CN1835973A - 用于治疗隐球菌病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文所述的发明提供了在非人动物中生产的人抗体，其特异性地结合新型隐球菌荚膜葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)。本发明还提供了在非人动物中制备所述抗体和在细胞(包括杂交瘤和重组宿主细胞体系)中表达所述抗体的方法。除了通过给患者施用本文所述的抗体或组合物来诊断、治疗、抑制或预防新型隐球菌感染或由这样的感染造成的病症或障碍的方法外，本发明还提供了包含所述抗体的试剂盒和组合物。

Description

用于治疗隐球菌病的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)感染和由这种感染造成的病症的组合物和方法。本发明涉及能特异性地结合新型隐球菌荚膜葡萄糖醛酸木甘露聚糖(glucuronoxylomannan)(GXM)的人抗体和编码该抗体的核酸分子。本发明还涉及针对新型隐球菌GXM的人抗体的分离的重链和轻链免疫球蛋白分子。本发明还涉及编码这样的重链和轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。本发明还包含针对新型隐球菌GXM的人抗体，它们是嵌合的、双特异性的、衍生的、单链抗体或融合蛋白的一部分。本发明还涉及检测或监测新型隐球菌感染的方法。本发明还涉及在非人的动物中制备所述抗体和在细胞系(包括杂交瘤和重组宿主细胞系统)中表达所述抗体的方法。本发明还涉及包含所述抗体的试剂盒和药物组合物。本发明还涉及通过给患者施用本文所述的组合物，治疗或预防新型隐球菌感染和由这样的感染造成的病症的方法。

背景技术

新型隐球菌是一种重要的人病原体，且是人(特别是免疫受损(immunocompromised)的那些)发病率和死亡率的主要原因。尽管可以得到针对新型隐球菌有活性的抗真菌剂，隐球菌病在免疫受损的患者中多半不能治愈，因为不能完全根除该生物体。因而，治疗可能需要昂贵的终生的抗真菌预防或维持疗法来控制感染。

有几种治疗可以预防复发病，包括吡咯预防，它与高活性的抗逆转录病毒疗法一起，在发达国家已经降低了HIV-相关的隐球菌病的发病率。但是，隐球菌病在其它免疫受损的患者群体中是新出现的问题，且在发展中国家仍然是脑膜脑炎的主要原因。而且，由于使用抗真菌药物的延长时间的维持疗法，耐药菌株的发生率也在增加。因此，迫切需要预防和治疗隐球菌病的其它方法。

发明内容

本发明提供了分离的能特异性地结合新型隐球菌荚膜葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的人抗体。更具体地，本发明提供了能识别新型隐球菌GXM的单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7。单克隆抗体G15B4G5在被动免疫中能有效地针对新型隐球菌攻击提供保护作用。本发明还提供了在非人的动物中制备所述抗体和在细胞系(包括杂交瘤和重组宿主细胞系统)中表达所述抗体的方法。本发明还提供了包含所述抗体的试剂盒和药物组合物。而且，本发明提供了通过给患者施用本文所述的药物组合物，治疗或预防新型隐球菌感染和由这样的感染造成的病症的方法。

附图说明

图1显示了可溶的GXM对G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的抑制曲线。显示了ELISA结合。小图A显示了可溶的SB4对单克隆抗体与24067的结合的抑制；小图B显示了24067对单克隆抗体与24067的结合的抑制；小图C显示了可溶的SB4对单克隆抗体与H99的结合的抑制。将结合表示为，显示在y轴上的在405nm的吸光度(Abs)相对于x轴上所示的单克隆抗体浓度。

图2显示了使用单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7进行的被动免疫实验。

图3中的表对比了针对新型隐球菌GXM的单克隆抗体的CDR1和CDR2的一部分。粗体且标有下划线的残基是鼠和人XenoMouse^小鼠-来源的单克隆抗体共有的；粗体且斜体的残基是体细胞突变；斜体(未加粗)的残基是在抗体中类似的、但是在不同位置的残基；小写的残基与减小了的GXM结合相关联。Hu-人；Ms-小鼠。

具体实施方式

本发明提供了能特异性地结合新型隐球菌GXM的全人抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，全人抗体是单克隆的。其它的实施方案包括包含核苷酸序列的核酸分子，所述的核苷酸序列编码所述抗体的重链和轻链的全部或部分，和包含由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，尤其是包含互补决定区(CDR)的序列。还提供了与本文所述的抗体具有类似的结合性质的抗体和具有类似的功能性的抗体(或其它拮抗剂)。还提供了能表达这样的免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤。

除非本文中另有定义，在本发明中使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。一般地，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关地使用的术语和技术，是本领域熟知的和常用的那些。除非另有说明，通常根据本领域熟知的常规方法，和如本说明书引用和讨论的各种一般的和更具体的文献所述的，实施本发明的方法和技术。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，它们在这里引作参考。如本领域常用的或如本文所述的，根据生产商的说明书，进行酶反应和纯化技术。与本文所述的分析化学、合成有机化学和医学与药物化学有关地使用的术语及实验室操作和技术，是本领域熟知的和常用的那些。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、制剂及输送和治疗患者。

下面的术语具有下面的一般含义，如它们在本文中所使用的：

“B淋巴细胞或其后代”是指从B淋巴细胞系传下来或注定要成为B淋巴细胞系的任何细胞。实例包括但不限于从最早的B淋巴细胞干细胞开始直至记忆B细胞、浆细胞的B细胞发育途径中的所有B淋巴细胞，和体外建立的任何杂交瘤。

″双特异性的抗体″是对2个单独分开的抗原具有亲和力的单一抗体。例如，双特异性的抗体可以使用重链和轻链的一种组合识别新型隐球菌GXM，并可以使用与第一组合相连的重链和轻链的第二组合识别白细胞的细胞表面标记。参见，例如，McCormick等，J.Immunol.158：3474-82(1997)。

″嵌合抗体″是已经从它们的原始形式改变成包含来自另一种蛋白的氨基酸序列的抗体。嵌合抗体保留了至少一部分原始抗体氨基酸序列，典型地该部分包含抗原结合区(Fab)。嵌合抗体的实例包括但不限于双特异性的抗体和与其它非免疫球蛋白的蛋白序列的融合体。

“细胞因子”通常是指免疫系统的信号传递分子。细胞因子包括但不限于白介素(IL)，转化生长因子(TGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，淋巴毒素(LT)，干扰素，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞CSF，粒细胞CSF和迁移抑制因子。

“衍生”是指使非免疫球蛋白活性剂连到免疫球蛋白分子上的过程。衍生剂的实例包括但不限于毒素、补体、抗生素、肽、多糖、脂类、有机聚合物、放射标记和无机化合物。

“融合蛋白”是指包含2种或多种不同蛋白的氨基酸序列的嵌合蛋白。典型地，融合蛋白由本领域熟知的体外重组技术产生。但是，融合蛋白可以由体内交换或其它重组事件产生。

如本文所使用的，术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但是残余的氨基酸序列与天然存在的序列中的对应位置相同。片段典型地为至少5，6，8或10个氨基酸长，包括，例如，至少14个氨基酸长，至少20个氨基酸长，至少50个氨基酸长，和至少70个氨基酸长。

根据本说明书的教导，本领域的普通技术人员可以容易地制备出抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。通常，片段或类似物的氨基和羧基末端出现在功能域的边界附近。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或专有的序列数据库进行对比，可以鉴别出结构域和功能域。例如，使用计算机化的对比方法来鉴别出现在已知结构和/或功能的其它蛋白中的基序或预测的蛋白构象域。已知鉴别折叠成已知的三维结构的蛋白序列的方法(Bowie等，Science 253：164(1991))。

优选的氨基酸置换是这样的，它们：(1)能降低对蛋白水解的敏感性，(2)能降低对氧化的敏感性，(3)能改变形成蛋白复合物的结合亲和力，和(4)能赋予或修饰这种类似物的其它物理化学性质或功能性质。类似物可以包括除了天然存在的肽序列以外的序列的多种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域外的多肽部分)中制造单或多氨基酸置换(优选保守的氨基酸置换)。保守的氨基酸置换基本上不会改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应当趋向于破坏发生在亲本序列中的螺旋，或者破坏能表征亲本序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例记载在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introductionto Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature 354：105(1991)，它们各在这里引作参考。

如本文所使用的，20种常规氨基酸和它们的缩写遵守常规用法。见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，它在这里引作参考。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然的氨基酸例如α-，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规的氨基酸也可以是本发明的多肽的合适组成成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，s-N-甲基精氨酸，和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。根据标准用法和惯例，在本文所用的多肽表示法中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。

“人免疫球蛋白分子”是指具有由人免疫球蛋白基因序列编码的序列的免疫球蛋白。在一些实施方案中，蛋白由种系人基因序列编码。在其它的实施方案中，蛋白可以包含从人种系序列的突变。

“人单克隆抗体”指是一群具有相同特异性的人抗体的成员的抗体。可以在杂交瘤或其它无限增殖化细胞系中以及在能表达外源人抗体基因序列的重组细胞系中生产该人抗体群。

“免疫受损的患者”是指其对外来抗原或物质的免疫应答受到损害削弱的患者，例如，受到疾病(例如AIDS)、侵入手术、与治疗其它病有关的药物疗法(例如器官移植患者)的损害，或者由于遗传缺陷。

