CN1772214A - 复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，所述组合物主要成分质量组成如下：积雪草15～45份，制大黄6～10份，桃仁6～10份，黄芪9～45份，当归6～20份；所述方法按如下：桃仁脱脂后与积雪草、黄芪合并进行醇提得提取液；制大黄润湿后进行渗漉，得提取液；取当归萃取挥发油，得药渣中加入乙醇水溶液作为夹带剂，萃取，得萃取液；(4)上述所得提取液、萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与所得挥发油加稀释剂混匀，过筛，得混悬药液，即为复方积雪草中药有效成分。本发明所述的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法有效成分提取充分，疗效好；所得有效成分安全、稳定，可根据需要制成任何剂型，尤其适用于软胶囊的制备。

Description

复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法

(一)技术领域

本发明涉及一种复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法。

(二)背景技术

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是各种原因所致肾损害后病情持续进展的结果，严重危害人类健康。我国每百万人口中约有100人死于CRF。当前，虽然替代疗法(透析、移植)对终末期肾衰(end stage renal disease，ESRD)的治疗有较大的作用，但不能解决该病的早中期防治问题，而且费用昂贵。肾衰一体化治疗新概念认为，尽管CRF呈慢性进展，但除了在病变活动期使用激素和免疫抑制剂外，还应严格控制血压、最大程度降低蛋白尿、合理使用阻断肾素-血管紧张素系统药物等，尽量避免过度启动残肾单位的代偿机制，使肾脏功能得以最大的保存，这样才有可能使病变进展延缓至最低程度。因此，如何控制疾病发展、改善肾功能和延缓肾衰进程已成为肾脏病专业的主攻方向之一。

临床实践证明，药材提取生产工艺对疗效影响非常显著。本发明人的已有专利：专利申请号为200410024761.7、发明名称为“一种含积雪草的中药组合物及其应用”的发明专利，提供了一种复方积雪草中药组合物，可对抗肾细胞纤维化、用于早期防治和延缓慢性肾功能衰竭，其中药有效成分的提取方法仅为普通的水煎法，难以达到中药组合物有效成分的充分利用、不能更好的发挥其疗效。

(三)发明内容

本发明既是为了提供一种有效成分提取充分、疗效好的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，所中药组合物主要成分质量组成如下：积雪草15～45份，制大黄6～10份，桃仁6～10份，黄芪9～45份，当归6～20份；所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，静置，过滤，滤液用大孔树脂提纯，以水、乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂混匀，过筛，得混悬药液，即为复方积雪草中药有效成分。

特别的，所述的中药组合物质量组成如下：积雪草20份，制大黄10份，桃仁10份，黄芪20份，当归6份；

所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，静置，过滤，滤液用大孔树脂提纯，以水、乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成千粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂混匀，过筛，得混悬药液，即为复方积雪草中药有效成分。

或者，所述的方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，加入药材总质量6～12倍的40～70％乙醇水溶液，回流提取2～3次，合并提取液，静置过夜，过滤，滤液过大孔树脂，滤液与树脂质量比为1∶1.5～2.5，柱床径高比1∶3～4，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液进行洗脱，收集70％乙醇洗脱液量为树脂用量10～20倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿1～5h后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液量为干药材质量4～8倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入质量为药渣40％的40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，45～65℃、24～45Mpa下萃取1.5～3.5h，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂，混匀，过筛，得混悬药液，即为所述复方积雪草中药组合物有效成分。进一步，所述的方法按如下步骤进行：

(1)桃仁于SFE-CO₂萃取釜内萃取，弃去挥发油，脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，加入药材总质量10倍的60％乙醇水溶液，回流提取2次，每次3h，合并提取液，静置过夜，过滤，滤液过大孔树脂，滤液与树脂质量比为1∶2，柱床径高比1∶3，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液进行洗脱，收集70％乙醇洗脱液量为树脂用量20倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)制大黄润湿5h后，装入渗漉筒，70％乙醇水溶液浸渍24h，收集渗漉液量为干药材质量6倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于SFE-CO₂萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入质量为药渣40％的70％乙醇水溶液作为夹带剂，置于SFE-CO₂萃取釜中，釜温65℃、压力45Mpa下萃取2.5h，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，-35～50℃下冷冻4h后，抽真空至12～20MPa、水分含量小于3％，缓慢升温至50℃，得冻干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加PEG-400，混匀，过筛，得混悬药液，即为所述复方积雪草中药组合物有效成分。

本发明所述的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法的有益效果主要体现在：(1)有效成分提取充分，疗效好；(2)所得有效成分安全、稳定，可根据需要制成任何剂型，尤其适用于软胶囊的制备。

(四)附图说明

图1为日服干膏量试验研究的提取工艺流程图；

图2为回流提取法试验研究提取工艺流程图；

图3积雪草苷标准曲线图，线性方程：Y＝95404.4X-4721.6(r＝0.9992)；

图4黄芪甲苷HPLC色谱图，(A)为对照品、(B)为样品；

图5黄芪甲苷UV扫描图；

图6为黄芪甲苷标准曲线图，线性方程：94.37X+734.84(r＝0.9996)

图7为黄芪甲苷洗脱曲线图，黄芪甲苷峰面积10×106；

图8为大黄素标准曲线图；

图9为阿魏酸色谱图，(A)为对照品、(B)为样品；

图10为阿魏酸标准曲线图，线性方程：Y＝6798.89X-1.89(r＝0.9998)

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：

在明确药材来源、产地、主要有效成分的前提下，为了选择合理、简而易行的提取方法，依据处方中各有效成分的理化性质：积雪草的积雪草苷(asiaticoside)和黄芪的黄芪甲苷(astragaloside)，桃仁(脱脂)的苦杏仁苷(amygdalin)均易溶于水、稀醇；大黄的大黄素(emodin)和大黄酸(rhein)等蒽醌衍生物易溶于乙醇、热水；当归的挥发油易被水蒸气蒸馏出，易溶于乙醇、乙醚、醋酸乙酯等有机溶剂，但在蒸馏过程中挥发油主成分-藁本内酯(lingustilide)容易异构化而生成4-羟基-3-甲基-乙酰苯、三甲基苯甲醛等次生物质；阿魏酸(ferulic acid)易溶于水、稀醇，但在水溶液中不稳定，酸性溶液中较稳定。同时结合剂型要求，对药材的提取方法作了预试和各种方法的比较试验。首先以日服干膏量为考察指标，进行了水提醇沉与回流提取加大孔树脂提纯法的比较试验；再以积雪草苷、黄芪甲苷的含量及TLC斑点显色反应为指标，进行了积雪草、黄芪、脱脂桃仁提取溶媒的选择和黄芪药材粒度选择试验；以大黄素、大黄酸的TLC斑点显色反应为指标，进行了大黄SFE-CO2萃取法与渗漉法提取的比较试验；又根据当归挥发油、阿魏酸的理化特性，以挥发油得率为指标，进行了水蒸气蒸馏法与超临界流体萃取法的比较试验；以阿魏酸含量为指标，进行了酸性溶剂回流法与超临界流体萃取法加夹带剂的比较试验；以及以阿魏酸的TLC荧光斑点为追踪指标，进行了夹带剂浓度的选择试验等多项研究。

(1)药材积雪草、制大黄、桃仁、黄芪、当归。

(2)试剂药用酒精，对照品：积雪草苷、黄芪甲苷、苦杏仁苷、大黄素、大黄酸、阿魏酸，乙醚、氯仿、苯等均为分析纯，甲醇为色谱纯。

(3)仪器设备HPLC仪、CS-930扫描仪、UV分析仪，标准挥发油测定器，回流提取器(磨口)，SEF-CO₂萃取设备(1L-HA231-50-2.5和10L-HA220-40-48型，江苏南通华安超临界萃取有限公司)。

