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CN1745177A - 检测葡萄球菌、肠球菌和链球菌属中的致病性革兰氏阳性菌的方法 - Google Patents

检测葡萄球菌、肠球菌和链球菌属中的致病性革兰氏阳性菌的方法 Download PDF

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CN1745177A
CN1745177A CNA2003801095511A CN200380109551A CN1745177A CN 1745177 A CN1745177 A CN 1745177A CN A2003801095511 A CNA2003801095511 A CN A2003801095511A CN 200380109551 A CN200380109551 A CN 200380109551A CN 1745177 A CN1745177 A CN 1745177A
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CN
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hybridization
pathogenic
gram
nucleic acid
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CNA2003801095511A
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G·哈伯豪森
T·埃姆里希
R·罗绍
G·延内斯
D·德沃斯
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Fujirebio Europe NV SA
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
Innogenetics NV SA
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种鉴定革兰氏阳性致病菌的方法，包括(a)使用至少第一组扩增引物进行的扩增步骤，所述扩增引物能够扩增致病性革兰氏阳性菌的第一预定亚组中的预选核酸序列区；(ab)使用至少第一种杂交试剂进行的检测步骤，所述杂交试剂能够特异性检测所述致病性革兰氏阳性菌第一预定亚组中的预选核酸序列区，所述检测步骤包括下列步骤：(aba)无论在预选温度下是否发生杂交，监测杂交的发生，所述杂交的发生指示存在于样品中的致病性生物的至少一个属，和(abb)监测杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示致病性革兰氏阳性菌的至少一个物种。

Description

检测葡萄球菌、肠球菌和链球菌属中的致病性革兰氏阳性菌的方法
本发明涉及检测致病性微生物的技术领域。更具体而言，本发明涉及通过扩增并检测所述致病性革兰氏阳性菌的特定核酸序列而检测由临床样品中的致病性革兰氏阳性菌引起的感染的领域。
背景技术
致病菌，特别是引起败血症的感染，大多发生且在医院的加强监护单元(ICU)中且较为严重。感染患者的细菌在绝大多数情况下是未知的且不能根据症状确定。每种细菌要求使用不同疗法，给予特定的抗生素。目前，在常规诊断中，致病菌，特别是革兰氏阳性菌是使用下列方法检测的：该方法包括培养血液或其它体液样品从而使细菌(如果存在)生长。这类培养在有利于细菌生长的条件下维持约3天。在该时间内，细菌数增加，由此它们的核酸数也增加。之后，溶解培养基。将溶解混合物用作杂交反应的样品。整个方法最少花费约4天时间，直到清除任何样品的致病菌感染。致病菌感染对于受感染的人而言是非常严重的。在感染的第一天，必须开始治疗，优选给予适于影响特定感染细菌的抗生素。否则，人将受到严重感染且可能在感染清除前死亡。另一方面，若干抗生素的同时给药将阻止所有可能细菌的生长，从而不可避免地使患者虚弱。因此，该方法对于常规ICU诊断而言是不能令人满意的。
长时间以来，使用特异性杂交探针、通过基于核酸的杂交来鉴定致病性生物如致病性细菌或真菌为本领域所知。例如，EP 0 131 052公开了方法和探针，其中特定物种或特定生物组的核糖体核糖核酸(rRNA)是从培养基直接检测的。核糖体靶序列的检测特别有效，这是由于这些序列是体内扩增，导致各测定法的高度灵敏性的事实。
基于致病性生物检测的核酸序列的改进是根据PCR技术的有效性实现的。就致病性真菌，如假丝酵母和曲霉而言，例如，WO 97/07238公开了一种使用通用引物扩增所有类型的真菌核糖体18S rRNA序列，随后与真菌物种特异性探针杂交的方法。
作为分析核糖体基因序列的选择性方法，非-编码但转录的核糖体间隔DNA序列，像位于16S和23S rRNA基因之间的ITS-1区已经用于检测和鉴定若干致病性生物(见，例如，EP 0 452 596)。
在另一篇文章中，已通过可与等位基因特异性扩增方法相比较的靶-依赖性扩增区别了革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的组(Klausegger等人，Journal of Clinical Microbiology 33(1990)464-466)。根据它们的16S rDNA序列，Klausegger等人研究的物种的区别在于16S rRNA基因的规定位置不同，所有研究过的革兰氏阴性菌都在特定核苷酸位置包含G-残基，而所有研究过的革兰氏阳性菌都在所述核苷酸位置包含C-残基。随后，使用分别具有区别性的互补3’-末端C-残基或互补G-残基的适宜引物可导致革兰氏阳性或革兰氏阴性序列来源的DNA扩增。
其它进展是在可进行动力学实时PCR的基础上做出的。在该类型的测定法中，在PCR的每个循环中监测PCR产物的形成。扩增通常是在热循环仪中测量的，该热循环仪还具有用于在扩增反应过程中监测荧光信号的其它检测工具。典型的例子是Roche DiagnosticsLightCyclerTM(Cat.No.20110468)。在LightCyclerTM以及迄今为止商业使用的其它实时PCR设备中，扩增产物是利用荧光标记的杂交探针检测的，它们仅在与靶核酸结合时发射荧光信号，或在某些情况下也利用结合双链DNA的荧光染料。测定所分析的所有反应的限定信号阈值并测定靶核酸以及参照核酸如标准或管家基因达到该阈值所需的循环次数(Cp)。靶分子的绝对或相对拷贝数可根据所获得的靶核酸及对照核酸的Cp值确定(Roche Diagnostics LightCyclerTM操作人员手册(Cat.No.2 0110468))。
有不同的检测扩增DNA的方式：
a)DNA结合染料方式
因为双链扩增产物的量通常多于最初存在于所分析样品中的核酸量，因此可使用双链DNA特异性染料，只要它们与双链DNA结合，用适宜波长激发后，即显示荧光增强。这种方法在EP 0 512 334中描述。优选地，仅使用那些染料，例如SYBRGreen I，其不会影响PCR反应的效率。
本领域已知的所有其它方式要求适当设计荧光标记的杂交探针，其仅在与其靶核酸结合后发射荧光。
b)TaqManTM探针