“毒素”是指为了杀死抗体已结合的细胞而连到抗体的蛋白或非蛋白化合物。毒素的实例包括但不限于补体、抗生素、肽、多糖、脂类、有机聚合物、放射标记和无机化合物。

“载体”是指能使目标核酸序列在它们的天然细胞外克隆、增殖、重组、突变或表达的核酸分子。载体经常具有能在特定条件下或在特定细胞中控制基因序列的表达的序列。

为了表达本发明的抗体或抗体部分，将如上所述得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使该基因可操作地连接到转录和翻译控制序列上。表达载体包括质粒、病毒、反转录病毒、粘粒、YAC、EBV-衍生的游离体等。将抗体基因连接到载体中，使载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因的转录和翻译的目标功能。选择的表达载体和表达控制序列能与使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中。在优选的实施方案中，将2个基因插入同一个表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或如果没有限制位点，则平端连接)，将抗体基因插入表达载体中。

一种便利的载体是能编码功能上完整的人C_H或C_L免疫球蛋白序列的载体，其具有适当的工程化设计的限制位点，使任意的V_H或V_L序列可以容易地插入和表达，如上所述。在这样的载体中，通常在插入的J区的拼接供体位点和在人C域之前的拼接受体位点之间发生拼接，也在存在于人C_H外显子内的拼接区发生拼接。聚腺苷酸化作用和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体还可以编码信号肽，它能促进抗体链从宿主细胞的分泌。可以将抗体链基因克隆进载体中，使信号肽符合读框地连接到免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。

除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带能控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。本领域的技术人员能够明白，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调节序列包括能在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达的病毒元件，例如源自反转录病毒LTR，巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)，猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子，多瘤和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调节元件和其序列的进一步描述，见，例如，Stinski的美国专利号5,168,062，Bell等的美国专利号4,510,245和Schaffner等的美国专利号4,968,615。

除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带其它序列，例如能调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于选择已经导入了载体的宿主细胞(见例如，Axel等的美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，典型地选择性标记基因会给已经导入了载体的宿主细胞赋予对药物(例如G418，潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。示例性的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞的氨甲蝶呤选择/扩增)，neo基因(用于G418选择)，和谷氨酸合成酶基因。

可以用编码抗-GXM抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体转染合适的哺乳动物宿主细胞。通过任何已知的将多核苷酸导入宿主细胞中的方法，可以进行转化。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，聚凝胺介导的转染，原生质体融合，电穿孔，多核苷酸包封到脂质体中，和将DNA直接显微注射进核中。另外，病毒载体可以将核酸分子导入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域众所周知的。见，例如，美国专利号4,399,216，4,912,040，4,740,461，和4,959,455(这些专利在这里引作参考)。

可得到的作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括许多可以从美国典型培养物中心(ATCC)得到的无限增殖化细胞系。它们包括尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO，SP2细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)，A549细胞，和许多其它细胞系。通过确定哪个细胞系具有高表达水平，选择出特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或者更优选地，足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，生产抗体。可以使用标准的蛋白纯化方法，从培养基中回收抗体。

另外，可以使用许多已知的技术，增强本发明的抗体(或来自它的其它部分)由生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。在欧洲专利号0 216846，0 256 055，和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4.中，完整地或部分地讨论了GS系统。

“可操作地连接的”序列包括与目标基因紧接的表达控制序列和反向或在远处起作用控制目标基因的表达控制序列。如本文所使用的，术语″表达控制序列″是指能使基因序列在特定条件下或在特定细胞中诱导型或组成型表达的序列。表达控制序列调节的细胞过程的实例包括但不限于基因转录，蛋白翻译，信使RNA拼接，免疫球蛋白同种型转换，蛋白糖基化，蛋白切割，蛋白分泌，胞内蛋白定位和胞外蛋白归位。表达控制序列包含合适的转录起始，终止，启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如拼接和聚腺苷酸化信号；能稳定胞质mRNA的序列；能提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；能提高蛋白稳定性的序列；和当需要时，能增强蛋白分泌的序列。这种控制序列的性质随宿主生物而异。在原核生物中，这种控制序列通常包含启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列。在真核生物中，通常，这种控制序列包含启动子和转录终止序列。术语″控制序列″意在最少包括其存在是表达和加工所必需的所有组分，还可以包括其存在是有利的其它组分，例如，前导序列和融合伴侣序列。

如本文所使用的，术语″重组宿主细胞″(或简称″宿主细胞″)意指其中已经导入了重组表达载体的细胞。应当明白，这样的术语不仅仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，这些后代实际上可以不与亲本细胞完全相同，但是仍然包含在如本文所使用的术语″宿主细胞″的范围内。

″XenoMouse^″小鼠指携带失活的内源免疫球蛋白基因座、使它们不能表达内源鼠免疫球蛋白、但是携带人免疫球蛋白基因座的实质性部分的小鼠。XenoMouse^系的小鼠能进行人免疫球蛋白基因的体细胞重排、人免疫球蛋白可变区的高突变和免疫球蛋白同种型转换。因此，XenoMouse^系的小鼠能利用人免疫球蛋白基因序列，发动有效的针对抗原攻击的体液应答。得到的抗体是全人的，且可以从动物本身、从取自动物的培养细胞、或从由XenoMouse^小鼠B淋巴细胞系或其后代建立的杂交瘤分离出来。而且，通过本领域熟知的重组方法，可以分离出重排的编码针对特定的抗原攻击产生的免疫球蛋白的人基因序列。

抗体结构。基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由2对多肽链组成，每对具有1条″轻链″(约25kDa)和1条″重链″(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包含约100-110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为κ和λ轻链。重链分成μ、δ、γ、α、或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM，IgD，IgG，IgA，和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12或更多个氨基酸的″J″区连接，重链还包含约10或更多个氨基酸的″D″区。见，通常，Immunology，Ch.4(Roitt，I.等编，第6版，Harcourt Publishers Ltd.，London(2001))(为了所有的目的，在这里整体引作参考)。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因而，完整的IgG抗体具有2个结合位点。除了在双功能的或双特异性的抗体中外，这2个结合位点是相同的。

链都表现出相同的由3个高变区(也称作CDR)连接的相对保守的构架区(FR)的一般结构。来自每对的2条链的CDR由构架区对齐，使得能结合特定的表位。从N-末端至C-末端，轻链和重链都包含域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。氨基酸向每个域的分配与免疫学兴趣的蛋白序列的Kabat数据库的定义一致(Johnson & Wu，Nucl.Acids Res.29：205-06(2001)；或Chothia&Lesk，J Mol.Biol.196：901-17(1987)；Chothia等，Nature 342：878-83(1989))。

双特异性的或双功能的抗体是具有2个不同的重链/轻链对和2个不同的结合位点的人工杂交抗体。可以通过许多方法，包括杂交瘤融合或连接Fab′片段，生产双特异性的抗体。见，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-21(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148：1547-53(1992)。此外，可以使双特异性的抗体形成“diabodies(双特异抗体)”(Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993))；或″Janusins″(Traunecker等，EMBOJ.10：3655-59(1991)和Traunecker等，Intl.J.Cancer Suppl.7：51-52(1992))。与常规抗体的生产相比，双特异性抗体的生产是相对劳动密集型的过程，且双特异性抗体的产率和纯度通常更低。双特异性的抗体不以具有单一结合位点的片段形式(例如，Fab，Fab′，和Fv)存在。

来自非人动物的人抗体。对于某些治疗性用途，具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体不如人抗体有用。这种小鼠或大鼠衍生的蛋白的存在，可以导致抗体的迅速清除，或可以导致患者产生针对该抗体的免疫应答。为了避免使用小鼠或大鼠衍生的抗体的这些问题，人们可以例如通过将人抗体功能导入啮齿动物中，使该啮齿动物会生产全人抗体，来开发人源化的抗体或生成全人抗体。

将兆碱基大小的人基因座克隆和重构到YAC中、并将它们导入小鼠种系的能力，提供了阐明非常大的或粗作图的基因座的功能组分以及生成有用的人疾病模型的有力途径。而且，利用这样的技术，将小鼠基因座替换为它们的人等同物，会提供对发育过程中人基因产物的表达和调节、它们与其它系统的通讯联系和它们在疾病诱导和进展中的参与的独特洞察。

这种策略的一个重要实践应用是小鼠体液免疫系统的″人源化″。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源Ig基因已经失活的小鼠中，会提供机会来研究抗体的程序化表达和装配潜在的机理以及它们在B细胞发育中的作用。而且，这样的策略会提供生产全人单克隆抗体(Mab)的理想来源，这是实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期全人抗体会使小鼠或小鼠-衍生的单克隆抗体固有的免疫原性反应和变应性反应最小化，从而提高施用的抗体的功效和安全性。因此，预期全人抗体的应用，会在潜在地需要重复施用抗体的慢性或复发性人疾病(例如炎症、自体免疫、癌症和细菌感染)的治疗中提供重大的优势。

