CN1863905A - 通过用前列腺素或前列腺素类似物补充培养基加强体外胚发育的方法以及组合物 - Google Patents
通过用前列腺素或前列腺素类似物补充培养基加强体外胚发育的方法以及组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1863905A CN1863905A CN 200480029052 CN200480029052A CN1863905A CN 1863905 A CN1863905 A CN 1863905A CN 200480029052 CN200480029052 CN 200480029052 CN 200480029052 A CN200480029052 A CN 200480029052A CN 1863905 A CN1863905 A CN 1863905A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- embryo
- hatching
- prostaglandin
- potential
- strengthen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 title abstract description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title abstract 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 207
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims abstract description 74
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 229960002240 iloprost Drugs 0.000 claims description 48
- HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N iloprost Chemical group C1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)C(C)CC#CC)[C@H](O)C[C@@H]21 HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N 0.000 claims description 43
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 claims description 20
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 claims description 10
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 claims description 10
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 7
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 46
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 12
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 3
- 101000874159 Mus musculus Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003653 radioligand binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 3
- RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N Hidralazin Chemical compound C1=CC=C2C(NN)=NN=CC2=C1 RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 2
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 2
- 208000033040 Somatoform disorder pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 2
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 150000003815 prostacyclins Chemical class 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 2
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- YNGDWRXWKFWCJY-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dihydropyridine Chemical compound C1C=CNC=C1 YNGDWRXWKFWCJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 206010065433 Ligament rupture Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000797947 Paria Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100038277 Prostaglandin G/H synthase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050003243 Prostaglandin G/H synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000883068 Seoda morula Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229960002474 hydralazine Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 208000024335 physical disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了加强哺乳动物胚体外发育的方法，包括用有效促进胚完全孵化(即，从透明带释放胚)量的前列腺素或者前列腺素类似物补充培养基。优选在胚的一或者多个下列发育阶段进行培养基的补充：(a)当基因组活化以及受精卵发育成桑椹胚时；以及(b)在胚发育的桑椹胚至早期胚泡阶段期间。由此加强体外受精胚的体内植入潜能以及活产潜能并促进成活怀孕的建立。
