CN1811430A - 一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型单线态氧铕荧光探针及其应用，是以三价铕离子Eu³⁺与含有功能性基团的2，2’：6’2”－联三吡啶骨架结构类配位体形成的配合物，其中所述配位体结构式如上，R＝H，C_nH_2n+1，C₆H₅。这类配合物可通过其功能性基团与单线态氧作用，使配合物的荧光强度发生很大的变化，进而用于单线态氧的荧光测定。

Description

一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及溶液中单线态氧(¹O₂)的测定技术，具体地说是一种新型¹O₂铕配合物荧光探针(即基于铕配合物的新型单线态氧荧光探针)及其应用。

背景技术

单线态氧(¹O₂)是一种氧分子的激发态，它不仅在有机合成中是一种非常有用的氧化剂，而且还具有十分重要的生理活性。在有机合成中，¹O₂使得在高度立体专一的有机化合物中引入氧变得极为容易。¹O₂有以下几种重要的反应：首先，¹O₂可以与单烯烃反应，生成二氧杂环烷烃或烃过氧化物。前者在室温下通常分解为相应的羰基化合物并发光，后者则在相应的条件下生成不饱和酮、烯丙醇或羟基化合物。其次，¹O₂可以和带有N、O或S等给电子杂原子的活泼双键反应，生成四元的1，2-二氧环，紧接着分裂成二醛类结构的化合物。同时，¹O₂能够与链状、环状、芳香、杂环芳香型共轭π键发生Diels-Alder型加成反应，生成内氧化物。除此之外，¹O₂还可与类胡罗卜素、胺类、酚类和杂环类化合物发生较复杂的化学和物理作用，使得¹O₂在生物体系中具有很高的反应活性。在生命体系中，¹O₂是生物体中一种常见的活性氧，它性质活泼、亲电子性强，可以与DNA、蛋白质和脂类物质等多种生物分子反应，起着非常重要的生理作用。¹O₂几乎在所有的生物光氧化系统中作为反应前体产生，是生物细胞光敏化损伤的主要作用物质。它可以破坏血液中红细胞的细胞膜，使细胞发生溶血；同时还可以与氨基酸作用，抑制羟基脱氢酶和胰岛素的活性。在免疫系统中，¹O₂是白细胞吞噬、溶解入侵有机体的主要杀菌剂。

由于¹O₂具有如此重要的作用，检测¹O₂、特别是生物体系中的¹O₂越来越引起人们的关注。从上个世纪70年代开始到现在，¹O₂的检测主要有以下几种方法：(1)利用¹O₂自身淬灭¹Δ_g→³∑_g-产生的磷光来检测¹O₂(文献1：A.A.，Jr.Krasnovsky，Biofzika，1976，21，748)。该方法专一性很高，但灵敏度低、检出信号弱，无法用于低浓度¹O₂的检测。目前，随着检测仪器性能的提高，该方法已经被用于某些生物体系中¹O₂的产生、生理作用和空间分布的研究(文献2：C.Kiryu，M.Makiuchi，J.Miyazaki，T.Fujinaga，K.Kakinuma，FEBS Lett.1999，443，154；文献3：S.Oelckers，T.Ziegler，I.Michler，B.Rder，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.1999，53，121；文献4：L.K.Andersen，P.R.Ogilby，Photochem.Photobiol.2001，73，489；文献5：L.K.Andersen，Z.Gao，P.R.Ogilby，L.Poulsen，I.Zebger，J.Phys.Chem.A 2002，106，8488)。(2)利用¹O₂与带有蒽环的荧光素类探针分子专一性反应，使得探针由原来的非荧光性分子变为强荧光性分子，从而用于¹O₂的检测(文献6：N.Umezawa，K.Tanaka，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1999，38，2899；文献7：K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2001，123，2530)。该方法检测时间短、灵敏度高，但不适用于低pH值环境和实时检测。(3)利用9，10-二苯基蒽(DPA)与¹O₂的特征性反应生成稳定的内氧化物，通过测定DPA吸收光谱的改变来测量¹O₂(文献8：M.J.Stenbeck，A.U.Khan，M.J.Kamovsy，J.Biol.Chem.1992，267，13425；文献9：M.J.Stenbeck，A.U.Khan，M.J.Kamovsy，J.Biol.Chem.1993，268，15649)。该方法已经被用于测定吞噬细胞中产生的¹O₂，但由于检测基于吸收光谱，所以灵敏度较低。(4)利用¹O₂与探针分子之间的能量传递，激发探针分子发出强的迟滞荧光，进而用于¹O₂的检测(文献10：A.A.Jr.Krasnovsky，C.Schweitzer，H.Lesmann，C.Tanielian，E.A.Luk’yanets，Quantum Electron.2000，30，445；文献11：A.A.Jr.Krasnovsky，M.E.Bashtanov，N.N.Drozdova，O.A.Yuzhakova，E.A.Luk’yanets，Quantum Electron.2002，32，83)。该方法适用于多种体系，且发光量子产率是¹O₂磷光的3-5倍。但检测所用的探针同时敏化¹O₂的生成，使测定结果产生偏差。(5)一种基于光诱导电子转移过程的化学发光法检测¹O₂(文献12：X.H.Li，G.X.Zhang，H.M.Ma，D.Q.Zhang，J.Li，D.B.Zhu，J.Am.Chem.Soc.2004，126，11543)。该方法选择性好、灵敏度高、检测迅速，但探针水溶性差，不利于生物体系中¹O₂的测定。