实现该目标的一个方法是，用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体产生方面缺陷的小鼠株，预期这样的小鼠会生产大量的人抗体而缺乏小鼠抗体。大的人Ig片段会保留大的可变基因多样性和对抗体生产和表达的适当调节。通过采用小鼠工具用于抗体多样化和选择、且缺乏对人蛋白的免疫耐受性，在这些小鼠株中再生的人抗体所有组成成分(repertoire)应产生对任何目标抗原(包括人抗原)高亲和力的抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地生产和选择具有理想的特异性的抗原特异性的人单克隆抗体。

随着第一种XenoMouse^动物株的生成，证实了该一般策略。见Green等，Nature Genet.7：13-21(1994)。用分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)，构建了XenoMouse^动物株，所述片段含有核心可变区和恒定区序列。Id。含有人Ig的YAC能与小鼠系统相容，进行抗体的重排和表达，并能替代失活的小鼠Ig基因。这由它们的诱导B细胞发育、生产全人抗体的成人样人所有组成成分和生成抗原特异性的人单克隆抗体的能力所证实。这些结果还表明，导入含有更大数目的V基因、其它调节元件和人Ig恒定区的人Ig基因座的较大部分，可以重演基本上完整的所有组成成分，它是对感染和免疫的人体液应答所特征性的。

近来，Green等的工作延伸到，通过分别导入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的、种系构型YAC片段，导入超过约80％的人抗体所有组成成分，以生成新的XenoMouse^小鼠。见Mendez等，NatureGenet.15：146-56(1997)和Green&Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-95(1998)，其内容在这里引作参考。

在美国专利5,916,771，5,939,598，5,985,615，5,998,209，6,075,181，6,091,001，6,114,598和6,130,364中，进一步讨论和描绘了这样的方法。也见1991年7月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，，1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的WO 98/16654，1998年6月11日公开的WO 98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的WO 99/45031，1999年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的WO 00/09560，和2000年6月29日公开的WO00/037504。上面引用的每篇专利、申请和文献的内容都在这里整体引作参考。

优选地，通过使用转基因小鼠，它具有插入的能生产人抗体的基因组的实质部分，但是被赋予了内源鼠抗体产生的缺陷，制备根据本发明的抗体。然后，这样的小鼠能生产人免疫球蛋白分子和抗体，且在生产鼠免疫球蛋白分子和抗体方面有缺陷。用于实现该目的的技术公开在上述的专利、申请和文献中。

通过使用这样的技术，生产了对新型隐球菌GXM的全人单克隆抗体或其抗原结合部分。基本上，我们用新型隐球菌GXM免疫了小鼠的XenoMouse^系，从能表达新型隐球菌GXM-特异性的抗体的小鼠回收脾和淋巴结细胞(例如B-细胞)，使这样回收的细胞与非分泌性的骨髓瘤细胞融合，制备无殖增殖的杂交瘤细胞系，并筛选杂交瘤细胞系，以鉴别能生产对新型隐球菌GXM特异性的抗体的那些。

还可以在除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达根据本发明的抗体。可以使用编码特定抗体的序列来转化合适的宿主细胞。通过将多核苷酸导入宿主细胞的任意已知方法，例如将多核苷酸包装到病毒(或病毒载体)中，并用该病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本领域已知的转染操作，如美国专利号4,399,216，4,912,040，4,740,461，和4,959,455(这些专利在这里引作参考)所示例的，可以进行转化。在给定情况下使用的转化方法取决于要转化的宿主。例如，将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，聚凝胺介导的转染，原生质体融合，电穿孔，多核苷酸包封到脂质体中，和将DNA直接显微注射进核中。

可得到的作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括许多可以从美国典型培养物中心(ATCC)得到的无限增殖化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NS/O，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，和许多其它细胞系。通过确定何种细胞系具有高表达水平、且能生产具有期望的新型隐球菌GXM结合性质的抗体，选择特别优选的细胞系。

另外，可以使用许多已知的技术，增强本发明的抗体(或来自它的其它部分)由生产细胞系的表达。例如，通过使用二氢叶酸还原酶(DHFR)的共扩增表达系统或谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)，可以实现增强的表达。参见，例如，Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-21(1982)；欧洲专利号0 216 846，0 256 055，和0 323 997；和欧洲专利申请号89303964.4。

通过生成对目标免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的动物或植物，和由它们产生可回收形式的抗体，也可以生产出本发明的抗体。关于在动物中的转基因生产，例如，抗体可以生产在山羊、母牛、或其它哺乳动物的奶中，并从其中回收。见，例如，美国专利号5,827,690，5,756,687，5,750,172，和5,741,957。

本发明包括分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的人单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，分离的人抗体或其抗原结合部分结合新型隐球菌GXM，并增强对象对新型隐球菌的抵抗力。

本发明包括分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分会预防由新型隐球菌感染造成的病症或障碍或者减轻其严重性。

本发明的分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分可以是免疫球蛋白G(IgG)，IgM，IgE，IgA或IgD。在一些实施方案中，IgA可以是IgA1或IgA2亚型，IgG可以是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。

本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且被标记了。在优选的实施方案中，标记是放射性标记，酶标记，荧光标记，毒素，磁性剂，第二抗体，亲和标记，附加表位，抗生素，补体蛋白或细胞因子。

本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含κ轻链。在一些实施方案中，κ轻链的可变(V)区包含由人VκIII DPK22/A27基因编码的从种系序列有至多5个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，κ轻链的连接(J)区包含由人Jκ1基因编码的氨基酸序列。当氨基酸序列包含从种系Vκ和/或Jκ序列的突变时，突变可以是在构架区、CDR5或二者中。

本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含含有如表3所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1；SEQID NO：5；SEQ ID NO：9)的κ轻链或其可变区。本发明还包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含含有表3中对单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7所示的CDR1和CDR3氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：2和4；SEQ ID NO：6和8；和SEQ IDNO：10和12)的κ轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有表3所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：9)从CDR1的开始至CDR3的末端的氨基酸序列的κ轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO：2-4，6-8或10-12所示的氨基酸序列的κ轻链。本发明还包括抗新型隐球菌GXM的抗体，其包含在SEQ ID NO：1，5或9中任一个中的FR1，FR2，FR3和/或FR4氨基酸序列。本发明还包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含含有由表2中所示的核酸序列(SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：17；或SEQ IDNO：21)编码的氨基酸序列的κ轻链或所述氨基酸序列的可变区。在本发明的任何抗体中，可以存在或不存在信号序列。本发明还包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含λ轻链。

本发明包括分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，其包含由G14F7E5、G15B4G5或G19B9G7抗体的可变区(V)、多变区(D)和连接(J)区组成的重链。本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含来自G14F7E5、G15B4G5或G19B9G7抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区中的一个或多个。

更具体地，本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含含有由人V_H3家族基因或人V_H6基因编码的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，人基因是V_H3-64或VH6-1基因。在使用V_H3家族基因的抗体中，重链氨基酸序列优选地是种系V_H3序列，虽然本发明包括具有从种系序列至多3个突变的利用人V_H3的抗体。在一些实施方案中，重链还包含由人D3-9或人D3-10基因编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链还包含由人J_H4b或J_H5b基因编码的氨基酸序列，或带有从种系序列1个突变的所述序列。在使用人V_H6-1基因的抗体的情况下，抗体序列可以具有从种系0-6个突变。当所述的氨基酸序列包含从种系V_H1、D和/或J_H序列的突变时，突变可以是在构架区、CDR5或二者中。

在优选的实施方案中，重链可变区包含由人V_H3-65基因、人D3-9基因和人J_H4b基因编码的氨基酸序列。在其它的实施方案中，重链可变区由人V_H64基因、人D3-10基因和人J_H5b基因编码。

本发明还提供了抗-新型隐球菌的抗体，其包含SEQ ID NO：43(G14F7E5)、SEQ ID NO：47(G15B4G5)或SEQ ID NO：51(G19B9G7)的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、任一个所述SEQ ID NO：的从CDR1开始至CDR3末端的氨基酸序列、或任何所述SEQ ID NO：的可变区的氨基酸序列。

本发明还提供了能特异性地结合新型隐球菌GXM的抗体，其中所述的抗体包含重链，后者包含SEQ ID NO 43，47或51中的任一个的FR1，F2，F3和/或F4的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗-GXM抗体的亲和力(表示为对GXM 24067的aKa)是1×10³M^-1或更大。在一些实施方案中，aKa是1.3×10³M^-1、2×10³M^-1或2.1×10³M^-1。如本文所使用的，aKa是在50％最大结合固相抗原时的可溶GXM抗原浓度的倒数。

在一些实施方案中，本发明的抗-GXM抗体能结合可溶的细胞表面上结合的来自血清型A新型隐球菌的GXM，例如来自菌株SB4和H99的GXM。

在一些实施方案中，本发明的抗-GXM抗体能介导C3补体沉积。

在一些实施方案中，本发明的抗-GXM抗体表现出针对新型隐球菌感染的保护。

本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其能特异性地结合新型隐球菌GXM，且包含选自下列的抗原结合域：Fab片段，F(ab′)₂片段和Fv片段。

本发明包括分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，且抗体是单链抗体。

本发明包括分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，且抗体是嵌合抗体。在优选的实施方案中，嵌合抗体包含来自不同人抗体的构架区和CDR区。在更优选的实施方案中，嵌合抗体是双特异性的。在更优选的实施方案中，嵌合抗体是对新型隐球菌GXM和选自下列的标记双特异性的：放射性标记的分子，酶标记，荧光标记，毒素，磁性剂，第二抗体，亲和标记，附加表位，抗生素，补体蛋白和细胞因子。

本发明包括分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其部分是衍生的。在优选的实施方案中，抗体或其部分是用聚乙二醇、至少一个甲基或乙基或至少一个碳水化合物部分衍生的。

使用本领域的普通技术人员已知的技术和方法，人们可以使用本发明的核酸分子来生成抗体衍生物。

在另一个实施方案中，可以用核酸分子、载体和宿主细胞制备突变的抗-GXM抗体。可以在重链和/或轻链的可变区对抗体进行突变，以改变抗体的结合性质。例如，可以在一个或多个CDR区产生突变，以增加或降低抗体对GXM的K_d，以增加或降低K_off，或改变抗体的结合特异性。定点诱变的技术是本领域熟知的。见，例如，Sambrook等和Ausubel等，同上。如果需要在抗体中导入突变，优选地在已知在抗-GXM抗体的可变区中与种系相比改变了的氨基酸残基处产生突变。更优选地在已知在本发明的一种抗-GXM抗体的可变区中与种系相比改变了的氨基酸残基处产生一个或多个突变。在另一个实施方案中，在一个或多个构架区对核酸分子进行突变。可以在构架区或恒定区产生突变，以提高抗-GXM抗体的半衰期。还可以在构架区或恒定区产生突变，以改变抗体的免疫原性，消除deanudation位点或糖基化位点、以提供共价地或非共价地结合另一种分子的位点，或改变补体固定等性质。可以在单个突变抗体的每一个构架区、恒定区和可变区中产生突变。或者，可以在单个突变抗体的仅一个构架区、可变区或恒定区中产生突变。

在另一个实施方案中，可以制备融合抗体或免疫粘合素，其包含连接到另一种多肽上的抗-GXM抗体的全部或部分。在优选的实施方案中，仅仅抗-GXM抗体的可变区连接到多肽上。在另一个实施方案中，抗-GXM抗体的V_H域连接到第一个多肽上，而抗-GXM抗体的V_L域连接到第二个多肽上，后者以V_H和V_L域可以彼此相互作用形成抗体结合位点的方式与第一个多肽相结合。在另一个优选的实施方案中，V_H域和V_L域被连接物隔开，以使V_H和V_L域可以彼此相互作用(也见单链抗体)。然后，将V_H-连接物-V_L抗体连接到目标多肽上。融合抗体可以用于检测GXM。此外，可以建立融合抗体，其中2个(或多个)单链抗体彼此连接。如果需要在单个多肽链上建立二价的或多价的抗体，或者如果需要建立双特异性的抗体，这是有用的。在一个实施方案中，使用来自抗-GXM抗体的一个或多个CDR区，制备了融合抗体或免疫粘合素。

本发明包括药物组合物，其包含药学上可接受的载体和分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分。本发明还包括试剂盒，其包含所述抗体或其抗原结合部分、它的药学上可接受的载体和容器。在一些实施方案中，试剂盒还包含关于应用的说明书。

本发明包括治疗或预防或抑制新型隐球菌感染或减轻由该感染造成的病症或障碍的严重性的方法，其包括将本发明的抗体或其抗原结合部分、或包含所述的抗体或部分的药物组合物施用给有此需要的患者，例如处于感染新型隐球菌的危险中或目前已经感染了新型隐球菌的患者的步骤。

在一些实施方案中，患者是免疫受损的患者。免疫受损的患者可以是其免疫应答受到年龄、疾病或药物治疗(包括用免疫抑制剂或抗肿瘤剂或其它化疗剂的治疗)损坏的患者。在一些实施方案中，免疫受损的患者患有抗体基因所有组成成分缺陷，尤其是缺陷或缺乏人V_H3家族基因。可以从本发明的抗-GXM Ab治疗获益的患者可以是任何年龄，即婴儿和儿童直到老年患者。

在优选的实施方案中，从非人动物得到人抗体。在更优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个优选的实施方案中，通过注射、透粘膜、经口、吸入、眼睛、直肠、长效植入、脂质体、乳剂、乳霜、局部的或持续释放的方式施用药物组合物。在另一个优选的实施方案中，抗体是与第二种蛋白的融合体。在更优选的实施方案中，第二种蛋白选自毒性肽部分，补体蛋白，放射性标记的蛋白，细胞因子或抗生素蛋白。在另一个优选的实施方案中，抗体标记有放射性标记，毒素，补体蛋白，细胞因子或抗生素。在另一个优选的实施方案中，药物组合物还包含毒素，补体蛋白，放射性标记的蛋白，细胞因子，抗生素，或其任何组合。

本发明包括分离的细胞，它能生产特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，细胞选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞和哺乳动物细胞。在具体实施方案中，哺乳动物细胞选自人细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，狗细胞，猴细胞，山羊细胞，猪细胞，牛细胞和仓鼠细胞。在其它具体实施方案中，哺乳动物细胞选自HeLa细胞，NIH 3T3细胞，CHO细胞，BHK细胞，VERO细胞，CV-1细胞，NS/0细胞和COS细胞。在其它的实施方案中，细胞系是杂交瘤。

本发明包括生产分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分的方法，包括a)在能生产抗体的条件下，培养能生产抗体的非人细胞；b)从细胞培养物中分离出抗体。

在一些实施方案中，生产分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分的方法使用无限增殖化细胞系。在一些实施方案中，无限增殖化细胞系是杂交瘤。

本发明包括生产能特异性地结合新型隐球菌GXM的其它人抗体或其抗原结合部分，包括：a)用新型隐球菌抗原组合物免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物；b)使非人动物发生针对抗原组合物的体液应答；和c)从非人动物分离出人抗体。

本发明包括从非人动物分离的核酸分子，其包含编码特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体重链或其部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，从能生产人抗体的杂交瘤分离出核酸分子。

本发明包括分离的核酸分子或其片段，其包含编码人抗体重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，后者包含编码G14F7E5、G15B4G5或G19B9G7单克隆抗体的重链的核苷酸序列，其中人抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM。在优选的实施方案中，分离的核酸分子包含编码人抗体的1-3个CDR区的序列。本发明还包括分离的核酸分子或其片段，其包含编码人抗体重链或其抗原结合部分的核酸序列，后者包含G14F7E5、G15B4G5或G19B9G7单克隆抗体的CDR3氨基酸序列，其中人抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM。

本发明包括分离的核酸分子，其包含编码抗-新型隐球菌抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸包含编码1个或多个选自SEQ ID NO：44，45，46，48，49，50，52，53或54的重链或轻链CDR氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO：43，47或51中的任一个中所示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的核苷酸序列。

在其它的实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO：43，47或51中的任一个的氨基酸序列或所述序列的可变区部分的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO：43，47或51中的任一个的FR1，FR2，FR3和/或FR4区氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸分子包含选自SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39的核苷酸序列，或其可变区、1个或多个CDR和/或1个或多个FR的核苷酸序列。

本发明包括载体，其包含编码人抗体重链或其抗原结合部分的核酸分子或其片段，其中抗体能特异性地结合新型隐球菌。在优选的实施方案中，载体还包含可操作地连接到所述核酸上的表达控制序列。

本发明包括分离的编码人抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子或其片段，其包含如表2中所示的核苷酸序列(SEQ ID：13，SEQ ID：17，或SEQ ID：21)，或其可变区或1个或多个FR区的核苷酸序列，其中抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM。在优选的实施方案中，分离的核酸分子包含编码人抗体的1-3个CDR区的序列。本发明还包括分离的核酸分子或其片段，其包含编码人抗体轻链或其抗原结合部分的核酸序列，所述抗原结合部分包含如表3中所示的CDR1和CDR3氨基酸序列(SEQID：2和4；SEQ ID NO：6和8；或SEQ ID NO：10和12)，其中人抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM。本发明包括分离的核酸分子或其片段，其包含编码人抗体轻链或其抗原结合部分的核酸序列，所述抗原结合部分包含如表2中所示的单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5或G19B9G7的CDR1和CDR3氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：14和16；SEQ ID NO：18和20；或SEQ ID NO：22和24)，其中人抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM。

本发明包括载体，其包含编码特异性地结合新型隐球菌的人抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子或其片段。在优选的实施方案中，载体还包含可操作地连接到所述核酸上的表达控制序列。

本发明包括分离的宿主细胞，其包含：a)从非人动物分离的核酸分子，其编码特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体的轻链或其抗原结合部分；或b)包含所述核酸分子的载体。

本发明包括分离的宿主细胞，其包含：a)从非人动物分离的核酸分子，其编码特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体的重链或其抗原结合部分；或b)包含所述核酸分子的载体。

本发明包括分离的宿主细胞，其包含：a)从非人动物分离的编码能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子和分离的编码所述抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子；或b)包含所述核酸分子的一个或多个载体。

本发明包括重组生产从非人动物鉴别出的、能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体的重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分、或轻链和重链或其抗原结合部分的方法，其包括在能表达所述核酸分子的条件下培养上述宿主细胞的步骤。

本发明包括分离的人抗体重链或其抗原结合部分，其中抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM，其由任一种上述编码重链的核酸分子编码，或从任一种上述宿主细胞分离。

本发明包括分离的人抗体轻链或其抗原结合部分，其中抗体能特异性地结合新型隐球菌GXM，其由任一种上述编码轻链的核酸分子编码，或从任一种上述宿主细胞分离。

本发明包括非人转基因动物，其包含任何上述的核酸分子。在优选的实施方案中，非人转基因动物能表达一个或多个所述核酸分子。在更优选的实施方案中，非人转基因动物包含分离的编码能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子和分离的编码所述抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子，且该非人动物能表达这2种核酸分子。在更优选的实施方案中，非人动物选自小鼠，大鼠，仓鼠，母牛，绵羊，灵长类动物，马和猪。在更优选的实施方案中，在源自动物的B淋巴细胞或其后代的细胞表面上表达由所述分离的核酸分子的表达产生的人抗体或其部分。在另一个优选的实施方案中，由分离的核酸分子的表达产生的人抗体或其部分被分泌到该动物的淋巴、血液、乳汁、唾液或腹水中。

本发明包括融合蛋白，其包含分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分和第二种多肽序列。在不同的实施方案中，第二种多肽序列选自附加表位，亲和标记，毒性多肽，抗生素，酶，第二抗体序列，补体蛋白，和细胞因子。

本发明包括分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，其中抗体的重链同种型是μ、γ、δ、ε或α。

本发明包括分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分由包括下述步骤的方法生产：a)用选自下述的抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物：新型隐球菌GXM制品，有毒力的新型隐球菌细胞制品，减毒的新型隐球菌细胞制品，和杀死的新型隐球菌细胞制品；b)使非人动物产生针对该抗原的免疫应答；和c)从非人动物分离抗体。

本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分，其从没有污染人生物材料的动物或细胞分离出来，所述的人生物材料例如病毒，酶，激素，细胞因子，受体，受体配体，免疫球蛋白，补体，核蛋白，和胞质信号传递蛋白。更具体地，本发明的人抗体没有EB病毒或反转录病毒。

通过常规混合、溶解、成粒、包糖衣、磨细、乳化、包封、包埋或冻干等方法，可以生产出药物组合物。

因而，使用一种或多种可药用的生理上可接受的载体，包含有利于活性化合物加工成制剂的赋形剂和辅料，可以以常规方式制备用于根据本发明的用途的药物组合物。适当的制剂取决于所选的给药途径。

对于注射，可以将本发明的药剂配制到水性溶液中，优选生理上相容的缓冲液中，例如Hanks溶液，林格氏溶液，或生理盐水缓冲液。对于透粘膜给药，在制剂中使用与要透过的屏障相适宜的渗透剂。这样的渗透剂是本领域熟知的。对于眼睛给药，如本领域熟知的，使用在适当盐水溶液中的悬浮液。

对于经口给药，通过使活性化合物和本领域熟知的药学上可接受的载体相组合，可以容易地配制化合物。这样的载体使本发明的化合物能配制成给要治疗的患者经口摄入的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等。经口使用的药物制剂可以制成固体赋形剂，任选地磨碎得到的混合物，和加工颗粒的混合物，在加入合适的辅料(如果需要)后，得到片剂或糖衣丸心。合适的赋形剂包括填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

给糖衣丸心提供了合适的包衣。为此，可以使用浓糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴浦尔胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣中，以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的轻压配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。轻压配合胶囊可以含有活性成分，其与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂相混合。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮到合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。经口给药的所有制剂都应当制成适于这样给药的剂量。

对于口含给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

对于吸入给药，以从加压包或喷雾器气雾剂呈递的形式，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，四氟二氯乙烷，二氧化碳或其它合适的气体，方便地输送用于根据本发明的用途的化合物。在加压气雾剂的情况下，通过提供阀门来输送计量的量，可以确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶的)，可以配制成含有化合物和合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

可以将化合物配制成通过注射肠胃外给药的制剂，例如通过快速推注或连续灌输。用于注射的制剂可以制成单位剂型，例如在含有加入的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳状液等形式，或可以含有配方辅剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水性溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可以含有能提高悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡萄糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或能提高化合物的溶解度的试剂，以制备高度浓缩的溶液。

或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体配制，例如无菌的无热原的水。

还可以将化合物制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯。

除了前述的制剂外，还可以将化合物制成长效制剂。可以通过植入(例如皮下地或肌肉内地)或通过肌肉内注射，施用这样的长效制剂。因而，例如，可以将化合物与合适的聚合物或疏水物(例如作为在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂一起配制，或制成难溶的衍生物，例如难溶的盐。

用于本发明的疏水化合物的药物载体是包含苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶的有机聚合物和水相的共溶剂系统。共溶剂系统可以是VPD共溶剂系统。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80、和65％w/v聚乙二醇300的溶液，在无水乙醇中补至体积。VPD共溶剂系统(VPD：5W)由与5％葡萄糖水溶液以1∶1稀释的VPD组成。该共溶剂系统能较好地溶解疏水化合物，且其自身在全身施用后产生的毒性低。自然地，可以显著地改变共溶剂系统的比例，而不破坏它的溶解度和毒性特征。而且，可以改变共溶剂组分的身份：例如，可以使用其它低毒性的非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80；可以改变聚乙二醇的分数大小；其它生物相容的聚合物可以代替聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮；且其它糖或多糖可以代替葡萄糖。

或者，可以使用用于疏水药物化合物的其它输送系统。脂质体和乳状液是疏水药物的输送介质或载体的众所周知的实例。也可以使用某些有机溶剂，例如二甲基亚砜，尽管通常具有更大的毒性。

另外，可以使用持续释放系统来输送化合物，例如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质。已经建立了多种持续释放的材料，且是本领域的技术人员熟知的。根据它们的化学性质，持续释放胶囊可以释放化合物几周至超过100天。

根据治疗剂的化学性质和生物学稳定性，可以使用稳定蛋白的其它策略。

药物组合物也可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

可以将本发明的分离的能特异性地结合新型隐球菌GXM的人抗体或其抗原结合部分制成与药学上相容的平衡离子的盐。可以与许多酸形成药学上相容的盐，包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与相应的游离碱形式相比，盐倾向于更易溶于水性或其它质子性溶剂中。

本发明的试剂盒包含关于使用本发明的组合物抑制、预防或治疗新型隐球菌感染或由这样的感染造成的病症或障碍的说明书。在试剂盒上印刷的说明书使本领域的技术人员能利用试剂盒实施本发明的方法。

下面的实施例仅仅用于解释。它们无意限制本文公开的发明范围。

实施例1-生成针对新型隐球菌荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的单克隆抗体

我们用与白喉类毒素缀合的新型隐球菌血清型D(菌株24067，ATCC)的葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM-DT)接种了IgG2-κ人免疫球蛋白转基因小鼠(XenoMouse^小鼠；Mendez等，Nat.Genet.15，pp.146-56(1997))。在尾巴根部，皮下进行接种。在第0、14和28天，给每只小鼠施用3次100ul 10ug GXM-DT与50ul铝胶和10ul CpG的注射液。根据本领域熟知的技术(Pirofski等，Infect.Immun.63：3005-14，1995；Chang等人，Infect Immun.70：4977-86，2002)，在第42天，从小鼠分离脾细胞，通过使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NSO的融合，制备杂交瘤。将杂交瘤细胞克隆到软琼脂中，使用富集的杂交瘤培养基繁殖。

筛选了超过500个杂交瘤细胞系是否分泌与GXM 24067反应的抗体。将来自表现出生长的细胞的上清液与包被了10μg/ml GXM 24067的聚苯乙烯ELISA平板(Corning^TM Glass Works，Corning，NY)一起在37℃温育1小时；洗涤平板，与缀合碱性-磷酸酶(AP)的对IgG、IgM、κ轻链的山羊抗-人试剂和对λ轻链特异性的山羊抗-小鼠试剂(FisherBiotech^，Fisher Scientific^TM，Pittsburgh，PA)一起在37℃温育1小时。洗涤平板，用对硝基苯基磷酸底物(Sigma，St.Louis，MO)检测结合。用MRX微板阅读器(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)，在405nm测量光密度。阴性对照是IgM骨髓瘤抗体(Calbiochem^，San Francisco，CA)。使用(Russell等，Infect.Immun.68：1820-26，2000，Pirofski等，Infect.Immun.63：3005-14，1995和Chang等，Infect.Immun.68：1820-26，2002)所述的标准技术，测试了GXM结合杂交瘤对各种抗原的结合，包括(Zhang等.，Infect.Immun.65 1158-64，1997和Fleuridor等，J Infect.Dis.180：1526-35(1999)所述的GXM-模拟位(P13)、葡萄球菌蛋白A(SPA；Sigma)、DT和BSA。

