CN1837348A - 一种球虫卵囊培养液和保存液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种球虫卵囊培养液和保存液，其特征在于，该培养液和保存液是采用氯胺T与纯净水以(0.5－8.0)∶100的比例经充分摇匀制备而构成的氯胺T溶液。从含卵囊的鸡粪便中分离和纯化出新鲜的球虫卵囊后，将卵囊沉淀物悬浮于所述氯胺T溶液培养液中，培养液的培养温度25℃～30℃、培养湿度50％以上、卵囊密度不超过100万个卵囊/ml、培养液深度不超过0.7cm、每天轻轻搅拌培养液3次以上，培养时间为24～72小时；当有80％以上的卵囊完成孢子化时，停止培养，收获卵囊培养液，离心浓缩后重新加入上述氯胺T溶液保存液中置4℃～8℃冰箱中保存即可。上述培养液和保存液具有显著提高了球虫卵囊的孢子化率，避免重金属物质在鸡体的残留和环境污染的优点。

Description

一种球虫卵囊培养液和保存液

技术领域：

本发明属于一种兽用疫苗病原体培养液和保存液，更确切地说，本发明采用氯胺T液作为鸡球虫病疫苗球虫卵囊的培养液和保存液。

背景技术：

鸡球虫病是危害集约化养鸡业的主要疾病之一，近年来对其防治仍以药物为主。然而，随着抗球虫药物的广泛和连续使用，耐药性与药物残留两大问题日趋严重，引起了全世界的警觉。随着绿色畜牧业的到来，使用球虫病疫苗免疫预防鸡球虫病是大势所趋。鸡球虫病疫苗经历了非致弱虫株疫苗(球虫卵囊强毒活疫苗)到致弱虫株疫苗(球虫卵囊弱毒活疫苗)，再到球虫亚单位疫苗和重组疫苗的发展历程。但迄今为止，生产上使用的鸡球虫病疫苗主要还是前两种疫苗。鸡球虫卵囊活疫苗的生产工艺跟病毒、细菌病类疫苗的生产有很大的不同，这主要与鸡球虫特有的发育繁殖方式有关。孢子化球虫卵囊感染鸡只后，在肠道粘膜上皮内经4～6天的发育，形成大量卵囊随粪便排出体外。排出的卵囊在体外必须经过一个孢子化过程，形成子孢子，才重新具有感染性。球虫卵囊孢子化需要合适的温度、湿度及充足的氧气。培养球虫卵囊所要求的合适温度、湿度条件是容易创造的，但从粪便中分离、收集的球虫卵囊会或多或少地带有细菌，培养球虫卵囊时细菌的大量繁殖常常竞争消耗氧气，所以，培养液应添加抑制细菌生长的物质。2.5％重铬酸钾液是一种强氧化剂，它既可提供氧气也可抑制细菌的生长繁殖，一直是作为常规的球虫卵囊培养液和保存液被广泛使用。但重铬酸钾是一种重金属化合物，长期使用会在动物机体和环境中残留，影响人类和动物健康。随着人民生活水平的不断提高，全社会对肉食品食用安全问题和环境保护问题越来越重视。寻找一种更加合适的球虫卵囊培养液和保存液成为球虫病疫苗研究者迫切需要解决的重要课题。

发明内容：

本发明的目的就是克服已有技术的一些缺点，在球虫病疫苗生产工艺上实现突破和创新，采用0.5％～8％氯胺T(Chloramine T)溶液取代常规的2.5％重铬酸钾溶液作为球虫卵囊培养液和保存液，避免了重金属物质在鸡体的残留和环境污染。

本发明是通过下述技术方案来实现的：一种球虫卵囊培养液和保存液，其特征在于，该培养液和保存液是采用氯胺T与纯净水以(0.5-8.0)∶100的比例经充分摇匀制备而构成氯胺T溶液。

所述培养液和保存液的培养和保存条件为：从含卵囊的鸡粪便中分离和纯化出新鲜的球虫卵囊后，将卵囊沉淀物悬浮于所述氯胺T溶液培养液中，培养液的培养温度25℃～30℃、培养湿度50％以上、卵囊密度不超过100万个卵囊/ml、培养液深度不超过0.7cm、每天轻轻搅拌培养液3次以上，培养时间为24～72小时；当有80％以上的卵囊完成孢子化时，停止培养，收获卵囊培养液，离心浓缩后重新加入上述氯胺T溶液保存液中置4℃～8℃冰箱中保存即可。

经过上述培养液和保存液处理的球虫卵囊，其孢子化率高达80％以上，无菌检验结果为阴性，且在4℃～8℃下保存9个月卵囊活力未受影响，效果优于传统的2.5％重铬酸钾溶液。