实施例1：日服处方配比量的不同提取方法得干膏量(或装0号胶囊数量)的考察：

①水提醇沉法：

由于处方中有效成分积雪草苷、黄芪甲苷、苦杏仁苷、阿魏酸、大黄素、大黄酸等均易溶于热水，积雪草、黄芪中又有大量多糖等杂质存在，故按常规临床用药习惯采用水提醇沉法。

投料：取日服的处方配比量。

日服干膏量试验研究的提取工艺流程见图1。

结果：经水提醇沉，得干膏8.2g，当归挥发油β-CD包合物1.58g，计9.78g。装入0^#胶囊，每粒0.46g，大约能制成21粒。按日服用剂量每日服用三次，每次7粒，服用量太大，病人难以接受。因而，说明水提醇沉后仍有诸多杂质存在，本法不适合胶囊剂型。

②溶剂回流后，再经大孔树脂提纯法

投料量同①法。积雪草、黄芪、脱脂桃仁、大黄、当归挥发油提取后的药渣，用70％乙醇10倍量，回流提取二次，每次2h，合并提取液，回收乙醇至无醇味，提取液通过大孔树脂吸附(药材量-大孔树脂＝1∶10)，依次以大量水洗脱(经TLC检查，无积雪草苷、黄芪甲苷、蒽醌类，弃去)，再以70％乙醇充分洗至TLC斑点无皂苷类、蒽醌类化合物的显色反应。收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，称重。

结果：得干膏2.56g，加挥发油包合物，计4.14g。同①法装9粒胶囊。日服三次，每次三粒。说明该工艺可把大量杂质除去，既保留了有效成分，又可使服用量减少。

③结论：根据预试结果，采用溶剂回流，再经大孔树脂提纯法可以满足胶囊剂型的要求。

④讨论：处方中积雪草、黄芪、桃仁的主要有效成分为水溶性成分，可以采用溶剂回流法。而大黄的大黄素和当归的阿魏酸及其挥发油中的藁本内酯对热、或在水中不稳定等性质，需经提取方法考察后，方能确定提取方法。

实施例2：含水溶性成分药材——积雪草、黄芪、桃仁的溶剂回流提取方法研究试验

①回流提取法溶媒的选择试验

②根据药材中主要有效成分——积雪草苷、黄芪甲苷、苦杏仁苷的理化性质，均易溶于水或稀醇，故选择水或不同浓度乙醇作为提取溶媒进行试验。

方法：取积雪草、黄芪(饮片)各20g、脱脂桃仁7g(n＝2)。分别用水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH回流提取，以积雪草苷、黄芪甲苷为考察指标，进行TLC检测。

回流提取法试验研究提取工艺流程见图2。

试验用的脱脂桃仁，采用EtOAC为溶媒用索氏提取器，回流脱脂法。

水、不同浓度的乙醇回流提取的检测结果：

#.以黄芪甲苷为指标的TLC检测方法

分别将黄芪甲苷对照品溶液、提取液(水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH)，定量点在同一块硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。

#.以积雪草苷为指标的TLC检测方法

分别将积雪草苷对照品溶液、提取液(水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH)，定量点在同一块硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)作展开剂，展开，取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液显色，在100℃加热至斑点显色清晰。

#.不同溶媒提取物TLC检测结果，见表1。

                     表1不同溶媒提取物TLC检测结果

药材	指标成分	H2O-ext.	40％EtOH-ext.	70％EtOH-ext.	95％EtOH-ext	TLC显色斑点
							积雪草	积雪草苷	不明显	明显	明显	不明显	蓝色
黄芪	黄芪甲苷	不明显	略明显	明显	不明显	紫色

结论：40～70％乙醇回流提取效果为佳。

实施例3：黄芪粒度选择试验

根据黄芪有效成分黄芪甲苷易溶于稀醇的理化特性和实施例2实验结果，采用60％EtOH为溶媒进行药材粒度的正交试验。

①因素水平设计

不同粒度(A)、溶媒量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)是影响黄芪甲苷提取率的主要因素，设计三因素四水平，以黄芪甲苷为考察指标，进行L₉(3⁴)正交试验，选择最佳药材粒度。因素水平表(见表2)。

                          表2因素水平设计

水平	因素
					黄芪粒度A	溶媒量B(倍)	提取时间C(h)	提取次数(D)
	123	粗粉黄豆粒大饮片	6810	123					123

②正交试验

I.方法  取不同粒度(粗粉、黄豆粒大、饮片)药材各约20g，精密称定，加60％EtOH，分别回流提取，按L₉(3⁴)安排试验，滤液浓缩至干膏，加甲醇50ml，超声处理30min，滤过，滤液回收甲醇并浓缩至干，残渣加20ml水微热使溶解，如下同上述黄芪药材的[含量测定]项下进行测定。

II.结果(见表3、4)。

                             表3正交试验结果分析(n＝3)

试验号	A	B	C	D	黄芪甲苷含量(％)
								yi1	yi2	yi
					123456789	111222333	123123123				123231312	123312231	0.1270.1470.1510.2010.1170.1380.0840.2570.078	0.1250.1440.1580.2010.1270.1240.0990.1920.075	0.2520.2910.3090.4020.2440.2620.1830.4490.153
IjIIjIIIjIj 2IIj 2IlIj 2RjSj	0.8520.9080.7850.7260.8240.6162.1160.422	0.8370.9840.7240.7013.9680.5242.1930.442	0.9630.8460.7360.9270.7160.5422.1850.436	0.6790.7361.1600.4610.5421.3462.3490.560				G＝2.545CT＝0.360S总＝0.038S总1＝0.036f总＝17f总1＝8Se＝0.002fe＝9

                               表4方差分析结果

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						AB	0.4220.442	22	0.2110.221	949.5994.5	P＜0.01P＜0.01

CD误差Se

0.4360.5600.002

229

0.2180.2800.0002

9811260

P＜0.01P＜0.01

F_0.05(2，9)＝4.26    F_0.01(2，9)＝8.02

③结论  表3直观分析结果表明，因素对黄芪甲苷含量的影响大小顺序为：D＞B＞C＞A。表4方差分析结果表明，因素A、B、C、D均有显著性意义。故选择A₂B₂C₁D₃为最佳条件，即黄豆粒大，8倍量60％EtOH提取三次，每次1h。

实施例4：桃仁脱脂法选择试验

①溶剂脱脂法  取10g(n＝2)桃仁粗粉，置于索氏提取器，加入醋酸乙酯100ml，回流提取6h，桃仁油提取率约30％。

②SFE-CO2法脱脂  取桃仁粗粉500g(n＝2)投入萃取釜I中，温度45℃，压力25MPa，流量36kg/h；分离釜I：温度40℃，压力8MPa；分离釜II：温度40℃，压力6MPa；分离釜III：温度40℃，压力6MPa；萃取6h，桃仁油提取率约44％。

③结论  采用SFE-CO2脱脂法，脱脂较完全，简而易行。

实施例5：桃仁的苦杏仁苷提取方法选择试验

①SFE-CO2萃取法  取500g桃仁脱脂后的残渣，直接加夹带剂60％乙醇110ml，萃取釜I，温度60℃，压力40Mpa，流量36kg/h；分离釜I：温度50℃，压力8MPa；分离釜II：温度40℃，压力6MPa；分离釜III：温度40℃，压力6MPa；萃取1h，补加60％乙醇50ml，继续萃取2h。收集分离釜I、II、III萃取液，分别用50％甲醇定容至50ml容量瓶中，作为供试品溶液。

