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CN1709506A - 马抗血清的制备纯化工艺 - Google Patents

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CN1709506A
CN1709506A CN 200510026317 CN200510026317A CN1709506A CN 1709506 A CN1709506 A CN 1709506A CN 200510026317 CN200510026317 CN 200510026317 CN 200510026317 A CN200510026317 A CN 200510026317A CN 1709506 A CN1709506 A CN 1709506A
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CN
China
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antitoxin
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antiserum
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CN 200510026317
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李景玉
张庶民
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Abstract

本发明涉及一种马抗血清(抗毒素)的制备、纯化工艺，该工艺包括免疫血浆消化处理、两次加硫酸铵的沉淀和第三次的吸附沉淀、浓缩等步骤，本发明采用离子交换剂柱层析吸附纯化；可除去F(ab) 2片段以外的酸性杂蛋白，如Fc片段、聚集物、小分子肽等。从而有效提高马抗血清(抗毒素)制剂的纯度，降低马血清制剂过敏反应率和血清病的发生。

Description

马抗血清的制备纯化工艺
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种马抗血清(抗毒素)的制备、纯化工艺。
背景技术：
马抗血清(抗毒素)是由相应毒素或类毒素(包括细菌、病毒)免疫动物所得的免疫血清(血浆)，经胃蛋白酶消化硫酸铵盐析制得的免疫球蛋白制剂。目前，马抗血清(抗毒素)的制备方法包括下述步骤：1、用蒸馏水将各种抗血清的免疫血浆稀释，并用胃酶进行消化处理得消化液；2、将消化液进行第一次沉淀及加温处理，在消化液中加入硫酸铵，并调节pH值，然后将消化液加温并保持，再降温，过滤收集上清夜，废弃沉淀；3、将上述清液进行第二次沉淀过滤，即在上述上清液中加入硫酸铵，静置后过滤取沉淀物，弃上清液；4、明矾沉淀；即将上述沉淀物稀释，再在稀释液中加明矾，静置后过滤取上清液，沉淀物废弃；5、将上述上清液浓缩即可制得抗血清原液。但该工艺的不足之处是制备的抗血清纯度[F(ab)2含量、比活性(IU/gp)]较低，马血清过敏反应率和血清病的发生率较高。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种提高马抗血清(抗毒素)制剂纯度[F(ab)2含量、比活性(IU/gp)]的制备工艺。
本发明提供了一种马抗血清(抗毒素)的制备纯化工艺，该工艺包括下述步骤：
(1)消化步骤：用免疫血浆消化工艺将免疫血浆消化；
(2)第一次沉淀过滤处理步骤：将上述处理的消化液中加入硫酸铵形成混悬液，并调节pH值为4.8-5.2，然后将混悬液加温并保持，再降温，过滤收集上清液，废弃沉淀；
(3)第二次沉淀过滤处理步骤，将上述(2)步的上述清液调整pH值为7.0-7.4，加入硫酸铵进行第二次沉淀，静置后过滤取沉淀物，弃上清液；
(4)明矾沉淀；即将上述(3)步的沉淀物稀释至蛋白含量不超过2g/L，再调整稀释液pH值为7.7-7.9，加明矾进行沉淀，静置后过滤取上清液，沉淀物废弃；
(5)将上述上清液用硫酸铵沉淀法或超滤法浓缩制得抗血清原液；
(6)离子交换剂吸附纯化：
1)用阴离子交换剂装柱，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液进行平衡；
2)将用0.45μm的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液洗柱，流速为3ml/min，收集穿透液(酸性杂质被吸附在层析介质上，F(ab)2流穿)；
3)用2M NaCl清洗柱体后，用20％乙醇洗柱，使介质浸泡其中保存；
4)将穿透液超滤浓缩调整抗血清浓度，调整蛋白含量不超过170g/L，按调整后制品总量，加氯化钠使最终含量为750-950g/L，加三氯甲烷使最终含量不超过5g/L或硫柳汞0.1g/L或间甲酚2.5g/L为防腐剂，调节pH至6.0-7.0，用0.22um滤膜除菌过滤。
所述的马抗血清(抗毒素)包括破伤风抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等。
所述的离子交换剂为SP、Q、CM、DEAE、ANX Sepharose Fast Flow中的一种。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、有效提高马抗血清(抗毒素)制剂的纯度，主要体现在F(ab)2含量和比活性(IU/gp)，如下表(一)，表(二)所示：
表一
质量指标 F(ab)2含量   比活性破伤风抗毒素   (IU/gp)抗狂犬病血清
  纯化前纯化后提高   50-70％70-90％20-50％   40000-6000060000-12000030-50％   3000-50005000-1000030-50％
表二
  制品名称   状态   F(ab)2含量   比活性(IU/gp)
  破伤风抗毒素   原液   61   54000
  纯化后   85   95000
  抗狂犬病血清   原液   56   3500
  纯化后   75   7300
 肉毒抗毒素(A型)   原液   65   22000
  纯化后   81   36000
2、有效降低马抗血清(抗毒素)制剂由于异种蛋白引起的过敏反应和血清病的发生率。
具体的实施方式：
实例1
马抗血清(抗毒素)的制备纯化工艺：
1、消化
将免疫血浆用蒸馏水稀释2-4倍，用1-2N盐酸调节pH至3.0-3.6，加入适量胃酶及甲苯0.2％(ml/ml)，于29-31℃消化1-1.5小时。
2、第一次沉淀及加温处理
将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g，白喉及破伤风抗毒素用1-2N氢氧化钠调节pH至5.0-5.4；抗蛇毒血清、气性坏疽及肉毒抗毒素调节pH至4.8-5.2，抗蛇毒血清、白喉、破伤风、气性坏疽抗毒素加温至57±1℃；肉毒抗毒素加温至51±1℃，均保持30分钟。加温完毕，尽快降温至45℃以下，过滤，取清液。
3、第二次沉淀
上述清液用1-2N氢氧化钠调节pH至7.0-7.4，每100ml加硫酸铵20g；搅拌均匀后静止30分钟，过滤，取沉淀。
4、明矾沉淀
上述沉淀用水稀释至蛋白含量不超过2g/L，每100ml加入10％明矾液6-10ml，用1-2N氢氧化钠调节pH至7.7-7.9，过滤，取清液。
5、浓缩
将上述清液混合，通过超滤装置进行超滤，浓缩至硫酸铵含量为0.1％(g/ml)以下，即为抗血清原液。
离子交换剂吸附纯化
(1)用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液进行平衡；
(2)将用0.45μm的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液洗柱，流速为3ml/min，收集穿透液(酸性杂质被吸附在层析介质上，F(ab)2流穿)；
(3)用2M NaCl清洗柱体后，用20％乙醇洗柱，使介质浸泡其中保存。
(4)将穿透液超滤浓缩调整抗血清浓度(抗体效价)，调整蛋白含量不超过170g/L。按调整后制品总量，加氯化钠使最终含量为750-950g/L，加三氯甲烷使最终含量不超过5g/L，硫柳汞0.1g/L或间甲酚2.5g/L为防腐剂。调节pH至6.0-7.0。用0.22um滤膜除菌过滤。
7、结果
  制品名称   状态   F(ab)2含量   比活性(IU/gp)
 破伤风抗毒素   原液   61   54000
  纯化后   85   95000
 抗狂犬病血清   原液   56   3500
  纯化后   75   7300
 肉毒抗毒素(A型)   原液   65   22000
  纯化后   81   36000

