CN1215177C - 用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片。它是在尼龙膜上设置包括有鉴定细菌的种，属特异性的探针，还包括由此衍生的探针以及每种探针的互补探针或它们的变体。特异性探针可以鉴定包括：流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌等至少40细菌，还包括有革兰氏阴性细菌通用探针、细菌通用探针以及假丝酵母探针。基于基因探针构成的基因芯片检测法比较快速、准确，可以用于临床微生物实验室中进行常规诊断，可用于提高微生物感染诊断的速度和准确度，因此可以达到更有效的治疗。
Description
所属技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片，在芯片上设置多种细菌的探针，其中包括一些常规培养难以分离的细菌，利用PCR扩增产物进行杂交试验检测、鉴定测试样品。
背景技术
从血液中分离到细菌通常表明病人严重感染，需要紧急抗菌治疗。不同的细菌需要使用不同的抗生素来治疗，成功的治疗依赖于正确药物的及时使用。目前临床应用的微生物鉴定方法是基于生理和生化的生物测定方法，需要培养和分离临床样品中的微生物。一般在病人抽血培养后8-12小时后培养液会显示阳性，这时候可以用Gram染色区分Gram染色阳性和阴性细菌。这一区分有助于用药，但作用并不明显。在24-28小时之后才能明确诊断细菌。这种延误造成以下后果：首先，由于对具有抗药性的细菌不能使用特异的抗生素治疗，病人遭受巨大的痛苦：其次，广谱抗生素的使用造成细菌抗药性的发展。
Anthony.R.M.et al.(Rapid diagnosis of bacteria by universal amplification of 23sribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array，J.Clinicalmicrobiology，Feb.2000.p781-788)，报道了对菌血症迅速诊断方面的研究结果，设计出了探针阵列应用于菌血症的诊断。但是，其中包括的探针较少，覆盖病原菌种类只有22个，会漏掉许多病原菌，而且准确性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法，本发明包括了用于病原体基因检测进行鉴定种、属特异性探针和细菌通用探针以及革兰氏阴性细菌通用探针，使用探针技术鉴定病原菌能够同时鉴定多种细菌，具有快速，灵敏的特点，是现有细菌鉴定技术的巨大突破。
本发明是在基质(尼龙膜)上设置包括有鉴定细菌种、属特异性探针、假丝酵母探针和细菌通用探针以及革兰氏阴性细菌通用探针，还包括由此衍生的探针以及每种探针的互补探针或它们的变体。
本发明实施的具体步骤是：
1.设计病原体特异性探针：
选择细菌的23S核糖体RNA基因为靶序列，从中选取种，属特异性和通用序列设计探针用于病原菌的检测。所述的探针见序列表所示。
2.合成探针：使用上海生物工程有限公司合成仪合成。
3.探针处理：由于设计的探针比较短，很难固化在膜上，因此我们在3’末端选择性加了polyT尾巴，使它能够固化在尼龙膜上。
4.基因芯片的制备
使用罗氏公司生产的带有正点荷的尼龙膜，使用点样仪按预先设定好的顺序进行点样。
5.将点好的膜在长波紫外灯下进行交联5-10分钟，使探针牢固固定在膜上。
6.将待检血标本按本试验室提供的试剂盒(另外申请专利：菌血症检验用基因芯片的检验方法)处理以抽提获得用于PCR的病原体DNA备用；
7.PCR扩增：
在PCR反应管中加入PCRmix、处理好的标本和引物，按下列程序进行PCR扩增：
在94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。
8.探针标记：使用罗氏公司生产的地高辛标记试剂，方法参照试剂盒的说明。
9.杂交：预杂交为10-15分钟杂交为1-2小时，在杂交箱中进行。
10.显色：参照BCIP/NBT或DAB检测方法试剂盒说明书进行。
11.检测：经杂交和显色后的芯片，可显示若干兰色或兰紫色杂交点。根据杂交点的位置，可人工肉眼判读，确定病原菌的有无或种类。
本发明适用于直接从血液，尿液等临床标本中直接抽提病原菌DNA用PCR扩增靶基因用于杂交检测。基因芯片具有诊断准确、特异性强、信息量高的特点，可以快速，准确，全面地鉴定各种细菌。首先，它用PCR的方法扩增细菌靶基因，避免了费时的培养阶段；其次，基于DNA-DNA的杂交鉴定方法较基于生理和生化的鉴定方法更准确，不受培养条件和细菌生理状态的影响：第三，在芯片上可以设置多种细菌的探针，其中包括一些常规培养难以分离的细菌，因此具有全面的特点。
本发明可以检测、鉴定测试样品中下列细菌(至少40种细菌)，包括：对流感嗜血杆菌，李斯特，产酸克雷伯氏菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，粪肠链球菌，肺炎链球菌，腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，噬麦芽窄食单胞菌，伤寒沙门氏菌，乙型副伤寒沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，大肠杆菌，阴沟肠杆菌，肺炎链球菌，副流感嗜血杆菌，粪肠球菌，气单胞菌，屎链球菌，屎肠球菌，粪肠球菌，洋葱伯克霍尔氏菌，嗜热链球菌，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，产碱菌，产气肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，乙型溶血型链球菌，黏质沙雷氏菌，蜡样芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌；以及假丝酵母。
本发明还包括有革兰氏阴性细菌通用探针以及细菌通用探针，因此可以检出测试标本中的任何感染细菌，并可以区分革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。
上述微生物种、属基因均是多种临床标本中相关的和常见的，这些基于DNA的检测法比较快速、准确，可以用于临床微生物实验室中进行常规诊断。这些新型方法可用于提高微生物感染诊断的速度和准确度，因此可以达到更有效的治疗。
附图说明
图1：本发明应用实施例1杂交点阵图谱。
图2：本发明应用实施例2杂交点阵图谱。
图3：本发明应用实施例3杂交点阵图谱。
具体实施方式
实施例
1.设计病原体特异性探针
选择细菌的23S核糖体RNA基因为靶序列，从中选取种，属特异性和通用序列设计探针用于病原菌的检测。所述的探针如序列表所示。
2.合成探针：使用上海生物工程有限公司合成仪合成。
3.探针处理：由于设计的探针比较短，很难固化在膜上，因此我们在3’末端选择性加了polyT(寡聚脱氧胸腺核苷酸)尾巴，使它能够固化在尼龙膜上。
4.基因芯片的制备
使用罗氏公司生产的带有正点荷的尼龙膜，使用点样仪按预先设定好的顺序进行点样。
5.将点好的膜在长波紫外灯下进行交联5分钟，使探针牢固固定在膜上。
6.取全血血液标本0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12000rpm，5分钟，弃去900ul上清液，加入400ul裂解缓冲液(lysis buffer：10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6ul 20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50ulTE溶解。吸出15ul作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5ul PCR buffer，5ul MgCL2，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul dNTP，0.3ul
Digoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq DNA Polymerase和16ul重蒸蒸馏水，使总反应体积为50ul(引物I：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’；引物II：5’-TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’；引物III：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’；引物IV：5’-TTCTCGGCATAATGATGTGA-3’)。
把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：
首先在94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。
7.杂交：预杂交为13分钟，杂交为1.5小时，在杂交箱中进行。
8.显色：参照BCIP/NBT或DAB检测方法试剂盒说明书进行。
9.检测：经杂交和显色后的芯片，可显示若干兰色或兰紫色杂交点。根据杂交点的位置，可人工肉眼判读，显色得出杂交点阵图与数据库中的杂交点阵图相比对，确定对应图形，确定病原菌的有无或种类，从而完成对此种未知样品的菌种鉴定。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
天津南开基因工程有限公司
<120>用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法
<130>2002.08.30
<160>26
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>炭疽热细菌(Bacillus anthracis)
<400>1
gtagacgaag cgacctgga 19
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>2
aggtagatga agaggtctgg aaag 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)
<400>3
gaatacatag gttaacgagg cgaa 24
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400>4
cagtgtgact cgtcacacta tcatt 25
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
<400>5
gcatcttgga agttagtgga acgg
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>副流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>6
gtgaattcat agcttgttga ggcaa 25
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400>7
gagattctgt gagtagcggc gag 23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400>8
aggacggagc acgagaaact ttg 23
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
<400>9
gacagccccg tacaaaagcg 20
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
<400>10
tgaccatagc gggtgacagt ccc 23
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
<400>11
tcaaaacttc gttctctcct gagtg 25
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400>12
gaatacatag gcttagagaa gcgaa 25
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)
<400>13
gttgaataca tagacttaga agcg 24
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>克雷伯氏菌(Klebsiella)
<400>14
aagcgtctgg aaagtcgcag 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>克雷伯氏菌(Klebsiella)
<400>15
gtctggaaag tccgacggta 20
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)
<400>16
tgaatttata gcatgtcaga aggcag 26
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400>17
aatacatagc atatcagaag gcac 24
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400>18
acttcgttct ctcttgaatg tatcc 25
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>19
gttctctcct gagtggatcc 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400>20
ggcgagcgaa acggaacata 20
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>葛兰氏阴性菌通用(Gram-negative bacteria)
<400>21
gaggaaaaga aatcaaccga gattcc 26
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>细菌通用(bacteria)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..()
<223>d＝a，g，t，
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..()
<223>y＝c/a；
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..()
<223>w＝c/g
<400>22
ggdgaactga aycatctaag tawc 24
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>23
agccccgtac acaaaaatgc aca 23
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>沙门氏菌(Salmonella)
<400>24
cccgtacaca aaagcgcatg t 21
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>25
ccagagcctg aatcagtgtg 20
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)
<400>26
acgaaaatgc acaggttgtg aact 24
应用实施例一：
患者：刘贾，男，18岁。8月2日高烧入院，体温38.9℃，医生给予丁胺卡那治疗，效果不佳，病人仍发热。用菌血症基因芯片进行诊断。诊断过程如下：
取刘贾血液0.1ml置eppendoff离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900ul上清液，加入400ul裂解缓冲液(lysis buffer：10mMTris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6ul，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50ulTE溶解。吸出15ul作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5ul PCR buffer，5ul Mgcl2，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul dNTP，0.3ul Digoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq DNA Polymerase和16ul无菌水，使总反应体积为50ul(引物I：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’；引物II：5’TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’；引物III：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’；引物IV：5’-TTCTCGGCATAATGATG-TGA-3’)。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图为图1。与数据库中的杂交点阵图相比对，确定结果为金黄色葡萄球菌感染。
换以头孢他定治疗，两天后，患者退烧。继续治疗三天后，传统的血培养也完成鉴定，鉴定结果为金黄色葡萄球菌感染。患者继续治疗一天后，出院。
用基因芯片的方法鉴定的菌种的结果与医院采用BacT/Alert全自动血培养仪方法鉴定的菌种的结果相一致，都是金黄色葡萄球菌感染。
应用实施例二：
患者，罗建华，男，43岁。7月15日因颈骨髓损伤，发热两天后入院，医师对其实行对症治疗及消炎抗菌治疗。入院第三天，进行了菌血症基因芯片诊断：
取罗建华血液0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900ul上清液，加入400ul裂解缓冲液(lysisbuffer：10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6ul，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50ulTE溶解。吸出15ul作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5ul PCR buffer，5ulMgcl2，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul dNTP，0.3ul
Digoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq DNA Polymerase和16ul无菌水，使总反应体积为50ul。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图为图2。与数据库中的杂交点阵图相比对，确定结果为铜绿假单胞菌。
随后，医师对罗建华的治疗进行了调整，除对症治疗外，以头孢他定进行抗菌消炎治疗。一周后，患者病情稳定，无发热现象，停用抗菌素继续针对颈髓损伤进行对症治疗。
传统血培养诊断结果为阴性。
用基因芯片方法鉴定菌种的结果为铜绿假单胞菌，而医院采用BacT/Alert全自动血培养仪方法进行鉴定，结果显示为阴性，即无菌生长。
此例说明，基因芯片的鉴定方法比全自动血培养仪的鉴定方法要灵敏。因为传统的方法要求的是活菌，并且要可以在适宜的条件下生长和繁殖。因此，很有可能，被检测的血液中的细菌进行鉴定的时候已经死亡，或是所用培养瓶的条件并不能使其继续生长繁殖。然而，基因芯片的鉴定方法，并不需要是活菌，当然也不需要菌的繁殖和生长。无论是死亡的细菌还是存活的细菌，只要有DNA存在，就可以被鉴定出来。因而，基因芯片的鉴定方法比全自动血培养仪的鉴定方法要灵敏。对152病例的鉴定就是可靠的证据。应用实施例三：
患者，刘连弟，男，73岁。7月10日入院，临床诊断为肺炎，有轻微发热情况。进行菌血症基因芯片诊断，诊断过程如下：
7月10日取刘连弟血样0.1ml置eppendorf离心管中，补加无菌水1ml在室温下静置5分钟，然后于室温下离心：12,000rpm，5分钟，弃去900ul上清液，加入400ul裂解缓冲液(lysis buffer：10mM Tris.HCL pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS)混匀后加6ul，20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司产品)，混匀，置56℃水浴中保温30分，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，加70％冷乙醇振荡洗涤一次，离心：12,000rpm，室温，5分钟，倾去上清，沉淀加50ulTE溶解。吸出15ul作为模板加入到PCR反应薄壁管中，再加入PCR反应体系，即相继分别加入5ul PCRbuffer，5ul Mgcl2，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul dNTP，0.3ulDigoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq DNA Polymerase和16ul无菌水，使总反应体积为50ul。把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，变性10min；然后94℃，30sec；57℃，15sec；72℃，40sec。这样进行5个循环。而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应。最后在72℃，延伸5min。扩增好的PCR产物与以制备好的芯片进行杂交反应。显色得出杂交点阵图为图3。只有质控点显色，诊断结果为没有细菌或真菌感染。
医师给予患者抗病毒等治疗，情况有所缓解，患者病情稳定。七天后，传统血培养方法鉴定结果为阴性。
以上实例表明，基因芯片检验病原菌的方法，其鉴定结果比医院采用全自动血培养仪方法鉴定的结果阳性率更高，更准确。
Claims (3)
1、一种用于鉴定血液中病原菌基因芯片，其特征在于它是在尼龙膜基质上设置包括鉴定细菌的种、属特异性的探针、特异性假丝酵母探针和细菌通用探针以及革兰氏阴性细菌通用探针；所述的探针序列为：
探针 序列
炭疽热细菌(Bacillus anthracis) gtagacgaag cgacctgga
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) aggtagatga agaggtctgg aaag