用两种组分标记单链杂交探针。根据荧光共振能量转移的原理，当用适宜波长的光激发第一组分，即所谓的荧光剂时，吸收的能量转移到第二组分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤过程中，杂交探针结合靶DNA并在延伸阶段过程中，被聚合酶，例如Taq聚合酶的5’-3’-外切核酸酶活性降解。因此，将激发的荧光组分和猝灭剂彼此空间分开，由此即可测量第一组分的荧光发射(EP B 0 543 942和US  5,210,015)。
c)分子信标
还可用第一组分和猝灭剂标记这些杂交探针，所述标记优选位于至少部分自互补的探针的不同末端。由于探针的次级结构，两组分在溶液中空间邻近。与靶核酸杂交后，两组分彼此分开，这样在用适宜波长的光激发后，即可测量第一组分的荧光发射(US 5,118,801)。
d)FRET杂交探针
荧光共振能量转移(FRET)杂交探针试验方式特别用于所有种类的均质杂交测定法(Matthews，J.A.和Kr i cka，L.J.，Anal Biochem 169(1988)1-25)。它的特征在于两个单链杂交探针，它们同时使用且与(扩增)靶核酸相同链的相邻位点互补。用不同荧光组分标记两个探针。当用适宜波长的光激发时，按照荧光共振能量转移的原理，第一组分将吸收的能量转移至第二组分，这样一来，只有当两个杂交探针结合所检测靶分子的相邻位置时，才可测量第二组分的荧光发射。
当退火于靶序列时，杂交探针的位置必须彼此非常接近，以头-尾方式排列。通常，第一探针的标记的3’末端与第二探针的标记的5’末端之间的间隔要尽可能的小，即1-5个碱基。这样使得FRET供体化合物与FRET受体化合物紧密邻近，通常为10-100埃。详细内容是熟知的且在，例如，EP0 070 687中公开。
作为监测FRET受体组分的荧光增强的可选方法，还可监测FRET供体组分的荧光减弱，如杂交事件的定量测量。
具体而言，FRET杂交探针方式可用于实时PCR，以便检测扩增的靶DNA。在实时PCR领域已知的所有检测方式中，FRET-杂交探针形式已被证实十分灵敏，准确且可靠(WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。然而，适宜的FRET杂交探针序列的设计有时可能受到所检测靶核酸序列的特殊特性的限制。
作为使用两个FRET杂交探针的选择性方法，还可使用荧光-标记的引物和仅仅一个标记的寡核苷酸探针(Bernard，P.S.等人，Anal.Biochem.255(1998)101-7)。在这点上，可任意选择，无论是用FRET供体还是FRET受体化合物标记引物。
FRET杂交探针(也称作FRET-Hybprobes或FRET探针)还可用于解链曲线分析(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。在这类测定法中，首先使用适宜的扩增引物在典型PCR反应中扩增靶核酸。杂交探针在扩增反应过程中已经存在或随后加入。PCR-反应完成后，样品温度显著增加。只要杂交探针与靶DNA结合即可检测荧光。在解链温度下，杂交探针自它们的靶释放出来，且荧光信号立即降至背景水平。这种降低是用适宜荧光与温度-时间的曲线监测的，这样即可计算第一衍生物函数的负数。然后，将与所获得的这种函数的最大值相对应的温度值确定为所述FRET杂交探针对的解链温度。
靶核酸内的点突变或多态性导致靶核酸与FRET探针之间的互补性低于100％，由此导致解链温度降低。这样一来，可通过FRET-Hybprobe杂交共同检测序列变体的集合，而随后，所述集合的不同成员可通过进行解链曲线分析而加以区别。代替FRET杂交探针，分子信标可替代性用于解链曲线分析。
在能够进行实时PCR和均质的实时PCR解链曲线分析的基础上，可使用双链DNA结合染料如SybrGreenTMI，或，可选地，使用专门设计的、与不同但相似的靶序列杂交的杂交探针，区分特定类型的物种或菌株。
在第一种情况下，必须确定所产生的双链PCR产物的解链温度。然而，由于差异，这种方法的应用有限，这是因为监测序列变异仅导致细微的解链温度差异，不能被有效监测。成功的例子已经由Woo等人公开，见Journal of Microbiology 35(1999)23-30，他进行了双曲钩端螺旋体16S rDNA序列的扩增，随后使用SybrGreenTMI作为DNA结合染料进行解链曲线分析，以便区别双曲钩端螺旋体株与来源于不同钩端螺旋体物种的DNA的非-特异性扩增产物。
可选地，杂交探针可以确定探针/靶核酸杂交物的解链温度的方式使用。例如，Espy等人，Journal of Clinical Microbiology 33(2000)795-799公开了通过扩增单纯疱疹序列，随后使用FRET杂交探针进行分析，以区别I型HSV和II型HSV基因型，而诊断单纯疱疹感染。
此外，WO 01/48237总体上提出扩增与温度依赖性杂交之间的联系以检测不同的致病性物种。然而，WO 01/48237没有教导能够专门检测致病性生物，而不是检测任意非致病性生物的任何方法或情况。
甚至是目前使用的方法，包括体外扩增特异性菌种且随后检测所述细菌，也不能用于需要紧急诊断的情况，例如，ICU，因为必须进行各细菌的扩增反应和检测反应。这要求从每名患者中抽取大体积的样品，如血液。在ICU中，从严重感染的患者中抽取大体积的样品是不可行的。
因此，本领域需要提供特别用于检测相关目标致病性生物的方法。具体而言，本领域需要能够检测所有相关致病性革兰氏阳性菌，但同时不检测类似非-致病性革兰氏阳性菌的方法。特别是，需要确定样品中存在的致病性属和/或种。
发明简述
上述问题是通过本申请中公开和要求保护的方法和化合物加以解决的。
因此，本发明涉及一种鉴定临床样品中的革兰氏阳性致病生物或属于致病性革兰氏阳性菌预定组的成员的生物亚群的方法，包括
a)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，
b)使所述临床样品经过至少一次扩增和检测，包括
ba)使用至少一组扩增引物进行的扩增步骤，所述扩增引物能够扩增来自所述革兰氏阳性致病性生物所属的致病性革兰氏阳性菌的预定亚组的预选核酸序列区，
bb)使用至少一种杂交试剂进行的检测步骤，所述杂交试剂能够检测来自致病性革兰氏阳性菌的所述预定亚组的所述预选核酸序列区，其中所述检测步骤bb)包括步骤
bba)监测预选温度下的杂交，所述杂交指示样品中存在包含于所述亚组中的至少一个物种，和
bbb)监测杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示至少存在所述致病性革兰氏阳性菌或所述生物亚群中的物种，
c)根据bb)中监测步骤的结果鉴定所述生物或所述生物亚群。
本发明还涉及适于进行上述方法的组合物。
此外，本发明涉及适于进行上述方法的试剂盒。
发明详述
本发明提供特别适于诊断革兰氏阳性菌的致病性感染的方法和化合物。在这点上，如果患者被怀疑感染革兰氏阳性菌，则本发明提供一种确定所述致病性革兰氏阳性生物的物种的方法。此外，本发明的新方法，特别是与实时PCR技术，如LightCyclerTM系统联合使用时，能够快速诊断引起败血症的感染剂，其对于很多临床环境都是非常重要的。