Claims (3)

1、一种马抗血清的制备纯化工艺，该工艺包括下述步骤：
(1)消化步骤：用免疫血浆消化工艺将免疫血浆消化；
(2)第一次沉淀过滤处理步骤：将上述处理的消化液中加入硫酸铵形成混悬液，并调节pH值为4.8-5.2，然后将混悬液加温并保持，再降温，过滤收集上清液，废弃沉淀；
(3)第二次沉淀过滤处理步骤：将上述(2)步的上述清液pH值调整为7.0-7.4，加入硫酸铵进行第二次沉淀，静置后过滤取沉淀物，弃上清液；
(4)明矾沉淀：即将上述(3)步的沉淀物稀释至蛋白含量不超过2g/L，再调整稀释液pH值为7.7-7.9，加明矾进行沉淀，静置后过滤取上清液，沉淀物废弃；
(5)将上述上清液用硫酸铵沉淀法或超滤法浓缩制得抗血清原液；
(6)离子交换剂吸附纯化：
1)用阴离子交换剂装柱，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液进行平衡；
2)将用0.45μm的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部，用pH值为7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸盐缓冲液洗柱，流速为3ml/min，收集穿透液，酸性杂质被吸附在层析介质上，F(ab)2流穿；
3)用2M NaCl清洗柱体后，用20％乙醇洗柱，使介质浸泡其中保存；
4)将穿透液超滤浓缩调整抗血清浓度，调整蛋白含量不超过170g/L，按调整后制品总量，加氯化钠使最终含量为750-950g/L，加三氯甲烷使最终含量不超过5g/L或硫柳汞0.1g/L或间甲酚2.5g/L为防腐剂，调节pH至6.0-7.0，用0.22um滤膜除菌过滤。
2、如权利要求1所述的马抗血清的制备纯化工艺，其特征在于其中所述的马抗血清包括破伤风抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。
3、如权利要求1所述的马抗血清(抗毒素)的制备纯化工艺，其特征在于所述的阴离子交换剂为SP、Q、CM、DEAE或ANX Sepharose Fast Flow。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102512449A (zh) * 2012-01-09 2012-06-27 玉溪九洲生物技术有限责任公司 在制备抗毒素、抗血清中去除病毒的方法
CN102532306A (zh) * 2012-01-09 2012-07-04 玉溪九洲生物技术有限责任公司 在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法
CN102639554A (zh) * 2009-11-18 2012-08-15 Lfb生物制药公司 包括通过分散的方式清洗的步骤的处理血浆的方法
CN113801221A (zh) * 2020-06-16 2021-12-17 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication