CN1693476A - 一种精液果糖测定新方法及用于该方法的葡萄糖异构酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精液果糖测定新方法。本发明还公开了一系列高活性葡萄糖异构酶突变体的氨基酸序列及编码该酶的核苷酸序列，以及获得这些高活性葡萄糖异构酶突变体的基因与蛋白工程技术及制备方法。利用本发明之高活性葡萄糖异构酶可用于测定人体精液、人体内其它器官、或其它生物体精浆中果糖的含量。
Description
技术领域 本发明涉及分子生物学领域与遗传工程领域，具体地说，涉及一种新的精液果糖测定方法；一系列葡萄糖异构酶突变体及这些酶的工程与制备方法。
技术背景 葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，简称GI；E.C.5.3.1.5)，又称木糖异构酶(Xylose isomerase，简称XI；E.C.5.3.1.5)催化葡萄糖转化为果糖，因此，葡萄糖异构酶在工业上可用于生产果葡糖浆；葡萄糖异构酶还可催化木糖转化为木酮糖，是将木聚糖转化为乙醇途径中的关键酶。因此，葡萄糖异构酶在工业上又可用于生产酒精。葡萄糖异构酶还可催化果糖转化为葡萄糖。利用这一特性，本发明首次将葡萄糖异构酶用在医学上，用来测定精液中果糖的含量。但是，现有的葡萄糖异构酶由于活性低、稳定性不够好而难以用来测定精液中果糖的含量。本发明经基因与蛋白工程技术产生了一系列高活性及稳定性好的葡萄糖异构酶突变体，这些突变体能够有效用于测定精液中果糖的含量。
精液中的果糖由精囊腺分泌，它是供精子利用的主要糖类物质。正常人体精液中果糖的含量为9.11-17.67毫摩尔/升。测定精浆中果糖含量，其目的在于：①衡量精囊腺的功能，精囊腺炎症时，果糖含量下降；如果糖为零，应考虑精囊腺缺如；②鉴别无精子症的病因，目前主要用于鉴别单纯性输精管阻塞和输精管、精囊腺缺如引起的无精子症；③间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮的功能；④精浆中果糖是由血液中葡萄糖在精囊转变而成的，如精浆中果糖含量明显高于正常，则应注意排除患者有无糖尿病。目前测定精液果糖的方法主要有色谱法、化学法及果糖脱氢酶法。色谱法受到仪器的限制，临床实验室较少有高效液相色谱仪，也缺乏有关技术。化学法是利用果糖和间苯二酚、吲哚或咔唑等化合物反应产生颜色变化，然后通过比色测出果糖含量。但化学显色反应必须在强酸性介质中进行，不安全；此外，由于显色产物不稳定，因此显色反应重复性很差。脱氢酶法是虽然反应条件较温和，测定结果较准确，但是，果糖脱氢酶本身及果糖脱氢酶反应中使用的显色剂不稳定，两者皆需在临用前新鲜配制，因此很是费时；而且，果糖脱氢酶试剂价格昂贵，因此其商业利用受到限制。故此，迄今尚没有一种较理想而实用的精液果糖测定方法。
本发明从Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A菌(ATCC 49915，USA)中分离到葡萄糖异构酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，139：1227-1234)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO.1，氨基酸序列为序列表SEQ.IDNO.2。然后，本发明通过基因与蛋白工程技术改良了本发明分离到的葡萄糖异构酶，使其催化转化果糖为葡萄糖之活性有了显著提高，并且该葡萄糖异构酶突变体之稳定性及在大肠杆菌中的表达水平有了显著提高。本发明之葡萄糖异构酶突变体在测定精液中果糖含量方面较前述的色谱法、化学法及果糖脫氢酶具有如下特点：(1)操作简便；(2)结果准确；(3)条件温和；(4)成本低廉。
本发明的葡萄糖异构酶突变体还可以用于人体内、或体内某一器官、或其它生物体精液果糖含量的测定。
发明内容 本发明的目的在于提供一种精液果糖测定方法。本发明的目还在于提供一种高催化活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。本发明的目的还在于提供使用本发明的高催化活性的葡萄糖异构酶突变体有效测定精液中的果糖含量。本发明的目的还在于提供使用本发明所述的葡萄糖异构酶突变体测定人体内其它器官、或其它生物体精液果糖含量。
本发明从Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A菌中分离到葡萄糖异构酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，139：1227-1234)。然后，本发明依据分离到的葡萄糖异构酶之二级结构及模拟三级结构之特性，通过基因与蛋白工程技术改良了该葡萄糖异构酶，使其催化转化果糖为葡萄糖之活性有了显著提高，并且该葡萄糖异构酶突变体之稳定性及在大肠杆菌中的表达水平有了显著提高。
本发明一方面提供一种精液果糖测定方法，该方法包括以下步骤：
1)将人体(或其它生物体，如牛、羊、马、狗)精液样品于80℃处理30分钟，室温下离心，再将上清液转入一洁净试管中；
2)加入Chelex 100树脂(BIO-RAD，USA)，去除精液中对本发明提供的葡萄糖异构酶有干扰的物质，室温下离心，收集上清液；
3)取上清液，加CoCl2和MgCl2，再加入一种本发明提供的葡萄糖异构酶突变体，于80℃反应10分钟；
4)反应产物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法测定；
5)根据果糖标准曲线，求算出精液中果糖含量。
本发明另一方面提供编码一系列耐高温葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列，所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(≥75％的同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义，所述的突变不包括公知的密码子简并性变化。
本发明进一步提供由序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.IDNO.9的核苷酸序列编码的相应的序列表SEQ.ID NO.4、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.IDNO.6、或SEQ.ID NO.10氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(≥90％的同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
本发明进一步提供耐高温葡萄糖异构酶突变体的工程方法，该方法包括以下步骤：
1)根据基因库(L09699)基因序列设计引物TF：5′AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAA 3′和TR：5′ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATACT 3′，利用引物对TF和TR及常规PCR技犬从Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC 49915，USA)中扩增出亲本葡萄糖异构酶基因(TS-F)；
2)分析亲本葡萄糖异构酶之二级结构与三级结构，选择位点R81、W139、R182、V186、Q59及T299六位点进行单个位点或/和多位点组合突变；
3)通过PCR技术突变产生突变基因，将产生的突变基因与载体pGEMT-Easy(Promega，USA)连接，得含突变基因的质粒；
4)将质粒转入感受态细菌细胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆；
5)从克隆中提取质粒DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。
本发明进一步提供耐高温葡萄糖异构酶突变体的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将含葡萄糖异构酶突变体基因的质粒转化感受态细菌细胞HB101，涂在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，37℃选择培养36小时，产生具有葡萄糖异构酶活性的克隆；