近年来，以稀土荧光配合物为探针的时间分辨荧光测定法已广泛应用于免疫分析、DNA杂交分析、荧光显微生物成像分析等多种测定中。稀土荧光配合物具有荧光寿命长、Stokes位移大、荧光发光峰尖锐等特点，通过使用时间分辨荧光测定法可有效除去各种散乱光和样品本底荧光对荧光测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。

发明内容

本发明的目的是将时间分辨荧光测定法应用于¹O₂的检测，提供一种灵敏度高、选择性及水溶性好、适用范围广的新型¹O₂铕配合物荧光探针。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

以稀土离子与含有蒽环取代2，2’：6’，2”-联三吡啶骨架结构的配位体形成的荧光探针，其所述配位体结构式为：

其中R为氢(H)、烷基(CnH_2n+1)或苯基(C₆H₅)；其中最好n＝1～6。

本发明的荧光探针能用于多种环境下¹O₂的测定，在各类生物及非生物环境中，即利用探针捕获体系中产生的¹O₂，使得探针的荧光强度极大的改变，然后通过测定探针与¹O₂作用前后荧光强度的变化量来测定¹O₂的浓度(产生及生成量)。

其中所述的荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还包括时间分辨荧光测定法及时间分辨荧光显微镜测定法。

本发明铕配合物荧光探针可制备成单线态氧铕配合物荧光探针的¹O₂检测试剂及试剂盒。

本发明的荧光探针具有如下优点：

1.本发明的新型¹O₂荧光探针具有很好的水溶性，适用于生物体系中¹O₂的测定。

2.本发明的新型¹O₂荧光探针稳定性高，能长期保存使用，适用于弱酸性、中性及碱性等多种环境。

3.本发明的新型¹O₂荧光探针具有极高的灵敏度，其最低检测限比已报道的化学发光方法低28倍。

4.本发明的新型¹O₂荧光探针对¹O₂有很好的选择性，与其他的活性氧物种作用荧光信号几乎无变化。

附图说明

图1为铕配合物¹O₂荧光探针的结构式；

图2为配位体ATTA的合成路线；

图3为含有蒽环取代2，2’：6’，2”-联三吡啶骨架结构配位体的合成路线；

图4为ATTA-Eu³⁺(实线，1.0μmol/L)和EP-ATTA-Eu³⁺(虚线，1.0μmol/L)在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光光谱；

图5为EP-ATTA-Eu³⁺(1.0μmol/L)在不同pH值的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的荧光强度(●)和荧光寿命(○)；