②溶剂回流提取法  取脱脂后桃仁残渣100g，加10倍量60％乙醇，回流提取二次，每次3h，合并提取滤液，回收乙醇，浓缩至干，用50％甲醇溶解，并定容至10ml容量瓶中，作为供试品溶液。

③苦杏仁苷检测与结果  照药典附录VIB薄层色谱法。称取对照品苦杏仁苷，用50％甲醇溶解，配制成1.25mg/ml，作为对照品溶液。分别吸取对照品、①、②供试液2μl点于同一块硅胶G薄层板上，以CHCl₃-EtOAc-MeOH-H₂O(15∶40∶22∶10)，5～10℃放置12h的下层溶液为展开剂，展开，取出，立即喷以磷钼酸硫酸溶液显色剂，105℃烘约10min，比较各显色斑点。

结果  供试品色谱中，在于对照品色谱相应位置上，供试液②有明显的相同显色斑点，而供试液①的斑点模糊。

④结论  以溶剂回流法提取苦杏仁苷为宜。可与积雪草、黄芪合并提取。

实施例6：当归挥发油提取方法选择试验

①水蒸气蒸馏法  照2000年版药典一部附录XD挥发油测定法进行提取。

I.试验  取100g当归饮片(n＝3)，加水1500ml，蒸馏8h，得比重＞1和比重＜1的挥发油，芳香水呈乳白状，用乙醚萃取后，计当归挥发油量。

II.挥发油测定结果，见表5。

                   表5水蒸气蒸馏法挥发油测定结果

批次(g)	药材取样量(ml)	加水量(ml)	芳香水和挥发油总计(ml)	挥发油(ml)
					021201021205021210	100100100	150015001500	900950930	0.500.450.43

结果  每批次含挥发油分别为0.50、0.45、0.43％，平均挥发油含量为0.46％。

②超临界流体萃取法萃取挥发油

I.萃取条件取当归粗粉(三批)，投入萃取釜中，萃取釜温度45℃，压力30MPa；分离釜I温度65℃，压力10MPa；分离釜II温度60℃，压力8MPa；分离釜III温度55℃，压力6MPa；提取时间2h；CO₂流量36kg/h。

II.挥发油(含油脂)测定结果，见表6。

                表6 SFE-CO₂萃取法挥发油(含油脂)测定结果

批次	投料量(g)	挥发油(含油脂)(ml or g)	挥发油(含油脂)得率(ml/100gor％)	残渣量(g)
					030411030416030418	770802750	15ml(13g)12ml(10g)12ml(8g)	1.95ml/100g(1.69％)1.50ml/100g(1.62％)1.60ml/100g(1.06％)	729789738

结果：三次SFE-CO₂萃取当归挥发油(含油脂)得率平均为1.44％(或1.68ml/100g)。

III、SFE-CO₂萃取当归挥发油(含油脂)的挥发油含量测定

照2000年版药典一部附录XD挥发油测定法，取批号030411、030416、030418的含油脂挥发油，分别加500ml水，蒸馏至挥发油的量不再增加，读取挥发油ml数。

结果：各批号分别得挥发油：8、7、6.5ml，平均含量为0.9％。

③结论：由于水蒸气蒸馏法挥发油得率低，且蒸馏过程产生异构化等弊端，SFE-CO2萃取法得率为水蒸气蒸馏法近2倍，故采用SFE-CO2萃取法。

实施例7：阿魏酸提取方法选择试验

根据阿魏酸的理化特性，既可以用酸水回流提取，又可以采用加夹带剂的超临界流体萃取法萃取，故分别进行试验，以阿魏酸含量为考察指标，选择最佳提取方法。

①酸水回流提取法

I.试验  取当归提取挥发油后的残渣100g(n＝3)，加含有0.8％冰醋酸的水600ml，回流提取二次(2h，1h)，合并酸水提液，滤过，滤液浓缩至干，105℃烘12h，得干膏粉52g。

II.阿魏酸测定  取干膏粉3.12mg，加甲醇50ml超声提取1h，趁热过滤至50ml容量瓶中，定容。HPLC法测定阿魏酸含量(HPLC测定条件同当归药材项下)。

III.结果  三批阿魏酸含量分别为0.40、0.43、0.40mg/g，平均0.41mg/g。

②SFE-CO₂萃取法

I.SFE-CO₂萃取夹带剂浓度的选择试验

取当归提挥发油后的药渣250g(n＝2)，分别用20％、40％、70％、95％EtOH作夹带剂，加入量均为药材用量的40％，SFE萃取阿魏酸，萃取条件如下：萃取釜温度55℃，压力30MPa；分离釜I温度50℃，压力15MPa；分离釜II温度45℃，压力8MPa；分离釜III温度40℃，压力6Mpa，萃取2.5h。

II.检测方法  以阿魏酸为指标，采用TLC和HPLC两种检测方法。

II-A.TLC检测方法  取阿魏酸对照品溶液、20％EtOH、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH萃取液，分别定量点于同一薄层板上，用苯-氯仿-甲醇(2∶2∶0.6)作展开剂，展开，取出，晾干，105℃烘约10min，紫外灯(365nm)下检视。

II-B.HPLC含量测定方法分别取20、40、70、95％EtOH萃取液照当归药材阿魏酸含量测定项下测定阿魏酸的含量。

III.结果

III-A.TLC检测结果，见表7。

                    表7不同浓度的夹带剂萃取的TLC检测结果

药材	指标成分	20％EtOH萃取	40％EtOH萃取	70％EtOH萃取	95％EtOH萃取	TLC显色斑点
							当归	阿魏酸	不明显	明显	明显	明显	蓝色荧光

结果  以40％～95％EtOH作夹带剂的提取液，斑点颜色明显。

III-B.HPLC阿魏酸含量测定结果，见表8。

                       表8不同浓度的夹带剂萃取的HPLC测定结果

药材	指标成分	20％EtOH萃取	40％EtOH萃取	70％EtOH萃取	95％EtOH萃取
						当归	阿魏酸(mg/g)	0.11	0.32	0.41	0.37

①结论

I.酸水回流提取与加夹带剂SFE-CO₂法萃取所提取的阿魏酸含量相近，但SFE-CO₂法操作简单、省时、方便，故选择加夹带剂SFE-CO₂法萃取当归阿魏酸。

II.选用40～95％乙醇作为夹带剂均可，其中以70％乙醇的萃取率最高，故选用该浓度作为夹带剂。

实施例8：大黄的大黄素、大黄酸提取方法选择试验

①SFE-CO₂萃取法  取大黄粗粉500g，照文献萃取条件：夹带剂为甲醇，用量为药材量的40％，萃取釜温度70℃，压力42MPa，分离釜I温度35℃，压力10MPa；分离釜II温度25℃，压力5MPa；分离釜III温度25℃，压力4.5MPa；萃取时间3h，CO₂流量36kg/h。收集分离釜I、II、III萃取液，蒸干，用甲醇定容至50ml容量瓶中，作为供试品溶液。

②渗漉法  取大黄粗粉100g(n＝3)，用60％乙醇80ml润湿，密闭放置3h后，装入渗漉筒内，60％乙醇浸渍24h，以1ml/min流速渗漉提取，收集洗脱液的量为药材重量的6倍。浓缩至干，用甲醇溶解，并移至10ml容量瓶定容，作为供试品溶液。

③大黄素、大黄酸检测方法与结果  照药典附录VIB薄层色谱法。称取对照品  大黄素、大黄酸各5mg，分别加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取对照品、①、②供试液2μl点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。应显相同橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。

结果  供试品色谱中，在于对照品色谱相应位置上，供试液②有明显而清晰的相同显色斑点，而供试液①的斑点不十分清晰。

④结论  渗漉法优于SFE-CO2萃取法。

实施例9：药材最佳提取生产工艺条件研究

在确定药材提取方法的基础上，对处方中各味药材的提取生产工艺条件进行了预试和设计。即采用正交设计试验，通过直观与方差分析，确立最佳生产工艺条件。本研究分别以积雪草苷、黄芪甲苷含量为指标，考察溶剂回流法提取积雪草、黄芪、脱脂桃仁，以及大孔树脂对提取物提纯的最佳生产工艺条件；以大黄素、大黄酸含量为指标，考察最佳渗漉生产工艺条件；以挥发油得率、阿魏酸含量及薄层层析荧光斑点为指标，考察超临界流体萃取当归挥发油及加夹带剂萃取阿魏酸的最佳生产工艺条件。

1、仪器、设备、试剂与药材

(1)仪器  岛津LC-10AT高效液相色谱仪(日本)；HS英谱色谱工作站。

(2)设备  多功能提取罐(60kg)；分离柱(22cm×100cm上海精科实业有限公司)；旋转薄膜蒸发器(10L，R-2002上海申胜生物技术有限公司)；渗漉筒(口径50cm×200cm)；超临界流体萃取器(1L-HA 231-50-2.5、10L-HA220-40-48，江苏南通华安超临界萃取有限公司)；冷冻干燥机。

(3)试剂与药材  甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2、积雪草、黄芪、脱脂桃仁最佳提取生产工艺条件选择试验研究

(1)正交试验因素水平的确立

根据预试结果，以溶剂回流法提取积雪草、黄芪、脱脂桃仁，影响其有效成分提取率的主要因素为醇的浓度(A)、提取时间(B)、溶媒量(C)、提取次数(D)。故采用四因素三水平正交设计，按L₉(3⁴)正交表安排试验(n＝2)，见表9。

                      表9因素水平设计

	因素
					A乙醇浓度(％)	B提取时间(h)	C溶媒量(倍)	D提取次数(次)
	123	305070	123	6810					123

(2)L₉(3⁴)正交试验

按L₉(3⁴)条件安排试验，每份试验取积雪草、黄芪各50g，脱脂桃仁16g，回流提取。由于无空白列，故作了重复试验(n＝2)，使试验分析结果更加精确可靠。以积雪草苷、黄芪甲苷为考核指标，进行最佳生产工艺条件优选。

(3)考核指标的测定方法

①积雪草苷测定方法  照药典附录VI高效液相色谱法。

I.试药与仪器

试药  积雪草购于浙江昌化药材公司(浙江临安产)，经杭州市药品检验所鉴定为伞形科植物积雪草Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草。对照品积雪草苷(批号8779901)由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯。

仪器  LC-10AT高效液相色谱仪(日本岛津)，SPD-10A检测器，HS英谱工作站；265紫外分光光度仪(日本岛津)。

II.色谱条件  色谱柱为SUPELCOSIL^TM LC-18-DB(15cm×4.5mm，5μm)，柱温为室温，流动相为甲醇-水(55∶45)，流速为1ml/min，检测波长为204nm。在此条件下，样品中积雪草苷峰与其他峰能达到基线分离，积雪草苷色谱峰的保留时间为5.9min。

III.对照品溶液制备  精确称取积雪草苷对照品2.4mg，置5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含积雪草苷0.48mg)。

IV.药材及提取物供试品溶液的制备  取积雪草药材粗粉0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇50ml，超声提取2h，提取液滤过，滤液浓缩至干，残渣用50％甲醇4ml溶解，微孔滤膜滤过，滤液作为药材供试品溶液。另取提取液适量，蒸干，精密称定，甲醇溶解，定容，滤过，滤液作为提取物供试品溶液。

V.检测波长的选择  取积雪草苷对照品溶液适量，经紫外分光光度仪在190～300nm波长下扫描，结果积雪草苷在204nm处波长有最大的吸收，故选择204nm作为检测波长。

VI.线性关系考察  精密吸取上述对照品溶液1、5、10、15、20μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得回归方程A＝95404.4C-4721.6，r＝0.9992；表明积雪草苷进样量在0.48～9.6μg呈良好的线性关系，见图3

VII.缺味空白试验  在与对照品相同保留时间未呈现色谱峰，说明空白无干扰。

VIII.精密度试验  取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，结果以峰面积计算RSD为2.1％。

IX.重现性试验  精密称取同一样品五份，各吸取供试品溶液10μl，注入色谱仪中，结果以峰面积计算RSD为1.6％。

X.回收率试验  精密称取已知积雪草苷含量的同一批样品，平行5份，分别加入积雪草苷对照品0.2mg，按含量测定方法操作，计算回收率。平均回收率为99.8％，RSD为2.41％。

XI.样品测定  取3批样品，照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。

结果  三批积雪草药材中积雪草苷分别为0.48、0.59、0.55％，平均含量为0.54％。提取液积雪草苷含量见表10。

②黄芪甲苷测定  照药典附录VI高效液相色谱法。

I.色谱条件  色谱柱为SHIMADZU VP-ODS(150L×4.6)，柱温为室温，流动相为乙腈-水(1∶2)，流速为1ml/min，检测波长为200nm。在此条件下，样品中黄芪甲苷与其他峰能达到基线分离，黄芪甲苷色谱峰的保留时间为6.2min(见图4)。

II.检测波长的选择  取黄芪甲苷对照品溶液，经紫外分光光度仪在190～300nm波长下扫描，结果黄芪甲苷在200nm处波长有最大的吸收，故选择200nm作为检测波长(见图5)。

III.线性关系考察  精密称取黄芪甲苷对照品2.2mg，加甲醇制成每毫升含0.44mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液1，5，10，15，20μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标作线性回归，回归方程为A＝19794.37C+734.84，r＝0.9996，表明黄芪甲苷进样量在0.44～8.80μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(见图6)。

IV.样品处理方法  供试品溶液的制备同测定积雪草项下。

V.缺味空白试验  在与对照品相同保留时间无色谱峰，说明无干扰。

VI.精密度试验  取供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，结果以峰面积计RSD为0.55％。

VII.重现性试验  按样品测定法，对同一批样品依法测定5次，结果以峰面积计RSD为0.83％。

VIII.回收率试验  取已测知黄芪甲苷含量的样品，平行5份，分别精密加入黄芪甲苷对照品0.25mg，按含量测定方法操作，计算5次平均回收率为98.2％，RSD为2.34％。

(4)正交试验结果与方差分析，见表10、11、12。

                   表10 L₉(3⁴)正交试验结果分析

试验号	A	B	C	D	积雪草苷/％			黄芪甲苷/％
											yi1	yi2	yi	yi1	yi2	yi
					123456789	111222333	123123123	123231312	123312231	0.1550.1880.2310.3660.3230.3840.2520.1560.310							0.1490.1760.2330.3480.3350.3730.2490.1620.325	0.3040.3640.4640.7140.6580.7570.5010.3180.635	0.1020.1510.1420.2610.2160.2260.4050.0950.210	0.1010.1420.1460.2570.2090.2340.3850.0920.221	0.2030.2930.2880.5180.4250.4600.7900.1870.431
Ij积IIj雪IIIj草Ij2苷IIj2/％IIIj2RjSj	1.1322.1291.4541.2814.5532.1147.9280.086	1.5191.3401.8562.3071.7963.4457.5480.023	1.3791.7131.6231.9022.9342.6347.4700.01	1.5971.6221.4902.5502.6322.2387.4190.0015							G＝4.715CT＝1.235S总＝0.1212f总＝17S总1＝0.1207f总1＝8Se＝0.0005fe＝9
					Ij黄IIj芪IIIj甲Ij2苷IIj2/％IIIj2RjSj	0.7841.4031.4080.6151.9681.9824.5650.043	1.5110.9051.1792.2830.8191.394.4920.031	0.851.2421.5030.7231.5432.2594.5250.036	1.0591.5430.9931.1212.380.9864.4870.03	G＝3.595CT＝0.718S总＝0.1401f总＝17S总1＝0.1397f总1＝8Se＝0.0004fe＝9