2)接种单个克隆于液体LB培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养；
3)离心收集菌体，并悬于磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。然后用超声波裂解细菌细胞；
4)离心并收集上清液；
5)上清液经80℃热处理10分钟后，离心并进一步收集上清液。上清液即为部分纯化的葡萄糖异构酶。
在本发明制备耐高温葡萄糖异构酶突变体的方法中，所述的载体可选用本领域已知的各种载体，包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy，pRSET和pET21。在生产本发明提供的耐高温葡萄糖异构酶时，可以将耐高温葡萄糖异构酶基因序列与表达调控序列相连，进而形成耐高温葡萄糖异构酶表达载体。表达载体含有复制起始点和表达调控序列、启动子、或/和增强子、或/和必要的加工信息位点、或/和信号肽编码序列。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。这些表达载体可以用本领域公知的重组DNA技术制备，可参考Sambrook，et al.，Molecularcloning：A laboratory manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在本发明制备葡萄糖异构酶的方法中，所述的葡萄糖异构酶可以在原核细胞(如HB101、BL21、DH5α)或真核细胞(如酿酒酵母、毕赤巴斯德酵母)内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达。
附图表说明 下列附图表用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1亲本葡萄糖异构酶TS-F之二级结构。
图2亲本葡萄糖异构酶TS-F之模拟三级结构。
图3葡萄糖异构酶突变体GI-1聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体的比活性。
表1亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体扩增反应之引物。
具体实施方式 下列实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。实施实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1：亲本基因(TS-F)的扩增及其载体的构建
根据基因库(L09699)基因序列设计引物TF和TR(见表1)。利用引物对TF和TR从T.saccharolyticum中扩增葡萄糖异构酶编码亲本基因(TS-F)。
扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM引物TR，1.5UPfu(Promega，USA)DNA聚合酶，用接种环挑取少许T.saccharolyticum菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环：95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的基因连接至载体pGEMT-Easy(Promega，USA)上，得质粒pGMT-TS-F。利用快速质粒制备试剂盒(Marligen Bioscience，USA)提取质粒pGMT-TS-F，经DNA测序确定TS-F葡萄糖异构酶的核苷酸序列为序列表SEQ.ID NO.1，相应的氨基酸序列为序列表SEQ.ID NO.2。
实施例2：葡萄糖异构酶二级结构与三级结构分析
利用PSIPRED软件获得亲本基因编码的葡萄糖异构酶之二级结构(参见McGufGIn L.J.etal.，Bioinformatics 2000，16：404-405)。葡萄糖异构酶二级结构结果见图1。利用SWISS-PROT软件分析获得亲本基因编码的葡萄糖异构酶之模拟三级结构(参见Reutrakul S.etal.，The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism2001，86(10)：5039-5044)。葡萄糖异构酶之模拟三级结构见图2。利因BLAST软件(见网址：
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将亲本葡萄糖异构酶基因与基因库中其它葡萄糖异构酶基因(特别是来源于耐热菌的葡萄糖异构酶基因，如基因库号A72225、P45687和P29441的GI基因)进行比较，获得葡萄糖异构酶基因的保守序列信息。再在亲本GI二级结构与三级结构的基础上，选择位点R81、W139、R182、V186、Q59及T182四位点进行单个位点和多位点组合突变(见实施例3、4和5)。
实施例3：葡萄糖异构酶之多位点组合突变GI-1
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-TS-F为模板，设计引物对81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、186TF和186TR、以及299QF和299QR(见表1)。引物TF和TR见实施例1。用引物对TF和81AR，扩增TFAR片段；引物对81AF和139FR，扩增AFFR片段；引物对139FF和182AR，扩增FFAR片段；引物对182AF和186TR，扩增AFTR片段；引物对186TF和299QR，扩增TFQR片段；引物对299QF和TR，扩增QFTR片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ngpGMT-TS-F，再用无菌水调反应体积至50ul。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用试剂盒QIAquick DNA(QIAGEN，German)回收，分别得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFTR片段、TFQR和QFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFAR片段、40ng AFFR片段、40ng FFAR片段、40ng AFTR片段、40ng TFQR片段和40ng QFTR片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用试剂盒QIAquick DNA回收，得到全长突变基因GI-1。将GI-1与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-1。将质粒pGEMT-GI-1转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-GI-1 DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。G1-1序列见序列表SEQ.ID NO.3-4。
实施例4：葡萄糖异构酶之多位点组合突变GI-2
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-TS-F为模板，设计引物对81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、187SF和187SR、以及299IF和299IR(见表1)。引物TF和TR见实施例1。用引物对TF和81AR，扩增TFAR片段；引物对81AF和139FR，扩增AFFR片段；引物对139FF和182AR，扩增FFAR片段；引物对182AF和187SR，扩增AFSR片段；引物对187SF和299IR，扩增SFIR片段；引物对299IF和TR，扩增IFTR片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngpGMT-TS-F，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，分别得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFSR片段、SFIR和IFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFAR片段、40ng AFFR片段、40ngFFAR片段、40ng AFSR片段、40ng SFIR片段和40ng IFTR片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到全长突变基因GI-2。将GI-2与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-2。将质粒pGEMT-GI-2转入感受态细菌细胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-G1-2DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。GI-2序列见序列表SEQ.ID NO.5-6。