图6为EP-ATTA-Eu³⁺(■)和荧光素(□)在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的光稳定性实验结果；

图7为使用ATTA-Eu³⁺检测Na₂MoO₄/H₂O₂体系中定量产生的¹O₂的工作曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1.配位体[4’-(9-蒽基)-2，2’：6’2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺]四乙酸(简称ATTA)的合成。

合成路线如图2所示，基体操作过程如下。

(1)(E)-3-(9-蒽基)-1-(2’-吡啶基)-2-丙烯酮(化合物1)的合成

将10.31克9-蒽醛(50mmol)和2.81克KOH(50mmol)混合溶于200ml甲醇与40ml水组成的混合溶液中；搅拌30分钟后，缓慢滴加6.06克2-乙酰基吡啶(50mmol)于反应体系中，室温下搅拌24小时；过滤收集沉淀，粗产品用乙醇重结晶；得目标化合物12.77克，产率：82.6％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝8.48-8.54(m，5H)；7.92(m，1H)；8.03(d，J＝8.4Hz，2H)；8.27-8.31(m，2H)；8.37(d，J＝8.0Hz，2H)；8.48(s，1H)；8.70(d，J＝4.4Hz，1H)；8.93(d，J＝16.0Hz，1H)。

(2)4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物2)的合成

在500ml干燥甲醇中加入15.47克化合物1，16.46克[2-(2’-吡啶基)-2-氧代乙基]吡啶碘化物(50mmol)和23.12克干燥的醋酸铵，反应液回流搅拌24小时；减压蒸除溶剂，残留物用400ml氯仿抽提；蒸除氯仿后，粗产品用硅胶柱层析分离，用2∶1的石油醚-乙酸乙酯做洗脱剂，收集第二个组份；产品用乙腈洗涤，真空干燥，得目标化合物5.48克，产率：26.8％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝7.26-7.37(m，4H)；7.47(t，J＝7.6Hz，2H)；7.71(d，J＝8.8Hz，2H)；7.92(m，2H)；8.07(d，J＝8.8Hz，2H)；8.55(s，1H)；8.61(s，2H)；8.63(d，J＝4.0Hz，2H)；8.79(d，J＝8.0Hz，2H)。元素分析结果，计算值：C 85.06％，H 4.68％，N 10.26％；实测值：C 84.66％，H 4.63％，N 9.90％。

(3)6，6”-二腈基-4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物3)的合成

将3.3克化合物2(8.0mmol)和6.9克80％的间氯过氧化苯甲酸(32.0mmol)溶于160ml二氯甲烷中，室温下搅拌24小时；有机相用150ml 10％的Na₂CO₃溶液洗涤两遍，无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂，真空干燥；将上述得到的产品与6.34克Me₃SiCN(64.0mmol)溶于200ml CH₂Cl₂中，室温下搅拌1小时后，缓慢滴加入5.62克苯甲酰氯(40.0mmol)，室温下搅拌24小时；减压蒸除溶剂，加入200ml 10％K₂CO₃溶液，室温下搅拌1小时；过滤收集沉淀，粗产品用乙腈洗涤；得目标化合物2.34克，产率：63.6％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝7.40(t，J＝7.2Hz，2H)；7.50(t，J＝8.0Hz，2H)；7.63(d，J＝8.8Hz，2H)；7.75(d，J＝7.2Hz，2H)；8.05-8.12(m，4H)；8.61(s，1H)；8.72(s，2H)；8.98(d，J＝8.0Hz，2H)。

(4)4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲酸二甲酯(化合物4)的合成

将1.89克化合物3(4.1mmol)溶于12ml浓硫酸、24ml冰醋酸和6ml水配成的混合溶液中，85-90℃下搅拌12小时；反应液到入500ml冰水中，过滤收集沉淀，真空干燥；

将4.11克SOCl₂(34.6mmol)在冰浴下缓慢加入到125ml干燥的甲醇中，搅拌20分钟后，加入上述水解产物，搅拌回流24小时；减压蒸除溶剂，加入100ml 10％的Na₂CO₃溶液中，过滤收集沉淀，真空干燥；粗产品用硅胶柱层析分离，用95∶5的氯仿-甲醇洗脱，收集第一个组分；得目标化合物1.56克，产率：72.4％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝3.90(s，6H)；7.36(t，J＝8.8Hz，2H)；7.50(t，J＝7.2Hz，2H)；7.66(d，J＝8.8Hz，2H)；8.06-8.12(m，4H)；8.19(d，J＝8.0Hz，2H)；8.61(s，1H)；8.73(s，2H)；8.99(d，J＝7.2Hz，2H)。

(5)6，6”-二羟甲基4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物5)的合成

将1.52克化合物4(2.9mmol)溶于48ml无水乙醇中，搅拌形成悬浊液；加入0.44克NaBH₄(11.6mmol)室温下搅拌2小时，再回流搅拌8小时；减压蒸除溶剂，加入8ml饱和NaHCO₃溶液加热至沸；冷却后加入60ml水，过滤收集沉淀，粗产品用水和乙腈洗涤，真空干燥；得目标化合物1.02克，产率：74.9％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝4.74(s，4H)；7.25(d，J＝7.8Hz，2H)；7.36(t，J＝7.8Hz，2H)；7.48(t，J＝7.8Hz，2H)；7.67(d，J＝8.0Hz，2H)；7.90(t，J＝7.8Hz，2H)；8.09(d，J＝8.8Hz，2H)；8.58(s，1H)；8.60(s，2H)；8.68(d，J＝8.0Hz，2H)。

(6)6，6”-二溴甲基-4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物6)的合成

在40ml无水DMF中加入1.21克PBr₃(4.5mmol)，室温下搅拌15分钟后加入0.84克化合物5(1.8mmol)，继续搅拌24小时；反应结束后加入饱和NaHCO₃溶液中和，过滤收集沉淀，粗产品用水和乙腈洗涤，真空干燥；得目标化合物0.83克，产率：77.9％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝4.52(s，4H)；7.38(t，J＝7.8Hz，2H)；7.49(m，4H)；7.70(d，J＝7.8Hz，2H)；7.92(t，J＝7.8Hz，2H)，；8.10(d，J＝8.0Hz，2H)；8.59(s，1H)；8.65(s，2H)；8.70(d，J＝8.0Hz，2H)。

(7)4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡-6，6”-二甲胺四乙酸乙酯(化合物7)的合成

将0.60克化合物6(1mmol)、0.42克二乙酸乙酯基胺(2.2mmol)和1.38克无水K₂CO₃(10mmol)加入70ml干燥的乙腈和21ml干燥的四氢呋喃配成的混合溶液中，搅拌回流24小时；过滤除去不溶物，减压蒸除溶剂；将生成物溶于100ml氯仿中，用相同体积的饱和NaHCO₃及水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后用硅胶柱层析分离，淋洗剂为2∶1∶0.3的石油醚-乙酸乙酯-三乙胺，收集第一个组份；减压蒸除溶剂后产品用少量石油醚洗涤，真空干燥；得目标化合物0.55克，产率：68.0％。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：δ＝1.07(t，J＝7.2Hz，12H)；3.58(s，8H)；3.97-4.02(m，12H)；7.37(t，J＝8.0Hz，2H)；7.48(t，J＝7.2Hz，2H)；7.64(d，J＝8.0Hz，2H)；7.72(d，J＝7.2Hz，2H)；7.90(t，J＝8.0Hz，2H)；7.72(d，J＝8.0Hz，2H)；8.57(s，3H)；7.72(d，J＝8.0Hz，2H)。