                   表11方差分析表(以积雪草苷为指标)

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABC	0.0860.0230.01	222	0.0430.0120.005	77420790	P＜0.01P＜0.01P＜0.01

D误差Se

0.00150.0005

29

0.00080.00006

13.5

P＜0.01

F_0.05(2，9)＝4.26  F_0.01(2，9)＝8.02

                        表12方差分析表(以黄芪甲苷为指标)

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABCD误差Se	0.0430.0310.0360.030.0004	22229	0.02150.01550.0180.0150.00004	483.75348.75405337.5	P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01

F_0.05(2，9)＝4.26  F_0.01(2，9)＝8.02

结果  表10直观分析结果表明，以积雪草苷为评价指标，影响因素的大小顺序为A＞B＞C＞D；以黄芪甲苷为评价指标，影响因素的大小顺序为A＞C＞B＞D。表11、12方差分析结果表明，以积雪草苷、黄芪甲苷为考察指标，因素A、B、C、D均有显著性差异。

(5)结论  以积雪草苷为考察指标，最佳工艺条件为A₂B₃C₂D₂；以黄芪甲苷为考察指标，最佳工艺条件为A₃B₁C₃D₂。鉴于积雪草为处方中君药，对试验结果综合考虑结果，以A₂B₃C₃D₂，即加10倍量的60％的乙醇，提取二次，每次3h为最佳提取工艺。

(6)最佳生产工艺条件验证试验

①方法  取积雪草、黄芪各100g、脱脂桃仁28g，按最佳工艺条件进行提取(n＝3)，提取液滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至100ml，分别精密吸取2ml，稀释至10ml，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别用HPLC法按前述色谱条件测定黄芪甲苷含量，计算转移率(％)。

②结果  黄芪药材的黄芪甲苷含量为0.14％，黄芪甲苷转移率为51.43％。

③结论  药材的最佳生产工艺条件合理、可行。

3.大孔树脂法提纯积雪草、黄芪、桃仁提取液的最佳生产工艺试验研究

(1)树脂型号的考察  不同类型大孔吸附树脂对总皂苷类化合物的饱和吸附容量及解吸率也不同。

①原理  一般非极性化合物在水中可以被非极性树脂吸附，极性树脂则在水中吸附极性物质。积雪草苷、黄芪甲苷既有极性部分葡萄糖基，又有非极性部分三萜母核，这样的结构使其在水中有着一定的溶解度，同时非极性部分三萜母核的存在使其在非极性大孔树脂上能较好地吸附。而极性较大的葡萄糖则在非极性大孔树脂上难以吸附，因此皂苷类化合物分离提纯应采用非极性或弱极性树脂，故选择D101、AB-8、HPD100，比较其对皂苷类化合物的吸附容量及解吸率。

②结果(见表13)

     表13不同树脂类型吸附、解吸测定结果

树脂型号	吸附容量(mg/g)	解吸率(％)
			D101AB-8HPD100	81.280.174.6	61.3254.2649.83

③结论  D101大孔树脂对皂苷类化合物吸附量大，解吸快，适于该提取液的分离提纯。

(2)药材-树脂比例的预试

①试验方法  取D101 20g，按不同的药材-树脂比，将积雪草、黄芪、脱脂桃仁的60％EtOH回流提取液浓缩至无醇味，静置过夜，滤过，上样。用水洗至洗脱液无色为止，水洗液蒸干，残渣用10ml甲醇溶解，作为TLC点样用的供试液。以积雪草苷、黄芪甲苷为考察指标，将其对照品溶液与水洗液分别点于同一硅胶G薄层板上，吸取对照品溶液2μl、水洗液20μl，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷10％硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰。

②结果  药材-树脂比1∶5、1∶2、1∶1.5的水洗液，在与对照品色谱相应的位置上，均未呈现相同的显色斑点，说明无泄漏。药材-树脂比1∶1水洗液，在积雪草苷、黄芪甲苷对照品色谱相应的位置上，有相同的蓝色、紫色斑点，说明药材-树脂比1∶1时，水洗液有泄漏，故不可取。以此试验结果为基础，拟用正交试验进一步确定药材-树脂最佳比例。

(3)洗脱曲线的制备

①原理  对非极性大孔吸附树脂，洗脱极性越小，洗脱能力越强；对中等极性大孔树脂和极性较大的化合物，则选用极性较大的洗脱剂为佳。

②方法  采用D101大孔树脂，用水、10、20、40、70、80、95％EtOH进行梯度洗脱，以黄芪甲苷为考察指标，考察最佳洗脱的乙醇浓度。

③供试品溶液的制备  取D101大孔树脂20g，按药材-树脂比1∶2，将积雪草、黄芪、脱脂桃仁的提取液浓缩至无醇味，静置过夜，滤过，上样，依次用水、10、20、40、70、80、95％EtOH洗脱，分别收集各洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解并定容至10ml，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

④黄芪甲苷测定  HPLC法测定黄芪甲苷含量，测定条件同前，进样10μl。

⑤测定结果，见表14。

                    表14不同浓度乙醇洗脱黄芪甲苷的测定结果

洗脱液	水	20％EtOH	30％EtOH	40％EtOH	70％EtOH	80％Et0H	95％Et0H
								峰面积	0	0	2124.3	444682.5	828316.6	51.3	0

⑥洗脱曲线图  以黄芪甲苷峰面积积分值为纵坐标，乙醇浓度为横坐标绘制洗脱曲线(见图7)。

由洗脱曲线可见，积雪草、黄芪总皂苷类的提纯，可先用适量水洗涤大孔吸附树脂柱，除去多糖等杂质(用薄层色谱法检识，防止皂苷洗下)，再用70％EtOH洗脱，收集70％EtOH洗脱液。

(4)洗脱条件的正交试验

①试验因素与水平的确立

以药材-树脂比(A)、柱床径高比(B)、洗脱流速(C)、收集洗脱液量(D)四因素三水平(见表15)，按L₉(3⁴)正交表安排试验。(柱的规格2.2cm×15.4cm)。

                                表15因素水平设计

水平	因素
					药材-树脂比A	柱床径高比B	洗脱流速C/BV/h	收集洗脱掖量D/树脂用量的n倍

123

1∶1.51∶2.01∶2.5

1∶31∶41∶5

123

101520

②L₉(3⁴)正交试验

按L₉(3⁴)正交表安排试验，上样后，先用水洗脱至糖的反应呈阴性(无还原糖反应)，改用70％EtOH洗脱，收集70％EtOH洗脱液，回收乙醇，浓缩，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10ml，微膜滤过，作为供试品溶液。由于无空白列，故作了重复试验。