因此，总的说来，本发明涉及鉴定临床样品中的革兰氏阳性致病生物或属于致病性革兰氏阳性菌预定组的成员的生物亚群的方法，包括
a)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，
b)使所述临床样品经过至少一次扩增和检测，包括
ba)使用至少一组扩增引物进行的扩增步骤，所述扩增引物能够扩增来自所述革兰氏阳性致病性生物所属的致病性革兰氏阳性菌的预定亚组的预选核酸序列区，
bb)使用至少一种杂交试剂进行的检测步骤，所述杂交试剂能够检测来自致病性革兰氏阳性菌的所述预定亚组的所述预选核酸序列区，其中所述检测步骤bb)包括步骤
bba)监测预选温度下的杂交，所述杂交指示样品中存在包含于所述亚组中的至少一个物种，和
bbb)监测杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示至少存在所述致病性革兰氏阳性菌或所述生物亚群中的物种，
c)根据bb)中监测步骤的结果鉴定所述生物或所述生物亚群。
在本发明中，上面所用的特定术语定义如下：
术语“鉴定致病性革兰氏阳性生物”用于描述确定样品中是否存在革兰氏阳性菌预定组或亚组中所含物种内的特定物种或菌株或分离物的方法。鉴定的输出或结果是物种或菌株或分离物的名称。这使得随后能够进行选择性抗生素疗法的适当选择。
术语“致病性革兰氏阳性菌的预定组”用于描述由作为特定任务目标的致病性革兰氏阳性菌组成的致病性革兰氏阳性菌的预定组。优选地，革兰氏阳性菌的预定组可以是所有致病性革兰氏阳性菌的组，在已知的临床环境下，它们在临床上相关联，且其被扩增的各基因组序列基本上是本领域已知的。
例如，这种预定组可包括两个或多个属的临床相关成员。可选择性地，特定属的所有已知临床相关成员可构成这种预定组。可选择性的，特定物种的所有已知的临床相关成员或菌株或分离物可构成这种预定组。预定组还可包括不同属的分类学亚组，与来源于其它属或物种的菌株混合。
术语“特异性”用于描述受试者的特征(例如方法、步骤或试剂)，所述受试者仅涉及特定和限定的结果。例如，如果只检测特定物种，但不检测其它物种，则用于检测该物种的方法被认为是特异的。探针与靶的特异性杂交是仅在探针与靶之间发生，而不是与其它核酸分子发生的杂交。
在本文中，本发明的整个方法优选在生物鉴定方面基本上是特异的。优选不鉴定不属于预定组或亚组成员的生物，这是因为使用试剂进行的步骤被调整为不检测不属于该组的生物。这并非必需指整个方法的每个步骤都是特异性的，而这是可能的。例如，如果选择对所鉴定生物为非特异性的扩增引物(那些引物可用于扩增不鉴定的生物的核酸)，步骤ba)可以是非特异性的。整个方法的特异性可通过选择特异性检测步骤的一个或多个部分，例如步骤bbb)来实现。作为例子，本发明包括下列实施方案，其中步骤bba)产生阳性信号，这是由于杂交试剂与预定组成员的核酸和样品或/和步骤ba)中扩增的非-靶核酸杂交，但在步骤bbb)监测温度依赖性中，仅证实了预定组成员物种的身份，与非-靶核酸的身份无关。
作为与本领域已知方法相比的主要优点，本发明首次选择性鉴定了细菌属或种的致病性成员，而没有鉴定其它已知的、所述属或种的非-致病性成员。
在本文中，值得注意的是，如果所分析的临床样品含有新的、具有新的稍稍不同于靶序列的先前未知的菌株，那么有时候本发明的新方法可导致假阳性或假阴性结果。如果扩增并检测未知的非-致病性生物，步骤bba)的结果将是假阳性的。然而，在这种情况下，假阳性结果可在要求保护方法的步骤bbb)，即杂交的温度依赖性的监测过程中检测。在这种情况下，比较步骤bbb)的温度依赖性和已知致病性生物的温度依赖性可表明该生物不属于预定组的物种，即步骤c)的结果将是阴性的。在未知的致病性生物没有被扩增或检测的情况下，则结果是假阴性的。然而，根据迄今为止本发明人进行的有关临床分离物的所有研究，这些情况是非常少见的且，此外，不能由本领域已知的任何其它类似方法避免。
术语“革兰氏阳性菌的预定亚组”用于描述致病菌预定组的一部分或全部。优选地，预定亚组仅是所有致病性革兰氏阳性菌的一小部分，更优选是主要存在于医院中的细菌。所述组和亚组的成员可从一个属选择，但也可从不同属选择。如果预定组由属的所有致病性和临床相关成员代表，则各亚组可包含特定物种的所有各致病性成员。同样，如果所述预定组由特定物种的所有临床相关成员组成，那么所述亚组可由特定菌株的所有成员组成。其中一个非常优选的亚组由物种：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌(称作I组)和菌株组成。另一优选亚组由金黄色葡萄球菌和所有凝固酶阴性葡萄球菌组成。另一优选亚群由屎肠球菌和粪肠球菌组成。
术语“扩增和检测反应”是指任何类型的体外方法，它包括一个或多个“扩增步骤”，从而扩增核酸序列集合中的一个或多个靶序列，它还包括一个或多个“检测步骤”，从而揭示扩增产物的身份。
术语“扩增步骤”是指通过使用从含DNA样品进行核酸扩增反应的正向和反向引物而扩增靶序列-如果存在于临床样品中-的反应或一系列反应。所述扩增步骤的特异性取决于所选的组且由所用引物的特异性支配。优选地，扩增是使用热稳定性DNA聚合酶，通过聚合酶链反应(PCR)获得的。在其中一个实施方案中，扩增通常对细菌是特异性的，即，病毒并没有被大量扩增。
优选地，扩增步骤对亚组成员是特异性的。在优选实施方案中，扩增对所鉴定物种所属的属是特异性的。
术语“检测步骤”是指通过与适宜杂交试剂杂交而检测扩增产物，包括监测所述试剂与靶核酸杂交的温度依赖性。扩增和检测不是必需分开且连续进行，而是可同时进行。
术语“预选核酸序列区”是指存在于所要扩增和检测的所有生物DNA中的独特靶核酸区。根据实施方案不同，在不同生物的序列之间可存在某些序列变异。换句话说，它常常是各生物的相同基因或相同同源序列，其被扩增。这种区的例子是16S/23S rDNA间隔区，即编码16S和23S rRNA的序列或其一部分之间的区。更优选地，预选核酸序列区包含来自所扩增生物的16S/23S间隔区的至少20个、甚至更优选超过40个连续的核酸碱基。该区包含进化保守的以及高变的序列，其允许属和种特异性引物和探针的灵活设计。所述区包含在由核酸上的引物结合位点限定的区内。
术语“致病性”是指如果人类被细菌感染，则该细菌可影响人类的健康状况。本发明的要点涉及引起败血症的细菌的鉴定。在这种情况下，是该预定组。
术语“扩增引物组”是指至少两个(可延伸的)寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，即，至少一个结合靶核酸的第一条链的(正向)引物，和至少第二个结合所扩增的靶核酸序列的相反链的(反向)引物。此外，引物的定位是以这种方式设计的，即每个引物的模板依赖性延伸产生延伸产物，其本身包括可与其它引物杂交的引物结合位点。
在绝大多数情况下，使用由一个正向引物和一个反向引物组成的一对两个扩增引物就已足够。然而，在某些情况下，在所鉴定的不同致病性革兰氏阳性菌不同序列的引物结合位点序列中可能存在某些微小的序列变异。因此，不可能仅通过使用一个正向和一个反向引物来扩增所有成员的序列。就那些情况而言，一组扩增引物可由1个、2个、或更多正向引物和/或1个、2个或更多反向引物组成，它们是相似的且结合同源序列，但由于一个、两个、三个或若干单核苷酸-、二核苷酸-或三核苷酸的置换、缺失或添加而彼此不同。