实施例2-隐球菌GXM的单克隆抗体的表征

重复筛选测试特异性后，发现3个杂交瘤细胞系具有与GXM的最高反应性，且仅仅与GXM具有反应性。进一步研究了由这些杂交瘤生产的3种人单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7。所有3种抗体都是IgM，且与GXM 24067反应，通过直接ELISA，都没有表现出显著的(超过背景的)向DT，BSA或GXM模拟位P13的结合。基于免疫荧光染色，所有3种单克隆抗体都结合到来自菌株24067的新型隐球菌细胞上的GXM。

根据布达佩斯公约关于用于专利程序目的的国际微生物保藏认可的规定，于2003年5月1日将3个杂交瘤保藏在美国典型培养物中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，U.S.A.。分配了下面的ATCC登录号：

G14F7E5  PTA-5170

G15B4G5  PTA-5171

G19B9G7  PTA-5172

还确定了单克隆抗体对新型隐球菌血清型A的特异性。血清型A是北美洲隐球菌病的最常见病因；而血清型D是北美洲的第二最常见血清型，且是欧洲该病的常见病因。使用纯化的GXM和全细胞ELISA，如下进行了血清型特异性研究。

纯化的GXM ELISA：用包被了10ug/ml来自新型隐球菌菌株24067、血清型A菌株SB4和H99(由Dr.Arturo Casadevall提供，AlbertEinstein College of Medicine)的GXM或在PBS中的P13-葡聚糖的ELISA平板，温育了每种单克隆抗体的系列稀释液(从10ug/ml开始)；洗涤平板，用山羊抗-人IgM-AP(Fisher)温育1小时，洗涤，并如上显色。单克隆抗体G14F7E5和G19B9G7与二种血清型A菌株反应，而G15B4G5没有显著地结合任一种血清型A菌株，表明所述单克隆抗体具有不同的菌株特异性。该实验的结果如表1所示。

表1：单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7与可溶GXM的反应性的菌株特异性

新型隐球菌菌株	G14F7E5	G15B4G5	G19B9G7
				24067(血清型D)	+++	+++	+++
SB4(血清型A)	+++	-	+++
				H99(血清型A)	+++	-	+++

全细胞ELISA：使新型隐球菌菌株24067、SB4和H99在Saboraud葡萄糖肉汤(Becton Dickinson，Sparks MD)中生长2天，此后在PBS中洗涤细胞，计数，并在68℃热杀死2小时。通过在31℃、在Saboraud葡萄糖肉汤中温育热杀死细胞过夜，确认细胞死亡。将细胞稀释到PBS中，以1×10⁷cfu/ml(50ul/孔)的浓度平板接种到ELISA平板，将平板在4℃温育过夜。使用骨髓瘤IgM(Calbiochem)和抗-PPS8单克隆IgM-D11作为对照。去除未结合的细胞，通过与150ul/孔的甲醇温育30分钟，将结合的细胞固定到平板上。洗涤平板，用1％BSA/PBS在37℃封闭1小时。洗涤后，以10ug/ml的初始浓度，将单克隆抗体或对照骨髓瘤IgM(Calbiochem，San Diego，CA)加入平板中，1∶3稀释，在37℃温育它们1小时。洗涤后，用1∶1000稀释(在0.1％BSA/PBS中)的AP-缀合的山羊抗-人IgM在37℃温育平板1小时。如上使平板显色，在405nm波长读数。

所有3种单克隆抗体都结合到了2种血清型A菌株上，尽管单克隆抗体G15B4G5的结合程度不如其它2种单克隆抗体。

实施例3-抗原特异性

用抑制ELISA确认了单克隆抗体的GXM特异性。使用人骨髓瘤IgM(见上)和D11作为对照，后者是对肺炎链球菌的血清型8特异性的IgM(Zhong等，Infect.Immun.67：4119-27，1999)。ELISA平板用包被了10ug/ml GXM(24067 SB4或H99)或10ug/ml P13-DEX(以前报道的多肽GXM-模拟位的葡聚糖缀合物；Fleuridor等，J.Immunol.166：1087-96(2001)；Maitta等，Infection Immun.72：196-208(2004))在室温包被3小时，洗涤，用1％BSA/PBS在4℃封闭过夜。用与单克隆抗体10或1ug/ml混合的可溶GXM的系列稀释液(从100ug/ml开始)温育平板；洗涤平板，用山羊-抗-人IgM-AP(Fisher)在37℃温育1小时，如上显色和读数。

如图1所示，来自菌株SB4的可溶GXM没有抑制任一种单克隆抗体向来自菌株24067的GXM的结合(小图A)。

实施例4-新型隐球菌GXM 24067的单克隆抗体的序列分析

通过对从杂交瘤得到的PCR-扩增的V_L cDNA进行测序，我们得到了单克隆抗体的轻链可变区(V_L)的核苷酸序列。使用V_L特异性的引物，我们通过RNA  的逆转录生成了V_L cDNA：V_K有义，5′-GAA(CT)ATC(T)GAGCTCACC(GT)CAGTCTCCA-3′(SEQ ID NO：25；(CT)表示3位具有相等的是A，C或T的频率；(T)表示6位具有相等的是C或T的频率；(GT)表示15位具有相等的是C，G或T的频率)；V_K反义，5′-CCTGTTGAAGCTCTTTGTGAC-3′(SEQ ID NO：26)。从2个独立实验对PCR产物进行了测序，发现是相同的。包含G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的可变区和CDR的核苷酸序列如表2所示。包含G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的可变区和CDR的氨基酸序列如表3所示。我们使用DNA PLOT(V Base Index；MRC Center for Protein Engineering，Cambridge，United Kingdom；Mukherjee等，J.Exp.Med.177：1105-16(1993))，将可变区序列与人免疫球蛋白序列数据库进行了对比。

表2：单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的轻链的核酸序列

序列标示	核酸序列	SEQ ID NO：
			G14F7E5可变区	5’-GGCACCCTGT CTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCT CCTG CAGGGC CAGTCAGAGT GTTATCAGCA GCTACTTAGC CTGGTACCAGCAGAAACCTG GCCAGGCTCC CAGGCTCCTCATCTAT GGTG CATCCAGCAG GGCCACTGGCATCCCAGACA GGTTCAGTGG CAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACTCTCAC CATCAGCAGACTGGAGCCTG AAGATTTTGC AGTGTATTACTGTCAGCAGT ATGGTAACTC ACGGACGTTCGGCCAAGGGA CCAAGGTGGA AATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGA GTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACCCTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAAGAAACACAAAGTT CTACGCCTGC GAAGGTNANNNATCAG-3’	13
G14F7E5CDR1	5’-AGGGCCAGTC AGAGTGTTAT CAGCAGCTACTTAGCC-3’	14
			G14F7E5CDR2	5’-GGTGCATCCA GCAGGGCCAC T-3’	15
G14F7E5CDR3	5’-CAGCAGTATG GTAACTCACG GACG-3’	16
			G15B4G5可变区	5’-CAGTCTCCAG GCACCCTGTC TTTGTCTCCAGGGGAAAGAG CCACCCTCTC CTGC AGGGCC AGTCAGAGTG TTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGC AGAAACCTGG CCAGGCTCCCAGGCTCCTCA T CTATGGTGC ATCCAGCAGG GCCACTGGCA TCCCAGACAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTG GGACAGACTT CACTCTCACCATCAGCAGAC TGGAGCCTGA AGATTTTGCAGTGTATTACT GTCAG CAGTA TGGTAGCTCA CGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACGAA CTGTGGCTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGA AGCAAAAGCA序列标示	17核酸序列

序列标示	核酸序列	SEQ ID NO：
				GACTACGAAG AAACACAAAG GTTCTACGCCTGCGAANGGT CAANACCAT-3’
G15B4G5CDR1	5’-AGGGCCAGTC AGAGTGTTAG CAGCAGCTACTTAGCC-3’	18
			G15B4G5CDR2	5’-GGTGCATCCA GCAGGGCCAC T-3’	19
G15B4G5CDR3	5’-CAGCAGTATG GTAGCTCACG GACG-3’	20
			G19B9G7可变区	5’-TCTTTGTCTC CAGGGGAAAG AGCCACCCTCTCCTGCAGG A CCAGTCAGAG TATTACCAAC AGCTACTTAG CCTGGTACCA GCAGAAACCTGGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTAT GGT GCATCCAGCA GGGCCACTGG CATCCCAGACAGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGACTTCACTCTCA CCATCAGCAG ACTGGAGCCTGAAGATTTTG CAGTGTATTA CTGT CAGCAG TATGGTAACT CACGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGG AAATCAAACG AACTGTGGCTGCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAAGA AACACAAAGTTCTACGCCTG CGAAAGGTNN AANANNGATCAAGGG-3’	21
G19B9G7CDR1	5’-AGGACCAGTC AGAGTATTAC CAACAGCTACTTAGCC-3’	22
			G19B9G7CDR2	5’-GGTGCATCCA GCAGGGCCAC T-3’	23
G19B9G7CDR3	5’-CAGCAGTATG GTAACTCACG GACG-3’	24