氯胺T是一种有机含氯衍生物，分子式为C₇H₇NClNO₂SNa·3H₂O，含24％的有效氯。氯胺T作为外用消毒剂已被应用于临床医学中，对细菌、病毒、真菌、芽胞均有杀灭作用。其作用机理是氯胺T溶于水后分解次氯酸，释放出活性氯，使微生物中的酶被氧化失效，破坏微生物正常的新陈代谢，使细菌死亡，从而达到杀菌的目的。氯胺本身亦有直接消毒作用，其杀菌活性在酸性中较强，碱性中因不易释出氯，因此杀菌作用减弱。氯胺生成次氯酸较次氯酸盐生成次氯酸慢，故消毒作用较弱而持久，刺激性、腐蚀性较小。

本发明通过氯胺T较弱而持久的杀菌作用，将卵囊培养时或保存时欲生长的细菌杀死，保证球虫卵囊生存所需的充足氧气，可作为球虫卵囊的培养液和保存液。另一方面，氯胺T最早是作为一种人医外用消毒剂而被发现，长期的应用证实它对动物体无毒性及残留，不污染环境。本发明在球虫病疫苗生产工艺上采用0.5％～8％氯胺T溶液取代常规的2.5％重铬酸钾溶液作为球虫卵囊培养液和保存液这一工艺的改进，在国内外尚属首创，未见有同类研究报道。

具体实施方式

本发明在球虫病疫苗生产工艺上采用0.5％～8％氯胺T溶液取代常规的2.5％重铬酸钾溶液作为球虫卵囊培养液和保存液，显著提高了球虫卵囊的孢子化率，避免了重金属物质在鸡体的残留和环境污染。

下面用实例进一步说明本发明的效果：

             例1氯胺T对球虫卵囊孢子发育的影响

1材料与方法

1.1培养液

阴性对照(纯净水)，阳性对照(2.5％重铬酸钾液)，0.5％、1％、2％、4％、8％氯胺T液。

1.2新鲜卵囊的准备

将球虫混合卵囊以1万个卵囊/只的剂量感染40只14日龄健康雏鸡，感染后第7天排卵囊高峰期间收集6小时内排出的粪便，按球虫疫苗制备的生产工艺分离与纯化出新鲜的球虫卵囊。

1.3试验分组及处理

将干净的球虫卵囊平分为7份，分别悬浮于上述所设计的7种培养液中，使培养密度为8万个卵囊/ml，置29℃培养箱中培养，每隔几个小时轻轻搅拌一次。分别于培养后14h、21h、28h和38h，用血球计数板计算出每组能进行孢子化的球虫卵囊数，计算出孢子化率。孢子化结束后，每组取0.1ml培养液，分别接种于营养琼脂平板上，置37℃培养3天，观察细菌生长情况。

2结果与结论

2.1球虫卵囊孢子化情况

结果见表1。从表1可以看出，当在2.5％重铬酸钾液培养24小时球虫卵囊有70％～80％已孢子化时，在0.5％、1％、2％、4％、8％氯胺T液组中的球虫卵囊已有80％～90％完全孢子化，后者高于前者。可见，使用0.5％～8％氯胺T溶液作为鸡球虫卵囊培养液，可显著提高球虫卵囊的孢子化率，其孢子化效果优于常规的2.5％重铬酸钾溶液。

       表1氯胺T对球虫卵囊孢子化率的影响试验

组别	不同培养时间球虫卵囊的孢子化率(％)
					14h	21h	28h	38h
	纯净水对照组	19	66	82					84

2.5％重铬酸钾组	31	70	82	86
					0.5％氯胺T组	45	82	88	89
1％氯胺T组	48	85	93	94
					2％氯胺T组	33	80	86	93
4％氯胺T组	42	81	85	91
					8％氯胺T组	43	88	90	93

2.2无菌检验结果

将各组培养液分别接种于营养琼脂平板上，置37℃培养3天，结果如下：纯净水对照组平板长满菌落；2.5％重铬酸钾液对照组平板长出3个菌落；0.5％、1％、2％、4％、8％氯胺T液组平板均无菌落生长。可见，氯胺T液能完全抑制细菌生长。

      例2球虫卵囊在0.5％～8％氯胺T液中保存其活力的测定

1材料与方法

1.1试验鸡及其饲养

从广东省农科院畜牧所购进合格岭南黄鸡种蛋，孵化至出壳，隔离饲养于火焰消毒过的铁丝笼中，饲喂无抗球虫药物的全价饲料，用前经70℃烘烤12h，饮用经煮沸处理的开水。试验前，检查粪便无球虫卵囊污染。

1.2鸡球虫病四价活疫苗

由佛山市正典生物技术有限公司研制，含柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)4个种，保存于0.5％～8％氯胺T液本实施例采用1％氯胺T溶液中。生产批号为20040001、20040002、20040003。