此外，如果使用两组、三组或多组能够扩增不同预选核酸序列区的扩增引物，则也落在本发明的范围内。在这种情况下，所述不同预选核酸序列并非必需在序列方面彼此相关。然而，如果不同的预选核酸序列区是至少部分或几乎完全重叠的，则它也落在本发明的范围内。
通常，扩增引物的设计是以有关所扩增致病菌的预选靶核酸序列区以及有关不扩增的那些革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的同源序列的可获得的序列信息为基础进行的。更确切而言，一组或多组扩增引物是以下列方式选择的，即对于致病性革兰氏阳性菌的所选预定组的所有靶核酸序列存在最大序列互补性，且，另一方面，对于所有其它未选革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，即不属于预定组或不是致病性的那些以及真菌的核酸序列存在最小序列互补性。
术语“杂交试剂”用于描述能够在预选核酸序列区内，即在扩增子至少一个链上与步骤bb)的扩增产物杂交的试剂。所述试剂可包含一个或多个探针，其优选单链的或在杂交前被制成单链的。优选地，所述试剂是单链核酸杂交探针系统，它通常包括能够与双链扩增靶核酸的其中一个链杂交的一个或两个核酸。根据检测方式类型的不同，如果用可检测实体适当标记杂交试剂，它在绝大多数情况下是有利的，这样就可通过所述标记的检测来检测扩增子/杂交-试剂杂交体。在优选实施方案中，用荧光实体标记杂交试剂，这样就可在商业所用的实时PCR设备中检测杂交。用于此目的的试剂在上述描述用于扩增DNA检测的不同方式的文献中公开。
简单情况中的杂交试剂可以是寡核苷酸探针。例如，可应用Molecular Beacon Format(US 5,118,801)。可选择性地，还可使用适宜的单一标记的寡核苷酸(WO 02/14555)。在此引用这些文献，以便引入其中涉及试剂和检测方法的内容。
更优选地，杂交试剂由两个相邻杂交的寡核苷酸组成，将它们适当标记，这样一来它们就可按照上面公开的FRET-Hybprobe检测方式共同发挥作用(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。
此外，在本文中，术语“FRET对”被定义为一对荧光标记，它们可共同发挥作用，产生FRET过程，即它由FRET供体部分和FRET受体部分组成。
与设计一组扩增引物组相似，杂交试剂或多种杂交试剂的设计也是以有关所扩增和检测的预选靶核酸序列以及有关那些不检测的致病性革兰氏阳性菌的同源序列的所有可获得的序列信息为基础进行的。更确切而言，杂交试剂的序列是以下列方式选择的，即对于致病性革兰氏阳性菌的所选预定组的所有靶核酸序列具有最大序列互补性，且，另一方面，对于所有其它未选择的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的所有同源核酸序列具有最小序列互补性。
此外，杂交试剂的设计需要考虑到可基于监测杂交的温度依赖性来区别若干靶序列变异。本发明要求杂交试剂与来源于不同致病性革兰氏阳性菌的不同靶序列变体的杂交具有不同的解链温度。因此，本发明杂交试剂的序列是以这种方式设计的，即不同杂交试剂/靶序列杂交体的计算解链温度(通过本领域已知方法计算的)彼此相差至少2℃、优选至少4℃且最优选至少6℃。
总之，本发明提供设计亚组，优选属特异性杂交试剂的可能性，其特征在于它们可检测属于特定预定组的特定亚组属的所有致病性成员。可选择性地，可设计物种或菌株特异性杂交试剂，其允许检测属于特定预定组的特定种类的所有致病性菌株。
术语“监测杂交的温度依赖性”是指根据测定法预期准确度的要求，监测反应混合物的特征达一段时间或以一定间隔进行监测，其随着杂交体的解离而改变且依赖于杂交体的解离。通常，且与使用标记探针的杂交测定法联合，特征是受探针上标记的影响且随着探针与扩增子/靶杂交而改变的信号。
在本文中，杂交体的解链温度(Tm)被定义为杂交的第一衍生物对温度信号曲线达到最大值的温度。Tm是杂交体的特征，取决于链的互补性。
在本发明中，优选探针的退火温度低于所用引物的解链温度。
特征的改变将特定在每个杂交体的解链温度下或解链温度周围发生。解链温度是通过特定的杂交试剂和与试剂结合的每个靶的相应区决定的。具体而言，在本发明的方法中，将探针从与靶核酸/扩增子形成的杂交复合物上解离下来的温度确定为解链温度。在本文中，值得注意的是，解链温度(Tm)取决于若干因素，这些因素与实际的靶核酸序列本身，如盐浓度、探针长度和GC-含量无关。此外，解链温度很大程度取决于错配的数目，即，探针与靶序列之间的互补程度。因此，在不同物种或不同属的不同物种的不同菌株中发现的靶序列得到不同的解链温度。因此，使用适宜的探针设计，一个类型的杂交试剂(例如一个探针)可用于生物预选组的所有成员的检测并通过监测杂交的温度依赖性区别所述成员。在这种情况下，所用探针的核苷酸序列与第一种革兰氏阳性致病生物(例如，屎肠球菌)的靶区上的序列互补，但与第二种革兰氏阳性致病菌(例如，粪肠球菌)的靶区上的序列稍有不同(例如，1个或2个核苷酸不同)。
术语“指示所述亚组中包含的至少一个物种”或“…所述属中”是指如果杂交信号在步骤bba)中出现，那么可从步骤c)推断出所述亚组或所述特定属的致病生物可分别存在于从患者采集的样品中。根据一组或多组扩增引物的设计(例如，序列)，且此外，根据杂交试剂的设计，从不同杂交试剂的信号获得的杂交信号甚至可指示所检测致病生物的物种。优选地，根据步骤bba)测定的杂交信号明确指示预定组其中一个成员的存在，但并非必需直接知晓究竟存在哪个成员。
术语“至少指示物种”是指基于在步骤bbb)中监测杂交温度依赖性的结果，从步骤c)明确推断出哪个致病物种存在于临床样品中。由于一组或多组扩增引物的设计和杂交试剂的设计，从监测杂交温度依赖性获得的数据指示物种的身份，甚至指示各致病生物的特定菌株。即使样品可包含与靶序列相似或相同的非-靶序列，它们也不能被扩增，因为所述引物不适于扩增非-靶区。
术语“生物亚群”用于描述物种的预定集合，它们全部都是致病性革兰氏阳性菌预定组和预定亚组的成员。大多数情况下，这些生物属于一个属。这类组的例子是凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的组，其包含表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌，或绿色链球菌组，其包含缓症链球菌、变异链球菌和牛链球菌。所述亚群优选包含少于10个、更优选少于7个物种。鉴定生物是否存在于所述亚群中的本发明方法并非必需提供临床样品中包含所述亚群物种的结果。
总之，本发明提供一种鉴定革兰氏阳性致病菌的方法，其中在第一扩增步骤中使用一组或几组适宜的引物对，扩增所有目标致病性革兰氏阳性菌的序列，随后利用适宜的杂交试剂检测。由于适宜的引物和探针设计，非-致病性革兰氏阳性菌或其它微生物的序列没有被扩增或没有被检测，或被扩增而未被检测。如果发生与不同的杂交试剂杂交，则至少指示革兰氏阳性感染剂的亚组或属。
随后，监测温度依赖性荧光，例如，以如下形式：使样品经历温度的连续升高并测定发生靶核酸与杂交试剂之间的解链的温度。然后，监测到的解链温度至少指示已经存在于原始样品中的各病原体的物种甚或亚种或菌株。