(8)[4’-(9-蒽基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺]四乙酸(ATTA)的合成

将1.39克化合物7(1.7mmol)溶于60ml乙醇和10ml水配成的混合溶液中，再加入2.02克KOH(36.0mmol)，回流搅拌2小时；减压蒸除溶剂后，产物溶于30ml水中，用1∶1的盐酸调pH值至3左右，室温下搅拌3小时；过滤收集沉淀，用水、乙腈充分洗涤；得目标化合物0.81克，产率：65.6％。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：δ＝3.45(s，8H)；3.96(s，4H)；7.47(t，J＝8.0Hz，2H)；7.56-7.63(m，4H)；7.80(d，J＝8.0Hz，2H)；8.08(t，J＝8.0Hz，2H)；8.23(t，J＝8.0Hz，2H)；8.43(s，2H)；8.69(d，J＝8.0Hz，2H)；8.82(s，1H)。元素分析结果，按C₃₉H₃₃N₅O₈·1.5H₂O计算值：C 64.64％，H 4.99％，N 9.64％；实测值：C 64.52％，H 5.38％，N 9.30％。ESI-MS：m/z(％)：698(100)M^--H]。

实施例2. 10-甲基-9-蒽基及10-苯基-9-蒽基取代[2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺]四乙酸配位体的合成

合成路线如图3所示，合成操作方法与实施例1相同。

实施例3. 配位体ATTA与Eu³⁺的配合物(简称ATTA-Eu³⁺)与¹O₂的反应

将36mg ATTA(0.05mmol)和18mg EuCl₃·6H₂O(0.05mmol)溶于pH值10.5的NaHCO₃-NaOH缓冲溶液中，室温下搅拌2小时后，加入1.2gNa₂MoO₄·2H₂O(5mmol)和500μl30％H₂O₂，再搅拌30分钟；观测反应液的荧光强度变化，继续加入H₂O₂，直至反应液荧光强度不再变化；用HCl将反应液的pH值调到3左右，过滤收集沉淀，水洗后真空干燥；ATTA-Eu³⁺与¹O₂反应生成的内氧化物(简称EP-ATTA-Eu³⁺)经ESI-MS确定：ESI-MS：m/z(％)：882(10)[M^--H]。

实施例4. 探针ATTA-Eu³⁺及其与¹O₂结合生成的内氧化物EP-ATTA-Eu³⁺的荧光性质测定

(1)荧光光谱、荧光强度及荧光寿命

用pH值9.1的0.05mol/L硼酸钠缓冲溶液为溶剂测定了ATTA-Eu³⁺在该溶剂中的紫外可见光谱、荧光光谱、摩尔消光系数(ε)、荧光量子收率(φ)及荧光寿命(τ)。EP-ATTA-Eu³⁺由ATTA-Eu³⁺与Na₂MoO₄/H₂O₂在pH值10.5的0.1mol/LNaHCO₃-NaOH缓冲溶液中制备，再用pH值9.1的0.05mol/L硼酸钠缓冲溶液稀释10倍后，测定其在该溶剂中的荧光性质。紫外可见光谱测定用仪器为天美UV7500分光光度计。荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计；荧光量子产率测定使用4’-苯基-2，2’：6’，2”-联三吡-6，6”-二甲胺四乙酸铕的配合物作为标准物测得(文献13：M.Latva，H.Takalo，V.M.Mukkala，C.Matachescu，J.C.Rodriguez-Ubis，J.Kankare，J.Lumin.，1997，75，149-169)，计算式为φ₁＝I₁ε₂C₂φ₂/I₂ε₁C₁，式中I₂、ε₂、C₂、φ₂为标准物的荧光强度、摩尔消光系数、浓度和荧光量子收率，I₁、ε₁、C₁、φ₁为待测物的荧光强度、摩尔消光系数、浓度和荧光量子产率。

测定结果见表1。

表1.ATTA-Eu³⁺和EP-ATTA-Eu³⁺在硼酸钠缓冲溶液中的吸收及荧光性质

化合物	最大吸收波长(nm)	摩尔消光系数，335nm(mol-1Lcm-1)	最大荧光发光波长(nm)	荧光量子产率(％)	荧光寿命(ms)
						ATTA-Eu3+	294，335	17200	615	0.58	0.989
EP-ATTA-Eu3+	294，335	14500	615	10.0	1.209