实施例5：葡萄糖异构酶之单一位点突变
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-GI-1(参见实施例3)为模板，设计引物对139DF和139DR(见表1)，将GI-1氨基酸序列中第139位点的Phe(F)突变为Asp(D)，获得突变体GI-F139D。引物TF和TR见实施例1。利用引物对TF和139DR，扩增TFDR片段；引物对139DF和TR，扩增DFTR片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U PfuDNA聚合酶，40ng pGEMT-GI-1，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到TFDR片段和DFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nMTR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFDR与40ng DFTR，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环： 95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到全长突变基因GI-F139D。将GI-F139D与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-F139D。将质粒pGEMT-GI-F139D转入感受态细菌细胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-GI-F139D DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。GI-F139D序列见序列表SEQ.ID NO.7-8。
按照类似步骤，以质粒pGEMT-GI-1(参见实施例3)为模板，设计引物对299EF和299ER(见表1)，将GI-1氨基酸序列中第299位点的Gln(Q)突变为Glu(E)，构建突变体GI-Q299E，将突变体与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-Q299E。GI-Q299E序列见序列表SEQ.ID NO.9-10。
实施例6：葡萄糖异构酶TS-F的提取与纯化
葡萄糖异构酶的提取与纯化主要参考Lee Y.E.etal.，Journal of GeneralMicrobiology.1993，139：1227-1234。
将含亲本葡萄糖异构酶基因的质粒pGEMT-TS-F转化感受态细菌细胞HB101，在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，37℃选择培养36小时。接种单个克隆在5ml LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养16小时。离心收集菌体，并悬浮于1ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，15,000 g，15分钟)并收集上清液。上清液经80℃热处理10分钟后，离心(10℃，15,000 g，15分钟)并收集上清液。上清液即为部分纯化的匍萄糖异构酶，可用于酶活性的测定和精液果糖含量测定。
实施例7：葡萄糖异构酶突变体的提取与纯化
葡萄糖异构酶突变体GI-1的提取与纯化与实施例5同，只是所用质粒为pGEMT-GI-1。纯化的葡萄糖异构酶见图3。其它葡萄糖异构酶突变体也照此所述提取与纯化。
实施例8：亲本葡萄糖异构酶TS-F活性的测定
取10μl按实施例5制备的葡萄糖异构酶，加入至90μl 1.0M的果糖和20mM磷酸钠缓冲溶液中(pH 6.5)，并含CoCl2和MgCl2终浓度分别为250μM和5mM，反应于80℃进行10分钟。将反应物置冰上以终止反应。反应产物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法测定，测定方法参见Trinder，P.Ann.Clin.Biochem.1981，18：64-67，以及上海科华-东菱诊断同品有限公司的葡萄糖试剂盒使用说明书。用Coomassie Plus Protein AssayReagent Kit(PIERCE，USA)测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔果糖为葡萄糖所需的酶量。图4显示亲本TS-F葡萄糖异构酶之比活性。
实施例9：葡萄糖异构酶突变体GI-1活性测定
葡萄糖异构酶突变体GI-1活性测定与实施例8同。其它葡萄糖异构酶突变体的活性也照此所述测定。图4显示葡萄糖异构酶突变体突变体与亲本TS-F葡萄糖异构酶比活性之差异。
实施例10：用葡萄糖异构酶突变体测定精液果糖含量
将人体精液样品于80℃处理30分钟，室温下离心(15,000g，20分钟)，再将上清液转入一洁净试管中。加入Chelex 100树脂(B1O-RAD，USA)至终浓度20％，于80℃反应30分钟，室温下离心(15,000g 15分钟)，收集上清液。取180μl上清液，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM，加入20μl按实施例6提取并纯化的葡萄糖异构酶突变体，于80℃反应10分钟。反应产物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法并按实施例7测定。根据果糖标准曲线(由浓度为0mM、0.5mM、1.0mM、2mM、4mM、8mM和10mM的果糖标准溶液并按实施例7制定)，求算出精液中果糖含量。按照类似步骤，测定其它生物体精浆中的果糖含量。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
表1亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体PCR扩增反应之引物
| 亲本 | 引物对 |
| TS-F | TF：5′agcctaggttaattaactttaagaaggagatatacatatgaataaatattttgagaa 3′TR：5′ataagctcagcggcgcgccttattctgcaaacaaatact 3′ |
| 突变体 | 引物对 |
| GI-1 | 81AF：5′tagcgaaagcaagggtagaagcagcatttga 3′81AR：5′tctacccttgctttcgctatatccataggat 3′139FF：5′aagttttgtttggtaccgcaaatcttttctc 3′139FR：5′gcggtaccaaacaaaacttttgtcttgctgg 3′182AF：5′agcttggcgcggaaaactacgtattttgggg 3′182AR：5′tagttttccgcgccaagctccttagtaatct 3′186TF：5′aaaactacacattttggggtggaagagaagg 3′186TR：5′ccccaaaatgtgtagttttcgcggccaagct 3′299QF：5′acgcaaatcaaggcgacatgcttttgggatg 3′299QR：5′atgtcgccttgatttgcgtcaattgatccta 3′ |