通常，特别应用新方法且该新方法在下列情况下是有效的，其中事先已经知晓患者具有革兰氏阳性致病菌感染，但所述感染剂的准确身份还未可知。
与所要求方法的不同步骤的定义无关，应了解步骤a)、b)和c)优选相继顺序进行，第一步是步骤a)，第二步是步骤b)，第三步是步骤c)。还可在这些步骤之前、之间和之后进行其它步骤。
本发明方法的起始材料是临床样品，其被怀疑含有革兰氏阳性菌。这种临床样品的例子是全血、血清和脑脊液。优选起始材料是人类来源的。
步骤a)常常是首先并按照本领域已知的方法进行。在本文中，“临床样品”可理解为样品，优选流体，其来源于含核酸，包括所鉴定生物核酸的临床样品。
为了获得检测感染的充足敏感度，本发明方法要求来源于原始样品的核酸至少部分纯化。所分离的核酸可以是RNA或DNA或其混合物。作为本发明最优选的实施方案，使用细菌DNA用于致病性生物的最终鉴定，它无需临床样品含RNA。因此，无需将RNA从临床样品中部分或者甚至完全分离出来。DNA从临床样品中的分离应是充分且完全的，因为需要接收具有阳性对照的信号。
特别是，将核酸从存在于原始样品中的蛋白、糖和盐中分离出来。本发明可使用本领域已知的任何纯化方法。优选地，所用方法可将所要分析的总DNA从临床样品其它组分基本完全纯化。至少，纯化应进行至没有任何进一步大量稀释，样品等分试样中的核酸序列可在体外扩增，如PCR中被成功扩增的程度。在纯化中，除去核酸中充分抑制聚合酶的任何化合物。特别有效的核酸分离方法在WO 96/41811中公开。
步骤a)的结果通常是包含来源于原始临床样品的核酸的流体以及另外在分离步骤过程中加入的试剂，如缓冲液。在步骤b)中，临床样品或其一部分经过一个或多个扩增反应。扩增和检测反应可包括一个或多个步骤。扩增和检测反应两者都是本领域已知的。扩增是使用体外方法，优选PCR进行的(EP 0 201 184)。下文中提到PCR，但应了解其它体外方法也是适宜的。扩增反应的结果是产生所述引物的大量延伸产物，主要具有从一个引物的5’-末端位置到另一引物的5’-末端位置的序列。所产生的那些核酸通常被称作“扩增子”。
为了避免由存在于临床样品中并用于量化目的的抑制性残余组分所致的假阴性结果，已经证实如果加入内部对照模板是特别有利的。通常，所述对照模板包括已知序列，该序列具有与用于扩增所检测靶核酸序列的至少一组扩增引物互补的引物结合位点。结果，所述扩增引物组也能够引发对照模板所选序列的扩增。使用内部标准品，特别是用于量化的详细描述在EP 0 497 784中公开。
已经证实使用具有10-100μl体积的临床样品等分试样进行本发明的方法是有利的。因此，本发明方法可以充足的灵敏度进行，只要得到少量临床样品如全血或血清即可。
然而，最终，本发明方法或本领域已知的任何其它方法的结果可受到存在于临床样品中的人基因组DNA的高水平背景的影响。如果是这种情况，可按照WO01/94634进行预-扩增步骤，其特征在于选择性扩增选择性非-人DNA序列。
就步骤b)而言，可能存在异源和同源实施方案。在异源实施方案中，首先加入步骤ba)所需的试剂并首先进行扩增步骤ba)。随后进行步骤bb)，且任选包括补充其它检测试剂。在较之非均质实施方案十分优选的均质实施方案中，在开始扩增步骤ba)之前，将扩增和检测步骤所用试剂加入到样品中。在某些情况下，步骤ba)和步骤bba)可并列进行，即在扩增过程中进行杂交监测，以针对每次热循环过程中或之后或至少在进行若干次热循环之后的PCR。在这种情况下，优选所述步骤bba)的预选温度通常与PCR热循环方案的退火温度相同或非常相似。退火温度是杂交试剂(例如探针)与其靶(即，所扩增的核酸或/和在早期延伸反应中形成的扩增子)杂交的温度。为了获得充分的杂交特异性(即，为了主要检测靶序列)，选择退火温度，这样探针就可主要退火/杂交于靶核酸，但不会退火/杂交于不鉴定的生物核酸。影响探针与核酸杂交的选择性的方法是广泛已知的(长度、GC-含量和互补程度)。
根据本发明，优选在均质测定方式中，顺序进行扩增步骤ba)和检测步骤bb)，其特征在于在扩增步骤过程中，反应混合物内已经存在一种或多种杂交试剂。换句话说，扩增步骤ba)和检测步骤bb)在同一反应容器中进行且在步骤之间无需加入其它试剂。
然而可选择性地，如果在扩增步骤ba)之后，将反应混合物分成至少2、3、4或若干小份，则至少在某些情况下它可能是有利的。然后使用至少相同数量的不同杂交试剂进行步骤bb)，每一个在不同的反应容器中进行。
步骤bba)是测量杂交的杂交试剂信号的步骤，其是按照常规的均质核酸杂交进行的，特别是按照上述不同方法在LightCycler上进行的。
步骤bba)和bbb)优选共同进行，即首先在预选的第一温度下监测杂交事件本身。然后，持续升高温度到至少含杂交试剂的杂交体被分辨的温度。换句话说，进行杂交体的解链曲线的分析。
更准确地说，扩增反应后，在第一温度，例如90-100℃下使PCR产物变性(在有杂交试剂存在的条件下)，随后冷却至第二温度，所述第二温度与PCR方案的退火温度相似或相同。然后以0.01-10℃/s，优选0.1-2℃/s，且最优选0.5-1℃/s的速率升高温度。
一旦进行充足数量的循环Cp以利用温度依赖性将所存在的任何靶序列扩增至可检测水平，则优选进行监测步骤bbb)。它通常与通过探针杂交检测的核酸量一致，即，只要在步骤bba)中测量到清晰的阳性信号，即可进行步骤bbb)。优选Cp在20-40之间。
如果在扩增反应过程中监测杂交(其也被称作“实时”)，则可忽略解链曲线分析的情况，只要不能在预选温度下发现杂交信号。
步骤c)包括解释在步骤bb)过程中获得的结果。这可通过解释所得结果人工进行。优选地，使用计算机程序分析结果，其产生的结果可清楚表明样品中是否存在革兰氏阳性菌和存在哪种革兰氏阳性菌并因此引起感染。
解释是基于步骤bba)和bbb)获得的信号与已知的阳性对照值之间的关联。阳性对照的使用通常也是现有技术已知的。阳性对照是已知存在于样品中或存在于人工制备的对照样品中的核酸。例如，预选温度下探针杂交的特异性用于确定样品中是否存在核酸，该核酸已经通过步骤ba)中的引物被扩增且属于所述革兰氏阳性致病生物的亚组。阳性信号(与阴性对照相比)指示存在属于所述亚组的种的物种(步骤bba)，即使没有从步骤bba)确定所述物种的身份。
杂交的温度依赖性用于鉴定存在于样品中的物种。通过该步骤，可确定是所述生物属于所述亚组的哪一物种，其存在是从步骤bba确定的。例如，它的解链温度指示特定物种的核酸。因此，实际样品中预定物种的存在可通过达到靶与杂交试剂的杂交体解链温度时信号的改变加以证实。
在第一个具体实施方案中，致病性革兰氏阳性菌的预定组包括2个或更多下列物种和菌株。
金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、绿色链球菌组(缓症链球菌、变异链球菌和牛链球菌)、屎肠球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌(被称作I组)。
优选地，这种方法不能充分检测任何其它致病性和非致病性生物，优选它不能检测下列物种和生物：
大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、白色假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、团假丝酵母、烟曲霉(被称作II组)。