Description
联邦政府资助研究或开发的声明
本发明全部或部分由美国儿童健康和人类发育研究所(NICHD)提供资金，资金编号HD01277。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于体外培养哺乳动物胚以及在将培养的胚植入合适的哺乳动物宿主的子宫后加强实现怀孕的组合物以及方法。
现有技术的描述
输卵管内的环境可以加强精液的受精作用潜能而且促进裂生胚的发育。胚与输卵管上皮细胞的共培养已经显示出可以促进发育，孵化以及植入[Xu，2001；Xu，2000]。
传统认为前列环素(PGI2)与维持血液以及血管的体内平衡有关。然而，最近对基因敲除小鼠的观察显示其可能具有其它的生理功能。子宫内膜-来源的PGI2的重要性通过对环加氧酶(COX)-2敲除小鼠的观察得以强调[Lim，1997]。COX-2敲除小鼠的子宫内膜通常不能脱落。结果，转移的野生型胚不能植入缺乏COX-2的雌性小鼠。上述异常在某种程度上可以通过给母亲施用外源PGI2类似物进行校正[Lim，1999]。
输卵管-来源的PGI2在胚植入前的发育中的作用尚不明确，因为PGI2受体(IP)敲除小鼠的窝产仔数尚未与野生型的窝产仔数相比较[Murata，1997]。然而，来自交配的杂合IP敲除小鼠的幼仔的遗传型分布没能遵循孟德尔遗传定律：具有纯合IP敲除基因型的雌雄幼仔的概率分别为37％以及20％，小于所预料的[Murata，1997]。
发明概述
最近，我们发现人类输卵管合成大量的前列环素(PGI2)以及PGE2[Huang，2002]。基因敲除研究表明子宫内膜-来源的PGI2对于子宫内膜的脱落是必不可少的，但是PGI2对胚植入前的发育的影响尚未有报道。利用胚植入前的最适发育可能需要PGI2的假说，基于完全孵化率研究PGI2对小鼠胚的影响。通过Western印迹分析以及免疫组织化学评价PGI2受体(IP)的表达。通过放射性配体结合分析证实PGI2与胚的结合。我们的结果证明小鼠胚的孵化通过添加伊洛前列素(ED506.7nM)，一种稳定的PGI2合成类似物得以加强。8-细胞至桑椹胚或桑椹胚至早期胚泡阶段暴露于伊洛前列素对于加强孵化是非常重要的。这种针对PGI2的阶段-特异性应答与IP的发育阶段-特异性表达相一致。实施了进一步的研究以求将胚的加强孵化与增加植入以及活产率相联系，将在补充有伊洛前列素(Iloprost)的培养基中培养的小鼠胚转入受孕的载体。将怀孕胚囊以及活幼仔的数目与对照胚的数目相比较。因为培养基中的添加剂据报道可以增加胎儿体重[DeBaun，2002；Thompson，1995；Sinclair，1999]，也比较幼仔以及胎盘的重量。我们的结果显示补充有伊洛前列素的培养基中培养胚加强了小鼠胚的植入以及活产率，但不影响幼仔或者胎盘的重量。
因此，在本发明的特定实施方案中，提供了加强胚体外发育的方法，包括用前列腺素诸如PGI2或者PGE2或者其类似物补充培养基。在某些实施方案中，前列腺素为PGI2或者PGE2，并且在某些实施方案中前列腺素类似物为伊洛前列素或者PGE1。在某些实施方案中，该方法包括向培养基中添加足以促进胚完全孵化量的前列腺素或者类似物。优选地，“完全孵化”包括由透明带释放胚。该方法的某些实施方案中，在胚的早期发育阶段补充培养基，在该阶段基因组被激活并且受精卵发育成桑椹胚。在一些胚为人的实施方案中，早期发育阶段开始于4-至8-细胞状态。在某些方法实施方案中，在胚的桑椹胚至早期胚泡阶段发育期间补充培养基。在某些方法实施方案中，在胚的早期发育阶段至桑椹期发育期间以及胚的桑椹胚至早期胚泡阶段发育期间补充培养基。在某些方法实施方案中，其中胚为小鼠来源，补充步骤包括在其2细胞发育阶段的胚收获以后的24至42小时之间将培养中的胚曝露于前列腺素或者类似物。在其中胚为小鼠的某些方法实施方案中，桑椹胚至早期胚泡阶段期间的补充步骤包括在其2-细胞发育阶段的胚收获以后的42至72小时之间将胚曝露于前列腺素或者前列腺素类似物。
根据本发明的某些实施方案也提供了提高体外受精胚的体内植入潜能的方法。“植入潜能”是胚植入子宫的能力。该方法包括进行上述实施方案之一以加强胚的体外发育，由此获得培养中的胚的完全孵化或者与其它IVF方法相比加强孵化。根据该方法的某些实施方案，然后将完全或者几乎孵化的胚导入哺乳动物宿主的子宫，从而获得胚的加强植入。在某些实施方案中，胚的体外完全孵化与成活怀孕的建立有关。
在本发明的某些实施方案中，提供了提高体外受精的哺乳动物胚的活产潜能的方法。“活产潜能”是胚获得活产胚的能力。该方法包括如上所述通过用适量的前列腺素或者其类似物的体外培养加强胚的体外发育，从而获得培养中的胚的加强孵化潜能或者完全孵化。在优选的实施方案中，这种处理赋予了完全孵化的加强潜能，甚至是在由培养物取出胚后以及在体内环境中。该特性被称为“加强孵化潜能”。然后将孵化的胚，或者具有加强孵化潜能的胚转入哺乳动物宿主的子宫；使胚植入并且体内生长，从而相对于植入但未加强孵化的植入的胚使胚获得活产的能力得以加强。
在本发明的另一实施方案中，提供了提高体外受精的哺乳动物胚群体出生率的方法，其包括根据以上所述方法加强胚的体外发育，使得孵化加强，或者优选地获得培养的胚的完全孵化。该方法包括将胚导入或者转移到哺乳动物宿主中；然后使胚体内生长，其中具有加强孵化的胚组的活产率大于转入宿主子宫的胚组的活产率，而不必首先完全孵化或者接受孵化的加强。
本发明的特定实施方案进一步提供了用于体外哺乳动物胚发育的改良的细胞培养基，其中所述改进包括补充有效加强孵化，并且优选地促进胚体外完全孵化量的前列腺素或者其类似物。在某些实施方案中，所述培养基含有有效加强胚在从体外培养取出并转入哺乳动物宿主的子宫后完全孵化潜能量的前列腺素，或者其类似物。本发明的这些及其它实施方案，特征以及优点将参考下列说明书以及附图而变得显而易见。
附图说明
图1是显示前列环素(PGI2)以及小鼠胚的完全孵化的图。用PGI2类似物培养2-细胞小鼠胚(伊洛前列素，1nM至10μM)。96小时后确定完全孵化率。3到5个独立实验的结果(每个实验17-20个胚)表示为平均值±S.D。ED50值约为6.7nM。
图2为显示完全孵化的加强以及前列环素(PGI2)暴露期间的柱状图(基于胚发育阶段的伊洛前列素暴露)。2-细胞小鼠胚在0.1μM伊洛前列素，PGI2类似物的存在下，显示的周期期间培养(表示为收获2-细胞胚后的小时数)。完全孵化率表示为平均值±S.D。胚暴露于伊洛前列素期间的发育阶段列于表中。2个阶段对于伊洛前列素的完全效果似乎很关键：24-42小时以及42-72小时，分别对应于从8-细胞胚至桑椹胚以及桑椹胚至早期胚泡的发育。各个阶段暴露于伊洛前列素确保了孵化的加强。独立观察的数目(每个有18-20个胚)为：对照，12；42-72个小时，3；其它的，4。对照胚中的完全孵化率不同于图1中的完全孵化率，可能是因为雄性小鼠来源的改变。
图3为显示小鼠胚中前列环素受体(IP)表达的Western印迹。来自60个小鼠胚泡(泳道1)的总细胞裂解物以及人血小板(阳性对照，泳道2)的微粒体的Western印迹分析显示了用抗人IP的抗体的免疫反应。小鼠IP的迁移小于人IP，分别与约50kDa以及约46kDa的预计分子量相一致。