③黄芪甲苷含量测定

采用HPLC法(HPLC测定条件同前)供试品溶液进样10μl，按前述色谱条件测定，计算黄芪甲苷含量。

④正交试验方案与结果，见表16、17。

                                  表16 L₉(3⁴)正交试验结果分析

试验号	A	B	C	D	黄芪甲苷/mg/g
								yi1	yi2	yi
					123456789	111222333	123123123				123231312	123312231	3.221.602.284.032.493.213.192.462.46	3.431.582.424.112.533.163.092.332.56	6.653.184.708.145.026.376.284.795.02
IjIIjIIIjIj2IIj2IIIj2	14.5319.5316.09211.12381.42258.89	21.0712.9916.09443.94168.74258，89	17.8116.3416.00317.20267.00256.00	16.6915.8317.63278.56250.59310.82				G＝50.15CT＝139.72S总＝8.3581S总1＝8.3024f总＝17f总1＝8

RjSSj

851.432.185

871.575.542

840.200.313

839.970.275

Se＝0.056fe＝9

                               表17方差分析结果

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABCD误差Se	2.1855.5420.3130.2750.056	22229	1.09252.7710.15650.13750.0062	175.58445.3450.322.1	P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01

F_0.05(2，9)＝4.26    F_0.01(2，9)＝8.02

结果  表16直观分析结果表明，影响因素大小顺序为：B＞A＞C＞D，最佳条件A₂B₁C₁D₃。表17方差分析结果表明，因素A、B、C、D均有极显著差异。

⑤结论  选择A₂B₁C₁D₃为最佳条件，即最佳条件为药材-树脂比1∶2，柱床径高比1∶3，洗脱流速1BV/h，收集洗脱液量为树脂用量的20倍。

(5)大孔树脂最佳提纯工艺条件验证试验

①提纯工艺条件考察

方法  取100g D101用去离子水充分溶胀，倒入交换柱内，先用相当于树脂体积2～4倍的去离子水以16BV/h洗至柱内的水沉没树脂顶部2.5cm以上为止，以除去大孔树脂中的水溶性杂质，再以相当于树脂体积5倍的95％乙醇以同样的流速洗脱至流出的乙醇液与水按1∶5混合时不显白色浑浊即可，以去除树脂中的油溶性杂质。最后仍用2～5倍的去离子水洗净后，按最佳提纯工艺进行试验(n＝3)，先水洗至Molisch反应阴性，改用70％EtOH洗脱，收集70％EtOH洗脱液，回收乙醇，浓缩，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至50ml容量瓶中，微膜滤过，滤液按前述HPLC条件测定其黄芪甲苷含量。

结果  药材含量0.19％，上柱后黄芪甲苷平均含量为0.10％，黄芪甲苷转移率为52.63％。

②洗脱率考察

方法  照最佳工艺条件试验，以黄芪甲苷为指标，考察上柱前样品和上柱后洗脱液的黄芪甲苷含量，计算洗脱率。

结果  上柱前黄芪甲苷含量为0.101％，上柱后洗脱液黄芪甲苷含量为0.0959％，洗脱率为94.95％。表明黄芪甲苷基本洗脱完全。

③结论  采用D 101大孔树脂提纯的生产工艺合理、可行。

4.大黄最佳渗漉生产工艺条件选择试验研究

影响大黄渗漉提取率的主要因素有粒度、润湿时间、流速、乙醇浓度、浸渍时间、渗漉液量等。故本研究进行二次正交试验，分别以大黄素、大黄酸为考察指标，选择最佳渗漉工艺条件。

(1)因素水平表设计(见表18)

考察粒度(A)、润湿时间(B)、流速(C)，对大黄有效成分渗漉提取率的影响。其中渗漉条件：乙醇浓度、浸渍时间、收集渗漉液量一致。

                        表18因素水平表

水平	因素
					粒度(A)	润湿时间(B)h	流速(C)ml/min	空白(D)
	123	最粗粉粗粉中粉	135	123

(2)按L₉(3⁴)正交表安排试验

①方法  称取不同粒度药材各100g，以药材量的80％溶剂，按设计的不同润湿时间湿润，上柱，用乙醇浸渍24h后，收集不同流速的乙醇渗漉液，渗漉液量均为干药材量的6倍。

②大黄素、大黄酸测定  照药典附录VI高效液相色谱法。

I.色谱条件  岛津10-AVP高效液相色谱仪，色谱柱SUPELCOSIL^TmLC-18-DB15cm×4.6mm，5μm；参照中国药典大黄含量测定项下，由于增加了大黄酸作为含量指标，在药典的流动相条件下大黄酸无法达到基线分离，结合试验，将流动相调整为甲醇-0.2％磷酸溶液(75∶25)时，大黄酸、大黄素、及大黄酚分离良好且保留时间适宜。流速：1.2ml/min；波长225nm；柱温25℃。

                              表19稳定性试验结果

测定时间	0	2	4	6	8	RSD(％)
							大黄酸大黄素	124320.8239901.7	129017.1249901.9	125881.9236657.0	121324.1237675.0	119933.9238460.2	2.922.24

结果表明  大黄酸的RSD为2.92％，大黄素的RSD为2.24％，说明对照品溶液在8小时内稳定。

VIII.精密度试验  每次吸取4μl对照品溶液(大黄酸每1ml含11μg，大黄素每1ml含14μg)，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定二种对照品的峰面积，结果见表20。

                          表20精密度试验结果

时间(h)	1	2	3	4	5	RSD％
							大黄酸大黄素	124320.8239901.7	125580.9241717.9	125106.5241710.3	129914.4244747.9	129017.1249901.9	1.981.48

II.波长选择  对大黄酸、大黄素对照品溶液分别进行了紫外吸收扫描，发现二种对照品分别在210～230nm、250～260nm都有一个明显的吸收峰，其中以210～230nm处的为最大吸收峰，峰形较尖锐。比较同一对照品相同进样量的峰面积，以及缺味样品的色谱图，发现以225nm为检测波长，二种对照品的峰面积都最大，说明灵敏度最高，并且缺味样品无干扰，因此最终确定检测波长为225nm。

III.对照品溶液制备  精密称取大黄酸对照品3mg、大黄素对照品2.8mg，分别置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得大黄酸对照品溶液(60μg/ml)、大黄素对照品溶液(56μg/ml)；分别精密吸取上述溶液各2.5ml，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(大黄酸每1ml中含15μg、大黄素每1ml中含14μg)。

IV.供试品溶液制备  分别精密吸取各份渗漉液0.5ml，蒸干，残渣用甲醇溶解至25ml容量瓶中，0.45μm微膜滤过，滤液作为供试品溶液。

V.对照品纯度试验  精密吸取上述大黄酸对照品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算纯度为99.01％；精密吸取大黄素对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算纯度为99.42％。

VI.线性关系考察  精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，分别以峰面积积分值为纵座标，对照品进样量(μg)为横座标，进行线性回归，得大黄酸的回归方A＝-12721.22+3068902.20C，r＝0.9996；大黄素的回归方程为：A＝-14090.90+3158251.40C，r＝0.9998。结果表明，大黄酸在0.015～0.15μg范围内呈线性；大黄素在0.014～0.14μg范围内呈线性(标准曲线见图8)。

VII.稳定性试验  分别吸取新配制的对照品溶液(大黄酸每1ml含11μg，大黄素每1ml含14μg)4μl，在0、2、4、6、8小时，注入液相色谱仪，测定三种对照品的峰面积，结果见表19。

结果表明  大黄酸的RSD为1.98％，大黄素的RSD为1.48％，说明精密度良好。

IX.重现性试验  取样品(批号030902)五份，精密称定，照供试品溶液制备方法操作，精密吸取样品溶液3μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表21。

                表21重现性试验结果

测定次数	大黄酸(mg/g)	大黄素(mg/g)
			12345平均值	1.52191.55241.58701.47161.57291.5412	0.97220.95380.96050.92230.95130.9520