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) gaatacatag gttaacgagg cgaa
肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) cagtgtgact cgtcacacta tcatt
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) gcatcttgga agttagtgga acgg
副流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) gtgaattcat agcttgttga ggcaa
败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) gagattctgt gagtagcggc gag
败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) aggacggagc acgagaaact ttg
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) gacagccccg tacaaaagcg
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) tgaccatagc gggtgacagt ccc
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) tcaaaacttc gttctctcct gagtg
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae) gaatacatag gcttagagaa gcgaa
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides) gttgaataca tagacttaga agcg
克雷伯氏菌(Klebsiella) aagcgtctgg aaagtcgcag
克雷伯氏菌(Klebsiella) gtctggaaag tccgacggta
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) tgaatttata gcatgtcaga aggcag
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) aatacatagc atatcagaag gcac
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) acttcgttct ctcttgaatg tatcc
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) gttctctcct gagtggatcc
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) ggcgagcgaa acggaacata
葛兰氏阴性菌通用(Gram-negative bacteria) gaggaaaaga aatcaaccga gattcc
细菌通用(bacteria) ggdgaactga aycatctaag tawc
大肠杆菌(Escherichia coli) agccccgtac acaaaaatgc aca
沙门氏菌(Salmonella) cccgtacaca aaagcgcatg t
大肠杆菌(Escherichia coli) ccagagcctg aatcagtgtg
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) acgaaaatgc acaggttgtg aact
2、如权利要求1所述的用于鉴定血液中病原菌基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计病原体特异性探针：选择细菌的23S核糖体RNA基因为靶序列，从中选取权利要求1所述的种、属特异性和通用探针序列；
2)合成探针：使用上海生物工程有限公司合成仪合成；
3)探针处理：在3’末端选择性加polyT尾巴，使它能够固化在基质上；
4)基因芯片的制备：使用点样仪在基质上按预先设定好的顺序进行点样；
5)将点好的膜在长波紫外灯下进行交联5-10分钟，使探针牢固固定在膜上。
3、如权利要求1所述的用于鉴定血液中病原菌基因芯片的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将待检血标本按本试验室提供的试剂盒处理以抽提获得用于PCR的病原体DNA备用；
2)PCR扩增：在PCR反应管中加入PCR待反应物、处理好的标本和引物，按下列程序进行PCR扩增：
在94℃，变性10分钟；然后94℃，30秒57℃，15秒；72℃，40秒；这样进行5个循环；而后，94℃，30秒，64℃，40秒，这样进行25个循环的反应，最后在72℃，延伸5分钟；
3)探针标记：使用罗氏公司生产的地高辛标记试剂；
4)杂交：在杂交箱中，使用所述的芯片与扩增样品接触，预杂交10-15分钟，杂交1-2小时；
5)显色：参照BCIP/NBT或DAB检测方法试剂盒说明书进行，显色得出杂交点阵图与数据库中的杂交点阵图相比对，确定对应图形，完成对此种未知样品的菌种鉴定。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101045945B (zh) * | 2007-01-12 | 2010-12-22 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 检测多种常见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒 |
| CN102102124A (zh) * | 2010-06-17 | 2011-06-22 | 深圳市疾病预防控制中心 | 伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测方法及检测试剂盒 |
| CN108624653A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-10-09 | 杭州千基生物科技有限公司 | 一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2002
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101045945B (zh) * | 2007-01-12 | 2010-12-22 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 检测多种常见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒 |
| CN102102124A (zh) * | 2010-06-17 | 2011-06-22 | 深圳市疾病预防控制中心 | 伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测方法及检测试剂盒 |
| CN102102124B (zh) * | 2010-06-17 | 2012-12-19 | 深圳市疾病预防控制中心 | 伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测试剂盒 |
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