由表1可见，探针ATTA-Eu³⁺与¹O₂反应前后其荧光强度发生了很大的变化，ATTA-Eu³⁺荧光很弱，而EP-ATTA-Eu³⁺具有很强的荧光。两种化合物的荧光光谱如图4所示。

(2)溶液pH值对EP-ATTA-Eu³⁺荧光性质的影响

将EP-ATTA-Eu³⁺用不同pH值的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，测定其在不同pH值下的荧光强度和荧光寿命，其结果见图5；由图可见，在pH值大于3的范围内，EP-ATTA-Eu³⁺的荧光强度和荧光寿命受pH值的影响不大，表明该探针在弱酸性、中性和弱碱性环境中均可使用。

(3)EP-ATTA-Eu³⁺的光稳定性

分别将荧光素和EP-ATTA-Eu³⁺的水溶液在30W的氘灯下照射65分钟，每隔5分钟记录一次荧光强度，结果如图6所示；由图6可以看出EP-ATTA-Eu³⁺比荧光素类探针具有更好的光稳定性，更加适用于生物体系中¹O₂的荧光显微镜成像测定。

实施例5.使用ATTA-Eu³⁺定量测定Na₂MoO₄/H₂O₂体系产生的¹O₂

在pH值10.5的0.1mol/L NaHCO₃-NaOH缓冲溶液中分别加入ATTA-Eu³⁺(100nmol/L)、Na₂MoO₄(10mmol/L)和一系列浓度的H₂O₂(该体系中每2分子的H₂O₂产生1分子的¹O₂)；37℃下放置18小时后对反应液进行时间分辨荧光测定。测定用仪器为Wallac Victor 1420多标记计数仪(Perkin Elmer Life Sciences公司产)，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；延迟时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。

如图7所示，¹O₂的量与荧光强度具有很好的线性关系，说明¹O₂可被探针ATTA-Eu³⁺定量检测。用本底信号标准偏差的3倍计算最低检出限，得ATTA-Eu³⁺对¹O₂的最低检出限为2.8nmol/L，比已报道的化学发光方法低28倍。

实施例6.ATTA-Eu³⁺对¹O₂的选择性检出

在含有100nmol/LATTA-Eu³⁺的pH值8.4的0.1mol/L NaHCO₃缓冲溶液中分别加入10μmol/L H₂O₂，10μmol/L H₂O₂和10μmol/L硫酸亚铁铵(·OH)及10μmol/L KO₂(O₂ ^-)，然后观测其荧光变化；探针ATTA-Eu³⁺与上述活性氧成分作用后，荧光强度分别增加了12％，76％和6％，远小于¹O₂(增加1246％)，说明ATTA-Eu³⁺对¹O₂具有非常高的选择性。

Claims (5)

1.一种单线态氧铕配合物荧光探针，其特征在于：是以三价铕离子Eu³⁺与含有功能性基团的2，2’：6’2”-联三吡啶骨架结构类配位体形成的配合物，其中所述配位体结构式为：

R＝H，C_nH_2n+1，C₆H₅

2.根据权利要求1所述单线态氧铕配合物荧光探针，其特征在于：其中n＝1～6。

3.一种权利要求1所述单线态氧铕配合物荧光探针的应用，其特征在于：在各类生物及非生物环境中，利用所述的铕配合物荧光探针捕获体系中的¹O₂，使得探针的荧光强度极大的改变，然后通过荧光测定法测定探针与¹O₂作用前后荧光强度的变化量来测定¹O₂的浓度，确定¹O₂的产生及生成量。

本发明铕配合物荧光探针可

4.根据权利要求3所述单线态氧铕配合物荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光测定法为常规的荧光测定法、时间分辨荧光测定法或时间分辨荧光显微镜测定法。

5.根据权利要求1所述单线态氧铕配合物荧光探针的应用，其特征在于：用于制备成含有权利要求1所述单线态氧铕配合物荧光探针的¹O₂检测试剂及试剂盒。

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