q8NH21  Q8NG18  Q8VFW3  Q8VGH5  Q8N148

Q8VGY7  O70265  Q8VEV0  Q8NH37  Q8NGI9  Q8VFW4  Q8VGH6  Q8NG79

Q8VGY8  O70266  Q8VEV1  Q8NH41  Q8NGJ0  Q8VFW5  Q8VGI7  Q8NG92

Q8VGY9  O70267  Q8VEV9  Q8NH42  Q8NGK9  Q8VFW6  Q8VGI8  Q8NGE0

Q8VGZ0  O70268  Q8VEW4  Q8NH43  Q8NGL0  Q8VFW7  Q8VGI9  Q8NGR1

Q8VGZ1  P58181  Q8VEW9  Q8NH49  Q8NGL1  Q8VFW8  Q8VGJ0  Q8NGR6

Q8VGZ2  Q9H209  Q8VEY4  Q8NH70  Q8NGL2  Q8VFW9  Q8VGJ2  Q8NGV6

Q8VGZ3  Q9H207  Q8VEY6  Q8NH72  Q8NGL3  Q8VFX0  Q8VGJ3  Q8NGV7

Q8VGZ4  Q96KK4  Q8VEY7  Q8NH73  Q8NGL4  Q8VFX1  Q8VGL1  Q8NGZ3

Q8VGZ5  Q9Y4A9  Q8VF05  Q8NH83  Q8NGL5  Q8VFX2  Q8VGU1  Q8NH08

Q8VGZ6  O60403  Q8VF17  Q8NH84  Q8NGN2  Q8VFX3  Q8VGU4  Q8NH09

Q8VGZ7  O60404  Q8VF18  Q8VET0  Q8NGN3  Q8VFX4  Q8VGU5  Q8NH14

Q8VGZ8  P30954  Q8VF37  Q8VET4  Q8NGN4  Q8VFX5  Q8VGW8  Q8NH44

Q8VGZ9  Q62007  Q8VF44  Q8VEX0  Q8NGN5  Q8VFZ3  Q924H8  Q8NHB7

Q8VH00  Q8CG22  Q8VF69  Q8VEX1  Q8NGN6  Q8VG00  Q9EPG1  Q8NHB8

Q8VH01  Q8NGA5  Q8VF80  Q8VEX3  Q8NGN7  Q8VG02  Q9EPG2  Q8NHC5

Q8VH02  Q8NG6A  Q8VF81  Q8VEX7  Q8NGP2  Q8VG03  Q9EPV0  Q8NHC6

Q8VH03  Q8NGE3  Q8VF87  Q8VEY5  Q8NGP3  Q8VG04  Q9H206  Q8VET6

Q8VH04  Q8NGE5  Q8VF88  Q8VEZ1  Q8NGP4  Q8VG05  Q9QWU6  Q8VET7

Q8VH05  Q8NGF6  Q8VF89  Q8VEZ2  Q8NGP6  Q8VG06  Q9Z1V0  Q8VEX5

Q8VH06  Q8NGI7  Q8VF92  Q8VEZ3  Q8NGP8  Q8VG07  P34987  Q8VEX6

Q8VH11  Q8NGM4  Q8VFA2  Q8VF10  Q8NGP9  Q8VG08  Q15622  Q8VF04

Q8VH12  Q8NGQ4  Q8VFA3  Q8VF11  Q8NGQ0  Q8VG09  O76100  Q8VF16

Q8VH13  Q8NGX3  Q8VFA4  Q8VF21  Q8NGQ1  Q8VG11  O14581  Q8VF32

Q8VH14  Q8NGX5  Q8VFA5  Q8VF29  Q8NGQ5  Q8VG13  O76099  Q8VF35

Q8VH15  Q8NGX6  Q8VFA6  Q8VF38  Q8NGQ6  Q8VG20  O60412  Q8VF42

Q8VH16  Q8NGY0  Q8VFA7  Q8VF39  Q8NGR3  Q8VG30  P23268  Q8VF43

Q8VH17  Q8NGY1  Q8VFA8  Q8VF40  Q8NGR4  Q8VG35  P23265  Q8VF93

Q8VH18  Q8NH19  Q8VFA9  Q8VF41  Q8NGZ2  Q8VG36  Q95157  Q8VFB8

Q8VH19  Q8NH36  Q8VFB2  Q8VF45  Q8NH10  Q8VG37  Q8N133  Q8VFB9

Q8VH20  Q8NH74  Q8VFC1  Q8VF46  Q8NH18  Q8VG38  Q8NG95  Q8VFC0

表1

Q8VH21  Q8NHC4  Q8VFC2  Q8VF47  Q8NH48  Q8VG39  Q8NG98  Q8VFE8

Q8VH22  Q8VBW9  Q8VFD4  Q8VF48  Q8NH50  Q8VG40  Q8NG99  Q8VFE9

Q924X8  Q8VES6  Q8VFD5  Q8VF56  Q8NH51  Q8VG42  Q8NGA0  Q8VFP3

Q99NH4  Q8VES7  Q8VFD6  Q8VF57  Q8NH69  Q8VG43  Q8NGA2  Q8VFY0

Q9EPN8  Q8VEU3  Q8VFF0  Q8VF58  Q8NH80  Q8VG44  Q8NH99  Q8VFY6

Q9EPN9  Q8VEV2  Q8VFG2  Q8VF83  Q8NH81  Q8VG65  Q8NHB5  Q8VFY7

Q9EQQ5  Q8VEW1  Q8VFG3  Q8VF84  Q8NH85  Q8VG66  Q8NHC1  Q8VG48

Q9EQQ6  Q8VEX4  Q8VFG4  Q8VF85  Q8NH86  Q8VG81  Q8VET8  Q8VGH2

Q9EQQ7  Q8VEY1  Q8VFG7  Q8VF86  Q8NH87  Q8VG83  Q8VEW3  Q8VGJ4

Q9GKV8  Q8VEZ4  Q8VFG8  Q8VF90  Q8NH88  Q8VG91  Q8VEY9  Q8VGL2

Q9H2C5  Q8VEZ5  Q8VFG9  Q8VF91  Q8NH89  Q8VG97  Q8VFF1  Q8VGL3

Q9H2C6  Q8VEZ8  Q8VFH0  Q8VF94  Q8NH90  Q8VGA2  Q8VFF2  Q8VGL4

Q9H2C8  Q8VF00  Q8VFH1  Q8VF95  Q8NH91  Q8VGA3  Q8VFF3  Q8VGL5

Q9H339  Q8VF20  Q8VFH2  Q8VF96  Q8NHC7  Q8VGA4  Q8VFF4  Q8VGL8

Q9H340  Q8VF55  Q8VFL3  Q8VF97  Q8VES8  Q8VGA5  Q8VFF5  Q8VGL9

Q9H342  Q8VFE2  Q8VFM2  Q8VF98  Q8VET1  Q8VGA6  Q8VFF6  Q8VGM0

Q9H345  Q8VFM7  Q8VFM3  Q8VF99  Q8VET3  Q8VGA7  Q8VFF7  Q8VGM1

Q9WU88  Q8VFQ0  Q8VFM4  Q8VFA0  Q8VET5  Q8VGA8  Q8VFI7  Q8VGM2

Q9WU89  Q8VFQ2  Q8VFM5  Q8VFB0  Q8VEU2  Q8VGB0  Q8VFI8  Q8VGP9

Q9WU90  Q8VFS1  Q8VFM6  Q8VFB1  Q8VEU4  Q8VGB3  Q8VFJ0  Q8VGQ0

Q9WU93  Q8VFT1  Q8VFN0  Q8VFC6  Q8VEU5  Q8VGB5  Q8VFJ1  Q8VGQ1

Q9WU94  Q8VFY4  Q8VFQ1  Q8VFC7  Q8VEU6  Q8VGC6  Q8VFJ2  Q8VGQ2

Q9WVD7  Q8VFY5  Q8VFS2  Q8VFC8  Q8VEU8  Q8VGC7  Q8VFJ3  Q8VGQ3

Q9WVD8  Q8VFZ4  Q8VFS3  Q8VFF8  Q8VEU9  Q8VGF0  Q8VFJ4  Q8VGQ4

Q9WVD9  Q8VFZ5  Q8VFS4  Q8VFF9  Q8VEV5  Q8VGI4  Q8VFJ5  Q8VGQ5

Q9WVN4  Q8VFZ6  Q8VFS5  Q8VFN1  Q8VEV6  Q8VGI5  Q8VFJ6  Q8VGQ6

Q9WVN5  Q8VG10  Q8VFS6  Q8VFT3  Q8VEV7  Q8VGI6  Q8VFM8  Q8VGQ7

Q9WVN6  Q8VG31  Q8VFY2  Q8VFT4  Q8VEV8  Q8VGR8  Q8VG88  Q8VGQ8

Q9YH55  Q8VG32  Q8VFY3  Q8VFT5  Q8VEW2  Q8VGR9  Q8VGB8  Q8VGQ9

Q9P1Q5  Q8VG98  Q8VG14  Q8VFU8  Q8VEW5  Q8VGS0  Q8VGG3  Q8VGR0

Q9Y585  Q8VG99  Q8VG49  Q8VFU9  Q8VEW6  Q8VGS1  Q8VGG4  Q8VGT4

Q15619  Q8VGC0  Q8VG72  Q8VFV0  Q8VEY2  Q8VGS2  Q8VGG5  Q8VGU2

P34982  Q8VGC1  Q8VG87  Q8VFV1  Q8VEY3  Q8VGS3  Q8VGG6  Q8VGV7

        Q8VGE0          Q8VG12          Q8VGS4          Q8VGW7

Claims (28)