RSD％

2.98

1.94

结果表明  RSD分别为2.98％、1.94％，说明重现性良好。

X.回收率试验  取已知含量的样品五份，每份约0.5g，在每一份中加入混合对照品溶液1ml(大黄酸每1ml含0.06mg、大黄素每1ml含0.056mg)照供试品溶液制备方法操作，精密吸取2μl，注入液相色谱仪中，测定峰面积，计算，结果见表22、23。

                      表22大黄酸回收率试验结果

样品中大黄酸含量(mg)		添加大黄酸的量(mg)	测得大黄酸的量(mg)	回收率％
					12345	0.76880.76840.77260.79560.7879	0.180.180.180.180.18	0.17240.17630.17930.18200.1749	95.7997.9799.61101.1297.17
平均回收率x  (％)RSD  (％)				98.362.18

结果  大黄酸平均回收率为98.36％，RSD为2.18％。

                       表23大黄素回收率试验结果

样品中大黄素的量(mg)		添加大黄素的量(mg)	测得大黄素的量(mg)	回收率％
					12345	0.47490.47470.47720.49140.4867	0.1680.1680.1680.1680.168	0.17330.16390.16600.16400.1735	103.1797.5798.7997.62103.28
平均回收率x  (％)RSD  (％)				100.092.90

结果  大黄素平均回收率为100.09％，RSD为2.9％。

XI.样品—药材(制大黄)含量测定  按药典含量测定方法对三批药材进行测定，吸取10μl，结果见表24

表24三批药材(制大黄)含量测定结果(n＝3)

批次	大黄酸％(g/g)	大黄素％(g/g)
			123	0.240.210.31	0.100.910.13

①正交试验结果，见表25、26、27。

表25粒度、润湿时间、流速正交试验结果分析

                     表26方差分析表(以大黄素为指标)

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						AB	0.0400.009	22	0.0200.0045	409	P＜0.01

C误差e(D)

0.0020.001

22

0.0010.0005

2

F_0.05(2，2)＝19.00  F_0.01(2，2)＝99.00

                    表27方差分析表(以大黄酸为指标)

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABC误差e(D)	0.0890.0250.0020.0045	2224	0.04450.01250.0010.001125	39.561.11	P＜0.01P＜0.01

F_0.05(2，4)＝6.9    F_0.01(2，4)＝18.00

结果  表25直观分析结果表明，以大黄素为考察指标，影响因素大小为A＞B＞C，因素A₃B₃C₃为最佳；以大黄酸为考察指标，影响因素大小为A＞B＞C，因素A₃B₃C₁为最佳。表26、27方差分析结果表明，以大黄素为考察指标，因素A有显著影响；以大黄酸为考察指标，因素A、B均有显著影响。

④结论  综上分析，选择A₃B₃C₃为最佳条件。即药材为中粉，润湿5h，流速为3ml/min。考虑大生产的需要，药材粒度以粗粉为宜。

(2)考察乙醇浓度(A)、浸渍时间(B)、渗漉液量(C)，对大黄渗漉提取率的影响。其中渗漉条件：粒度、润湿时间、流速一致。

因素水平表设计(见表28)

                      表28  因素水平表

水平	因    素
					乙醇浓度(A)％	浸渍时间(B)h	收集渗漉液量(c)干药材量的n倍	空白(D)
	123	407095	243648	468

②按L₉(3⁴)正交表安排试验

I.方法取药材100g(粗粉)，润湿5h，流速3ml/min，考察最佳浸渍时间、乙醇浓度、收集渗漉液量。

II.大黄素、大黄酸测定照药典附录VI高效液相色谱法。色谱条件、供试品制备、测定方法同(1)。

①正交试验结果，见表29、30、31。

表29乙醇浓度、浸渍时间、收集渗漉液量正交试验结果分析

                        表30方差分析表(以大黄素为指标)

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABC误差e(D)	0.5950.0200.0890.006	2222	0.29750.0100.04450.003	99.173.3314.83	P＜0.01

F_0.05(2，2)＝19.00    F_0.01(2，2)＝99.00

                 表31方差分析表(以大黄酸为指标)

方差来源

离均差平方和

自由度

方差

F值

显著性

ABC误差e(D)

0.2110.00360.00620.0012

2224

0.10550.00180.00310.0006

175.8335.17

P＜0.01

F_0.05(2，4)＝6.9    F_0.01(2，4)＝18.00

结果  表29直观分析结果表明，以大黄素为考察指标，影响因素大小为A＞B＞C＞D，因素A₃B₁C₃为最佳；以大黄酸为考察指标，影响因素大小为A＞B＞C＞D，因素A₂B₁C₃为最佳。表30、31方差分析结果表明，以大黄素、大黄酸为考察指标，因素A有显著影响，因素B、C均无显著差异。

④结论  综上分析，选择A₂B₁C₂为最佳条件。即70％乙醇渗漉，浸渍24h，收集渗漉液量为干药材量的6倍。

(3)大黄最佳渗漉生产工艺条件的验证试验

①方法  取大黄粗粉100g，照最佳渗漉工艺条件进行试验。并按(1)的色谱条件、供试品制备方法，测定大黄素、大黄酸含量，计算其转移率％。

②结果  药材大黄素含量为0.13％，大黄素的转移率为60.5％；药材大黄酸含量为0.31％，大黄酸的转移率为62.2％。

③结论  大黄的生产工艺合理、可行。

5.当归挥发油SFE-CO₂法最佳萃取生产工艺验证试验

当归挥发油SFE-CO₂萃取方法，经过药材提取方法试验研究，证明该萃取条件可行。故未再进行最佳工艺条件选择试验，而是直接进行验证试验。

(1)方法  取当归粗粉500g(n＝3)，萃取条件：萃取釜温度45℃，压力30MPa；分离釜I温度65℃，压力10MPa；分离釜II温度60℃，压力8MPa；分离釜III温度55℃，压力6MPa；提取时间2h；CO₂流量36kg/h。

(2)结果  当归挥发油(含油脂)平均得率1.44％。

(3)结论  进一步证明文献SFE-CO₂的萃取条件合理、可行。

6.当归阿魏酸的SFE-CO₂萃取最佳生产工艺条件选择试验研究。根据阿魏酸溶于水、稀醇的理化特性，取当归经SFE-CO₂法萃取挥发油后的残渣，继续用SFE-CO₂法加夹带剂萃取阿魏酸，并采用正交设计试验，以阿魏酸为考核指标，对夹带剂的浓度、萃取条件进行优选。

(1)正交试验方法

①试验因素水平的设计

根据预试结果，设定萃取压力(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)夹带剂浓度(D)四因素三水平(见表32)，以阿魏酸为考察指标，采用L₉(3⁴)正交表进行试验。

                           表32因素水平设计

水平	因素
					A萃取压力/Mpa	B萃取温度/℃	C萃取时间/h	D夹带剂浓度/EtOH％
	123	253545	455565	3.52.51.5					95％70％40％

②L₉(3⁴)正交试验

按L₉(3⁴)条件安排试验，每份各取当归提挥发油后残渣250g投料，继续SFE-CO₂法萃取，夹带剂用量为药材量的40％(250g×40％＝100g)，分离釜I温度50℃、压力15MPa，分离釜II温度45℃、压力8MPa，分离釜III温度40℃、压力6MPa，CO₂流量36kg/h。又由于无空白列，故作了重复试验，使试验结果更加准确可靠。

③阿魏酸HPLC测定方法

I.色谱条件  色谱柱为SUPELCOSIL^TM LC-18-DB115cm×4.5mm，5μm)，柱温25℃，流动相甲醇-0.05％冰乙酸(2∶3)，流速0.5ml/min，检测波长320nm。在此条件下，样品中阿魏酸色谱峰与其他峰能达到基线分离，阿魏酸色谱峰的保留时间为10.6min(见图9)。

II.线性关系考察  精密称取阿魏酸对照品0.12mg，加甲醇-1％冰乙酸制成每毫升含0.012mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液1、5、10、15、20μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标作线性回归，回归方程为A＝6798.88965C-1.88942，r＝0.9998，表明阿魏酸进样量在0.012～0.24μg范围内与峰面积是良好的线性关系(见图10)。

III.样品测定方法  每份提取液分别精密吸取0.5ml，用40％EtOH稀释100倍(其中正交3号稀释60倍，正交4号稀释20倍)，微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，进样20μl，含量测定结果见正交试验结果分析表25。

IV.精密度试验  取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，结果以峰面积计RSD为1.2％，表明精密度较好。

V.重现性试验  取同一批样品，称取5份，照上述供试品制备方法制备供试品溶液，分别进样，结果以峰面积计RSD为2.8％，表明重复性较好。

VI.稳定性试验  分别在样品制备后1，2，4，6，8，16h吸取供试液，测定阿魏酸含量，结果RSD为1.98％，表明阿魏酸溶液在16h内是稳定的。

VII.加样回收率试验  取已测知阿魏酸含量的样品5份，分别精密加入阿魏酸对照品0.03mg，按含量测定方法操作，计算5次平均回收率为97.3％，RSD为2.01％。

VIII.三批药材测试结果  阿魏酸平均含量为0.44mg/g。

④正交试验结果与方差分析(见表33、34)。

                       表33 L₉(3⁴)正交试验结果分析

试验号	A	B	C	D	阿魏酸/mg/g
								yi1	yi2	yi
					123456	111222	123123				123231	123312	0.0760.1540.1610.1430.0570.233	0.0790.1720.1510.1360.0600.241	0.1550.3260.3120.2790.1170.474

789	333	123	312	231	0.1880.1590.227	0.1860.1630.241	0.3740.3220.468
								IjIIjIIIjIj2IIj2IIIj2RjSSj	0.7930.8701.1640.6290.7571.3552.7410.013	0.8080.7651.2540.6530.5851.5732.8110.029	0.9511.0730.8030.9041.1510.6452.7000.006	0.741.1740.9130.5481.3780.8342.7600.020	G＝2.827CT＝0.444S总＝0.06S总1＝0.059f总＝17f总1＝8Se＝0.001fe＝9

                          表34方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	方差	F值	显著性
						ABCD误差Se	0.0120.0270.0070.0180.003	22229	0.0060.01350.00350.0090.0003	1840.510.527	P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01

F_0.05(2，9)＝4.26    F_0.01(2，9)＝8.02

结果  表33直观分析结果表明，影响因素大小顺序为B＞D＞A＞C。表34方差分析结果表明，因素A、B、C、D均有显著性差异。

⑤结论  综合分析选择A₃B₃C₂D₂为当归提挥发油后残渣继续SFE-CO2萃取阿魏酸的最佳条件，即其最佳条件为萃取釜温度65℃、压力45MPa，萃取时间2.5h，夹带剂为70％EtOH(用量为药材量的40％)。

⑥讨论  阿魏酸含量测定

采用TLC检测当归加夹带剂萃取阿魏酸后残渣是否萃取完全。

I.TLC检测  精密称取当归加夹带剂提阿魏酸后药渣5.0065g，加200ml50％EtOH超声处理1h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液1。另取当归挥发油10ml，加20ml乙醚后用30ml水萃取三次，收集水层，蒸干，残渣用1ml甲醇溶解，作为供试品溶液2。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含2.4mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各20μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以苯一氯仿一甲醇(2∶2∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，105℃加热约l0min，紫外灯365nm下检视。

II.结果  供试品溶液2在与对照品色谱相应的位置上，有一相同的蓝色荧光斑点，而供试品溶液1在此位置上无斑点。由此说明残渣中的阿魏酸已提取完全。

⑦最佳生产工艺验证试验

I.方法  取当归粗粉500g按最佳工艺条件萃取挥发油及阿魏酸。

II.结果  药材含油脂挥发油为1.69％，三批当归萃取挥发油(含油脂)平均1.44％，含油脂挥发油转移率为85.2％；药材含阿魏酸为0.438mg/g，萃取阿魏酸含量为0.345mg/g，转移率为78.8％。

III.结论  当归先用SFE-CO2萃取挥发油，后加夹带剂继续萃取阿魏酸的提取生产工艺条件合理、可行。

7.冷冻干燥条件  总过程24小时，温度为负30～35℃～正50℃，冷冻4～5h，慢慢升温至50℃，开始升温时抽真空至15～20MPa.水分3％以下。

Claims (4)

1.一种复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，其特征在于所中药组合物主要成分质量组成如下：积雪草15～45份，制大黄6～10份，桃仁6～10份，黄芪9～45份，当归6～20份；所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，静置，过滤，滤液用大孔树脂提纯，以水、乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂混匀，过筛，得混悬药液，即为复方积雪草中药有效成分。

2.如权利要求1所述的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的中药组合物质量组成如下：

积雪草20份，制大黄10份，桃仁10份，黄芪20份，当归6份；

所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，静置，过滤，滤液用大孔树脂提纯，以水、乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂混匀，过筛，得混悬药液，即为复方积雪草中药有效成分。

3.如权利要求1或2所述的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁置于萃取釜内萃取，弃去挥发油，留下脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，加入药材总质量6～12倍的40～70％乙醇水溶液，回流提取2～3次，合并提取液，静置过夜，过滤，滤液过大孔树脂，滤液与树脂质量比为1∶1.5～2.5，柱床径高比1∶3～4，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液进行洗脱，收集70％乙醇洗脱液量为树脂用量10～20倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)润湿1～5h后的制大黄，进行渗漉，40～95％乙醇水溶液浸渍24～48h，收集渗漉液量为干药材质量4～8倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入质量为药渣40％的40～95％乙醇水溶液作为夹带剂，置于萃取釜中，45～65℃、24～45Mpa下萃取1.5～3.5h，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加稀释剂，混匀，过筛，得混悬药液，即为所述复方积雪草中药组合物有效成分。

4.如权利要求3所述的复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)桃仁于SFE-CO₂萃取釜内萃取，弃去挥发油，脱脂桃仁与积雪草、黄芪合并，加入药材总质量10倍的60％乙醇水溶液，回流提取2次，每次3h，合并提取液，静置过夜，过滤，滤液过大孔树脂，滤液与树脂质量比为1∶2，柱床径高比1∶3，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液进行洗脱，收集70％乙醇洗脱液量为树脂用量20倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(2)制大黄润湿5h后，装入渗漉筒，70％乙醇水溶液浸渍24h，收集渗漉液量为干药材质量6倍，回收乙醇至无醇味，得提取液；

(3)取当归置于SFE-CO₂萃取釜内萃取挥发油，得挥发油与药渣；往药渣中加入质量为药渣40％的70％乙醇水溶液作为夹带剂，置于SFE-CO₂萃取釜中，釜温65℃、压力45Mpa下萃取2.5h，除乙醇，得萃取液；

(4)步骤(1)所得提取液、步骤(2)所得提取液、步骤(3)所得萃取液合并，-35～50℃下冷冻4h后，抽真空至12～20MPa、水分含量小于3％，缓慢升温至50℃，得冻干粉，粉碎、过筛，药粉与步骤(3)所得挥发油加PEG-400，混匀，过筛，得混悬药液，即为所述复方积雪草中药组合物有效成分。

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