最优选地，这类方法可检测由I组所有物种组成的生物组，但不能检测属于II组的任何生物。
在第二个具体实施方案中，致病性革兰氏阳性菌的预定组包括屎肠球菌和粪肠球菌物种和菌株，但不检测II组的任何生物。
在第三个具体实施方案中，致病性革兰氏阳性菌的预定组包括金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌物种和菌株，但不检测II组的任何生物。所鉴定的生物是金黄色葡萄球菌(物种)和CoNS(亚型，中间没有差异)。
该区含有进化保守的以及高变的序列，其允许属和物种特异性引物和探针的灵活设计。
因此本发明还涉及如上所述检测致病性革兰氏阳性菌的方法，其中使用至少一组SEQ ID NO：1和2(肠球菌)和SEQ ID NO：7和8(葡萄球菌)的扩增引物。
此外，本发明提供按照本发明中公开的方法，通过扩增并检测ITS-1序列而用于鉴定致病性革兰氏阳性菌的化合物和试剂盒。
一方面，本发明提供一种组合物，它含有上面定义的至少一组扩增引物，优选具有SEQ ID NO：1和2(肠球菌)和SEQ ID NO：7和8(葡萄球菌)的序列。
第二方面，本发明提供一种组合物，还含有至少两对FRET杂交探针，其中所述两对选自下组FRET对：
SEQ ID NO.3和4
SEQ ID NO.5和6
SEQ ID NO.9和10。
除了上面公开的成分外，本发明组合物可包含一种或几种其它化合物和试剂，它们选自下列：
-缓冲液，用于聚合酶链反应
-脱氧核苷三磷酸盐
-模板依赖性DNA聚合酶，优选热稳定性的，
每一种均分开或组合。
此外，这种组合物还可包含至少部分纯化的核酸，其可以，例如，来源于临床样品或经过本发明任何方法处理。
一方面，本发明提供一种试剂盒，它含有至少一组扩增引物，所述引物具有SEQ ID NO：1和2(肠球菌)和SEQ ID NO：7和8(葡萄球菌)的寡核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种试剂盒，它还含至少两个FRET杂交探针，其中所述杂交探针能够与扩增子杂交，所述扩增子是通过扩增任何肠球菌属、葡萄球菌属和链球菌属的任何致病生物的16S/23S rRNA间隔区的至少20个核苷酸而制备的。
除了上面公开的成分外，本发明试剂盒可包含一种或几种其它化合物和试剂，它们选自下列：
-缓冲液，用于聚合酶链反应
-脱氧核苷三磷酸盐
-模板依赖性DNA聚合酶，优选热稳定性的，
上面公开的各组分可在单一贮存容器中贮存。然而，也可将组分的任何组合贮存于同一容器内。
此外，这种试剂盒还可包含软件工具，如携带定性或定量分析通过所要求保护方法获得的数据的计算机程序的光盘。
本发明与现有技术中细菌测定法的不同之处在于已知测定法仅提供有关一个特定物种或菌株的信息(检测样品中是否存在特定生物的常规方法)，而本发明的试剂适用于有效鉴定两个或更多物种，且同时表明它们中的任何一个是否存在(与哪种生物无关)。
参考文献列表
EP 0 131 052
EP 0 452 596
WO 97/46707
WO 97/46712
WO 97/46714
EP 0 512 334
EP 0 543 942
US 5,210,015
EP 0 070 687
EP 0 201 184
EP 0 497 784
WO 01/94634
WO 97/07238
WO 01/48237
WO 02/14555
US 5,118,801
Klausegger等人，Journal of Clinical Microbiology 33(1990)464-466Woo等人，Journal of Microbiology 35(1999)23-30Espy等人，Journal of Clinical Microbiology 33(2000)795-799Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，Anal Biochem 169(1988)1-25Bernard，P.S.等人，Anal Biochem 255(1998)101-7
实施例
提供下列实施例、参考文献、序列表和图用于帮助理解发明，其真正的范围在权利要求中提出。应理解可在不背离本发明精神的前提下对该过程进行改进。
概述：
此处提到的所有寡核苷酸都是通过化学合成制备的。用于攻击标记的试剂可从Roche Diagnostics GmbH(LightCycler Red 640NHS EsterCat.No.2015161；LightCycler Red 705Phosphoramidite Cat.No.2157594；LightCycler Fluorescein(下面缩写为‘F’)CPG Cat.No.3113906)购买。这些试剂的使用在Biochemica No.1(2001)，p.8-13中描述。
需要检查所有试剂是否被所要检测的生物污染。只有不含那些生物和来源于它们的核酸的试剂才能产生最佳灵敏度。
实施例1
肠球菌
A.材料
引物
SEQ ID NO 1：5′-tac ttt gtt cag ttt tga gag gt-3′正向引物
SEQ ID NO 2：5′-gca att gaa ctt att aaa aaa ctc-3′反向引物
探针
SEQ ID NO 3：LCR640-5′acc gag aac acc gcg ttg aat-3′锚定探针
SEQ ID NO 4：5′-ctg gat att gaa gta aaa aga atc aaa ac-3′-F传感探针
SEQ ID NO 5：5′-gat att tga agt aaa tgt aag taa t-3′-F传感探针(用于靶和用于IC)
SEQ ID NO 6：LCR705-5′-cca gca gaa tgc caa cca cc-3′锚(用于IC)
阳性对照(PC)
pEfis_wt1基于含粪肠球菌16S/23S-rRNA-间隔区的pT3T7BM的质粒
pEfum_wt2基于含屎肠球菌16S/23S-rRNA-间隔区的pT3T7BM的质粒
内部对照(IC)
PEntero_IC2基于pEfis_wt1的质粒，但SEQ ID NO 3的互补序列被SEQ ID NO 6的互补序列替换
硬件/软件
具有3.5版本软件(Roche Diagnostics GmbH，Germany)的LightCyclerTM 1.2(20μl毛细管)
试剂
1.FastStart聚合酶
2.FastStart主混合物，含有
MgCl2          3.5mM
引物            0.5μM
传感探针        0.2μM
锚定探针        0.3μM
传感探针(IC)    0.2μM
3.PCR-级H2O(纯化至不含交叉污染的核酸和早期扩增的扩增子)
FastStart聚合酶和FastStart Master通常被建议用在LightCycler-FastStart-DNA Master Hybridization Probes试剂盒(Roche Diagnostics GmbH Cat.No.2239272)中。
样品
样品是
a.含引物和探针的适宜结合序列的质粒DNA或
b.细菌DNA制品(例如，来源于细菌培养)。