1.一种产生嗅觉GPCR的方法，其包含：

在体外将表达盒引入大胶质细胞中，所述表达盒包含可经由操作连接到编码所述嗅觉GPCR的核酸的启动子，和

在适于产生所述嗅觉GPCR的条件下维持所述细胞，以产生所述嗅觉GPCR。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述大胶质细胞为髓磷脂产生细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述大胶质细胞为许旺氏(Schwann)细胞、寡突细胞或嗅鞘细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述大胶质细胞为原代许旺氏细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为永生化大胶质细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述嗅觉GPCR可在细胞表面上检测到。

7.一种筛选嗅觉调节剂的方法，其包含：

根据权利要求1所述的方法在大胶质细胞中产生嗅觉GPCR，其中所述嗅觉GPCR偶合到G蛋白；

使所述细胞与候选药剂接触；和

评定所述候选药剂对所述嗅觉GPCR的活性的作用，

其中调节所述嗅觉GPCR的活性的候选药剂为嗅觉调节剂。

8.一种筛选嗅觉GPCR的调节剂的方法，其包含：

根据权利要求1所述的方法在大胶质细胞中产生所述嗅觉GPCR，其中所述嗅觉GPCR偶合到G蛋白；

使所述细胞与候选药剂接触；和

评定所述候选药剂对所述嗅觉GPCR的活性的作用，

其中调节所述嗅觉GPCR的活性的候选药剂为所述嗅觉GPCR的调节剂。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述药剂为小有机分子。

10.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述药剂为气味剂。

11.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述接触是在已知的嗅觉GPCR促效剂的存在下进行。

12.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述调节剂是选自由促效剂、部分促效剂、反向促效剂和拮抗剂组成的群组。

13.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述评定是通过对GTPγS结合水平的测量来进行。

14.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述评定是通过对选自由环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)和Ca2+组成的群组的第二信使的含量的测量来进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二信使为cAMP。

16.一种筛选嗅觉GPCR的配位体的方法，其包含：

根据权利要求1所述的方法在大胶质细胞中产生所述嗅觉GPCR；

使所述嗅觉GPCR与候选药剂接触；和

评定所述候选药剂与所述嗅觉GPCR的结合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述候选药剂是经标记的。

18.一种筛选嗅觉GPCR的配位体的方法，其包含：

根据权利要求1所述的方法在大胶质细胞中产生所述嗅觉GPCR；

在经标记的已知嗅觉GPCR配位体的存在下，使所述嗅觉GPCR与候选药剂接触；和

评定所述经标记的已知嗅觉GPCR配位体的结合；

其中在所述候选药剂的存在下，所述经标记已知配位体结合的降低表明所述候选药剂为所述嗅觉GPCR的配位体。

19.一种筛选嗅觉调节剂的方法，其包含：

根据权利要求1所述的方法产生多个不同的嗅觉GPCR，其中每一所述嗅觉GPCR都偶合到G蛋白；

识别由第一药剂活化的一组不同嗅觉GPCR，其中所述第一药剂为已知的嗅觉调节剂；

使所述GPCR组与第二药剂接触；和

评定所述第二药剂对所述嗅觉GPCR的活性的作用，

其中调节由所述第一药剂所调节的所述一组不同GPCR中的一个或一个以上GPCR的第二药剂为嗅觉调节剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组包含三个或三个以上的GPCR。

21.一种大胶质细胞，其包含编码嗅觉GPCR的重组核酸。

22.一种试剂盒，其包含：

大胶质细胞；和

编码嗅觉GPCR的核酸。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其进一步包含用于使用所述大胶质细胞产生所述嗅觉GPCR的说明。

24.一种识别样本中所关注的气味剂的方法，其包含：

使样本与根据权利要求1所述的方法产生多个不同嗅觉GPCR的多个大胶质细胞接触，其中每一所述嗅觉GPCR都偶合到G蛋白；和

评定所述嗅觉GPCR的活化作用以评定所述气味剂的存在；

其中一预定嗅觉GPCR组的活化作用指示所述样本中所述气味剂的存在。

25.一种测定气味剂的“指纹”的方法，其包含：

使样本与根据权利要求1所述的方法产生多个不同嗅觉GPCR的多个大胶质细胞接触，其中每一所述嗅觉GPCR都偶合到G蛋白；和

评定所述嗅觉GPCR的活化作用以评定由所述气味剂引起的活化作用；

其中所述“指纹”包含由所述气味剂活化的所述一组不同嗅觉GPCR。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述接触是在所述多个嗅觉GPCR的一个或一个以上的已知促效剂的存在下进行。

27.根据权利要求24至26中任一权利要求所述的方法，其中所述多个细胞为一可寻址的细胞阵列，其中所述阵列的每一地址都含有产生单一重组嗅觉GPCR的大胶质细胞。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述GPCR活化作用是使用GPCR活化作用的发光报导子来评定。

Images