表3：单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的轻链的氨基酸序列

序列标示	氨基酸序列	SEQ ID NO：
			G14F7E5可变区	GTLSLSPGER ATLSC RASOS VISSYLAWYOOKPGOAPRLL IY GASSRATG IPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYY C OOYGNSRTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEETQSSTPAKVX XQ	1
G14F7E5CDR1	RASQSVISSY LA	2
			G14F7E5CDR2	GASSRAT	3
G14F7E5CDR3	QQYGNSRT	4
			G15B4G5可变区	QSPGTLSLSP GERATLSC RA SQSVSSSYLAWYOOKPGOAP RLLIY GASSR ATGIPDRFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFA VYYC QQYGSS RTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSP QQHPDAEAKADYEETQRFYA CEXSXP	5
G15B4G5CDR1	RASQSVSSSY LA	6
			G15B4G5CDR2	GASSRAT	7
G15B4G5CDR3	QQYGSSRT	8
			G19B9G7可变区	SLSPGERATL SC RTSOSITN SYLAWYOOKPGOAPRLLIY G ASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYC OO YGNSRTFGOGTKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEETQSSTPAKGXXXI K	9
G19B9G7CDR1	RTSQSTTNSY LA	10
			G19B9G7CDR2	GASSRAT	11
G19B9G7CDR3	QQYGNSRT	12

所有3种单克隆抗体的V_L链可变区基因转录物都利用人V_KA27(DPK22)基因和人J_K1轻链基因元件。序列对比表明，G15B4G5具有种系A27序列。相比之下，G14F7E5和G19B9G7都在CDR3区具有相同的核苷酸置换，从G至A(SEQ ID NO：13中的257位和SEQ ID NO：21中的248位)。G15B4G5缺乏该置换。该置换导致从丝氨酸(S)至天冬酰胺(N)的氨基酸变化(SEQ ID NO：1中的86位和SEQ ID NO：9中的83位)。序列对比表明，G14F7E5在CDR1具有从G至T的单核苷酸置换(SEQ IDNO：13中的65位)。该置换导致从丝氨酸(S)至异亮氨酸(I)的氨基酸变化(SEQ ID NO：1中的22位)。G19B9G7在CDR1具有4个置换：在SEQ IDNO：13中的40，52和59位是从G至A，在SEQ ID NO：13中的56位是从G至C。这些置换导致如下的氨基酸变化：在SEQ ID NO：9中的14位是从丙氨酸(A)至苏氨酸(T)，在SEQ ID NO：9中的18位是从缬氨酸(V)至异亮氨酸(I)，在SEQ ID NO：9中的19位是从丝氨酸(S)至苏氨酸(T)，在SEQ ID NO：9中的20位是从丝氨酸(S)至天冬酰胺(N)。

我们如下从来自能生产单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的杂交瘤的PCR-扩增的V_H基因cDNA确定了V_H基因序列。使用V_H恒定区引物，我们通过RNA的逆转录生成了V_HcDNA。然后，我们使用V_H特异性的引物的混合物，它们全体共同地覆盖了使用的XenoMouse^小鼠中的所有V_H基因，通过PCR从cDNA扩增了V_H区：

V_H3-07有义，5′-CACCATGGARTTGGGGCTGAGCTGG-3′(SEQ ID NO：29)；

V_H3-09有义，5′-CACCATGGAGTTKGGACTGAGCTGG-3′(SEQ ID NO：55)；

V_H3-11有义，5′-CACCATGGAGTTTGGGCTKAGCTGG-3′(SEQ ID NO：56)；

V_H3-21有义，5′-CACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGG-3′(SEQ ID NO：57)；

V_H3-48有义，5′-CACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGG-3′(SEQ ID NO：58)；

V_H3-53有义，5′-CACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGG-3′(SEQ ID NO：59)；

V_H3-64有义，5′-CACCATGACGGAGTTTGGGCTGAGC-3′(SEQ ID NO：60)；或

V_H6有义，5′-CACCATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTT-3′(SEQ ID NO：61)；和

V_H3反义-IgM ASO，5′-GTGCTGCTGATGTCAGAGTTG-3′(SEQ ID NO：30)。

我们进行了凝胶纯化，并根据生产商的说明书，将V_HPCR产物克隆进了TA克隆系统的pCR1000质粒(Invitrogen^TM，San Diego，CA)中。我们使用Maxi质粒方案(Qiagen^，Inc.，Chatsworth，CA)分离了质粒DNA，并使用ABI-PRISM Big Dye终止子循环测序预备反应试剂盒(Perkin Elmer，Torrance，CA)进行了测序。我们使用DNA PLOT(V BaseIndex；MRC Center for Protein Engineering，Cambridge，UnitedKingdom；Mukherjee等，J.Exp.Med.177：1105-16(1993))，将可变区序列与人免疫球蛋白序列数据库进行了对比，以确定基因用法，并识别出CDR1、CDR2和CDR3序列。

表4：单克隆抗体G14F7E5、G15B4G5和G19B9G7的重链的核酸序列

序列标示	核酸序列	SEQ ID NO：
			G14F7E5可变区	5’-GAAGATCTCA CCATGTCTGT CTCCTTCCTCATCTTCTTGC CCGTACTGGG CCTCCCATGGGGTGTCCTGT CACAGGTACA GCTGCAGCAGTCAGGTCCAG GACTGGTGAA GCCCTCGCAGACCCTCTCAC TCACCTGTGC CATCTCC GGG GACAGTGTCT CTAGCAACAA TGCTGCTTGG AACTGGATCA GGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGC TGGGA AGGAC ATACTTCAGG TCCAAGTGGT ATAATGATTA TGCAGTATCT GTGAAAAGTC GAATAACCAT CAACCCAGACACATCCAAGA ACCAGTTCTC CCTGCAGCTGAACTCTGTGA CTCCCGAGGA CACGGCTGTGTATTACTGTG CTAGA GAGGG TACTATGATT CGGGGAATTA TAAACTGGTT CGACTCCTGGGGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCAGGGAGTGCAT CCGCCCCAAC CCTTTTCCCCCTCGT-3’	31
G14F7E5CDR1	5’-GGGGACAGTG TCTCTAGCAA CAATGCTGCTTGGAAC-3’	32
			G14F7E5CDR2	5’-AGGACATACT TCAGGTCCAA GTGGTATAATGATTATGCAG TATCTGTGAA AAGT-3’	33
G14F7E5CDR3	5’-GAGGGTACTA TGATTCGGGG AATTATAAACTGGTTCGACT CC-3’	34
			G15B4G5可变区G15B4G5CDR1	5’-CTGAGCTGGT TTCCTGTTGC TATTTTTAAAGGTGTCCAGT GTGAGGTGCA GCTGGTGGAGTCTGGGGAAG GCTTGGTCCA GCCTGGGGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGC AGCCTCT GGA TTCACCTTCA GTAGCTATGC TATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAA GGGACTGGAATATGTTTC AG CTATTAGTAG TAATGGGGGT AGCACATATT ATGCAGACTC TGTGAAGGGCAGATTCACCA TCTCCAGAGA CAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTTCAAAT GGGCAGCCTGAGAGCTGAGG ACATGGCTGT GTATTACTGTGCGAGAGA TC ATACGATATT TGGACTGGTT CCTCCGTTGG ACTACTGGGG CCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCCTCAGG GAGTGCATCCGCCCCAACCC TTTTCCCCCT CGTCTCCTGTGAGAATTCCC CGTCGGATAC GAGCAGCGTGGCCGTTGGCT GCCTCGCACA GGACTTCCTTCCCGACTCCA TCACTTTCTC CTGGAAATACAAGAACAACT CTGAC-3’5’-GGATTCACCT TCAGTAGCTA TGCTATGCAC-3’序列标示	3536核酸序列

序列标示	核酸序列	SEQ ID NO：
			G15B4G5CDR2	5’-GCTATTAGTA GTAATGGGGG TAGCACATATTATGCAGACT CTGTGAAGGG C-3’	37
G15B4G5CDR3	5’-GATCATACGA TATTTGGACT GGTTCCTCCGTTGGACTAC-3’	38
			G19B9G7可变区	5’-ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCTTGCCCGTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCACAGGTACAGC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGACTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTCACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCTAGCAACAATG CT GCTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGGCCT TGAGTGGCTGGGAAGGACAT ACTACAGGTC CTACTGGTATAATG ATTATG CAGTATCTGT GAAAAGTCGA ATAACCATCA ACCCAGACAC ATCCAAGAACCAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACTCCCGAGGACA CGGCTGTGTA TTACTGTGCAAGAGA GGGTA CTATGATTCG GGGAATTATA AACTGGTTCG ACTCCTGGGG CCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCCTCAGG GAGTGCATCCGCCCCAACCC-3’	39
G19B9G7CDR1	5’-GGGGACAGTG TCTCTAGCAA CAATGCTGCTTGGAA C-3’	40
			G19B9G7CDR2	5’-AGGACATACT ACAGGTCCTA CTGGTATAATGATTATGCAG TATCTGTGAA AAGT-3’	41
G19B9G7CDR3	5’-GAGGGTACTA TGATTCGGGG AATTATAAACTGGTTCGACT CC-3’	42

表5：单克隆抗体G14F7E5、G1584G5和G1989G7的重链的氨基酸序列

加粗的序列是信号(前导)序列。

分析重链序列发现，G15B4G5包含人V_H3-64基因的种系序列。G15B4G5的可变区还利用人D3-9基因和人J_H4b基因。对比赋予针对新型隐球菌感染的保护作用的G15B4G5的可变区序列和已经报道会赋予保护的另一种人抗-新型隐球菌GXM，显示了CDR2中的保守残基。见图3。