图4A-E以及G为显示桑椹胚以及胚泡中前列环素受体(IP)的表达的显微照片。显示了2个桑椹胚的相差(图4A)以及IP染色(图4B)显影。透明带由箭头显示。图4C显示了胚泡中核的碘化丙啶鎓染色。图4D中胚泡的IP以及碘化丙啶鎓染色重叠。图4E显示了胚泡的IP染色，显示为网状模式。仅仅在滋养外胚层中观察到成簇的IP染色；显示内细胞团的染色没有加强。图4F为显示胚泡内内细胞团(ICM)位置的草图。图4G为显示仅仅滋养外胚层由IP抗体染色的胚泡的共焦点显微镜显影。截面由面板F中的划线显示。阴性对照，未受精的卵母细胞或者其它发育阶段(未显示)的胚中无IP染色。图中的线条为约20μm。
图5为显示结合于完整小鼠胚的伊洛前列素的柱状图。在5μM未标记的伊洛前列素的存在或者缺少的条件下用0.1μM 3H-伊洛前列素，PGI2类似物温育116个小鼠胚泡。由膜滤法分离结合以及游离的3H-伊洛前列素。
图6A-B显示了受孕载体的子宫中的怀孕胚囊。由植入位置血管供应的增加确定植入并由怀孕胚囊的存在进行证实。胚移植后72个小时，经尾部静脉对受孕的载体施用1％的芝加哥蓝并在3分钟后实施安乐死。图6A显示了围绕接受胚的子宫角的不连续的蓝色条带(由*显示)。在图6B中，每一蓝带对应于怀孕胚囊，其在开放的子宫角显示为粉红色组织。在没有接受胚的子宫角中(由箭头标明)没有发现蓝色条带或者怀孕的胚囊。
优选实施方案的详细描述
本公开在研究PGI2以及PGE2对精液以及胚影响的过程中，以及随后的调查中得以发展。我们最近的结果显示人[Huang，2002]以及小鼠[Huang，2004]输卵管上皮细胞表达对于PGI2的合成必需的酶，即COX-1或者COX-2以及PGI2合成酶。当用由人[Huang，2002]或者小鼠输卵管[Huang，2004]制备的微粒体温育14C-花生四烯酸时产生大量的PGI2以及PGE2。本研究也考虑了精液移动至远端输卵管使卵受精并且在输卵管中发生胚发育的最初72个小时的事实。
作为本研究的一部分，通过观察用PGI2类似物培养的小鼠胚的完全孵化评价PGI2对胚的影响。为了进一步阐明该机制，也由放射性标记的伊洛前列素研究了IP的表达以及胚的结合。
材料以及方法
试剂的来源以及制度的许可。
除非另有说明，试剂购自Sigma Co.(St.Louis，MO，USA)。由保护人受试者委员会(Committee for the Protection of Human Subjects)(相当于制度审查委员会)批准人样品的使用。实验动物的管理以及研究方案由动物福利委员会(Animal Welfare Committee)批准。
收获以及培养小鼠胚。
在受控温度，湿度以及光循环(12小时光/黑暗)条件下，允许自由摄取水以及食物饲养小鼠。由Harlan(Indianapolis，IN，USA)购买3-周龄C57B1/6雌性小鼠。最初由Harlan以后由The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME，USA)购买8-周龄C3H雄性小鼠。通过腹膜内注射孕马血清促性腺激素(5IU)，随后人绒毛膜促性腺激素(hCG，5IU)46小时后获得雌性小鼠中的超数排卵。接受hCG后，每只雌性小鼠与一只可繁殖的雄性小鼠配对。48小时以后，由输卵管收获2-细胞胚到补充有25mM HEPES以及1％BSA(Irvine Scientific)的α-MEM培养基中。
在37℃，5％CO2下在每孔含有600μl的培养基的4-孔平皿(NalgeNunc International，Naperville，IL，USA)中培养胚(每组17-20)。在96-小时期间顺序使用HTF以及α-MEM培养基以符合裂解胚的营养需求的改变[Gardner，1998]。在最初48小时期间使用HTF培养基(SAGEBiopharma)，并在第二48小时期间使用具有Earle′s盐以及2mM谷氨酰胺的α-MEM培养基(Irvine Scientific)。实验性的胚接受水中的伊洛前列素并且对照胚接受等量的水。初步试验显示超过95％的胚经96小时变成胚泡，类似于KSOM培养基中培养的胚(Specialty Media，Cell andMolecular Technologies，Inc.Phillipsburg，NJ，USA)。96-小时培养后，检查每一胚透明带的存在。完全不含透明带的胚被计算为完全孵化的胚。通过将完全孵化的胚除以胚的总数确定完全孵化率。将胚的完全孵化选作终点而不是胚泡形成或者胚孵化，因为后2个标记与成活怀孕的建立不相关[Lane，1997]。
Western印迹分析
小鼠IP(417a.a.，Genebank BAA05144)以及人IP(386 a.a.，Genebank_BAA06110)推断的氨基酸序列高度同源[Katsuyama，1994]。初步的研究证明亲和性-纯化的多克隆肽抗体(由Dr.Ke-He Ruan惠赠，University of Texas Health Science Center)与小鼠IP交叉-反应。如前所述进行Western印迹分析[Huang，2002]。简而言之，通过在10％丙烯酰胺凝胶(PAGE)上分离来自60个小鼠胚泡的总的细胞裂解物并转入硝化纤维膜(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH，USA)。通过用抗体温育并用加强的化学荧光(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)进行目测检测免疫活性蛋白质，利用STORM 860激光扫描器(Amersham Biosciences)检测。人血小板微粒体被用作阳性对照。利用预吸收的抗体在平行实验中证实抗体的特异性。
免疫组织化学，荧光显微术以及共聚焦显微镜术。
在4℃，在4％仲甲醛(pH7.4)中固定小鼠胚30分钟。用PBS冲洗3次后，室温下含有0.05％Tween-20，5％奶粉以及0.1％Triton X-100的Tris-缓冲盐封闭胚20分钟。用IP抗体(5ng/ml)的封闭缓冲液温育胚2小时，然后用偶联Alexa 488的山羊抗-兔IgG(2.5μg/ml，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)在37℃温育30分钟。在室温下用10μg/ml碘化丙啶鎓对细胞核复染20分钟。在Fluoromount-G(SouthernBiotechnology Associates Inc.，Birmingham，AL，USA)上封固胚。对于荧光显微术，将胚泡置于封固剂中并用盖玻片覆盖。对于共焦点显微镜术而言，将约50μm的间隔基置于玻片和盖玻片之间维持胚的三维形态。对于阴性对照而言，用10ng/ml的非免疫性兔IgG温育胚(即，初级抗体的两倍浓度)。
利用装备有合适的过滤器的Zeiss AxioPlan 2显微镜进行荧光显微术(Carl Zeiss，Baden-Wuerttemberg，Germany)。利用CCD照相机捕捉影像并通过AxioVision程序(3.0.6版本)处理。利用连接于OlympusBX-50显微镜的BioRad Radiance 2000共聚焦系统(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)进行共聚焦显微镜术。利用Image-Pro+程序处理影像(Media-Cybernetics，Carlsbad，CA，USA)。
全胚放射性配体结合分析