| GI-2 | 81AF：5′tagcgaaagcaagggtagaagcagcatttga 3′81AR：5′tctacccttgctttcgctatatccataggat 3′139FF：5′aagttttgtttggtaccgcaaatcttttctc 3′139FR：5′gcggtaccaaacaaaacttttgtcttgctgg 3′182AF：5′agcttggcgcggaaaactacgtattttgggg 3′182AR：5′tagttttccgcgccaagctccttagtaatct 3′187SF：5′actacgtgagctggggtggaagagaagggt 3′187SR：5′ccaccccagctcacgtagttttcgcggccaa 3′299IF：5′acgcaaatattggcgacatgcttttgggatg 3′299IR：5′atgtcgccaatatttgcgtcaattgatccta 3′ |
| GI-F139D | 139DF：5′aagttttggatggtaccgcaaatcttttctc 3′139DR：5′gcggtaccatccaaaacttttgtcttgctgg 3′ |
| GI-D299E | 299EF：5′acgcaaatgaaggcgacatgcttttgggatg 3′299ER：5′atgtcgccttcatttgcgtcaattgatccta 3′ |
序列表
序列(SEQ.ID NO.)1
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat
61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag
121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt
181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa
241 cgaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc
301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat
361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtggggt
421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct
481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt
541 ggccgcgaaa actacgtatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca
601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca
661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa
721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac
781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa
841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatacaggc
901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt
961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca
1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg
1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac
1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc
1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa
序列(SEQ.ID NO.)2
(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
mnkyfenvsk ikyegpksnn pysfkfynpe evidgktmee hlrfsiaywh tftadgtdqf
gkatmqrpwn hytdpmdiak rrveaafeff dkinapffcf hdrdiapegd tlretnknld
tivamikdyl ktsktkvlwg tanlfsnprf vhgastscna dvfaysaaqv kkaleitkel
grenyvfwgg regyetllnt dmeleldnfa rflhmavdya keigfegqfl iepkpkeptk
hqydfdvanv laflrkydld kyfkvniean hatlafhdfq helryaring vlgsidantg
dmllgwdtdq fptdirmttl amyevikmgg fdkgglnfda kvrrasfepe dlflghiagm
dafakgfkva yklvkdgvfd kfieeryasy kegigadivs gkadfkslek yalehsqivn
ksgrqelles ilnqylfae
序列(SEQ.ID NO.)3
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat
61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag
121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt
181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa
241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc
301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat
361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt
421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct
481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt
541 ggcgcggaaa actacacatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca
601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca
661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa
721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac
781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa
841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc
901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt
961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca
1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg
1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac
1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc
1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa
序列(SEQ.ID NO.)4
(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQF
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*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat
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301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat
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421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct
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541 ggcgcggaaa actacgtgag ctggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca
601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca
661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa
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(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
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*长度：1320碱基对
*类型：核酸
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*长度：440个氨基酸残基
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(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
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(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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KSGRQELLESILNQYLFAE*
Claims (16)
1.一种精液果糖测定新方法，其特征在于：该方法使用了一种能高效催化果糖转化为葡萄糖的高活性葡萄糖异构酶。
2.权利要求1项所述的测定方法，其特征还在于：使用chelex 100树脂或其类似物去除精液中葡萄糖异构酶反应干扰物质。
3.一种分离的DNA分子，其特征在于：它是编码权利要求1项所述的高活性葡萄糖异构酶的核苷酸序列。
4.权利要求3项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.3的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有≥75％同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
5.权利要求4项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.IDNO.4中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有≥90％同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
6.权利要求3项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.5的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有≥75％同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
7.权利要求6项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.IDNO.6中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有≥90％同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
8.权利要求3项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.7的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有≥75％同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
9.权利要求8项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.IDNO.8中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有≥90％同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
10.权利要求3项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有≥75％同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
11.权利要求10项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.ID NO.10中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有≥90％同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
12.如权利要求1项所述的高活性葡萄糖异构酶是部分纯化或完全纯化的酶。
13.如权利要求1项所述的高活性葡萄糖异构酶是液相酶或固相酶。
14.如权利要求1项所述的高活性葡萄糖异构酶可以是以固相细胞形式存在于大肠杆菌、酵母或其它原核或真核生物细胞中。
15.权利要求1项所述的精液果糖测定方法，可用于男性不育诊断。
16.权利要求1项所述的精液果糖测定方法，还可用在测定其它生物体精液的果糖含量。
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| CN 200410037442 CN1693476A (zh) | 2004-05-08 | 2004-05-08 | 一种精液果糖测定新方法及用于该方法的葡萄糖异构酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN 200410037442 CN1693476A (zh) | 2004-05-08 | 2004-05-08 | 一种精液果糖测定新方法及用于该方法的葡萄糖异构酶突变体 |
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 200410037442 Withdrawn CN1693476A (zh) | 2004-05-08 | 2004-05-08 | 一种精液果糖测定新方法及用于该方法的葡萄糖异构酶突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| CN (1) | CN1693476A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1956083A1 (en) * | 2005-11-18 | 2008-08-13 | Bioright Worldwide Company Limited | Glucose isomerase mutants, the use thereof and the dnas encoding the same |
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-
2004
- 2004-05-08 CN CN 200410037442 patent/CN1693476A/zh not_active Withdrawn
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