实施例5-小鼠保护实验

在小鼠的被动保护实验中，评价了单克隆抗体的保护功效。将每种单克隆抗体或对照骨髓瘤IgM稀释到无菌的PBS中，将1000、100、50、5和0.5ug剂量腹膜内地(IP)施用给10只6-8周龄雌性BALB/c小鼠(从NCI得到)中的每一只，1小时后，用5×10⁶菌落形成单位(cfu)的新型隐球菌菌株24067进行IP感染。注射液是0.1ml，在PBS中稀释，并通过铺板到saboraud葡萄糖琼脂平板(Fisher)上，确认了真菌接种物。每日监测存活小鼠的数目。当对照小鼠死亡时，用Kaplan-Meier 1og-排列存活率检验，统计学评价存活率。100ug剂量的G15B4G5是保护性的。没有其它剂量或单克隆抗体能赋予大于对照的保护。G19B9G7在所有浓度都增强致死率(相对于PBS)。该实验的结果如图2所示。

在本说明书和权利要求书中，术语“包含/包括”应当理解为表示包括所述的整数或整数组，而不是排除任何其它的整数或整数组。

在本说明书中引用的所有公开和专利申请，都在这里引作参考，如同特别地和分别地指明各公开或专利申请引作参考。尽管为了清楚地理解的目的，已经通过例示解释和实施例比较详细地描述了前面的发明，本领域的普通技术人员能够根据本发明的教导容易地明白，可以对其进行某些变化和改进，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (43)

1.特异性地结合新型隐球菌的荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或部分包含：

(a)重链氨基酸序列，其包含人VH 3-64基因或人VH-6-1基因的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，有或没有信号序列；

(b)轻链氨基酸序列，其包含人VκA27基因的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，有或没有信号序列；或

(c)(a)和(b)二者，

其中所述的氨基酸序列可以包含从种系基因序列的至多6个突变。

2.根据权利要求1的抗体或抗原结合部分，其中氨基酸序列是种系基因序列。

3.根据权利要求1的抗体或抗原结合部分，其中抗体包含选自下述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列：

(a)SEQ ID NO：43的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和SEQ IDNO：1的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：47的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和SEQ IDNO：5的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列；和

(c)SEQ ID NO：51的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和SEQ IDNO：9的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

4.根据权利要求1的抗体或抗原结合部分，其中抗体包含重链和轻链，且其中重链和轻链的氨基酸序列选自：

(a)抗体G14F7E5的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，有或没有信号序列；

(b)抗体G15B4G5的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，有或没有信号序列；和

(c)抗体G19B9G7的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，有或没有信号序列。

5.根据权利要求1的抗体或抗原结合部分，其中重链和轻链分别包含选自下述的重链可变区和轻链可变区：

(a)SEQ ID NO：43的重链可变区和SEQ ID NO：1的轻链可变区，有或没有信号序列；

(b)SEQ ID NO：47的重链可变区和SEQ ID NO：5的轻链可变区，有或没有信号序列；和

(c)SEQ ID NO：51的重链可变区和SEQ ID NO：9的轻链可变区，有或没有信号序列。

6.选自G14F7E5(ATCC登录号PTA-5170)、G15B4G5(ATCC登录号PTA-5171)或G19B9G7(ATCC登录号PTA-5172)的细胞系。

7.由根据权利要求6的细胞系生产的单克隆抗体。

8.特异性地结合新型隐球菌GXM的单克隆抗体，其中抗体包含根据权利要求7的单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列。

9.分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的抗体，其中所述抗体的轻链利用人VκIII DPK22/A27基因。

10.根据权利要求6的抗体，其中轻链还利用人Jκ1基因。

11.分离的特异性地结合新型隐球菌GXM的抗体，其中所述抗体的重链利用人V_H 3-64或人V_H 6-1基因。

12.特异性地结合新型隐球菌的荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或部分包含轻链，所述的轻链氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-99的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基16-89的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：14，15和16所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

13.核酸分子，其包含编码选自下述的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的残基1-99的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的残基16-89的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)SEQ ID NO：2，3和4所述的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

14.多肽，其包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-99的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：13所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基16-89的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：14，15和16所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

15.核酸分子，其包含选自下述的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：13所述的序列；

(b)SEQ ID NO：13的1-297位的核苷酸序列；

(c)SEQ ID NO：13的CDR1-CDR3编码序列；和

(d)SEQ ID NO：14，15和16的CDR1、CDR2和CDR3编码序列。

16.特异性地结合新型隐球菌的荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含轻链，该轻链含有选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-102的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基19-92的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：18，19和20所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

17.多肽，其包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-102的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：17所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基19-92的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：18，19和20所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

18.核酸分子，其包含编码选自下述的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列的残基1-102的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列的残基19-92的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)SEQ ID NO：6，7和8所述的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

19.核酸分子，其包含选自下述的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：17所述的DNA序列；

(b)SEQ ID NO：17的1-306位的核苷酸序列；

(c)SEQ ID NO：17的CDR1-CDR3编码DNA序列；和

(d)SEQ ID NO：18，19和20的CDR1、CDR2和CDR3编码DNA序列。

20.特异性地结合新型隐球菌的荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-96的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基13-86的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：22，23和24所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

21.多肽，其包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-96的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：21所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基13-86的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：22，23和24所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

22.核酸分子，其包含编码选自下述的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：21所述的氨基酸序列的残基1-96的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列的残基13-86的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)SEQ ID NO：10，11和12所述的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

23.核酸分子，其包含选自下述的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：21所述的DNA序列；

(b)SEQ ID NO：21的1-288位的核苷酸序列；

(c)SEQ ID NO：21的CDR1-CDR3编码DNA序列；和

(d)SEQ ID NO：22，23和24的CDR1、CDR2和CDR3编码DNA序列。

24.特异性地结合新型隐球菌的荚膜多糖葡萄糖醛酸木甘露聚糖(GXM)的抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或部分包含轻链，所述的轻链氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：

(a)由SEQ ID NO：31，35或39所述的DNA序列编码的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO：31所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-150的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-136的氨基酸序列，包括两端在内；或由SEQID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-146的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：31所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基50-139的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基40-125的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基46-135的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：32，33和34；36，37和38或40，41和42所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

25.核酸分子，其包含编码选自下述的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：43，47或51所述的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：43所述的氨基酸序列的残基1-150的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-136的氨基酸序列，包括两端在内；或由SEQ ID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-146的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：31所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基50-139的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基40-125的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基46-135的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：32，33和34；36，37和38或40，41和42所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

26.多肽，其包含选自下述的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：43，47或51所述的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：43所述的氨基酸序列的残基1-150的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-136的氨基酸序列，包括两端在内；或由SEQ ID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基1-146的氨基酸序列，包括两端在内；

(c)由SEQ ID NO：31所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基50-139的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：35所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基40-125的氨基酸序列，包括两端在内；由SEQ ID NO：39所述的DNA序列编码的氨基酸序列的残基46-135的氨基酸序列，包括两端在内；和

(d)由SEQ ID NO：32，33和34；36，37和38或40，41和42所述的DNA序列编码的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。

27.根据权利要求13，15，18，19，22，23和25中的任一项的核酸分子，其可操作地连接到表达控制序列。

28.用根据权利要求27的核酸分子转化的宿主细胞。

29.生产特异性地结合新型隐球菌GXM的抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养根据权利要求28的宿主细胞的步骤。

30.用根据权利要求13，15，18，19，22，23和25中的任一项的核酸分子转化的宿主细胞。

31.生产特异性地结合新型隐球菌GXM的抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养根据权利要求30的宿主细胞的步骤。

32.组合物，其包含根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

33.根据权利要求32的组合物，还包含选自下述的组分：

(a)诊断剂；和

(b)治疗剂。

34.试剂盒，其包含根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或其抗原结合片段。

35.预防有此需要的对象中由新型隐球菌感染造成的病症或障碍或减轻其严重性的方法，包括施用有效量的根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求32或33中的任一项的组合物的步骤。

36.增强有此需要的对象对新型隐球菌感染或由这样的感染造成的病症或障碍的抵抗力的方法，包括施用根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求32或33中的任一项的组合物的步骤。

37.根据权利要求35或36的方法，其中对象是免疫受损的。

38.根据权利要求35或36的方法，其中对象感染了HIV-1。

39.根据权利要求35或36的方法，其中对象缺乏1个或多个人V_H3家族基因。

40.根据权利要求35-39中的任一项的方法，其中与施用另一种治疗剂联合施用抗-新型隐球菌GXM抗体或其抗原结合片段。

41.检测新型隐球菌感染的方法，包括：使来自怀疑被感染的对象的样品接触根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或抗原结合片段，并检测所述的抗体或片段与新型隐球菌GXM的结合。

42.根据权利要求1-5，7-12，16，20和24中的任一项的抗体或抗原结合片段，其源自非人转基因动物。

43.根据权利要求42的抗体或抗原结合部分，其中非人转基因动物是XenoMouse^动物。

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