如前所述只进行稍微的修饰[Arbab，2002]进行3H-伊洛前列素与胚泡的结合分析。用结合缓冲液(10mM MnCl2的10mM HEPES溶液，pH 7.4)冲洗232个孵化的以及孵化中的胚泡然后转入有或者没有未标记伊洛前列素(5μM)的100μl的结合缓冲液。通过添加含有3H-伊洛前列素(200nM，比活度11.0Ci/mmol，Amersham Biosciences)的等量结合缓冲液启动反应并在室温下温育60分钟。通过将胚泡转入2ml的冰冷冲洗缓冲液(0.01％BSA的10mM HEPES溶液，pH7.4)终止反应。通过玻璃纤维过滤器(Whatman GF/C 2.4cm)过滤缓冲液以及胚泡并用2ml的冲洗缓冲液冲洗过滤物3次。通过用5ml的闪烁液体闪烁计数确定放射性之前在烘箱中干燥过滤物。
统计分析
适当时，使用Student′s t-检验或者单向方差分析继之以Dunnett检验。p＜0.05被认为是统计上显著的。剂量反应曲线的构建以及ED50值的计算(曲线斜率设置在1.0)由GraphPad Prism软件(GraphPad PrismSoftware公司，San Diego，CA，USA)完成。
胚转移
如上所述收获小鼠胚并培养随后由本发明人公开(Huang等人，2003)。简要地，由注射hCG后42小时的超数排卵的3-周龄C57B1/6雌性小鼠收获2-细胞胚(C3B6F1)。在37℃，5％CO2条件下于每个包含600μl HTF培养基(SAGE Biopharma，Bedminster，NJ，USA)的4-微孔平皿(Nalge Nunc International，Naperville，IL，USA)中培养胚(每组14个)。实验胚接受伊洛前列素(1μM，Caymen Chemical，Ann Arbor，MI，USA)的水溶液，对照胚接受等量水。两种情况下，水的体积都小于培养基的0.1％。
胚供体接受hCG第二天，从可能的受孕载体(8周龄C3B6F1雌性小鼠)获得阴道涂片确定发情周期的阶段。将那些发情的动物与切除输精管的ICR雄性小鼠(Harlan)配对并在随后的早晨检查阴道拴。具有阴道拴的动物被称为0.5天假孕。
在解剖显微镜(Olympus SZ-PT)下假孕的2.5天进行胚转移。通过腹膜内注射氯胺酮(200mg/Kg)以及甲苯噻嗪(10mg/Kg)(两者都获自Burns Vet Supply Inc.TX，USA)获得外科麻醉。经2-厘米的侧翼切口进入每个子宫角。邻近的输卵管由一对钳子固定，在子宫角的远端用30规格针在反肠系膜侧产生开口。该开口允许具有135μm内径的移液吸管的进入(MidAtlantic Diagnostics，Inc.NJ，USA)。将0.8μl的转移培养基(具有25mM HEPES以及1％BSA的αMEM)中高达7个胚转入每个角中。每次转移后，在立体显微镜下检验移液管的内容物以鉴定保留的胚。侧翼切口用9mm金属夹子(Clay Adams，Parsippany，NJ，USA)封闭。由于胚从一个角迁移到另一个角(与Dr.Andreas Zimmer，University of Bonn，Germany的私人联络)，为了避免对照和实验胚的混合，每一受孕载体接受对照或者实验胚。为了保持一致的转移技术，根据相同的方案以及由同一个个体进行胚转移，所述同一个个体对于被安排接受的处理不知情。为了保证两个组同样由研究过程(约6个月)获得的经验受益，在4个区块对胚安排处理(对照或者伊洛前列素)。
确定植入率
胚转移后72个小时，根据如前所述进行某些修改的方法(Paria等人，1993)确定植入。简要地，安乐死之前3分钟，经受孕载体的尾部静脉注射0.1ml的芝加哥蓝(1％)。对载体处死以后，除去子宫角。对围绕子宫角的离散的蓝色条带(显示为*)计数(图6A)。这些条带的存在反映了植入位点血管的维管供应的加强。然后打开子宫角并对怀孕的胚囊计数(图6B)。植入率表示为每个转移的胚怀孕胚囊的数目。
确定出生率以及幼仔和胎盘的重量
初步研究显示一些受孕的载体在其一窝产仔数较少时吃它们的幼仔。为了对幼仔精确计数以及称重，我们在胚转移后14天(怀孕的第16.5或者自然生产前2天)处死受孕的载体。实施安乐死后，对活幼仔进行计数并确定个体幼仔以及胎盘的重量。检查所有幼仔的大体异常情况。也对空怀孕胚囊的数目计数以便确定植入率。出生率表示为每转移胚活幼仔的数目；植入率表示为每转移胚有或者没有活幼仔的胚囊的数目。
统计分析
Fisher’s精确检验用来比较比率；Student′s t检验用来比较重量。p＜0.05被认为是统计上显著的。GraphPad Instal软件(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA，USA)用于统计分析。
结果
PGI2提高了小鼠胚的完全孵化。
小鼠胚的完全孵化由伊洛前列素以浓度依赖的方式得以提高。在0.1μM或者更高的浓度，效果在统计上是显著的(图1)。完全胚孵化的最大加强发生在1μM，其中81±7％(平均值±S.D.n＝3)的实验胚完全孵化。相比之下，只有49±14％(平均值±S.D.n＝5)的对照胚完全孵化。来源于剂量反应曲线的ED50值为6.7nM(图1)。饱和浓度依赖的应答以及6.7nM的ED50值显示伊洛前列素的效果由受体介导。
对于加强孵化很关键的PGI2暴露时间以及胚的发育阶段。
因为胚在进入子宫之前经历了几个发育阶段，我们研究了针对伊洛前列素的发育阶段特异性应答。我们的结果显示96-小时培养期间的一些时间比其它时间更重要。在最初的24小时培养期间(在这期间大多数2-细胞胚发育成8-细胞胚)暴露于伊洛前列素并不加强孵化(图2)。另一方面，收获以后0-72小时或者24-72小时之间暴露于伊洛前列素与0-96小时暴露产生相同的完全孵化比率(图2)。
确保伊洛前列素的全部效果的暴露于伊洛前列素的2个关键时间是在收获后24至42小时以及42至72小时之间，分别对应于从8-细胞胚向桑椹胚以及由桑椹胚向早期胚泡的转化(图2底部的表)。我们的数据显示将胚简短暴露于PGI2加强了完全孵化的潜能，甚至在胚离开输卵管后。
小鼠胚表达IP。
为了研究小鼠胚中发育阶段-特异性表达IP，在不同的发育阶段我们在胚泡上进行了Western印迹分析并在胚上进行了免疫组织化学分析。Western印迹分析显示由亲合性-纯化的抗IP抗体检测到期望分子量的蛋白(图3)。荧光显微术显示IP染色存在于桑椹胚以及胚泡(图4A-E)而不是在未受精卵中，或者在单细胞，2-细胞，4-细胞以及8-细胞胚中(未显示)。桑椹胚以及胚泡中IP染色均具有相同的精细网状模式。共聚焦显微镜术显影显示IP在滋养外胚层中优选表达(图4G)。因此，由小鼠胚阶段-特异性表达IP与对伊洛前列素的反应一致。
放射性标记的伊洛前列素与小鼠胚结合。
由伊洛前列素浓度依赖性加强的完全胚孵化显示所述效果是由受体介导的。我们进行了放射性配体结合分析以进一步证实小鼠胚由伊洛前列素结合。我们选择在0.1μM的配体水平对伊洛前列素结合进行定量，其中首先观察到孵化加强并发现大约3.04fmol的3H-伊洛前列素与116个胚泡特异性结合(图5)。
讨论
我们的数据首次显示PGI2加强胚的完全孵化。这与先前报道小鼠胚与人输卵管的上皮细胞的共培养提高了胚的细胞数目，降低了细胞程序性死亡，并改进胚孵化相一致[Piekos，1995；Xu，2000；Xu，2001]。因此，输卵管-来源的PGI2以及血管内皮来源的PGI2以类似旁泌性方式发挥效果。前者加强胚孵化；后者阻止血小板凝聚。浓度-依赖的应答与受体-介导的事件相一致而6.7nM的ED50值类似于报道的来自人血小板的溶解的IP(8nM)的Kd值[Tsai，1989]。
胚对伊洛前列素的应答是发育阶段特异性的并与IP的表达相一致(图2)。应答的这些关键时间与小鼠胚在输卵管中的逗留相一致，在此期间受精卵发育成桑椹胚。相关的发育阶段也与人和小鼠胚中基因组的活化相一致，其分别发生在4-和8-细胞阶段之间以及二细胞阶段后[Tesarik，1986；Tesarik，1988；Braude，1988]。
不希望限于IP如何发挥其效果的特定理论，我们提出发育早期暴露于输卵管-来源的PGI2或者PGE2的胚当他们达到子宫时维持加强的孵化潜能。通过输卵管-来源的PGI2，胚主动准备其自身的植入，虽然他们尚在输卵管中。从胚的角度，输卵管-来源的PGI2补充子宫内膜-来源的PGI2，其介导子宫内膜的脱落确保接收性[Lim，1999]。
不希望限于特定的理论，我们提出由PGI2或者PGE2介导的加强孵化可归于胚细胞数目的增加。不同的机制涉及小鼠胚体外以及体内的孵化。体外孵化包括胚泡膨胀，带破裂之前引起总带变细，而体内孵化包括由子宫或者滋养外胚层溶胞素全面的带溶解[Montag，2000]。因此，足够高数量的胚细胞是完成体外孵化所需的。在这方面，我们的结果与胚与输卵管上皮细胞的共培养具有更多细胞，更少细胞死亡，以及提高孵化的发现相一致[Yeung，1992；Xu，2000]。此外，PGI2可以提高由滋养外胚层产生胰蛋白酶类蛋白酶从而溶解带[Sawada，1990；Perona，1986]。
试管受精胚的低植入潜能(每胚10-20％)[CDC，2001]部分归因于次最佳的培养条件[De Vos，2000]。已经改进了培养基以便提高体外胚发育[Gardner，1998]。根据我们的数据，补充有PGI2和/或PGE2类似物诸如伊洛前列素，PGE1的培养基可以为胚发育提供改良的环境并提高其植入潜能。
最后，PGI2加强培养的小鼠胚的完全孵化。由小鼠胚阶段-特异性表达IP与其对PGI2的反应一致。最后，根据我们的初始数据，PGE2也加强培养的小鼠胚的完全孵化。
在更进一步的研究中，我们证明了补充有PGI2的培养基加强小鼠胚的植入以及潜在的活产。这些结果证实了我们最初观察到的PGI2加强培养中的小鼠胚的完全孵化[Huang，2003]；他们同时支持了我们假设的输卵管-来源的PGI2可以提供生理功能[Huang，2002]。
表1显示PGI2加强了小鼠胚的植入潜能。将84个对照胚以及81个伊洛前列素-处理的胚转入12个受孕的载体。72小时后，在伊洛前列素-处理组中发现比对照组更多的怀孕胚囊(76％对比42％，相关风险1.84，95％置信区间1.38-2.43，p＜0.0001)。在转移时，可比较胚的发育阶段。
表2显示PGI2伊洛前列素加强了小鼠胚的活产潜能。分别将406个对照胚以及415个伊洛前列素-处理的胚转入30以及31只受孕的载体。对照以及实验组的出生率分别是28％以及36％(p＝0.0017，相关风险1.28，95％置信区间：1.044-1.560)。幼仔以及胎盘的重量是可比较的。因此，PGI2提高了小鼠胚的活产潜能而不影响幼仔或者胎盘的重量。此外，记录没有大体的异常情况。
如上所述，大约70％的实验以及对照胚在转移时为桑椹期(表1)，然而转移的实验胚产生更多的怀孕胚囊。这些结果证实了我们先前观察的在8-细胞和桑椹期之间暴露于PGI2足以加强小鼠的完全孵化[Huang，2003]。它们也与输卵管-来源的PGI2作为胚营养素因子相一致，因为受精的小鼠卵在输卵管内发育成桑椹胚[Snell，1966]。
以上现象显示PGI2引发一连串的事件最终加强孵化，植入并提高活产率。在这点上，PGI2使人想起血小板活化因子(PAF)，其中短时间暴露于PAF提高小鼠[O′Neill，1998]以及人胚[O′Neill，1989]的植入。由PGI2引发的分子以及细胞事件对孵化非常重要。它们可以包括提高胚细胞数目[Montag，2000]，加强由滋养外胚层胰蛋白酶类蛋白酶的产生[Sawada，1990；Perona，1986]，加强应归于加强滋养外胚层的Na+-K+-ATP酶系统的囊胚腔膨胀[Biggers，1988]或者还有待于发现的机制。
当转移后分别在72小时或者14天检查时可比较对照胚的植入率(42％以及46％)。另一方面，转移后14天检验的实验胚的植入率(59％)比转移后72小时检验的植入率显著低(p＝0.038)(76％)。在实验组中由于植入位点的聚集更多胚囊被完全再吸收是合理的。或者，伊洛前列素“拯救”一些可能不会植入的胚并且只有一小部分那些“拯救的”胚发育成活幼仔。本研究的结果以及由人[Huang，2002]以及小鼠[Huang，2004]输卵管产生大量的PGI2显示PGI2是由输卵管分泌的一种胚营养素因子，并且因此用PGI2类似物补充胚培养基应该改进IVF的结果。
用加强胚发育或者植入的物质补充IVF培养基已经由大多数实验室以及小心翼翼的培养基厂商采用。可以关注包括关于再生毒物学，致畸性，以及这种操作的可能外生效应的问题。来自培养在补充有人血清的培养基中的绵羊胚的羊羔更重并具有更长的怀孕期[Thompson，1995；Holm，1996；Sinclair，1999]。包括过度生长以及肿瘤形成，Beckwith-Wiedermann综合症的先天紊乱与辅助的再生技术有关[DeBaun，2002；Maher，2003]。
对伊洛前列素的再生毒理学研究[Battenfeld，1995]显示胚以及胎儿发育不影响兔以及猴，但是在大鼠中观察到足趾减少。足趾异常可能应归于引起受影响结构的氧不足的子宫胎盘流动性的降低而非伊洛前列素的先天致畸性，因为伊洛前列素是血管扩张剂并在整个怀孕期中研究的动物接受伊洛前列素。类似缺陷可以由具有不同化学结构的血管扩张剂诸如肼苯哒嗪以及二氢吡啶诱导。在当前的研究中，暴露于伊洛前列素发生在胚植入前期间。在246只检验的活幼仔中，没有足趾减少或者其它的异常并且2组之间幼仔以及胎盘的重量相仿。尽管如此，用PGI2类似物补充IVF培养基应该被认为是一个实验方案。
在这些示范性研究中，我们证明PGI2加强了小鼠胚的植入以及活产潜能不影响胎儿或者胎盘的重量，即前列环素不加重胎盘或者婴儿。这是独立于植入以及活产加强的优点，并且显示前列环素不同于加强植入以及活产的其它试剂。先前报道加强植入以及活产的试剂也加重婴儿，使那些试剂不适合于人的体外受精(IVF)应用。而且，因为在体内小鼠模型中前列环素不影响胎盘以及婴儿的重量，其可以考虑用于人IVF胚中。
上述小鼠胚的体内试验获得的结果被认为是在包括人的其它哺乳动物胚可能获得的类似有利的体内结果的代表或者预言，即当那些胚在转入子宫之前被类似地用前列腺素或者前列腺素体外处理时。当前人IVF包括向患者的子宫转移8-细胞阶段或者胚泡阶段的胚。在这方面，人IVF类似于包括向受孕的载体转移对照或者前列环素类似物处理的胚的我们的实验设计。我们的数据显示，当转入受孕的载体时，8-细胞和桑椹期之间暴露于前列环素类似物的实验胚具有比对照胚显著高的植入率以及活产率(分别如表1以及2所示)。
表1
| 处理 | P | ||
| 对照 | 伊洛前列素 | ||
| 总转移的胚 | 84 | 81 | |
| 退化的 | 0 | 0 | n.s. |
| 桑椹胚 | 48 | 49 | n.s. |
| 早期胚泡+ | 12 | 8 | n.s. |
| 晚期胚泡+ | 24 | 22 | n.s. |
| 正孵化的胚泡 | 0 | 2 | n.s. |