1.3攻击用虫株

为各疫苗株相应的亲代株，均由佛山市正典生物技术有限公司分离、鉴定和保存。

1.4试验分组及处理

将制备的3批鸡球虫病四价活疫苗分别于4℃冰箱保存0个月、3个月、6个月、9个月后，口服接种免疫3日龄雏鸡；另设一空白对照组。各组鸡在相同条件下隔离饲养(垫料上饲养，以木屑为垫料，饲养密度15只/m²)。免疫后28天，每鸡用强毒孢子化混合卵囊(含堆型艾美耳球虫10万个，其他3种球虫各5万个)口服攻击，观察5～7日，将所有鸡扑杀剖检，检查每只鸡适宜部位(柔嫩艾美耳球虫检查盲肠；毒害艾美耳球虫检查小肠中部和盲肠；巨型艾美耳球虫检查小肠中部；堆型艾美耳球虫检查十二指肠)的病变并记分。

2结果与结论

结果见表2。从表2可知，在4℃～8℃冰箱中保存了0个月、3个月、6个月、9个月的鸡球虫病四价活疫苗，在免疫3日龄雏鸡28天后均能产生良好的免疫力，表明球虫卵囊在0.5％～8％氯胺T液中4℃～8℃下保存9个月其活力未受影响。

         表2球虫卵囊在0.5％～8％氯胺T液中保存其活力测定结果

组别	疫苗批号	疫苗保存时间	试验鸡数	粪便记分	存活率(％)	病变记分
									盲肠	十二指肠	小肠中段
						免疫组1	20040001	0个月				20	0	100	0.55	0.36	1.22
3个月	20	0	100	0.57	0.33				1.17
								6个月		20	0	100	0.65	0.46	1.24
9个月	20	0	100	0.74	0.58				1.36

免疫组2	20040002	0个月	20	0	100	0.52	0.35	1.13
									3个月	20	0	100	0.55	0.38	1.14
		6个月	20	0	100	0.69	0.47	1.21
									9个月	20	0	100	0.83	0.75	1.39
		免疫组3	20040003	0个月	20	0	100	0.46								0.33	1.07
3个月	20								0	100	0.42	0.35	1.03
				6个月	20	0	100	0.75						0.36	1.22
9个月	20								0	100	0.86	0.65	1.35
				空白对照		0个月	20	++++						65	3.56	3.07	3.35
3个月	20	++++	65						3.59	3.02	3.26
						6个月	20	++++				65	3.55	3.06	3.41
9个月	20	++++	65						3.53	3.12	3.33

              例3鸡球虫病四价活疫苗对小鼠的急性毒性试验

1材料与方法

1.1试验动物

体重18～24g的昆明小鼠40只，雌雄各半，购自中山医科大学。试验前在恒定条件下饲养7天，健康情况及生理状况均表现良好。

1.2受试物

鸡球虫病四价活疫苗，批号20040001，由佛山市正典生物技术有限公司研制，内含0.5％～8％氯胺T液。

1.3试验分组及处理

将上述40只昆明小鼠随机分为4组，每组10只(雌雄各半)。停食4小时后，1～3组每只小鼠以灌胃途径分别给予鸡球虫病四价活疫苗(用前大力摇匀)10μl、50μl、100μl，第4组为空白对照组。灌服后连续观察7天，记录试验小鼠的中毒症状和发病时间、死亡数和死亡时间。若灌服4天后小鼠继续死亡，则延长观察时间至14天。

2结果与结论

如表3所示，试验小鼠分别给予相当于鸡球虫病四价活疫苗免疫鸡时推荐使用量(10ml/瓶，供1000羽份使用，即平均每羽10μl)1倍、5倍、10倍的灌服量时，小鼠无任何中毒症状，100％存活，表明氯胺T低剂量使用时对动物机体无毒性作用。

                   表3鸡球虫病四价活疫苗对小鼠的急性毒性试验结果

组别	灌服剂量(μl/只)	灌服量相当于实际用量的倍数	试验动物数	死亡动物数	死亡率(％)	存活率(％)
							1	10	1	10	0	0	100
2	50	5	10	0	0	100
							3	100	10	10	0	0	100
4	-	-	10	0	0	100

Claims (2)

1、一种球虫卵囊培养液和保存液，其特征在于，该培养液和保存液是采用氯胺T与纯净水以(0.5-8.0)∶100的比例经充分摇匀制备而构成的氯胺T溶液。

2、根据权利要求1所述的球虫卵囊培养液和保存液，其特征在于，所述培养液和保存液的培养和保存条件为：从含卵囊的鸡粪便中分离和纯化出新鲜的球虫卵囊后，将卵囊沉淀物悬浮于所述氯胺T溶液培养液中，培养液的培养温度25℃～30℃、培养湿度50％以上、卵囊密度不超过100万个卵囊/ml、培养液深度不超过0.7cm、每天轻轻搅拌培养液3次以上，培养时间为24～72小时；当有80％以上的卵囊完成孢子化时，停止培养，收获卵囊培养液，离心浓缩后重新加入上述氯胺T溶液保存液中置4℃～8℃冰箱中保存即可。