样品(特别是临床样品)经过样品制备，其中从样品的其它组分释放并纯化核酸。这是使用MagNAPureTM LC和MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH，Germany，CatNo.3 264 785)进行的。样品制备产生含有溶于洗脱缓冲液中的核酸的样品。
IC是在样品制备中加工的(例如，通过MagNA Pure)或加入到完全的主混合物(见下文)中，这取决于它是用于样品制备过程还是用于每个毛细管中LightCycler测定性能的过程内对照。IC的信号是在LightCycler设备的F3通道中检测的。
B.方法
首先，将整个转子的32个毛细管中的FastStart主混合物的所有组分混合在一起。
然后将15μl主混合物的等分试样吸移到各毛细管中。在将IC用作PCR对照的情况下，将IC加入到主混合物中。
可选地，将IC放在MagNA Pure LC溶解/结合缓冲液中并与样品共同处理。
向含主混合物的第一毛细管中加入5μl含两个质粒组合的阳性对照溶液，所述两个质粒分别具有对SEQ ID NO 3和4或SEQ ID NO 5和3特异的序列。
向第二个毛细管中加入5μl水形式的“阴性对照”，代替样品或阳性对照。阴性对照还包含过程内对照的IC。
盖上阳性和阴性对照后，向其它毛细管中加入样品(每种5μl体积)。
盖上剩余毛细管后，使用下列方案进行LightCycler-运行：
        循环次数    时间(秒)    温度(℃)    坡度(℃)
变性    1           600         95℃        20
扩增    45          10          95          20
                    15          50          20
                    10          72          20
解链曲线1           60          95          20
                    60          40          20
                    0           80          0.1
冷却    1           30          40          20
C.结果
如上所述在LightCycler中进行分析。屎肠球菌和粪肠球菌样品分别在54.5℃和58.5℃下，在通道F2中显示量化曲线和解链峰。绝大多数其它肠球菌物种没有检测到。某些少见的物种(例如，耐久肠球菌、小肠肠球菌、蒙氏肠球菌)在较低温度(＜46℃)下达到解链峰。
因此，可将所检测物种(屎肠球菌和粪肠球菌)彼此区别开来且样品中存在的所有其它肠球菌物种可通过解链温度不同而确定。我们发现至少10-20基因组等同物/PCR的较低检测限。
PC(pEfis_wt1和pEfum_wt2的混合物)显示出量化曲线和双峰，其由屎肠球菌和粪肠球菌特异性峰的组合所引起。
IC允许在没有特异性样品存在的情况下检测。在过量粪肠球菌或屎肠球菌模板DNA的情况下不可检测。
实施例2
葡萄球菌
A.材料
引物
SEQ ID NO 7：5′-tgt aca ttg aaa act aga taa gta ag-3′正向引物
SEQ ID NO 8：5′-acg cgt tat taa tct tgt gag t-3′反向引物
探针
SEQ ID NO 9：LCR640-5′-gct tga att cat aag aaa taa tc-3′锚定探针
SEQ ID NO 10：5′-ccg agt gaa taa aga gtt tta aa-3′-F传感探针(用于靶和用于IC)
SEQ ID NO 6：LCR705-5′-cca gca gaa tgc caa cca cc-3′锚(用于IC)
阳性对照(PC)
PStaph_wt    基于含金黄色葡萄球菌16S/23S-rRNA-间隔区的
pT3T7BM的质粒
内部对照(IC)
PStaph_IC  基于pStaph_wt的质粒，但SEQ ID NO 9的互补序列被
SEQ ID NO 6的互补序列替换
硬件/软件
具有3.5版本软件(Roche Diagnostics GmbH，Germany)的
LightCyclerTM 1.2(20μl毛细管)
试剂
1.FastStart聚合酶
2.FastStart主混合物，含有
MgCl2              3.5mM
引物                0.4μM
探针                0.2μM
传感探针(IC)        0.1μM
3.PCR-级H2O(纯化至没有交叉污染的核酸和早期扩增的扩增子)
FastStart聚合酶FastStart Master通常被建议用在LightCycler-FastStart-DNA Master Hybridization Probes 试剂盒(RocheDiagnostics GmbH Cat.No.2239272)中。
样品
样品是
a.含引物和探针的适宜结合序列的质粒DNA或
b.细菌DNA制品(例如，来源于细菌培养)。
样品(特别是临床样品)经过样品制备，其中从样品的其它组分释放并纯化核酸。这是使用MagNAPureTM LC和MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH，Germany，CatNo.3 264 785)进行的。样品制备产生含有溶于洗脱缓冲液中的核酸的样品。
IC是在样品制备中加工的(例如，通过MagNA Pure)或加入到完全的主混合物(见下文)中，这取决于它是用于样品制备过程还是用于每个毛细管中LightCycler测定性能的过程内对照。IC的信号是在LightCycler设备的F3通道中检测的。
B.方法
首先将整个转子的32个毛细管中的FastStart主混合物所有组分混合在一起。
然后将15μl主混合物的等分试样吸移到各毛细管中。在将IC用作PCR对照的情况下，将IC加入到主混合物中。
可选地，将IC放在MagNA Pure LC溶解/结合缓冲液中并与样品共同处理。
向含主混合物的第一毛细管中加入5μl含质粒的阳性对照溶液，所述质粒分别具有对SEQ ID NO 9和10特异的序列。
向第二个毛细管中加入5μl水形式的“阴性对照”，代替样品或阳性对照。阴性对照还包含过程内对照的IC。
在盖上阳性和阴性对照后，向其它毛细管中加入样品(每种5μl体积)。
盖上剩余毛细管后，使用下列方案进行LightCycler-运行：
            循环次数    时间(秒)    温度(℃)    坡度(℃)
变性        1           600         95℃        20
扩增        45          10          95          20
                        15          50          20
                        10          72          20
解链曲线    1           60          95          20