| 怀孕胚囊的数目 | 35(42％) | 62(76％) | ＜0.0001* |
n.s.不显著
*Fisher’s精确检验，相关风险1.84(95％置信区间：1.39-2.43)
+早期和晚期胚泡表示囊胚腔分别占据＜49％和≥50％的胚。
表2
| 处理 | P | ||
| 对照 | 伊洛前列素 | ||
| 总转移的胚 | 406 | 415 | |
| 怀孕载体的数目 | 30 | 31 | |
| 活幼仔的总数 | 115(28％) | 149(36％) | 0.017* |
| 幼仔重量(gm**) | 0.788±0.151 | 0.772±0.124 | n.s. |
| 胎盘重量(gm**) | 0.166±0.037 | 0.166±0.003 | n.s. |
n.s.不显著
*Fisher’s精确检验，相关风险1.28(95％置信区间：1.04-1.56)
**表示为平均值±S.D。
1.Arbab，F.，Goldsby，J.，Matijevic-Aleksic，N.，Huang，G.，Ruan，K.H.，and Huang，J.C.(2002)Prostacyclin is an autocrine regulator in the contraction of oviductal smoothmuscle.Hum Reprod.17，3053-9.
2.Battenfeld，R.，Schuh，W.，and Schobel，C.(1995)Studies on reproductive toxicity ofiloprost in rats，rabbits and monkeys.Toxicol Lett.78，223-34.
3.Biggers，J.D.，Bell，J.E.，and Benos，D.J.(1988)Mammalian blastocyst：transportfunctions in a developing epithelium.Am J Physiol.255，C419-32.
4.Braude，P.，Bolton，V.，and Moore，S.(1988)Human gene expression first occursbetween the four-and eight-cell stages of preimplantation development.Nature.332,459-61.
5.CDC.(2001).“ART Cycles Using Fresh，Nondonor Eggs or Embryos.”1999 AssistedReproductive Technology Success Rates，National Summary and Fertility Clinic Reports，U.S. Department of Health and Human Services Center for Disease Control andPrevention，35.
6.De Vos，A.，and Van Steirteghem，A.(2000)Zona hardening，zona drilling and assistedhatching：new achievements in assisted reproduction.Cells Tissues Organs.166,220-7.
7.DeBaun，M.R.，Niemitz，E.L.，and Feinberg，A.P.(2002)Association of In VitroFeltilization with Beckwith-Wiedemann Syndrome and Epigenetic Alterations of LIT1and H19.Am J Hum Genet.72，1.
8.Gardner，D.K.(1998)Changes in requirements and utilization of nutrients duringmammalian preimplantation embryo development and their significance in embryoculture.Theriogenology.49，83-102.
9.Holm，P.，Walker，S.K.，and Seamark，R.F.(1996)Embryo viability，duration ofgestation and birth weight in sheep after transfer of in vitro matured and in vitro fertilizedzygotes cultured in vitro or in vivo.J Reprod Fertil.107，175-81.
10.Huang，J.C.，Arbab，F.，Tumbusch，K.J.，Goldsby，J.S.，Matijevic-Aleksic，N.，and Wu，K.K.(2002)Human Fallopian Tubes Express Prostacyclin(PGI)Synthase andCyclooxygenases and Synthesize Abundant PGI.J Clin Endocrinol Metab.87，4361-4368.
11.Huang，J.C.，Goldsby，J.S.，Arbab，F.，Melham，Z.，Alecsic，N.，and Wu，K.K.(2004)Oviduct Prostacyclin Functions as a Paracrine Factor to Augment the Development ofEmbryos.Hum Reprod.in press.
12.Huang，J.-C.，Wun，W.-S.A.，Goldsby，J.S.，Wun，I.C.，Falconi，S.M.，and Wu，K.K.(2003)Prostacyclin enhances embryo hatching but not sperm motility.Hum.Reprod.，18，2582-2589.
13.Katsuyama，M.，Sugimoto，Y.，Namba，T.，Irie，A.，Negishi，M.，Narumiya，S.，andIchikawa，A.(1994)Cloning and expression of a cDNA for the human prostacyclinreceptor.FEBS Lett.344，74-8.
14.Lane，M.，and Gardner，D.K.(1997)Differential regulation of mouse embryodevelopment and viability by amino acids.J Reprod Fertil.109，153-64.
15.Lim，H.，Gupta，R.A.，Ma，W.G.，Paria，B.C.，Moller，D.E.，Morrow，J.D.，DuBois，R.N.，Trzaskos，J.M.，and Dey，S.K.(1999)Cyclo-oxygenase-2-derived prostacyclinmediates embryo implantation in the mouse via PPARdelta.Genes Dev.13，1561-74.