                        60          40          20
                        0           80          0.1
冷却        1           30          40          20
C.结果
如上所述在LightCycler中进行分析。金黄色葡萄球菌和凝固酶-阴性葡萄球菌(称作CoNS)样品显示量化曲线。分别在约55℃(金黄色葡萄球菌)和48-48℃(CoNS)下，在通道F2中观察到解链峰。我们发现至少10-20基因组等同物/PCR的较低检测限。
PC显示出类似金黄色葡萄球菌量化和解链峰的量化曲线。
IC允许在没有特异性样品存在的情况下检测。在过量葡萄球菌模板DNA的情况下不可检测。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
<110>Innogenetics N.V.
<120>检测葡萄球菌、肠球菌和链球菌属中的致病性革兰氏阳性菌的方法
<130>21518 EP
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>肠球菌
<400>1
tactttgttc agttttgaga ggt                                            23
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>肠球菌
<400>2
gcaattgaac ttattaaaaa actc                                           24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>肠球菌
<400>3
accgagaaca ccgcgttgaa t                                              21
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>肠球菌
<400>4
ctggatattg aagtaaaaag aatcaaaac                                      29
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>对照
<400>5
gatatttgaa gtaaatgtaa gtaat                                          25
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>对照
<400>6
ccagcagaat gccaaccacc                                                20
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>葡萄球菌
<400>7
tgtacattga aaactagata agtaag                                        26
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>葡萄球菌
<400>8
acgcgttatt aatcttgtga gt                                           22
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>葡萄球菌
<400>9
gcttgaattc ataagaaata atc                                          23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>葡萄球菌
<400>10
ccgagtgaat aaagagtttt aaa                                          23
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>对照
<400>11
ccagcagaat  gccaaccacc                                             20

Claims (10)

1.鉴定临床样品中的革兰氏阳性致病生物或属于致病性革兰氏阳性菌预定组的成员的生物亚群的方法，包括
a)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，
b)使所述临床样品经过至少一次扩增和检测，包括
ba)使用至少一组扩增引物进行的扩增步骤，所述扩增引物能够扩增来自所述革兰氏阳性致病性生物所属的致病性革兰氏阳性菌的预定亚组的预选核酸序列区，
bb)使用至少一种杂交试剂进行的检测步骤，所述杂交试剂能够检测来自致病性革兰氏阳性菌的所述预定亚组的所述预选核酸序列区，其中所述检测步骤bb)包括步骤
bba)监测预选温度下的杂交，所述杂交指示样品中存在包含于所述亚组中的至少一个物种，和
bbb)监测杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示至少存在所述致病性革兰氏阳性菌或所述生物亚群中的物种，
c)根据bb)中监测步骤的结果鉴定所述生物或所述生物亚群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚组是属。
3.根据权利要求1和2任何一项所述的方法，其中所述杂交试剂包含两个与靶核酸序列区中的相邻序列互补的探针，一个被FRET供体标记，另一个被FRET受体标记。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的方法，其中所述致病性革兰氏阳性菌的预定组包括物种。
5.根据权利要求1-4任何一项所述的方法，其中所述预定亚组包括物种：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌和粪肠球菌。
6.根据权利要求1-5任何一项所述的方法，其中所述预选核酸序列区包含rRNA间隔区的至少20个核苷酸。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其中所述扩增和检测均质地进行。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的方法，其中所述物种选自葡萄球菌属、肠球菌属和链球菌属。
9.根据权利要求1-7任何一项所述的方法，其中所述物种选自葡萄球菌属之一。
10.一种鉴定选自肠球菌属、葡萄球菌属和链球菌属的革兰氏阳性致病菌的试剂盒，它包含一组引物，所述引物能够分别扩增来自肠球菌、葡萄球菌和链球菌的16S-23S rRNA间隔区的至少20个核苷酸的序列。
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