16.Lim，H.，Paria，B.C.，Das，S.K.，Dinchuk，J.E.，Langenbach，R.，Trzaskos，J.M.，andDey，S.K.(1997)Multiple female reproductive failures in cyclooxygenase 2-deficientmice.Cell.91，197-208.
17.Maher，E.R.，Brueton，L.A.，Bowdin，S.C.，Luharia，A.，Cooper，W.，Cole，T.R.，Macdonald，F.，Sampson，J.R.，Barratt，C.L.，Reik，W.，and Hawkins，M.M.(2003)Beckwith-Wiedemann syndrome and assisted reproduction technology(ART).J MedGenet.40，62-64.
18.Montag，M.，Koll，B.，Holmes，P.，and van der Ven，H.(2000)Signficance of the numberof embryonic cells and the state of the zona pellucida for hatching of mouse blastocysts invitro versus in vivo.Biol Reprod.62，1738-44.
19.Murata，T.，Ushikubi，F.，Matsuoka，T.，Hirata，M.，Yamasaki，A.，Sugimoto，Y.，Ichikawa，A.，Aze，Y.，Tanaka，T.，Yoshida，N.，Ueno，A.，Oh-ishi，S.，and Narumiya，S.(1997)Altered pain perception and inflammatory response in mice lacking prostacyclinreceptor.Nature.388，678-82.
20.O′Neill，C.(1998)Autocrine mediators are required to act on the embryo by the 2-cellstage to promote normal development and survival of mouse preimplantation embryos invitro.Biol Reprod.58，1303-9.
21.O′Neill，C.，Ryan，J.P.，Collier，M.，Saunders，D.M.，Ammit，A.J.，and Pike，I.L.(1989)Supplementation of in-vitro fertilisation culture medium with platelet activating factor.Lancet.2，769-72.
22.Paria，B.C.，Huet-Hudson，Y.M.，and Dey，S.K.(1993)Blastocyst′s state of activitydetermines the″window″of implantation in the receptive mouse uterus.Proc Natl AcadSci USA.90，10159-62.
23.Perona，R.M.，and Wassarman，P.M.(1986)Mouse blastocysts hatch in vitro by using atrypsin-like proteinase associated with cells of mural trophectoderm.Dev Biol.114，42-52.
24.Piekos，M.W.，Frasor，J.，Mack，S.，Binor，Z.，Soltes，B.，Molo，M.W.，Radwanska，E.，and Rawlins，R.G.(1995)Evaluation of co-culture and alternative culture systems forpromoting in-vitro development of mouse embryos.Hum Reprod.10，1486-91.
25.Sawada，H.，Yamazaki，K.，and Hoshi，M.(1990) Trypsin-like hatching protease frommouse embryos：evidence for the presence in culture medium and its enzymaticproperties.J Exp Zool.254，83-7.
26.Sinclair，K.D.，McEvoy，T.G.，Maxfield，E.K.，Maltin，C.A.，Young，L.E.，Wilmut，I.，Broadbent，P.J.，and Robinson，J.J.(1999)Aberrant fetal growth and development afterin vitro culture of sheep zygotes.J Reprod Fertil.116，177-86.
27.Snell，G.D.，and Stevens，L.C.(1966).“Early embryology.”Biology of the LaboratoryMouse by the staff of the Jackson Laboratory.E.L.Green，ed.，Blakiston Division，McGraw-Hill Book Company，New York，205-245.
28.Tesarik，J.，Kopecny，V.，Plachot，M.，and Mandelbaum，J.(1986)Activation of nucleolarand extranucleolar RNA synthesis and changes in the ribosomal content of humanembryos developing in vitro.J Reprod Fertil.78，463-70.
29.Tesarik，J.，Kopecny，V.，Plachot，M.，and Mandelbaum，J.(1988)Early morphologicalsigns of embryonic genome expression in human preimplantation development asrevealed by quantitative electron microscopy.Dev Biol.128，15-20.
30.Thompson，J.G.，Gardner，D.K.，Pugh，P.A.，McMillan，W.H.，and Tervit，H.R.(1995)Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-elongationdevelopment of ovine embryos.Biol Reprod.53，1385-91.
31.Tsai，A.L.，Hsu，M.J.，Vijjeswarapu，H.，and Wu，K.K.(1989)Solubilization ofprostacyclin membrane receptors from human platelets.J Biol Chem.264，61-7.
32.Xu，J.，Cheung，T.M.，Chan，S.T.，Ho，P.C.，and Yeung，W.S.(2000)Human oviductalcells reduce the incidence of apoptosis in cocultured mouse embryos.Fertil Steril.74，1215-9.
33.Xu，J.S.，Cheung，T.M.，Chan，S.T.，Ho，P.C.，and Yeung，W.S.(2001)Temporaleffect of human oviductal cell and its derived embryotrophic factors on mouse embryodevelopment.Biol Reprod.65，1481-8.
34.Yeung，W.S.，Ho，P.C.，Lau，E.Y.，and Chan，S.T.(1992)Improved development ofhuman embryos in vitro by a human oviductal cell co-culture system.Hum Reprod.7，1144-9.
不经更进一步的描述，可以相信本领域技术人员可以使用本发明的描述最大程度利用本发明。上述实施方案是说明性的，而非以任何方式限制其余的公开。虽然本发明的优选实施方案已经显示并描述，本领域技术人员在不背离本发明的精神和教导的条件下可以对其进行修改。在这里描述的实施方案只是示范性的，而非限制性的。可以对这里公开的本发明进行许多改变以及修改并在本发明的范围内。在本发明的发明背景中论述的参考文献不是本发明的现有技术，尤其公开日在本发明的优先权日以前的文献。所有的专利，专利申请以及在这里引用的公开在此处引入参考，对在这里列举的文献提供示范性，程序上或者其它的详细补充。
Claims (16)
1.加强哺乳动物胚体外发育的方法，包括用有效促进胚完全孵化量的前列腺素或者其类似物补充培养基。
2.权利要求1的方法，其中所述前列腺素为前列环素(PGI2)或者前列腺素E2(PGE2)。
3.权利要求1的方法，其中所述前列腺素类似物为伊洛前列素或者前列腺素E1(PGE1)。
4.权利要求1的方法，其中所述培养基的补充是在胚早期发育阶段期间进行，在该期间基因组被活化，受精卵发育成桑椹胚。
5.权利要求1的方法，其中所述胚为人并且所述早期发育阶段开始于4-至8-细胞阶段。
6.权利要求1的方法，其中所述培养基的补充在胚的桑椹胚至早期胚泡发育阶段期间进行。
7.权利要求1的方法，其中所述培养基的补充在胚的早期发育阶段至桑椹期发育期间以及桑椹胚至早期胚泡发育阶段期间进行。
8.权利要求1的方法，其中所述胚为小鼠并且所述补充包括将培养的胚在收获2-细胞发育阶段的胚后24至42小时之间暴露于前列腺素或者类似物。
9.权利要求1的方法，其中所述胚为小鼠并且所述补充包括将胚在收获2-细胞发育阶段的胚后42至72小时之间暴露于所述前列腺素或者其类似物。
10.提高体外受精胚体内植入潜能的方法，包括：
根据权利要求1的方法加强胚的体外发育，由此加强胚的孵化潜能并提高体内植入潜能。
11.权利要求9的方法，包括使所述胚完全孵化，其中完全孵化包括从透明带释放所述胚。
12.权利要求10的方法，包括将所述胚植入哺乳动物宿主的子宫以及使所述完全孵化与成活怀孕的建立相关。
13.提高体外受精的哺乳动物胚活产潜能的方法，包括：
根据权利要求1的方法加强胚的体外发育，从而实现胚的加强孵化或者加强孵化潜能；
将具有加强孵化潜能的胚引入哺乳动物宿主的子宫；以及
使引入的胚植入所述子宫，其中胚植入宿主子宫的能力相对于植入类似宿主的子宫但没有这种加强的胚加强。
14.提高体外受精的哺乳动物胚群体出生率的方法，包括：
根据权利要求1的方法加强所述胚的体外发育，从而实现胚的加强孵化或者加强孵化潜能；
将具有加强孵化潜能的胚引入哺乳动物宿主；以及
使植入的胚体内生长，使得具有加强孵化或者加强孵化潜能的活产率大于植入但没有这种加强的胚的活产率。
15.用于哺乳动物胚体外早期发育的改进的细胞培养基，其中的改进包括补充有效促进所述胚体外完全孵化量的前列腺素或者其类似物。
16.权利要求15的培养基，其中前列腺素或者其类似物的所述量可在所述胚从体外培养取出并转入哺乳动物宿主的子宫后有效加强所述胚的完全孵化潜能。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50116603P | 2003-09-08 | 2003-09-08 | |
| US60/501,166 | 2003-09-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1863905A true CN1863905A (zh) | 2006-11-15 |
Family
ID=37390830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200480029052 Pending CN1863905A (zh) | 2003-09-08 | 2004-09-08 | 通过用前列腺素或前列腺素类似物补充培养基加强体外胚发育的方法以及组合物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007504807A (zh) |
| CN (1) | CN1863905A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101600426B (zh) * | 2006-12-28 | 2012-07-25 | 雷瑟尔股份有限公司 | 用于治疗肠道疾病的异山梨醇单硝酸酯衍生物 |
| CN110819585A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 山东大学 | 含有igf2的胚胎体外培育方法和培养基 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010010201A1 (es) | 2008-07-22 | 2010-01-28 | Equipo Ivi Investigacion Sl | Perfil de expresion genetica como marcador de la receptividad endometrial |
| EP2348318A1 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-27 | Equipo Ivi Investigación, S.L. | Diagnostic method for endometrial receptivity |
| US11129851B2 (en) | 2014-06-17 | 2021-09-28 | Igenomix S.L. | Stem cell therapy in endometrial pathologies |
-
2004
- 2004-09-08 CN CN 200480029052 patent/CN1863905A/zh active Pending
- 2004-09-08 JP JP2006525526A patent/JP2007504807A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101600426B (zh) * | 2006-12-28 | 2012-07-25 | 雷瑟尔股份有限公司 | 用于治疗肠道疾病的异山梨醇单硝酸酯衍生物 |
| CN110819585A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 山东大学 | 含有igf2的胚胎体外培育方法和培养基 |
| CN110819585B (zh) * | 2018-08-09 | 2022-12-06 | 山东大学 | 含有igf2的胚胎体外培育方法和培养基 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007504807A (ja) | 2007-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100335625C (zh) | 来自有蹄动物胚胎的培养内细胞团细胞系 | |
| CN1265600A (zh) | 用来自分化细胞的供体核克隆猪的方法 | |
| US7709259B2 (en) | Enhancement of mammalian embryo development | |
| CN112574944A (zh) | 基于体外诱导eps发育形成类囊胚结构的方法 | |
| Chojnacka-Puchta et al. | Obtaining chicken primordial germ cells used for gene transfer: in vitro and in vivo results | |
| US10947562B2 (en) | Methods for making and using modified oocytes | |
| CN109182340B (zh) | 一种ox40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用 | |
| Terada et al. | Essential roles of the sperm centrosome in human fertilization: developing the therapy for fertilization failure due to sperm centrosomal dysfunction | |
| CN1863905A (zh) | 通过用前列腺素或前列腺素类似物补充培养基加强体外胚发育的方法以及组合物 | |
| CN104789592A (zh) | 一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用 | |
| CN103674653B (zh) | 一种原始生殖细胞的爬片方法 | |
| Dong et al. | Generation of chimeric piglets by injection of embryonic germ cells from inbred Wuzhishan miniature pigs into blastocysts | |
| JP3639898B2 (ja) | ブタ体外生産胚の体外培養用培養液及び該培養液を用いたブタ体外生産胚の体外培養方法 | |
| Yoshimatsu et al. | A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as “Uteroid” and “Oviductoid” | |
| JP7578306B2 (ja) | 動物の製造方法 | |
| CN109112160B (zh) | 一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法 | |
| CN113862219A (zh) | 一种用于猪胎盘滋养层类器官培养的分子培养基 | |
| JPWO2017061097A1 (ja) | 培養容器の表示用シール | |
| Olsson et al. | Live births from urine derived cells | |
| JP5234535B2 (ja) | 哺乳動物未成熟卵子の体外成熟培養用添加剤及びそれを用いた成熟卵子の作出方法 | |
| Nguyen et al. | Generation of allogenic chimera carrying mutations in PDX1 and TP53 genes via phytohemagglutinin-mediated blastomere aggregation in pigs | |
| Goel et al. | Status and prospects of reproductive biotechnologies of small ruminants in India: an overview | |
| JPWO2015056727A1 (ja) | 低受胎率受精卵の発生率改善培地 | |
| CN118389597B (zh) | 一种小鼠全能性干细胞的获得方法 | |
| CN113234666B (zh) | 组蛋白甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1098506 Country of ref document: HK |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061115 |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1098506 Country of ref document: HK |